CN116888265A

CN116888265A - 用于抑制rtel1表达的增强寡核苷酸

Info

Publication number: CN116888265A
Application number: CN202280012862.9A
Authority: CN
Inventors: E·丰德; N·赫鲁什卡; S·卡姆勒; E·科勒; B·伦纳德; S·卢昂塞; S·莫尔; T·尼尔松; S·奥特森; L·佩德森; S·V·拉斯姆森; S·施密特; S·索英; D·特利; J·M·沃尔特
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2021-02-02
Filing date: 2022-02-02
Publication date: 2023-10-13

Abstract

本发明涉及增强反义寡核苷酸，其靶向端粒延伸解旋酶1调控因子(RTEL1)，引起对RTEL1表达的调节或对RTEL1活性的调节。本发明特别地涉及靶向RTEL1的增强反义寡核苷酸用于治疗和/或预防乙型肝炎病毒(HBV)感染，特别是慢性HBV感染的用途。本发明特别地涉及靶向RTEL1的所述增强反义寡核苷酸用于使cccDNA，诸如HBV cccDNA去稳定的用途。本发明还包括一种药物组合物及其在HBV感染的治疗和/或预防中的用途。

Description

用于抑制RTEL1表达的增强寡核苷酸

技术领域

本发明涉及靶向RTEL1(端粒延伸解旋酶1调控因子(Regulator of telomereelongation helicase 1))的增强反义寡核苷酸，导致RTEL1表达的调节或RTEL1活性的调节。本发明特别地涉及靶向RTEL1的增强反义寡核苷酸用于治疗和/或预防乙型肝炎病毒(HBV)感染，特别是慢性HBV感染的用途。本发明特别地涉及靶向RTEL1的增强反义寡核苷酸用于使cccDNA，诸如HBV cccDNA去稳定的用途。本发明还包括一种药物组合物及其在HBV感染的治疗和/或预防中的用途。

背景技术

乙型肝炎是一种由乙型肝炎病毒(HBV)引起的传染病，乙型肝炎病毒是一种小型的嗜肝病毒，其可通过反转录复制。慢性HBV感染是导致严重肝病(诸如肝硬化和肝细胞癌)的关键因素。目前对慢性HBV感染的治疗是基于施用聚乙二醇化的1型干扰素或核苷(核苷酸)类似物的，诸如拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦、替诺福韦二吡呋酯和替诺福韦艾拉酚胺，它们可靶向病毒聚合酶(一种多功能反转录酶)。治疗是否成功通常以乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的损失量来衡量。然而，由于感染后乙型肝炎病毒DNA仍然存在于体内，因此很难完全清除HBsAg。HBV持续性是由附加体形式的HBV基因组介导的，该基因组稳定地存在于细胞核中。这种附加体形式被称为“共价闭合环状DNA”(cccDNA)。cccDNA可作为所有HBV转录本的模板，包括前基因组RNA(pgRNA，一种病毒复制中间体)。少量cccDNA拷贝的存在可能足以再次引发HBV感染。目前对HBV的治疗并不针对cccDNA。然而，慢性HBV感染的治愈需要消除cccDNA(由Nassal,Gut.2015年12月；64(12):1972-84.doi:10.1136/Gutjnl-2015-309809综述)。

端粒延伸解旋酶1调控因子(RTEL1)编码一种DNA解旋酶，该DNA解旋酶在端粒的稳定性、保护和延伸中发挥作用，并与已知在DNA复制过程中保护端粒的保卫蛋白复合物(shelterin)中的蛋白质相互作用。该基因的突变与先天性角化不全和霍耶尔-赫里达斯(Hoyerall-Hreidarsson)综合征有关(参见例如Vannier等人的综述，2014Trends CellBiol.第24卷第416页)。

RTEL1位于细胞核中，作为一种ATP依赖性DNA解旋酶，参与端粒长度调节、DNA修复和基因组稳定性维持。RTEL1用作一种抗重组酶，可抵抗毒性重组并限制减数分裂过程中的交叉，以及通过物理解离链侵入事件来调节减数分裂重组和交叉稳态，从而通过减数分裂合成依赖性链退火(SDSA)和分解D环重组中间体来促进非交叉修复。另外，RTEL1可解构T-环并通过抵消端粒G4-DNA结构来预防端粒脆性，这些共同确保端粒的动态性和稳定性。

RTEL1已在siRNA筛选中被识别为HPV附加体的稳定剂：(Edwards等人，2013PLoSOne第8卷，e75406)。靶向RTEL1的siRNA同样已被用于在霍耶尔-赫里达斯综合征中识别与RTEL1的相互作用物(Schertzer等人，2015Nucleic Acid Res第43卷第1834页)。此外，从必需宿主蛋白的siRNA筛选中将RTEL1识别为HIV宿主依赖性因子，以提供用于抑制HIV感染的靶标(WO 2007/094818)。

在WO 2020/011902中，表明用反义寡核苷酸靶向RTEL1使得RTEL1减少。此外，还观察到对HBV感染参数(例如HBV cccDNA、pgRNA、HBsAg和HBeAg)的影响。

需要可以特异性抑制RTEL1的治疗剂。本发明已经筛选了超过1000种靶向人RTEL1的反义寡核苷酸，并鉴定了序列和化合物，它们对特异性靶向人RTEL1特别有效。具体来说，鉴定了四种LNA间隔聚体(gapmer)寡核苷酸，这在体外赋予了人RTEL1的明显下调。鉴定出的LNA间隔聚体寡核苷酸靶向人RTEL1前体mRNA的内含子区域。

发明目的

本发明提供调节RTEL1(“端粒延伸解旋酶1调控因子”)表达的反义寡核苷酸及其缀合物。本发明鉴定了存在于人RTEL1前体mRNA中的基因内靶序列，其可以由反义寡核苷酸或其缀合物靶向以给出有效的RTEL1抑制。特别地，就减少RTEL1而言，SEQ ID NO:1的靶向位置8681-8701或11753-11774是有利的。因此，本发明的一个目的是提供靶向RTEL1的增强反义寡核苷酸或其缀合物，其中反义寡核苷酸能够在体外和体内抑制RTEL1的表达，从而减少HBV感染的细胞中的cccDNA。靶向RTEL1的增强反义寡核苷酸或其缀合物可用于HBV感染的治疗。

发明内容

本发明提供了与RTEL1核酸互补并且能够抑制RTEL1核酸的表达的反义寡核苷酸或其缀合物，及其在医药中的用途。

本发明提供了一种反义寡核苷酸，其包含与人RTEL1前体mRNA(如SEQ ID NO:1所示)的区域互补，诸如完全互补的连续核苷酸序列，该区域诸如来自SEQ ID NO:1的核苷酸8681-8701或核苷酸11753-11774的区域。

在一些实施例中，反义寡核苷酸或连续核苷酸序列与SEQ ID NO:1的核苷酸8681至8701的区域互补，诸如完全互补。

在一些实施例中，反义寡核苷酸或连续核苷酸序列与来自SEQ ID NO:1的核苷酸11753-11774的区域互补，诸如完全互补，该区域诸如来自SEQ ID NO:1的核苷酸11757-11774、11756-11774、或11753-11770的区域。

本发明的反义寡核苷酸的长度通常为12至24个核苷酸，诸如12至22个核苷酸，诸如16至22个核苷酸，并且包含至少12个核苷酸的连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列与人RTEL1前体mRNA(如SEQ ID NO:1所示)的区域互补，诸如完全互补，该区域选自SEQ ID NO:1的核苷酸8681-8701和11753-11774。

本发明提供了长度为12至22个核苷酸的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包含长度为12至22个核苷酸的连续核苷酸序列，其中该连续核苷酸序列与SEQ ID NO 7、8、9和/或10互补，诸如完全互补。

本发明提供了长度为12个至22个核苷酸(诸如长度为15个、16个、17个、18个、19个或20个核苷酸)的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包含长度为12个至18个核苷酸(诸如长度为15个、16个、17个或18个核苷酸)的连续核苷酸序列，其中该连续核苷酸序列与SEQID NO 11互补，诸如完全互补。

本发明提供长度为10个至30个核苷酸的反义寡核苷酸，其包含长度为10个至30个核苷酸的连续核苷酸序列，其中该连续核苷酸序列与选自由以下项组成的组的序列100％相同：SEQ ID NO:3、4、5和6；或其至少14个连续核苷酸。

本发明提供长度为10个至30个核苷酸的反义寡核苷酸，其包含长度为10个至30个核苷酸的连续核苷酸序列，其中该连续核苷酸序列与选自由以下项组成的组的序列100％相同：SEQ ID NO:3、4、5和6；或其至少15个连续核苷酸。

本发明提供长度为10个至30个核苷酸的反义寡核苷酸，其包含长度为10个至30个核苷酸的连续核苷酸序列，其中该连续核苷酸序列与选自由以下项组成的组的序列100％相同：SEQ ID NO:3、4、5和6；或其至少16个连续核苷酸。

本发明提供了一种反义寡核苷酸，其包含与选自由以下项组成的组的序列100％相同的连续核苷酸序列：SEQ ID NO:3、4、5和6，或其至少14个连续核苷酸。

本发明提供了一种反义寡核苷酸，其包含选自由以下项组成的组的连续核苷酸序列：SEQ ID NO:3、4、5和6。

本发明提供了一种反义寡核苷酸，其包含与以下项100％相同的连续核苷酸序列：SEQ ID NO:3(AATTTTACATACTCTGGT)或其至少14、15、16或17个连续核苷酸。

本发明提供了一种反义寡核苷酸，其包含与以下项100％相同的连续核苷酸序列：SEQ ID NO:4(AATTTTACATACTCTGGTC)或其至少14、15、16、17或18个连续核苷酸。

本发明提供了一种反义寡核苷酸，其包含与以下项100％相同的连续核苷酸序列：SEQ ID NO:5(TTACATACTCTGGTCAAA)或其至少14、15、16或17个连续核苷酸。

本发明提供了一种反义寡核苷酸，其包含与以下项100％相同的连续核苷酸序列：SEQ ID NO:6(CTTTATTATAACTTGAATCTC)或其至少14、15、16、17、18、19、20或21个连续核苷酸。

本发明提供了反义寡核苷酸，其包含选自由化合物ID No 3_1、4_1、5_1和6_1组成的组的化合物的连续核苷酸(参见例如下表6)。

在一些实施例中，反义寡核苷酸不是选自由WO 2020/011902 A1的化合物ID No36_1、35_1、33_1、34_1和37_1组成的组的反义寡核苷酸(参见例如WO 2020/011902 A1的表6)。

在一些实施例中，反义寡核苷酸不是WO 2020/011902 A1的反义寡核苷酸化合物ID No 23_1(参见例如WO 2020/011902 A1的表6)。

本发明提供了一种选自表1中列出的组的反义寡核苷酸或其药用盐。

本发明提供了选自由以下项组成的组的反义寡核苷酸：AATTttacatactctgGT(SEQID NO:3，化合物ID No 3_1)，AAttttacatactctGGTC(SEQ ID NO:4，化合物ID No 4_1)，TTacatactctggtCAAA(SEQ ID NO:5，化合物ID No 5_1)以及CTttattataactTgaAtCTC(SEQID NO:6，化合物ID No 6_1)，其中大写字母为β-D-氧基LNA核苷，小写字母为DNA核苷，所有LNA C均为LNA 5-甲基胞嘧啶，并且所有核苷间键(linkage)均为硫代磷酸酯核苷间键。

本发明还提供了本发明的反义寡核苷酸的药用盐。

表1化合物表(本发明的示例性反义寡核苷酸)-HELM注释格式

Helm注释索引：

[LR](G)是β-D-氧基-LNA鸟嘌呤核苷，

[LR](T)是β-D-氧基-LNA胸腺嘧啶核苷，

[LR](A)是β-D-氧基-LNA腺嘌呤核苷，

[LR]([5meC])是β-D-氧基-LNA 5-甲基胞嘧啶核苷，

[dR](G)是DNA鸟嘌呤核苷，

[dR](T)是DNA胸腺嘧啶核苷，

[dR](A)是DNA腺嘌呤核苷，

[dR](C)是DNA胞嘧啶核苷，

[sP]是硫代磷酸酯核苷间键，

P是磷酸二酯核苷间键。

因此，本发明提供了一种反义寡核苷酸，该反义寡核苷酸选自由化合物ID号#3_1、4_1、5_1和6_1组成的组。

本发明进一步提供了包含本发明的反义寡核苷酸以及与所述反义寡核苷酸共价连接的至少一个缀合物部分的缀合物。

在一些实施例中，缀合物部分能够结合脱唾液酸糖蛋白受体，诸如人脱唾液酸糖蛋白受体。例如，缀合物部分可包含至少一个选自由以下项组成的组的脱唾液酸糖蛋白受体靶向部分：半乳糖、半乳糖胺、N-甲酰基-半乳糖胺、N-乙酰半乳糖胺、N-丙酰基-半乳糖胺、N-正丁酰基-半乳糖胺和N-异丁酰基半乳糖胺。

在一些实施例中，脱唾液酸糖蛋白受体靶向部分是N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。因此，本发明的反义寡核苷酸可以缀合至至少一个包含至少一个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分的缀合物部分，诸如至少一个包含至少一个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分的缀合物部分，如下所述。根据本发明的一方面，缀合物部分是如下文所述的GalNAc残基R。

在一些实施例中，缀合物部分是至少三价的，诸如二价、三价或四价GalNAc残基R。优选地，缀合物部分是三价GalNAc残基R。如本文所用，术语“三价GalNAc残基”是指包含三个N-乙酰半乳糖胺部分的残基，即优选地下式的三个部分

缀合物部分或GalNAc残基R可经由接头L(诸如可生物裂解的接头L)分别与反义寡核苷酸连接在一起。因此，缀合物化合物可包含接头L，其分别位于反义寡核苷酸和缀合物部分或GalNAc残基R之间。

在一个实施例中，缀合物部分是三价N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)，诸如图5所示的那些。在一个实施例中，缀合物部分是图5A-1或图5A-2的三价N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)或者两者的混合物。在一个实施例中，缀合物部分是图5B-1或图5B-2的三价N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)或者两者的混合物。在一个实施例中，缀合物部分是图5C-1或图5C-2的三价N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)或者两者的混合物。在一个实施例中，缀合物部分是图5D-1或图5D-2的三价N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)或者两者的混合物。缀合物部分和反义寡核苷酸可以经由接头诸如生物可生物裂解的接头连接。因此，缀合物化合物可包含接头，其位在介于该反义寡核苷酸与该缀合物部分之间。

在一些实施例中，接头包含1个至10个连接的核苷或由其组成，诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连接的核苷，诸如2个至6个连接的核苷，诸如2个至5个连接的核苷，诸如2个至4个连接的核苷。在一些实施例中，接头包含两个连接的核苷酸。因此，核苷可以是DNA核苷。通常，核苷经由磷酸二酯核苷间键连接。此外，接头可以经由磷酸二酯核苷间键与反义化合物连接。

表2中提供了示例性缀合物(采用HELM注释格式)。除了表1中所示的化合物之外，化合物还包含两个核苷酸“ca”作为5’末端的可裂解接头。这是表2中序列的HELM注释的一部分。GalNAc介导的递送成功后，可裂解接头被裂解，留下化合物作为活性药物。

本发明提供了一种选自表2中列出的缀合物的组的缀合物或其药用盐。

表2.化合物表(本发明的示例性缀合物)-HELM注释格式(关于HELM注释的注释，参见表1的解释)。

在上表中，5gn2c6是图5D-1或图5D-2的三价N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)或者两者的混合物。在一些实施例中，5gn2c6是具有下式的GalNAc残基R：

应当理解，如上图中所示的R是图5D1和图5D2中所示的两种立体异构体的混合物。

根据本发明的另一方面，如上图中所示的R是如图5D1所示的立体异构体。

根据本发明的另一方面，如上图中所示的R是如图5D2所示的立体异构体。表2中提供的缀合物的结构如图1至4所示。

本发明提供了图1的缀合物或其药用盐。本发明提供了化合物ID号3_1的反义寡核苷酸或其药用盐。

本发明提供了图2的缀合物或其药用盐。本发明提供了化合物ID号4_1的反义寡核苷酸或其药用盐。

本发明提供了图3的缀合物或其药用盐。本发明提供了化合物ID号6_1的反义寡核苷酸或其药用盐。

本发明提供了图4的缀合物或其药用盐。本发明提供了化合物ID号5_1的反义寡核苷酸或其药用盐。

式(I)化合物

本发明还提供了下式(I)的化合物

其中

n为0或1

p为0或1

条件是在n为1的情况下，p优选地为1，

以及条件是在n为0并且p为0的情况下，R优选地为H，

L为接头，优选地L为包含2个至10个核苷或由其组成的接头，诸如2个至5个核苷，

R为GalNAc残基，优选地为三价GalNAc残基，

A为根据本发明的反义寡核苷酸残基。

术语“反义寡核苷酸残基”是指根据本发明的反义寡核苷酸，其经由-(L)_n-(O-P(＝O)(-OH)-)_p-经由其5'末端连接至残基R，诸如表6所示的反义寡核苷酸。优选的反义寡核苷酸残基在图1A、图2A、图3A、图4A、图5A、图6A、图7A和图8A中描绘。

GalNAc残基R

R为GalNAc残基，优选地为三价GalNAc残基。如本文所用，术语“GalNAc残基”是指包含至少一个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分的残基，即下式的至少一个部分

如本文所用，术语“三价GalNAc残基”是指包含三个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分的残基，即优选地为下式的三个部分

优选地，GalNAc残基包含至少一个(优选地三个)具有以下结构的GalNAc结构单元(L^a)，

其中接头^a选自烷基基团、烷基-氧基-烷基基团、包含至少一个磷酸二酯键的烷基基团、包含至少一个酰胺键的烷基基团、包含至少一个磷酸二酯键的烷基-氧基-烷基基团和包含至少一个酰胺键的烷基-氧基-烷基基团。

术语“烷基”是指取代或未取代的直链或支链烷基基团，诸如C1至C20烷基基团，优选地，C2至C8，诸如C2、C3、C4、C5、C6、C7或C8烷基基团。优选地，烷基基团是未取代的，更优选地直链和未取代的烷基基团。

术语“烷基-氧基-烷基”是指至少两个经由氧连接的烷基基团，优选地与乙基-氧基-乙基连接，诸如-(CH₂-O)_x-基团，具有整数x，x优选地在2至20的范围内，更优选地在2至6的范围内，诸如2、3、4、5或6，更优选地x为3或5。

根据本发明的一个方面，GalNAc结构单元(L^a)选自以下结构(L^a)的组。

如果多于一个残基(L^a)存在于GalNAc残基中，诸如三价GalNAc残基中的三个残基，则所有残基优选地相同。

最优选地，L^a具有结构

在这种情况下，缀合物部分R包含多个，诸如优选地三个GalNAc部分，R除了GalNAc结构单元(L^a)之外，还包含多价，优选地四价结构单元(L^b)，结构单元(L^a)优选地经由-(L)_n-(O-P(＝O)(-OH)-)p-_p-连接至反义寡核苷酸残基A。

L^b优选地选自一下结构之一：

X为O或S，且Z为O或NH，且其中n为1至4，优选地为2或3，更优选地为2。

更优选地，L^b具有以下结构

应当理解，L^b具有结构L^b*或结构L^b**或其混合物。根据优选的方面，L^b为L^b*和L^b**的混合物。：

因此，缀合物部分R优选地包含结构(L^a)₃-L^b-，更优选地R包含以下结构之一

更优选地，结构

其中L^b优选地为L^b*和L^b**的混合物，

并且其中X为O或S，且Z为O或NH，且其中n为1至3，优选地为2，且L^a如上所述，优选地为L^a选自由以下项组成的组

及其混合物，其中优选地GalNAc残基内的所有残基(L^a)相同。

如果(L^a)₃-L^b为

L^a更优地选自由以下项组成的组

如果(L^a)₃-L^b为

优选地，

L^a优选地

任选地，缀合物部分R另外包含接头L^c。因此，R优选地具有结构(L^a)₃-L^b-(L^c)_c-具有1或0的整数c。

这样的接头化合物是本领域技术人员已知的并且被适当地选择以将(L^a)₃-L_b连接到化合物的剩余部分，即经由-(L)_n-(O-P(＝O)(-OH)-)_p-连接至反义寡核苷酸残基。

根据L^b的结构，L^c选自由以下项组成的组：烷基、烷基-氧基-烷基、氨基-烷基(-NH-烷基-)、氨基-烷基-氧基-烷基、非天然氨基酸残基和天然氨基酸残基。根据本发明的一个方面，L^c为取代或未取代的赖氨酸基团。

根据本发明的一个方面，R为(L^a)₃-L^b-(L^c)_c，其中c＝1并且(L^a)₃-L_b为

L^c优选地为氨基-烷基或氨基酸，诸如取代或未取代的赖氨酸基团，特别是

L^C为例如选自由以下项组成的组

氨基与L^b的羰基相连，形成酰胺键。根据该方面的优选的残基R在图5A1、图5A2、图5C1、图5C2、图5D1、图5D2中描绘。因此，根据本发明的一个方面，R选自在图5A1、图5A2、图5C1、图5C2、图5D1和图5D2中描绘的残基。

根据本发明的另一方面，R具有结构(L^a)₃-L^b-(L^c)_c，其中c为0，并且其中(L^a)₃-L_b为

根据本发明该方面的优选残基R在图5B1和图5B2中描绘。

根据本发明的另一方面，R具有结构(L^a)₃-L^b-(L^c)_c与(L^a)₃-L_b

并且Z为O。此时，c优选地为1，L^c优选地为烷基，更优选地为C3～C6烷基，更优选地为丙基，最优选地为正丙基基团。根据该方面的优选的残基R在图5E1、图5F1、图5G1和图5H1中描绘。因此，根据本发明的一个方面，R选自由在图5E1、图5F1、图5G1和图5H1中描绘的残基组成的组。

并且Z为NH。在这种情况下，c优选地为1且L^c优选地为烷基基团、包含氨基酸的基团或具有以下结构的基团：

特别地，在这种情况下L^c为

根据本发明该方面的优选残基R在图5J1中描绘。

并且Z为NH，并且c为0。根据本发明该方面的优选残基R在图5I1中描绘。

根据本发明的一个方面，R为(L^a)₃-L^b-(L^c)_c，其中c＝0并且其中(L^a)₃-L_b为

根据本发明该方面的优选残基R在图5L1和图5L2中描绘。

因此，R优选地选自在图5A1、图5A2、图5B1、图5B2、图5C1、图5C2、图5D1、图5D2、图5E1、图5F1、图5G1、图5H1、图5I1、图5J1、图5L1、图5L2中描绘的残基及其混合物，诸如图5A1和图5A2、图5B1和图5B2、图5C1和图5C2或图5D1和图D2的立体异构混合物；更优选地R为选自图5D1、图5D2中描绘的残基及其混合物，更优选地R为图5D1和图5D2中描绘的残基的混合物，诸如具有在10:90至90:10的范围内的5D1与5D2的摩尔比的混合物，诸如在30:70至70:30的范围内，诸如在45:55至55:45的范围内。

因此，化合物(I)优选地选自在图6A1、图6A2、图6B1、图6B2、图6C1、图6C2、图6D1、图6D2、图6E1、图6F1、图6G1、图6H1、图6I1、图6J1、图6L1、图6L2中描绘的化合物及其混合物，诸如图6A1和图6A2、图6B1和图6B2、图6C1和图6C2或图6D1和图6D2的立体异构混合物；更优选地化合物(I)选自由以下组成的组：图6D1、图6D2中描绘的化合物及其混合物，更优选地化合物(I)为图6D1和图6D2中描绘的化合物的混合物，诸如具有6D1与6D2的摩尔比在10:90至90:10的范围内，诸如在30:70至70:30的范围内，诸如在45:55至55:45的范围内的混合物。

接头L

上式中，L为如本文所定义的接头，优选地L为包含2个至10个核苷或由其组成的接头，诸如2个至5个核苷，诸如2个核苷，其中任选地，核苷为磷酸二酯连接的核苷。

如接头L包含1个至10个连接的核苷，诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连接的核苷，诸如2个至6个连接的核苷，诸如2个至5个连接的核苷，诸如2个至4个连接的核苷。在一些实施例中，接头包含两个连接的核苷酸。因此，核苷可以是DNA核苷。通常，核苷经由磷酸二酯核苷间键连接。此外，接头L可以经由磷酸二酯核苷间键与反义化合物连接。此外，接头L经由合适的官能团连接至缀合物部分R，诸如例如经由酰胺、胺、醚、酯、磷酸二酯(-O-P(＝O)(-OH)-O-)或硫代磷酸二酯(-O-P(＝S)(-OH)-O-)连接。应当理解，L可以任选地在核苷和将L连接到R的官能团之间另外包含烷基基团或烷基-氧基-烷基基团。在这种情况下，核苷优选地经由磷酸二酯键连接到烷基基团或烷基-氧基-烷基基团又经由合适的官能团连接到R，诸如例如经由酰胺、胺、醚、酯、磷酸二酯(-O-P(＝O)(-OH)-O-)或硫代磷酸二酯(-O-P(＝S)(-OH)-O-)键。

根据优选的实施例，L为

反义(A)寡核苷酸残基

A为根据本发明的反义寡核苷酸残基，诸如表6中所示的反义寡核苷酸，经由其5′引物端连接至R经由-(L)_n-(O-P(＝O)(-OH)-)_p。优选地，A是选自图1A、2A、3A和4中描绘的残基的反义寡核苷酸残基。

因此，化合物(I)优选地选自在图6A1、图6A2、图6B1、图6B2、图6C1、图6C2、图6D1、图6D2、图6E1、图6F1、图6G1、图6H1、图6I1、图6J1、图6L1、图6L2中描绘的化合物及其混合物，诸如图6A1和图6A2、图6B1和图6B2或图6C1和图6C2或图6D1和图6D2的立体异构混合物；更优选化合物(I)选自图6D1和图6D2中描绘的化合物及其混合物，更优选地化合物(I)为化合物6D1和化合物6D2的混合物，优选地A选自表6中所示的反义寡核苷酸，优选A为选自图1A、图2A、图3A、图4A、图5A、图6A、图7A和图8A中描绘的残基的反义寡核苷酸残基。并且L为包含2个至10个核苷或由其组成的接头，诸如2个至5个核苷，诸如2个核苷，其中任选地核苷是磷酸二酯连接的核苷，

更优选地，其中L为

/>

在另一方面，R为具有结构(I)的残基

L为如本文所定义的接头，优选地L为包含2个至10个核苷或由其组成的接头，诸如2个至5个核苷，诸如2个核苷，其中任选地，核苷为磷酸二酯连接的核苷，更优选地L为

并且

A为根据本发明的反义寡核苷酸，诸如表6中所示的反义寡核苷酸。

根据本发明的一个方面，A为选自在图1A、图2A、图3A和图4A中描绘的残基的反义寡核苷酸残基，

例如A是下式的反义寡核苷酸：

本发明提供了包含本发明的反义寡核苷酸或其缀合物以及药用稀释剂、载体、盐和/或佐剂的药物组合物。

本发明提供了本发明的反义寡核苷酸的药用盐，或其缀合物。在一些实施例中，药用盐选自由钠盐、钾盐和铵盐组成的组。

本发明提供了本发明的反义寡核苷酸或其缀合物的药物溶液，其中该药物溶液包含本发明的反义寡核苷酸或其缀合物以及药用溶剂，诸如盐水。

本发明提供了以固体粉末形式的本发明的反义寡核苷酸或其缀合物，诸如冻干粉末的形式。

本发明提供了本发明的反义寡核苷酸的药用盐，或其缀合物。

本发明提供了根据本发明的反义寡核苷酸或本发明的缀合物的药用盐，其中该药用盐是钠盐或钾盐。

本发明提供了药物组合物，该药物组合物包含本发明的反义寡核苷酸或本发明的缀合物、或本发明的盐，以及药用稀释剂、溶剂、载体、盐和/或佐剂。

本发明提供了用于抑制表达RTEL1的靶细胞中RTEL1表达的方法，所述方法包括向所述细胞施用有效量的本发明的反义寡核苷酸、或本发明的缀合物、或本发明的盐或本发明的组合物。该方法可为体内方法或体外方法。

本发明提供了一种用于治疗和/或预防受试者(诸如人)的HBV感染的方法，该方法包括施用治疗或预防有效量的本发明的反义寡核苷酸，或本发明的缀合物，或本发明的盐或本发明的组合物，诸如治疗和/或预防HBV感染，诸如慢性HBV感染。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸、或本发明的缀合物、或本发明的盐或本发明的药物组合物在治疗和/或预防HBV感染，诸如慢性HBV感染中的用途。

本发明提供了用于医药中的本发明的反义寡核苷酸、或本发明的缀合物、或本发明的药物组合物或盐。

在另一方面，本发明提供了用于抑制表达RTEL1的靶细胞中RTEL1表达的方法，其通过向所述细胞施用有效量的本发明的反义寡核苷酸或本发明的缀合物来实施。在另一方面，本发明提供了用于通过向表达RTEL1的靶细胞施用有效量的本发明的反义寡核苷酸，或本发明的缀合物来抑制靶细胞中RTEL1表达的体内或体外方法的方法。例如，细胞可以是人细胞，诸如肝细胞(liver cell)，诸如肝细胞(hepatocyte)。

在另一方面，本发明提供用于减少HBV感染的细胞中的cccDNA的方法，通过向所述细胞施用有效量的本发明的反义寡核苷酸、或本发明的缀合物。在另一方面，本发明提供了用于减少HBV感染的细胞中的cccDNA的体内或体外方法，通过向所述细胞施用有效量的本发明的反义寡核苷酸、或本发明的缀合物。

在另一方面，本发明提供了用于治疗和/或预防HBV感染诸如慢性HBV感染的方法。

在另一方面，本发明的反义寡核苷酸、或本发明的缀合物、或本发明的药物组合物用于治疗和/或预防病毒性肝脏感染，诸如HBV、HCV、HDV或寄生虫感染如疟疾、弓形虫病、利什曼病和锥虫病或肝癌或肝脏转移。

在另一方面，本发明提供了本发明的反义寡核苷酸或缀合物或本发明的药物组合物，其用于制备用于治疗和/或预防HBV感染，诸如慢性HBV感染的药物。

在另一方面，本发明提供了用于制备抗病毒药物的反义寡核苷酸、或本发明的缀合物或本发明的药物组合物。

本发明提供了本发明的反义寡核苷酸、或本发明的缀合物、或本发明的药物组合物，其用于治疗HBV感染，诸如慢性HBV感染。

序列表

与本申请一起提交的序列表通过引用并入本文。如果序列表与本说明书或附图不一致，本说明书(包括附图)中所公开的信息应视为正确。

附图说明

图1化合物3_1(SEQ ID NO:3)经由磷酸二酯连接的DNA二核苷酸缀合至三价GalNAc部分

图1A化合物3_1(SEQ ID NO:3)的残基A

图2化合物4_1(SEQ ID NO:4)经由磷酸二酯连接的DNA二核苷酸缀合至三价GalNAc部分

图2A化合物4_1(SEQ ID NO:4)的残基A

图3化合物6_1(SEQ ID NO:6)经由磷酸二酯连接的DNA二核苷酸缀合至三价GalNAc部分

图3A化合物6_1(SEQ ID NO:6)的残基A

图4化合物5_1(SEQ ID NO:5)经由磷酸二酯连接的DNA二核苷酸缀合至三价GalNAc部分

图4A化合物5_1(SEQ ID NO:5)的残基A

图5图5示出了示例性GalNAc部分。图5L中的化合物由单体GalNAc亚磷酰胺组成，该亚磷酰胺作为合成的一部分添加至寡核苷酸，同时仍在固体支持物上，X为S或O，Y为S或O并且n＝1至3(参见WO 2017/178656)。图5B和图5D在本文中也被称为GalNAc2或GN2，其分别不带有和带有C6接头。

图6图6A-L：示出了示例性反义寡核苷酸缀合物，其中寡核苷酸由如上所述的术语“A”表示。图6A-D中的化合物包含二赖氨酸支链分子，PEG3间隔物和三个末端GalNAc碳水化合物部分。在图6A(图6A-1和图6A-2示出了同一化合物的两种不同非对映异构体)和图6B(图6B-1和图6B-2示出了同一化合物的两种不同非对映异构体)的化合物中，寡核苷酸在无烷基接头的情况下直接连接至脱唾液酸糖蛋白受体靶向缀合物部分。在图6C(图6C-1和图6C-2示出了同一化合物的两种不同非对映异构体)和图6D(图6D-1和图6D-2示出了同一化合物的两种不同非对映异构体)的化合物中，寡核苷酸经由C6接头连接至脱唾液酸糖蛋白受体靶向缀合物部分。图6E-J中的化合物包含可商业获得的三倍体支链分子和不同长度和结构的间隔物以及三个末端GalNAc碳水化合物部分。图6L1和6L2中的化合物由单体GalNAc亚磷酰胺组成，该亚磷酰胺作为合成的一部分添加至寡核苷酸，同时仍在固体支持物上，其中X＝S或O且独立地Y＝S或O并且n＝1至3(参见WO 2017/178656)。

图7：体外测试寡核苷酸CMP ID No 3_1、4_1、5_1和6_1在人细胞系MDA-MB-231中的浓度依赖性效力和功效。

图8：体外测试寡核苷酸CMP ID No 3_1、4_1、5_1和6_1以及现有技术化合物(CMPID No 7_1至23_1)在人细胞系MDA-MB-231中的浓度依赖性效力和功效。

图9：体外测试寡核苷酸反义分子及其较短的代谢物在人细胞系MDA-MB-231中的浓度依赖性效力和功效。A)CMP ID 5_1，B)CMP ID 7_1，C)CMP ID 8_1，D)CMP ID 9_1，E)CMP ID 10_1。

图10：用GalNAc缀合的CMP ID 5_1处理的小鼠体内分析的研究方案

图11：用GalNAc缀合的寡核苷酸反义CMP ID No 3_1和5_1处理的PXB小鼠肝组织中RTEL1 mRNA的水平

图12：用GalNAc缀合的CMP ID 5_1处理的HBV感染PXB小鼠体内分析的研究方案。

图13：用GalNAc缀合的CMP ID 5_1和对照处理的HBV感染PXB小鼠肝组织中RTEL1mRNA水平和HBV cccDNA水平：A)第105天，B)第56天。

定义

HBV感染

术语“乙型肝炎病毒感染”或“HBV感染”在本领域中是公知的，是指由乙型肝炎病毒(HBV)引起并影响肝脏的传染病。HBV感染可以是急性或慢性感染。慢性乙型肝炎病毒(CHB)感染是一种全球性疾病难题，影响着全球2.48亿人。每年约有686,000例死亡归因于HBV相关的晚期肝病和肝细胞癌(HCC)(GBD 2013；Schweitzer等人，2015)。WHO预测，如果不加大干预措施，未来40至50年内，CHB感染者的人数将保持在目前的高水平，2015年至2030年之间累计死亡人数将达到2000万(WHO 2016)。CHB感染不是具有单一临床表现的同质性疾病。感染者在其一生中经历了与CHB相关的肝病的几个阶段，这些疾病阶段也是采用标准护理(SOC)治疗的基础。目前的指南建议基于三个标准(血清ALT水平、HBV DNA水平和肝病严重程度)，仅对选定的CHB感染者进行治疗(EASL，2017)。该建议归因于SOC(即核苷(核苷酸)类似物(NAs)和聚乙二醇化干扰素-α(PEG-IFN))无法治愈，必须长期施用从而增加其安全风险的事实。NAs可以有效抑制HBV DNA复制；然而，它们对其他病毒标记物的作用非常有限/没有影响。HBV感染的两个标志，即乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和共价闭合环状DNA(cccDNA)，是针对治愈HBV的新药的主要目标。在CHB个体的血浆中，HBsAg亚病毒(空)颗粒数超过HBV病毒粒子10³到10⁵倍(Ganem&Prince，2014)；据信，其过量可能导致该疾病的免疫发病机制，包括个体无法产生中和性抗HBs抗体，这是在急性HBV感染消退后观察到的血清学标记物。

cccDNA(共价闭合环状DNA)

cccDNA是位于感染的肝细胞的细胞核中的病毒基因模板，其中它会产生增值性感染所需的所有HBV RNA转录本，并在慢性HBV感染的自然过程中对病毒的持续性起主要作用(Locarnini&Zoulim,2010Antivir Ther.15Suppl 3:3-14.doi:10.3851/IMP1619)。cccDNA用作病毒库，是停止治疗后病毒反弹的来源，因此需要长期(通常是终生)治疗。由于各种副作用，因此PEG-IFN仅可施用于一小部分CHB。

因此，大多数CHB患者迫切需要新的治疗方法，即通过降解或清除HBV cccDNA来实现完全治愈。

化合物

在本文中，术语“化合物”是指能够抑制RTEL1表达或活性的任何分子。本发明的特别化合物是根据本发明的反义寡核苷酸或包含这种核酸分子的任何缀合物。例如，本文中化合物可以是靶向RTEL1的核酸分子，特别是反义寡核苷酸。

