KR20200104339A - Htra1 rna 길항제에 대한 동반 진단제 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 안구 질환, 예컨대 황반 변성의 치료에서 HTRA1 mRNA 길항제의 용도, 및 HTRA1 mRNA 길항제에 대한 개체의 치료의 적합성에 대한 진단용 바이오마커로서 안방수 및 유리액의 HTRA1 수준의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 안구 질환, 예컨대 황반 변성의 치료에서 HTRA1 mRNA 길항제의 용도, 및 HTRA1 mRNA 길항제에 대한 개체의 치료의 적합성에 대한 진단용 바이오마커로서 안방수 및 유리액의 HTRA1 수준의 용도에 관한 것이다.
세린 프로테아제의 인간 고온 리콰이어먼트 A(high temperature requirement A; HTRA) 패밀리는, 프로테아제 및 샤페론(chaperone)의 이중 기능을 조합함으로써 세포외 구획에서 단백질 항상성을 유지하는 데 관련되는 보편적으로 발현된 PDZ-프로테아제이다. HTRA 프로테아제는 세포외 기질의 구성, 세포 증식 및 노화에 관련된다. HTRA 활성의 조절은 뒤시엔느 근육퇴행위축(문헌[Bakay et al. 2002, Neuromuscul. Disord. 12: 125-141]), 관절염, 예컨대 골관절염(문헌[Grau et al. 2006, JBC 281: 6124-6129]), 암, 가족성 허혈성 뇌 소형-혈관 질병 및 연령-관련 황반 변성, 뿐만 아니라 파킨슨병 및 알츠하이머병을 포함하는 여러 질병과 관련된다. 인간 HTRA1은 인슐린-유사 성장 인자(IGF) 결합 도메인을 함유한다. 이는 IGF 이용률 및 세포 성장을 조절하고(문헌[Zumbrunn and Trueb, 1996, FEES Letters 398:189-192]) 종양 억제 특성을 나타내는 것으로 제시되었다. HTRA1 발현은 전이성 흑색종에서 하향-조절되고, 이에 따라 흑색종 진행의 정도를 나타낼 수 있다. 전이성 흑색종 세포주에서 HTRA1의 과발현은 시험관내 증식 및 침입을 감소시키고 이종이식 마우스 모델에서 종양 성장을 감소시켰다(문헌[Baldi et al., 2002, Oncogene 21:6684-6688]). 또한, HTRA1 발현은 난소암에서 하향-조절된다. 난소암 세포주에서, HTRA1 과발현은 세포사를 유도하는 반면에, 안티센스 HTRA1 발현은 앵커리지(anchorage)-독립적 성장을 촉진한다(문헌[Chien et al., 2004, Oncogene 23:1636-1644]).
IGF 경로에 대한 이의 효과에 더하여, HTRA1은 또한 성장 인자의 TGFβ 패밀리에 의한 신호전달을 억제한다(문헌[Oka et al., 2004, Development 131:1041-1053]). HTRA1은 아밀로이드 전구체 단백질(APP)을 절단할 수 있고, HTRA1 억제제는 배양된 세포에서 Aβ 펩티드의 축적을 야기한다. 따라서, HTRA1은 또한 알츠하이머병과 관련된다(문헌[Grau et al.,2005, Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 102:6021-6026]).
또한, HTRA1 상향-조절이 관찰되었고, 뒤시엔느 근육퇴행위축(문헌[Bakay et al. 2002, Neuromuscul. Disord. 12: 125-141]), 골관절염(문헌[Grau et al. 2006, JBC 281: 6124-6129]) 및 AMD(문헌[Fritsche, et al. Nat Gen 2013 45(4):433-9])에 연관된 것으로 보인다.
HTRA1 프로모터 영역의 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)(rs11200638)은 연령-관련 황반 변성(AMD) 발생의 10배 증가된 위험성과 연관된다. 또한, HTRA1 SNP는 연령-관련 황반 변성(AMD) 발생의 증가된 위험과 연관된 ARMS2 SNP(rs10490924)와의 연쇄 불균형에 있다. 위험성 대립형질은 2 내지 3배 증가된 HTRA1 mRNA 및 단백질 발현에 연관되고, HTRA1은 AMD 환자의 드루젠에 존재한다(문헌[Dewan et al., 2006, Science 314:989-992]; [Yang et al., 2006, Science 314:992-993]). HtrA1의 과발현이 마우스에서 AMD-유사 표현형을 유도한다. hHTRA 유전자 도입된 마우스(문헌[Veierkottn, PlosOne 2011])는 브루크막의 탄력판의 저하를 나타내고 맥락막 혈관 이상(문헌[Jones, PNAS 2011])을 확정하고 폴립모양 맥락막 혈관병(PCV) 병소(문헌[Kumar, IOVS 2014])를 증가시킨다. 추가적으로, 담배 연기에 노출시 결정된 hHTRA1 Tg 마우스에서 브루크막 손상이 CNV를 3배 증가시키는 것으로 보고되었다(문헌[Nakayama, IOVS 2014]).
연령-관련 황반 변성(AMD)은 65세 이상의 인간에서 비가역적인 시력 손실의 선두적인 원인이다. AMD의 발병과 함께, 눈의 뒤쪽의 감광성 광수용기 세포, 이를 대사적으로 지지하는 아래에 있는 색소 상피 세포, 및 이것이 제공하는 날카로운 중심시가 점전적으로 손실된다. 연령은 AMD 발병의 주요 위험 인자이다: AMD 발생의 가능성은 55세 이후 3배가 된다. 흡연, 옅은 홍채색, 성별(여성이 보다 큰 위험에 있다), 비만 및 자외선 방사에 반복적인 노출이 또한 AMD의 위험을 증가시킨다. AMD 진행은 3개의 단계로 정의될 수 있다: 1) 초기, 2) 중기 및 3) 후기 AMD. 후기 AMD의 2개의 형태가 존재한다: 건성 AMD(지도모양위축(GA)으로도 지칭됨) 및 습성 AMD(삼출성 AMD으로도 공지됨). 건성 AMD은 시력 손실을 야기하는 광수용기 및 망막 색소 상피 세포의 손실을 특징으로 한다. 습성 AMD는 병리학적 맥락막(망막하로도 지칭됨) 혈관신생과 관련된다. 비정상적인 혈관 형성으로부터의 누출은 이러한 처리에서 황반을 손상시키고 시력을 악화시켜, 궁극적으로 맹증을 야기한다. 일부 경우에, 환자는 후기 AMD의 모든 유형과 관련된 병리학을 제시할 수 있다. 습성 AMD에 대한 치료 전략은 안 내로의 빈번한 주사를 필요로 하며, 주로 질병 진행의 지연에 초점을 맞춘다. 현재, 건성 AMD에 대해 이용가능한 승인된 치료제는 없다.
WO 2017/075212는 항-HtrA1 항체; 및 환자의 선택을 위한 바이오마커로서 항-Htra1 항체의 사용을 포함하는 이의 사용 방법에 관한 것이다.
문헌[Tosi et al., IOVS 20017, p162 - 167]은 혈관신생 연령-관련 황반 변성 환자의 안방수의 상승된 HTRA1 농도를 보고하고, 안방수의 HTRA1의 수준이 라니비주맙(ranibizumab), 및 VEGF-A를 표적화하는 항체에 의한 치료 후에 정상화된다는 것을 보고한다.
WO 2008/013893은 HTRA1 유전자 또는 mRNA에 혼성화시키는 안티센스 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는, 연령-관련 황반 변성을 앓는 개체의 치료용 조성물을 주장한다: 안티센스 분자는 개시되지 않는다. WO 2009/006460은 HTRA1을 표적화하는 siRNA, 및 AMD의 치료에서 이의 용도를 제공한다.
그 전문이 참고로 포함되는 PCT/EP2017/065937 및 EP17173964.2는 HTRA1 mRNA의 강한 생체내 억제제인 안티센스 올리고뉴클레오티드, 및 황반 변성 치료의 용도를 포함하는 이의 치료 용도를 개시한다.
본 발명자는, HTRA1 mRNA 길항제에 의해 치료 받는 개체의 망막 상피 세포의 HTRA1 mRNA의 억제와 상기 개체의 안방수 및 유리액의 HTRA1 단백질의 수준 사이에 직접적인 상관관계가 있음을 밝혔다. 상기 직접적인 상관관계는 HTRA1 mRNA 길항제에 의한 치료에 대한 개체의 적합성을 결정하는 진단용 또는 예후용 바이오마커로서 HTRA1의 사용, 및 예를 들어, 환자 모니터링에서 HTRA1 mRNA 길항성 치료제와의 동반 진단제로서의 사용을 가능하게 한다.
본 발명은 HTRA1 mRNA 길항제 투여에 대한 개체의 치료의 적합성을 결정하는 방법을 제공하되, 상기 방법은
i) 상기 개체로부터 수득한 안방수 또는 유리액의 샘플의 HTRA1의 수준을 결정하는 단계; 및
ii) 상기 단계 i)에서 수득한 HTRA1의 수준을 하나 이상의 기준 샘플 또는 기준 값과 비교하여 상기 개체가 HTRA1 mRNA 길항제에 의한 치료에 적합할 가능성이 있거나 적합한지를 결정하는 단계
를 포함하고,
상기 개체는 안구 질환, 예컨대 황반 변성을 앓거나 이의 발병 위험이 있다.
본 발명은 HTRA1 mRNA 길항제 투여에 대한 개체의 치료의 적합성을 결정하는 진단 또는 예후 방법을 제공하되, 상기 방법은
i) 상기 개체로부터 수득한 안방수 또는 유리액의 샘플의 HTRA1의 수준을 결정하는 단계; 및
ii) 상기 단계 i)에서 수득한 HTRA1의 수준을 하나 이상의 기준 샘플 또는 기준 값과 비교하여 상기 개체가 HTRA1 mRNA 길항제에 의한 치료에 적합할 가능성이 있거나 적합한지를 결정하는 단계
를 포함하고,
상기 개체는 안구 질환, 예컨대 황반 변성을 앓거나 이의 발병 위험이 있다.
본 발명은 HTRA1 mRNA 길항제에 의한 치료가 필요한 개체에 대한 HTRA1 mRNA 길항제의 적합한 투여량 양생법을 결정하는 방법을 제공하되, 상기 방법은
i) 상기 개체로부터 수득한 안방수 또는 유리액의 샘플의 HTRA1의 수준을 결정하는 단계; 및
ii) 상기 단계 i)에서 수득한 HTRA1의 수준을 하나 이상의 기준 샘플 또는 기준 값과 비교하여 상기 개체가 HTRA1 mRNA 길항제에 의한 치료에 적합할 가능성이 있거나 적합한지를 결정하는 단계
를 포함하고,
상기 개체는 안구 질환, 예컨대 황반 변성을 앓거나 이의 발병 위험이 있다.
유리하게는, 본 발명의 방법 또는 용도에서 언급된 개체로부터 수득한 샘플은 개체의 안방수 샘플이다.
본 발명은 HTRA1 mRNA 길항제에 의한 치료가 필요한 개체, 예를 들어, 황반 변성을 앓거나 이의 발병 위험이 있는 개체의 치료 방법을 제공하되, 상기 방법은
i) 상기 개체로부터 수득한 안방수 또는 유리액의 샘플의 HTRA1의 수준을 결정하는 단계;
ii) 상기 단계 i)에서 수득한 HTRA1의 수준을 하나 이상의 기준 샘플 또는 기준 값과 비교하는 단계;
iii) 상기 개체가 HTRA1 mRNA 길항제에 의한 치료에 적합할 가능성이 있거나 적합한지를 결정하는 단계; 및
iv) 효과량의 HTRA1 mRNA 길항제를 상기 개체에게 투여하는 단계
를 포함한다.
본 발명은 HTRA1 mRNA 길항성 치료제에 대한 동반 진단제로서 HTRA1 항체의 용도를 제공한다.
본 발명은 HTRA1 mRNA 길항제에 의한 치료를 받고 있거나, HTRA1 mRNA 길항제에 의한 치료의 적합성에 대해 평가되고 있는 개체로부터 수득한 안방수 또는 유리액 샘플의 HTRA1 수준의 검출에서 HTRA1 항체의 용도를 제공한다.
본 발명은 HTRA1 mRNA 길항제를 포함하는 치료제에 대한 개체의 가능한 반응을 결정하기 위한 바이오마커의 용도를 제공하되, 상기 바이오마커는, 건강한 개체의 기준 샘플로부터 수득한 HTRA1의 수준과 비교하여, 상기 개체의 안방수 또는 유리액으로부터 수득한 생물학적 샘플에서 상승된 수준의 HTRA1을 포함한다.
도 1: HTRA1의 예시적 LNA 안티센스 올리고뉴클레오티드 길항제(서열번호 13, 화합물 번호 13,1).
도 2: HTRA1의 예시적 LNA 안티센스 올리고뉴클레오티드 길항제(서열번호 15, 화합물 번호 15,3).
도 3: HTRA1의 예시적 LNA 안티센스 올리고뉴클레오티드 길항제(서열번호 17, 화합물 번호 17).
도 4: HTRA1의 예시적 LNA 안티센스 올리고뉴클레오티드 길항제(서열번호 18, 화합물 번호 18).
도 5: HTRA1의 예시적 LNA 안티센스 올리고뉴클레오티드 길항제(서열번호 19, 화합물 번호 19).
도 6: 도 2에 나타낸 화합물(화합물 번호 15,3)을 사용한 비-인간 영장류(NHP) PK/PD 연구 - 실시예 1 참조, IVT 투여, 25 μg/눈. 6a) qPCR에 의해 망막에서 측정한 HTRA1 mRNA 수준. 6b) ISH에 의해 도시된 HTRA1 mRNA 수준. 6c 및 6d) IP-MS에 의한 망막 및 유리체 각각의 HTRA1 단백질 수준의 정량화. 도트는 별개의 동물에 대한 데이터를 나타낸다. 오차 막대는 기술 복제물에 대한 표준 편차를 나타낸다(n=3).
도 7: 도 3(화합물 번호 73,1), 4(화합물 번호 86) 및 5(화합물 번호 67)에 나타낸 화합물을 사용한 NHP PK/PD 연구(실시에 2): IVT 투여, 25 μg/눈. 7a) qPCR에 의해 망막에서 측정한 HTRA1 mRNA 수준. 7b) 올리고 ELISA에 의해 측정한 망막의 올리고 함량. 7c) ISH에 의해 도시된 HTRA1 mRNA 수준. 7d 및 7e) IP-MS에 의한 망막 및 유리체 각각의 HTRA1 단백질 수준의 정량화. 도트는 별개의 동물에 대한 데이터를 나타낸다. 오차 막대는 기술 복제물에 대한 표준 오차를 나타낸다(n=3). 7f 및 7g) 웨스턴 블롯(western blot)에 의해 도시된 망막 및 유리체 각각의 HTRA1 단백질 수준의 감소.
도 8: HTRA1 단백질 정량화 - 면역 포착 및 LC-MS 접근법. 8a) 접근법의 도식. 8b) HTRA1 mRNA를 표적화하는 LNA 안티센스 화합물의 투여 후에, 망막, 유리체 및 안방수의 HTRA 단백질 수준의 LC-MS에 의한 정량화. 8c) 망막, 유리체 및 안방수의 HTRA1 단백질 감소. 8d) 단일 IVT 25 μg 투여량 2일, 7일, 14일 및 21일 후에 채취한 연속 안방수 샘플의 PD 분석.