寡核苷酸

如本文所用，术语“寡核苷酸”如本领域技术人员通常理解的那样被定义为包含两个或更多个共价连接的核苷的分子。此类共价结合的核苷也可被称为核酸分子或寡聚物。寡核苷酸通常是在实验室中制作，先经固相化学合成后再加以纯化和分离。当提及寡核苷酸的序列时，提及的是共价联接的核苷酸或核苷的核碱基部分或其修饰的序列或顺序。本发明的寡核苷酸是人造的，并且是化学合成的，并且通常是纯化或分离的。本发明的寡核苷酸可包含一个或多个修饰的核苷，诸如2′糖修饰的核苷。本发明的寡核苷酸可包含一个或多个修饰的核苷间键，诸如一个或多个硫代磷酸酯核苷间键。

反义寡核苷酸

如本文所用的术语“反义寡核苷酸”定义为能够通过与靶核酸特别是与靶核酸上的连续序列杂交来调节靶基因表达的寡核苷酸。反义寡核苷酸基本上不是双链的，因此不是siRNA或shRNA。优选地，本发明的反义寡核苷酸为单链的。应理解的是，只要序列内或序列间自身互补的程度低于跨寡核苷酸全长的50％，本发明的单链寡核苷酸便可形成发夹或分子间双链体结构(同一寡核苷酸的两个分子之间的双链体)。

在一些实施例中，本发明的单链反义寡核苷酸可以不含RNA核苷。

有利的是，本发明的反义寡核苷酸包含一个或多个经修饰的核苷或核苷酸，诸如2′糖修饰的核苷。此外，优选的是未修饰的核苷是DNA核苷。

连续核苷酸序列

术语“连续核苷酸序列”是指寡核苷酸的与靶核酸互补的区域。该术语在本文中与术语“连续核碱基序列”和术语“寡核苷酸基序序列”可互换使用。在一些实施例中，寡核苷酸的所有核苷构成连续核苷酸序列。在一些实施例中，寡核苷酸包含连续核苷酸序列，诸如F-G-F′间隔聚体区域，并且可任选地包含其他核苷酸，例如可用于将官能团(例如缀合物基团)连接至连续核苷酸序列的核苷酸接头区域。核苷酸接头区域可与靶核酸互补或不互补。在一些实施例中，反义寡核苷酸的核碱基序列是连续核苷酸序列。

核苷酸和核苷

核苷酸和核苷是寡核苷酸和多核苷酸的组成部分，并且出于本发明的目的，包括天然存在的和非天然存在的核苷酸和核苷。在自然界中，核苷酸，诸如DNA和RNA核苷酸包含核糖糖部分、核碱基部分和一个或多个磷酸酯基团(其不存在于核苷中)。核苷和核苷酸也可以可互换地称为“单元”或“单体”。

修饰的核苷

如本文所用，术语“修饰的核苷”或“核苷修饰”是指与等同的DNA或RNA核苷相比，通过引入糖部分或(核)碱基部分的一种或多种修饰而被修饰的核苷。有利地，本发明的反义寡核苷酸的一种或多种修饰的核苷包含修饰的糖部分。术语“修饰的核苷”在本文中还可与术语“核苷类似物”或修饰的“单元”或修饰的“单体”互换使用。具有未修饰的DNA或RNA糖部分的核苷在本文中被称为DNA或RNA核苷。在DNA或RNA核苷的碱基区域中具有修饰的核苷如果允许沃森克里克(Watson Crick)碱基配对，则通常仍称为DNA或RNA。

修饰的核苷间键

如技术人员通常所理解的，术语“修饰的核苷间键”定义为除磷酸二酯(PO)键以外的键，其将两个核苷共价偶联在一起。因此，本发明的寡核苷酸可包含一个或多个经修饰的核苷间键，诸如一个或多个硫代磷酸酯核苷间键，或一个或多个二硫代磷酸酯核苷间键。

在一些实施例中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列中至少50％的核苷间键是硫代磷酸酯，寡核苷酸或其连续核苷酸序列中的诸如至少60％、诸如至少70％、诸如至少75％、诸如至少80％或诸如至少90％的核苷间键是硫代磷酸酯。在一些实施例中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列的全部核苷间键均为硫代磷酸酯。

在一些有利实施例中，寡核苷酸的连续核苷酸序列的所有核苷间键均为硫代磷酸酯，或寡核苷酸的所有核苷间键均为硫代磷酸酯键。

应当认识到，如EP 2 742 135中所公开的，反义寡核苷酸可包含其他核苷间键(除磷酸二酯、硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯以外)，例如烷基膦酸酯/甲基膦酸酯核苷间，其根据EP 2 742 135可以例如以其他方式被DNA硫代磷酸酯的间隔区域中所耐受。

核碱基

术语核碱基包括存在于核苷和核苷酸中的嘌呤(例如腺嘌呤和鸟嘌呤)和嘧啶(例如尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶)部分，其在核酸杂交中形成氢键。在本发明的上下文中，术语核碱基还包括修饰的核碱基，其可不同于天然存在的核碱基，但在核酸杂交过程中为功能性的。在此上下文中，“核碱基”是指天然存在的核碱基，诸如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸苷、尿嘧啶、黄嘌呤和次黄嘌呤，以及非天然存在的变体。此类变体例如描述于Hirao等人(2012)，Accounts of Chemical Research，第45卷第2055页和Bergstrom(2009)CurrentProtocols in Nucleic Acid Chemistry，增刊37 1.4.1中。

在一些实施例中，通过以下方式修饰核碱基部分：将嘌呤或嘧啶改变为修饰的嘌呤或嘧啶，诸如取代的嘌呤或取代的嘧啶，诸如选自异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑并-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-噻唑并-尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶、2’-硫代-胸腺嘧啶、肌苷、二氨基嘌呤、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤的核碱基。

核碱基部分可由每个相应核碱基的字母代码来表示，例如A、T、G、C或U，其中每个字母可任选地包括具有同等功能的修饰的核碱基。例如，在示例性的寡核苷酸中，核碱基部分选自A、T、G、C和5-甲基胞嘧啶。任选地，对于LNA间隔聚体，可使用5-甲基胞嘧啶LNA核苷。

修饰的寡核苷酸

术语经修饰的寡核苷酸描述了一种寡核苷酸，其包含一个或多个糖修饰的核苷和/或修饰的核苷间键。术语“嵌合”寡核苷酸是已在文献中用于描述包含修饰的核苷和DNA核苷的寡核苷酸的术语。本发明的反义寡核苷酸优选地是嵌合寡核苷酸。

互补性

术语“互补性”描述了核苷/核苷酸的Watson-Crick碱基配对的能力。沃森克里克碱基对为鸟嘌呤(G)-胞嘧啶(C)和腺嘌呤(A)-胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)。应当理解，寡核苷酸可包含具有修饰的核碱基的核苷，例如经常使用5-甲基胞嘧啶代替胞嘧啶，因此，术语互补性涵盖未修饰的核碱基和修饰的核碱基之间的沃森克里克碱基配对(参见例如Hirao等人(2012)Accounts of Chemical Research，第45卷第2055页和Bergstrom(2009)CurrentProtocols in Nucleic Acid Chemistry，增刊37 1.4.1)。

如本文所用，术语“互补性百分比”是指核酸分子(例如寡核苷酸)中连续核苷酸序列的与参考序列(例如靶序列或序列基序)互补的核苷酸的比例(以百分比表示)，该核酸分子跨连续核苷酸序列。因此，通过计数两个序列之间(当与靶序列5'-3’和3'-5’的寡核苷酸序列比对时)互补(形成Watson Crick碱基对)的对准的核碱基数，将其除以寡核苷酸中核苷酸的总数，然后乘以100，来计算互补性的百分比。在这种比较中，未对齐(形成碱基对)的核碱基/核苷酸被称为错配。在计算连续核苷酸序列的互补性百分比时，不允许插入和删除。应当理解，在确定互补性时，只要保留了形成Watson Crick碱基配对的核碱基的功能能力，就不考虑核碱基的化学修饰(例如，在计算互补性百分比时，认为5'-甲基胞嘧啶与胞嘧啶相同)。

术语“完全互补”是指100％互补性。

同一性

如本文所用，术语“同一性”是指核酸分子(例如寡核苷酸)中连续核苷酸序列的与参考序列(例如序列基序)相同的核苷酸比例(以百分比表示)，该核酸分子跨连续核苷酸序列。因此，通过计数两个序列(在本发明的化合物的连续核苷酸序列中和在参考序列中)相同(匹配)的对准核碱基数，将该数除以寡核苷酸的核苷酸总数再乘以100，来计算同一性百分比。因此，同一性百分比＝(匹配数×100)/比对区域的长度(例如，连续核苷酸序列)。在计算连续核苷酸序列的同一性百分比时，不允许插入和删除。应当理解，在确定同一性时，只要保留了形成Watson Crick碱基配对的核碱基的功能能力，就不考虑核碱基的化学修饰(例如，在计算同一性百分比时，认为5-甲基胞嘧啶与胞嘧啶相同)。

杂交

如本文所用，术语“杂交”(hybridizing/hybridizes)应当理解为两条核酸链(例如寡核苷酸和靶核酸)在相反链上的碱基对之间形成氢键，从而形成双链体。两条核酸链之间结合的亲和力为杂交的强度。它通常根据解链温度(T_m)来描述，该解链温度被定义为一半寡核苷酸与靶核酸形成双链体的温度。在生理条件下，T_m并非确实与亲和力严格成比例(Mergny与Lacroix,2003年，Oligonucleotides 13:515–537)。标准状态Gibbs自由能ΔG°是结合亲和力的更精确的表述并且与反应的解离常数(K_d)通过ΔG°＝-RTln(K_d)相关，其中R是气体常数并且T是绝对温度。因此，寡核苷酸与靶核酸之间反应的非常低的ΔG°反映了寡核苷酸和靶核酸之间强力杂交。ΔG°是与其中水浓度为1M、pH为7并且温度为37℃的反应相关的能量。寡核苷酸与靶核酸杂交是自发反应，并且对于自发反应，ΔG°小于零。ΔG°可实验上测量，例如，可利用如Hansen等人，1965,Chem.Comm.36–38及Holdgate等人2005年在Drug Discov Today中所描述的等温滴定量热(ITC)法测量。本领域的技术人员将知道商业设备可用于测量ΔG°。也可以通过使用如SantaLucia,1998,Proc Natl Acad Sci USA.95:1460–1465所述的最近相邻模型，适当使用Sugimoto等人，1995,Biochemistry 34:11211–11216和McTigue等人，2004,Biochemistry 43:5388–5405描述的推导的热力学参数在数值上估计ΔG°。为了具有通过杂交调节其预期的核酸靶标的可能性，对于长度为10-30个核苷酸的寡核苷酸，本发明的寡核苷酸以低于-10kcal的ΔG°估值与靶核酸杂交。在一些实施例中，杂交的程度或强度通过标准状态Gibbs自由能ΔG°测量。对于长度为8-30个核苷酸的寡核苷酸，寡核苷酸可与靶核酸以低于-10kcal，诸如低于-15kcal、诸如低于-20kcal和诸如低于-25kcal的ΔG°估值杂交。在一些实施例中，寡核苷酸以-10至-60kcal，诸如-12至-40、诸如-15至-30kcal或-16至-27kcal，诸如-18至-25kcal的ΔG°估值与靶核酸杂交。

靶标

本文使用的术语“靶标”是指哺乳动物蛋白RTEL1(“端粒延伸解旋酶1调控因子”)，或者称为“KIAA1088”或“C20ORF41”或“端粒长度的调节因子”或“端粒长度调节因子”或“染色体20开放阅读框41”。智人RTEL1基因位于20号染色体组63,657,810至63,696,253(智人更新注释，版本109.20200228，GRCh38.p13)。RTEL1蛋白为ATP依赖性DNA解旋酶，参与端粒长度调节、DNA修复和基因组稳定性维持。人RTEL1的氨基酸序列是本领域已知的并且可以经由UniProt进行评估，参见用于人RTEL1的UniProt条目Q9NZ71，通过引用并入本文。

靶核酸

根据本发明，靶核酸是编码哺乳动物RTEL1的核酸，并且可以例如是基因、RNA、mRNA和前体mRNA、成熟的mRNA或cDNA序列。该靶标因此可以称为RTEL1靶核酸。

本发明的反义寡核苷酸可以例如靶向哺乳动物RTEL1的外显子区域，或者可以例如靶向RTEL1前体mRNA中的内含子区域。人RTEL1基因编码15个转录本，其中7个是蛋白质编码的，并且因此是潜在的核酸靶标。表3列出了位于SEQ ID NO:1的人RTEL1前体mRNA上的7个转录本的预测外显子和内含子区域。

表3.人RTEL1前体mRNA(SEQ ID NO:1)中用于对RTEL1 mRNA转录本进行不同的蛋白质编码的转录区域、外显子区域和内含子区域

/>

合适地，靶核酸编码RTEL1蛋白，特别是哺乳动物RTEL1，例如人RTEL1(参见例如表3和表4)，其提供人和猴的前体mRNA序列RTEL1。

在一些实施例中，靶核酸选自SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2或其天然存在的变体(例如编码哺乳动物RTEL1蛋白的序列)。

如果在研究或诊断中采用本发明的反义寡核苷酸或本发明的缀合物，则靶核酸可以是cDNA或衍生自DNA或RNA的合成核酸。

对于体内或体外应用，本发明的反义寡核苷酸通常能够抑制表达RTEL1靶核酸的细胞中RTEL1靶核酸的表达。本发明的反义寡核苷酸的核碱基的连续序列通常与RTEL1靶核酸互补，如在整个反义寡核苷酸的长度上测量的，任选地，除了一个或两个错配以外，并且任选地排除可以将反义寡核苷酸与任选的官能团连接的基于核苷酸的接头区域，诸如缀合物或其他非互补性末端核苷酸(例如区域D’或D”)。在一些实施例中，靶核酸可以是RNA或DNA，诸如信使RNA，诸如前体mRNA，诸如人RTEL1，例如人RTEL1前体mRNA序列，诸如公开为SEQ ID NO:1的序列，或食蟹猴RTELl前体mRNA序列，诸如公开为SEQ ID NO:2的序列。SEQID NO:1和SEQ ID NO:2是DNA序列-应当理解，靶RNA序列具有代替胸苷碱基(T)的尿嘧啶(U)碱基。

表4和表5提供了有关示例性靶核酸的更多信息。

表4.多个物种的RTEL1的基因组和组装体信息。

Fwd＝正向链。基因组坐标提供了前体mRNA序列(基因组序列)。NCBI参考提供了mRNA序列(cDNA序列)。

表5.跨物种的RTEL1的序列详细信息。

物种	RNA类型	长度(nt)	SEQ ID NO
				人类	前体mRNA	38444	1
猴	前体mRNA	37214	2

注释：SEQ ID NO:2包含多个NNNN区域，其中测序无法准确地精炼序列，因此包含简并序列。为了避免疑问，本发明的化合物与实际靶序列互补，因此不是简并化合物。

在一些实施例中，靶核酸是SEQ ID NO:1。

在一些实施例中，靶核酸是SEQ ID NO:2。

在一些实施例中，靶核酸为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。

靶序列

本文所用的术语“靶序列”是指存在于靶核酸中的核苷酸的序列，其包含与本发明的寡核苷酸为互补的核碱基序列。在一些实施例中，靶序列由靶核酸上具有与本发明寡核苷酸的连续核苷酸序列互补的核碱基序列的区域组成。靶核酸的这一区域可以互换地称为靶标核苷酸序列、靶序列或靶标区域。在一些实施例中，靶序列比单个寡核苷酸的互补序列更长，并且可以例如代表靶核酸的优选区域，其可以被本发明的几种寡核苷酸靶向。

本发明的寡核苷酸包含与靶核酸(诸如本文所述的靶序列)互补和杂交的连续核苷酸序列。

与寡核苷酸互补的靶序列通常包含至少10个核苷酸的连续核碱基序列。该连续核苷酸序列的长度介于10至30个核苷酸，诸如12至30个、诸如14至20个、诸如长度为15至18个连续核苷酸、诸如长度为15、16、17个连续核苷酸。

靶序列区域

发明人已经鉴定了RTEL1靶核酸的特别有效的序列，其可以由本发明的寡核苷酸或其缀合物靶向。

在一些实施例中，靶序列为SEQ ID NO:7。

在一些实施例中，靶序列为SEQ ID NO:8。

在一些实施例中，靶序列为SEQ ID NO:9。

在一些实施例中，靶序列为SEQ ID NO:10。

在一些实施例中，靶序列为SEQ ID NO:11。

SEQ ID NO 7:TTTGACCAGAGTATGTAAAATT

SEQ ID NO 8:ACCAGAGTATGTAAAATT

SEQ ID NO:9:GACCAGAGTATGTAAAATT

SEQ ID NO:10:TTTGACCAGAGTATGTAA

SEQ ID NO:11:GAGATTCAAGTTATAATAAAG

SEQ ID NO:7至SEQ ID NO:11是DNA序列-应当理解，靶RNA序列具有代替胸苷碱基(T)的尿嘧啶(U)碱基。

SEQ ID NO:7至10所示的靶序列可以在人RTEL1的内含子8中找到。SEQ ID No:11所示的靶序列可以在人RTEL1的内含子7中找到。

在一些实施例中，靶序列为SEQ ID NO:1的核苷酸11753至11774的区域。

在一些实施例中，靶序列为SEQ ID NO:1的核苷酸11757至11774的区域。

在一些实施例中，靶序列为SEQ ID NO:1的核苷酸11756至11774的区域。

在一些实施例中，靶序列为SEQ ID NO:1的核苷酸11753至11770的区域。

在一些实施例中，靶序列为SEQ ID NO:1的核苷酸8681至8701的区域。

靶细胞

如本文所用，术语“靶细胞”是指表达靶核酸的细胞。在一些实施例中，靶细胞可以是体内或体外的。在一些实施例中，靶细胞是哺乳动物细胞，诸如啮齿动物细胞，诸如小鼠细胞或大鼠细胞，或灵长类动物细胞，诸如猴细胞或人细胞。

通常，靶细胞表达RTEL1 mRNA，诸如RTEL1前体mRNA或RTEL1成熟的mRNA。为了实验评估，可以使用表达包含靶序列(诸如人RTEL1前体mRNA，例如SEQ ID NO:1)的核酸的靶细胞。

对于反义寡核苷酸靶向作用，通常不考虑RTEL1 mRNA的聚腺苷(poly A)尾部。

本发明的反义寡核苷酸通常能够抑制RTEL1靶核酸在表达RTEL1靶核酸的细胞(靶细胞)中的表达，例如体内或体外。

此外，靶细胞可以是肝细胞。在一个实施例中，靶细胞是HBV感染的原代人肝细胞，其衍生自HBV感染者或具有人源化肝脏的HBV感染的小鼠(PhoenixBio，PXB-小鼠)。

根据本发明，靶细胞可以被HBV感染。此外，靶细胞可包含HBV cccDNA。因此，靶细胞优选地包含RTEL1 mRNA，诸如RTEL1前体mRNA或RTEL1成熟的mRNA，以及HBV cccDNA。

天然存在的变体

术语“天然存在的变体”是指RTEL1基因或转录本的变体，其源自与靶核酸相同的遗传基因座，但是可能例如由于遗传密码的简并性导致编码相同氨基酸的密码子的多样性而不同，或由于前体mRNA的可变剪接、或存在多态性诸如单核苷酸多态性(SNP)和等位基因变体而不同。基于与寡核苷酸足够互补序列的存在，本发明的寡核苷酸因此可以靶向靶核酸及其天然存在的变体。

在一些实施例中，天然存在的变体与哺乳动物RTEL1靶核酸具有至少95％，诸如至少98％或至少99％的同源性，所述靶核酸诸如SEQ ID NO:1的靶核酸。在一些实施例中，天然存在的变体与SEQ ID NO:1的人RTEL1靶核酸具有至少99％的同源性。

表达的抑制

如本文所用，术语“表达的抑制”应理解为，寡核苷酸抑制靶细胞中RTEL1的数量或活性的能力的总称。活性的抑制可以通过测量RTEL1前体mRNA或RTEL1 mRNA的水平，或通过测量细胞中RTEL1或RTEL1活性的水平来确定。因此，可以在体外或体内确定表达的抑制。

通常，通过比较由于向靶细胞施用有效量的反义寡核苷酸而导致的对活性的抑制并将该水平与从未施用反义寡核苷酸的靶细胞(对照实验)获得的参考水平或已知的参考水平(例如，在施用有效量的反义寡核苷酸之前的表达的水平，或预先确定的或以其他方式已知的表达水平)进行比较来确定表达的抑制。

例如，对照实验可以是动物或人，或用盐水组合物或参考寡核苷酸(通常是乱序对照)处理的靶细胞。

术语抑制(名词)或抑制(动词)也可称为下调、降低、抑制、减少、减低RTEL1(诸如RTEL1前体mRNA)的表达。

表达的抑制可能诸如通过降解前体mRNA或mRNA(诸如，使用RNA酶H募集寡核苷酸，诸如间隔聚体)发生。

高亲和力修饰的核苷

高亲和力修饰的核苷是一种经修饰的核苷，当并入所述寡核苷酸中时，可增强所述寡核苷酸对其互补靶的亲和力，例如以解链温度(Tm)所测定的。本发明的高亲和力修饰的核苷优选地使每一经修饰的核苷的解链温度增加介于+0.5℃至+12℃之间，更优选地是介于+1.5℃至+10℃之间，最优选地是介于+3℃至+8℃之间。许多高亲和力修饰的核苷是本领域已知的，并且包括例如许多2′取代的核苷以及锁定的核酸(LNA)(参见例如Freier&Altmann；Nucl.Acid Res.,1997,25,4429-4443和Uhlmann；Curr.Opinion in DrugDevelopment,2000,3(2),293-213)。

糖修饰

本发明的寡聚物可以包含一种或多种具有修饰的糖部分的核苷，所述修饰的糖部分即与DNA和RNA中发现的核糖糖部分相比时糖部分的修饰。

已经制备了许多具有核糖糖部分的修饰的核苷，主要目的为改善寡核苷酸的某些特性，诸如亲和力和/或核酸酶抗性。

此类修饰包括其中核糖环结构如下被修饰的那些：例如通过用己糖环(HNA)或通常在核糖环上的C2和C4碳之间具有双基桥的双环(LNA)或通常在C2和C3碳之间缺乏键的未连接的核糖环(例如UNA)替换。其他糖修饰的核苷包括，例如，双环己糖核酸(WO2011/017521)或三环核酸(WO2013/154798)。修饰的核苷还包括其中糖部分被非糖部分替换的核苷，例如在肽核酸(PNA)或吗啉代核酸的情况下。

糖修饰还包括通过将核糖环上的取代基改变为除氢以外的基团或DNA和RNA核苷中天然存在的2′-OH基团而进行的修饰。例如，可以在2′、3′、4′或5'位置引入取代基。

2′糖修饰的核苷

2′糖修饰的核苷是一种核苷，其在2′位置具有除H或-OH以外的取代基(2′取代的核苷)或包含能够在2′碳与核糖环中的第二个碳之间形成桥的2'连接双基，诸如LNA(2′-4'双基桥连)核苷。

事实上，人们已花费很多精力开发2′糖取代的核苷，并且发现许多2′取代的核苷掺入寡核苷酸后具有有益的特性。例如，2′修饰的糖可提供对寡核苷酸的增强的结合亲和力和/或增加的核酸酶抗性。2′取代的修饰的核苷的实例是2′-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2′-烷氧基-RNA、2′-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)、2′-氨基-DNA、2′-氟-RNA和2′-F-ANA核苷。有关进一步的实例，请参见例如Freier&Altmann；Nucl.Acid Res.,1997,25,4429-4443和Uhlmann；Curr.Opinion in Drug Development,2000,3(2),293-213以及Deleavey和Damha，Chemistry and Biology 2012,19,937。下面为一些2′取代的修饰的核苷的示意图。

关于本发明，2′取代的糖修饰的核苷不包括像LNA那样的2′桥连的核苷。

锁定的核酸核苷(LNA核苷)

“LNA核苷”是一种2′-修饰的核苷，其包含连接所述核苷的核糖环的C2′和C4′的双基(也称为“2′-4′桥”)，其限制或锁定核糖环的构象。这些核苷在文献中也被称为桥连核酸或双环核酸(BNA)。当将LNA掺入互补RNA或DNA分子的寡核苷酸中时，核糖构象的锁定与杂交亲和力的增强(双链体稳定化)相关。这可通过测量寡核苷酸/互补双链体的解链温度来常规确定。

非限制性的示例性LNA核苷公开于WO 99/014226、WO 00/66604、WO 98/039352、WO2004/046160、WO 00/047599、WO 2007/134181、WO 2010/077578、WO 2010/036698、WO2007/090071、WO 2009/006478、WO 2011/156202、WO 2008/154401、WO 2009/067647、WO2008/150729、Morita等人Bioorganic&Med.Chem.Lett.12,73-76,Seth etal.J.Org.Chem.2010,Vol 75(5)pp.1569-81和Mitsuoka et al.,Nucleic AcidsResearch 2009,37(4),1225-1238以及Wan和Seth，J.Medical Chemistry 2016,59,9645-9667中。

其他非限制性的示例性LNA核苷公开于方案1中。

方案1：

特定的LNA核苷是β-D-氧基-LNA、6'-甲基-β-D-氧基LNA诸如(S)-6'-甲基-β-D-氧基-LNA(ScET)和ENA。一种特别有利的LNA是β-D-氧基-LNA。

核酸酶介导的降解

核酸酶介导的降解意指一寡核苷酸能够在与互补核苷酸序列形成双链体时，居中影响所述序列的降解。

在一些实施例中，寡核苷酸可经由靶核酸的核酸酶介导的降解而发挥作用，其中本发明的寡核苷酸能够募集核酸酶，特别是核酸内切酶，优选地RNA酶(RNA酶)，诸如RNA酶H。经由核酸酶介导的机制而运作的寡核苷酸设计实例是这样的寡核苷酸，该寡核苷酸通常包含至少5个或6个连续DNA核苷的区域，并且在该区域的一侧或两侧上侧接有亲和力增强核苷，例如间隔聚体。

RNA酶H活性和募集

反义寡核苷酸的RNA酶H活性是指其与互补RNA分子形成双链体时募集RNA酶H的能力。WO01/23613提供了用于确定RNA酶H活性的体外方法，该方法可用于确定募集RNA酶H的能力。如果在向寡核苷酸提供互补靶核酸序列时具有以下初始速率(以pmol/l/min计)，则一般认为其能够募集RNA酶H，该初始速率是使用WO01/23613(通过引用在此并入)的实例91至95提供的方法学，使用具有与所测试的经修饰的寡核苷酸相同的碱基序列但在寡核苷酸中的所有单体之间仅包含具有硫代磷酸酯键的DNA单体的寡核苷酸确定的初始速率的至少5％，诸如至少10％或超过20％。为了用于确定RNA酶H活性，可从Creative(与大肠杆菌中表达的His标签融合的重组人RNA酶H1)获得重组人RNA酶H1。

间隔聚体

本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列可以是间隔聚体，也称为间隔聚体寡核苷酸或间隔聚体设计。反义间隔聚体一般用于通过RNA酶H介导的降解来抑制靶核酸。间隔聚体寡核苷酸包含至少三个不同的结构区域，分别为“5->3”方向的5'侧翼、缺口和3′侧翼F-G-F′。“缺口”区域(G)包含一段使寡核苷酸能够募集RNA酶H的连续DNA核苷酸。该缺口区域的侧翼是包含一个或多个糖修饰的核苷(优选地是高亲和力糖修饰的核苷)的5'侧翼区域(F)，以及包含一个或多个糖修饰的核苷(优选地是高亲和力糖修饰的核苷)的3'侧翼区域(F')。区域F和F'中的一个或多个糖修饰的核苷增强寡核苷酸对靶核酸的亲和力(即，亲和力增强的糖修饰的核苷)。在一些实施例中，区域F和F'中的一个或多个糖修饰的核苷是2'糖修饰的核苷，诸如高亲和力的2'糖修饰、诸如独立地选自LNA和2'-MOE。

在间隔聚体设计中，缺口区域的5’和3’最末端核苷是DNA核苷，分别位于5'(F)或3'(F')区域的糖修饰核苷附近。侧翼可进一步定义为在距缺口区域最远的端，即在5'侧翼的5'端和3'侧翼的3'端，具有至少一个糖修饰的核苷。在一些实施例中，式F-G-F′的间隔聚体区域的核苷之间的所有核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。

区域F-G-F’形成连续核苷酸序列。本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列可包含式F-G-F’的间隔聚体区域。

间隔聚体设计F-G-F'的总长度可以是例如12至32个核苷，诸如13至24个核苷，诸如14至22个核苷，诸如15至20个核苷，诸如16至18个核苷。

举例而言，本发明的间隔聚体寡核苷酸可由下式代表：

F_1-8-G_5-16-F'_1-8，诸如

F_1-8-G_7-16-F’_2-8或

F_1-8-G_11-16-F’_2-8，前提条件是间隔聚体区域F-G-F'的总长度至少为12，诸如至少14个核苷酸。

在本发明的方面，反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列由式5'-F-G-F′-3'的间隔聚体组成或包含式5'-F-G-F'-3′的间隔聚体，其中区域F和F′独立地包含1-8个核苷或由1至8个核苷组成，其中1至4个经2'糖修饰且限定F和F'区域的5'和3′端，并且G为能够募集RNA酶H的介于6个与16个核苷之间的区域。

以下进一步定义了区域F、G和F'，并且可以将其掺入到F-G-F'式中。

间隔聚体-区域G

间隔聚体的区域G(缺口区域)是核苷的区域，其使得寡核苷酸能够募集RNA酶H，诸如人RNA酶H1，通常是DNA核苷。RNA酶H是一种识别DNA和RNA之间的双链体并酶促裂解RNA分子的细胞酶。适当的间隔聚体可具有长度为至少5或6个邻接DNA核苷，诸如5-16个邻接DNA核苷，诸如6-15个邻接DNA核苷，诸如7-14个邻接DNA核苷，诸如8-12个邻接DNA核苷酸，诸如长度为8-12个邻接DNA核苷酸的缺口区域(G)。在一些实施例中，缺口区域G可由6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个邻接DNA核苷组成。此外，区域G可以具有11至16个连续DNA核苷酸的长度。

在一些情况下，缺口区域中的一个或多个胞嘧啶(C)DNA可能会被甲基化(例如，当DNA c后接DNA g时)，此类残基被注释为5-甲基-胞嘧啶(^meC)。在一些实施例中，缺口区域G可由6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或16个邻接的硫代磷酸酯连接的DNA核苷组成。

在一些实施例中，缺口中的所有核苷间键是硫代磷酸酯键。

间隔聚体-侧翼区域，F和F'

区域F紧邻区域G的5'DNA核苷。区域F的3'最末端核苷是糖修饰的核苷，诸如高亲和力糖修饰的核苷，例如2′取代的核苷，诸如MOE核苷或LNA核苷。

区域F′紧邻区域G的3'DNA核苷。区域F'的5'最末端核苷是糖修饰的核苷，诸如高亲和力糖修饰的核苷，例如2′取代的核苷，诸如MOE核苷或LNA核苷。

区域F的长度为1-8个连续核苷酸，诸如长度为2-6个、诸如2-4个连续核苷酸。在一些实施例中，区域F的长度为2个连续核苷酸。在一些实施例中，区域F的长度为3个连续核苷酸。在一些实施例中，区域F的长度为4个连续核苷酸。

优选地，区域F的5′最末端核苷是糖修饰的核苷。在一些实施例中，区域F的两个5′最末端核苷为糖修饰的核苷。在一些实施例中，区域F的5′最末端核苷是LNA核苷。在一些实施例中，区域F的两个5′最末端核苷是LNA核苷。

区域F’的长度为1-8个连续核苷酸，诸如长度为2-6个连续核苷酸。在一些实施例中，区域F′的长度为2个连续的核苷酸。在一些实施例中，区域F′的长度为4个连续的核苷酸。在一些实施例中，区域F′的长度为5个连续的核苷酸。在一些实施例中，区域F′的长度为6个连续的核苷酸。

优选地，区域F的3′最末端核苷为糖修饰的核苷。在一些实施例中，区域F的两个3′最末端核苷为糖修饰的核苷。在一些实施例中，区域F′的两个3′最末端核苷是LNA核苷。在一些实施例中，区域F′的3′最末端核苷是LNA核苷。

应当注意，当区域F的长度为一时，优选地，它为LNA核苷。此外，注意到当区域F和/或F′的长度为二时，区域F和/或F′的两个核苷有利地为LNA核苷。

在一些实施例中，区域F和F′中糖修饰的核苷仅由一种类型的糖修饰的核苷组成，诸如仅由MOE组成或仅由β-D-氧基LNA组成或仅由ScET组成。这样的设计也称为均匀侧翼或均匀间隔聚体设计。

在一些实施例中，区域F或F'或者F和F'的所有核苷都是LNA核苷，诸如β-D-氧基LNA核苷。在另选的实施例中，区域F和F′的所有糖修饰核苷均为LNA核苷，诸如β-D-氧基LNA核苷，其中区域F或F′或者F和F′两者可以任选地包含DNA核苷(交替侧翼，有关更多详细信息，请参见这些的定义)。

在一些实施例中，区域F和F′的5′和3′最末端核苷为LNA核苷，诸如β-D-氧基LNA核苷。

在一些实施例中，区域F和区域G之间的核苷间键和/或区域F'和区域G之间的核苷间键为硫代磷酸酯核苷间键。在一些实施例中，区域F或F'，F和F'的核苷之间的核苷间键为硫代磷酸酯核苷间键。

LNA间隔聚体

LNA间隔聚体是其中区域F和F’中的一者或两者包含LNA核苷或由LNA核苷组成的间隔聚体。β-D-氧基间隔聚体是其中区域F和F′中的一者或两者包含β-D-氧基LNA核苷或由其组成的间隔聚体。

在一些实施例中，LNA间隔聚体具有下式：[LNA]_1-5-[区域G]-[LNA]_1-5，其中区域G是或包含能够募集RNA酶H的连续DNA核苷区域。

MOE间隔聚体

MOE间隔聚体是其中区域F和F’由MOE核苷所构成的间隔聚体。在一些实施例中，MOE间隔聚体的设计为[MOE]_1-8-[区域G]_5-16-[MOE]_1-8，诸如[MOE]_2-7-[区域G]_6-14-[MOE]_2-7，诸如[MOE]_3-6-[区域G]_8-12-[MOE]_3-6，其中区域G具有如间隔聚体定义中的定义。具有5-10-5设计的MOE间隔聚体(MOE-DNA-MOE)已在本领域中广泛使用。

混合型翼间隔聚体

混合型翼间隔聚体为以下LNA间隔聚体，其中区域F和区域F′中的一者或两者包含2′取代的核苷，诸如独立地选自由以下项组成的组中的2'取代的核苷：2′-O-烷基-RNA单元、2′-O-甲基-RNA、2′-氨基-DNA单元、2′-氟-DNA单元、2′-烷氧基-RNA、MOE单元、阿糖核酸(ANA)单元和2′-氟-ANA单元诸如MOE核苷。在一些实施例中，其中区域F和F′中的至少一者或区域F和F′两者均包含至少一个LNA核苷，区域F和F'的其余核苷独立地选自由MOE和LNA组成的组。在一些实施例中，其中区域F或F′中的至少一者或区域F和F'两者均包含至少两个LNA核苷，区域F和F′的其余核苷独立地选自由MOE和LNA组成的组。在一些混合型翼的实施例中，区域F和F′中的一者或两者可进一步包含一个或多个DNA核苷。

交替性侧翼间隔聚体

侧翼区域可包含LNA和DNA核苷两者，并且由于其包含LNA-DNA-LNA核苷的交替基序，因此称为“交替侧翼”。包含至少一个交替侧翼的间隔聚体称为“交替侧翼间隔聚体”。因此，“交替侧翼间隔聚体”是LNA间隔聚体寡核苷酸，其中至少一个侧翼(F或F′)除LNA核苷以外还包含DNA。在一些实施例中，区域F或F′中的至少一者或两者都包含LNA核苷和DNA核苷两者。在这样的实施例中，侧翼区域F或F′，或F和F′两者都包含至少三个核苷，其中F和/或F′区域的5′和3′最末端核苷是LNA核苷。交替侧翼LNA间隔聚体公开于WO2016/127002。

交替侧翼区域可包含最多3个连续DNA核苷，例如1至2个或1个或2个或3个连续DNA核苷。

交替侧翼区域可以注释为一系列整数，表示多个LNA核苷(L)后跟多个DNA核苷(D)，例如[L]1-3-[D]1-3-[L]1-3or[L]1-2-[D]1-2-[L]1-2-[D]1-2-[L]1-2。在寡核苷酸设计中，这些将经常表示为数字，使得2-2-1代表5′[L]2-[D]2-[L]3′，并且1-1-1-1-1代表5′[L]-[D]-[L]-[D]-[L]3′。具有交替侧翼的寡核苷酸中侧翼(区域F和F')的长度如上文对此区域的描述，诸如4个至8个、诸如5个至6个核苷，诸如4个、5个、6个或7个修饰的核苷。可能有利的是，在3'侧翼(F”的3′端具有至少两个LNA核苷以赋予额外的核酸外切酶抗性。