도 9a: 화합물 번호 15,3 및 17을 시노몰구스 원숭이의 유리체내로 투여하였고, 안방수 샘플을 주사 3일, 8일, 15일 및 22일 후에 수집하였다. 희석하지 않은 샘플의 단백질을 페기 수(Peggy Sue) 장치(프로틴 심플(Protein Simple))를 사용하는 모세관 전기영동에 의해 분석하였다. HTRA1을 주문 생산한 다클론성 토끼 항혈청을 사용하여 검출하였다. 동물 번호 J60154(비히클), J60158(화합물 번호 15,3) 및 J60162(화합물 번호 17)의 데이터를 나타냈다.
도 9b: 신호 강도를 정제된 재조합(S328A 돌연변이체) HTRA1 단백질(오리진(Origene), #TP700208)과 비교하여 정량화하였다. 검량 곡선이 본 도면에 도시되어 있다.
도 9c 내지 9e: 상부 패널: 별개의 동물의 계산한 HTRA1 안방수 농도를 주사 후 시간에 대해 플롯팅하였다. 하부 패널: 각각의 시점에서 비히클 군의 평균 HTRA1 농도를 결정하고 처리된 동물의 상응하는 상대적 농도를 계산하였다. 빈 원: 별개의 값, 채워진 원: 군 평균. 제22일의 HTRA1 감소율(%)을 나타냈다.
도 10: HTRA1 전사체를 표적화하는 다양한 LNA 분자로 처리된 시노몰구스 원숭이의 안방수(청색 다이아몬드) 또는 망막(적색 정사각형)의 HTRA1 단백질 수준에 대해 플롯팅된 HTRA1 mRNA. 값을 PBS 대조군에 대해 정규화된 백분율로서 표현한다.
도 11: HTRA1 전사체를 표적화하는 다양한 LNA 분자로 처리된 시노몰구스 원숭이에서, 안방수의 HTRA1 단백질과 (A) 망막의 HTRA1 단백질 및 (B) 망막의 HTRA1 mRNA의 상관관계. 값을 PBS 대조군에 대해 정규화된 백분율로서 표현한다.
도 12a: IVT LNA 적용 36일 후에 평균 HTRA1 단백질 수준. HTRA1 억제율(%)을 청색으로 나타냈다. 오차 막대: 군 sd.
도 12b: 대조군(○) 및 LNA 처리된(●) 동물에서, 후안부 조직 대 안방수(AH)의 HTRA1 농도.
도 13: 안방수의 HTRA1 농도의 동력학. 채워진 기호: 활성제 처리, 빈 기호: 비히클 처리. 별개의 정규화된 값.
도 14: LNA 처리되거나 처리되지 않은 상이한 구획에서 HTRA1 mRNA 발현 수준. HTRA1 mRNA 수준을 RPKM(reads per kilobase per million sequencing reads)으로 나타냈다. 오차 막대는 3마리 이상의 동물의 평균 RPKM 주위의 표준 편차를 나타낸다. 별표는 통계적 유의도(거짓 발견 비<0.05)를 나타낸다. 막대 위의 수는 HTRA1 mRNA 수준의 감소율을 나타낸다.
도 2: HTRA1의 예시적 LNA 안티센스 올리고뉴클레오티드 길항제(서열번호 15, 화합물 번호 15,3).
도 3: HTRA1의 예시적 LNA 안티센스 올리고뉴클레오티드 길항제(서열번호 17, 화합물 번호 17).
도 4: HTRA1의 예시적 LNA 안티센스 올리고뉴클레오티드 길항제(서열번호 18, 화합물 번호 18).
도 5: HTRA1의 예시적 LNA 안티센스 올리고뉴클레오티드 길항제(서열번호 19, 화합물 번호 19).
도 6: 도 2에 나타낸 화합물(화합물 번호 15,3)을 사용한 비-인간 영장류(NHP) PK/PD 연구 - 실시예 1 참조, IVT 투여, 25 μg/눈. 6a) qPCR에 의해 망막에서 측정한 HTRA1 mRNA 수준. 6b) ISH에 의해 도시된 HTRA1 mRNA 수준. 6c 및 6d) IP-MS에 의한 망막 및 유리체 각각의 HTRA1 단백질 수준의 정량화. 도트는 별개의 동물에 대한 데이터를 나타낸다. 오차 막대는 기술 복제물에 대한 표준 편차를 나타낸다(n=3).
도 7: 도 3(화합물 번호 73,1), 4(화합물 번호 86) 및 5(화합물 번호 67)에 나타낸 화합물을 사용한 NHP PK/PD 연구(실시에 2): IVT 투여, 25 μg/눈. 7a) qPCR에 의해 망막에서 측정한 HTRA1 mRNA 수준. 7b) 올리고 ELISA에 의해 측정한 망막의 올리고 함량. 7c) ISH에 의해 도시된 HTRA1 mRNA 수준. 7d 및 7e) IP-MS에 의한 망막 및 유리체 각각의 HTRA1 단백질 수준의 정량화. 도트는 별개의 동물에 대한 데이터를 나타낸다. 오차 막대는 기술 복제물에 대한 표준 오차를 나타낸다(n=3). 7f 및 7g) 웨스턴 블롯(western blot)에 의해 도시된 망막 및 유리체 각각의 HTRA1 단백질 수준의 감소.
도 8: HTRA1 단백질 정량화 - 면역 포착 및 LC-MS 접근법. 8a) 접근법의 도식. 8b) HTRA1 mRNA를 표적화하는 LNA 안티센스 화합물의 투여 후에, 망막, 유리체 및 안방수의 HTRA 단백질 수준의 LC-MS에 의한 정량화. 8c) 망막, 유리체 및 안방수의 HTRA1 단백질 감소. 8d) 단일 IVT 25 μg 투여량 2일, 7일, 14일 및 21일 후에 채취한 연속 안방수 샘플의 PD 분석.
도 9a: 화합물 번호 15,3 및 17을 시노몰구스 원숭이의 유리체내로 투여하였고, 안방수 샘플을 주사 3일, 8일, 15일 및 22일 후에 수집하였다. 희석하지 않은 샘플의 단백질을 페기 수(Peggy Sue) 장치(프로틴 심플(Protein Simple))를 사용하는 모세관 전기영동에 의해 분석하였다. HTRA1을 주문 생산한 다클론성 토끼 항혈청을 사용하여 검출하였다. 동물 번호 J60154(비히클), J60158(화합물 번호 15,3) 및 J60162(화합물 번호 17)의 데이터를 나타냈다.
도 9b: 신호 강도를 정제된 재조합(S328A 돌연변이체) HTRA1 단백질(오리진(Origene), #TP700208)과 비교하여 정량화하였다. 검량 곡선이 본 도면에 도시되어 있다.
도 9c 내지 9e: 상부 패널: 별개의 동물의 계산한 HTRA1 안방수 농도를 주사 후 시간에 대해 플롯팅하였다. 하부 패널: 각각의 시점에서 비히클 군의 평균 HTRA1 농도를 결정하고 처리된 동물의 상응하는 상대적 농도를 계산하였다. 빈 원: 별개의 값, 채워진 원: 군 평균. 제22일의 HTRA1 감소율(%)을 나타냈다.
도 10: HTRA1 전사체를 표적화하는 다양한 LNA 분자로 처리된 시노몰구스 원숭이의 안방수(청색 다이아몬드) 또는 망막(적색 정사각형)의 HTRA1 단백질 수준에 대해 플롯팅된 HTRA1 mRNA. 값을 PBS 대조군에 대해 정규화된 백분율로서 표현한다.
도 11: HTRA1 전사체를 표적화하는 다양한 LNA 분자로 처리된 시노몰구스 원숭이에서, 안방수의 HTRA1 단백질과 (A) 망막의 HTRA1 단백질 및 (B) 망막의 HTRA1 mRNA의 상관관계. 값을 PBS 대조군에 대해 정규화된 백분율로서 표현한다.
도 12a: IVT LNA 적용 36일 후에 평균 HTRA1 단백질 수준. HTRA1 억제율(%)을 청색으로 나타냈다. 오차 막대: 군 sd.
도 12b: 대조군(○) 및 LNA 처리된(●) 동물에서, 후안부 조직 대 안방수(AH)의 HTRA1 농도.
도 13: 안방수의 HTRA1 농도의 동력학. 채워진 기호: 활성제 처리, 빈 기호: 비히클 처리. 별개의 정규화된 값.
도 14: LNA 처리되거나 처리되지 않은 상이한 구획에서 HTRA1 mRNA 발현 수준. HTRA1 mRNA 수준을 RPKM(reads per kilobase per million sequencing reads)으로 나타냈다. 오차 막대는 3마리 이상의 동물의 평균 RPKM 주위의 표준 편차를 나타낸다. 별표는 통계적 유의도(거짓 발견 비<0.05)를 나타낸다. 막대 위의 수는 HTRA1 mRNA 수준의 감소율을 나타낸다.
본원에서, 용어 "알킬"은, 단독으로 또는 조합으로, 1 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킬 기, 특히 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킬 기, 보다 특히 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킬 기를 의미한다. 직쇄 및 분지쇄 C1-C8 알킬 기의 예는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, tert-부틸, 이성질체 펜틸, 이성질체 헥실, 이성질체 헵틸 및 이성질체 옥틸, 특히 메틸, 에틸, 프로필, 부틸 및 펜틸이다. 알킬의 특정한 예는 메틸, 에틸 및 프로필이다.
용어 "사이클로알킬"은, 단독으로 또는 조합으로, 3 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 사이클로알킬 고리, 3 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 사이클로알킬 고리를 의미한다. 사이클로알킬의 예는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸 및 사이클로옥틸, 보다 특히 사이클로프로필 및 사이클로부틸이다. "사이클로알킬"의 특정 예는 사이클로프로필이다.
용어 "알콕시"는, 단독으로 또는 조합으로, 화학식 알킬-O-의 기(여기서 용어 "알킬"은 이전에 제시된 의미를 갖는다), 예컨대 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, 이소부톡시, sec-부톡시 및 tert-부톡시를 의미한다. 특정 "알콕시"는 메톡시 및 에톡시이다. 메톡시에톡시는 "알콕시알콕시"의 특정 예이다.
용어 "옥시"는, 단독으로 또는 조합으로, -O- 기를 의미한다.
용어 "알켄일"은, 단독으로 또는 조합으로, 올레핀계 결합, 및 8개 이하, 바람직하게는 6개 이하, 특히 바람직하게는 4개 이하의 탄소 원자를 포함하는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 잔기를 의미한다. 알켄일 기의 예는 에텐일, 1-프로펜일, 2-프로펜일, 이소프로펜일, 1-부텐일, 2-부텐일, 3-부텐일 및 이소부텐일이다.
용어 "알킨일"은, 단독으로 또는 조합으로, 삼중결합, 및 8개 이하, 바람직하게는 6개 이하, 특히 바람직하게는 4개 이하의 탄소 원자를 포함하는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 잔기를 의미한다.
용어 "할로겐" 또는 "할로"는, 단독으로 또는 조합으로, 불소, 염소, 브롬 또는 요오드, 특히 불소, 염소 또는 브롬, 보다 특히 불소를 의미한다. 용어 "할로"는, 또 다른 기와 조합으로, 상기 기가 하나 이상의 할로겐, 특히 1 내지 5개의 할로겐, 특히 1 내지 4개의 할로겐, 즉, 1, 2, 3 또는 4개의 할로겐으로 치환되는 것을 나타낸다.
용어 "할로알킬"은, 단독으로 또는 조합으로, 하나 이상의 할로겐, 특히 1 내지 5개의 할로겐, 특히 1 내지 3개의 할로겐으로 치환된 알킬 기를 나타낸다. 할로알킬의 예는 모노플루오로-, 다이플루오로- 또는 트라이플루오로-메틸, -에틸 또는 -프로필, 예를 들어, 3,3,3-트라이플루오로프로필, 2-플루오로에틸, 2,2,2-트라이플루오로에틸, 플루오로메틸 또는 트라이플루오로메틸을 포함한다. 플루오로메틸, 다이플루오로메틸 및 트라이플루오로메틸이 특정 "할로알킬"이다.
용어 "할로사이클로알킬"은, 단독으로 또는 조합으로, 하나 이상의 할로겐, 특히 1 내지 5개의 할로겐, 특히 1 내지 3개의 할로겐으로 치환된, 상기에 정의된 사이클로알킬 기를 나타낸다. "할로사이클로알킬"의 특정 예는 할로사이클로프로필, 특히 플루오로사이클로프로필, 다이플루오로사이클로프로필 및 트라이플루오로사이클로프로필이다.
용어 "하이드록시"는, 단독으로 또는 조합으로, -OH 기를 의미한다.
용어 "티오하이드록시"는, 단독으로 또는 조합으로, -SH 기를 의미한다.
용어 "카본일"은, 단독으로 또는 조합으로, -C(O)- 기를 의미한다.
용어 "카복시"는, 단독으로 또는 조합으로, -COOH 기를 의미한다.
용어 "아미노"는, 단독으로 또는 조합으로, 일차 아미노 기(-NH2), 이차 아미노 기(-NH-) 또는 삼차 아미노 기(-N-)를 의미한다.
용어 "알킬아미노"는, 단독으로 또는 조합으로, 상기에 정의된 1 또는 2개의 알킬 기로 치환된, 상기에 정의된 아미노 기를 의미한다.
용어 "설폰일"은, 단독으로 또는 조합으로, -SO2 기를 의미한다.
용어 "설핀일"은, 단독으로 또는 조합으로, -SO- 기를 의미한다.
용어 "설판일"은, 단독으로 또는 조합으로, -S- 기를 의미한다.
용어 "시아노"는, 단독으로 또는 조합으로, -CN 기를 의미한다.
용어 "아지도"는, 단독으로 또는 조합으로, -N3 기를 의미한다.
용어 "니트로"는, 단독으로 또는 조합으로, NO2 기를 의미한다.
용어 "폼일"은, 단독으로 또는 조합으로, -C(O)H 기를 의미한다.
용어 "카바모일"은, 단독으로 또는 조합으로, -C(O)NH2 기를 의미한다.
용어 "카바미도"는, 단독으로 또는 조합으로, -NH-C(O)-NH2 기를 의미한다.
용어 "아릴"은, 단독으로 또는 조합으로, 할로겐, 하이드록시, 알킬, 알켄일, 알킨일, 알콕시, 알콕시알킬, 알켄일옥시, 카복시, 알콕시카본일, 알킬카본일 및 폼일로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의적으로 치환된 6 내지 10개의 탄소 고리 원자를 포함하는 일가 방향족 탄소환형 일환형 또는 이환형 고리 시스템을 나타낸다. 아릴의 예는 페닐 및 나프틸, 특히 페닐을 포함한다.
용어 "헤테로아릴"은, 단독으로 또는 조합으로, 할로겐, 하이드록시, 알킬, 알켄일, 알킨일, 알콕시, 알콕시알킬, 알켄일옥시, 카복시, 알콕시카본일, 알킬카본일 및 폼일로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의적으로 치환된, 1, 2, 3 또는 4개의 헤테로 원자를 포함하고 나머지 고리 원자는 탄소인 5 내지 12개의 고리 원자의 일가 방향족 헤테로환형 일환형 또는 이환형 고리 시스템을 나타낸다. 헤테로아릴의 예는 피롤릴, 퓨란일, 티엔일, 이미다졸릴, 옥사졸릴, 티아졸릴, 트라이아졸릴, 옥사다이아졸릴, 티아다이아졸릴, 테트라졸릴, 피리딘일, 피라진일, 피라졸릴, 피리다진일, 피리미딘일, 트라이아진일, 아제핀일, 다이아제핀일, 이소옥사졸릴, 벤조퓨란일, 이소티아졸릴, 벤조티엔일, 인돌릴, 이소인돌릴, 이소벤조퓨란일, 벤즈이미다졸릴, 벤조옥사졸릴, 벤조이소옥사졸릴, 벤조티아졸릴, 벤조이소티아졸릴, 벤조옥사다이아졸릴, 벤조티아다이아졸릴, 벤조트라이아졸릴, 푸린일, 퀴놀릴, 이소퀴놀릴, 퀴나졸린일, 퀴녹살린일, 카바졸릴 또는 아크리딘일을 포함한다.
용어 "헤테로사이클릴"은, 단독으로 또는 조합으로, 할로겐, 하이드록시, 알킬, 알켄일, 알킨일, 알콕시, 알콕시알킬, 알켄일옥시, 카복시, 알콕시카본일, 알킬카본일 및 폼일로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의적으로 치환된, N, O 및 S로부터 선택된 1, 2, 3 또는 4개의 고리 헤테로 원자를 포함하고 나머지 고리 원자가 탄소인 4 내지 12개, 특히 4 내지 9개의 고리 원자의 일가 포화 또는 부분적 불포화 일환형 또는 이환형 고리 시스템을 의미한다. 일환형 포화 헤테로사이클릴의 예는 아제티딘일, 피롤리딘일, 테트라하이드로퓨란일, 테트라하이드로-티엔일, 피라졸리딘일, 이미다졸리딘일, 옥사졸리딘일, 이소옥사졸리딘일, 티아졸리딘일, 피페리딘일, 테트라하이드로피란일, 테트라하이드로티오피란일, 피페라진일, 모폴린일, 티오모폴린일, 1,1-다이옥소-티오모폴린-4-일, 아제판일, 다이아제판일, 호모피페라진일 또는 옥사제판일이다. 이환형 포화 헤테로사이클로알킬의 예는 8-아자-바이사이클로[3.2.1]옥틸, 퀴누클리딘일, 8-옥사-3-아자-바이사이클로[3.2.1]옥틸, 9-아자-바이사이클로[3.3.1]노닐, 3-옥사-9-아자-바이사이클로[3.3.1]노닐 또는 3-티아-9-아자-바이사이클로[3.3.1]노닐이다. 부분적 불포화 헤테로사이클로알킬의 예는 다이하이드로퓨릴, 이미다졸린일, 다이하이드로-옥사졸릴, 테트라하이드로-피리딘일 또는 아디하이드로피란일이다.
용어 "약학적으로 허용되는 염"은, 생물학적으로 또는 달리 바람직한, 유리 염기 또는 유리 산의 생물학적 효과 및 특성을 보유하는 염을 지칭한다. 염은 무기 산(예컨대 염산, 브롬화 수소산, 황산, 질산, 인산, 특히 염산) 또는 유기 산(예컨대 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 옥살산, 말레산, 말론산, 석신산, 퓨마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 신남산, 만델산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 살리실산, N-아세틸시스테인)에 의해 형성된다. 또한, 이들 염은 무기 염기 또는 유기 염기를 유리 산에 첨가함으로써 제조될 수 있다. 무기 염기로부터 유도된 염은 비제한적으로 나트륨, 칼륨, 리튬, 암모늄, 칼슘, 마그네슘 염을 포함한다. 유기 염기로부터 유도된 염은 비제한적으로 일차, 이차 또는 삼차 아민, 치환된 아민(천연-발생 치환된 아민), 환형 아민 및 염기성 이온 교환 수지, 예컨대 이소프로필아민, 트라이메틸아민, 다이에틸아민, 트라이에틸아민, 트라이프로필아민, 에탄올아민, 리신, 아르기닌, N-에틸피페리딘, 피페리딘, 폴리아민 수지의 염을 포함한다. 또한, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 쌍성 이온의 형태로 존재할 수 있다. 특히 바람직한 본 발명의 약학적으로 허용되는 염은 염산, 브롬화 수소산, 황산, 인산 및 메탄설폰산의 염이다.
용어 "보호기"는, 단독으로 또는 조합으로, 다작용성 화합물의 반응성 부위를 선택적으로 차단하여 화학 반응이 또 다른 보호되지 않은 반응성 부위에서 선택적으로 수행될 수 있도록 하는 기를 의미한다. 보호기는 제거될 수 있다. 예시적 보호기는 아미노 보호기, 카복시 보호기 또는 하이드록시 보호기이다.
"하이드록시 보호기"는 하이드록시 기의 보호기이고, 또한 티올 기를 보호하는 데 사용된다. 하이드록시 보호기의 예는 아세틸(Ac), 벤조일(Bz), 벤질(Bn), β-메톡시에톡시메틸 에터(MEM), 다이메톡시트라이틸(또는 비스-(4-메톡시페닐)페닐메틸)(DMT), 트라이메톡시트라이틸(또는 트리스-(4-메톡시페닐)페닐메틸)(TMT), 메톡시메틸 에터(MOM), 메톡시트라이틸 [(4-메톡시페닐)다이페닐메틸(MMT), p-메톡시벤질 에터(PMB), 메틸티오메틸 에터, 피발로일(Piv), 테트라하이드로피란일(THP), 테트라하이드로퓨란(THF), 트라이틸 또는 트라이페닐메틸(Tr), 실릴 에터(예를 들어, 트라이메틸실릴(TMS), tert-부틸다이메틸실릴(TBDMS), 트라이-이소-프로필실릴옥시메틸(TOM) 및 트라이이소프로필실릴(TIPS) 에터), 메틸 에터 및 에톡시에틸 에터(EE)이다. 하이드록시 보호기의 특정 예는 DMT 및 TMT, 특히 DMT이다.
본 발명의 출발 물질 또는 화합물 중 하나가 하나 이상의 반응 단계의 반응 조건 하에 안정하지 않거나 반응성인 하나 이상의 작용기를 함유하는 경우, 적절한 보호기(예를 들어, 문헌["Protective Groups in Organi Chemistry" by T. W. Greene and P. G. M. Wuts, 3rd Ed., 1999, Wiley, New York]에 기재되어 있음)가 당분야에 주지된 중요한 단계 적용 방법 전에 도입될 수 있다. 이러한 보호기는 문헌에 기재된 표준 방법을 사용하여 합성의 말기 단계에서 제거될 수 있다. 보호기의 예는 tert-부톡시카본일(Boc), 9-플루오렌일메틸 카바메이트(Fmoc), 2-트라이메틸실릴에틸 카바메이트(Teoc), 카보벤질옥시(Cbz) 및 p-메톡시벤질옥시카본일 (Moz)이다.
본원에 기재된 화합물은 여러 비대칭 중심을 함유할 수 있고, 광학적으로 순수한 거울상 이성질체, 거울상 이성질체의 혼합물, 예컨대 라세미체, 부분입체 이성질체의 혼합물, 부분입체 이성질체 라세미체 또는 부분입체 이성질체 라세미체의 혼합물의 형태로 존재할 수 있다.
제제, 예를 들어, 약학 제형의 "효과량"은 목적하는 치료 또는 예방 결과를 달성하기 위해 투여량에서 필요한 시간 동안 효과적인 양을 지칭한다.
올리고뉴클레오티드
본원에 사용된 용어 "올리고뉴클레오티드"는 2개 이상의 공유결합으로 연결된 뉴클레오시드를 포함하는 분자로서 당업자에게 일반적으로 이해되는 바와 같이 정의된다. 이러한 공유결합으로 연결된 뉴클레오시드는 또한 핵산 분자 또는 올리고머로서 지칭될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 고체-상 화학 합성 후에 정제에 의해 실험실에서 통상적으로 제조된다. 올리고뉴클레오티드의 서열을 언급하는 경우, 공유결합으로 연결된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드의 핵염기 모이어티 또는 이의 변형의 서열 또는 순서가 언급된다. 올리고뉴클레오티드는 인공적이고 화학적으로 합성되고 전형적으로 정제되거나 단리된다. 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명에 언급되는 HTRA1 RNA 길항제는 올리고뉴클레오티드, 예컨대 siRNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있고, 이는 HTRA1 표적 핵산의 발현을 조절할 수 있다. HTRA1 RNA 길항제를 통한 조절은 예를 들어, mRNA의 저하 또는 전사의 차단에 의해 또는 HTRA1 pre-mRNA의 선택적 스플라이싱(HTRA1 pre-mRNA의 스플라이스 조절)을 통해 HTRA1의 발현을 억제하거나 하향-조절하거나 감소시키거나 진압하거나 제거하거나 중단시키거나 차단하거나 방지하거나 경감시키거나 저하시키거나 회피하거나 종결시키는 능력을 포함한다.
siRNA 및 shRNA
일부 실시양태에서, HTRA1 mRNA 길항제는 siRNA 또는 shRNA이다.
siRNA는, 18 내지 25개의 염기쌍의 듀플렉스 영역을 함께 형성하는 센스 및 안티센스 가닥을 포함하는 짧은 이중가닥 복합물이다. HTRA1을 표적화하는 siRNA의 안티센스 가닥은 HTRA1 표적 핵산, 예컨대 HTRA1 mRNA에 상보성이다. US 2007/185317은 HTRA1을 표적화하는 siRNA를 개시한다.
짧은 헤어핀 RNA 또는 작은 헤어핀 RNA(shRNA/헤어핀 벡터)는, RNA 간섭(RNAi)을 통해 표적 유전자 발현을 사일런싱(silencing)시키는 데 사용될 수 있는, 급격한 헤어핀 전환을 갖는 인공 RNA 분자이다. 세포의 shRNA의 발현은 전형적으로 플라스미드의 전달에 의해 또는 바이러스 또는 박테리아 벡터를 통해 달성된다.
안티센스 올리고뉴클레오티드
유리하게는, HTRA1 mRNA 길항제는 HTRA1 핵산을 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다.
본원에 사용된 용어 "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 특히 표적 핵산을 발현하는 세포에서, 표적 핵산, 특히 표적 핵산 상의 인접 서열에 혼성화함으로써 표적 유전자의 발현을 조절할 수 있는 올리고뉴클레오티드로서 정의된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 본질적으로 이중가닥이 아니고, 이에 따라 siRNA 또는 shRNA가 아니다. 바람직하게는, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 단일가닥이다. 인트라 또는 인터 자기-상보성의 정도가 올리고뉴클레오티드의 전장에 걸쳐 50% 미만인 경우 본 발명의 단일가닥 올리고뉴클레오티드가 헤어핀 또는 분자간 듀플렉스 구조(동일한 올리고뉴클레오티드의 2개의 분자 사이의 듀플렉스)를 형성할 수 있음이 이해된다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 인공적이고 화학적으로 합성되고 전형적으로 정제되거나 단리된다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
인접 뉴클레오티드 서열
용어 "인접 뉴클레오티드 서열"은 표적 핵산에 상보성인 올리고뉴클레오티드의 영역을 지칭한다. 상기 용어는 본원에서 용어 "인접 핵염기 서열" 및 용어 "올리고뉴클레오티드 모티프 서열"과 상호교환적으로 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 모든 뉴클레오티드는 인접 뉴클레오티드 서열을 구성한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 인접 뉴클레오티드 서열, 예컨대 F-G-F' 갭머(gapmer) 영역을 포함하고, 추가의 뉴클레오티드, 예를 들어, 작용기를 인접 뉴클레오티드 서열에 부착하는 데 사용될 수 있는 뉴클레오티드 연결기 영역을 임의적으로 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 연결기 영역은 표적 핵산에 상보성이지 않거나 상보성일 수 있다.
뉴클레오티드
뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드의 빌딩 블록이고, 본 발명의 목적을 위하여 천연 발생 및 비-천연 발생 뉴클레오티드를 둘 다 포함한다. 천연적으로, 뉴클레오티드, 예컨대 DNA 및 RNA 뉴클레오티드는 리보스 당 모이어티, 핵염기 모이어티 및 하나 이상의 포스페이트 기(뉴클레오시드에는 부재함)를 포함한다. 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는 또한 "단위" 또는 "단량체"와 상호교환적으로 지칭될 수 있다.
변형된 뉴클레오시드
본원에 사용된 용어 "변형된 뉴클레오시드" 또는 "뉴클레오시드 변형"은 당 모이어티 또는 (핵)염기 모이어티의 하나 이상의 변형을 도입함으로써, 등가의 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드와 비교하여 변형된 뉴클레오시드를 지칭한다. 바람직한 실시양태에서, 변형된 뉴클레오시드는 변형된 당 모이어티를 포함한다. 용어 "변형된 뉴클레오시드"는 또한 본원에서 용어 "뉴클레오시드 유사체", 변형된 "단위" 또는 변형된 "단량체"와 상호교환적으로 사용될 수 있다. 변형되지 않은 DNA 또는 RNA 당 모이어티를 갖는 뉴클레오시드는 본원에서 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드로 지칭된다. DNA 또는 RNA 뉴클레오시드의 염기 영역에 변형을 갖는 뉴클레오시드는 왓슨-크릭 염기 페어링(Watson-Crick base pairing)을 허용하는 경우 일반적으로 DNA 또는 RNA로 지칭된다.
변형된 뉴클레오시드간 연결기
용어 "변형된 뉴클레오시드간 연결기"는 2개의 뉴클레오시드를 함께 공유결합으로 커플링시키는, 포스포다이에스터(PO) 이외의 연결기로서 당업자에게 일반적으로 이해되는 바와 같이 정의된다. 따라서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오시드간 연결기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오시드간 연결기는 포스포다이에스터 연결기와 비교하여, 올리고뉴클레오티드의 뉴클레아제 내성을 증가시킨다. 천연 발생 올리고뉴클레오티드의 경우, 뉴클레오시드간 연결기는 인근 뉴클레오시드 사이에 포스포다이에스터 결합을 생산하는 포스페이트 기를 포함한다. 변형된 뉴클레오시드간 연결기는 생체내 사용을 위해 올리고뉴클레오티드를 안정화시키는 데 특히 유용하고, 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드의 영역에서, 예를 들어, 변형된 뉴클레오시드의 영역, 예컨대 영역 F 및 F'뿐만 아니라 갭머 올리고뉴클레오티드의 갭 영역 내에서 뉴클레아제 절단에 대해 보호하는 역할을 할 수 있다.
한 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 천연 포스포다이에스터로부터 변형된 하나 이상의 뉴클레오시드간 연결기, 예컨대 예를 들어, 뉴클레아제 공격에 대해 더욱 내성인 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드간 연결기를 포함한다. 뉴클레아제 내성은 혈청 중 올리고뉴클레오티드를 항온처리함으로써 또는 뉴클레아제 내성 검정(예컨대, 뱀 독액 포스포다이에스터라제(SVPD))(둘 다 당분야에 널리 공지됨)을 사용함으로써 측정될 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 뉴클레아제 내성을 강화시킬 수 있는 뉴클레오시드간 연결기는 뉴클레아제 내성 뉴클레오시드간 연결기로 지칭된다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오시드간 연결기 중 50% 이상이 변형되고, 예컨대 올리고뉴클레오티드 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오시드간 연결기 중 60% 이상, 예컨대 70% 이상, 예컨대 75% 이상, 예컨대 80% 이상, 또는 예컨대 90% 이상이 뉴클레아제 내성 뉴클레오시드간 연결기이다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열의 모든 뉴클레오시드간 연결기는 뉴클레아제 내성 뉴클레오시드간 연결기이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 비-뉴클레오티드 작용기, 예컨대 접합체에 연결하는 뉴클레오시드가 포스포다이에스터일 수 있음이 인정될 것이다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드에서 사용하기 위해 바람직한 변형된 뉴클레오시드간 연결기는 포스포로티오에이트이다.