寡核苷酸中的区域D'或D”

在一些实施例中，本发明的寡核苷酸可以包含以下项或由其组成：与靶核酸互补的寡核苷酸的连续核苷酸序列，诸如间隔聚体区域F-G-F′，以及另外的5′和/或3'核苷。所述其他的5’和/或3’核苷可与或不与所述靶核酸为完全互补。此类其他的5’和/或3’核苷本文中可称为区域D’和D”。

出于将连续核苷酸序列(诸如间隔聚体)与缀合物部分或另一个官能团接合的目的，可以使用添加区域D'或D”。当用于将连续核苷酸序列与缀合物部分接合时，其可用作可生物裂解的接头。替代地，其可以用于提供核酸外切酶保护或使合成或制备变得容易。

可以将区域D'和D”分别连接到区域F的5'端或区域F'的3′端，以生成下式：D'-F-G-F'、F-G-F'-D”或D'-F-G-F'-D”。在这种情况下，F-G-F’是寡核苷酸的间隔聚体部分，而区域D’或D'’构成寡核苷酸的单独部分。

区域D’或D'’可以独立地包含1个、2个、3个、4个或5个另外的核苷酸或由其组成，它们可以与靶核酸互补或不互补。与F或F'区域相邻的核苷酸不是糖修饰的核苷酸，诸如DNA或RNA或这些的碱基修饰形式。D′或D”区域可以用作核酸酶敏感的可生物裂解的接头(参见接头的定义)。在一些实施例中，另外的5′和/或3′端核苷酸与磷酸二酯键联接，并且是DNA或RNA。WO2014/076195中公开了适合用作区域D′或D”的基于核苷酸的可生物裂解的接头，其包括例如磷酸二酯连接的DNA二核苷酸。WO2015/113922中公开了在聚寡核苷酸构建体中可生物裂解的接头的用途，其中它们被用于在单个寡核苷酸内连接多个反义构建体(例如间隔聚体区域)。

在一个实施例中，本发明的寡核苷酸除构成间隔聚体的连续核苷酸序列外还包含区域D′和/或D”。

在一些实施例中，本发明的寡核苷酸可以由下式表示：

F-G-F’；特别是F_1-8-G_5-16-F’_2-8

D′-F-G-F′，特别是D′_1-3-F_1-8-G_5-16-F′_2-8

F-G-F'-D”，特别是F_1-8-G_5-16-F′_2-8-D”_1-3

D′-F-G-F′-D”，特别是D′_1-3-F_1-8-G_5-16-F′_2-8-D”_1-3

在一些实施例中，位于区域D′与区域F之间的核苷间键是磷酸二酯键。在一些实施例中，位于区域F′与区域D”之间的核苷间键是磷酸二酯键。

缀合物

如本文所用，术语“缀合物”是指与非核苷酸部分(缀合物部分或区域C或第三区域)共价联接的寡核苷酸。缀合物部分可以与反义寡核苷酸共价连接，任选地经由接头基团，例如区域D′或D”。

寡核苷酸缀合物及其合成也在Manoharan于Antisense Drug Technology,Principles,Strategies,and Applications,S.T.Crooke编辑,第16章,Marcel Dekker,Inc.,2001中所作综述和Manoharan,Antisense and Nucleic Acid Drug Development,2002,12,103中报导。

在一些实施例中，所述非核苷酸部分(缀合物部分)选自由碳水化合物(例如GalNAc)、细胞表面受体配体、药物、激素、亲脂性物质、聚合物、蛋白质、肽、毒素(例如细菌毒素)、维生素、病毒蛋白质(例如衣壳)或其组合组成的组。

示例性缀合物部分包含那些能够结合脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的缀合物部分。特别地，三价N-乙酰半乳糖胺缀合物部分适用于与ASGPR结合，参见例如WO 2014/076196、WO 2014/207232和WO 2014/179620。此类缀合物用于增强肝脏对寡核苷酸的吸收。

在一些实施例中，所述缀合物是对运铁蛋白受体具有特定亲和力的抗体或抗体片段，例如WO 2012/143379中所公开者，在此以引用方式并入。在一些实施例中，所述非核苷酸部分是抗体或抗体片段，诸如有助于跨脑血管屏障提供药性的抗体或抗体片段，特别是靶向运铁蛋白受体的抗体或抗体片段。

接头

键或接头是两个原子之间的连接，其经由一个或多个共价键将一个目标化学基团或区段与另一个目标化学基团或区段联接。缀合物部分可直接或通过联接部分(例如接头或系链)连接至寡核苷酸。接头可将第三区域，例如缀合物部分(区域C)，共价连接至第一区域，例如与所述靶核酸互补的寡核苷酸或连续核苷酸序列(区域A)。

在本发明的一些实施例中，本发明的缀合物或寡核苷酸缀合物可以任选地包含位于与靶核酸互补的寡核苷酸或连续核苷酸序列(区域A或第一区域)与缀合物部分(区域C或第三区域)之间的接头区域(第二区域或区域B和/或区域Y)。

包含生理上不稳定的键或由其组成的可生物裂解的接头(区域B)，该键在哺乳动物体内通常遇到的条件下或与之相似的条件下可裂解。生理上不稳定的接头经历化学转化(例如裂解)的条件包括化学条件，诸如pH、温度、氧化或还原条件或试剂，以及在哺乳动物细胞中遇到的盐浓度或与之相似的盐浓度。哺乳动物细胞内条件还包括通常存在于哺乳动物细胞中的酶活性，诸如来自蛋白水解酶或水解酶或核酸酶的酶活性。在一个实施例中，可生物裂解的接头对S1核酸酶裂解敏感。在一些实施例中，生理上不稳定的接头(可生物裂解的)包含1个至10个连接的核苷，诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连接的核苷，诸如2个至6个连接的核苷，诸如2个至5个连接的核苷，诸如2个至4个连接的核苷，其中至少两个连续键为可生物裂解的，诸如至少3个或4个或5个连续磷酸二酯键。优选地，该核苷是DNA或RNA。

在一个实施例中，寡核苷酸和缀合物部分之间的接头是生理上不稳定的接头，由2个至5个连续的磷酸二酯连接的核苷组成，在反义寡核苷酸的连续核苷酸序列的5′或3′端包含至少两个连续的磷酸二酯键。

在一些实施例中，生理上不稳定的接头包含DNA二核苷酸或由其组成，该DNA二核苷酸具有选自由以下项组成的组的序列：AA、AT、AC、AG、TA、TT、TC、TG、CA、CT、CC、CG、GA、GT、GC或GG，其中两个DNA二核苷酸之间存在磷酸二酯键，并且在二核苷酸的5′或3′端至少有一个磷酸二酯连接核酸分子的寡核苷酸至二核苷酸或连接缀合物部分至二核苷酸。例如，接头可以是CA二核苷酸。在一些实施例中，生理上不稳定的接头包含序列AAA、AAT、AAC、AAG、ATA、ATT、ATC、ATG、ACA、ACT、ACC、ACG、AGA、AGT、AGC、AGG、TAA、TAT、TAC、TAG、TTA、TTT、TTC、TAG、TCA、TCT、TCC、TCG、TGA、TGT、TGC、TGG、CAA、CAT、CAC、CAG、CTA、CTG、CTC、CTT、CCA、CCT、CCC、CCG、CGA、CGT、CGC、CGG、GAA、GAT、GAC、CAG、GTA、GTT、GTC、GTG、GCA、GCT、GCC、GCG、GGA、GGT、GGC或GGG的DNA三核苷酸或由这些序列的DNA三核苷酸组成，其中在DNA核苷之间存在磷酸二酯键，并且在三核苷酸的5'或3'端可能还有一个磷酸二酯。包含磷酸二酯的可生物裂解的接头更加详细地描述于WO 2014/076195(通过引用并入本文)中。当与标准比较时，在带有生物可裂解的接头的缀合物化合物中至少约50％的缀合物部分从寡核苷酸上裂解下来、诸如至少约60％裂解、诸如至少约70％裂解、诸如至少约80％裂解、诸如至少约85％裂解、诸如至少约90％裂解、诸如至少约95％的缀合物部分从裂解的寡核苷酸上裂解下来。

区域Y是指不一定是可生物裂解的但主要用于将缀合物部分(区域C或第三区域)与寡核苷酸(区域A或第一区域)共价连接的接头。区域Y接头可以包含重复单元诸如乙二醇、氨基酸单元或氨基烷基的链结构或寡聚物。本发明的寡核苷酸缀合物可以由以下区域性元件A-C、A-B-C、A-B-Y-C、A-Y-B-C或A-Y-C构成。在一些实施例中，接头(区域Y)为氨基烷基(诸如C2-C36氨基烷基基团)，包括例如C6至C12氨基烷基基团。在一些实施例中，接头(区域Y)是C6氨基烷基基团。

优选地，可裂解接头在将本发明的缀合物递送至其靶细胞后被裂解。例如，在GalNAc介导的缀合物递送至靶细胞(例如肝细胞)后，接头被裂解掉，留下裸化合物作为活性药物。例如，实例部分中测试的缀合物含有CA二核苷酸接头。

药用盐

术语“药用盐”是指保留游离碱或游离酸的生物效果和特性的那些盐，这些盐在生物学或其他方面不是不合需要的。这些盐用无机酸诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸(特别是盐酸)和有机酸诸如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸、N-乙酰基半胱氨酸形成。此外，这些盐可以通过向游离酸添加无机碱或有机碱制备。衍生自无机碱的盐包括但不限于钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐。衍生自有机碱的盐包括但不限于与下述有机碱形成的盐：伯胺、仲胺和叔胺，取代胺包括天然出现的取代胺、环状胺和碱性离子交换树脂，诸如异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、赖氨酸、精氨酸、N-乙基哌啶、哌啶、聚胺树脂。本发明的化合物也可以两性离子的形式存在。式(I)的化合物的特别优选的药用盐为盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸和甲磺酸的盐。

治疗

本文所用的术语“治疗”是指既存疾病(例如本文所指的疾病或疾患)的治疗或疾病的阻止，即预防。因此将认识到，在一些实施例中，本文所指的治疗可以是预防性的。预防可理解为阻止HBV感染转变为慢性HBV感染或阻止由慢性HBV感染引起的严重肝病，诸如肝硬化和肝细胞癌。

预防

本文中的术语“阻止”、“预防”或“防止”涉及预防性治疗，即其目的是预防而不是治愈疾病的措施或程序。预防是指获得期望的药理和/或生理效果，该效果在完全或部分地阻止疾病或症状方面具有预防作用。因此，本文中的“阻止HBV感染”包括阻止在受试者体内发生HBV感染，以及阻止HBV感染症状的发生。在本发明中，特别地考虑了预防由HBV感染的母亲对孩子造成的HBV感染。还考虑了预防由急性HBV感染转变为慢性HBV感染。

患者

为了本发明的目的，“受试者”或“患者”可以是脊椎动物。在本发明的上下文中，术语“受试者”包括人和其他动物，特别是哺乳动物和其他生物。因此，本文提供的手段和方法适用于人类治疗和兽医应用。因此，本文的受试者可以是动物，诸如小鼠、大鼠、仓鼠、兔、豚鼠、雪貂、猫、狗、鸡、绵羊、牛科动物、马、骆驼或灵长类动物。优选地，受试者是哺乳动物。更优选地，受试者是人。在一些实施例中，患者患有本文所指的疾病，诸如HBV感染。在一些实施例中，患者易于患所述疾病。

具体实施方式

感染的肝细胞中的乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)负责持续的慢性感染和再激活，是所有病毒亚基因组转录本和前基因组RNA(pgRNA)的模板，以确保新合成的病毒后代和cccDNA池经由细胞内核衣壳回收而得到补充。RTEL1与cccDNA稳定性相关。RTEL1的抑制导致HBV感染受试者体内的cccDNA的去稳定化，这反过来又为彻底治愈慢性感染HBV患者创造机会。

本发明的一个方面是用于治疗和/或预防HBV感染特别是慢性HBV感染的靶向RTEL1的增强反义寡核苷酸或其缀合物。

在一个实施例中，靶向RTEL1的反义寡核苷酸或其缀合物可以例如减少RTEL1蛋白的表达、RTEL1蛋白与cccDNA的结合，从而减少感染细胞(诸如HBV感染细胞)中的cccDNA和/或pgRNA。

在一个实施例中，靶向RTEL1的反义寡核苷酸或其缀合物能够在HBV感染个体的体内减少HBsAg和/或HBeAg。

在一个实施例中，靶向RTEL1的反义寡核苷酸或其缀合物能够在HBV感染个体的体内减少cccDNA。

在一个实施例中，靶向RTEL1的反义寡核苷酸或其缀合物能够在HBV感染个体的体内减少pgRNA。

本发明的反义寡核苷酸

本发明的增强反义寡核苷酸或其缀合物可能是出色的RTEL1抑制剂，因为它们可以靶向RTEL1转录物并且经由RNA酶H裂解促进其降解。

本发明的一个方面是用于治疗和/或预防HBV感染的增强反义寡核苷酸或其缀合物。

本章节描述了适用于在HBV的治疗和/或预防中使用的新型寡核苷酸。

本发明的反义寡核苷酸或其缀合物能够在体外和体内抑制RTEL1的表达。抑制是通过将寡核苷酸与编码RTEL1或参与RTEL1调节的靶核酸杂交来实现的。靶核酸可以是哺乳动物RTEL1序列，诸如SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的序列。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸或其缀合物能够通过抑制或调降靶标的表达而对其产生调节的效果。优选地，与靶标的正常表达水平相比，这种调节产生至少20％的表达抑制，更优选地与靶标的正常表达水平相比，至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的抑制。在一些实施例中，在PXB-PHH细胞中使用10μM的本发明的反义寡核苷酸或其缀合物，可能能够在体外将RTEL1mRNA的表达水平抑制至少60％或70％。在一些实施例中，在PXB-PHH细胞中使用10μM的本发明的反义寡核苷酸或其缀合物，可能能够在体外将RTEL1蛋白的表达水平抑制至少50％，就选择与cccDNA减少具有良好相关性的反义寡核苷酸而言，靶标减少的这一范围是优选的。适合的是，实例中提供了可用于测量RTEL1 RNA抑制的测定(例如实例1)。通过反义寡核苷酸的连续核苷酸序列与靶核酸之间的杂交触发靶抑制。在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸包含反义寡核苷酸和靶核酸之间的错配。尽管错配，与靶核酸的杂交仍可能足以显示出所需的RTEL1表达抑制。由错配导致降低的结合亲和力可以优选地通过寡核苷酸中核苷酸数量的增加和/或能够增加与靶标结合亲和力的修饰核苷数量的增加来补偿，所述修饰核苷诸如存在于寡核苷酸序列中的2’糖修饰的核苷，包括LNA。

本发明的一个方面涉及长度为12个至60个核苷酸的增强反义寡核苷酸，其包含长度为至少10个核苷酸，诸如长度为至少12个至30个核苷酸的连续核苷酸序列，且与哺乳动物RTEL1靶核酸特别是人RTEL1核酸至少95％互补，诸如完全互补。反义寡核苷酸能够抑制RTEL1的表达。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸包含长度为12个至22个核苷酸，诸如15个至20个核苷酸的连续核苷酸序列，其与SEQ ID NO:7的靶核酸至少90％互补，诸如完全互补。

在一些实施例中，反义寡核苷酸包含长度为15个至18个核苷酸，诸如17个或18个核苷酸的连续核苷酸序列，其与SEQ ID NO:8的靶核酸至少90％互补，诸如完全互补。

在一些实施例中，反义寡核苷酸包含长度为15个至19个核苷酸，诸如18个或19个核苷酸的连续核苷酸序列，其与SEQ ID NO:9的靶核酸至少90％互补，诸如完全互补。

在一些实施例中，反义寡核苷酸包含长度为15个至18个核苷酸，诸如17个或18个核苷酸的连续核苷酸序列，其与SEQ ID NO:10的靶核酸至少90％互补，诸如完全互补。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸包含长度为12个至22个核苷酸，诸如17个至22个核苷酸的连续核苷酸序列，其与SEQ ID NO:11的靶核酸至少90％互补，诸如完全互补。

在一些实施例中，反义寡核苷酸包含15个至22个核苷酸的连续核苷酸序列，诸如15个至18个核苷酸，诸如17个或18个核苷酸，其与靶核酸具有至少90％的互补性，诸如完全互补，该靶核酸选自SEQ ID NO:1的以下区域：SEQ ID NO:1的8681-8701、SEQ ID NO:1的11753-11774，诸如与来自SEQ ID NO:1的核苷酸11757-11774、11756-11774或11753-11770的区域互补。

本发明的一个方面涉及反义寡核苷酸，其是长度为12个至30个核苷酸的反义寡核苷酸，其包含长度为至少10个核苷酸，诸如10个至30个核苷酸的连续核苷酸序列，且与哺乳动物RTEL1至少90％互补，诸如完全互补。

本发明的另一方面涉及反义寡核苷酸，其包含长度为12个至20个核苷酸，诸如15个至22个核苷酸的连续核苷酸序列，其与SEQ ID NO:1的靶核酸至少90％互补，诸如完全互补。

在一些实施例中，反义寡核苷酸包含长度为10个至30个核苷酸的连续序列，该序列与靶核酸的区域或靶序列至少90％互补，诸如至少91％、诸如至少92％、诸如至少93％、诸如至少94％、诸如至少95％、诸如至少96％、诸如至少97％、诸如至少98％或100％互补。

如果本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列与靶核酸的区域完全互补(100％互补)，或者在一些实施例中可包含寡核苷酸与靶核酸之间的一个或两个错配，则是优选的。

在一些实施例中，反义寡核苷酸序列与SEQ ID NO:1的相应靶核酸100％互补。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸或连续核苷酸序列与SEQ ID NO:1和SEQID NO:2的靶核酸至少95％互补，例如完全(或100％)互补。

在一些实施例中，连续核苷酸序列包含选自由SEQ ID NO 3、4、5和6组成的组的核碱基的序列或其至少14个连续核苷酸。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列在其长度上包含10个至30个核苷酸或由其组成，诸如在长度上包含从12个至25个，诸如11个至22个，诸如从12个至20个，诸如从14个至18个或14个至16个连续核苷酸或由其组成。

在一些实施例中，反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含22个或更少的核苷酸(诸如20个或更少的核苷酸，诸如18个或更少的核苷酸，诸如14、15、16或17个核苷酸)或由其组成。应当理解的是，本文中给出的任何范围均包括范围的端点。据此，若本文中描述一寡核苷酸包括自10个至30个核苷酸，则10个及30个核苷酸均包含在内。

在一些实施例中，连续核苷酸序列在长度上包含10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个或22个连续核苷酸或由其组成。

在一些实施例中，反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含选自SEQ ID NO:3、4、5和6的序列或由其组成。

本发明提供了根据本发明的反义寡核苷酸，诸如长度为12个至24个核苷酸、诸如长度为12个至18个核苷酸的反义寡核苷酸，其中该反义寡核苷酸包含连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列包含存在于SEQ ID NO:7中的至少12个、诸如至少13个、诸如至少14个、诸如至少15个或至少16个连续核苷酸。

本发明提供了反义寡核苷酸，诸如长度为12个至24个核苷酸、诸如长度为12个至18个核苷酸的反义寡核苷酸，其中该反义寡核苷酸包含连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列包含存在于SEQ ID NO:8中的至少12个、诸如至少13个、诸如至少14个、诸如至少15个或至少16个连续核苷酸。

本发明提供了反义寡核苷酸，诸如长度为12个至24个核苷酸、诸如长度为12个至18个核苷酸的反义寡核苷酸，其中该反义寡核苷酸包含连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列包含存在于SEQ ID NO:9中的至少12个、诸如至少13个、诸如至少14个、诸如至少15个或至少16个连续核苷酸。

本发明提供了反义寡核苷酸，诸如长度为12个至24个核苷酸、诸如长度为12个至18个核苷酸的反义寡核苷酸，其中该反义寡核苷酸包含连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列包含存在于SEQ ID NO:10中的至少12个、诸如至少13个、诸如至少14个、诸如至少15个或至少16个连续核苷酸。

本发明提供了反义寡核苷酸，诸如长度为12个至24个核苷酸、诸如长度为12个至18个核苷酸的反义寡核苷酸，其中该反义寡核苷酸包含连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列包含存在于SEQ ID NO:11中的至少12个、诸如至少13个、诸如至少14个、诸如至少15个或至少16个连续核苷酸。

在优选地的实施例中，本发明的反义寡核苷酸包含一个或多个糖修饰的核苷，诸如一个或多个2′糖修饰的核苷，诸如一个或多个2′糖修饰的核苷独立地选自2′-O-烷基-RNA、2′-O-甲基-RNA、2′-烷氧基-RNA、2′-O-甲氧基乙基-RNA、2′-氨基-DNA、2′-氟-DNA、阿糖核酸(ANA)、2′-氟-ANA和LNA核苷。如果一个或多个修饰的核苷是锁定的核酸(LNA)，则是优选的。

在一些实施例中，连续核苷酸序列包含LNA核苷。

在本发明的寡核苷酸的一些实施例中，所有的LNA核苷都是β-D-氧基LNA核苷。

在一些实施例中，连续核苷酸序列包含LNA核苷和DNA核苷。

在一些实施例中，连续核苷酸序列包含2'-O-甲氧基乙基(2′MOE)核苷。

在一些实施例中，连续核苷酸序列包含2′-O-甲氧基乙基(2′MOE)核苷和DNA核苷。

有利地，反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列的3′最末端核苷为2′糖修饰的核苷。

优选地，反义寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷间键，例如硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯。

在一些实施例中，连续核苷酸序列中的至少一个核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。

在一些实施例中，连续核苷酸序列中的至少一个核苷间键是二硫代磷酸酯核苷间键。

在一些实施例中，连续核苷酸序列中的至少一个核苷间键是磷酸二酯核苷间键。

在一些实施例中，连续核苷酸序列中的所有核苷间键都是硫代磷酸酯核苷间键。

在一些实施例中，反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列中的至少75％核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。

在一些实施例中，反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列中的所有核苷间键都是硫代磷酸酯核苷间键。

在本发明的一个有利实施例中，本发明的反义寡核苷酸能够募集RNA酶H，诸如RNA酶H1。在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列是一个间隔聚体。

在一些实施例中，反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列，包含式5′-F-G-F′-3′的间隔聚体或由其组成。

在一些实施例中，区域G由6个至16个DNA核苷组成，诸如11个至16个DNA核苷。在一些实施例中，区域F包含2个至4个DNA核苷和/或区域F′包含2个至6个DNA核苷。

在一些实施例中，区域F和F′各自包含至少一个LNA核苷。

在一些实施例中，本发明的寡核苷酸是具有均匀侧翼的LNA间隔聚体。例如，具有均匀侧翼的LNA间隔聚体可具有选自以下设计的设计：4-12-2、2-13-4和2-12-5。表6列出了每个基序序列的优选的设计。

在本发明的一些实施例中，LNA间隔聚体是交替侧翼LNA间隔聚体。在一些实施例中，交替侧翼LNA间隔聚体包含至少一个交替侧翼(诸如侧翼F’)。在一些实施例中，交替侧翼LNA间隔聚体包含一个交替侧翼(诸如侧翼F’)和一个均匀侧翼(诸如侧翼F)。例如，具有一个交替F′侧翼的LNA间隔聚体可能具有以下设计：2-11-1-2-1-1-3。

本发明提供以下寡核苷酸化合物(表6)：

表6：本发明的寡核苷酸基序序列(由SEQ ID NO表示)的列表，其设计以及基于基序序列设计的本发明的特异性寡核苷酸化合物(由CMP ID NO表示)。

表中的标题“寡核苷酸化合物”代表基序序列的特定设计。大写字母为β-D-氧基LNA核苷，小写字母为DNA核苷，所有LNA C均为5-甲基胞嘧啶，所有核苷间键均为硫代磷酸酯核苷间键。标题“设计”指的是间隔聚体设计，F-G-F′。在经典的间隔聚体设计中，即具有均匀侧翼的间隔聚体(例如4-12-2)，侧翼中的所有核苷酸(F和F')均由相同类型的2'-糖修饰核苷构成，例如LNA、cET或MOE，以及中间形成缺口(G)的一段DNA。在具有交替侧翼设计的间隔聚体中，寡核苷酸的侧翼被注释为一系列整数，代表多个β-D-氧基LNA核苷(L)后跟多个DNA核苷(D)。例如，具有1-2-1-1-3基序的侧翼F’代表LDDLDLLL(参见CMP ID NO 6_1)。两个侧翼在5'和3'端均具有β-D-氧基LNA的核苷。由许多DNA核苷构成的缺口区域(G)位于侧翼之间。

对于本发明的一些实施例，寡核苷酸选自由CMP-ID-NO:3_1、4_1、5_1和6_1组成的寡核苷酸化合物的组(见表6)。

在所有情况下，F-G-F′设计可进一步包括区域D'和/或D”，如“定义”章节中“寡核苷酸中的区域D'或D”下所述”。在一些实施例中，本发明的寡核苷酸在间隔聚体区域的5’或3'端，诸如在5'端具有1个、2个或3个磷酸二酯连接的核苷单元，诸如DNA单元。在一些实施例中，本发明的寡核苷酸由两个5'磷酸二酯连接的DNA核苷和随后的如上所定义的F-G-F'间隔聚体区域组成。在5'或3'端含有磷酸二酯连接的DNA单元的寡核苷酸适用于缀合，并且可以进一步包含本文所述的缀合物部分。对于递送至肝脏，ASGPR靶向部分作为缀合物部分是特别优选的，参见缀合物部分了解更多详情。

缀合

因为HBV感染主要影响肝脏中的肝细胞，所以将本发明的增强反义寡核苷酸缀合至缀合物部分是有利的，与未缀合的反义寡核苷酸相比，缀合物部分将增加反义寡核苷酸至肝脏的递送。在一个实施例中，肝靶向部分选自能够与脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)结合的胆固醇或其他脂质或缀合物部分。

在一些实施例中，本发明提供了缀合物，其包含共价连接至缀合物部分的本发明的反义寡核苷酸。

脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)缀合物部分包含一种或多种能够以等于或大于半乳糖的亲和力结合脱唾液酸糖蛋白受体(ASPGR靶向部分)的碳水化合物部分。许多半乳糖衍生物对脱唾液酸糖蛋白受体的亲和力已经进行过研究(例如：Jobst,S.T.和Drickamer,K.JB.C.1996,271,6686)或使用本领域典型的方法容易地确定。

在一个实施例中，缀合物部分包含至少一个选自由以下项组成的组的脱唾液酸糖蛋白受体靶向部分：半乳糖、半乳糖胺、N-甲酰基-半乳糖胺、N-乙酰半乳糖胺、N-丙酰基-半乳糖胺、N-正丁酰基-半乳糖胺和N-异丁酰基半乳糖胺。优选地，脱唾液酸糖蛋白受体靶向部分是N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。

为了生成ASGPR缀合物部分，可以将ASPGR靶向部分(优选地GalNAc)附接于缀合物支架上。通常，ASPGR靶向部分可以在支架的相同端。在一个实施例中，缀合物部分由连接至间隔物的二至四个末端GalNAc部分组成，所述间隔物将每一个GalNAc部分连接至可与反义寡核苷酸缀合的支链分子。

在另一个实施例中，缀合物部分相对于脱唾液酸糖蛋白受体靶向部分为一价、二价、三价或四价。优选地，脱唾液酸糖蛋白受体靶向部分包含N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分。

GalNAc缀合物部分可包括例如那些WO 2014/179620和WO 2016/055601和PCT/EP2017/059080(通过引用并入本文)中所述的缀合物部分，以及连接有GalNAc部分的小肽，诸如Tyr-Glu-Glu-(氨基己基GalNAc)3(YEE(ahGalNAc)3；与肝细胞上脱唾液酸糖蛋白受体结合的糖三肽，参见，例如，Duff等人,Methods Enzymol,2000,313,297)；基于赖氨酸的半乳糖簇(例如L3G4；Biessen等人,Cardovasc.Med.,1999,214)；和基于胆烷的半乳糖簇(例如，脱唾液酸糖蛋白受体的碳水化合物识别基序)。

可以使用本领域已知的方法将ASGPR缀合物部分，特别是三价GalNAc缀合物部分附接于寡核苷酸的3'端或5'端。在一个实施例中，ASGPR缀合物部分连接至寡核苷酸的5'端。

在一个实施例中，缀合物部分是三价N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)，诸如图5所示的那些。在一个实施例中，缀合物部分是图5A-1或图5A-2的三价N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)或者两者的混合物。在一个实施例中，缀合物部分是图5B-1或图5B-2的三价N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)或者两者的混合物。在一个实施例中，缀合物部分是图5C-1或图5C-2的三价N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)或者两者的混合物。在一个实施例中，缀合物部分是图5D-1或图5D-2的三价N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)或者两者的混合物。

在一些实施例中，缀合物选自由以下组成的组：

5'-GN2-C6_oc_oa_oA_sA_sT_sT_st_st_sa_sc_sa_st_sa_sc_st_sc_st_sg_sG_sT_s,

5'-GN2-C6_oc_oa_oA_sA_st_st_st_st_sa_sc_sa_st_sa_sc_st_sc_st_sG_sG_sT_s ^mC_s,

5'-GN2-C6_oc_oa_o ^mC_sT_st_st_sa_st_st_sa_st_sa_sa_sc_st_sT_sg_sa_sA_st_s ^mC_sT_s ^mC_s和5'-GN2-C6_oc_oa_o T_sT_sa_sc_sa_st_sa_sc_st_sc_st_sg_sg_st_s ^mC_sA_sA_sA_s

其中大写字母代表β-D-氧基LNA核苷，小写字母代表DNA核苷，其中每个LNA胞嘧啶为5-甲基胞嘧啶，下标s代表硫代磷酸酯核苷间键，下标o代表磷酸二酯核苷间键，GN2-C6为三价N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)，诸如图5中所示的那些，例如诸如图5D-1或图5D-2的三价N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)，或两者的混合物。

代表某些分子的化学图如图1至4所示。

在一些实施方式中，缀合物是如图1所示的缀合物。

在一些实施方式中，缀合物是如图2所示的缀合物。

在一些实施方式中，缀合物是如图3所示的缀合物。

在一些实施方式中，缀合物是如图4所示的缀合物。

图1至4中所示的化合物以质子化形式示出，也就是硫代磷酸酯键上的S原子经质子化；应知质子的存在将取决于分子的环境酸性以及替代性阳离子的存在(例如当所述寡核苷酸是以盐的形式时)。质子化硫代磷酸酯是以互变异构的形式存在。

药用盐

根据本发明的化合物可以以其药用盐的形式存在。术语“药用盐”是指保留本发明化合物的生物有效性和特性并由合适的无毒有机或无机酸或者有机或无机碱形成的常规酸加成盐或碱加成盐。酸加成盐包括(例如)那些衍生自无机酸诸如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸和硝酸的盐，和那些衍生自有机酸诸如对甲苯磺酸、水杨酸、甲磺酸、草酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、富马酸等的盐。碱加成盐包括那些衍生自铵、钾、钠和季铵氢氧化物诸如氢氧化四甲基铵的盐。为了获得改善的化合物的物理和化学稳定性、吸湿性、流动性和溶解性而将药物化合物化学修饰成盐是药物化学家众所周知的技术。例如，Bastin在《有机工艺研究与发展》(Organic Process Research&Development)2000年第4期，第427-435页或Ansel在以下文章中对此进行了描述：《药物剂型和药物递送系统(第六版)》(Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,6th ed.(1995))第196和1456-1457页。例如，本文提供的化合物的药用盐可以是钠盐。

在另一方面，本发明提供了反义寡核苷酸或其缀合物的药用盐，诸如药用钠盐、铵盐或钾盐。

制造方法

在另一方面，本发明提供了用于制造本发明的寡核苷酸的方法，该方法包括使核苷酸单元反应并由此形成包含在寡核苷酸中的共价连接的连续核苷酸单元。优选地，该方法使用亚磷酰胺化学方法(参见例如Caruthers et al,1987,Methods in Enzymologyvol.154,pages 287-313)。在另一个实施例中，该方法进一步包括使连续核苷酸序列与缀合物部分(配体)反应以将缀合物部分共价连接至寡核苷酸。在另一方面，提供了一种用于制造本发明的组合物的方法，该方法包括将本发明的寡核苷酸或缀合寡核苷酸与药用稀释剂、溶剂、载体、盐和/或佐剂混合。

药物组合物

在另一方面，本发明提供了药物组合物，其包含任何前述寡核苷酸和/或寡核苷酸缀合物或其盐以及药用稀释剂、载体、盐和/或佐剂。药用稀释剂包括磷酸盐缓冲盐水(PBS)，而药用盐包括但不限于钠盐和钾盐。在一些实施例中，药用稀释剂是无菌磷酸盐缓冲盐水。在一些实施例中，寡核苷酸以50μM至300μM溶液的浓度在药用稀释剂中使用。

用于本发明的合适的制剂可见于《雷明顿药物科学(第十七版)》(Remington'sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Philadelphia,Pa.,17th ed.,1985)中。对于药物递送方法的简要综述，参见例如Langer(Science 249:1527-1533,1990)。WO 2007/031091(通过引用并入本文)提供了药用稀释剂、载体和佐剂的其他合适的和优选的实例。WO2007/031091中也提供了合适的剂量、制剂、施用途径、组合物、剂型、与其他治疗剂的组合、前药制剂。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸或其缀合物或其药用盐为固体形式，诸如粉末、诸如冻干粉末。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸或其缀合物可与药用活性或惰性物质混合，用以制备药物组合物或制剂。药物组合物的组成和配制方法取决于许多标准，包括但不限于施用途径、疾病程度或施用剂量。

这些组合物可以通过常规的灭菌技术进行灭菌，或者可以进行无菌过滤。所得的水溶液可以包装后直接使用或冻干，在施用前将冻干的制剂与无菌水性运载体混合。制剂的pH通常为介于3至11之间，更优选地介于5和9之间或介于6和8之间，并且最优选地介于7和8之间，诸如7至7.5。可以将固体形式的所得组合物包装在多个单剂量单元中，每一个单元包含固定量的一种或多种上述试剂，诸如在片剂或胶囊的密封包装中。固体形式的组合物也可以灵活的量包装在容器中，诸如在设计用于局部适用的乳膏或软膏的可挤压管中。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸或其缀合物是前药。特别地，对于反义寡核苷酸缀合物，一旦前药被递送至作用位点例如靶细胞，缀合物部分就从寡核苷酸上裂解下来。

应用

本发明的增强反义寡核苷酸可作为研究试剂使用，例如用于诊断、治疗和预防。

在研究中，此类反义寡核苷酸可用于特异性调节细胞(例如体外细胞培养物)和实验动物中RTEL1蛋白质的合成，从而有助于靶标的功能分析或对其作为治疗干预靶标的可用性的评估。通常，通过降解或抑制产生蛋白质的mRNA从而防止蛋白质形成，或通过降解或抑制产生蛋白质的基因或mRNA来实现靶标调节。

如果在研究或诊断中采用本发明的反义寡核苷酸，则靶核酸可以是cDNA或衍生自DNA或RNA的合成核酸。

本发明还包括在体内或体外调节表达RTEL1的靶细胞中RTEL1表达的方法，所述方法包括以有效量向所述细胞施用本发明的反义寡核苷酸、其缀合物或药物组合物。

在一些实施例中，靶细胞是哺乳动物细胞，特别是人细胞。靶细胞可以是形成哺乳动物组织的一部分的体外细胞培养物或体内细胞。在优选的实施例中，靶细胞存在于肝脏中。靶细胞可以是肝细胞。

本发明的一个方面涉及用作药物的本发明的反义寡核苷酸、其缀合物或药物组合物。

在本发明的一个方面，本发明的反义寡核苷酸、其缀合物或药物组合物能够降低感染的细胞中的cccDNA水平，并因此抑制HBV感染。特别地，反义寡核苷酸或其缀合物能够影响以下参数中的一个或多个：i)减少cccDNA和/或ii)减少pgRNA和/或iii)减少HBV DNA和/或iv)减少感染的细胞中的HBV病毒抗原。

例如，抑制HBV感染的反义寡核苷酸或其缀合物可以i)与对照物相比，将感染的细胞中的cccDNA水平降低至少40％，诸如降低50％、60％、70％、80％或90％；或ii)与对照物相比，将pgRNA的水平减少至少40％，诸如减少50％、60％、70％、80％或90％。对照物可以是未处理的细胞或动物，或用适当的对照物处理的细胞或动物。