포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기는 뉴클레아제 내성, 이로운 약동학 및 제조 용이성에 기인하여 특히 유용하다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오시드간 연결기의 50% 이상이 포스포로티오에이트이고, 예컨대 올리고뉴클레오티드 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오시드간 연결기의 60% 이상, 예컨대 70% 이상, 예컨대 75% 이상, 예컨대 80% 이상, 또는 예컨대 90% 이상이 포스포로티오에이트이다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오시드간 연결기 모두가 포스포로티오에이트이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 포스포로다이티오에이트 연결기에 더하여 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기 및 하나 이상의 포스포다이에스터 연결기, 예컨대 2, 3 또는 4개의 포스포다이에스터 연결기 모두를 포함한다. 갭머 올리고뉴클레오티드에서, 포스포다이에스터 연결기는, 존재하는 경우, 갭 영역 G의 인접 DNA 뉴클레오시드 사이에 적합하게 위치되지 않는다.
뉴클레아제 내성 연결기, 예컨대 포스포로티오에이트 연결기는, 표적 핵산, 예컨대 갭머의 영역 G와의 듀플렉스를 형성할 때 뉴클레아제를 모집할 수 있는 올리고뉴클레오티드 영역에서 특히 유용하다. 그러나, 포스포로티오에이트 연결기는 또한 비-뉴클레아제 모집 영역 및/또는 친화도 강화 영역, 예컨대 갭머의 영역 F 및 F'에서 유용할 수 있다. 갭머 올리고뉴클레오티드는, 일부 실시양태에서, 영역 F 또는 F', 또는 영역 F 및 F' 모두에 하나 이상의 포스포다이에스터 연결기를 포함할 수 있고, 여기서 영역 G의 모든 뉴클레오시드간 연결기는 포스포로티오에이트일 수 있다.
유리하게는, 올리고뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 서열의 모든 뉴클레오시드간 연결기, 또는 올리고뉴클레오티드의 모든 뉴클레오시드간 연결기는 포스포로티오에이트 연결기이다.
EP 2 742 135에 개시된 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 (포스포다이에스터 및 포스포로티오에이트 이외에) 다른 뉴클레오시드간 연결기, 예를 들어, 알킬 포스포네이트/메틸 포스포네이트 뉴클레오시드간 연결기를 포함할 수 있고, 이는 EP 2 742 135에 따라 예를 들어, DNA 포스포로티오에이트 갭 영역에서 허용될 수 있다는 것이 인정된다.
핵염기
용어 "핵염기"는 핵산 혼성화에서 수소결합을 형성하는 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드에 존재하는 푸린(예컨대, 아데닌 및 구아닌) 및 피리미딘(예컨대, 우라실, 티민 및 사이토신) 모이어티를 포함한다. 본 발명에 있어서, 용어 "핵염기"는 또한 천연 발생 핵염기와 상이할 수 있지만 핵산 혼성화 동안 작용성인 변형된 핵염기를 포함한다. 이러한 맥락에서, "핵염기"는 천연 발생 핵염기, 예컨대 아데닌, 구아닌, 사이토신, 티미딘, 우라실, 잔틴 및 하이포잔틴, 및 비-천연 발생 변이체를 둘 다 지칭한다. 이러한 변이체는, 예를 들어, 문헌[Hirao et al (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055] 및 문헌[Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1]에 기술되어 있다.
일부 실시양태에서, 핵염기 모이어티는 푸린 또는 피리미딘을 변형된 푸린 또는 피리미딘, 예컨대 치환된 푸린 또는 치환된 피리미딘, 예컨대 이소사이토신, 슈도이소사이토신, 5-메틸-사이토신, 5-티오졸로-사이토신, 5-프로핀일-사이토신, 5-프로핀일-우라실, 5-브로모-우라실, 5-티아졸로-우라실, 2-티오-우라실, 2'-티오-티민, 이노신, 다이아미노푸린, 6-아미노푸린, 2-아미노푸린, 2,6-다이아미노푸린 및 2-클로로-6-아미노푸린으로부터 선택되는 핵염기로 바꿈으로써 변형된다.
핵염기 모이어티는 각각의 상응하는 핵염기에 대한 문자 부호, 예컨대 A, T, G, C 또는 U로 표시될 수 있고, 이때 각각의 문자는 임의적으로 균등한 기능의 변형된 핵염기를 포함한다. 예를 들어, 예시적인 올리고뉴클레오티드에서, 핵염기 모이어티는 A, T, G, C 및 5-메틸-사이토신으로부터 선택된다. 임의적으로, LNA 갭머의 경우, 5-메틸-사이토신 LNA 뉴클레오시드가 사용될 수 있다.
변형된 올리고뉴클레오티드
용어 "변형된 올리고뉴클레오티드"는 하나 이상의 당-변형된 뉴클레오시드 및/또는 변형된 뉴클레오시드간 연결기를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 기술한다. 용어 "키메라" 올리고뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오시드를 갖는 올리고뉴클레오티드를 기술하기 위해 문헌에서 사용되는 용어이다.
상보성
용어 "상보성"은 뉴클레오시드/뉴클레오티드의 왓슨-크릭 염기 페어링을 위한 능력을 기술한다. 왓슨-크릭 염기 쌍은 구아닌(G)-사이토신(C) 및 아데닌(A)-티민(T)/우라실(U)이다. 올리고뉴클레오티드가 변형된 핵염기를 갖는 뉴클레오시드를 포함할 수 있고, 예를 들어, 5-메틸 사이토신이 종종 사이토신 대신에 사용되고, 상기 용어 "상보성"은 비-변형된 핵염기와 변형된 핵염기 사이의 왓슨-크릭 염기 페어링을 포괄함이 이해될 것이다(예를 들어, 문헌[Hirao et al (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055] 및 문헌[Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1] 참조).
본원에 사용된 용어 "% 상보성"은, 인접 뉴클레오티드 서열에 걸쳐 기준 서열(예를 들어, 표적 서열 또는 서열 모티프)에 상보성인 핵산 분자(예를 들어, 올리고뉴클레오티드)의 인접 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드의 비(%)를 지칭한다. 따라서, 상보성의 백분율은, (표적 서열 5'-3' 및 올리고뉴클레오티드 서열 3'-5'에 의해 정렬시) 2개의 서열 사이에 (왓슨-크릭 염기쌍으로부터) 상보성인 정렬된 핵염기의 수를 세고 상기 수를 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드의 총 수로 나누고, 100을 곱함으로써 계산된다. 이러한 비교에서, 정렬(염기쌍을 형성)하지 않는 핵염기/뉴클레오티드는 미스매치(mismatch)로 지칭된다. 삽입 및 결실은 인접 뉴클레오티드 서열의 % 상보성의 계산에서 허용되지 않는다. 상보성의 결정에서, 왓슨-크릭 염기 페어링을 형성하는 핵염기의 기능적 능력이 유지된다면, 핵염기의 화학적 변형이 무시된다는 것이 이해된다(예를 들어, 5'-메틸 사이토신은 % 동일성의 계산을 위해 사이토신과 동일한 것으로 간주된다).
용어 "완전히 상보성"은 100% 상보성을 지칭한다.
동일성
본원에 사용된 용어 "동일성"은, 인접 뉴클레오티드 서열에 걸쳐 기준 서열(예를 들어, 서열 모티프)와 동일한 핵산 분자(예를 들어, 올리고뉴클레오티드)의 인접 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드의 비(%)를 지칭한다. 따라서, 동일성 백분율은, (본 발명의 화합물의 인접 뉴클레오티드 서열에서 및 기준 서열에서) 2개의 서열 사이에 동일한 정렬된 염기(매치)의 수를 세고, 상기 수를 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드의 총 수로 나누고, 100을 곱함으로써 계산된다. 따라서, 동일성의 백분율 = (매치 x 100)/정렬된 영역(예를 들어, 인접 뉴클레오티드 서열)의 길이. 삽입 및 결실은 인접 뉴클레오티드 서열의 동일성의 백분율의 계산에서 허용되지 않는다. 동일성의 결정에서, 왓슨-크릭 염기 페어링을 형성하는 핵염기의 기능적 능력이 유지된다면, 핵염기의 화학적 변형이 무시된다는 것이 이해된다(예를 들어, 5'-메틸 사이토신은 % 동일성의 계산을 위해 사이토신과 동일한 것으로 간주된다).
혼성화
본원에 사용된 용어 "혼성화함" 또는 "혼성화하다"는 대향하는 가닥 상의 염기 쌍 사이에 수소결합을 형성하고 이에 의해 듀플렉스를 형성하는 2개의 핵산 가닥(예컨대, 올리고뉴클레오티드 및 표적 핵산)으로 이해되어야 한다. 2개의 핵산 가닥 사이의 결합의 친화도는 혼성화의 강도이다. 이것은 종종 올리고뉴클레오티드의 절반이 표적 핵산과 듀플렉싱된 온도로서 정의되는 용융 온도(Tm)에 의하여 기술된다. 생리학적 조건 Tm은 친화도에 엄격히 비례하지는 않는다(문헌[Mergny and Lacroix, 2003, Oligonucleotides 13:515-537]). 표준 상태 깁스(Gibbs) 자유 에너지 ΔG°는 결합 친화도의 더욱 정확한 표현이고, ΔG°= -RTln(Kd)(이때, R은 기체 상수이고, T는 절대 온도임)에 의해 반응의 해리 상수(Kd)와 관련된다. 따라서, 올리고뉴클레오티드와 표적 핵산 사이의 반응의 매우 낮은 ΔG°는 올리고뉴클레오티드와 표적 핵산 사이의 강한 혼성화를 반영한다. ΔG°는 수성 농도가 1 M이고, pH가 7이고, 온도가 37℃인 반응과 연관된 에너지이다. 표적 핵산으로의 올리고뉴클레오티드의 혼성화는 자발적인 반응이고, 자발적인 반응의 경우, ΔG°는 0 미만이다. ΔG°는, 예를 들어, 문헌[Hansen et al., 1965, Chem. Comm. 36-38] 및 문헌[Holdgate et al., 2005, Drug Discov Today]에 기술된 등온 적정 열량계(ITC) 방법을 사용함으로써 실험적으로 측정될 수 있다. 당업자는 시판 중인 장비가 ΔG° 측정에 이용가능함을 알 것이다. ΔG°는 또한 문헌[Sugimoto et al., 1995, Biochemistry 34:11211-11216] 및 문헌[McTigue et al., 2004, Biochemistry 43:5388-5405]에 기술된 대략적으로 유도된 열역학 파라미터를 사용하는 문헌[SantaLucia, 1998, Proc Natl Acad Sci USA. 95: 1460-1465]에 기술된 최근접 이웃 모델(nearest neighbor model)을 사용함으로써, 수치적으로 추정될 수 있다. 혼성화에 의해 의도된 핵산 표적을 조절할 가능성을 갖기 위하여, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드에 대해 -10 kcal 미만의 추정된 ΔG° 값을 갖는 표적 핵산에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 혼성화의 정도 또는 강도는 표준 상태 깁스 자유 에너지 ΔG°에 의해 측정된다. 올리고뉴클레오티드는 8 내지 30개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드에 대해 -10 kcal 미만, 예컨대 -15 kcal 미만, 예컨대 -20 kcal 미만, 예컨대 -25 kcal 미만의 추정된 ΔG° 값을 갖는 표적 핵산에 혼성화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 -10 내지 -60 kcal, 예컨대 -12 내지 -40 kcal, 예컨대 -15 내지 -30 kcal 또는 -16 내지 -27 kcal, 예컨대 -18 내지 -25 kcal의 추정된 ΔG° 값을 갖는 표적 핵산에 혼성화한다.
표적 서열
본원에 사용된 용어 "표적 서열"은 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드에 상보성인 핵염기 서열을 포함하는 표적 핵산에 존재하는 뉴클레오티드의 서열을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 표적 서열은 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 서열에 상보성인 핵염기 서열을 갖는 표적 핵산 상의 영역으로 이루어진다. 표적 핵산의 영역은 표적 뉴클레오티드 서열, 표적 서열 또는 표적 영역과 상호교환적으로 지칭될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 서열은 단일 올리고뉴클레오티드의 인접 상보성 서열보다 길고, 예를 들어, 다수의 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 의해 표적화될 수 있는 표적 핵산의 바람직한 영역을 나타낼 수 있다.
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산, 예컨대 본원에 기재된 표적 서열에 상보성인 인접 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
올리고뉴클레오티드가 상보성인 표적 서열은 일반적으로 10개 이상의 뉴클레오티드의 인접 핵염기 서열을 포함한다. 인접 뉴클레오티드 서열은 10 내지 50개의 뉴클레오티드, 예컨대 12 내지 30개, 예컨대 14 내지 20개, 예컨대 15 내지 18개의 인접 뉴클레오티드이다.
표적 세포
본원에 사용된 용어 "표적 세포"는 표적 핵산을 발현하는 세포를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 표적 세포는 생체내 또는 시험관내의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 세포는 포유류 세포, 예컨대 설치류 세포, 예컨대 마우스 세포 또는 래트 세포, 또는 영장류 세포, 예컨대 원숭이 세포 또는 인간 세포이다.
고친화도 변형된 뉴클레오시드
고친화도 변형된 뉴클레오시드는, 예를 들어, 용융 온도(Tm)에 의해 측정시, 올리고뉴클레오티드 내로 혼입될 때, 상보성 표적에 대한 올리고뉴클레오티드의 친화도를 강화시키는 변형된 뉴클레오티드이다. 본 발명의 고친화도 변형된 뉴클레오시드는 바람직하게는 변형된 뉴클레오시드 당 +0.5 내지 +12℃, 더욱 바람직하게는 +1.5 내지 +10℃, 가장 바람직하게는 +3 내지 +8℃의 용융 온도 증가를 야기한다. 수많은 고친화도 변형된 뉴클레오시드가 당분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 많은 2' 치환된 뉴클레오시드 및 잠금 핵산(LNA)을 포함한다(예컨대, 문헌[Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443] 및 문헌[Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213] 참고).
당 변형
본 발명의 올리고머는 DNA 및 RNA에서 발견되는 리보스 당 모이어티와 비교시, 변형된 당 모이어티, 즉, 당 모이어티의 변형을 갖는 하나 이상의 뉴클레오시드를 포함할 수 있다.
리보스 당 모이어티의 변형을 갖는 수많은 뉴클레오시드는 주로 올리고뉴클레오티드의 특정 특성, 예컨대 친화도 및/또는 뉴클레아제 내성을 개선할 목적으로 제조되었다.