HBV感染的抑制作用可以在体外使用HBV感染的原代人肝细胞进行测量，或在体内使用人源化肝细胞PXB小鼠模型(可从PhoenixBio获得，也参见Kakuni等人,2014Int.J.Mol.Sci.15:58-74)进行测量。对HBsAg和/或HBeAg分泌的抑制可以通过ELISA测定，例如使用CLIA ELISA试剂盒(Autobio Diagnostic)根据制造商的说明进行。细胞内cccDNA或HBV mRNA和pgRNA的减少可通过qPCR测定，例如，如“材料和方法”章节所述。评估测试化合物是否抑制HBV感染的其他方法是通过例如WO 2015/173208中所述的qPCR测量HBV DNA的分泌，或使用Northern印迹杂交、原位杂交或免疫荧光测量。

由于RTEL1水平的降低，本发明的反义寡核苷酸、其缀合物或药物组合物可用于抑制HBV感染的发展或治疗HBV感染。特别地，与仅减少HBsAg分泌的化合物相比，本发明的反义寡核苷酸、其缀合物或药物组合物对cccDNA的去稳定化和减少作用更有效地抑制了慢性HBV感染的发展或治疗慢性HBV感染。

因此，本发明的一个方面涉及本发明的反义寡核苷酸、其缀合物或药物组合物用于减少HBV感染者中的cccDNA和/或pgRNA的用途。

本发明的另一方面涉及本发明的反义寡核苷酸、其缀合物或药物组合物在抑制慢性HBV感染的发展或治疗慢性HBV感染中的用途。

本发明的另一方面涉及本发明的反义寡核苷酸、其缀合物或药物组合物在降低HBV感染的人的传染性中的用途。在本发明的一个特定方面，本发明的反义寡核苷酸、其缀合物或药物组合物抑制慢性HBV感染的发展。

用本发明的反义寡核苷酸、其缀合物或药物组合物治疗(或预防性地接受本发明的反义寡核苷酸、其缀合物或药物组合物)的受试者优选为人，更优选地为HBsAg阳性和/或HBeAg阳性的人类患者，甚至更优选地为HBsAg阳性和HBeAg阳性的人类患者。

因此，本发明涉及一种治疗HBV感染的方法，其中该方法包括施用有效量的本发明的反义寡核苷酸、其缀合物或药物组合物。本发明进一步涉及预防由慢性HBV感染引起的肝硬化和肝细胞癌的方法。

本发明还提供了本发明的反义寡核苷酸、其缀合物或药物组合物在制备药物，特别是用于治疗HBV感染或慢性HBV感染或降低HBV感染之人的传染性的药物中的用途。在优选的实施例中，药物被制备成用于皮下施用的剂型。

本发明还提供了本发明的反义寡核苷酸、其缀合物、药物组合物在制备药物中的用途，其中所述药物为用于静脉内施用的剂型。

本发明的反义寡核苷酸、其缀合物或药物组合物可以用于联合疗法。例如，可以将本发明的反义寡核苷酸、其缀合物或药物组合物可与其他抗HBV试剂诸如干扰素α-2b、干扰素α-2a和干扰素αcon-1(聚乙二醇化和非聚乙二醇化)、利巴韦林、拉米夫定(3TC)、恩替卡韦、替诺福韦、替比夫定(LdT)、阿德福韦或其他新兴的抗HBV药物诸如HBV RNA复制抑制剂、HBsAg分泌抑制剂、HBV衣壳抑制剂、反义寡聚物(例如，如WO2012/145697、WO 2014/179629和WO2017/216390中所述)、siRNA(例如，在WO 2005/014806、WO 2012/024170、WO 2012/2055362、WO 2013/003520、WO 2013/159109、WO 2017/027350和WO2017/015175中所述)、HBV治疗性疫苗、HBV预防性疫苗、HBV抗体治疗(单克隆或多克隆)或TLR 2、3、7、8或9激动剂联合来治疗和/或预防HBV。

联合疗法

在一些实施例中，本发明的增强反义寡核苷酸、其缀合物或药物组合物是用于与另一治疗剂联合治疗。治疗剂可以例如是上述疾病或疾患的护理标准。

举例来说，本发明的反义寡核苷酸、其缀合物或药物组合物可以与其他活性物质联合使用，诸如基于寡核苷酸的抗病毒药(诸如基于序列特异性寡核苷酸的抗病毒剂)，其通过反义(包括其他LNA寡聚物)、siRNA(诸如ARC520)、适体、吗啉代物或任何其他抗病毒毒药，核苷酸序列依赖性作用模式作用。

作为进一步的实例，本发明的反义寡核苷酸、其缀合物或药物组合物可以与其他活性物质，诸如免疫刺激性抗病毒化合物，诸如干扰素(例如聚乙二醇化干扰素α)、TLR7激动剂(例如GS-9620)或治疗性疫苗联合使用。

作为进一步的实例，本发明的反义寡核苷酸、其缀合物或药物组合物可以与具有抗病毒活性的其他活性物质诸如小分子联合使用。这些其他活性物质可以是例如核苷/核苷酸抑制剂(例如恩替卡韦或富马酸替诺福韦二吡呋酯酯)、衣壳化抑制剂、进入抑制剂(例如Myrcludex B)。

在某些实施例中，另外的治疗剂可以是HBV剂、丙型肝炎病毒(HCV)剂、化疗剂、抗生素、镇痛剂、非甾体抗炎(NSAID)剂、抗真菌剂、抗寄生虫剂、止吐剂、抗腹泻剂或免疫抑制剂。

特别地，相关的实施例中，另外的HBV剂可以是干扰素α-2b、干扰素α-2a和干扰素αcon-1(聚乙二醇化和非聚乙二醇化)、利巴韦林；HBV RNA复制抑制剂；第二反义寡聚物；HBV治疗性疫苗；HBV预防性疫苗；拉米夫定(3TC)；恩替卡韦(ETV)；富马酸替诺福韦二吡呋酯酯(TDF)；替比夫定(LdT)；阿德福韦；或HBV抗体疗法(单克隆或多克隆)。

在其他特定的相关实施例中，另外的HCV剂可以是干扰素α-2b、干扰素α-2a和干扰素αcon-1(聚乙二醇化和非聚乙二醇化)；利巴韦林；Pegasys；HCV RNA复制抑制剂(例如ViroPharma的VP50406系列)；HCV反义剂；HCV治疗性疫苗；HCV蛋白酶抑制剂；HCV解旋酶抑制剂；或HCV单克隆或多克隆抗体疗法。

施用

本发明的增强反义寡核苷酸、其缀合物或药物组合物可以局部施用(诸如施用至皮肤、吸入、眼部或耳部)或肠内施用(诸如口服或通过胃肠道施用)或肠胃外施用(诸如静脉内、皮下或肌肉内施用)。

在一个优选的实施例中，本发明的反义寡核苷酸、其缀合物或药物组合物通过肠胃外途径施用，包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌肉内施用。在一个实施例中，活性反义寡核苷酸或其缀合物通过静脉内施用。在另一个实施例中，将活性反义寡核苷酸或其缀合物通过皮下施用。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸、其缀合物或药物组合物以0.1mg/kg至15mg/kg，诸如0.2mg/kg至10mg/kg、诸如0.25mg/kg至5mg/kg的剂量施用。施用可以是每周一次、每二周一次、每三周一次或甚至每月一次。

本发明还提供了如所述的本发明的反义寡核苷酸或其缀合物在制备药物中的用途，其中所述药物处于用于皮下施用的剂型中。

本发明的实施方式

本发明的以下实施例可以与本文描述的任何其他实施例联合使用。以上在本文中(特别是在章节“发明内容”、“定义”和“具体实施方式”中)提供的定义和解释比照适用于下文。

1.一种包含连续核苷酸序列的反义寡核苷酸，其与RTEL1核酸至少90％互补性，诸如100％互补性，其中反义寡核苷酸能够抑制RTEL1，诸如人RTEL1在细胞中的表达。

2.根据实施例1所述的反义寡核苷酸，其中连续核苷酸序列与如SEQ ID NO:1所示的人RTEL1前体mRNA的核苷酸11753-11774的区域完全互补，诸如来自SEQ ID NO:1的核苷酸11757-11774、核苷酸11756-11774或核苷酸11753-11770的区域。

3.根据实施例1和2所述的反义寡核苷酸，其中连续核苷酸序列与SEQID NO 7、8、9和/或10完全互补。

4.根据实施例1所述的反义寡核苷酸，其中连续核苷酸序列与如SEQ ID NO:1所示的人RTEL1前体mRNA的核苷酸8681-8701的区域完全互补。

5.根据实施例1和4所述的反义寡核苷酸，其中连续核苷酸序列与SEQID NO 11完全互补。

6.根据实施例1至5中任一项所述的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸的长度为12个至30个核苷酸，诸如长度为12个至22个核苷酸，诸如长度为16个至20个核苷酸。

7.根据实施例1至6中任一项所述的反义寡核苷酸，其中连续核苷酸序列为至少12个核苷酸，诸如14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个核苷酸的连续序列。

8.根据实施例7所述的反义寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列为18个或19个核苷酸的连续序列。

9.根据实施例1至8中任一项所述的反义寡核苷酸，其中连续核苷酸序列与选自由SEQ ID NO:3、4、5和6组成的组的序列100％相同；或其至少15个连续核苷酸。

10.根据实施例1至9中任一项的反义寡核苷酸，其在连续核苷酸序列中包含一个或多个经修饰的核苷。

11.根据实施例10所述的反义寡核苷酸，其中连续核苷酸序列中的一个或多个经修饰的核苷是2′糖修饰的核苷。

12.根据实施例11所述的反义寡核苷酸，其中一个或多个2'糖修饰的核苷独立地选自由以下项组成的组：2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2′-O-甲氧基乙基-RNA、2′-氨基-DNA、2′-氟-DNA、阿糖核酸(ANA)、2′-氟-ANA和LNA核苷。

13.根据实施例10至12中任一项所述的反义寡核苷酸，其中一个或多个经修饰的核苷为LNA核苷，诸如具有以下2′-4′桥-O-CH₂-的氧基LNA。

14.根据实施例13所述的反义寡核苷酸，其中一种或多种经修饰的核苷为β-D-氧基-LNA。

15.根据实施例1至14中任一项所述的反义寡核苷酸，其中连续核苷酸序列中的至少一个核苷间键为硫代磷酸酯核苷间键。

16.根据实施例1至15中任一项所述的反义寡核苷酸，其中连续核苷酸序列中的至少一个核苷间键为硫代磷酸酯核苷间键。

17.根据实施例1至16中任一项所述的反义寡核苷酸，其中连续核苷酸序列中的至少一个核苷间键为磷酸二酯核苷间键。

18.根据实施例17所述的反义寡核苷酸，其中连续核苷酸序列中的所有核苷间键都是硫代磷酸酯核苷间键。

19.根据实施例1至18中任一项所述的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸是能够募集RNA酶H的反义寡核苷酸，诸如RNA酶H1。

20.根据实施例19所述的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列由式5′-F-G-F′-3′的间隔聚体组成或包含式5′-F-G-F′-3′的间隔聚体。

21.根据实施例20所述的反义寡核苷酸，其中区域G的长度为6个至16个DNA核苷，诸如11个至16个DNA核苷。

22.根据实施例19至21中任一项所述的反义寡核苷酸，其中区域F和F′各自包含至少一个LNA核苷，例如其中区域F和F′各自包含至少一个LNA核苷。

23.根据实施例19至22中任一项所述的反义寡核苷酸，其中区域F的长度为1个至8个DNA核苷，诸如2个至4个DNA核苷。

24.根据实施例19至23中任一项所述的反义寡核苷酸，其中区域F’的长度为1个至8个DNA核苷，诸如2个至6个DNA核苷。

25.根据实施例19至24中任一项所述的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列由式F_2-4-G_11-16-F’_2-6的间隔聚体组成或包含式F_2-4-G_11-16-F’_2-6的间隔聚体。

26.根据实施例19至25中任一项所述的反义寡核苷酸，其中间隔聚体包含至少一个交替侧翼。

27.根据实施例19至25中任一项所述的反义寡核苷酸，其中间隔聚体包含两个均匀侧翼。

28.根据实施例1至27中任一项所述的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸选自由以下项组成的反义寡核苷酸的组：

AATTttacatactctgGT(SEQ ID NO:3，化合物ID No 3_1)，

AAttttacatactctGGTC(SEQ ID NO:4，化合物ID No 4_1)，

TTacatactctggtCAAA(SEQ ID NO:5，化合物ID No 5_1)以及

CTttattataactTgaAtCTC(SEQ ID NO:6，化合物ID No 6_1)，

其中大写字母为β-D-氧基LNA核苷，小写字母为DNA核苷，所有LNA C均为5-甲基胞嘧啶，所有核苷间键均为硫代磷酸酯核苷间键。

29.一种缀合物，其包含：根据实施例1至28中任一项所述的反义寡核苷酸，以及共价连接至所述反义寡核苷酸的至少一个缀合物部分。

30.根据实施例29所述的缀合物，其中缀合物部分包含至少一个选自由以下项组成的组的脱唾液酸糖蛋白受体靶向部分：半乳糖、半乳糖胺、N-甲酰基-半乳糖胺、N-乙酰半乳糖胺、N-丙酰基-半乳糖胺、N-正丁酰基-半乳糖胺和N-异丁酰基半乳糖胺。

31.根据实施例30所述的缀合物，其中脱唾液酸糖蛋白受体靶向部分是N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。

32.根据实施例30或31所述的化合物，其中缀合物部分相对于脱唾液酸糖蛋白受体靶向部分为一价、二价、三价或四价。

33.根据实施例32所述的化合物，其中缀合物部分由两个至四个末端GalNAc部分和将每一个GalNAc部分连接至可与反义化合物缀合的支链分子的间隔物组成。

34.根据实施例33所述的缀合物，其中间隔物为PEG间隔物。

35.根据实施例30至34中任一项所述的缀合物，其中缀合物部分是三价N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分。

36.根据实施例30至35中任一项所述的化合物，其中缀合物部分选自图5中的三价GalNAc部分中的一者。

37.根据实施例36所述的缀合物，其中缀合物部分为图5中的三价GalNAc部分，诸如图5D-1或图5D-2的三价GalNAc部分或者两者的混合物。

38.根据实施例29至37中任一项所述的缀合物，该缀合物化合物包含位于反义寡核苷酸与缀合物部分之间的接头。

39.根据实施例38所述的缀合物，其中生理上不稳定接头包含2个至5个连续的磷酸二酯连接的核苷或由其组成，诸如2个连续的磷酸二酯连接的核苷。

40.根据实施例29至39中任一项所述的缀合物，其中缀合物选自由以下项组成的组：

5′-GN2-C6_oc_oa_oA_sA_sT_sT_st_st_sa_sc_sa_st_sa_sc_st_sc_st_sg_sG_sT、

5'-GN2-C6_oc_oa_oA_sA_st_st_st_st_sa_sc_sa_st_sa_sc_st_sc_st_sG_sG_sT_s ^mC、

5′-GN2-C6_oc_oa_o ^mC_sT_st_st_sa_st_st_sa_st_sa_sa_sc_st_sT_sg_sa_sA_st_s ^mC_sT_s ^mC以及

5′-GN2-C6_oc_oa_o T_sT_sa_sc_sa_st_sa_sc_st_sc_st_sg_sg_st_s ^mC_sA_sA_sA

其中大写字母代表β-D-氧基LNA核苷，小写字母代表DNA核苷，其中每个LNA胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶，^mc是5-甲基胞嘧啶DNA，并且其中下标s代表硫代磷酸酯核苷间键，下标o代表磷酸二酯核苷间键，GN2-C6是下式的残基：

其中残基GN2-C6经由磷酸二酯键连接在寡核苷酸的5’末端，和/或其中GN2-C6是图5D1或图5D2的三价N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)，或两者的混合物，更优选其中GN2-C6是图5D1或图5D2中所示的三价N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)残基的混合物。

41.缀合物示于图1中。

42.缀合物示于图2中。

43.缀合物示于图3中。

44.缀合物示于图4中。

45.一种实施例1至28中任一项的寡核苷酸、或根据实施例29至44中任一项所述的缀合物的药用盐。

46.一种药物组合物，其包含根据实施例1至28中任一项所述的反义寡核苷酸、根据实施例29至44中任一项所述的缀合物或根据实施例45所述的药用盐，以及药用稀释剂、溶剂、载体、盐和/或佐剂。

47.一种用于在表达RTEL1的靶细胞中调节RTEL1表达的体内或体外方法，所述方法包括向所述细胞施用有效量的根据实施例1至28中任一项所述的反义寡核苷酸、根据实施例29至44中任一项所述的缀合物、根据实施例45所述的药用盐或根据实施例46所述的药物组合物。

48.一种治疗或预防疾病的方法，其包括向患有或易患所述疾病的受试者施用治疗或预防有效量的根据实施例1至28中任一项所述的反义寡核苷酸、根据实施例29至44中任一项所述的缀合物、根据实施例45所述的药用盐或根据实施例46所述的药物组合物，其中该疾病为乙型肝炎病毒(HBV)感染，诸如慢性HBV感染。

49.根据实施例1至28中任一项所述的反义寡核苷酸、根据实施例29至44中任一项所述的缀合物、根据实施例45所述的药用盐或根据实施例46所述的药物组合物，其用于医药中。

50.根据实施例1至28中任一项所述的反义寡核苷酸、根据实施例要求29至44中任一项所述的缀合物、根据实施例45所述的药用盐或根据实施例46所述的药物组合物，其用于乙型肝炎病毒(HBV)感染，诸如慢性HBV感染的治疗或预防。

51.根据实施例1至28中任一项所述的反义寡核苷酸、根据实施例29至44中任一项所述的缀合物、根据实施例45所述的药用盐或根据实施例46所述的药物组合物用于制备药物的用途，该药物用于乙型肝炎病毒(HBV)感染，诸如慢性HBV感染的治疗或预防。

实例

材料和方法

寡核苷酸合成

寡核苷酸合成是本领域公知的。以下是可以实施的方案。就设备、载体和所用浓度而言，本发明的寡核苷酸可以通过略有变化的方法来产生。

使用亚磷酰胺方法在Oligomaker 48上以1μmol规模在尿苷通用载体上合成寡核苷酸。合成结束时，使用氨水于60℃将寡核苷酸从固体支持物上切割5-16小时。通过反相HPLC(RP-HPLC)或通过固相萃取纯化寡核苷酸，并通过UPLC进行表征，并通过ESI-MS进一步确认分子量。

通过使用5′-O-DMT保护的亚酰胺在乙腈中的0.1M溶液和DCI(4,5-二氰基咪唑)在乙腈(0.25M)中用作活化剂，进行β-氰基乙基亚磷酰胺的偶联(DNA-A(Bz)、DNA-G(ibu)、DNA-C(Bz)、DNA-T、LNA-5-甲基-C(Bz)、LNA-A(Bz)、LNA-G(dmf)或LNA-T)。对于最后的循环，可以使用具有所需修饰的亚磷酰胺，例如，用于附接缀合物基团或这样的缀合物基团的C6接头。通过使用氢化黄原素(0.01M，在乙腈/吡啶9:1中)进行硫醇化以引入硫代磷酸酯键。可利用0.02摩尔的碘于THF/吡啶/水7:2:1引入磷酸二酯键。其余试剂是通常用于寡核苷酸合成的试剂。

对于固相合成后的缀合，可以在固相合成的最后一个循环中使用可商购的C6氨基接头亚磷酰胺，并且在脱保护并从固体载体上裂解后，分离出氨基连接的脱保护的寡核苷酸。使用标准合成方法通过官能团的活化来引入缀合物。

粗制化合物在PhenomenexC18 10μ150x10mm色谱柱上通过制备型RP-HPLC纯化。0.1M醋酸铵pH 8和乙腈以5mL/min的流速用作缓冲液。将收集的级分冻干以给出纯化的化合物，通常为白色固体。

缩写：

DCI：4,5-二氰基咪唑

DCM：二氯甲烷

DMF：二甲基甲酰胺

DMT：4,4’-二甲氧基三苯甲基

THF：四氢呋喃

Bz：苯甲酰基

Ibu：异丁酰基

RP-HPLC：反相高效液相色谱

原代人肝细胞(PXB-PHH)

从人源化小鼠(uPA/SCID小鼠)(本文称为PHH)收获的新鲜原代人肝细胞(PXB-PHH)

以96孔格式从PhoenixBio Co.,Ltd(Japan)获得，并在改良的肝细胞克隆生长培养基(dHCGM)中培养。dHCGM是一种DMEM培养基，其含有100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、20mM Hepes、44mM NaHCO₃、15μg/ml L-脯氨酸、0.25μg/ml胰岛素、50nM地塞米松、5ng/mlEGF、0.1mM Asc-2P、2％DMSO和10％FBS(Ishida等人，2015)。

将细胞在37℃于具有5％CO₂的潮湿气氛中进行培养。除周末外，每2天更换一次培养基直至收获。

HBV感染和寡核苷酸处理

将PHH与HBV(从慢性乙型肝炎(CHB)个体中纯化)以40的感染复数(MOI)以及4％PEG一起孵育24小时。次日除去病毒接种物并用PBS洗涤细胞3次，然后添加新鲜培养基。

为了建立cccDNA，在HBV感染后第3天开始在PHH中处理化合物。细胞以1:10稀释阶梯剂量反应方式从10μM开始给药。在HBV感染后第3天、第5天和第7天，以最终体积为100μI/孔的dHCGM培养基向细胞给予寡核苷酸化合物。感染后第5天开始10nM恩替卡韦(ETV)处理，确保通过qPCR测量真实的cccDNA，并且每两天(周末除外)更换一次包含10nM ETV的培养基，直到HBV感染后第16天收获细胞。所有实验以三次生物重复进行。

细胞内RTEL1 RNA的实时PCR

使用Qiagen BioRobot通用系统和RNeasy 96孔提取板(RNeasy 96BioRobot 8000试剂盒(12)/目录号IID:967152)根据制造商的方案从细胞提取总mRNA。在ABIQuantStudio^TM12k Flex上使用实时PCR分析mRNA表达水平。在技术重复中使用TaqManFast Advanced Master Mix(Life Technologies，目录号4444558)通过qPCR对β-肌动蛋白(ACT B)进行定量。使用Fast SYBR^TMGreen Master Mix(Life Technologies，目录号4385612)对RTEL1基因进行qPCR。结果相对于人ACT B内源性对照物进行标准化。使用比较周期阈值2-ΔΔCt方法分析mRNA表达，该方法针对参考基因ACT B和未处理的细胞进行了标准化。表7列出了用于ACTB RNA和RTEL1 RNA定量的引物：

表7：ACT B和RTEL1 RNA qPCR引物

HBV cccDNA定量

使用SDS裂解缓冲液(50mM Tris pH8、5mM EDTA、1％ SDS)从HBV感染的原代人肝细胞中提取DNA。在80μl SDS裂解缓冲液中裂解细胞后，将样品在-80℃下冷冻至少2小时。将样品在37℃下解冻，并向96孔板的每个孔中添加1μl蛋白酶K(目录号AM25448@Ambionbiosciences，20mg/mL原液)，并将样品在56℃下孵育30分钟。孵育后，添加来自ZYMOResearch Genomic DNA Clean&Concentrator试剂盒(ZymoResearch，目录号D4067)的3体积ChIP DNA结合缓冲液，并按照制造商的方案纯化DNA。将DNA在20μl DNA洗脱缓冲液中洗脱，并使用2μl DNA进行qPCR。

使用比较循环阈值2-ΔΔCt方法对技术重复中的cccDNA表达水平进行定量。定量实时聚合酶链式反应测量在QuantStudio 12K Flex PCR系统(Applied Biosystems)上进行。使用Fast SYBR^TMGreen Master Mix(Life Technologies，目录号4385612)对线粒体DNA(mitoDNA)和作为内源对照的未处理细胞进行标准化。将循环仪设置调整为在95℃下孵育5分钟，然后进行45个下述循环，即95℃孵育1秒和60℃孵育35秒。使用的引物列于下表8(图表中的所有探针均为SYBR Green)：

表8：cccDNA qPCR引物。

实例1：靶向RTEL1的反义寡核苷酸对HBV感染的PHH细胞中RTEL1 RNA和cccDNA的影响。

使用表6中的寡核苷酸化合物测试RTEL1敲低对RTEL1 RNA和cccDNA的影响。如“材料和方法”章节所述培养PHH。如上所述，用来自表6的化合物处理HBV感染的PHH细胞。16天处理后，如上所述通过qPCR测量RTEL1 mRNA和cccDNA。结果显示在表9中，为平均无药物对照(NDC)样品的百分比(即，值越低，抑制/减少越大)。

表9：LNA ASO敲低RTEL1后对cccDNA的影响

对于化合物：大写字母代表LNA核苷(使用了β-D-氧基-LNA核苷)，所有LNA胞嘧啶均为5-甲基胞嘧啶，小写字母代表DNA核苷。所有核苷间键均为硫代磷酸酯核苷间键。

实例2：就浓度反应曲线而言，不同浓度的靶向人MDA-MB-231细胞中RTEL1 mRNA的反义寡核苷酸的体外功效的测试。

人MDA-MB-231细胞系购自ATCC，并按照供应商的建议保持在37℃和5％ CO₂的加湿培养箱中。对于测定，将3500个细胞/孔接种在96孔板中的培养基中。将细胞培养24小时，然后添加溶解在PBS中的寡核苷酸。寡核苷酸最高筛选浓度：50μM和随后8个阶梯的1:1稀释。添加寡核苷酸后3天，收获细胞。根据制造商的说明，使用PureLink^TMPro 96RNA纯化试剂盒(Thermo Fisher Scientific)提取RNA，并在50μl水中洗脱。随后将RNA用无DNA酶/RNA酶的水(Gibco)稀释10倍，并加热至90℃保持一分钟。

对于基因表达分析，使用qScript^TMXLT One-Step RT-qPCR LowROX^TM(Quantabio)在双链体设置中进行一步法RT-qPCR。将以下TaqMan引物测定用于qPCR：RTEL1_Hs00249668_m1[FAM-MGB]和内源性对照GUSB_Hs99999908_m1[VIC-MGB]。所有引物组均购自Thermo Fisher Scientific。IC50测定是在GraphPad Prism7.04中根据生物学重复n＝2进行的。用50μM寡核苷酸处理时的相对RTEL1 mRNA水平以对照(PBS处理的样品)的百分比形式显示在表10中。

表10：Max K_D时的IC50值和mRNA水平

如图7所示，人细胞系MDA-MB-231中的浓度反应曲线显示，这些化合物在敲低人类RTEL1 mRNA方面表现出非常好的功效和效力。

实例3：本发明化合物与现有技术化合物的体内功效的直接比较

在该实验中，将本发明的化合物(CMP ID No：3_1、4_1、5_1和6_1，参见例如表6)与WO 2020/011902 A1中公开的化合物进行比较。所测试的现有技术化合物示于表11中(CMPID NO:7_1至23_1)。具体来说，测试了对人MDA-MB-231细胞中RTEL1 mRNA水平的影响。

对于基因表达分析，使用qScript^TMXLT One-Step RT-qPCRLowROX^TM(Quantabio)在双链体设置中进行一步法RT-qPCR。将以下TaqMan引物测定用于qPCR：RTEL1_Hs00249668_m1[FAM-MGB]和内源性对照GUSB_Hs99999908_m1[VIC-MGB]。所有引物组均购自Thermo Fisher Scientific。IC50测定是在GraphPad Prism7.04中根据生物学重复n＝2进行的。用50μM寡核苷酸处理时的相对RTEL1 mRNA水平以对照(PBS处理的样品)的百分比形式显示在表11中。结果在图8中示出。

表11：Max K_D时的IC50值和mRNA水平

实例4：在HepG2和3T3细胞中以100nM浓度进行反义寡核苷酸Caspase筛选24小时。

在该实验中，通过HepG2细胞中的Caspase筛选评估本发明的化合物(CMP ID No：3_1、4_1、5_1和6_1，参见例如表6)的毒性。本研究包括实例3中测试的现有技术化合物。此外，分析了全长CMP ID NO:3_1和5_1的较短代谢物(更多细节，参见实例6)。

将HepG2或3T3细胞在约70％汇合度在含有GlutaMax(Gibco#41090；HepG2)的MEM培养基或含有Glutamax(Gibco#31966)的DMEM中培养，该培养基添加了5mMHEPES(3T3)，补充有10％热灭活胎牛血清。使用0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液(Gibco#25200056)分离细胞，并以1x 10⁴个细胞/孔(HepG2)或0.25x 10⁴个细胞/孔(3T3)的密度接种到黑色、透明96孔板(美国纽约Corning#3904)中。接种后24小时，使用溶解在Opti-MEM(Gibco#31985)中的100nM寡核苷酸，用Lipofectamine 2000(Life Technologies#11668019)瞬时转染细胞。使用3/7测定(美国威斯康星州麦迪逊Promega Corporation)确定Caspase-3/7活性。转染后24小时将重构的/>3/7试剂添加到细胞中，孵育60分钟，将细胞裂解物转移至不透明96孔板(美国纽约Corning#3600)中，然后根据制造商的说明在Enspire多模式读板器(Perkin Elmer)上确定发光。

结果如表12所示。

表12：Caspase评分结果

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AW值超过60％的化合物被视为有毒(T)。AW值为40％-60％的化合物被视为中等毒性(MT)。AW值为20％-40％的化合物被视为轻度毒性(M)。AW值低于20％的化合物被视为无毒(NT)

从表12可以得出，具有CMP ID NO:11_1(MT)、CMP ID NO:12_1(T)、CMP ID NO:13_1(MT)、CMP ID NO:14_1(MT)、CMP ID NO:15_1(T)、CMP ID NO:16_1(T)、CMP ID NO:17_1(T)、CMP ID NO:18_1(T)、CMP ID NO:19_1(T)、CMP ID NO:20_1(MT)、CMP ID NO:21_1、CMPID NO:22_1和CMP ID NO:23_1的化合物显示中等毒性(MT)或有毒(T)，从而取消选择化合物以进行进一步分析。

实例5：就浓度反应曲线而言，不同浓度的靶向人MDA-MB-231细胞中RTEL1 mRNA的全长反义寡核苷酸及其代谢物的体外功效的测试。

已知反义寡核苷酸在细胞中代谢。在此实验中，测试了全长寡核苷酸及其3'末端代谢物(即n-1、n-2、n-3、n-4、n-5和n-6)的减少RTEL1mRNA靶标的体外效力。

人MDA-MB-231细胞系购自ATCC，并按照供应商的建议保持在37℃和5％ CO₂的加湿培养箱中。对于测定，将3500个细胞/孔接种在96孔板中的培养基中。将细胞培养24小时，然后添加溶解在PBS中的寡核苷酸。寡核苷酸最高筛选浓度：50μM和随后8个阶梯的稀释。添加寡核苷酸后3天，收获细胞。根据制造商的说明，使用PureLink^TMPro 96RNA纯化试剂盒(Thermo Fisher Scientific)提取RNA，并在50μL水中洗脱。随后将RNA用无DNA酶/RNA酶的水(Gibco)稀释10倍，并加热至90℃保持一分钟。

对于基因表达分析，使用qScript^TMXLT One-Step RT-qPCR LowROX^TM(Quantabio)在双链体设置中进行一步法RT-qPCR。将以下TaqMan引物测定用于qPCR：RTEL1_Hs01548056_m1[FAM-MGB]和内源性对照GUSB_Hs99999908_m1[VIC-MGB]。所有引物组均购自Thermo Fisher Scientific。相对RTEL1 mRNA水平显示为对照(PBS处理的样品)的百分比，并使用GraphPad Prism7.04确定IC₅₀。

结果在图9和表13中示出。

表13：全长寡核苷酸及其代谢物的体外效力

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从表13和图9a可以得出，全长寡核苷酸CMP 5_1的IC₅₀为0.6μM。有利地，在其他代谢物(n-3至n-6)显示最大功效和效力减少之前，第一和第二代谢物(CMP 5_1-1和CMP 5_1-2)保留相似的靶标敲低活性，IC₅₀分别为0.4μM和0.7μM。对于所有其他化合物，与它们各自的全长序列化合物相比，n-1和n-2代谢物已经显示出效力和/或最大功效的显著损失。

实例6：CMP 5_1-GalNAc反义寡核苷酸的体内研究

研究方案

该研究在HBV感染的中进行，这是一种具有稳定人肝细胞植入的嵌合小鼠模型(PhoenixBio)，共77天，分为3组(载体、CMPD3_1_GalNAc、CMPD5_1_GalNAc)，每组由20只动物组成。每周使用10mg/kg的化合物或等体积的载体向动物给药。分别在第28天和第56天处死5只动物/组。在第77天处死其余动物，随后对动物的肝脏进行生物分析。研究概要方案在图10中示出。

方法和材料

用于CMP 3_1和CMP 5_1的GalNAc缀合物通过本领域已知的方法产生(参见例如Javanbakh等人，Liver-Targeted Anti-HBV Single-Stranded Oligonucleotides withLocked Nucleic Acid Potently Reduce HBV Gene Expression In Vivo.Mol TherNucleic Acids.2018年6月1日；11:441-454.doi:10.1016/j.omtn.2018.02.005.Epub2018年2月23日PMID:29858079；PMCID:PMC5992345)。产生的缀合物分别在图1和表4中示出。

动物和处理

HBV基因分型C型感染的人肝嵌合uPA/SCID小鼠(PXB小鼠；供体肝细胞BD195(Corning Incorporated))购自PhoenixBio Co,Ltd.。动物处理由位于日本东广岛的PhoenixBio Co,Ltd.现场进行。选择给药开始(第0天)时至少为20周且在给药开始前一天(第-1天)测定的体重为18g或以上的雄性小鼠用于研究。小鼠在给药开始前至少6周感染了HBV基因分型C型(代码号：PBB004，批号：180118，PhoenixBio Co.,Ltd.)，并在第-7天显示血清HBV-DNA水平>1x10⁶拷贝/ml(通过qPCR确定)。在第-1天基于体重的算术平均值以及血液h-Alb浓度和血清HBV-DNA浓度的几何平均值确定研究开始时的组随机化。

10mg/kg的所有剂量均基于给药当天施用前小鼠的个体体重计算。所有受试者小鼠在第0、7、14、28、35、42、49、56、63和70天接受使用带有永久连接针头的一次性1.0mL注射器(Terumo Corporation)将剂量制剂注射到上背部的颈部皮下组织中。

在各自的处死日，用异氟烷麻醉目标动物并通过心脏穿刺和放血处死。取出肝脏并将左外侧叶分成约100mg的切片。记录准确的重量，并将肝脏样品在液氮中快速冷冻并储存在-80℃直至进一步处理。

根据需要处死具有垂死迹象或体重减轻>初始体重的20％的动物。所有过早终止/发现死亡的动物以及处死时患有胸腺瘤/淋巴瘤的小鼠均被排除在分析之外。

RTEL1 mRNA表达的定量

将肝组织样品保持冷冻直至在MagNA Pure LC RNA分离组织裂解缓冲液(产品编号03604721001，Roche)中裂解，并按照用户手册使用MagNA Pure 96细胞RNA大容量试剂盒(产品编号05467535001，Roche)在MagNA Pure 96仪器(Roche)上继续提取RNA，并且用水调节RNA浓度。

对于基因表达分析，使用qScript^TMXLT One-Step RT-qPCRLowROX^TM(Quantabio)进行一步法RT-qPCR。将以下TaqMan引物测定用于qPCR：Hs01548056_m1；Hs00249680_m1；Hs00249668_m1和参考基因GAPDH_Hs99999905_m1；PGK1_Hs99999906_m1和GUSB_Hs99999908_m1。所有引物组均购自Thermo Fisher Scientific。相对mRNA表达水平以相对于盐水处理对照组的百分比显示。

结果在图11中示出。分析显示，每周给药10mg/kg的CMP3_1_GalNAc，具有大约80％的敲低功效。每周给药10mg/kg的CMP5_1_GalNAc，具有约95％的敲低功效。

实例7：原代人肝细胞的体外研究

方法和材料

细胞培养

通过胶原酶灌注法从具有人源化肝脏的嵌合尿激酶型纤溶酶原激活物/严重联合免疫缺陷病(uPA/SCID)小鼠中分离出原代人肝细胞(PHH)，上述小鼠获自PhoenixBio(日本广岛)。将PHH以每孔7×10⁴个细胞的浓度接种于I型胶原包被的96孔板中，培养基为改良的肝细胞克隆生长培养基(dHCGM)。dHCGM是一种DMEM培养基，其含有100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、20mM Hepes、44mM NaHCO₃、15μg/ml L-脯氨酸、0.25μg/ml胰岛素、50nM地塞米松、5ng/ml EGF、0.1mM Asc-2P、2％ DMSO和10％ FBS(Ishida等人，2015)。

将细胞在37℃于具有5％ CO₂的潮湿气氛中进行培养。除周末外，每2天更换一次培养基直至收获。

然后将感染复数(MOI)为40的HBV基因分型C型添加到96孔板中的细胞中，最终浓度为4％ PEG 8000(Sigma-Aldrich)。感染的细胞在37℃下孵育20小时，然后用PBS洗涤两次以去除HBV接种物并重新填充完全培养基。感染后第4天，用不同浓度的LNA处理细胞。感染后第6天和第8天用新的LNA更换培养基。将磷酸盐缓冲盐水(PBS)用作“无药物”对照(NDC)。感染后第19天收获上清液和细胞并用于HBV标记物和靶标敲除分析。

根据制造商的方案，使用细胞计数试剂盒8(Sigma-Aldrich)评估LNA的细胞毒性，并表示为相对于NDC的细胞毒性百分比。

RNA提取和实时定量PCR

根据制造商的方案，使用MagNA Pure 96robot和MagNA Pure 96Cellular RNA大容量试剂盒(Roche)从细胞中提取细胞内mRNA。使用QuantStudio 12K Flex(LifeTechnologies)使用TaqMan RNA-to-Ct一步试剂盒(Applied Biosystems,#4392938)以技术重复进行相对总HBV、RTEL1、pgRNA和β-葡糖醛酸酶(GusB)内源对照mRNA的定量。使用比较周期阈值2-ΔΔCt方法分析mRNA表达，该方法针对参考基因GusB和无药物对照进行了标准化。TaqMan引物和测定ID如下：RTEL1，Hs02568623_s1；总HBV RNA Pa03453406_s1；HBVpgRNA AILJKX5。使用Hs00939627_m1作为参考基因GusB。所有引物和探针组均从ThermoFisher获得。

25μM的反义寡核苷酸的结果显示在表14中，其中尤其包括关于细胞的细胞毒性和RTEL1 mRNA敲低的信息。CMP10_1显示出高细胞毒性，但靶向RTEL1 mRNA的功效较差。此外，CMP9_1显示了第二差的RTEL1mRNA敲低，剩余RTEL1 mRNA为57％。

表14：原代人肝细胞的体外研究(25μM反义寡核苷酸)

5μM反义寡核苷酸的结果如表15所示。CMP10_1在靶向RTEL1mRNA方面表现出较差的功效。此外，CMP9_1再次显示出第二差的RTEL1 mRNA敲低，剩余RTEL1 mRNA为79％。

表15：原代人肝细胞的体外研究(5μM反义寡核苷酸)

实例8：CMP5_1-GalNAc的体内概念验证

研究方案

该研究在HBV感染的小鼠中进行，这是一种具有稳定人肝细胞植入的嵌合小鼠模型(PhoenixBio)，将它们在第56天和第105天处死。在8周的每周给药5、10和20mg/kg后(第56天，参见图12)对CMP5_1-GalNac进行了评估。此外，还在15周的每周给药10mg/kg后(第105天)对CMP5_1-GalNac进行了评估。对于每组，都有一个单独的载体对照组，接受与治疗动物相同体积的载体。研究开始时所有组均为6只小鼠。对动物的肝脏进行生物分析。

方法和材料

动物和处理

HBV基因分型C型感染的人肝嵌合uPA/SCID小鼠(PXB小鼠；供体肝细胞BD195(Corning Incorporated))购自PhoenixBio Co,Ltd.。动物处理由位于日本宇土的LSIMSafety Institute Corporation进行。选择给药开始(第0天)时至少为25周且在给药开始前一天(第-1天)测定的体重为18g或以上的雄性小鼠用于研究。小鼠在给药开始前至少6周感染了HBV基因分型C型(代码号：PBB004，批号：180118，PhoenixBio Co.,Ltd.)，并在第-7天显示血清HBV-DNA水平>1x10⁶拷贝/ml(通过qPCR确定)。在第-1天研究开始时基于体重和血液h-Alb浓度以及血清HBV-DNA浓度进行分层随机化。

所有剂量均基于给药当天施用前小鼠的个体体重计算。所有受试者小鼠都接受了将剂量制剂或匹配的载体注射到上背部的颈部皮下组织中。第56天处死的动物在第0、7、14、21、28、35、42和49天进行注射(见图12)。连续两次注射10mg/kg，剂量为20mg/kg/周，以避免嵌合肝脏中ASGPR超载。因此，这些小鼠在第0、1、7、8、14、15、21、22、28、29、35、36、42、43、49和50天给药。在第0、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77、84、91和98天，使用带有永久连接针头的一次性1.0mL注射器(Terumo Corporation)向在第105天处死的动物施用10mg/kg(参见图12)。

通过Southern印迹分析确定cccDNA

将肝组织保持冷冻直至在DNA提取缓冲液(50mM Tris pH8、5mM EDTA、150mMNaCl、1％ SDS)中匀浆。首先用RNA酶混合物(ThermoFisher)在环境温度下消化提取物30分钟，然后在轻微搅拌下用Proteinase K(ThermoFisher)在56℃下消化2小时。通过离心沉淀碎片，并用1体积UltraPure缓冲液饱和苯酚(ThermoFisher)振荡3次，然后用1体积苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1；ThermoFisher)提取，从上清液中提取DNA。然后通过添加1体积100％乙醇和60mM(最终)NaAc(SigmaAldrich)在-20℃过夜沉淀DNA。然后通过离心沉淀DNA，用70％乙醇洗涤沉淀并风干，然后重悬于10mM Tris-HCl pH8(ThermoFisher)中。

DNA含量使用NanoDrop(ThermoFisher)进行定量，并将浓度标准化为1.5μg/μl。然后将30μg DNA用70U T5核酸外切酶(New England Biolabs)在1x CutSmart缓冲液(NewEngland Biolabs)中于37℃消化2小时。对于每个样品，将等体积与Blue Juice上样缓冲液(ThermoFisher)混合，然后上样到0.95％琼脂糖-TAE凝胶(SigmaAldrich)上。在每组(生物学)样品之间，添加1个载有DNA分子量标记物VII(Roche)的泳道(每个泳道中的量相同)。分离后，将凝胶转移至新鲜的0.2M HCl(Acros Organics)中10分钟，然后用水冲洗三次。随后，将凝胶置于变性缓冲液(0.5M NaOH、1.5M NaCl)中30分钟，并用水冲洗一次。接下来，将凝胶转移至中和缓冲液(0.5M Tris pH7.5、1.5M NaCl)中30分钟。最后，用20x SSC缓冲液(ThermoFisher)将凝胶平衡30分钟。然后根据制造商的说明，使用TurboBlotter试剂盒(Cytiva)将DNA转移至Hybond-XL膜(Cytiva)，并使用20x SSC缓冲液(ThermoFisher)进行过夜转移。转移后，DNA通过1800J紫外线辐射辐照与膜交联，然后将膜干燥。

对于HBV cccDNA的特异性检测，根据制造商的说明，将DIG核酸检测试剂盒与DIGEasyHyb缓冲液以及DIG洗液和封闭缓冲液套件(均为Roche)一起使用。根据制造商的说明，使用DIG PCR探针试剂盒(Roche)通过PCR生成探针。含有HBV基因分型C型基因组的质粒用作模板，具有以下引物：正向引物，GTTTTTCACCTCTGCCTAATCATC(SEQ ID NO:70)；反向引物，GCAAAAAGTTGCATGGTGCTGGT(SEQ ID NO:71)。

使用在100℃变性5分钟的探针进行杂交，然后快速冷却至4℃在37℃下过夜。根据制造商的说明进行洗涤和检测。使用FUSION FX系统(Vilber)获取图像，设置适当的曝光时间以检测载体对照样品中的cccDNA。为了进行分析，使用ImageStudio软件(Licor)对cccDNA带(2.1kB大小)进行定量。为了解释不均匀转移，还对DNA分子量标记物VII的2.8kB带进行定量，并将cccDNA带强度标准化为构成该组的两个带的平均强度。然后将各个值标准化为载体对照组的平均带强度。

RTEL1 mRNA分析

对于基因表达分析，使用qScript^TMXLT One-Step RT-qPCR LowROX^TM(Quantabio)进行一步法RT-qPCR。将以下TaqMan引物测定用于qPCR：Hs01548056_m1；Hs00249680_m1；Hs00249668_m1和参考基因GAPDH_Hs99999905_m1；PGK1_Hs99999906_m1和GUSB_Hs99999908_m1。所有引物组均购自Thermo Fisher Scientific。相对mRNA表达水平以相对于盐水处理对照组的百分比显示。/>

图13A显示每周给予CMP5_1-GalNAc持续105天的实例，使RTEL1mRNA减少至约15％且使cccDNA减少至约20％。

图13B显示在第56天每周给药5、10和20mg/kg CMP5_1-GalNac后，RTEL1 mRNA分别敲低87％、91％和97％。给药10和20mg/kg CMP5_1-GalNac后，cccDNA分别减少59％和73％。

结论：从以上实例可知，CMP ID 5_1显示出用于在体内和体外靶向RTEL1 mRNA的安全且有效的化合物。我们在这里展示了CMP ID_5_1良好的体外药物特性，并且我们展示了RTEL1的靶标可以在体内非常有效地参与病毒cccDNA的随后的减少。此外，我们已经表明，通过下调RTEL1mRNA，可以使用乙型肝炎感染的人源化小鼠模型引发对病毒cccDNA的显著剂量依赖性效应。化合物5_1还具有从3’末端降解后保留活性的特性。这意味着，与全长CMP ID_5_1相比，n-1和n-2从3'末端开始具有相当的体外效力。n-3降解仍保留对RTEL1的活性，尽管体外效力较低。这一特征给该分子带来了明显的好处，因为母体分子的代谢物仍然对RTEL1mRNA产生所需的影响。

序列表

<110> 豪夫迈·罗氏有限公司 (F. Hoffmann-La Roche AG)

<120> 用于抑制 RTEL1 表达的增强寡核苷酸

<130> P35909

<160> 71

<170> PatentIn 3.5 版

<210> 1

<211> 38444

<212> DNA

<213> 智人

<400> 1

agtcagccct gctgccagcc agtgccgggt gctggggact cagggaggcc cgccgggacc 60

actgcgggac agtgagccga gcagaagctg gaacgcagga gaggaaggag agggggcggt 120

cagggctctc aggagccggg tcctgggcaa ggcgcagccg ttttcaaatt ttcaggaaag 180

cggtcggctc acactcgagc agtaaaaaga tgcctctggg gaggaggccc gtgcagctct 240

ccgggcaatg gtggtggctc ggcctagaga ggcggtagtg gaacgcagac cctggtgggg 300

gaatgacatc aagggaggag acgggcggga ccccagattt ctgcctgtgg gcgatggaag 360

tgaggttcac tggccagcgg agccggacac agaacgcgca aaacgccgtg taggcctgga 420

ggagccgaag agcaggcgga ccccctccgc gggggaacag tttccgccgg gagcacaaag 480

caacggaccg gaagtggggg gcggaagtgc agtgggctca gcgccgactg cgcgcctctg 540

cccgcgaaaa ctctgagctg gctgacagct ggggacgggt ggcggccctc gactggagtc 600

ggttgagttc ctgagggacc ccggttctgg aaggttcgcc gcggagacaa gtgagcagtg 660

agtcgcagtg accctacaag tggttctttt acccgagcgg ctcgtaggcg cgttgcggtt 720

tttcgaaact acagctcccg gcaggcccca agccgccctc ggggccgcgg gtcggcggat 780

tggccgcgct gcattttggg acctgtagtt tcctgcgctc gtggcgctgg cgccgcggcg 840

ttggctgagc ccttgaccgg ggctggaggg aagggccgac attcagtgtg tccgcgtctg 900

ttctgttagt cccagttccc gggcgggatt gaggcttaga gaagttgagt gatttgctga 960

gggctgcacg ggttggcatc ccggcatgct ctttcgctac tttggctgca tctggttgcc 1020

cacccgggcg gatggggaat ggactccagc cagccaggag ggcagagggc tggagaggca 1080

gggccggagg ttcagaccct ccgctctgac gttgcgcctg gtgaggccgg gaggggtgcc 1140

gcttgcctct tcagccctca cgctcttgtg gaagtcgcgg aattactgca ggcggaactt 1200

gcagcactgt gggcgtcttt tccagagaag gacggagttg tggggcggga ggataaggca 1260

aggcccagcc acttcgcatc ttcgccccgc cagctcctcg agatgggata taccagggtt 1320

gctctccaac cctctccgca ggagggactg atggaaacgc ctgggaaagt agcccggtac 1380

ccacaaaggc tgtctacaaa cagagtctta ctgtctttcc caggtctgtg ccatagggat 1440

tctcgaagag aacagcgttg tgtcccagtg cacatgctcg catcgcttac caggagtgcc 1500

cgagacccta agatgttcgg agtggttttt tcgcacagac ccgaatagcc tgcccctcag 1560

ccacgctctg tgcccttctg agaacaggct gatatgccca agatagtcct gaatggtgtg 1620

accgtagact tccctttcca gccctacaaa tgccaacagg agtacatgac caaggtcctg 1680

gaatgtctgc agcaggtaga gcacaggccc cgaggaaagg actgcgggtg ggtggagctt 1740

cagccaggac ggggtgtgct tccctctccc ggcccattcc agccaggccc ctccgggcca 1800

gaggcagcgt ctgtcataaa aagggctggt gttccaggtg gggtcagaga gaggattgac 1860

aagtaaaaac gatcgtcctt tgaagggggc cggcccctcc acacctgtgg gtatttctca 1920

tcaggcggga cgagagactg agaaaatgaa taagacacag agacaaagta tagagagaaa 1980

agtgggccca ggggaccggc gctcagcata cagaggacct gcaccggcac cagtctctga 2040

gtttcctcag tattcattaa ttactatttt cactatctca gcaagaggaa tgcggcagga 2100

cagcaaggtg atagtgggga gaaggtcagc aagaaaacgt gagcaaagga atctgggtca 2160

caaataagtt caagggaagg tactatgcct ggatgtgcac gtaggctagt tttatgcttt 2220

tctccaccca aacatctcgg tggagtaaag agtaacagag cagcattgct gccaatatgt 2280

ctcgcctcct gccacagggc ggcttttctc ctatctcaga attgaacaaa tgtacaatcg 2340

ggttttatac cgaaacattc agttcccagg ggcaggcagg agacagtggc cttcctctat 2400

ctcgactgca agaggctttc ctcttttact aatcctcagc acagaccctt cacgggtgtt 2460

gggctggggg actgtcaggt ctttcccatc ccacgaggcc atatttcaga ctatcacatg 2520

gagagaaacc ttgggcaata cccggctttc cagggcagag gtccctgcgg ctttccgcag 2580

tgcatcgtgc ccctggttta tcgagactgg agaatggcga tgacttttac caagcatact 2640

gcctgtaaac atattgttaa caaggcacgt tctgcacagc tctagatccc ttaaaccttg 2700

attccataca acacatgttt ctgtgagctc aaggctgggg caaagttaca gattaacagc 2760

atcttagggc aaagcaattg ttcagggtac aggtcaaaat ggagtgtgtt atgtcttccc 2820

tttctacata gacacagtaa cagtctgatc tctcttttcc ctacagtcct tgagggtgac 2880

agacttagga gtgccttggg ggcctctctg aggagcagct gatattcacg ggtcaggagg 2940

aagcatttcc attagagggg cagccggtgg ccagcctcac ttggaaggtc tttgaacctc 3000

gggggtgcag ggaggtggca gtggtgcagg ttgccttctc ctgggttcct tgaggtgccc 3060

tcttgtaccc ggctcacacc cttcccctcc ccgagtttcc tgctcaggtt cccgtctgag 3120

agcttgtatg taggacgtca gataggacag cataaatgtt tggatccaga aacgcagaac 3180

agtttcctat tttgagactt gacacctaat tagtcatctt actatttaag ctgaaaaata 3240

gtgtcgtgtt ttgggtaacg ttctgcaaat cgtttgctaa tggcggctga gttgcttcac 3300

gccctttagg gcaagagtgg gacttgcctg tggacttctc cgcggtccca cagggctctc 3360

gccacctggc agtggcctct gcatctgcaa agagctgccc gctggctgcc gaagcttgtc 3420

tcagggcagc ttgtgtggcc tcgcctcttc ctggcttccc cgtaaccctt gctccgaact 3480

ccgttcagaa ggtgaatggc atcctggaga gccctacggg tacagggaag acgctgtgcc 3540

tgctgtgcac cacgctggcc tggcgagaac acctccgaga cggcatctct gcccgcaaga 3600

ttgccgagag ggcgcaagga gagcttttcc cggatcgggc cttgtcatcc tggggcaacg 3660

ctgctgctgc tgctggagac cccataggtg accctagttc ccaggcctct cctggcctcc 3720

tgtggggatg gttggcaagg gatggcgctg agggtggggt gggcccatgg ggactcctgc 3780

cgtctctcaa gcagaactca aggagaattt tttagctgct gtataatttc tcgccatcgt 3840

gggtgtaaac ctagggttgg gcttttttgc tgaattaggg cacggcagat gcccacttca 3900

cccatttttg ataaaccagt atctggggtg tcagattctt ggctgtctgc agggccgagt 3960

tagccgaatg ccacctgcct ttgatacgtg agaacgttgt ctgagaaccg tgacttctgt 4020

gcttgcttgt gtctggtcag cttgctacac ggacatccca aagattattt acgcctccag 4080

gacccactcg caactcacac aggtcatcaa cgagcttcgg aacacctcct accggtgggt 4140

cagacgagtt tacacctgtc tcggggtcct caagagaacc agcttggcat ggtgctgagt 4200

ccacagcccc atgctgtgct gtggtggagg gtggtggtct ttctagacgc tcccccgaag 4260

tgtgcagagc gctggtgccc aggggtgggg tgcggcctgg gctgcctcca atgcccatta 4320

cttgtgagga agcagctttg catctgtgtg ctgaccttgg gcgggcgtcc tgagctcctc 4380

gcaggtgctg ttgtagcagc tgtgcagtag gtcagggctg gcccccagtg cagctttgca 4440

catgaagtag gaggaggccc tgctgcttgt cagagcccag cagagtcttg gtgttctgtc 4500

gggttcctgt ggccggacca gtggcagggt gctgtggaag ctgtcgaatc tcctccctct 4560

gtccagtacc cccgctcgtc ttctagctcc ctcctacgcc cgggccacgt ttcagttatg 4620

ctcacttcct ctgaccgccg aggctcctgc gtgtctccat acagctcacg ctgcagggcc 4680

acgctgtggg tgttggagac agctcctcct cgacccacgg tgctctctcc caccaggcct 4740

aaggtgtgtg tgctgggctc ccgggagcag ctgtgcatcc atcctgaggt gaagaaacaa 4800

gagagtaacc atctacaggt aggctcctgg gctcccgctc cggctcagtg tccgacaggc 4860

gagtgctgct gggtgtccag agccccaggc tgcgctcccg ctgggctagg gtttgaagtt 4920

cactggggga ctgcagggga ggacctggtg ggggtgggga ctggcttcgg tcctttcttg 4980

gccgtgcttc agctgcgcac tctgcccttc ctcccacaga tccacttgtg ccgtaagaag 5040

gtggcaagtc gctcctgtca tttctacaac aacgtagaag gtacaagcag ctgggtggga 5100

ccagggtcgg gttggagtgt gtgcagcctc tcagggtgga gctcagtggt gtcacagcct 5160

ggttgtgctt gcccggtggg gcggccagtg cggccatgta cctgggccct gtcttctgac 5220

tcggggccac ccatgttaga cttctgtgtg gaagagctca cacagtggtc tgagacagcc 5280

agccggcaag actgcctctg gctggtgcct ggggccttgg attttgggaa ggctccctcc 5340

atttcctgat gagagggtct ccctgcacct aacctgctgg tgcaaacagt aggggttttg 5400

ctgaacaccg gctttctctt cggggacttt gttgcttgcc cagcagcagg tgctccagtg 5460

accggccctc ataccatctt gggagggtgt cctggaagcc gtgtctggcc tcccgcgacc 5520

ctgccccgtg tgtctttttc ctgtgctgac cttgctgcgg aaaattatgg ccctgagtgt 5580

gactccaggc tgagtcctgt gggtccaaca cgggatgcct tggggcctct tctggagacg 5640

ggatgtgagt gacaggagcc ggccggggca gcttgccctg tgactgcacg tggccacagc 5700

ctgtgagggc cgggggtgct tctccaccca cgtggctgcc cctcgggtat gtcaagggct 5760

tctggggctc atcacggggt cctagagaca gtggcagggt gcacccccgt tggctgccct 5820

tacagtttct gtgacctgag ggtggcatct gtgcagtcgg cgcggtctgt gcttctgtgg 5880

gatcagggtt ccctctgttt cctgcctcag ttggggctca agcctcaggt gaggtggccc 5940

cggagcactc agaaggcatc ggcggtcctg tgggctgctt tctgcactca cgtttgctga 6000

gtgctcagtg tgccaggact gaggaccctg aagctgctct tgtatttagg gcggcgctcc 6060

cctggcagag actgagccag gtggtcccgc atgacccact accaggcgtt tctgggccct 6120

ggcccttgga gggacagggt gggcggaaca tgggcctgca gggaggctcc cgcttactgg 6180

aggcatgtgc tgtgttgctg gagacatcct ctgtgttgct tcttgttcgc tgtggttttt 6240

ggtctggtgg caccaaggac cctcagtcat cttgatgtgt ggttgtccag gcctttttgt 6300

tggtcctaag aaggggctct gcctttgtgc ccccaggttc cctgacagga gctgccggct 6360

cgtcccggtg atgcctgcag gacgtgactc tgggacgggg ggttgggcag atgtgctgat 6420

ggaaattctc aagcaggcgt catttccgag gtcctcacct ggatttccag gacaggagtg 6480

cctgctgggt gtccccagtc ccatgcagcg ggggtccttg ggatagcatg gaacgctgag 6540

catgggcctg gccggccgtg gtcctggaca agggcagtgc cccggtggct gctgggcctg 6600

ggacctggtg gggacgctgg gcctggtacc tggtggggat gctgggcctg ggacctggtg 6660

gggaggcctc tgactgcctc ctggtgctgc ttccgtctgt gttaggcctc tgggtattgg 6720

ggcccccatc tgtctcctcc tccaggcctg tggactcaga ccaggaagac acaggccagc 6780

ccctgcctgt cccccttggc ttgggctctc actgcccgac ctggcgggag gttgcctagc 6840

cgtgaacctt cgcaccctgt ctgccaccgg acaggctgtg agggggtgtc tgcagcacct 6900

gcaccggcct gagcatcttc agagtgggct gcagctcctg gaggggtctg agaggaaggg 6960

aggcaggtat tttgggcgaa tgaggagaca gctggagagc tggcaccctt cctggcctgc 7020

gtcctgtgag gactctggtt ggggacagca agcttggggt cagcctgggg cagagcctct 7080

gggacggccc cgcccctcgt gccccttccc ctcgcagctc ctgtcctcgc cccgccctca 7140

gctctccgcc aggcaaggtt tggcaagtgc cgctgtgcgg cagtgcctgc tgattggctg 7200

gtctgttgct atggtgctgc ccaggggtgt gcttttcctc ccctgccttc cctgctatcc 7260

ctgggagtat ctggggttgg gtcatcgctg gtgtgtgtga gtgtgtgtgt gtgtgtatgt 7320

gcacgtgtgc atatgtgtgc gcttctggcc tctgcagctg agtcctggcc ctcggggggc 7380

ctggcacctc ctggggacag gcacaaagca gccatgatgg agtcgggagc tgggggaggc 7440

cccattgccc cacgtggctg ccctgtgact ctggggtgct tgttagaaga ggtatctggt 7500

tctgtctgtg tttaagcaac tccctaagga attcttgtgg ttccagtttg gggggcctgt 7560

actgtagagg caagggaggg gcaggacatc ccccagactc tgacttctga agccttttct 7620

gcccggggcc tctccgccag tacaggcagt gtcctttgcc agggctgcca tgctgcagag 7680

gggagtgggc cactgtttag cccaggaaaa cctggctctc ccttagctgg aagttctggg 7740

cctgttgtgg ttggcaggga agctgagtga cggtgctaat cacaggggca cctgcagggg 7800

tttgtgggag atgcctctgt gggttggggc gataggctga ggggctgttc ttccctgccc 7860

tgaggagggc tgagtgtagc cgccactcct gtcctgtctt gggctgtctc ggagaggatg 7920

cgtagaaccc tcgggatcct gctggcctcc gtctggtcca ccctgaacct caggccttct 7980

gggggcagag gaggattccc tcaggatcac tcgggtgggg gcctctcttg ggcacctgag 8040

accctcagtg ggtgctttgt ggcgcgttca cggttggtgg gggacgccca gccctgcccg 8100

ccgtgtagga gccgttctgt cctgggcatc cccctgtggt ctgggactta gtggaccctg 8160

agggtgtgtg tttacccctg cctcacacct gcagaaaaaa gcctggagca ggagctggcc 8220

agccccatcc tggacattga ggacttggtc aagagcggaa gcaagcacag gtgagacccc 8280

tcagtgaggc cacgaccact gtccttccat ggcccagctc tcctgtgacc tgtggaggcc 8340

cggatatatt tcttcacttt tctttgttcc tttttaaatt atgaaactaa ccaccattca 8400

gtacgaaaaa gtttaagcag ctctgaggaa gatagagtaa aaaattgtct ccctcttccc 8460

tggccctcag ccatccccgg tggccaccgt ggagtgtgga cggagccctg caggcctgtg 8520

tctgtgcgga agcacgcgca gttttgtctg cacagactgt cctgcagttg gctgttttca 8580

ctcagcgttg tgggtatagc ttcccatgct ggtgctggca gctcggcctt gttcttttga 8640

ggacagcaga tgtctcctat gtctacctct tacagcttca gagattcaag ttataataaa 8700

gctcttctta tattgagggg gaaacctccc tccccctttt ttttgaaaca gggtctcgct 8760

ctgctaccca ggctgcagtg cagtgtcaca gtcttggctc actgcagcct cagcctccca 8820

ggctcaagcg attttcccac ctcagcctcc caagtagccg ggactgcagg cacacaccac 8880

catgcctggt taatttttgt attttttgta cagacagggt ctcactctgt tgctcaggcc 8940

agtctcctga gctcgagagt tccacctgcc ttggcctccc aaagtgctgg gattacaggc 9000

gtgagacccc atgcctggcc agctcttttt tttttttttt ttttttttga gacggagtct 9060

cgctctgtcg cccaggctgg agtgcagtgg tgcgatctcg gctcactgca agctccgcct 9120

cccgagttca cgccattctc ctgcctcagc ctcccgagta gctgggacta caggtgcccg 9180

ccaccacgtc tggctaattt tctgtatttt tagtagagac ggggtttcac cgtgttagcc 9240

aggatggtct cgatcttctg accttgtgat ccgcccacct cggcctccca aagtgctggg 9300

attacaggag tgagccaccg cgcccggccc agctctgctt tttcttagtg gttctgcgtt 9360

gtgtttgttt ctatccagga atagggttgg ttttactttt ccatcgagtt tttaaagaga 9420

cgacgattta catggtcgga aactcacgag gactccccat cccttggtcg gaaactcaca 9480

tggactcccc atcccttggt cagaaactca cgtggactcc catccatccc aggcagcagc 9540

ttcccacctg ggccctacgt gcaggatgag ggctccttcc gggtcagaag acatggcggc 9600

ctcggggcac cgtcccctgc atggggtgct cacaggatct tctcctctct ccttcccagg 9660

gtgtgccctt actacctgtc ccggaacctg aagcagcaag ccgacatcat attcatgccg 9720

tacaattact tgttggatgc caaggtgggg gctcagtcct gtagctgacg actcctgatg 9780

tccaggggtg tccctgggct tgggaacagc tgtccgagcc tttgctgctt cagggcctta 9840

gatcagcagg cctgggtggg aggactcacc tctgtcactg ggcaggggct caacctggcc 9900

agacacactt gtgagcagcc ccaggccaca ggtcagtttt ctgagcagtc tgggagcggg 9960

caggctggtg ggagtgagga gagacctcca ggctgtggtc cataggccag tgcccgctct 10020

tgatcctgac agctcaggtt ctctccttca cgtcaggcca tgggaggcac cgagaacaca 10080

ggaagcccac tgactcccct cttcccagcg cgtgcccggc cccacactca ctccccctcc 10140

cagcatgtgc ccggcttcac actcactccc ctcttcccag tgcatgcccg gccccacact 10200

cactcccccc acagcatgtg cccggcctga cactcactcc cctcctccca gtgtgtgccc 10260

agccccactc ccttccgccc cgtgtgccca gccccacgct cactcccccc gccagcatgt 10320

gcccggcccc acactcaact cccctcctcc cagtgtgtgc ccggccctgc tgccctcctc 10380

cccatgtgcc ctgcttttgt gccccacact ttttacttag tgcaggtggg atcacacgcc 10440

acgggtcaat ggtttgtgtg ttcacgtgac gatggcgtgg tgacgtttcc agatcccgtc 10500

gttggttcgc tcattctcgg ggtgtatatt tattgagagc tcatcatgct gggtgctatt 10560

ccaggcatag caagactggc ttcactcaca tggagctttg attctagtgg tggggacagg 10620

tggacagcaa aagagtaagc acgtgagctg atgatactga agggaaatag agcagaggga 10680

ggaggcggag accgagccaa gcgggcccaa gtgcgatgtc ggcgggaggt ggggaatgct 10740

ggtgggtctg aggggagcct cagcaggtgc agcagagcaa gggaagaggt gagtgggggc 10800

ggctgggggg ccgactcctg ggaagctgta gcagaacccc acagagagct ggtgaggttt 10860

gccgtggttg tgggtgactc ggtgctttga gccctggctg cccctgggaa ccatctggag 10920

agcttctaac ccaaccaggc ccctccctgg gacagttata tcacagctgg taagccgagt 10980

ctaacacttt cacggaaacg cagaagatct aaaacagcaa gatgaccgtg aagaagaaca 11040

gagctggagg actcacctcg ctggtttcaa gactcctcta aagctgcagg agtggaggtg 11100

gagatggccc agctcaggca caggcctgca ggccatggag aaggcagcaa gctcaagctg 11160

acccacacgc atgtggtcat tgtttttttt ttcagttgga atctcactct gtcacccagg 11220

ttggagtgca gtggcaccat ctcggctcac tgcagccccc gcccctaggt tctagcgatt 11280

ctcccacatc agcctcccga gtagctggga ttacaggcgt gcgccaccat gcctggccct 11340

tggtgattgt tttttgacaa acatgccaat ttaattgaga gaggaaatga aggttgattt 11400

ctggttttct gaaaaaatgg tgctaagaac agctggatat ctgttcggaa aacagtgaat 11460

cttaactctt gttttaccct gtataaacct aaatgtaaaa gctaaactaa aagttataga 11520

aaggaacatg ggggaggtct ttgcaacttt ggggtaggca gagatttctt agtatggata 11580

cacaaggcac tagccatgaa gaaaaacatt aaaatttaga cttcaccaaa atttaaagct 11640

tcaactctgt ggaagagttg agaaaatgaa aaagcagtta aagaaaggga gaaaatactt 11700

ctttcaaagg acttaaaaaa ttttttcagc cctcctctga tttgaaagga cctttgacca 11760

gagtatgtaa aattctccca taactaagca aacaacccac ttaaccactg ggaagggatc 11820

tggacagacg tttcaccaag atgggtggaa tggccagtta accactggga gagcatccgg 11880

acagacgttt cgccaagatg ggtggaatgg ccagttaacc actgggagag catccggaca 11940

gacgtttcgc caagatgggt ggaatggcca gttaaccact gggagagcat ccggacagac 12000

gtttcgccaa gatgggtgga atggccagtt aaccactggg agagcatccg gacagacgtt 12060

tcgccaagat gggtggaatg gccagttaac cactgggaga gcatccggac agacgtttcg 12120

ccaagatggg tggaatggcc agttaaccac tgggagagca tccggacaga cgtttcgcca 12180

agatgggtgg aatggccagt taaccactgg gagagcatcc ggacagacgt ttcgccaaga 12240

tgggtggaat ggccagttaa ccactgggag agcatccgga cagacgtttc gccaagatgg 12300

gtggaatggc cagttaacca ctgggagagc atccggacag acgtttcgcc aagatgggtg 12360

gaatggccag ttaaccactg ggagagcatc cggacagacg tttcgccaag atgggtggaa 12420

tggccagtta accactggga gagcatccgg acagacgttt cgccaagatg ggtggaatgg 12480

ccagttaacc actgggagag catccggaca gacgtttcgc caagatgggt ggaatggcca 12540

gttaaccact gggagagcat ccggacagac gtttcgccaa gatgggtgga atggccagtt 12600

aaccactggg agagcatccg gacagacgtt tcaccaaggt ggatggaatg accagttgag 12660

cacatggaaa gtcgcccagc atctccagtc ataggagaag gcagattaaa gccacgggga 12720

gccgacactg tggtcccact ggcatggctg aaattcagaa gccctgagtg tggcatgagg 12780

atgtggaaca gctggatctc atccatcgct gtgaagttgt gtagccactc cacaaacgtg 12840

tggcaaacag ccgagccggg agaagggaag acgtgttcaa agattcatat gtggccaggc 12900

tcagtggctc acgcctgtaa tcccagaact ttaggggcca aggctggggg atcgcttaag 12960

cccaggagtt tgagaccagc ctaggcaaca tagggagacc ccatctcaaa aaaaaaaaaa 13020

aagaaaaaag aaaagacttc agtgtgcagg tttaccagag ttttgtttgc agttgccaaa 13080

actgggaagc agcccgcgtg agcccatcca caggtgaatg gacagaccgt ggtacccgaa 13140

cactaacagc agccacgggc gtggactgtg gtcacacagc agcagggagc cgatgagtct 13200

cggacatgct aacccagaga ggcccattga ggaggaccta ctgttttttg tgtttttgtt 13260

ttttgttttg aaatggagtc tcgctctgtg gtgcaggctg gagtgcagtg gtgtggtctt 13320

ggctcactgc agcttccgcc tcttgggttc aaacagttct cctgcctcag ccttccgagt 13380

agctgggact acaggcaccc gccaccacac ccggctaatt tttgtatttt cagtagagac 13440

ggcagttcgc catgttggcc aggctggtcc caaactcctg accttgtcat ccactcactt 13500

tggcctccca aagtgctgag gttgcaggca tgaaccaccg cacccggctg gacctactgt 13560

tttattccat ttatgtgaca ctctattaat agaaaaggca ggggtggggc tggtggttat 13620

atggtgcaca taactgccag aactcagtac acttaaaatg aacatcttaa tgtgtgaaat 13680

tttttttttt gagacggggt cttgctctgt cacccaggct agagtgcagt ggtgcgatct 13740

ccactcactg caagctctgc ctcctgggtt cacgccattc tcctgcctca gcctcccgag 13800

tagctgggac tacaggcgcc cgccaccacg cctggctaat tttttttttt tttttgtatt 13860

tttagtagag acggggtttc acagtgttcg ccaggctggt ctcgatctcc tgacctcgtg 13920

atccgcctgc ctcggcctcc gaaagtgctg ggcttgcagg cgtgagccac catgcccggc 13980

caatgtgtga aaatttaaaa gtaccaaagc tggaccccac cccagattgc tcccatgaca 14040

ctctgtgggt gggacctggg agttgggttt tgttttgttt tgttttgttt ttgagatgaa 14100

gtctcactct gtcgcctagg ctggagtgca gtgacacaat ctcggctcac attaacctct 14160

gcctcccaga tgaaagcgat tctcctgcct cagccttctg agtagctggg attacaggca 14220

cacaccacca ccccctgcta atttttgtat ttttagtaga gacggggttt taccatgttg 14280

gccaggctgg tcttgaactc ctgacctcgt gatccgcccg cctcggcctc ccaaagtgct 14340

gggattacag gcgtgagcca ccgcgcctgg ctgggagttg ggtttgtaaa tctccctgag 14400

tggggctggg gcagggaact gctgggtctg ggtcttcctg gctcctctgg tctgtggctt 14460

cctgactgcg gtggccgggg gctcccaggg catcgtggcc gtctgtcttg ctgagcgtgg 14520

cacgtgcctt tccatgctgt ggaggagcgt ctcccggtat ggcgaactgc tggttagggt 14580

ggggcggtgt tgccaggtca tccaggtctg gcctctgctc tcgacatcgc cggcgctgtt 14640

gctcatctgc gcttgtgatg ttcgatgcct gctgcacatg tcttggcttc cctctttccc 14700

ggcctctgtg agctccagcg ctgcgtccct tctcttcctc ctgtagagcc gcagagcaca 14760

caacattgac ctgaagggga cagtcgtgat ctttgacgaa gctcacaacg tggtgagtct 14820

ccgctggcct cctaaacacc tcctattgct tctggccttt ttgtcaagag ccacgcaaac 14880

ctttctggag gggctctggc caaactcctg aagccctagg tgcccaggac tggggactga 14940

gcacaccagg agcttctgcc accccctccc gccctgatcc gatgcctctg ctggggctgg 15000

agactggcca gctgggccag ggacctgccc gtcaggcgca gggcccccac aggccgctca 15060

ccagaccctt tccctccagc cagctcgggg tcagcctggg ccagggctgt ctcctctgcc 15120

ctcggcagca gcaggcttgt ggtcttgcct gcagtgtctc tgcccttccg gccacatggc 15180

ttgagactga ggcaggagaa tcgcttgaac cttggaggca gaggctgcag tgagccagga 15240

tcacaccact gcattccagc ctgggtgaca aagcgggatt ctgtgtcaaa aaaaaaaatg 15300

ttgactgggc gcgctagctc atgcctataa tcccagcact ttgggaggct gaggtgggcg 15360

gatcacgagg tcaagagatc aagaccatcc tggccaacat agtgaaacac cgtctctact 15420

aaaaatacaa aaaaattagc tgggcgtggt ggcgtgtgcc tatagtccca gctactcagg 15480

aggctgaggc aggagaatca ctcgaaccca ggaggtagag gttgcaatga gccaagatca 15540

caccactgta ctccagcctg gtgacagagc aagactccgt ctcaaaaaaa ataaaatcaa 15600

aaagaataat tggcaattcc agtgaaataa ttgtttgttt gtttgttgag acagggtctc 15660

cttctgtcgt ccaggctgga gttcagtggt atgatcttgg cccactgcaa cctccacctc 15720

ctgggctcaa gccatcctcc cacctcagcc tcccgagtag ccgggactac aggtgcacac 15780

caccacgccc ggctaatttt tgtatttttt gtagaggcgg ggtttcccag cgttgcccag 15840

gctggtcttg aacccctgag ctcaagtgat ctgcccacct tggcctccca aagtgctggg 15900

attacaggtg tgagccaccg cgcccggcct gaaacaatcg tttctaaata ttggtgtggg 15960

ccacacagtc atgtttggac ctacttgtgg ccttttacag accccaggcc aaggctttgg 16020

gaacttggct gtcagcctcc tgtgccttct gcacccccac cccatttctg ctttctggaa 16080

cccccgatcc tgtcctgttc tgtggtgatt cgggtgtgct tgggctctag gagaagatgt 16140

gtgaagaatc ggcatccttt gacctgactc cccatgacct ggcttcagga ctggacgtca 16200

tagaccaggt gctggaggag cagaccaagg cagcgcagca gggtgagccc cacccggagt 16260

tcagcgcgga ctcccccagc ccaggtgcgt tcatagccag actgcttggt cctgaggcct 16320

gcgctgctgc agggtgagcc ccacccggag ttcagcacgg actcccccag cccaggtgcg 16380

ttcatagcca ggctgcttgg tcctgaggcc cgtgctactg cagtgggcag cctgccctgt 16440

ggctgtgtgt ggtcggcctg ggcaccatct attcaggctg gcactgcagg gcatccgctt 16500

ctctcagagg cttcttgggt gtgaattctt cagggtcctg tagcctgtgg aagggctggt 16560

attgttcagt agttctggta ttttccaaag acctatgtct tctcccagcc agtatcaact 16620

tggcctctac tgtgtaaaac tggaaaactc tactttgtga agctgagttg ggagcatcgc 16680

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aattagccag gtgtggtggt gtgctcctgt ggtccaagct tttccggagg ccgaagtggg 16800