이러한 변형은, 예컨대, 헥소스 고리(HNA), 리보스 고리 상의 C2와 C4 탄소 사이에 바이라디칼 가교를 전형적으로 갖는 이환형 고리(LNA), 또는 C2와 C3 탄소 사이에 결합이 전형적으로 결핍된 연결되지 않은 리보스 고리(예컨대, UNA)에 의한 치환에 의해, 리보스 고리 구조가 변형된 것들을 포함한다. 다른 당 변형된 뉴클레오시드는, 예를 들어, 바이사이클로헥소스 핵산(WO 2011/017521) 또는 삼환형 핵산(WO 2013/154798)을 포함한다. 변형된 뉴클레오시드는 또한, 예를 들어, 펩티드 핵산(PNA) 또는 모폴리노 핵산의 경우, 당 모이어티가 비-당 모이어티로 대체되는 뉴클레오시드를 포함한다.
2' 변형된 뉴클레오시드
2' 당 변형된 뉴클레오시드는 2' 위치에서 H 또는 -OH 이외의 치환기를 갖거나(2' 치환된 뉴클레오시드) 리보스 고리의 2' 탄소와 제2 탄소 사이에 가교를 형성할 수 있는 2' 연결된 바이라디칼을 포함하는 뉴클레오시드, 예컨대 LNA(2'-4' 바이라디칼 가교된) 뉴클레오시드이다.
2' 치환된 뉴클레오시드 개발이 많이 주목되었고, 많은 2' 치환된 뉴클레오시드가 올리고뉴클레오티드 내로 혼입될 때 유리한 특성을 갖는 것이 밝혀졌다. 예를 들어, 2' 변형된 당은 강화된 결합 친화도 및/또는 증가된 뉴클레아제 내성을 올리고뉴클레오티드에 제공할 수 있다. 2' 치환된 변형된 뉴클레오시드의 예는 2'-O-알킬-RNA, 2'-O-메틸-RNA, 2'-알콕시-RNA, 2'-O-메톡시에틸-RNA(MOE), 2'-아미노-DNA, 2'-플루오로-RNA 및 2'-F-ANA 뉴클레오시드이다. 추가 예의 경우, 예를 들어, 문헌[Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443]; [Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213] 및 [Deleavey and Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937]을 참조한다. 일부 2' 치환된 변형된 뉴클레오시드가 하기 제시된다:
본 발명과 관련하여, 2' 치환된 당 변형된 뉴클레오시드는 2' 가교된 뉴클레오시드, 예컨대 LNA를 포함하지 않는다.
잠금 핵산(LNA)
"LNA 뉴클레오시드"는, 상기 뉴클레오시드의 리보스 당 고리의 C2' 및 C4'을 연결하는 바이라이칼("2'- 4' 가교"로도 지칭됨)을 포함하는 2'- 변형된 뉴클레오시드이며, 이는 리보스 고리의 형태를 제한하거나 잠근다. 이들 뉴클레오시드 문헌에서 가교된 핵산 또는 이환형 핵산(BNA)으로 지칭된다. 리보스의 형태의 잠금은, LNA가 상보성 RNA 또는 DNA 분자에 대한 올리고뉴클레오티드 내로 혼입될 때, 혼성화의 강화된 친화도(듀플렉스 안정화)와 관련된다. 이는 올리고뉴클레오티드/상보성 듀플렉스의 융점을 측정함으로써 통상적으로 결정될 수 있다.
비제한적인 예시적 LNA 뉴클레오시드가 WO 99/014226, WO 00/66604, WO 98/039352, WO 2004/046160, WO 00/047599, WO 2007/134181, WO 2010/077578, WO 2010/036698, WO 2007/090071, WO 2009/006478, WO 2011/156202, WO 2008/154401, WO 2009/067647, WO 2008/150729, 문헌[Morita et al., Bioorganic & Med.Chem. Lett. 12, 73-76], [Seth et al. J. Org. Chem. 2010, Vol 75(5) pp. 1569-81]; [Mitsuoka et al., Nucleic Acids Research 2009, 37(4), 1225-1238] 및 [Wan and Seth, J. Medical Chemistry 2016, 59, 9645-9667]에 개시되어 있다.
추가의 비제한적인 예시적 LNA 뉴클레오시드가 하기 도식 1에 개시되어 있다.
[도식 1]
특정 LNA 뉴클레오시드는 베타-D-옥시-LNA, 6'-메틸-베타-D-옥시 LNA, 예컨대 (S)-6'-메틸-베타-D-옥시-LNA(ScET) 및 ENA이다.
특히 유리한 LNA는 실시예의 화합물에 사용된 바와 같이 베타-D-옥시-LNA이다.
RNase H 활성 및 모집
안티센스 올리고뉴클레오티드의 RNase H 활성은 상보성 RNA 분자와의 듀플렉스에서 RNase H를 모집하는 이의 능력을 지칭한다. WO 01/23613은 RNase H를 모집하는 능력을 측정하는 데 사용될 수 있는 RNase H 활성을 측정하기 위한 시험관내 방법을 제공한다. 전형적으로, 상보성 표적 핵산 서열과 함께 제공될 때, 시험되는 변형된 올리고뉴클레오티드와 동일한 염기 서열을 갖지만, 올리고뉴클레오티드 내의 모든 단량체 사이에 포스포로티오에이트 연결기를 갖는 DNA 단량체만을 함유하는 올리고뉴클레오티드를 사용하고, WO 01/23613(본원에 참고로 포함됨)의 실시예 91 내지 95에 제공된 방법을 사용하여 측정된 초기 속도의 5% 이상, 예컨대 10% 이상 또는 20% 초과의 초기 속도(pmol/L/분으로 측정됨)를 가진다면, 올리고뉴클레오티드는 RNase H를 모집할 수 있는 것으로 간주된다. RHase H 활성의 결정에서 사용하기 위해, 재조합 인간 RNase H1이 루비오 사이언스 게엠베하(Lubio Science GmbH, 스위스 루체른 소재)로부터 입수가능하다.
갭머
안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열은 갭머일 수 있다. 안티센스 갭머는 RNase H 매개된 저하를 통해 표적 핵산을 억제하는 데 통상적으로 사용된다. 갭머 올리고뉴클레오티드는 3개 이상의 별개의 구조적 영역 5'-플랭크, 갭 및 3'-플랭크(F-G-F')를 '5 -> 3' 배향으로 포함한다. "갭" 영역(G)은 올리고뉴클레오티드가 RNase H를 모집하는 것을 가능하게 하는 인접 DNA 뉴클레오티드의 스트레치를 포함한다. 갭 영역은 하나 이상의 당 변형된 뉴클레오시드, 유리하게 고친화도 당 변형된 뉴클레오시드를 포함하는 플랭킹 영역(F), 및 하나 이상의 당 변형된 뉴클레오시드, 유리하게 고친화도 당 변형된 뉴클레오시드를 포함하는 3' 플랭킹 영역(F') 옆에 위치된다. 영역 F 및 F'의 하나 이상의 당 변형된 뉴클레오시드는 표적 핵산에 대한 올리고뉴클레오티드의 친화도를 증진시킨다(즉, 이는 친화도 증진 당 변형된 뉴클레오시드이다). 일부 실시양태에서, 영역 F 및 F'의 하나 이상의 당 변형된 뉴클레오시드는 2' 당 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 고친화도 2' 당 변형이고, 예컨대 독립적으로 LNA 및 2'-MOE로부터 선택된다.
갭머 디자인에서, 갭 영역의 5'에 가장 가까운 뉴클레오시드 및 3'에 가장 가까운 뉴클레오시드(5' and 3' most nucleoside)는 DNA 뉴클레오시드이고, 각각 5'(F) 또는 3'(F') 영역의 당 변형된 뉴클레오시드에 인접하게 위치된다. 플랭크는, 갭 영역으로부터 가장 떨어진 단부에서, 즉, 5' 플랭크의 5' 단부에서 및 3' 플랭크의 3' 단부에서 하나 이상의 당 변형된 뉴클레오시드를 갖는 것에 의해 추가로 한정될 수 있다.
영역 F-G-F'은 인접 뉴클레오티드 서열을 형성한다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열는 식 F-G-F'의 갭머 영역을 포함할 수 있다.
갭머 디자인 F-G-F'의 전체 길이는 예를 들어, 12 내지 32개의 뉴클레오시드, 예컨대 13 내지 24개, 예컨대 14 내지 22개의 뉴클레오시드, 예컨대 14 내지17개, 예컨대 16 내지 18개의 뉴클레오시드일 수 있다.
예로서, 본 발명의 갭머 올리고뉴클레오티드는 하기 식으로 나타낼 수 있다:
F1-8-G5-16-F'1-8, 예컨대
F1-8-G7-16-F'2-8
이때, 갭머 영역 F-G-F'의 전체 길이는 12개 이상, 예컨대 14개 이상의 뉴클레오티드 길이이다.
영역 F, G 및 F'은 하기에 추가로 정의되며 F-G-F' 식 내로 혼입될 수 있다.
갭머 - 영역 G
갭머의 영역 G(갭 영역)는 올리고뉴클레오티드가 RNaseH, 예컨대 인간 RNase H1 모집을 가능하게 하는 뉴클레오시드의 영역, 전형적으로 DNA 뉴클레오시드이다. RNaseH는, DNA와 RNA 사이의 듀플렉스를 인식하고 RNA 분자를 효소 작용에 의해 절단하는 세포 효소이다. 적합하게 갭머는 적어도 5 또는 6개의 인접 DNA 뉴클레오시드, 예컨대 5 내지 16개의 인접 DNA 뉴클레오시드, 예컨대 6 내지 15개의 인접 DNA 뉴클레오시드, 예컨대 7 내지 14개의 인접 DNA 뉴클레오시드, 예컨대 8 내지 12개의 인접 DNA 뉴클레오티드, 예컨대 8 내지 12개의 인접 DNA 뉴클레오티드 길이의 갭 영역(G)을 가질 수 있다. 갭 영역 G는, 일부 실시양태에서, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개의 인접 DNA 뉴클레오시드로 이루어질 수 있다. 갭 영역의 사이토신(C) DNA는 일부 예에서 메틸화될 수 있고, 상기 잔기는 5-메틸-사이토신(meC, 또는 c 대신 e로)으로서 주석이 달린다. cg 다이뉴클레오티드가 갭에 존재하여 잠재적 독성을 감소시키는 경우 갭의 사이토신 DNA의 메틸화는 유리하고, 변형은 올리고뉴클레오티드의 효능에 유의미하게 영향을 미치지 않는다.
일부 실시양태에서, 갭 영역 G는 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개의 인접 포스포로티오에이트 연결된 DNA 뉴클레오시드로 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 갭의 모든 뉴클레오시드간 연결기는 포스포로티오에이트 연결기이다.
종래의 갭머가 DNA 갭 영역을 갖는 반면에, 갭 영역 내에서 사용될 때 RNaseH 모집을 가능하게 하는 변형된 뉴클레오시드의 많은 예가 있다. 갭 영역 내에 포함될 때 RNaseH를 모집할 수 있는 것으로 보고된 변형된 뉴클레오시드는 예를 들어, 알파-L-LNA, C4' 알킬화된 DNA(본원에 참고로 포함된 PCT/EP2009/050349 및 문헌[Vester et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 18 (2008) 2296 - 2300]에 기재됨), 아라비노스 유도된 뉴클레오시드, 예컨대 ANA 및 2'F-ANA(문헌[Mangos et al. 2003 J. AM. CHEM. SOC. 125, 654-661]), UNA(비잠금 핵산)(본원에 참고로 포함된 문헌[Fluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039]에 기재됨)를 포함한다. UNA는, 전형적으로 리보스의 C2와 C3 사이의 결합이 제거되어 비잠금 "당" 잔기를 형성하는 비잠금 핵산이다. 이러한 갭머에 사용된 변형된 뉴클레오시드는 갭 영역 내로 도입될 때 2' 엔도(DNA 유사) 구조, 즉 RNaseH 모집을 가능하게 하는 변형을 채택하는 뉴클레오시드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 DNA 갭 영역(G)은 갭 영역 내로 도입될 때 2' 엔도(DNA 유사) 구조를 채택하는 1 내지 3개의 당 변형된 뉴클레오시드를 임의적으로 함유할 수 있다.
영역 G - "갭-브레이커(gap-breaker)"
대안적으로, 일부 RNaseH 활성을 유지하면서 갭머의 갭 영역 내로 3' 엔도 형태를 부여하는 변형된 뉴클레오시드의 삽입에 대한 많은 보고가 존재한다. 하나 이상의 3' 엔도 변형된 뉴클레오시드를 포함하는 갭 영역을 갖는 이러한 갭머를 "갭-브레이커" 또는 "갭-저해된" 갭머로서 지칭하고, 예를 들어, WO 2013/022984를 참조한다. 갭-브레이커 올리고뉴클레오티드는 갭 영역 내에 DNA 뉴클레오시드의 충분한 영역을 유지하여 RNaseH 모집을 가능하게 한다. RNaseH를 모집하는 갭-브레이커 올리고뉴클레오티드 디자인의 능력은 전형적으로 서열 또는 심지어 화합물 특이적이고 - 문헌[Rukov et al. 2015 Nucl. Acids Res. Vol. 43 pp. 8476-8487]을 참조하고, 이는 일부 예에서 표적 RNA의 보다 특이적 절단을 제공하는 RNaseH를 모집하는 "갭-브레이커" 올리고뉴클레오티드를 개시한다. 갭-브레이커 올리고뉴클레오티드의 갭 영역 내에 사용되는 변형된 뉴클레오시드는 예를 들어, 3' 엔도 형태를 부여하는 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 2'-O-메틸(OMe) 또는 2'-O-MOE(MOE) 뉴클레오시드, 또는 베타-D LNA 뉴클레오시드(뉴클레오시드의 리보스 당 고리의 C2'과 C4' 사이의 가교가 베타 형태이다), 예컨대 베타-D-옥시 LNA 또는 ScET 뉴클레오시드일 수 있다.
상기에 기재된 영역 G를 함유하는 갭머와 같이, 갭-브레이커 또는 갭-저해된 갭머의 갭 영역은 (영역 F의 3' 뉴클레오시드에 인접한) 갭의 5' 단부에 DNA 뉴클레오시드, 및 (영역 F'의 5' 뉴클레오시드에 인접한) 갭의 3' 단부에 DNA 뉴클레오시드를 갖는다. 저해된 갭을 포함하는 갭머는 전형적으로 갭 영역의 5' 단부 또는 3' 단부에 적어도 3 또는 4개의 인접 DNA 뉴클레오시드의 영역을 갖는다.
갭-브레이커 올리고뉴클레오티드의 예시적 디자인은 하기를 포함한다:
F1-8-[D3-4-E1- D 3-4]-F'1-8
F1-8- [D 1-4-E1- D 3-4]-F'1-8
F1-8- [D 3-4-E1- D 1-4]-F'1-8
상기에서, 영역 G는 괄호 [Dn-Er- Dm] 내에 존재하고, D는 DNA 뉴클레오시드의 인접 서열이고, E는 변형된 뉴클레오시드(갭-브레이커 또는 갭-저해 뉴클레오시드)이고, F 및 F'은 본원에 정의된 플랭킹 영역이되, 갭머 영역 F-G-F'의 전체 길이는 12개 이상, 예컨대 14개 이상의 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 갭 저해된 갭머의 영역 G는 6개 이상의 DNA 뉴클레오시드, 예컨대 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개의 DNA 뉴클레오시드를 포함한다. 상기에 기재된 바와 같이, DNA 뉴클레오시드는 인접할 수 있거나, 임의적으로 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드와 함께 배치될 수 있되, 갭 영역 G는 RNaseH 모집을 매개할 수 있다.