aggcgtgctt gagcctggga ggcagagctt ccggtgcccc agatgactcc actgcactcc 16860

agcctgggcg gcagagtgag gccatctcaa aaaaaaaaaa aaggaaaact aaatatattc 16920

actgtaaggg cattttgcat ctttaaatga cccacaaatc tggcatgcat cagctgctct 16980

gcctgtaggt tccttcccag tgtttgtcca gaggtgtatt tccacacagc gctagtcacg 17040

gcatacgtgg aaaacgtgga aacccttcat ggatgttgtc agttggtcta tattttcttt 17100

cttttttttt tttttgagat ggagtttcac ttttgttgcc caggctggag tgcaatggcg 17160

cgatcttggc tcactgcaac ctccgcctcc tgggttcaag caattctcct gcctcagcct 17220

cccaagtagc tgggatcaca ggcgtgcacc accacgccca gctaattttg tatttttagt 17280

agagatggtt tctccgtgtt ggccaggctg gtctcgaact cctgacctca cgtgatccac 17340

ccgcttcggc ctcccaaagt gctgggatta caggcgtgag ccgccacgcc cggcctttgt 17400

ccatattttc tacatggctt ctgtaaacag ctgactagga gtctgtgtga atatcttcat 17460

aggttctgct gtgacactac ttgctcgtga gcatctccag gtgtaaacag catcagcttc 17520

ccccattttc ctttaaaatc gcacatgtgg acggacacca cggggaccct ggaccctggg 17580

gagccccgtc ctcacccttc tcaccaggat ggctgcttgg tagagagtga gtttgcaaag 17640

ttggcatttg tttagtacag aagttatcag gtgttctggc tttagaatcc ctttatatat 17700

atatatatat acatatattt aagtgacagg gtctcactct gttgcccagg ctggaatgtg 17760

gtggtacaat caaagttccc tgtagcctcg gcctcctggg ctcatgggat cttcccgtct 17820

cagcgtctta aagcgccggg accacaggtg tgcaccactg ccaccggctc tcaagattgc 17880

cacgcaggga gttgcagtgg gggaaggggt tcctgggact ttgaacgctc cacctccctc 17940

ctctccacag tcccccaacc ccacctctct aacggggtgg acggccgcct ctttccatcc 18000

ttcgcttggc gcagggtggg gagagtgaca ggtctccttc cctcatctcg gcagctgcca 18060

tttcatcgct tacataacgt gggagaaaca tccacccacc cccaggcctg tgtgaacatc 18120

accacggggc cttctccact cttcagtttt gttagttact tgatgtgcag ggctttttgt 18180

tgtaactagt gggggacgtg tggtggggtg ggcttctgcc atctcattca ggaccagaac 18240

ttcagttttc atccctatct gttcccccac ccctttggag atggggtctc actctgtcac 18300

ccaggctgga gagcggtggt gccatcacgg ctcactgcag cctccacctc ctgcagcctc 18360

cacctcttgg gctcaagtga tcctcctgcc tcggcctccc aagctcctgg gactacaggc 18420

gtgtgccact gtgcttggca gggtccattc ttttcctcac actttattta ttgaagagcc 18480

caggccgttt accctgcaga gtcggaatct gtacaggagg ggcagccaca cgagttcccc 18540

ggtttactct gaacttaggt ggcttgaggg ccccagttag actgcggcca ccgtttgccg 18600

ggctccagat gggacgtcct ttctatcaga aggctcacag tatctccttt cccgtttctt 18660

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atggcagtgt gctaattcca tcatctagtc agttagcagg aataacttag gaccacgccc 18780

tgcaccatat cagctatgtg gtgatcccat tcacacagga aaggtgggac aaatgctggg 18840

ggtgggccgg gtgtgctgtc tcacacctgt catcccagca ctttgggagg cccaggcagg 18900

cggatcacga ggtcagagat tgagaccatc ctggccaaca cggtgaaacc ccgtctctac 18960

taaaaataca aaaaaattag ccaggtgtgg tggtgcatgc ttgtaatccc agctacttgg 19020

gaggctgagg caggagaatc acttgaaccc aggaggcgga ggttgcagtg agccgagatc 19080

gcaccattgc actccagcct ggcgacagag cgagactccg tctcaaaaat caatcagtca 19140

atcaagtgtc atcactgaat gtttgtgtgt gaacgtgggg attggtcctg ccccatgctc 19200

cctcctgaat ctcactcctg acctcagttg ctgcaccttg aggtgttttc atgtgggctc 19260

ttgtgtcctg accccggcgg ttgtggcctc tttgctgtct gggagtcagg atttttcaca 19320

ctcatgtcct gctccagacc tggaatcagc caagtctcca agaagccctg ctttcttttc 19380

ctgcaagacg gtatttcaag acccgccatg cggcagcggg ttggtcatgg ttactgggtt 19440

ggtcgttgtt actgggtgtt ttcgtggaga tacagccata cgcacaggtg tgttcacaaa 19500

tgttaattct aaaggtcaaa cacccggcca ggcataaggg ctcagcggta atcccagcac 19560

tttgggagac caagactggt ggatcacctg aggtcaggag tttaagacca gcctgagcaa 19620

cagggtgaaa ccccatctct actaaaaatg cgaaaattag ccgggcatgg tggcgcacac 19680

ctatagtccc agctagtcgg gagacagaca cgagaattgc ttgaacctgg gacatggagg 19740

ttgcagtgag cagagatggc gctgctgcac ccctgcctgg gtgacagagt gacaccctgt 19800

ctcaaaaatg aatagataaa taaagataaa acacctgctc ctcttggtgt ctccagtttg 19860

gatttggcct gtgtagcctc ttccttcgcc tgttggtgga tttggcctgc acggattctg 19920

tgtggcctct tccttcccct gttggtggat ttggcctgca cggattctgt gtggcctctt 19980

ccttcccctg ttggtggatt tggcctgcac ggattctgtg tggcctcttc cttcccctgt 20040

tggtggattt ggcctgcacg gattctgtgt ggcctcttcc ttcccctgtt ggtggatttg 20100

gcctgcacgg attctgtgtg gcctcttcct tcccctgttg gtggatttgg cctgcacgga 20160

ttctgtgtgg cctcttcctt cccatgttgg tggatttggc ctgcatggat tctgtgtggc 20220

ctcttccttt ccatgttggt gtcctttttt ccatgccagg aatcctggtt ctcaagggcg 20280

gggttgttgg cacgagcgtg atgcagactg cctttgctgc ctttctcttg cccagggctg 20340

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gcagctgggt ggggcctcct ccttgcgagg aggtgggtga cacctcctcg acccacagtg 20460

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gtcaccaagc cagggaggtg agaggcgggg agccagcccc ttcactgcag gcccagccta 20580

gagctagaaa cgggccatgg tgcagtcctg ggctgtcaca tcacgagtga ggcctgtttt 20640

caggcctgtt ttcccttttt gagacctggg aggagcacct gctttgcatg atctggttgc 20700

tgagatgttg agaggagcag cacacactcc cacgggacag cacacagccc cccacggaac 20760

ggcacacaca cccatggaac agcacacaca ctcccacgaa cagcacacac actcccacga 20820

acagcacaca cactcccacg gaacagcaca cacacccacg gaacggcaca cacacccacg 20880

gaacagcaca cacactccca cggaacagca cacacaccca cggaacggca cacactccca 20940

cggaacggca cactctccca cggaacagca cactctccca cggaacagca cacacactcc 21000

cacggaacag cacacacacc cacggaacgg cacacactcc cacggaacag cagactctcc 21060

cacggaacag cacacacact cccacagaca gcacacacac acccacggaa cagcacactc 21120

tcccacgcgg ggccgctggg tttcctgcag tttctcctcc tccaggcctt tccctggacc 21180

ctggtccagt ccgtcatttg agcacaggtg cctgttagaa cgagaccttc ttgttaggac 21240

gatgagtgtc ccagccacca cctcttttgg actccgggag gcctggaacg ttctgaacgc 21300

tccgtggggc tccagtcttc tccgcagcca gggcagcagg gtttgctgtc tgtcctgcag 21360

gcagatgagg agtcagggct ggggcctgtg tgggggctct cctgagcgca cagccgccga 21420

ggtggagcgt gttctgcctg agcgccgacc tggtcggggg aatcccagtt gcttccaggt 21480

ggagccactg tcctcagcgt aatgctcaag gctctggcct ggctcctcgg ccaccctgca 21540

ccctcagggt cccctcctgt agcttctgct gccccatcac tgtcactctc caaagctttg 21600

gggactctgc ccagagccac cgcctcccag aagcccctga caacctcttg acgaccccct 21660

agtgacccca tccctcccct ctgacggcgg cccctgctct gaggcggctt cttttcctcg 21720

gtgctgttct cgtgctggcc aggcctcctc tccccacctg gaggctcctg agggcggagg 21780

cctctcacct ccaatgctgg cgtcccctgg agggctgaat ttgtttccga gggaaggaaa 21840

cttccacagt tgttgccttc agttccaaag ctgcagcctg atttccccct ccaggctcga 21900

gcctgttttc ttctcggcag ctacatcttt gaccagtgtc gtcccccctc aggcccgagc 21960

ctgccttctt ctcctcagtt cccaaagctg cagtctggtc cccccgccag gctcgagcct 22020

gccttcttct cctcggcagc tacatctttg agctgtttgc tgaagcccag atcacgtttc 22080

agaccaaggg ctgcatcctg gactcgctgg accagatcat ccagcacctg gcaggacgtg 22140

agtgctggca cggggtcttt ggtgcgggca aatgtggcgt agggggtgca gcaggcctcc 22200

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aacctcatct tctgatcggg gcgtggaggc gttagtgcca cttgccagct gccgtagagc 22320

ctgtcccagt tctgcagctg gcggcttcgt cctacagcct catcccatta ttctgctttt 22380

gagaaagagc agcccaaggc cctagctggc ttgtggggcc tctggcttct ccacaccacc 22440

ccgagttctg cttctcagag ttgtggggtc cagaggcttt gcccagaggc ggtgtcccca 22500

tgggctgctc tggtttgaga cgccgggccc agcggggtct ctcctctgct gcgctcccgg 22560

gtgctgggga gggtggcttt tgctgcttca acccttaggc gaccatagag cctcttttca 22620

agtcccactg acccccttgg agactctgtc cctgcctggc ttctctcctg gctgctggga 22680

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gcaggagatg gagcttggca gtcgggctga gcgggctcat gctggaaggg ccggggctgg 22800

ggtcggggcc tcccctgcct gcagtgtggg tgtcagcgcc ctgctgccct ccaggtgctg 22860

gagtgttcac caacacggcc ggactgcaga agctggcgga cattatccag gtggggcctg 22920

ctcctctgtg gcatctcctt ccctgatgga agccgggcgg gtgccttctc ctgctgtatt 22980

agttaactga ttctagactt ggggatggga gaaaggcccc tacaccacct gtttctgatt 23040

ggcaaactct cggctccttt ccagtgccct aaacccacac tgggcctcct gcagggatgg 23100

gggaggacga ggtctggtgg cacatgccca gggtgatgct ggtgagggag gacgcaaagg 23160

acagtggggg ccggggagcc gctcctgccc tgtccgggcc ctcaggccag gggggaccca 23220

ctgctggcag ccccagcagc cccagctgca cgcagatgaa gagctctgga cacacgcggc 23280

ttcctgaaca gcttctccag ggacagacaa atggggaccc tgcaggttcc cggcaggggt 23340

gtccctggga gcccatgatt gggggtgcga ccctggcccc cttctcattg gccccgtcct 23400

gtcctgcaat gcccgtccca tgtgaggtct gcttctggct ccatgcctat ggcagcacct 23460

gctttccctg gcgtagaggt gcttgtccgg tttgtggagg gcacgcccca ttttgggtgc 23520

tctgggcacg ttgcctctcc ggggcctcgg tggctttttt agaagcagac tcagaagtcc 23580

ctgactgggg aagccaaggc acaggtggct gtgtggagcc ctgtgaggcc tcctctgtgc 23640

tgcccacgct gtacctgctg gccacacgag atcatggcag ggttaggcag ggctgcccag 23700

cgctatgaca gcttcatgag tgtccatctg gcctgtgggg tgcttgagct gggggaggcc 23760

gcagaagaac cctgggatgc atggctggcc tgtgcatgct gctgggcatg gagctgcaga 23820

tcccggaaca agcaggcact gccttctcct tcacagacgc agctctgagc gggggcgaga 23880

cctgggcagg gaccaggtgg ggtgggcaca gggtggtggg gcccaggctc agccctccct 23940

ccactgtggc cgtctctgtg gccagtgacg ccacagcctg tgtcttctct gtgcggtagc 24000

tggggctgga aggacagcac tgccttgtcc tcccaactcc tccccaaagg cacggtgggc 24060

atcccaggcc cagacccctc tgtctgtggc tcctgcctgc caagggctgc tgtgctgtcc 24120

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cagcttccca ggctcccact tatggagaag tctcctccac actatggaac tgaatcctag 24360

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ccagctatgg agaagactcc acactctgga accgaatcct ggaacgcggc ctcccaggcc 24480

cccagctatg gagaagactc cacactctgg aaccgaatcc tggaacgcgg cctcccaggc 24540

ccccagctat ggagaagact ccacactctg gaaccggatc ctggaacgcg gcctcccagc 24600

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tagctggagg caaactctgg gcagtgctgg cccgtgttgg ggaaccagtt gcccctgggc 25080

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ctggagtgca ggggcttgat cacagctcac tgcagcctca acctcctggg cccaagtgat 25260

cctcttgcct cagccacccg aggagctgtg aacacaggtg tgcaccaccg cactcagcta 25320

atttttaaaa tttttttgta gagatgaggt cttgccatgt ttcccaggct ggtctcaaac 25380

tcctgggctc aggcagtctg cccgccttgg cctcccaaag tgctgggatt acaggcaaga 25440

gcttccatgc ctgcccagca gaaggctttt cgaaggaagc tgtttcctga ggcagactca 25500

gccctgctca tggcagccac cagcgtgggg gtgaacttgt tctgttactt ccatccccgt 25560

gggccaaatg ctttggtaaa acacaaggcc ctgtgtttag ctgtcttgac agtgaaaatg 25620

gctgggaagg aaggaaggaa cggaaggaaa tttctctctc cttctgtgcg tacccaggca 25680

cgtgcacatg catgcagagt acgcacacac gcacgcacgc ctgcacaaat ccacgcatgt 25740

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tccgcatttc tgtgaatgat tccggcttct tggtgttccc agcagaactc cctcaagtct 25860

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ggctttgcgt tcctgttctg gccgtttttg gctcgttttc caggaacggt cgtcacgcgc 25980

tcctctccta gtgcaggcat cattcctttc ccattgattt gcagggttct ctgtaagttc 26040

tgaggatccc atatacatat actctctgta agttctgagg atcccatata catattctct 26100

ctctaagttc tgaggatccc atatacatat tctctctcta agttctgagg atcccatgcc 26160

gacatacata ttctttcctt gtctcatgct ggtcattttt tccattttca tgacaggttt 26220

ggtgaacaca tgtttccttg tcagattttt gttctgagct tgtgcctccc gaccaagatg 26280

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tccactgggc acctgccaca cttttcctca tgtttttgtt cactgtggtt ttgtcgtaag 26520

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ttcacgccat tctcctgcct cagcctccca aatacctggg attataggca cctgccacca 26700

cgcctggcta attttttgta tttttagtag agacgaggtt tcaccgtgtt agccaggatg 26760

gtctcgatct cctgacctcg tgatccgcct cccaaagtgc tgggattaca ggcatgagcc 26820

accgtgccca gcctgatatt tttagtagaa atggggtttt gccatgttgg ccaggctggt 26880

ctcgaactcc tgacctcagg tgatcctctc accttggcct cccagagtgc tgggattacg 26940

ggtgtgagcc accacgcccg gcctcttgtt cttttgaaac ctgccctgac gttttttcca 27000

tagtgcatct tggagtcagc gtgtctactt cctgtaaaaa tcttactgtg attttgacta 27060

gaatgtgttg aattcctgtt ttttttttga gtcagggtct ctctgttgcc caggctggag 27120

tgcagtggga ccatcacagc tcactgcagc ctcaacctcc tgggctcagg ggatcctctc 27180

agctcaacct cccaagtagc tgggaccaca ggcacatgcc accatgcccg gctaggtttt 27240

tttttttttt tttttggtga acaccctggg gttgcaccat gttgcccagg ctggtctcga 27300

actcctgggt tcgggcagtt tgctcctctc agcctcccgg agtgctggga ttacaggcct 27360

gagccactgc actaggccat gttgaatttc tagattaatt tggggccctc aggggcacag 27420

agaggagggc tgggccagtt ggcgggagga gaggcccctc gggctgccgc attttcagtg 27480

catggagatg gcctatgttg ggggaacaca gagctcaccg ggggtccctg cagggaggag 27540

aaagggtcag gcaggtgcca gctcctgtcc attggcctgg ggctgcatga tggcaggggc 27600

cggtgaaccg atgacccctg ggtgtcctgt gaccttctgt gtatgcggct gatgctgcag 27660

aaagtcgggt ggcctcaggc tcctgacggg gctgcacttc ctctgccttt cagattgtgt 27720

tcagtgtgga cccctccgag ggcagccctg gttccccagc agggctgggg gccttacagt 27780

cctataaggt aggggccacc tccaggaggc aggtggaggg cagcccttgt tccccggcag 27840

ggctgggggc cttacagtcc tataaggtgg gggccacctc caggaggcag gtggggctgg 27900

gggtcttctg gtcctaaaag gtaaggggct gcccccagga catgggcggg gcctccacac 27960

tcctggtcct gtcccctcca ggtgcacatc catcctgatg ctggtcaccg gaggacggct 28020

cagcggtctg atgcctggag caccactgca gccagaaagc gaggtacaga cctgggccca 28080

cacgctcccc gcccgcccgg gtgcagtgcc cggcaccacc atgccacagg ctaggcacat 28140

gcccagccgt ggatctcctg cccccatggg cctggccacc ttctccatat ccaggccaat 28200

ccagagcatt ctcctcactg tccctctgaa gattggagtt actgagagac gtaggagatg 28260

gcctgatggc accgtgacct gcccagagtc acctggttgg tggtggcaga gccacagccc 28320

agccaggcct ccctgctggg acacgctcgt ttatgccgag gccgtcagca cagagcctcc 28380

acagtgaggc acggctctgc ctgctgcctc cacgcagcgc ctggccgggc caagcctcag 28440

ggtcacatct gaagggggcc cggctggccc tgttgtccga agcccctggt gcgctcagcc 28500

ccgaggcccc acgtgccttc ttggcttcct gtgctccgtg gcgtcttcga gtcggtgctg 28560

ccggggacgc tgtgtggatg gggtctgtga gtgtgccctc ggctccgtgt ccggagccct 28620

gtggttcttg gggtgtatct ggccccaccc ccactgcgtg gtgtccaggg tggggcttca 28680

cggctgcagc tgcgggagct gctgcccctg ccttgtgctc cagtggggcc ttgcctctgg 28740

gcttggttcg tccctctctg gaacattctt tctcagctgc tgtccgaccc atggtggcat 28800

gacgtggccc tggctgaagc agcccttgtg cggttgctgt ggttgggtct gcctggccga 28860

gccggaaggg aagggctggg agggcgtcag ggtggcgtgg cttgaccccc gctcggtgat 28920

ggtcctgcag caaggcctct cccagcagga agcgtccatc ccggggggag gccggcgccc 28980

ctcacgcagt tggggttgcg ggaggcagtg cgtgcctgag gcagccggtg cacagattcc 29040

aagggcctgg aatctgtttg ttccattgac ctctgatgtc acttgacttc tcagaagcag 29100

ccactccctg cactgggcgt ttgtaggaaa tgagctcctg gaggaggggg tggggaagtt 29160

cccccattgc agggcacact cagccccagg aaggaaacgt gcctcgtccc tgctgactcc 29220

gaatcgcagt cagagtcgtt ctgcttgtgc cgtgttgaat tcccggcatc cggcatccag 29280

actcagcctc ctccccaggc cacggccgcc gtggccagtc ggtcaagccc ttctaggaac 29340

ttcctttgag ctggcgccct tgttcactgc tgacgccact cagaggcttg tgcacgtgtc 29400

ctgcttccag gcagagctgg gaactcgcac cccgtcttct gcacgcggcc gtggaatgtc 29460

gggatgccgg cgcttccttc ccgtgtgctc ttggcggggt gggcttcttg ccctgagccg 29520

catgtcacag tttctgcaga agtttagggt tggagtgggc tgacctctct gcaggtgtcc 29580

ccagcctctg cctggggtct gcctcctact cccaggaccc cctgtccccc agaggggccc 29640

caagctggca ggctcacact cagggcagcc tcctttgttc tgacttctgc acagtgggcc 29700

tgggtggctg cccgcggctc gcttgcttga tgccagtggg tggagagggt gatgggcaga 29760

gaggcaggtg gtcaggcccc cagtcccgtc ctcacactct gtgccctctg ccgccccccg 29820

ccccacaggg aaggtgctga gctactggtg cttcagtccc ggccacagca tgcacgagct 29880

ggtccgccag ggcgtccgct ccctcatcct taccagcggc acgctggccc cggtgtcctc 29940

ctttgctctg gagatgcaga tgtacgggcc acccctgcca gggcctgagc accggtgaca 30000

cctctgacat cagcggggtg gaagtggtgg gggtccccat gagccgggtg ctgggggtct 30060

cgggcctcga gggctaaagg ggtgctggtg cacttcccca ctgtctgctc cctctggcca 30120

cgctcagccc tttcccagtc tgcctggaga acccacacat catcgacaag caccagatct 30180

gggtgggggt cgtccccaga ggccccgatg gagcccagtt gagctccgcg tttgacagac 30240

ggtgagggcc tgtccctggg ccctgctggg gtgggaggtg ggggagcact gaggcctgag 30300

gtcctgagca gtggcctctc cggctctagg ttttccgagg agtgcttatc ctccctgggg 30360

aaggctctgg gtgagtgccc tgaatgcccc agctgtgccc atcctggatc ctggacccct 30420

gctcccaaga gctggtaggg aaccctgcag acatcctgcc cctgccttga ccccggcccc 30480

tgcacttcca ggcaacatcg cccgcgtggt gccctatggg ctcctgatct tcttcccttc 30540

ctatcctgtc atggagaaga gcctggagtt ctggcgggtg cgtctcccct gtgttctggg 30600

cggggtgggt gagggcaggg ctggagcatg aagcaggcag tggtcacagc tcctgcttgc 30660

cctcatcgga tcggcggcgt gaccagggct gccgtgtccc tgcctcttcc tcccacaggc 30720

ccgcgacttg gccaggaaga tggaggcgct gaagccgctg tttgtggagc ccaggagcaa 30780

aggcagcttc tccgaggtcg gcacttggcc ggggctctgg gcctgctgcc ccctcgtgcc 30840

tcccctgcct ctcacagctt ccccaaggct gaccactggc cctgaccatg ggctccggcg 30900

gctcccgctg cctcttcagg gctcctgcgt ttccttcctg gccctgagtg ttgcctctta 30960

tcttacaaag cccccagcac cgggtgggtg tggtaacagt ggccctcctg tctgagtagc 31020

cctagtcggc caccctggcc ctggggttcc ccgtgttttc tgggaagcac tgagcaggcg 31080

tggggtcagc ctgggatccg tgccaggaag aagcttccag aacccgattg gccttcctgg 31140

ctaggacgat ccttcatctt ggagcatgag acctgggtct ccctcatggg ggaggaaggg 31200

gctggggggg ggctccaggc tcagcctcac caactttcct tccagaccat cagtgcttac 31260

tatgcaaggg ttgccgcccc tgggtccacc ggcgccacct tcctggcggt ctgccggggc 31320

aaggtgagct ctccagggcc ctctgccctg acctggttgc ctgttccctg gtgggtgctt 31380

atggctcccc agcagactct gggccctggg ggctgcccgg tcccctcctt gggtcccacg 31440

agagcgactg ctggccctgc tgggagcgtg tcctgctctg ggcctgggca ggcaggatgg 31500

gagtttcctg gccacaagag ttggaggtgg cgtctgggag ctgtggaccc caagtggggt 31560

cctgacccac agatggagct tcctcccacc cctggttggg gacggagcct cggggaaggt 31620

ggctgggctg ggtgtgggca ccagggagag gagcccccac ggccccaggc agctccctgg 31680

tgtgtcccct aggccagcga ggggctggac ttctcagaca cgaatggccg tggtgtgatt 31740

gtcacgggcc tcccgtaccc cccacgcatg gacccccggg ttgtcctcaa gatgcagttc 31800

ctggatgaga tgaagggcca gggtggggct gggggccagg tgagttacag cagggtgggg 31860

ctggggtaag gcggtctggt gactgagccc ccgccccgtg gccaagggag cccccgtgac 31920

cgagccgcct cgccccacag ttcctctctg ggcaggagtg gtaccggcag caggcgtcca 31980

gggctgtgaa ccaggccatc gggcgagtga tccggcaccg ccaggactac ggagctgtct 32040

tcctctgtga ccacaggtgc gtgcagtccg gtggcaggcg cggcgccagg ggacacgccc 32100

acaccccact gggcccctgg actctccttc cccacatgag gccccgtctc ctccagagcc 32160

tctccggcta ctcggggtca gcgtggggcc cctgcagcag atgagggtct tcacttcggt 32220

gaactgaacc cttgaagcgg ctgtgggcag ggcagcaggg ctatggccac cccccaggtt 32280

cgcctttgcc gacgcaagag cccaactgcc ctcctgggtg cgtccccacg tcagggtgta 32340

tgacaacttt ggccatgtca tccgagacgt ggcccagttc ttccgtgttg ccgagcgaac 32400

tgtgagttcc tgcccaggga ggggatgagg gtgttgtccc cagaggagcc agaaatgggt 32460

ccacccaccc ccatggttct gcagatgcca gcgccggccc cccgggctac agcacccagt 32520

gtgcgtggag aagatgctgt cagcgaggcc aagtcgcctg gccccttctt ctccaccagg 32580

aaagctaaga gtctggacct gcatgtcccc agcctgaagc agaggtcctc aggtgcggac 32640

gggcagcgct gggtgggcgg tgtgggggtg gcggagcggg cggcgtgggg cgggcagcac 32700

caggcgccca gggcggaggc gactcacctg gctttgtgcg cttcccctcc cacctccaaa 32760

ggctgcctct ccctcctagg gcagggcccc cacgggctgc aaccctcccc tacaggcaga 32820

gaacgcccca ggcaaggatg ccccccgagg ctgagactcc ccccaatagc agggaggaca 32880

cccacaggca ggaccccaag tgctgggact ctcccccaag aggggctttg ccacaggcag 32940

ggaccccagc tggggccccc cgtgggcttc actgcgcact cgggtgcccc tgcagggtca 33000

ccagctgccg gggaccccga gagtagcctg tgtgtggagt atgagcagga gccagttcct 33060

gcccggcaga ggcccagggg gctgctggcc gccctggagc acagcgaaca gcgggcgggg 33120

agccctggcg aggagcaggt acagttccag ggccttggga tggacacaga ccctctgtct 33180

cctgaggcca acccgacccc gcccatctgg cctcaggcac ctccccacac acccctgtaa 33240

atcccctgcc tggcaggcag gcgggcaagc gggcggggga tcccagctgc ctggctgtct 33300

gtgggtcctc caccccacct cacccacagg ctgctggctc ccaggtggtg catgccctgg 33360

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actcaaggtc gggtgcccct gccactggct gcgcttgagg ctggcctttc tccaggaatg 33480

tgctgcgggt ggaacccagg ttccttcttc cttggggcct tttgccccag aagcccataa 33540

ttcctcaggc caacccgaaa ttttctccct gcttcctgct gggagccatt cccctcttcc 33600

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tgtccccttc ctgccagccc ctcgctgtgg tcggactgtc ttccctggac ctgctcttac 33720

aagtcaccac ctgcgagcct catgagccgc tggtgtgact tggacaggac caagttgtgg 33780

cactgtcacc ggggtgtgct gtgcccccct cccccgacct ccatcttggc tcagggctcc 33840

ttgggaccat cttccctgtg cgtccaggtg ctttgggacc ccagagtgtg tggttggggt 33900

ctgtgtgtgg ttgtgagctg tgtcctcctc aggcccacag ctgctccacc ctgtccctcc 33960

tgtctgagaa gaggccggca gaagaaccgc gaggagggag gaagaagatc cggctggtca 34020

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ggagctgatg tccagggcag ctgtgatgct gacggccagg ggctcaagtg tgtggtttct 34200

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tggggcctgc agcactgggc ttggccctgg catttccctc aagtgtggat gcacacctgc 34320

ctcatgtgag ggacacagcc cattcctagc cttggatcaa agaacggagt tatagccgga 34380

gccaggaagc cccctgcctg ctggaaaacc ccaagtgtgg cggcctttgt ccatgtccct 34440

tggcttctgg gaagaactgg gtggtgccca ggcagggctg gtgccatcag gaagtgggtg 34500

gctgctgagg ggcctgggct ggcgagggcc tgggtgggga gtgcctgggc cgcccctgcc 34560

ttggtttcca cgtttccgtg ttggtctggg gtgtgtagag agatgggcac tgctcatccg 34620

gaagcccctc cttgtgcgct gccatcctgg gagcctcagc cgcatccgct gtggggcagg 34680

gggcttgagg gaggaggaga gagacgggcc atgcaggacc cctggcttga ggcagagcca 34740

atctaccctt tgcccattca ctgctctcag ttccctgcca gcctctcact gtgtgacctc 34800

agacgggccc agccccacag ctttcttccc gcagcccctc cctatgtcca tccagccagc 34860

cagtttctca ggcagcagcc ccacctcggc agtcactgtc ccagggaacg ctcaatgttc 34920

caaggaaggc tctgcagccc cagggaccag atgatgaggc tggccctgat ggagcctcgg 34980

gcctgtgtcc tgcaggagga gcccgtggct ggtgcacaga cggacagggc caagctcttc 35040

atggtggccg tgaagcagga gttgagccaa gccaactttg ccaccttcac ccaggccctg 35100

caggactaca agggttccga tgacttcgcc gccctggccg cctgtctcgg ccccctcttt 35160

gctgaggacc ccaagaagca caacctgctc caaggtgccc tggcttgcag aggccaccca 35220

ccctgagggc agtgctgccg ccgcgtgtgg ggtgggggcc atctgggtcc aaggtggtct 35280

ctgttctcta gagaaaaagg ggcagatggg gacagacgcc ccttcctcta caggcttcta 35340

ccagtttgtg cggccccacc ataagcagca gtttgaggag gtctgtatcc agctgacagg 35400

acgaggctgt ggctatcggc ctgagcacag cattccccga aggcagcggg cacagccggt 35460

cctggacccc actggtaaat ggggccccag gtgggaccct cagactcctg cgtggaaggc 35520

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cctctctgtt cccctatggg agtgatgggg gcctccacct ccaccaccag caccagcagc 35640

accacctcca cctccacctc cacctccacc tccaccacca cctccacctc caccaccacc 35700

tcctccacca ccaccacctc caccaccacc accaccacca ccacctccac ctccaccacc 35760

tccacctcca ccaccaccac ctccacctcc accaccacca cctccacctc caccaccacc 35820

tccaccacca ccacctccac ctccaccacc acctccacca ccaccaccac caccaccacc 35880

accaccacca ccacctccac caccaccacc tgcaccacca cctccacctc caccaccacc 35940

accacctcca cctccaccag cagcagcatc acttgttggg gagaccctgt gcaactccat 36000

gcacagccct gtccctgcca tagccccgac ccctaagcac agccctgtcc aactgccaca 36060

cgtcccctgc ctcccatgca tggtcctggg gggtcaactg cacacgccag ggtcctaggg 36120

tcctagaccc ctgtcctccc tgtttctgcc tctgtttggg gtggagtcca agtctccaga 36180

ggcggaagca tctgtgttcg tgtgttaatg aacagcccct acagagttcc cctagttcac 36240

ccagggggga acctagcctg ttgggacgac cccagatccc ttctgggctt ggtactcact 36300

gggatatcct catgcctgca cccagcctac ggctctgagc tcctgagtgg ggctttggcc 36360

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tggctctaca tctcttcatc aggaagaacg gcgccggatc ccaagctgac cgtgtccacg 36600

gctgcagccc agcagctgga cccccaagag cacctgaacc agggcaggcc ccacctgtcg 36660

cccaggccac ccccaacagg tagctgactc ctgaaccgtg tgcagcctac gacttggtgg 36720

gtccctcagt ggcttcacga ggctaactct tgagtgtggc cggggctgcc cctgtgggga 36780

gccatctcat ggtggggact gctcccggtt ctgcaccccg cagttgtcct gagcagctct 36840

ccaggagttc ctggaggaag ggcgggcagg gcggtgggac tctcagtcct ccaccccagc 36900

gccactctga gccatgctac tcccacacca ggagaccctg gcagccaacc acagtggggg 36960

tctggagtgc ccagagcagg gaagcagggc cagcacgccg tgagcgccta cctggctgat 37020

gcccgcaggg ccctggggtc cgcgggctgt agccaactct tggcagcgct gacagcctat 37080

aagcaagacg acgacctcga caaggtgctg gctgtgttgg ccgccctgac cactgcaaag 37140

ccagaggact tccccctgct gcacagcaag tggccctggc gtggggaaca gccggtgggg 37200

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cagcatgttt gtgcgtccac accacaagca gcgcttctca cagacgtgca cagacctgac 37320

cggccggccc tacccgggca tggagccacc gggaccccag gaggagaggc ttgccgtgcc 37380

tcctgtgctt acccacaggg ctccccaacc aggtagggca cctgcctggc tgctcctggc 37440

agcgccccaa ccgcacgcag ccctgggagt gagcagcaaa gccccaggcc cccctcagac 37500

tcaagtctct gtctccaggc ccctcacggt ccgagaagac cgggaagacc cagagcaaga 37560

tctcgtcctt ccttagacag aggccagcag ggactgtggg ggcgggcggt gaggatgcag 37620

gtcccagcca gtcctcagga cctccccacg ggcctgcagc atctgagtgg ggtgagcctc 37680

atgggagaga catcgctggg cagcaggcca cgggagctcc gggcgggccc ctctcagcag 37740

gctgtgtgtg ccagggctgt ggggcagagg acgtggtgcc cttccagtgc cctgcctgtg 37800

acttccagcg ctgccaagcc tgctggcaac ggcaccttca ggttggtgcc tggccactac 37860

agttcctgct gggtgtagcc ccaggtgatg ggctgagggg gaaagggcag gcccttgtcc 37920

tggtggcaac gcctggcaga cgtgtgcagt gggccggttg tctcacaggc ctctaggatg 37980

tgcccagcct gccacaccgc ctccaggaag cagagcgtca tgcaggtctt ctggccagag 38040

ccccagtgag tgcccacgga ggcccccagc acacccaacg tggcttgatc acctgcctgt 38100

ccagctctgg tgggccaaga acccacccaa cagaataggc cagcccatgc cagccggctt 38160

ggcccgctgc aggcctcagg caggcggggc ccatggttgg tccctgcggt gggaccggat 38220

ctgggcctgc ctctgagaag ccctgagcta ccttggggtc tggggtgggt ttctgggaaa 38280

gtgcttcccc agaacttccc tggctcctgg cctgtgagtg gtgccacagg ggcaccccag 38340

ctgagcccct caccgggaag gaggagaccc ccgtgggcac gtgtccactt ttaatcaggg 38400

gacagggctc tctaataaag ctgctggcag tgcccaggac ggtg 38444

<210> 2

<211> 37214

<212> DNA

<213> 食蟹猴

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<221> misc_feature

<222> (4525)..(4624)

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<222> (4914)..(5013)

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<222> (9472)..(9571)

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<222> (16613)..(17049)

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<222> (19812)..(19911)

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<222> (35806)..(36357)

<223> n 是 a、c、g 或 t

<400> 2

atgcccaaga tagtcctgaa tggtgtgacc atagacttcc cattccagcc ctacaaatgc 60

caacaggagt acatgaccaa ggtcctggaa tgcctgcagc aggtagagca caggctggga 120

ggaaaggact gcaggcaggt ggagctgggg ctgggtgtgc gtccctctcc cgacccattc 180

cagccaggcc cctccagagg cagcctctgt cataaaaagg ctggtgttcc aggtggggtc 240

agagagagga ttgacaagta aaaacatcgt ccttgagagt gacagactta gtgccttggg 300

ggcctctgag gagcggctgg tattcacagg tcaggaggaa gcatttccat cagaggggca 360

gccgggggcc agcctcactt tgaaggtctt tgaacctttg gggtgcaggg aggtggcagc 420

ggcgcaggtt gccttctcct gggttccttg aggtgccctc ttgtacccgg ctcacacccc 480

tcccctcccc gagtttcccg ctcaggttcc catctgagag ctcgtatgta ggacatcaga 540

taggacagcg taagtgtttg gatctggaaa cacagaacag tttcctattt tgagacttga 600

tgcctaatta gtcatcttac tatttaggct gaaaaatact gttgcatttc gggtaacgtt 660

ctgcaaatgg tctgctgatg gcagctggag ttgcttcacg ccctttaggg caagagtgga 720

aagtgtcctg cggacttatc catggtcccg tggggctctc gccacctgac agcggcctct 780

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ttgcctcttc ctggcttccc cgtaaccctt gcccccaact ctgttcagaa ggtgaacggc 900

attctggaga gccccacggg cacggggaag acgctgtgcc tgctgtgtac cacgctggcc 960

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gagcttttcc cgaatcaggc cttgtcgtcc tggggcaacg ctgctgctgc tgctgaagat 1080

cccataggtg accctagttc ccaggccttc cctgacctcc tgtggggatg gctggcaagg 1140

gatggcgctg agggtagggt gggcccatgg ggacttctgc cagcagagct caaggagaat 1200

tttgtagctg ccacataatt tctcgccatc gtgggtataa acctagggtt gggctttttt 1260

gctgaattag ggcgtggcag gtgtacactt cgcccgtttg tgataaacga gtctctgggg 1320

tgtcagattc ttggctgtct gcagggctga gttagccgaa tgccacccgc ctttaacacg 1380

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agatcattta cgcctccagg acccactcgc aactcacgca ggtcatcaac gagcttcgga 1500

acacctccta ccggtgggtc agacgagttc acgcctgtct tggggtcctc gagagaacca 1560

gcttgacgtg gtgctgggtc cacagaccac gctgtgctgt agtggagggg gcggtctttc 1620

cagacgctcc ccagaagtat gcagtgtgct ggtgcccagg ggtggggcgg ggcccgggct 1680

gtccctagtg cccattactt gtgaggaggc agctttgcat ttgtgtgctg accttgggct 1740

ggcgtcctga gctcctttca ggtgctgttg tggcagctgt gtggcaggtc agggccggcc 1800

cccagtgcag ctttgcacat gaagtgggag gaggccctgc cgcttgtcag agccctgcag 1860

agtcttggtg ttctgtcggg ttcctgtgga ggggccgatg gcggggtgct gtggaagctg 1920

tcgaatctcg tccctctgtc cagttccccc gcttgtctcc ttgctccctc ctactcccgg 1980

gccacgatcc tatgccgggg ccactctcct gcacccggac cacgctccta cgcccaggcc 2040

actctcctac gcctggacca cattgcagtt atgctgactt cctctggctg ccagtgctcc 2100

tgtgtgtctc catacagctc acgctgcggg accacgctgt ggctgttgga ggcagctcct 2160

cctccaccca tagtgctctc tccctccagg cctaaggtgt gtgtgctggg ctcccgggag 2220

cagctgtgca tccatccaga ggtgaagaaa caagagagta accacatgca ggtgggctcc 2280

tggctcccgc tccggctcag ggttccgtga ggcgagtgct gctgggtatc cagagtccca 2340

ggctgtgctc ctgctgggct ggggttcgaa gttcactggg ggactgcagg cgagggcctg 2400

gtgggggtgg ggactggctc gggtcctttc ttggccatac tccagccgcg cactctgccc 2460

ttcctcccgc agatccactt gtgccgcaag aaggtggcaa gtcgctcctg tcatttctac 2520

aacaacgtgg aaggtacagg cagctcggtg ggaccaggct tgggttggag tgtgtgcagc 2580

ctctcagggc gtcagcctgg ttgtgcttgc cgggtggggc ggccagtgca gccgtgtacc 2640

tgggcactgt cttctgactc gggaccaccc gtgttagtct tctgtgtgga agagctcacc 2700

cagtggtctg agacagccag ccggccggac tgcctgtggc tggtgcctgg ggccttggat 2760

tttgggaagg ctccctccat ttccggacga gaagggctcc ctgcacctga ctactggtgc 2820

atacagcagc ggttttgctg aacacctgct ttgtcttcgg ggagcctgag gttttgttgc 2880

ttgcccagca gcgggtgctc ctgtgaccgg cccttgtacc atcttgggag ggtgtcctgg 2940

aagccgtgtc tggcctcccc cgaccttgcc gcatgtgtct ttgtcctgtg ctgacgttgc 3000

agagaaaaat tacagccccg agcgtgactc caggctgagt cctgtgggtc cgacacggga 3060

ggccttgggg cctcttcagg agacgggatg agtgagtgat gggagcagag ccagggcacc 3120

tcgccctgtg actgcaggtg gccacagcct gtgagggcca ggggtgcttc tccacccacg 3180

tggctgcccc tcgggtatgt caggggcttc tggggctctt cacgaggtct cagagacagt 3240

agcagggtgt gcccccgtcg gctgccctta cagtttctgt gacctgaggg tggcatctgt 3300

gcggttggca tggcctgagc ttctgtggga tcagagttcc ctttgtttcc tgcctcagtt 3360

ggggctcaag cctcaggtga cgtggccctg gagcacctgg aaggcgtcgg cggtcctgcg 3420

ggctgctgtc tgcactcgtg tttgctgagt gctcagtatg ccaggactga ggaccctgaa 3480

gctgctgtta tatttaggac ggttctcccc tggcagagac ggagccgggt ggtcccgcct 3540

gacccaccac caggcgtttc tgggccctgg agggacaggg tgggcggaac atgggcctgc 3600

agggagacct ccacttactg gaggctcgtg ctgtgttgct ggaggcatct tctgtgttgc 3660

ttcttgtttg ctgtgtcttt tgttctggtg gcaccaagga cctccagtca ccttgatgtg 3720

tggttgtcca ggcctttttg gtggtcctga gaaggggtct gaggggctct gcctctgccg 3780

ccaggttccc tgatggaagc tgcccactcg tcctggtggt gcccacagga cgtgactctg 3840

gcacaggagg gcagatgtgc tgttggagat tctcagcccg tcgtcgtcat ttccaaagtc 3900

ctcacccgca tttctgggac aggacaggag tgcctgctgg gtgtccccgg tcccatgcag 3960

cgggggtcct tgggatagtg tggaacgctg agtgtgggcc tgtccggcgg tggtcctgga 4020

caagggtagc acccctgtgg ccgccgggcc tggtgcctgg tgcctagcgg ggaggccgct 4080

gaccgcctcc tgtgctgctt ccatccgtgt caggcctctg ggtgttgggc ccccatctgt 4140

ctccccccag gcctgtggga tcagtccaag aagactcaat ccagccccag cctgtccccc 4200

ttggcttggg ctctcactgc ccgacctggc aggaggttgc ctagcggtga acctttgcat 4260

cctgtctgcc ccctggacag gctctgaggg ggtgtctgca acacctgtgc cagcctgggc 4320

atcttttttt tttttttttt cttttgagac gaaatctcgc tctgccgccc aggctggagt 4380

gcagtggcgt gatctcagct cactgcaagc tccacctccc gggttcacgc cattctcctg 4440

cctcagcctc ccgagtagtt gggactacag gtgcccgcca ccatgcccgg ctaatttttt 4500

gtattttttt tctttttttt tttgnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 4560

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 4620

nnnntttgag acggagtctc gctatgtcgc ccagggtgga gtgcagtggc cggatctcag 4680

ctcactgcaa gctccgcctc ccgggttttt acgccattct cctgcctcag cctcccgagt 4740

agccgggact acaggcgccc gccacctcgc ccggctagtt ttttgtattt tttagtagag 4800

acggggtttc actgtgttag ccaggatggt ctcgaactcc tgacctcgtg atccgcccgt 4860

ctcggcctcc caaagtgctg ggattacagg cttgagccac cgcgcccggc cttnnnnnnn 4920

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 4980

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnttttgta tattttttta gtagagatgg 5040

ggtttcaccg tgttagccag gatggtctcg atgatctgac cgcgtgatcc gcccacctcg 5100

gcctcccaaa gtgctgggat tgcaggcttg agccaccgtg cccggccagc ctgggcatct 5160

ttagagtggg ctgcagctcc tggaggggtc tgagaggaag gaaggcaggt attttgtgaa 5220

tgaagagaca gctagagagc tggcaccctt cctggcctgc gtcctgtgag gactctggtt 5280

ggggacagca agcttggggt tagcctgggg cagagcctct gggaggcccc tgccccttgt 5340

cccccttccc cttgcagctc ctgtcctcgc cccgccctca gctctctgcc agggaaggtt 5400

tggcaagtgc cgctgtgcgg cagtgcgtgc tgattggctg gtcgttgcta tggtgccgct 5460

cagggatatg cttttcctcc cctgccttcc ctgctatccc tgggagcatc tggagttgag 5520

tcatcgctgg tgtgtgtgtg tgtgtgtgag tgtgtgtgtg agtgtgtgag tgtgtgtgtg 5580

cgtgtgtgtg tgtgtgtgtg agtgtgtgag tgtgtgtgtg tgagtgtgtg tgtgagtgtg 5640

tgtgtgtgtg agtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgagtgtg tgtgtgagtg 5700

tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgagtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtcagtg tgtgtgtgtg 5760

tgtgtgtgtg tgtgtgagtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgagtgtgtg tgtgagtgtg 5820

tgtgtgagtg tgtgtgtgag tgtgtgtgag tgtgtgtgag tgtgtgtgtg agtgtgtgtg 5880

agagtgtgtg tgagagtgtg tgtgagtgtg tgtgtgtgag tgtgtgtgtg agtgtgtgtg 5940

tgagagtgtg tgtgtgagtg tgtgtgtgtg tgtgagagtg tgtgtgtgtg agtgtgtgtg 6000

tgtgagtgtg tgtgtgtgtg tttgtgcccg tgtgcgcctc tggcctctgc agctgagtcc 6060

tggctctcag ggggcctggc acctcccggg gatgggcaca aagcagccac gatgcagccg 6120

ggagctgggg aaggccccat tgccccacac ggctgcccta agactctggg gtgcttcttg 6180

gaagaggtcc ttgcttctgt ctgtgtttaa gcagctccct aaggagttct tgtggttcca 6240

ggttgggggc ctgtgctgtg gaggcgaggg aggggcagga cccccaactc cctgaagcct 6300

tttctggcct ggtcctctca gccagcatag gcagggccct ttcccagggc tgccatgctg 6360

cagaggggag cgggccacta tgtagcctag gaaaacctga cgttccttcc gctggcagtt 6420

ctgggcctgt tgtggttggc agggaagctg agccacggtg ctcatcacag gggcacctcc 6480

aggatttttg ggagatgcct ccgtgggctg gggcgatacg ctgaggagct gttcttccct 6540

gccctgagga gggctgagtg tagccgtcac ccctgtcctg tcttgggctg tctcagggag 6600

gatgcataga accctcggaa ccctgctggc ccttgtctga tccaccctca acctcaggcc 6660

ttctaggggc acaggagggc tccgtcggga tcactgcggg tgggggcctc ccttggacac 6720

ctgagaccct caatgggtgc tttgtggcac gttcatgatt ggggcggggg gcacccagcc 6780

ctgcctgccg tgtaggagct gttctgtcct gggcgtccct ctgtggttgg gacccggagg 6840

gtgtgtgttt accccgcctc acacctgcag agaaaggcct ggagcaggag ttggccagcc 6900

ccatcctgga catcgaggac ttggtcaaga gcggaagcaa gcacaggtga gacccctcag 6960

tgaggccacg accactgtcc ttccatggcc cagctctcct gtgacctgtg gaggcccaga 7020

tatgtttctt cccttttctt tgttcctttc taagtcgtga aactaaccac cgtttagtgt 7080

gagaaagttg aagcagctct gaggaacgta gagtaaaaag cgaaaccgcc tccctcttcc 7140

ctggccgtca gccaccccag gagccaccgt ggagcgggga cagagccctg caggctcgtg 7200

tctgtgtgga agcacgcacg gttttgtctg cacagactgt tctgcagttt gccgttttca 7260

ctcagcgttg tgggtagctt cgcatgctgg tgctggtcgt ccggcttcgt tcttctgagg 7320

acagcaaata tgtcctttgt ccacctcttt tatagtttca gagattcaag ttataataaa 7380

gcttttctta tattgagggg gagagctcct gcccctcttt ttttttttag acagagtctc 7440

gctctgctgt ccaggctgga gtgcagcgtc gtgatcttgg ctcactgcag tctcaacctc 7500

ccaggctcaa gtgattctct cagctcagcc tcccaagtag ctgggactgc aggcatgcac 7560

caccacgcct ggttaatttt tgtatttttt gtacggacaa ggtctcactc tgttgctcag 7620

tccagtcttg aactcctgag ctcaagagtt ccacccgcct cggcctccca aagttctggg 7680

attccaggcg tgagcaccac gcccgaccca gctctgcttt gttttagtgg ttctgtttgt 7740

gtttgtttct gatgacctct atccaggaat agggttggtt tttcttttcc atggagtttt 7800

taaagagatg atgatttaca tggtttaaaa ctcatgtgga ctccccgtcc atcccagaca 7860

gcggcttccc acctggaccc catgctcagg attagggctc cttccgggtc agaagatgtg 7920

gcggccccgg cctcgggtca ccgtcccctg cacggggtgc tcacagcatc ttcccctctc 7980

ctcgttccca gggtgtgccc ttactacctg tcccggaacc tgaagcagca agccgacatc 8040

gtcttcatgc cgtacaatta cttgttggat gccaaggtgg gggctcagtc tgcgtcgctg 8100

acaactcctg atgtccaggg gggttcctgg gcttgggaaa ggccgtccga gcctttgctg 8160

ctgcagggac ttagagcagc aggcctgggt gggagagctc acctgtcact gggcaggggc 8220

tcaacctggc cagacacact tgtgagcacc cccaggccct gggtcagttg ttctgagcaa 8280

tctgggagtg ggcaggctgg tgggagtgag gagaggcctc caggctgtgg tccacaggcc 8340

agcgcccact cttgatcctg acagctcagg ttctctcctt cacgtccgat cacaggaagc 8400

aaagcactga gaacacggga agcccactca ctcccctcct cccagcccca cactcactcc 8460

cccccatgcc cggccccaca ctcacttccc tcctcgtagc ctgtactcac ccacatgctg 8520

ttgtgcccca cactttttat ttagtgcagg tggcatctcg ccgcgggtca gtgacttgtg 8580

ttcacgtggc gatgacgtgg tgacgcttcc agatccctcc attggtttgc tcattctcag 8640

ggtgtatatt tatcaagagc ccatcgtgct gggggctgtt ctaggcatag caagactggc 8700

ttcattcatg tggagctttg attctagcgg tggggacagg tagacagcag aagagtaagc 8760

ccgtgagccg atgagactga agagaagtag agcagagcga ggaggtggag acagagccga 8820

gtgggcaggg cccaagtgcg atgtcggcag gagatgggga atgctgatgt gtctgagggg 8880

agcccgagct ggtgcagcag agcaagggag gaggcggggg gccgactcct gggcagcgat 8940

tgtagaaccc cacggagagc tggtgaggtt tgccgtggtt gcaggtgact cggtgctttg 9000

agccgtggct gcccctggga accacctgga gagcttctaa cccaaccagg cccttccctg 9060

ggacaattct gtcacagctg gtaagctaag tccaacactt tcacggaaac acagaagatc 9120

taaaacggca cgatgaccgt gaagaacaga gctggaggac tcacctcact ggtttcaaga 9180

ctcctctaaa actgcaggag tggaggtgga gacggctcag ctcaggcaca agcctgcagg 9240

ccatggagaa ggcagcaagc tccagctgac ccacacgctt gcggtcattg tttttttttt 9300

ttagttggaa tctccctctg tcaccccagt tggactgcag tggcaccatc tcggctcact 9360

gcagccccca cctcctgggt tcaagcgatt ctcccacatc agcctcccga gtcactggga 9420

ttacaggcgt gcgccaccac gccctgcccg tgatgattgt tttttttttt tnnnnnnnnn 9480

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 9540

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nttttgagac agagtctcgc tgtgtcgccc 9600

agggtggagt gcagtggccg gatctcagct cactgcaagc tctgcctccc gggtttttac 9660

gccattctcc tgcctcagcc tcccgagtgg ccgggactac aggcacccac cacctcgccc 9720

ggctagtttt ttgtattttt tagtagagac ggggtttcac cgtgttagcc aggatggtct 9780

cgaactcctg acctcgtgat ccgcccgtct cggcctccca aagtgctggg attacaggct 9840

tgagccaccg cgcccggccg atgattgttt tttgacaaat gcgccaatgt aattgagaga 9900

ggaaatgaag gttgattttt ggttttctga aaaagtggtg ctaagaacag ctggatatct 9960

gtttggaaaa cagcgaatct taactcttgc tttactctat ataaacctaa atgtaaaagc 10020

taaactaaag gttatagaaa gaaacatggg ggggtctttg caactctggg gtaggcagag 10080

attccttagt gtggatacat aaggcactag ccgtgaagaa aaacataaaa tttggatttc 10140

accaaaattt aaagcttcaa cacttgagaa gacttgagaa aattaaagag cagttatgga 10200

aagggagaaa atgcttctgt ctttcagagg acttaaaaaa catttttcag ccctcctcat 10260

attttaaagg acctttgacc agagtatgta aaattctctc ataactaagc aaaaaaccca 10320

tttaaccagt gggaaaggat ctgcacagac gtttcaccaa gatggacgga gtggccagtt 10380

gggcacatgg aaggacgccc agcatctcca gtcacaggag aaggcagatt aaagccacgg 10440

ggagccggca ctacggtccc gctagcatgc tgaaattcag aagcctgagt gtggcacgag 10500

gaggtggaac agctggatct catccattgc tcctaagctg tgaagctgtg tagccactcc 10560

acaaacacgt gtggcgaaca gccgaaccgg gagaagggaa gacgtgttca aagatttgtg 10620

tgtggccagg ctcagtggct cacacctgta atcccagaac tttaggggcc aaggctcagg 10680

gatcgcttac gcccaggagt ctgagaccag cctgggcaac atagggagac cccatctcaa 10740

aaaaaaagaa aaaagaaaaa aaaagactta aatgtgcaag tttaccagag ctttgtttaa 10800

gttgccagaa ctgggaagcc gcccacgtga gtccatccac tggtgaacgg acaaaccgtg 10860

gttcgcaaac cccaacagca gccgcgggca tgggctgtgg tcacacagca gcagggagcc 10920

agtgagtctc agatgtgcta acccagaggc caactgagga ggacctactg ttttttgttt 10980

tttgattttt gttttgagac agagtcttgc tctgtggtgc aggctggagt gcagtggtgt 11040

ggtctcggct cactgcagcc tctgcctctc gggttcaagc agttctcctg cctcagcctt 11100

ccgagtatct gggactacag gcacccgcca ccacacccgg ctaatttttg tatttttagt 11160

agagacggca tttcgccatg ttggccaggc tggtttcaaa ctcctgacct tgtgatccac 11220

tcaccttggc ctcccaaagt gctgggatta caggcgtgag ccaccgcacc cagctggacc 11280

tactgtttta ttccgtttat atgacgctgt attaatagaa gaggcagggg tagagctggt 11340

ggttatgtgg tgcacttaac tgccagaact cagtaccctt aaaatgggca tcttaatgtg 11400

tgaaaactta aaagtaccaa agctggaccc caccccagct tgctcccatg acactctgtg 11460

gtgggacctg ggagttgggg tttttttttt tttttttcag atggagtctc actctgttgc 11520

ccaggctgga gtgcagtggt gcaatcttgg ctcactgcaa cctctgcctc ccagattaaa 11580

gcgattctcc tgcctcagcc ttctgagtag ctggggttac aggcgcacac caccacgccc 11640

ggctaatttt tgtgttttta gtagagatgg ggtttcacca tgttggtcag gctggtctcg 11700

aactcctgac ctcatgatcc acccgcctcg gcctcccaca gtgctgggat tacaggtggg 11760

agccaccgcg cccggcctgg agttgggttt gtaaatctcc ctgagtgggg ccggggcaga 11820

gaactgctgg gtctgggtct tcctggctcc tgtggtctgt ggctggctga ctgcggtggc 11880

cgggggctcc caggacgtcg tggccgtccg tcttgctgag cgtggcgcgt gcctttccat 11940

gctgtgcgtg agcgtctccc ggcgtggcga gctgctgctt cgggtggggc ggtgttgcca 12000

ggttgccatc cagatctggc ctctcctctc cacgtcgccg gcggtgtttg tcatcggcac 12060

ttgcgatgtt cgatgccggc cacatgtgcc ttggtttccc tccttcctgc ccctgtgagc 12120

tccagcaccg tgtcccttct cttcctcctg tagagccgca gagcacacag cattgacctg 12180

aaggggacgg tcgtgatctt tgacgaagct cacaatgtgg tgagtctcca ctgcctccta 12240

aacgcctcct gtttcttcaa gagcagcgca aacctttctg gaggggctct ggccaaaccc 12300

ttgcagcctt cggtgcccag gactgaggac tgagcacccc aggagcttct gcaccccttc 12360

ccactctgat ccgatgcctc tgctggggct ggagactggc cagctgggcc agggacctgc 12420

ccctcaggcg cagggccccc acaggccgct ccccaggcct tccctctagc cagctagggg 12480

tcagcctggg ccaggggtgt ctcctctgcc ctcggcttct gtcaccaggg cagcagcagg 12540

cgtgtggtct cgcctgcagt gtctctgccc ttccggccac atggcctgag gctgaggcag 12600

aattgcttga accctggagg tggaggctgc ggtgagccag gatcacaccg ctgcactcca 12660

gcctgggtga cagagcggga ttctgtgtca aaaaaaaaaa aaatgttgac tgggcgcagt 12720

aggtcatgcc tataatccca gcactttggg aggccgaggc gggcggatca tgaagtcaag 12780

agatcaagac tatcctggcc aacatagtga aaccccattt ctactaaaaa tacaaaaata 12840

ttagctgggc gtggtggtgg gtgcctatag tcccagctac tcaggaggct gaggcaggag 12900

aattgctcga acccgggagg tggaggttgt agtgagccaa gatcacacta ttgcactcta 12960

gcctggtgac agcgagactc cgtctcaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaatt ggcaactcca 13020

ttgaaataat tgtttgtttg tgttttgaga cagggtctca ttctgtcgtc caggctggag 13080

ttcagtggtg tgatcttggt ccactgcaac ctccacctcc tgggctcaag ccatcctcct 13140

acttcatcct cccaagtaac caggactaca ggtgcacacc accacgcctg gctaattttt 13200

gtattttttg tagagatggg gttttgcatc attgcccagg ctggttttga actcctgagc 13260

tcaagtgatc tgtccacctc agcctcccaa agtgctggga tcacaggtgt gagccgctgc 13320

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tgcttgtggc ctggccttag agaccccagg gcgtggcttt ggggacttgg ctgtcagcct 13440

cctgtgcctt ctgcacccaa ccccattcct gctttctgga acccccgatc ctatcctgct 13500

ctgtggtgat ccgggtgatt tgggctcccg atcctatcct gctctgtggt gatccgtgtg 13560

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tatcctgctc tgtggtgatc cgggtgattc gggctcctga tcctatcccg ctctgtggtg 13680

atctgggtga ttcaggctcc cgatcctgtc ctgctctgtg gtgatccggg tgattcaggc 13740

tcctgatcct atcctgctct gtggtgatcc cggtgattcg ggcccccaat cctatcctgc 13800

tctgtggtga tcccggtgat tccggctccc gatcctgtcc tgctgtgtgg tgatcccggt 13860

gattcgggcc cccaatccta tcccgctctg tggtggtccg ggtgatttgg gctcctgatc 13920

ctgtcctgct ctgtggtgat ccgtgtgatt caggctcctg atcctgtcct gctcggtggt 13980

gatcccagtg attcgggccc ccgatcctat cctgctctgt ggtgatccgt gtgattcggg 14040

ctcctgatcc tatcctgctc tgtggcgatc ccggtgattt gggctcccga tcctatcctg 14100

ctctgtggtg atctgggtgt gctcggactc caggagaaga tgtgtgaaga atcagcgtcc 14160

tttgacctga ccccccatga cctggcttca ggactggacg tcatagacca ggtgctggag 14220

gagcagacca agactgtgca gctgggcgag ccccacccgg agttcagcac agactccccc 14280

agcccaggtg cgttcatagc caggctgctc ggtcctgagg cctgcgctgc tgcagggggc 14340

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gggcacccac ttctctcaga ggcttctcgg gtgtgaattg tttggggtcc tgtaggctgt 14460

ggaagggctg gtatcgttca gtagttctgg tattttccga agacctatgt cttctcccag 14520

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ggttggtctg tactgtctgt gttttcttcc tttctttttt tttttgagat ggagttccac 15060

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accacgccca gctaattttg tatttttagc agagtcaggg tttctccatg ttggccaggc 15240