갭머 - 플랭킹 영역 F 및 F'
영역 F는 영역 G의 5' DNA 뉴클레오시드에 바로 인접하여 위치된다. 영역 F의 3'에 가장 가까운 뉴클레오시드는 당 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 고친화도 당 변형된 뉴클레오시드, 예를 들어, 2' 치환된 뉴클레오시드, 예컨대 MOE 뉴클레오시드, 또는 LNA 뉴클레오시드이다.
영역 F'은 영역 G의 3' DNA 뉴클레오시드에 바로 인접하여 위치된다. 영역 F'의 5'에 가장 가까운 뉴클레오시드는 당 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 고친화도 당 변형된 뉴클레오시드, 예를 들어, 2' 치환된 뉴클레오시드, 예컨대 MOE 뉴클레오시드, 또는 LNA 뉴클레오시드이다.
영역 F는 1 내지 8개의 인접 뉴클레오티드 길이, 예컨대 2 내지 6개, 예컨대 3 내지 4개의 인접 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 유리하게는 영역 F의 5'에 가장 가까운 뉴클레오시드는 당 변형된 뉴클레오시드이다. 일부 실시양태에서, 영역 F의 5'에 가장 가까운 2개의 뉴클레오시드는 당 변형된 뉴클레오시드이다. 일부 실시양태에서, 영역 F의 5'에 가장 가까운 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드이다. 일부 실시양태에서, 영역 F의 5'에 가장 가까운 2개의 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드이다. 일부 실시양태에서, 영역 F의 5'에 가장 가까운 2개의 뉴클레오시드는 2' 치환된 뉴클레오시드, 예컨대 2개의 3' MOE 뉴클레오시드이다. 일부 실시양태에서, 영역 F의 5'에 가장 가까운 뉴클레오시드는 2' 치환된 뉴클레오시드, 예컨대 MOE 뉴클레오시드이다.
영역 F'은 2 내지 8개의 인접 뉴클레오티드 길이, 예컨대 3 내지 6개, 예컨대 4 내지 5개의 인접 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 유리하게는, 실시양태에서, 영역 F'의 3'에 가장 가까운 뉴클레오시드는 당 변형된 뉴클레오시드이다. 일부 실시양태에서, 영역 F'의 3'에 가장 가까운 2개의 뉴클레오시드는 당 변형된 뉴클레오시드이다. 일부 실시양태에서, 영역 F'의 3'에 가장 가까운 2개의 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드이다. 일부 실시양태에서, 영역 F'의 3'에 가장 가까운 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드이다. 일부 실시양태에서. 영역 F'의 3'에 가장 가까운 2개의 뉴클레오시드는 2' 치환된 뉴클레오시드, 예컨대 2개의 3' MOE 뉴클레오시드이다. 일부 실시양태에서, 영역 F'의 3'에 가장 가까운 뉴클레오시드는 2' 치환된 뉴클레오시드, 예컨대 MOE 뉴클레오시드이다.
영역 F 또는 F'의 길이가 1인 경우, 이는 유리하게는 LNA 뉴클레오시드인 것에 유의해야 한다.
일부 실시양태에서, 영역 F 및 F'은 독립적으로 당 변형된 뉴클레오시드의 인접 서열로 이루어지거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 영역 F의 당 변형된 뉴클레오시드는 독립적으로 2'-O-알킬-RNA 단위, 2'-O-메틸-RNA, 2'-아미노-DNA 단위, 2'-플루오로-DNA 단위, 2'-알콕시-RNA, MOE 단위, LNA 단위, 아라비노 핵산(ANA) 단위 및 2'-플루오로-ANA 단위로부터 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 영역 F 및 F'은 독립적으로 LNA 및 2' 치환된 변형된 뉴클레오시드 모두를 포함한다(혼합된 윙(mixed wing) 디자인).
일부 실시양태에서, 영역 F 및 F'은 단지 하나의 유형의 당 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 단지 MOE, 단지 베타-D-옥시 LNA 또는 단지 ScET로 이루어진다. 또한, 이러한 디자인은 균일한 플랭크 또는 균일한 갭머 디자인으로 지칭된다.
일부 실시양태에서, 영역 F 또는 F', 또는 F 및 F'의 모든 뉴클레오시드는 예컨대 독립적으로 베타-D-옥시 LNA, ENA 또는 ScET 뉴클레오시드로부터 선택된 LNA 뉴클레오시드이다. 일부 실시양태에서, 영역 F는 1 내지 5개, 예컨대 2 내지 4개, 예컨대 3 내지 4개, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 인접 LNA 뉴클레오시드로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 영역 F 및 F'의 모든 뉴클레오시드는 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드이다.
일부 실시양태에서, 영역 F 또는 F', 또는 F 및 F'의 모든 뉴클레오시드는 2' 치환된 뉴클레오시드, 예컨대 OMe 또는 MOE 뉴클레오시드이다. 일부 실시양태에서, 영역 F는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 인접 OMe 또는 MOE 뉴클레오시드로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 플랭킹 영역 중 단지 하나가 2' 치환된 뉴클레오시드, 예컨대 OMe 또는 MOE 뉴클레오시드로 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 5' (F) 플랭킹 영역은 2' 치환된 뉴클레오시드, 예컨대 OMe 또는 MOE 뉴클레오시드로 이루어지는 반면에, 3' (F') 플랭킹 영역은 하나 이상의 LNA 뉴클레오시드, 예컨대 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드 또는 cET 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 3' (F') 플랭킹 영역은 2' 치환된 뉴클레오시드, 예컨대 OMe 또는 MOE 뉴클레오시드로 이루어지는 반면에, 5' (F) 플랭킹 영역은 하나 이상의 LNA 뉴클레오시드, 예컨대 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드 또는 cET 뉴클레오시드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 영역 F 및 F'의 모든 변형된 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드, 예컨대 독립적으로 베타-D-옥시 LNA, ENA 또는 ScET 뉴클레오시드로부터 선택된 LNA 뉴클레오시드이고, 여기서 영역 F 또는 F', 또는 F 및 F'은 임의적으로 DNA 뉴클레오시드를 포함할 수 있다(교호 플랭크, 세부사항은 이의 정의를 참조한다). 일부 실시양태에서, 영역 F 및 F'의 모든 변형된 뉴클레오시드는 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드이고, 여기서 영역 F 또는 F', 또는 F 및 F'은 임의적으로 DNA 뉴클레오시드를 포함할 수 있다(교호 플랭크, 세부사항은 이의 정의를 참조한다).
일부 실시양태에서, 영역 F 및 F'의 5'에 가장 가까운 뉴클레오시드 및 3'에 가장 가까운 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드, 예컨대 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드 또는 ScET 뉴클레오시드이다.
일부 실시양태에서, 영역 F와 영역 G 사이의 뉴클레오시드간 연결기는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기이다. 일부 실시양태에서, 영역 F'과 영역 G 사이의 뉴클레오시드간 연결기는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기이다. 일부 실시양태에서, 영역 F 또는 F', F 및 F'의 뉴클레오시드 사이의 뉴클레오시드간 연결기는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기이다.
또한, 갭머 디자인은 참고로 포함된 WO 2004/046160, WO 2007/146511 및 WO 2008/113832에 개시되어 있다.
LNA 갭머
LNA 갭머는, 영역 F 및 F' 중 하나 또는 둘 모두가 LNA 뉴클레오시드를 포함하거나 이로 이루어진 갭머이다. 베타-D-옥시 갭머는, 영역 F 및 F' 중 하나 또는 둘 모두가 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드를 포함하거나 이로 이루어진 갭머이다.
일부 실시양태에서, LNA 갭머는 식 [LNA]1- 5-[영역 G] -[LNA]1-5를 가지며, 여기서 영역 G는 갭머 영역 G 정의에서 정의된 바와 같다.
MOE 갭머
MOE 갭머는 영역 F 및 F'이 MOE 뉴클레오시드로 이루어진 갭머이다. 일부 실시양태에서, MOE 갭머는 디자인 [MOE]1-8-[영역 G]-[MOE] 1-8, 예컨대 [MOE]2-7-[영역 G]5-16-[MOE] 2-7, 예컨대 [MOE]3-6-[영역 G]-[MOE] 3-6의 것이고, 여기서 영역 G는 갭머 정의에서 정의된 바와 같다. 5-10-5 디자인(MOE-DNA-MOE)을 갖는 MOE 갭머가 당분야에서 널리 사용된다.
혼합된 윙 갭머
혼합된 윙 갭머는, 영역 F 및 F' 중 하나 또는 둘 모두가 2' 치환된 뉴클레오시드, 예컨대 2'-O-알킬-RNA 단위, 2'-O-메틸-RNA, 2'-아미노-DNA 단위, 2'-플루오로-DNA 단위, 2'-알콕시-RNA, MOE 단위, 아라비노 핵산(ANA) 단위 및 2'-플루오로-ANA 단위로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 2' 치환된 뉴클레오시드, 예컨대 MOE 뉴클레오시드를 포함하는, LNA 갭머이다. 영역 F 및 F' 중 하나 이상 또는 영역 F 및 F' 모두가 하나 이상의 LNA 뉴클레오시드를 포함하는 일부 실시양태에서, 영역 F 및 F'의 나머지 뉴클레오시드가 MOE 및 LNA로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 영역 F 및 F' 중 하나 이상, 또는 영역 F 및 F' 모두가 2개 이상의 LNA 뉴클레오시드를 포함하는 일부 실시양태에서, 영역 F 및 F'의 나머지 뉴클레오시드는 MOE 및 LNA로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 혼합된 윙 실시양태에서, 영역 F 및 F' 중 하나 또는 둘 모두는 하나 이상의 DNA 뉴클레오시드를 추가로 포함할 수 있다.
혼합된 윙 갭머 디자인은 WO 2008/049085 및 WO 2012/109395에 개시되어 있고, 이 둘 모두는 본원에 참고로 포함된다.
교호 플랭크 갭머
플랭킹 영역은 LNA 및 DNA 뉴클레오시드 모두를 포함할 수 있고, LNA-DNA-LNA 뉴클레오시드의 교호 모티프를 포함하기 때문에 "교호 플랭크"로서 지칭된다. 이러한 교호 플랭크를 포함하는 갭머는 "교호 플랭크 갭머"로 지칭된다. 따라서, "교호 플랭크 갭머"는 LNA 뉴클레오시드에 더하여 플랭크(F 또는 F') 중 하나 이상이 DNA를 포함하는 LNA 갭머 올리고뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 영역 F 또는 F' 중 하나 이상, 또는 영역 F 및 F' 둘 모두는 LNA 뉴클레오시드 및 DNA 뉴클레오시드 모두를 포함한다. 이러한 실시양태에서, 플랭킹 영역 F 또는 F', 또는 F 및 F' 둘 모두는, F 및/또는 F' 영역의 5'에 가장 가까운 뉴클레오시드 및 3'에 가장 가까운 뉴클레오시드가 LNA 뉴클레오시드인, 3개 이상의 뉴클레오시드를 포함한다.
교호 플랭크 LNA 갭머는 WO 2016/127002에 개시되어 있다.
교호 플랭크를 갖는 올리고뉴클레오티드는, LNA 뉴클레오시드에 더하여 플랭크(F 또는 F') 중 하나 이상이 DNA를 포함하는 LNA 갭머 올리고뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 영역 F 또는 F' 중 하나 이상, 또는 영역 F 및 F' 둘 모두는 LNA 뉴클레오시드 및 DNA 뉴클레오시드 모두를 포함한다. 이러한 실시양태에서, 플랭킹 영역 F 또는 F', 또는 F 및 F' 둘 모두는, F 및/또는 F' 영역의 5'에 가장 가까운 뉴클레오시드 및 3'에 가장 가까운 뉴클레오시드가 LNA 뉴클레오시드인, 3개 이상의 뉴클레오시드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 영역 F 또는 F' 중 하나 이상, 또는 영역 F 및 F' 둘 모두는 LNA 뉴클레오시드 및 DNA 뉴클레오시드 모두를 포함한다. 이러한 실시양태에서, 플랭킹 영역 F 또는 F', 또는 F 및 F' 둘 모두는 F 또는 F' 영역의 5'에 가장 가까운 뉴클레오시드 및 3'에 가장 가까운 뉴클레오시드가 LNA 뉴클레오시드인 3개 이상의 뉴클레오시드를 포함한다. LNA 및 DNA 뉴클레오시드 모두를 포함하는 플랭킹 영역은 LNA-DNA-LNA 뉴클레오시드의 교호 모티프를 포함하기 때문에 교호 플랭크로서 지칭된다. 교호 플랭크 LNA 갭머는 WO 2016/127002에 개시되어 있다.
교호 플랭크 영역은 3개 이하의 인접 DNA 뉴클레오시드, 예컨대 1 내지 2개, 또는 1, 2 또는 3개의 인접 DNA 뉴클레오시드를 포함할 수 있다.
교호 플랭크에 많은 LNA 뉴클레오시드(L)에 뒤따르는 많은 DNA 뉴클레오시드(D)를 나타내는 일련의 정수를 주석으로 달 수 있으며, 예를 들어, 하기와 같다:
[L]1-3-[D]1-4-[L]1-3
[L]1-2-[D]1-2-[L]1-2-[D]1-2-[L]1-2
올리고뉴클레오티드 디자인에서, 이는 흔히 숫자로서 표시되고, 예를 들어, 2-2-1은 5' [L]2-[D]2-[L] 3'을 나타내고, 1-1-1-1-1은 5' [L]-[D]-[L]-[D]-[L] 3'을 나타낸다. 교호 플랭크를 갖는 올리고뉴클레오티드의 플랭크(영역 F 및 F')의 길이는 독립적으로 3 내지 10개의 뉴클레오시드, 예컨대 4 내지 8개, 예컨대 5 내지 6개의 뉴클레오시드, 예컨대 4, 5, 6 또는 7개의 변형된 뉴클레오시드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 갭머 올리고뉴클레오티드의 플랭크 중 단지 하나가 교호하는 반면에, 나머지 하나는 LNA 뉴클레오티드로 구성된다. 3' 플랭크(F')의 3' 단부에서 2개 이상의 LNA 뉴클레오시드를 가져 추가적 엑소 뉴클레아제 내성을 부여하는 것이 유리할 수 있다. 교호 플랭크를 갖는 올리고뉴클레오티드의 일부 예는 하기와 같다:
[L]1-5-[D]1-4-[L]1-3-[G]5-16-[L]2-6
[L]1-2-[D]1-2-[L]1-2-[D]1-2-[L]1-2-[G]5-16-[L]1-2-[D]1-3-[L]2-4
[L]1-5-[G]5-16-[L]-[D]-[L]-[D]-[L]2
여기서, 갭머의 전체 길이는 12개 이상, 예컨대 14개 이상의 뉴클레오티드 길이를 갖는다.
올리고뉴클레오티드의 영역 D' 또는 D''
본 발명의 올리고뉴클레오티드는, 일부 실시양태에서, 표적 핵산에 상보성인 올리고뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 서열, 예컨대 갭머 F-G-F', 및 추가적 5' 및/또는 3' 뉴클레오시드를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 추가적 5' 및/또는 3' 뉴클레오시드는 표적 핵산에 완전히 상보성이지 않거나 완전히 상보성일 수 있다. 이러한 추가적 5' 및/또는 3' 뉴클레오시드는 본원에서 영역 D' 및 D''으로 지칭될 수 있다.