tggtctcaaa ctccaggtga tccgcccacc tcggcctcct gaagtgctgg gatccaggcg 15300

tgagccgccg cgcccggcct gtgtcgtgtt ttctgcgtgg cctctgtaaa cagctgacta 15360

ggagtctgtg agcatcttca ttggttccgc tgtgacttgc gtgtgagcat ctccagcatc 15420

agctttcctc attttccttt aaaatcgcac atgtggatgg acaccatggg gaccctggac 15480

cctgggcagc ctcgtcctca cctttctcac cagggtggct gcttgggaga gagtgagttt 15540

gcgaacttgg catttgttct ggctgtagga tccgtttata tatatacata tatttaagtg 15600

acagggtctg actctgttgc ccaggctgga atgcggtggc gtgatcttag ctccctgtag 15660

cctcagcctc ctgggctcgt ggggtcttcc cgtctcagcc tcttaaagca ccgggaccgc 15720

aggcggtcgc cactgccatc ggatctcaag gctgccacgc agggcgctgc agtaggggaa 15780

ggggttcctg ggactttgaa cgctccacct ccctcttctc cacagtcccc caaccccacc 15840

tctaactggg agtggatggc cacctctttc catcctttgc ctggcgcagg gtggggagaa 15900

tgacaggtct ccttcccgca tctcggcagc tgccctttcg tcggttatat gacgtgggag 15960

agaccccggc cacccccagg gctgtgtgac gtgggagaga ccccggccac ccccagggct 16020

gtgaacaccg ccacaggggc cttctccact cttcagtttt gttagttacg tgacgtgcag 16080

ggcttttcgt tgtaactagt gggggacgtg tggtgagggg ggcttctgcc gtctcattca 16140

ggaccggaac ttcagttttc atcgctattt gtcctcctac gcctttggag atggggtctc 16200

gctctgttac ccaggctgga gagcagtggt gccatcaggg ctcacggcag cctcctcctc 16260

ctgcagcctc cgcctcttgg gctcacacaa tcctcctgcc tcggcctccc aaactcctgg 16320

gacgactaca gacgtgcgcc accgtgcttg gcagggttca ttcttttcct cacactttat 16380

ttattggaga gcccggtaga gcgcccggtt tgcacgatct ggttgttgag acgttgagag 16440

gaaccctgcg gagtctgaat ctgggtatgg gaggggcagt cacacgagtt ccccggtgtc 16500

ctcgtctcct ccgcacttag gtgcccttag gtggcttgag gaccccagtt agactggggc 16560

caccctttgc ctggctccag gcgggatgtc ctttcttttt tttttttttt ttnnnnnnnn 16620

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 16680

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 16740

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 16800

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 16860

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 16920

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 16980

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 17040

nnnnnnnnnc tgggactaca ggcgcccgcc acctcgcccg gctagttttt tgtatttttt 17100

agtagagacg gggtttcacc gtgtcagcca ggatggtctc gatctcctga cctcgtgatc 17160

cgcccgcctc ggcctcccaa agtgctggga ttacaggctt gagccaccgc gcccggccgg 17220

gatgtccttt ctatcaggag gctcacagta tctgctttcc agtttcttct gatgttaatg 17280

ttgttgctgc tgaacacctg actctgttga ttattggggg attgcaagat ggtagtgtcc 17340

caattctgtc gcttagtcag ttagcaggaa taatctagca ccatgctctg catcgcatca 17400

gccgtgtggt gatcccattc acacaggaaa ggcgggataa atgctggctg tgggccgggt 17460

gtgctgtccc gcatctgtaa tcccagcact ttgggaggcc agggcggtcg gatcacgagg 17520

tcagagattg agaccatcct ggccaacatg gtgaaacccc gtctctacta aaaatacaaa 17580

aaaaaaccca aaacatgagt gggctgtggt ggcgcgtgct tgtaatccca gctaccgggg 17640

agactgaggc aggagaatca cttgaacccg gggggcggag gttgcagaga gctgagatcg 17700

cgccactgca ctccagcctc acaacaaagc gagactctgt ctcagtaatc aatcagtcaa 17760

tcaatcagac gtcatcagtg aatgtacgtg agcgtgtagg gattggtcct gctccgcgcg 17820

ccaccctcaa tctcacttct gacctccgtt ctccacctcg aggtgttttc atgtgggccc 17880

gtgtgtcctg accccagcag ttgtggcctc tttgctgtct gggagtcagg atttttcaca 17940

ctcatgtcct gctccagacc tggaatcagc caagtctcca agaagctctg gtttcttttc 18000

ctgcaaggtg gtatttcagg acccacgatg cggcaacagg ctggtcatgg ttactgggtt 18060

ggtcattgtt actgggtgtt tttgtggaga tacatccata cgcacagatg tgttcacaaa 18120

tgttaactct gaaggtaaac cacccggctg ggcacaaggg ctcaccggta atcccagcac 18180

tttgggagac cgagacagtt ggatgacctg aggtcgggag tttaagacca gcctgggcaa 18240

catggtgaaa ccccatctct actaaaaacg caaaaattag ccaggtgtgg tggcacacgc 18300

cggtagtccc agctagttgg gagacagaca tgctggaacc tgggacacgg aggttgcaga 18360

gagcagagat agtgccgctg caccccagcc tgggtgatag ggtgacaccc tgtctccaaa 18420

ataaatagat aaataaaggg aaaacgcctc ctcttggtgt ctccagtttg gactggctgg 18480

catgggttcc ggtagcctct tcccccatgg tggcgtcctt ttttccatgc cgggaatcct 18540

ggttctcaag ggcggggttg ttggtctgag tgtgacacag actgtgcctt tgctgccttt 18600

ctcttgccca gggctgaaca tggagctgga agacattgca aagctgaaga gtaagtgctg 18660

ccctccccac cttcttgcgg ctgggtgggg cctccccctg atgcctcctc aacccgacct 18720

gcagtgatcc tgctccgcct ggagggggcc atcgatgcca ttgagctgcc tggagacgac 18780

agcggtgtca ccaagccagg gaggtgagag gcggggagcc agctgcttca ctggaggccc 18840

agcctggagc tagagatagg ccatggtgca gtcctaggct gtcccaccag tgaggcctgt 18900

tttcaggccc gttttccctt tttgagacct ggtaggagca cctggtttgc atgatctggt 18960

tgttgagacg ttgagaggaa gagcacacgc atccacggaa cagcacacgc atccacggaa 19020

cagcacacgc atccacggaa cagcacacac tcccacggaa cagcacacgc atccacggaa 19080

cagcacccac tcccacggaa cagcacacac acccacggaa cagcacatgc ttccacggaa 19140

cagcacatgc ttccacggaa cagcacaccc ccacggaacg gcacccacgg aacagcacgc 19200

acgcccccac agaacagcac acacccccac agaacagcac ccacgccccc acggaacagc 19260

acacacaccc acggaacagc acacacgccc ccacagaaca gcacacaccc ccacggaaca 19320

gcacacgcac ccatggaaca gcacccacgg aacagcacac actcccacgg aacagcacac 19380

gcccccacgg aacagcacac acacccacgg aacagcacac actcccacgg aacagtacac 19440

gcatccacgg aacagcacac acgcccacgg aacagcacac gcatccacgg aacagcacac 19500

actcccatgg aacagcacac gcatccacag aacagcacac acactcccac ggaacagcac 19560

acaacagcac acactcccac ggaacagcac acgcccccac ggaacagcac acacacccac 19620

ggaacagcac acactcccac ggaacagcac acgcccccac ggaacagcac acacacccac 19680

ggaacagcac acacgccccc acagaacagc acacaccccc acggaacagc acacgcaccc 19740

atggaacagc acccacggaa cagcacacac tcccacggaa cagcacacgc acccacggaa 19800

cagcacacac annnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 19860

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ngcacccacg 19920

gaacagcacg cacgccccca cagaacagca cacaccccca cagaacagca cccacgcccc 19980

cacggaacag cacacacacc cacggaacag cacacacgcc cccacagaac agcacacacc 20040

cccacggaac agcacacgca cccatggaac agcacccacg gaacagcaca cactcccacg 20100

gaacagcaca cgcccccacg gaacagcaca cactcccacg gaacagcaca cgcccccacg 20160

gaacagcaca cacacccacg gaacagcaca cactcccacg gaacagtaca cgcatccacg 20220

gaacagcaca cacgcccacg gaacagcaca cgcatccacg gaacagcaca cactcccatg 20280

gaacagcaca cgcatccaca gaacagcaca cacactccca cggaacagca cacactccca 20340

tggaacagca cacacacacc cacggaacag cacacacgcc cacggaacag cacacactcc 20400

cacggaacag cacacacatc cacggaacag cacccacgga acagcaccca cgcccgcatg 20460

gaacagcacc cacggaacaa cacacacccc cacggaacag cacacacccc cacggaacaa 20520

cacacactcc cacggaacaa cacacacccc cacggaacaa cacacacccc cacggaacag 20580

cacacacacc cacggaacaa cacacactcc cacggaacaa cacacacccc cacggaacaa 20640

cacacacccc cacggaacag cacacacacc cccacggaac aacacacacc cccacggaac 20700

agcacacact cccatggaac agcacacaca cccacggaac agcacacaca cacccacgga 20760

acagcacaca cacgcccacg gaacagcaca cacccccacg gaacagcaca cacccccacg 20820

gaacagcaca cacccccacg gaacagcaca cacacgccca cggaacagca cacacgccca 20880

tgcggggccg ctgggtttcc tgcagtttgt cctcctccag gcctttccct ggacctcctc 20940

aggtgcctgt tagaatgaga ccttcttgtt aggacgatga gtgtcccagc caccacctct 21000

tttggactcc gggaggcccg gaacattctg aaggctccgt gggtctcctg tcttctccgc 21060

ggccagggca gcagcatttg ttgtctgtcc tgcaggcaga tgagggtcag gcctggggcc 21120

cgtgtggggc tccactgagt gcacagccgc caaggcgagc gcgttctgcc tgagcgctga 21180

ccttgtggcg actcccagtt gcttccaggt ggagccagtg tcctcagcgt aatgctcaag 21240

gctctggcgt ggctcctcgg ccacctgcac ccccaggggc ccctcctgta gcttctgctg 21300

ccgccatcac tgtcactctc ccaaggcttt ggggactctg cccagagccg ctgcctccca 21360

gaagcccctg acgacccccc ggcgacccca tccctccctc tgatgacggc ctctgccccg 21420

aggcggcttt tccttggtgc tgttcttgtg ccggccaggc ctccacttcc catctggagg 21480

ctcctgaggg cggaggcctc tcacccccaa tgccggcgtc ccctggaggg ctcagtttgt 21540

ttccgaggga aggaaacttc cacagttgct gccttcagtt cccaaagctg cagcctgatc 21600

ccccgtccag gctcgagcct gccttcttct cctcgcagct acatctttga gctgtttgct 21660

gaagcccgga tcacgtttca gaccaagggc tgcatcctgg actcgctgga ccagatcatc 21720

cagcacctgg ccggacgtga gtgccggggc ggggtccttg gtgtgggcag acgtggcgta 21780

gggggtgcag caggcctcca tcctggcagt cagggctcgc ctggccatca cctggccgtc 21840

agcaggaaca ggctcacaga acctcacctg gtcggggcgt ggaggcgtta gtgccggttg 21900

cccactgccg tagagcctgt cccagttctg cagctggcgg cttcgtcctg cagactcatc 21960

ccattattcc ccttttaagg aagagcagcc caaggccctg gctgggttgt ggggcctcag 22020

gcttctccac acaccctgag ttctgcttct cagagctgtg gggtccagag gctttgccca 22080

gaggcagtgt cgtcatgggc tgctctggtt tgagatgccg gcccgccggg gcctctgctg 22140

tgctcccagg tgctggggag ggcggctctt gctgcttcaa accttaggtg accatagagc 22200

ctcttttcaa gttccaccgg cccccttgga gacgctgtcc ctgcctggct gctctcctgg 22260

ctgctgggaa gggcaggcga gctgcccgcc ctgagtggac actgcgctcc accctgggcc 22320

ccccgttggg caggagatgg agcttggcag tcgggctgag ctggcttatg gctggaaggg 22380

cgggggctgg ggtcggggcc tcccctgcct gcagtgcggg tgtcagcgcc cggcatgcta 22440

cctccccagg tgctggagtg ttcaccaaca cggccggact gcagaagctg gcggacatca 22500

tccaggtggg gcctgctcct ctggcgtctc cttccctgat ggaagccggg cgggtgcctt 22560

ctcctgctgt attagttact gactctagac gtgggggtgg gagaacggcc cccacaccac 22620

ctgtttccga ctggcaaacg cttggctcct ttcctgtgac ccaaacccac actgggcctc 22680

ccgcggggat gggggaggac gaggtctggt ggcccgtgcc cagggtgacg ctggtggggg 22740

aggacgtgaa ggggagtggg ggccagggag ccgctcctgc cctgtccggg ccctcaggcc 22800

ggggggaccc actcctggca gccccagcta cacgcagatg aagagctctg gacacacgta 22860

gcttcctgaa cagcttctcc agggacagac aaacggggac cctgcaggtt gccggcgggg 22920

gtgtccctgc gagcccatga tgggggatgc ggccccggcc cccttcttgg ccccgtcctg 22980

ccctgtgatg cccgtcccct cccatgtgag gttgctcctg gctctgtgcc tgtggcagca 23040

cctgctttcc ctgaggcaga cgggcttgtg cggtttgtgg agggcaagcc ccatttttgg 23100

gtgctctggg cacacacttg cctctcctgg acctcggtgc attttttaga agcagaccca 23160

caagtccctg actgggaggc catcagtcct tggggaaacc gaggcacagg tggctgtgtg 23220

gagccatgtg aggctgcctc tgtgctgccc acactgaacc tcctggccac acgaggtcat 23280

ggcagggtta ggtggggctg cccagctctg tgacaacttc gtgagtgtcc gcctggggtg 23340

gggggtgctt gagctggggg aggccgcaga agaaccctgg aatgtaccgc cggcctgtgc 23400

atgcagtgcg gtgctctgtg catgctactg ggcgtggagc tgcaggcccc aggacgacca 23460

ggcactgcct tcttcataga cgtggctctg agcaggggcg agacctgggc agggaccagg 23520

tggggtgggc acagcaggtg gtagggccca ggctcagccc tacctccacc gtggccttct 23580

ctgcggccag tgatgccaca gccagtgtct tctctgtgtg gcagctgggg ctggaaagac 23640

ggcactgcta tgtctcccag ctcctcccca aaagcacggt gggcatccca gggccagacc 23700

cctctctctg tggctcctgc ctgccaaggg ctgctttgcc gtcccgcctg gagcgtggtt 23760

ggctcttcaa gcaggaggcc gtgcacctgc caggcggacc tgcttccatg tcctgacggg 23820

tcactcaaag cacctccagc acatggccat cgaggcagcc ctgcagccca gggcctggag 23880

ggcaggtgtg agctggcccg ggcctgcccc tccctggaat gtggcttccc aggctccagt 23940

atggagcagt gtccacactc tggaaccaaa tcttgttcac cccattggtt tggaatttcc 24000

tttggctgct gctctaagta gccactggga gatgactcag ctcctcccaa ccctggggac 24060

tgcacaccgt gttcaccctc ggctgctcct gagtccctgc aggtgtgggc actgctcata 24120

gggctgctgc tgggctggac ttgcagccct gaggcacagg tgaccctggg gacagagtgg 24180

ggctagagtg gggctagtgg ccccaggaag aggatgtggg atgcacggtt cagttggagg 24240

caagtccggg cagggccagg ctgtgtgctg gggaggtaga gcttagctgg aggcaaactc 24300

tgggcagtgc tggcccgtgc tgggcagcca gtcaccgctg ggcccctgtg agactagtgg 24360

gtcccctttc ttctctgcct gagctgccct ggggctgaag cacggggcgg tttgtagtgg 24420

tgtttttttg agacagggtc tcgctctgtc accccagcgg gagtgcaggg ccttgtcacc 24480

agctcactgc agcctcagcc tcctgggccc aggccatcct cttgcctcag ccacctgagt 24540

agctgggaac acaggcgtgc accaccacgc ccggctaatt ttaaaagctt ttttgtggag 24600

atggggtctt ggcgtgcacc accacgctcg gctaattttt taaattttta tgtggagatg 24660

ggtcttgcca tgttgcccag gctggtctca aagtcctggg ctccggcagt ctgcccacct 24720

tggcctccca cagtgctggg attacaggta agagcttcca ggcctgccca tcagagggct 24780

ggctttttga gggaagctgt ttcctgaggc agcctcagcc cctgctcatg gcagcccctg 24840

gtgtcatggt gaatttgttc tgttgtttcc atccctgtgg gccaaatgct ttggtaaaac 24900

gcaaggcctt gtatttagct gtcttgacag tgaaaatggc tgggaaggaa ggaaggaagg 24960

aatggaagga agtttctctc tcccgtgcat acccaggcac gtgcacacgt gcgcagtcca 25020

cgcacgctgc cggtctctgt cccagccgcg gtgccggccc ccgtgttctc cagttcagct 25080

tctccgcatt tctgtgaacg attccggctt cttgatgttc ccagcagaac tccctcaagc 25140

cttcggcttc tccagggctc tgacggcggc tgggctgacg tggccgctct gcggagcctg 25200

ttggggcttc acgttcctgt tctggccatt tccggctctt tttccgggaa gggtcatcac 25260

gcgctctttt cctagtgcag gcatcgtccc tttcccgttg atttgcaggg ttctctgtaa 25320

gatctgagga acacgtgcca acatattctt tcctggtctc gtgctggtca ttttttccat 25380

tttcacgaca ggtttggtga acagatgttt ccttgtcatc agacttttgt cttgagcttg 25440

tatcccccga ccaagatgct aaactgggtc ttgtgtgttc tccaaactgc actgtagggt 25500

ggcggagctt tgtgtcgggg cctccgcacc ttccggcgtc acctgtgggg gtgtgaaagg 25560

cagactctac ctggattttt cccagcacgc cacaccggtg gttccgtctg ctgaccgagt 25620

ggctcggctt ctcccaactc cgctgggcac ctgccacact gttttcctca cggttttgtt 25680

cgtggtggtt ttgtcgtaag tcctggtgtc ggccagaacc aatttctgtt tttgtttgtt 25740

tttgagatgg agtttcgctc ttgtcgccca gggtggagtg cagtggtacg atcttggctc 25800

actgtaacct ccgcctcctg ggttcaaatg attctcctgc ctcagcctcc tgagtagctg 25860

ggattacagg tgcttgccac cacgcccagc taattttcat atttttagta gagacggggt 25920

tttgccgtgt gggccaggct ggtctcgaac ccctgacctc aggtgatcct ctcgcctcag 25980

cctcccagag tgctgggatt acaggtgtga gccgccgcgc ccggcctctt gttcttctta 26040

aacctgccct gatgttttct ccatgatgca tgttggagtc aacctgtctg cttcctttaa 26100

aaatcttgct gtgattttga ctggaatgtg tggaattcct gtgtttttga gtcagtgtct 26160

ctctgttgcc cagtctggag tgcagtggga ccatcacagc tcactgcagc ctcaacctcc 26220

tgggctcagg ggatcctctc agcccagcct cccaagtagc tgggaccacg gcacgtgcca 26280

ccacgcccgg ctagttttca tatttttttg gtggagaccc cagggttgca ccatgttgcc 26340

caggctggtc tcgaactcct gggttcgggc agttcgcccc tctcggcctc tcagagtgct 26400

gggattacag gcgtgagcca ctgcactagg ccatgttgaa tttctagatt aatttgggac 26460

ccttaggggc acagagagga gggctgggcc agctggtggg aggagaggcc tctcgggctg 26520

ccgcatttcc agtgcacgga gatggcctgc gtagggggaa cagagctcac tgggggtccc 26580

tccagggagg agaaagggtc aggcaggtgc cagctcctgt ccatcagcct ggggctgcat 26640

gatggcaggg gctggtgaac cgatgacctc tgggtgtcct gtgaccttcc gtgtgtgggg 26700

ctgatgccgc agaagatcag gtggcctcca gggctccggg ctctggcctc aggctcctca 26760

cgggactgca cctcctctct ttcagattgt gtttagtgtg gacccctccg agggcagccg 26820

tggttccccg gcagggctgg gacccttaca gtcctataag gtaggggcca cctccaggag 26880

gcaggtgggg ctgggggtcc tgcagtcctg aaaggtaagc ggctgccccc aggacacggg 26940

cggggtctcc acacttctgg tcctgtcccc tccaggtgca cgtccatcct gatgctggtc 27000

accggaggac ggctcagcgg tctgatgcct ggagcaccac tgcagccaga aagcgaggta 27060

cagacctggg cccacactct ccccgcccgc ccgggtgtgg tgctcagcac cagcatgcca 27120

caggctaggc acgtggccag ccgtgggtct cctgcccccc tgggcctggc caccttctcc 27180

atgtccaggc caatccagag cgttctcctc actgtccctc tgaaggctgg agttactgag 27240

agacatggga gagggcctga tggcaccgtg acctgcccag agtcacctgg ttggtggcgg 27300

cagagccaca gctcagccag gccttcctgc tgggacacac tggtttatgc caaggccgtc 27360

agcacggagc cccacagtga ggcacagctt tccctgctgc ctccacccag cgcctggctg 27420

ggccaagcct cagggtctca tctgaagggg gcccgactgg ccctgttgtc cgaagcctct 27480

ggtgcgctcg gccctgaggc cccacgtgcc ttgttggctt cctgtgctct gtggcgtctt 27540

cgagtcggtg ctgccgggta cctgtgtgga tggggcccgt gagtgggccc tcggctccgt 27600

gtccagagtc ctgtggttct tggagtgtgt ccggccccac ccggccatgt ggtgtccaag 27660

gggggctttg tggcggcagc ggtgggagct gctgcccctt ctcgtgctcc agtggggcct 27720

tgcctctggg cttggttcgt tcctctctgg aacgttcttt ctcagagctc tctggcccgc 27780

ggtggcacga cgtggccctg gctgaagcag cccccgcgtg gttgctgtgg ttggtctgcc 27840

tggccgagcc ggaaggggag gcccgggagg gcgtcagggt tgcgtggctt gacccccggt 27900

cggtggctcg gtgatggcct cgtggcaagg cgtctcccag caggaagcgt ccatcctggg 27960

gggtcgtggg aggcggcgcg tgcctgaggc agctggcgca cagatcctga gggcctggaa 28020

tctatttgtt ccattgacct gtgacgtcac ttgacttctg agaagcagcc gctccctgcg 28080

ttgggtgttt gtaggaaatg agttcctgga ggcggaggtc gggaagttcc cccgctgcag 28140

ggcacgctca gccccaggaa gcggggtgac ctttgctggg agaggtgcct tgtccctgct 28200

gaccccgagt cacagtcagc gtcgttctgc ttgtgccgtg tttaattcct ggtgtccggt 28260

gcccaggctc agtctcctcc ccaggccgcg gccgctgcgg tcagtcagtc aagcacttct 28320

aggaacttcc tttgaaccgg tgcccttgtt cgctgctgac gccactcgga ggcttcctgg 28380

cggagcgggg aactcgcact tcctcttgtg cgcgtccctg gaatgtcggg acgctggcgc 28440

ttgcttcccg tgcgctcttg gcgggatgag cttgccctga gctgcatgtc actgtttctg 28500

cagaagttta gggttggagt tggctgacct ctctggaggt gtccccagca tctgcctggg 28560

gtctgcctcg tactcccggg acccccagtc ccccagaggg gaccccagct ggcagactgc 28620

gctcacactc agggcagcct cctttgttct gacttctgca cgctgggcct gggtggctgt 28680

gggcggctca cttgcttgat gccagtgggt gagagggtga tgggcagaga ggcaggcggt 28740

caggccccca gtcccgtcct cacaccctgt gtcccctgct cccctccgcc ccacagggaa 28800

ggtgttgagc tactggtgct tcagtcccgg ccacagcatg cgcgagctgg tccgccaggg 28860

cgtccgctcc ctcatcctta ccagcggcac gctggccccg gtgtcctcct ttgccctgga 28920

gatgcagatg tacgggccac ccctgccagg ggcctaagca ctggtgacgc ctgtgacgtt 28980

agtggggtgg gagtgctggg ggtccccatg agccggggtg ctgggggtct tgggcctcac 29040

tgggggtctc gggccttgag ggctaaaggg gtgctggtgt ccttccccac tgtctgtccc 29100

tccggccacg ctcagccctt tcccggtctg cctggagaac ccacacatca tcgacaagca 29160

ccagatctgg gtgggggtcg tccccagagg tcccgacgga gcccagctga gctccgcgtt 29220

tgacagacgg tgagggcctg tccctgggcc gtgctggggt gcgaggtcgg ggagtactga 29280

gccctgaggc cctgagcagt ggcctctcgg ctctgtgcag gttttctgag gagtgcttgt 29340

cctccctggg gaaggctctg ggtaagtgcc cggcacaccc cagctgtgcc catcctggat 29400

cctggaccct gctcccaaga gctggtaggg accccggaag acgccccgcc cctgccctga 29460

ccccagcccc tgcacttcca ggcaacatcg cccgcgtggt gccctacggg ctgctgatct 29520

tcttcccttc ctatcctgtc atggagaaga gcctggagtt ctggcgagta tgtctcccct 29580

gtgtgtcctg ggtggggtgg gtgagggcag ggctggagca cgaagcaggc agtggccaca 29640

gctcctgcct gccctcatcg gatcggcggc gtaaccaggg ctgccgtgtc cctgcctctt 29700

cctcccacag gcccgcgact tggccaggaa gatggaggca ctgaagccgc tgtttgtgga 29760

gcccaggagc aaaggcagct tctccgaggt cagcacttgg ccggggctct gggtctgctg 29820

ccccctcgtg cctcccgtgc ccctcacagc ttccccgagg ctgaccacca gccctgacca 29880

cgggctctgg cggctcccgc ctgcctcttc agggcccctg cgtttccttc ctggccctga 29940

gtgttgcctc ttatcttaca aagcccccag cactgggtgg gtgtggcgac agtggtcctc 30000

ctgcctgagg agctatagcc ggcggccacc ctggccctgg gattccccgt gttttctggg 30060

aagcactgag caggcgcagg atcagcctgg gatccgtgcc aggaagaagt ttccagaacc 30120

cagttggcct tcctggctag gatagtcctt catcttggag gatgagacct gggtctccct 30180

catgggggaa gaaggggccg aggtgggctc caggctgagc ctgaccaact ttccttccag 30240

accatcagtg cttactatgc aagggtcgct gcccctgggt ccaccggcgc caccttcctg 30300

gcggtgtgcc ggggcaaggt gagctctctg gggccctctg tcctgacccg gttgcctgtt 30360

ccccagtggg tgctcatggc tcctcagctg actttgggcc ctgggggctg cctggtcccc 30420

tccttgggcc ccacaagagc aaagcactgg tggcctgctg ggagcgtgcc ccgctctggg 30480

tcgggcaggc aggatgcagg aggttcctgg ccacgagagt tggaggtggc gtctgggagc 30540

tgtggacccc aagtggggtc ctgacccata gatggggctt cctcccaccc ctggttggag 30600

cccccatggc cccaggcagc tccctggtgt gtcccccagg ccagcgaggg gttggacttc 30660

tcagacacga atggccgtgg tgtgatcgtc acgggcctcc cgtacccccc ccgcatggac 30720

ccccgggttg tcctcaagat gcagttcctg gacgagatga agggccaggg tggggctggg 30780

ggccaggtga gttacagcag ggcggggctg gggtaaggca atctggcgac tgagcccccc 30840

tgtgaccacg ggagcccctg tgaccgagcc tcctcgccct ccagttcctc tctgggcagg 30900

agtggtaccg gcagcaggcg tccagggcgg tgaaccaggc catcgggcga gtgatccggc 30960

accgccagga ctacggggct gtcttcctct gtgaccacag gtgcgtgcag tccgggggca 31020

ggcgtggcgc caggggacac ggccacatcc cactgggccc tggactcctt ccccacatga 31080

ggccccgtct cccccagagc ctctctggcg actcggggtc agcctgaggc ccctgcggca 31140

gatgagggtc ttcacttggg tgaactgacc ccctgaagcg gctgtgggca gggcagcagg 31200

gctgtggcca ccccccaggt tcgcctttgc tgatgccaga gcccagctgc cctcctgggt 31260

gcgtcctcac gtcagggtgt acgacaactt cggccacgtc atccgagacg tggcccagtt 31320

cttccgtgtt gccgagcgaa ctgtgagttt ctgcccaggg aggggatgag ggtgttgtcc 31380

ccagaggagc cagaaatggg cccacccacc cccagtggtt ctgcagatgc cagcaccggc 31440

cccccgggct gcagcaccca gtttgcgtga aggagaagat gctgtcaggg aggccaagtc 31500

gcctgacccc ctcctctcca ccaggaaagc taagagtctg gacctgcatg tccccagcct 31560

gaagcagagg tcctcaggtg cagatggcca gtgcgggacg ggcagtgtgg ggcgggcggg 31620

gcaggcggat tggggcgggc cgtgtggggc aagcagcggg gcaggtggtg tggggcgggc 31680

ggcaccaggc gcccagggtg gaggcggctc acctggcttt atgcactgcc cctcccacct 31740

ccaaaggctg tgtctgcctc ctagggtggg gttcccacgg gctggaaccc tcccctacag 31800

gcagagaagg cctcaggcaa agacgcgccc caaggctggg actcccccta atagcaggga 31860

ggacacccac aggcaggggc ccccaaatgc tgggaccctc cctcaggagg ggctccgtca 31920

taggcaggga cccccagctg gggccccgcg gtgggcttca ctgcgcactc gggtactctg 31980

caggatcacc agctgccggg gaccccgaga gtagcctgtg tgtggagtat gagcaggagc 32040

cagttcctgc ccggcagagg cccagggggc tgctggccgc cctggagcac agtgaacagc 32100

gggccgggga ccttggcgag gagcaggtgc agttccaggg ccttgggatg gacacagacc 32160

ctctgtctcc tgaggccaac cccaccccgc ccatctgact tcaggcacct ccccacacac 32220

ccctgtaaat cccctgcctg tggggcgggc aggcaggtga gggatcccag ctgcctggct 32280

gtgtgtgtgc cctccacctc gcctcaccca caggctgctg gctcccaggt ggtgcatgcc 32340

ctggccctca gcgggtgccc ccacatcact ttgattctct ggcaggtcag cttggctcag 32400

ggcactcaag gtcgggtgcc cctgcccctg gctgtgcctg aggctggcct ttctccagga 32460

atgtgctgcg gttgggaccc aggttccttc ctccttgggg ccttttgccc cagaagccca 32520

taatttctca gctttctccc tgcttcctgc tgggggccgt tctcttgctg cctgtccctg 32580

cccttcaggc tcctggagtg agccccgggt gcaggcacca gacacctgtg tccccttcct 32640

gccagcccct cgctgtggtc ggactgtcct tcctggacct gctcttacgt gtcaccacct 32700

gtgagcctca tgagccgctg gcgtgacttg gacaggacca agttgtggga ctgtcaccag 32760

ggtgtgccgc gcccctcccc cgaccttcgt cttggctact gctcagggct ccttggggcc 32820

atcttccctg tgggcccagg tgctttgggg ccctggagtg tgtggttgga accacagctg 32880

tgtcctcctc aggcccacag ctgctccacc ctgtccctcc tggctgagaa gaggccggca 32940

gaggagctgc gaggagggag gaagaagatc cggctggtca gccacctggt gcgtgagctg 33000

tccctgcacc tgtgccgacc accatagaca cgtgtgggaa cccggccctg ggtgccccca 33060

gccaagttgg gatgtgggcc cgatgggacc agggaagtta cccccgggag ctgatgtcca 33120

gggcggctgt gaagctgtcg gcccaagggc tcaagggcag ctgggatcag gccccgccct 33180

tgggcaggct tggtttgggg gctgcagcac tgggtttggc cctggcattt ccctcaagtg 33240

tggacgtgca cctgcctcat tcgaggggcg cagcccattc ccagccttgg atgaaagaac 33300

cgagttatag tcggagccag gaagccccct gcctgctgga aagccccaag tgtggcagcc 33360

tttgtccatg tcccttggct tctgggaaga actgggtggt gcccaggcag ggctggtgcc 33420

atcaggaagt gggcggctgc cgaggggcct gggctgttga gggcctgggt ggggagtgcc 33480

ggggctgccc ctgccttggt ttccacgttt ccgtgttggt ctggggtgtg tggagagatg 33540

agcaccgctt cttgggaagc ccctccctat gatctgccat cctggagcct cagctgtgtc 33600

cgctgtgggg tgggggcttt agggaggagg agagaggacc cccagcttga gggagagcca 33660

gtctaccctt tgcccattcg ctgccctcgg ttccctgcca gcctctcact gtgtgaccca 33720

gacaggccca gccccgcagc tttcctcccg cagcacctcc gtgtccatcc agccaaccag 33780

tttctcaggc agcagccccc gctcagcaat cactgtcccg gggaacaccc aatgctccaa 33840

ggaaggctct gcagctccag ggacgggatg atgaggctgg ccctgatgga gcctcgggcc 33900

tgtgtgctgc aggaggagcc cgtggctggc gcacagatgg acagggccaa gctcttcatg 33960

gtggctgtga agcaggaact gagccaagcc aactttgcca ccttcaccca ggccctgcag 34020

gactacaagg gttccgatga cttcgccgcc ctggccgcct gtctcggccc cctctttgct 34080

gaggacccca agaagcacag cctgctccaa ggtgccctgg cttgcagggg ccgcccatcc 34140

tgagggcagt gctgccgctg tgtggggtgg gggccatctg ggtccaaggt tgtctctgtt 34200

ctctagagaa aagggggcgg atggggacag acaccccttc ctctacaggc ttctaccagt 34260

ttgtgcggcc tcaccacaag gagcagtttg aggaggtctg tatccagctg acgggacggg 34320

gctgcggcta ccggccagag cacagcgttc cccgaaggca gcgggcacag ccagccctgg 34380

accccactgg taaatggggc ctcgggtggg accctcagac tcctccgtgg aaggcaccgg 34440

agtcctgggc tggttggggt gggcatccct ggggccctgc gtggccccgc ctctctgttc 34500

ccgtgtggga gtgatggggg ccacccccca ccaccagcag cagtatcact tgttggggag 34560

accctgtgca actccacgca gggccctgcc cttcccatag cccctgaccc ctacgcacag 34620

ccctgtccag ctgccgcacg tgtcccctgc cccccatgca cagccctggg gagtccactg 34680

cacacgccag ggtcctagac ccctagaccc ctagatccct gtcctcccgt cctccctact 34740

tctgcctttg cctagggtgg agtccaagcc tccagaggtg ggagtgtctg tgttcgtgct 34800

tgttaacgaa cagcccccat agagctcctc cagtgtaggg ttcacccagc ggggaaccta 34860

acctgttggg aagaccccag accccttctg ggcttggtac ccaccctggg gctctaagct 34920

cctgagcagg gctttggcct gcctgccact gttccagccc ccatccagca gttggtgtct 34980

cctctgctgc cccggcacct gggcacgtgt gcctgcctgg gttttcccgc cctggtccga 35040

ggtgggtgag gcctggcctc cccagccagc ccttccccct ccccggggga actttccagg 35100

tgcttgggac cagctttgtg gctctccatc tcttcatcag gaaggacagc gctagatccc 35160

aagctgactg tgtccaaggc tgcagcccag cagctggacc cccgagagca cctgaaccag 35220

ggcaggcccc acctgtcgcc cagaccaccc cccacaggta gctgagtcct gaactgtgtg 35280

cagcctgtga cttggtgggt tcctcagtgg cttgatgagg ctaacacttg agtgtggctt 35340

gagcctttga accggaggtg ccagtggagc tgcccctgtg gggagcatct cctggtgggg 35400

gctcccggtt ctgtaccccg cagttgtcct gagcagctct ccaggagttc gtgggaggaa 35460

gggcaggcag ggtggtggga ctctcagtcc tctgccccag cgccactctg agccatgcta 35520

ctcccacacc aggaggccct ggcagccacc cacagcaggg gtccagagcg cccagagcag 35580

ggaagcaggg ccagcgcgcc gtgagcgcct acctggcaga tgtccgcagg gccctggggt 35640

ctgcaggctg tagccagctc ttggcagcac tgacagccta caagcaagac gatgacctcg 35700

acaaggtgct ggccgtgctg gccgccctga ccactgcaaa gccggaggac ttccccctgc 35760

tgcagagcaa gtggcctggg cgtgggggac agccagtggg gtgggnnnnn nnnnnnnnnn 35820

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 35880

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 35940

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 36000

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 36060

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 36120

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 36180

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 36240

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 36300

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnggg 36360

ggcaggggca gggtggggac cgtgccgggt ctgagtgaag ctccccgcag ggttcagcat 36420

gtttgtgcgt ccacaccaca agcagcgctt ctcacagacg tgcacagacc tgaccggcag 36480

accctccctg ggcacggagc caccaggacc ccaggaggag agtcttgccg tgcctcctgt 36540

gctcacccac agggctcccc aaccaggtag ggcgcctgcc tggctgctcc tgacagtgcc 36600

ccaaccgcac gcagccctgg gagtgagcag caaagcccca ggccctgctc agactcagtc 36660

tccgtctcca ggcccctcac ggtccgagaa gcccggaaag acccagagcg agatctcgac 36720

cttccttaga cagaggccag cagggactgt gggggcgggc ggtgaggctg cagggcccag 36780

ccagtcccca ggacctcccc acgggcctgc agcatctgag tggggtgagc ctcctgggag 36840

agaccttgct gggcagcagg ctgcgggagc tccgagcggg cccctctcag caggctgtgt 36900

gtgccagggc tgtggggcgg aggatgtggt gcccttccag tgccctgcct gtgatttcca 36960

gcgctgccaa gcctgttggc aacggcacct tcaggttggt gcctggtcac tacagttcct 37020

gctgggtgta gccccaggtg gtgggctgag ggggaaaggg ccgggtatag ccccaggtgg 37080

tgggctggtg gcaacgcctg gcaggtgcgt ccagcgggcc ggttgtctta caggcctcta 37140

ggacgtgccc atcctgccac accgcctcca ggaagcagag cgtcacgcag gtcttctggc 37200

cagagcccca gtga 37214

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 寡核苷酸化合物 3_1

<400> 3

aattttacat actctggt 18

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 寡核苷酸化合物 4_1

<400> 4

aattttacat actctggtc 19

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 寡核苷酸化合物 5_1

<400> 5

ttacatactc tggtcaaa 18

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 寡核苷酸化合物 6_1

<400> 6

ctttattata acttgaatct c 21

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 智人

<400> 7

tttgaccaga gtatgtaaaa tt 22

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 智人

<400> 8

accagagtat gtaaaatt 18

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 智人

<400> 9

gaccagagta tgtaaaatt 19

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 智人

<400> 10

tttgaccaga gtatgtaa 18

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人

<400> 11

gagattcaag ttataataaa g 21

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 12

ggagtgtgga ttcgcactcc t 21

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 13

agattgagat cttctgcgac 20

<210> 14

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 探针

<400> 14

aggcaggtcc cctagaagaa gaactcc 27

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 15

ccatcctgga cattgaggac t 21

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 16

caggttccgg gacaggtagt a 21

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 17

cgtctgtgcc ttctcatctg c 21

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 18

gcacagcttg gaggcttgaa 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 19

ccgtctgaac tatcctgccc 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 20

gccgtagtcg gtgtactcgt 20

<210> 21

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 21

gaattttaca tactctggt 19

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 22

gaattttaca tactctggtc 20

<210> 23

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 23

caaaaaacag taggtcc 17

<210> 24

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 24

gagggaggtg gagcgtt 17

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 25

agctttatta taacttgaat 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 26

ttttacatac tctggtcaaa 20

<210> 27

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 27

ttttacatac tctggtca 18

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 28

gagaatttta catactctgg 20

<210> 29

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 29

gcatccaaca agtaattgt 19

<210> 30

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 30

ggtgggtgga tgtttc 16

<210> 31

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 31

ggtggtgtgg agaagc 16

<210> 32

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 32

ggcatccaac aagtaatt 18

<210> 33

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 33

ggaataaaac agtaggtc 18

<210> 34

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 34

gccattttca ctgtcaa 17

<210> 35

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 35

gtgcagaagt cagaacaaa 19

<210> 36

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 36

caaaatgccc ttacagtga 19

<210> 37

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 37

ggaataaaac agtaggt 17

<210> 38

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 38

aattttacat actctgg 17

<210> 39

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 39

aattttacat actctg 16

<210> 40

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 40

ttacatactc tggtcaa 17

<210> 41

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 41

ttacatactc tggtca 16

<210> 42

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 42

ttacatactc tggtc 15

<210> 43

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 43

ttacatactc tggt 14

<210> 44

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 44

ttacatactc tgg 13

<210> 45

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 45

ttacatactc tg 12

<210> 46

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 46

gaattttaca tactctgg 18

<210> 47

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 47

gaattttaca tactctg 17

<210> 48

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 48

gaattttaca tactct 16

<210> 49

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 49

gaattttaca tactc 15

<210> 50

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 50

gaattttaca tact 14

<210> 51

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 51

gaattttaca tac 13

<210> 52

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 52

gaattttaca tactctggt 19

<210> 53

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 53

gaattttaca tactctgg 18

<210> 54

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 54

gaattttaca tactctg 17

<210> 55

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 55

gaattttaca tactct 16

<210> 56

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 56

gaattttaca tactc 15

<210> 57

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 57

gaattttaca tact 14

<210> 58

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 58

caaaaaacag taggtc 16

<210> 59

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 59

caaaaaacag taggt 15

<210> 60

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 60

caaaaaacag tagg 14

<210> 61

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 61

caaaaaacag tag 13

<210> 62

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 62

caaaaaacag ta 12

<210> 63

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 63

caaaaaacag t 11

<210> 64

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 64

gagggaggtg gagcgt 16

<210> 65

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 65

gagggaggtg gagcg 15

<210> 66

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 66

gagggaggtg gagc 14

<210> 67

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 67

gagggaggtg gag 13

<210> 68

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 68

gagggaggtg gag 13

<210> 69

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 69

gagggaggtg g 11

<210> 70

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 70

gtttttcacc tctgcctaat catc 24

<210> 71

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 71

gcaaaaagtt gcatggtgct ggt 23

Claims

1.一种选自由以下项组成的反义寡核苷酸的组的反义寡核苷酸：

TTacatactctggtCAAA(SEQ ID NO:5)，

AATTttacatactctgGT(SEQ ID NO:3)，

AAttttacatactctGGTC(SEQ ID NO:4)，和

CTttattataactTgaAtCTC(SEQ ID NO:6)，

其中大写字母为β-D-氧基LNA核苷，小写字母为DNA核苷，所有LNA C均为5-甲基胞嘧啶，并且所有核苷间键均为硫代磷酸酯核苷间键。

2.一种缀合物，其包含根据权利要求1所述的反义寡核苷酸，以及共价连接至所述反义寡核苷酸的至少一个缀合物部分。

3.根据权利要求2所述的缀合物，其中所述至少一个缀合物部分能够与脱唾液酸糖蛋白受体结合。

4.根据权利要求2和3所述的缀合物，其中所述缀合物部分选自图5中的三价GalNAc部分中的一者。

5.根据权利要求4所述的缀合物，其中所述缀合物部分为图5D中的三价GalNAc部分，诸如图5D-1或图5D-2的三价GalNAc部分或者两者的混合物。

6.根据权利要求2至5中任一项所述的缀合物，其包含位于所述反义寡核苷酸与所述缀合物部分之间的接头。

7.根据权利要求6所述的缀合物，其中所述接头包含2个至5个连续的磷酸二酯连接的核苷或由其组成。

8.一种缀合物，其选自由图1、图2、图3和图4中所示的缀合物组成的组。

9.一种根据权利要求1所述的反义寡核苷酸、或根据权利要求2至8中任一项所述的缀合物的药用盐。

10.一种药物组合物，其包含根据权利要求1所述的反义寡核苷酸、根据权利要求2至8中任一项所述的缀合物或根据权利要求9所述的药用盐，以及药用稀释剂、溶剂、载体、盐和/或佐剂。

11.一种用于在表达RTEL1的靶细胞中调节RTEL1表达的体内或体外方法，所述方法包括向所述细胞施用有效量的根据权利要求1所述的反义寡核苷酸、根据权利要求2至8中任一项所述的缀合物、根据权利要求9所述的药用盐或根据权利要求10所述的药物组合物。

12.一种用于治疗或预防疾病的方法，其包括向患有或易患所述疾病的受试者施用治疗或预防有效量的根据权利要求1所述的反义寡核苷酸、根据权利要求2至8中任一项所述的缀合物、根据权利要求9所述的药用盐或根据权利要求10所述的药物组合物，其中所述疾病为乙型肝炎病毒(HBV)感染，诸如慢性HBV感染。

13.根据权利要求1所述的反义寡核苷酸、根据权利要求2至8中任一项所述的缀合物、根据权利要求9所述的药用盐或根据权利要求10所述的药物组合物，其用于医药中。

14.根据权利要求1所述的反义寡核苷酸、根据权利要求2至8中任一项所述的缀合物、根据权利要求9所述的药用盐或根据权利要求10所述的药物组合物，其用于乙型肝炎病毒(HBV)感染，诸如慢性HBV感染的治疗或预防。

15.根据权利要求1所述的反义寡核苷酸、根据权利要求2至8中任一项所述的缀合物、根据权利要求9所述的药用盐或根据权利要求10所述的药物组合物用于制备药物的用途，所述药物用于乙型肝炎病毒(HBV)感染，诸如慢性HBV感染的治疗或预防。