영역 D' 또는 D''의 추가는 인접 뉴클레오티드 서열, 예컨대 갭머를 접합체 모이어티 또는 또 다른 작용기에 연결하기 위한 목적으로 사용될 수 있다. 인접 뉴클레오티드 서열을 접합체 모이어티와 연결하기 위해 사용될 때, 생체절단성 연결기로서 작용할 수 있다. 대안적으로, 이는 엑소뉴클레아제 보호를 제공하거나 합성 또는 제조의 용이성을 위해 사용될 수 있다.
영역 D' 및 D''은 각각 영역 F의 5' 단부 또는 영역 F'의 3' 단부에 부착하여 식 D'-F-G-F', F-G-F'-D'' 또는 D'-F-G-F'-D''의 디자인을 생성할 수 있다. 이러한 예에서, F-G-F'은 올리고뉴클레오티드의 갭머 부분이고, 영역 D' 또는 D''은 올리고뉴클레오티드의 별개의 부분을 구성한다.
영역 D' 또는 D''은 독립적으로 1, 2, 3, 4 또는 5개의 추가적 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 이루어질 수 있고, 이는 표적 핵산에 상보성이거나 비-상보성일 수 있다. F 또는 F' 영역에 인접한 뉴클레오티드는 당-변형된 뉴클레오티드, 예컨대 DNA 또는 RNA, 또는 이의 염기 변형된 버전이 아니다. D' 또는 D' 영역은 생체절단성 연결기에 민감한 뉴클레아제로서 작용할 수 있다(연결기의 정의 참조). 일부 실시양태에서, 추가적 5' 및/또는 3' 단부 뉴클레오티드는 포스포다이에스터 연결기와 연결되고, DNA 또는 RNA이다. 영역 D' 또는 D''으로서 사용하기에 적합한 뉴클레오티드 기반 생체절단성 연결기는 WO 2014/076195에 개시되어 있고, 이는 예로서 포스포다이에스터 연결된 DNA 다이뉴클레오티드를 포함한다. 폴리-올리고뉴클레오티드 구축물에서 생체절단성 연결기의 사용은 WO 2015/113922에 개시되어 있고, 여기서 이는 단일 올리고뉴클레오티드 내에서 다수의 안티센스 구축물(예를 들어, 갭머 영역)을 연결하는 데 사용된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 갭머를 구성하는 인접 뉴클레오티드 서열에 더하여 영역 D' 및/또는 D''을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 하기 식으로 표현될 수 있다:
F-G-F'; 특히 F1-8-G5-16-F'2-8
D'-F-G-F', 특히 D'1-3-F1-8-G5-16-F'2-8
F-G-F'-D'', 특히 F1-8-G5-16-F'2-8-D''1-3
D'-F-G-F'-D'', 특히 D'1-3- F1-8-G5-16-F'2-8-D''1-3
일부 실시양태에서, 영역 D'과 영역 F 사이에 위치한 뉴클레오시드간 연결기는 포스포다이에스터 연결기이다. 일부 실시양태에서, 영역 F'과 영역 D'' 사이에 위치한 뉴클레오시드간 연결기는 포스포다이에스터 연결기이다.
접합체
본원에 사용된 용어 접합체는 비-뉴클레오티드 모이어티(접합체 모이어티 또는 영역 C 또는 제3 영역)에 공유결합으로 연결되는 올고뉴클레오티드를 지칭한다.
하나 이상의 비-뉴클레오티드 모이어티에 대한 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 접합은 예를 들어, 올리고뉴클레오티드의 활성, 세포 분포, 세포 섭취 또는 안정성에 영향을 미침으로써 올리고뉴클레오티드의 약리학을 개선할 수 있다. 일부 실시양태에서, 접합체 모이어티는 올리고뉴클레오티드의 세포 분포, 생체이용률, 대사, 배설, 투과성 및/또는 세포 섭취를 개선함으로써 올리고뉴클레오티드의 약동학 특성을 변형하거나 증진시킨다. 특히, 접합체는 올리고뉴클레오티드를 특정 기관, 조직 또는 세포 유형에 표적화하여 상기 기관, 조직 또는 세포 유형에서 올리고뉴클레오티드의 효능을 증진시킬 수 있다. 동시에, 접합체는 비-표적 세포유형, 조직 또는 기관에서 올리고뉴클레오티드의 활성, 예를 들어, 오프(off) 표적 활성 또는 비-표적 세포유형, 조직 또는 기관에서의 활성을 감소시키는 작용을 할 수 있다. 본원에 참고로 포함된 WO 93/07883 및 WO 2013/033230은 적합한 접합체 모이어티를 제공한다. 추가로 적합한 접합체 모이어티는 아시알로 당단백질 수용체(ASGPr)에 결합할 수 있는 것이다. 특히, 3가 N-아세틸갈락토사민 접합체 모이어티가 ASGPr에 대한 결합에 적합하고, 예를 들어, 본원에 참고로 포함된 WO 2014/076196, WO 2014/207232 및 WO 2014/179620(특히 WO 2014/076196의 도 13 또는 WO 2014/179620의 청구항 158 내지 청구항 164)을 참조한다.
또한, 올리고뉴클레오티드 접합체 및 이의 합성이 문헌[Manoharan, Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications, S.T. Crooke, ed., Ch. 16, Marcel Dekker, Inc., 2001] 및 [Manoharan, Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 2002, 12, 103]에 보고되어 있고, 이들 각각은 그 전문이 본원에 포함된다.
한 실시양태에서, 비-뉴클레오티드 모이어티(접합체 모이어티)는 탄수화물, 세포 표면 수용체 리간드, 약물 물질, 호르몬, 친유성 물질, 중합체, 단백질, 펩티드, 독소(예를 들어, 박테리아 독소), 비타민, 바이러스 단백질(예를 들어, 캡시드) 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
연결기
연결기는 하나의 해당 화학적 기 또는 분절을 하나 이상의 공유결합을 통해 다른 해당 화학적 기 또는 분절에 연결하는 2개의 원자 사이의 결합이다. 접합체 모이어티는 직접적으로 또는 연결 모이어티(예를 들어, 연결기 또는 테더)를 통해 올리고뉴클레오티드에 부착될 수 있다. 연결기는 제3 영역, 예를 들어, 접합체 모이어티(영역 C)를 제1 영역, 예를 들어, 표적 핵산에 상보성인 올리고뉴클레오티드 또는 인접 뉴클레오티드 서열(영역 A)에 공유결합으로 연결하여 영역 A의 말단 중 하나를 영역 C에 연결시키는 역할을 한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 본 발명의 접합체 또는 올리고뉴클레오티드 접합체는 표적 핵산에 상보성인 올리고뉴클레오티드 또는 인접 뉴클레오티드 서열(영역 A 또는 제1 영역)과 접합체 모이어티(영역 C 또는 제3 영역) 사이에 위치되는 연결기 영역(제2 영역 또는 영역 B 및/또는 영역 Y)을 포함할 수 있다.
영역 B는 포유류 신체 내에서 통상적으로 맞닥뜨리거나 통상적으로 맞닥뜨리는 것과 유사한 조건 하에 절단성인 생리학적으로 불안정한 결합을 포함하거나 이로 이루어진 생체절단성 연결기를 지칭한다. 생리학적으로 불안정한 연결기가 화학적 변형(예컨대, 절단)을 겪는 조건은 포유류 세포에서 발견되거나 포유류 세포에서 맞닥뜨리는 바와 유사한 pH, 온도, 산화 또는 환원 조건 또는 약품, 및 염 농도와 같은 화학적 조건을 포함한다. 포유류 세포내 조건은 또한 포유류 세포에 통상적으로 존재하는 효소적 활성, 예컨대 단백질 분해 효소 또는 가수분해 효소 또는 뉴클레아제로부터의 효소적 활성의 존재를 포함한다. 한 실시양태에서, 생체절단성 연결기는 S1 뉴클레아제 절단에 민감하다. 바람직한 실시양태에서, 뉴클레아제 민감성 연결기는 2개 이상의 연속적인 포스포다이에스터 연결기, 예컨대 적어도 3, 4 또는 5개의 연속적인 포스포다이에스터 연결기를 포함하는 1 내지 10개의 뉴클레오시드, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 뉴클레오시드, 더욱 바람직하게는 2 내지 6개의 뉴클레오시드, 가장 바람직하게는 2 내지 4개의 연결된 뉴클레오시드를 포함한다. 바람직하게는, 뉴클레오시드는 DNA 또는 RNA이다. 포스포다이에스터 함유 생체절단성 연결기는 WO 2014/076195(본원에 참고로 포함됨)에 더욱 상세히 기술되어 있다.
또한, 접합체는 비-생체절단성 연결기를 통해 올리고뉴클레오티드에 연결될 수 있거나, 일부 실시양태에서, 접합체는 생체절단성 연결기(영역 Y)에 공유결합으로 부착된 비-절단성 연결기를 포함할 수 있다. 반드시 생체절단성인 것은 아니나 주로 접합체 모이어티(영역 C 또는 제3 영역)를 올리고뉴클레오티드(영역 A 또는 제1 영역)에 공유결합으로 연결하는 연결기는 반복 단위, 예컨대 에틸렌 글리콜, 아미노산 단위 또는 아미노 알킬 기의 쇄 구조 또는 또는 올리고머를 포함할 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드 접합체는 영역 원소 A-C, A-B-C, A-B-Y-C, A-Y-B-C 또는 A-Y-C로 구축될 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-절단성 연결기(영역 Y)는 아미노 알킬, 예컨대 C2 내지 C36 아미노 알킬 기, 예를 들어, C6 내지 C12 아미노 알킬 기이다. 바람직한 실시양태에서, 연결기(영역 Y)는 C6 아미노 알킬 기이다. 접합체 연결기는 아미노 변형된 올리고뉴클레오티드 및 접합체 기 상의 활성화된 에스터 기의 사용을 통해 올리고뉴클레오티드에 통상적으로 부착될 수 있다.
HTRA1
본원에 사용된 용어 "HTRA1"은 달리 지시되지 않는 한 임의의 포유류 공급원, 예컨대 영장류(예를 들어, 인간) 및 설치류(예를 들어, 마우스 및 래트)로부터의 포유류, 예컨대 영장류 또는 인간 고온 리콰이어먼트 A1 단백질을 지칭한다. 상기 용어는 "전장" 미처리 HTRA1 및 세포에서 처리로부터 야기된 임의의 형태의 HTRA1을 포함한다. 또한, 상기 용어는 HTRA1의 천연-발생 변이체, 예를 들어, 스플라이스 변이체 또는 대립형질 변이체를 포함한다. 인간 HTRA1의 유니프롯(UniProt) 수탁 번호는 Q92743이다. 예시적 인간 HTRA1의 아미노산 서열을 하기 서열번호 1에 나타냈다.
서열번호 1:
예시적 영장류 HTRA1의 아미노산 서열을 서열번호 2(마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis))에 나타냈다. 마카카 물라타(Macaca mulatta) HTRA1 아미노산 서열은 유니프롯 수탁 번호 H9FX91에 개시된다.
서열번호 2:
또한, HTRA1은 프로테아제, 세린, 11(IGF 결합)(PRSS11), ARMD7, HtrA 및 IGFBP5-프로테아제로서 당분야에 공지되어 있다. 또한, 용어 "HTRA1"은 천연 서열 HtrA1 폴리펩티드, 예컨대 서열번호 1 또는 서열번호 2에 대해 약 90% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 활성 HtrA1 폴리펩티드를 의미하는 "HTRA1 변이체"를 포함한다. 통상적으로, HTRA1 변이체는 천연 HTRA1 서열, 예를 들어, 서열번호 1 또는 서열번호 2에 대해 약 95% 이상의 아미노산 서열 동일성, 약 98% 이상의 아미노산 서열 동일성 또는 약 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가질 것이다.
용어 "HTRA1 mRNA 길항제"는 HTRA1 핵산, 예컨대 mRNA(HTRA1 mRNA 또는 pre-mRNA를 포함함)를 표적화하는 HTRA1 길항제를 지칭하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, HTRA1 mRNA 길항제는 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA 및 shRNA 또는 리보자임이다.
HTRA1 mRNA 길항제는 HTRA1 표적 핵산을 발현하는 세포에서 HTRA1 표적 핵산의 발현을 억제할 수 있다. 유리하게는, HTRA1 mRNA 길항제는, 올리고뉴클레오티드 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열에 걸쳐 측정시, 올리고뉴클레오티드의 핵염기의 인접 서열이 HTRA1 표적 핵산에 상보성인, 예컨대 완전히 상보성인, 올리고뉴클레오티드이거나 이를 포함한다. HTRA1 표적 핵산은 일부 실시양태에서, RNA 또는 DNA, 예컨대 메신저 RNA, 예컨대 성숙 mRNA 또는 pre-mRNA일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산은 포유류 HTRA1 단백질, 예컨대 인간 HTRA1, 예를 들어, 인간 HTRA1 mRNA 서열(예컨대 서열번호 3 또는 4로서 개시됨)을 암호화하는 RNA이다. 예시적 표적 핵산에 대한 추가 정보는 하기 표 1 및 2에 제공된다.
종 | Chr. | 가닥 | 게놈 좌표 |
어셈블리 | mRNA에 대한 NCBI 기준 서열* 수탁 번호 | |
개시 | 종결 | |||||
인간 | 10 | fwd | 122461525 | 122514908 | GRCh38.p2 release 107 | NM_002775.4 |
시노 | 9 | fwd | 121764994 | 121817518 | Macaca_fascicularis_5.0 | NC_022280.1** |
Fwd = 정방향 가닥. 게놈 좌표는 pre-mRNA 서열(게놈 서열)을 제공한다. NCBI 기준은 mRNA 서열(cDNA 서열)을 제공한다. *미국 국립 생물정보센터(The National Center for Biotechnology Information) 기준 서열 데이터베이스는 게놈, 전사체 및 단백질을 비롯한 포괄적이고 통합되고 중복되지 않고 주석이 달린 기준 서열의 집합이다. 이는 url[www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq]에서 호스팅된다. **NCBI 기준 서열에서, 동일성이 공지되지 않은 위치 126에서 위치 227까지의 100개의 뉴클레오티드의 스트레치가 존재한다. 서열번호 5 및 6에서, 상기 스트레치는 상기 영역에서 인간 및 마카카 물라타 HTRA1 premRNA 서열 모두에서 나타나는 뉴클레오티드에 의해 대체되었다. |
종 | RNA 유형 | 길이 (nt) | 서열번호 |
인간 | mRNA | 2138 | 3 |
인간 | premRNA | 53384 | 4 |
시노 | mRNA | 2123 | 5 |
시노 | premRNA | 52575 | 6 |
HTRA1의 올리고뉴클레오티드 길항제
PCT/EP2017/065937 및 EP17173964.2(이들 둘 모두는 그 전문이 참고로 포함됨)는 HTRA1 mRNA의 강한 생체내 억제제인 많은 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 이의 치료적 용도, 예컨대 황반 변성을 치료하는 용도를 개시하고, 이는 본 발명에서 사용될 수 있다.
HTRA1 mRNA 길항제는 포유류 HTRA1 핵산, 예컨대 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 또는 서열번호 6에 90% 이상 상보성인, 예컨대 완전히 상보성인 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이를 갖는 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA일 수 있다.
유리하게는, HTRA1 mRNA 길항제는 LNA 안티센스 올리고뉴클레오티드, 예컨대 LNA 갭머 올리고뉴클레오티드이다.
일부 실시양태에서, HTRA1 mRNA 길항제, 예컨대 안티센스 올리고뉴클레오티드, 예컨대 LNA 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 갭머 올리고뉴클레오티드는 하기 서열번호 7에 대해 90% 이상, 예컨대 100% 상보성인 10 내지 22개의 뉴클레오티드 길이를 갖는 인접 뉴클레오티드 영역을 포함한다:
서열번호 7: 5' CCAACAACCAGGTAAATATTTG 3'
일부 실시양태에서, HTRA1 mRNA 길항제, 예컨대 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA, 예컨대 LNA 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 갭머 올리고뉴클레오티드는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 존재하는 12개 이상의 인접 뉴클레오티드 길이를 갖는 인접 뉴클레오티드 영역을 포함한다:
서열번호 8: CAAATATTTACCTGGTTG
서열번호 9: TTTACCTGGTTGTTGG
서열번호 10: CCAAATATTTACCTGGTT
서열번호 11: CCAAATATTTACCTGGTTGT
서열번호 12: ATATTTACCTGGTTGTTG
서열번호 13: TATTTACCTGGTTGTT
서열번호 14: ATATTTACCTGGTTGT
서열번호 15: ATATTTACCTGGTTGTT
일부 실시양태에서, HTRA1 mRNA 길항제(안티센스 올리고뉴클레오티드)는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드이거나 이를 포함한다:
CsAsAsAstsastststsascscstsgsGsTsTsG(서열번호 8, 화합물 번호 8,1)
TsTstsascscstsgsgststsgstsTsGsG(서열번호 9, 화합물 번호 9,1)
CsCsAsAsastsastststsascscstsgsGsTsT(서열번호 10, 화합물 번호 10,1)
CsCsAsasastsastststsascscstsgsgststsGsT(서열번호 11, 화합물 번호 11,1)
AsTsAstststsascscstsgsgststsgsTsTsG(서열번호 12, 화합물 번호 12,1)
TsAsTststsascscstsgsgstsTsGsTsT(서열번호 13, 화합물 번호 13,1)
TsAstststsascscstsgsGstsTsgsTsT(서열번호 13, 화합물 번호 13,2)
TsAsTststsascscstsgsgsTsTsgsTsT(서열번호 13, 화합물 번호 13,3)
AsTsAsTststsascscstsgsgsTsTsGsT(서열번호 14, 화합물 번호 14,1)
AstsAsTsTstsascscstsgsgstsTsGsT(서열번호 14, 화합물 번호 14,2)
AstsAsTststsascscstsgsGsTsTsgsTsT(서열번호 15, 화합물 번호 15,1)
AsTsAstststsascscstsgsGstsTsgsTsT(서열번호 15, 화합물 번호 15,2)
AstsAsTststsascscstsgsgstsTsGsTsT(서열번호 15, 화합물 번호 15,3)
상기에서, 대문자는 베타-D 옥시 LNA 뉴클레오시드 단위를 나타내고, 소문자는 DNA 뉴클레오시드 단위를 나타내고, 아래첨자 s는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기를 나타내고, 모든 LNA 사이토신은 5-메틸 사이토신이다.
일부 실시양태에서, HTRA1 mRNA 길항제는 식 5' TsAsTststsascscstsgsgstsTsGsTsT 3'(서열번호 13) 또는 5' AstsAsTststsascscstsgsgstsTsGsTsT 3'(서열번호 15)의 LNA 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이거나 이를 포함하되, 여기서 대문자는 베타-D 옥시 LNA 뉴클레오시드 단위를 나타내고, 소문자는 DNA 뉴클레오시드 단위를 나타내고, 아래첨자 s는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기를 나타내고, 모든 LNA 사이토신은 5-메틸 사이토신이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이를 갖되, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 HTRA1 핵산을 표적화하고, 하기 서열번호 16에 90% 이상, 예컨대 100% 상보성인 10 내지 22개의 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함한다:
서열번호 16:
일부 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 하기 서열번호 17, 18 및 19 중 어느 하나로부터 선택된 인접 뉴클레오티드 영역, 또는 이의 12개 이상의 인접 뉴클레오티드이거나 이를 포함한다:
CTTCTTCTATCTACGCAT(서열번호 17)
TACTTTAATAGCTCAA(서열번호 18)
TTCTATCTACGCATTG(서열번호 19)
일부 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 하기로부터 선택된 인접 뉴클레오티드 영역이거나 이를 포함한다:
CTTCttctatctacgcAT(서열번호 17)
TACTttaatagcTCAA(서열번호 18)
TTCtatctacgcaTTG(서열번호 19)
상기에서, 대문자는 LNA 뉴클레오티드이고, 소문자는 DNA 뉴클레오시드이고, 사이토신 잔기는 임의적으로 5-메틸 사이토신이다.
일부 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 하기로부터 선택된 인접 뉴클레오티드 영역이거나 이를 포함한다:
mCsTsTs mCststscstsastscstsas mcsgscsAsT(서열번호 17, 화합물 번호 17)
TsAs mCsTststsasastsasgscsTs mCsAsA(서열번호 18, 화합물 번호 18)
TsTs mCstsastscstsas mcsgscsasTsTsG(서열번호 19, 화합물 번호 19)
상기에서, 대문자는 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드를 나타내고, 소문자는 DNA 뉴클레오시드를 나타내고, 아래첨자 s는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기를 나타내고, mC는 5 메틸 사이토신 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드를 나타내고, mc는 5 메틸 사이토신 DNA 뉴클레오시드를 나타낸다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 또는 본 발명에 따른 방법에서 사용하기 위한 HTRA1 mRNA 길항제인 예시적 LNA 안티센스 올리고뉴클레오티드 화합물에 대해 도 1, 2, 3, 4 및 5를 참조한다.
안구 질환 및 HTRA1 연관된 질환
본원에서 사용된 용어 "HtrA1 연관된 질환"은 광의로 비정상적인 HTRA1 발현 또는 활성을 포함하는 HTRA1 발현 또는 활성과 연관된 임의의 장애 또는 질환을 지칭한다. 일부 실시양태에서, HTRA1 연관된 질환은, 비정형 증상이 신체에 국소적으로(예를 들어, 눈에) 및/또는 전신으로 HTRA1의 수준 또는 활성에 기인하여 나타날 수 있는, 과잉의 HTRA1 수준 또는 활성과 연관된다. 예시적 HTRA1 연관된 질환은 HTRA1 연관된 안구 질환을 포함하고, 이는 비제한적으로 예를 들어, 연령-관련 황반 변성(AMD), 예컨대 습성(삼출성) AMD(예컨대 초기, 중기 및 후기 습성 AMD) 및 건성(비-삼출성) AMD(예컨대 초기, 중기 및 후기 건성 AMD(예를 들어, 지도모양위축(GA))를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "안구 질환"은 비제한적으로 안구 질환, 예컨대 황반 변성 질환, 예컨대 연령-관련 황반 변성(AMD), 예컨대 습성(삼출성) AMD(예컨대 초기, 중기 및 후기 습성 AMD) 및 건성(비-삼출성) AMD(예컨대 초기, 중기 및 후기 건성 AMD(예를 들어, 지도모양위축(GA)); 당뇨병성 망막증(DR) 및 기타 허혈-관련 망막증; 내안구염; 포도막염; 맥락막 혈관신생(CNV); 미숙아 망막증(ROP); 폴립모양 맥락막 혈관병(PCV); 당뇨병성 황반 부종; 병리학적 근시; 본 힙펠-린도우병(von Hippel-Lindau disease); 눈 히스토플라스마증; 망막중심정맥 폐색(CRVO); 각막 혈관신생; 및 망막 혈관신생을 포함한다. 일부 실시양태에서, 안구 질환은 AMD(예를 들어, GA)이다.
개체
"대상체" 또는 "개체"는 포유동물이다. 포유동물은 영장류(예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이) 및 설치류(예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 대상체 또는 개체는 인간이다. "개체"는 "환자"일 수 있거나(여기서 환자는 치료가 필요한 인간 개체임), HTRA1 연관된 질환, 예컨대 안구 질환을 앓는 개체일 수 있다(여기서 개체는 HTRA1 연관된 질환, 예컨대 안구 질환의 발병 위험이 있음).
일부 실시양태에서, 환자는 안구 질환, 예컨대 본원에 열거된 안구 질환, 예컨대 AMD, 당뇨병성 망막증, 미숙아 망막증 또는 폴립모양 맥락막 혈관병으로 이루어진 군으로부터 선택된 안구 질환을 진단 받은 개체이다. 일부 실시양태에서, 안구 질환은 초기 건성 AMD, 중기 건성 AMD 또는 후기 건성 AMD로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 안구 질환은 지도모양위축이다.
일부 실시양태에서, 환자는 안구 질환, 예컨대 본원에 열거된 것, 예컨대 AMD, 당뇨병성 망막증, 미숙아 망막증 또는 폴립모양 맥락막 혈관병으로 이루어진 군으로부터 선택된 안구 질환의 발병 위험이 있는 것으로 확인된 개체이다. 일부 실시양태에서, 안구 질환은 초기 건성 AMD, 중기 건성 AMD 또는 후기 건성 AMD으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 안구 질환은 지도모양위축이다.
일부 실시양태에서, 환자는 안방수 또는 유리액의 상승된 HTRA1 수준을 갖는 개체이다. 일부 실시양태에서, 환자는 HTRA1 연관된 질환을 진단 받은 개체 또는 HTRA1 연관된 질환의 발병 위험이 있는 것으로 확인된 개체이다. 따라서, 환자는, 안방수 또는 유리액의 상승된 HTRA1 수준을 갖고 임의적으로 증상이 없을 수 있는 개체일 수 있다.
일부 실시양태에서, 환자는 HTRA1 유전자 또는 HTRA1 조절 서열에서 하나 이상의 질병 연관된 다형성, 예컨대 HTRA1 프로모터 다형성 rs11200638(G/A)을 갖는 개체일 수 있다(예를 들어, 그 전문이 본원에 참고로 포함된 문헌[DeWan et al., Science 314: 989-992, 2006] 참조). 따라서, 환자는, HTRA1 유전자 또는 HTRA1 조절 서열에서 질병 연관된 다형성을 갖고 임의적으로 증상이 없을 수 있는 개체일 수 있다.
약학 염
치료적 사용을 위해, 본 발명의 방법 또는 용도에 따라 사용되는 HTRA1 mRNA 길항제, 예컨대 HTRA1을 표적화하는 올리고뉴클레오티드는 적합한 약학 염, 예컨대 나트륨 또는 칼륨 염으로서 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 나트륨 염이다.
약학 조성물
추가적 양상에서, 본 발명은 임의의 전술된 올리고뉴클레오티드 및/또는 올리고뉴클레오티드 접합체, 및 약학적으로 허용되는 희석제, 담체, 염 및/또는 보조제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 약학적으로 허용되는 희석제는 포스페이트-완충된 염수(PBS)를 포함하고, 약학적으로 허용되는 염은 비제한적으로 나트륨 및 칼륨 염을 포함한다. 일부 실시양태에서, 약학적으로 허용되는 희석제는 멸균 포스페이트-완충된 염수이다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 약학적으로 허용되는 희석제 중에서 50 내지 300 μM 농도의 용액으로 사용된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 10 내지 1000 μg의 투여량으로 투여된다.
WO 2007/031091은 약학적으로 허용되는 희석제, 담체 및 보조제의 적합하고 바람직한 예를 제공한다(본원에 참고로 포함됨). 적합한 투여량, 제형, 투여 경로, 조성, 투여량 형태, 다른 치료제와의 조합, 전구약물 제형이 또한 WO 2007/031091에 제공되어 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 접합체는 약학 조성물 또는 제형의 제조를 위해 활성이거나 불활성인 약학적으로 허용되는 물질과 혼합될 수 있다. 조성물 및 약학 조성물의 제조 방법은 투여 경로, 질병의 정도 또는 투여할 양을 포함하는 많은 기준에 좌우된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 접합체는 전구약물이다. 특히 올리고뉴클레오티드 접합체에 관하여, 접합체 모이어티는 전구약물이 작용 부위, 예를 들어, 표적 세포에 전달된 후에 올리고뉴클레오티드로부터 절단된다.
투여
HTRA1 mRNA 길항제는 국소적으로(예컨대 흡입에 의해, 피부, 눈 또는 귀에), 장관내로(예컨대 경구적으로 또는 위장관을 통해) 또는 비경구적으로(예컨대 정맥내, 피하, 근육내, 대뇌내, 뇌실내 또는 경막내) 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, HTRA1 mRNA 길항제는 정맥내, 동맥내, 피하, 복강내 또는 근육내 주사 또는 주입, 경막내 또는 두개내(예를 들어, 대뇌내) 또는 심실내 투여를 포함하는 비경구적 경로에 의해 투여된다. 일부 실시양태에서, 활성 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 접합체는 정맥내 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 활성 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 접합체는 피하 투여된다.
안구 질환의 치료에서 사용하기 위해, HTRA1 mRNA 길항제, 예를 들어, 본원에 기재된 LNA 올리고뉴클레오티드가 안내 주사로 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 약 10 내지 약 200 μg/눈, 예컨대 약 50 내지 약 150 μg/눈, 예컨대 약 100 μg/눈의 투여량으로 안내 주사를 통해 투여된다. 일부 실시양태에서, 투여량 간격, 즉, 연속적인 투여 사이의 기간은 적어도 1개월에 1회, 예컨대 적어도 2개월에 1회 또는 적어도 3개월에 1회이다.
샘플의 HTRA1의 수준의 결정
유리체 또는 안방수, 유리하게는 안방수의 샘플은 개체로부터 수득된다. 샘플에 존재하는 HTRA1의 수준은 당분야의 임의의 공지된 방법에 의해, 적합하게는 면역 분석으로 항-HTRA1 항체의 사용을 통해, 또는 질량 분석의 사용을 통해 결정될 수 있다.
일부 실시양태에서, HTRA1 단백질 수준은 질량 분석을 사용하여 결정된다.
일부 실시양태에서, HTRA1 단백질의 수준은 HTRA1 특이적 항체를 사용하는 면역 분석을 사용하여 결정된다.
일부 실시양태에서, HTRA1 단백질 수준은 HTRA1 항체 포착 후에 LC-MS를 사용하여 결정된다.
일부 실시양태에서, HTRA1 단백질 수준은 개체의 유리체 또는 안방수의 샘플로부터 수득한 면역-포착된 HTRA1의 프로테아제, 예를 들어, 트립신에 의해 소화된 단백질 샘플의 LC-MS를 통해 결정된다. 면역-포착된 HTRA1을 소화시키는 데 사용될 수 있는 다른 프로테아제는 LysC, AspN, GluC를 포함한다.
일부 실시양태에서, HTRA1 단백질은 HTRA1 항체를 사용하여 샘플로부터, 예컨대 면역 포착 효소-연결된 면역 흡착 분석(ELISA)을 통해 또는 웨스턴 블롯을 통해 면역 포착된다.
HTRA1의 수준과 하나 이상의 기준 샘플의 비교
상기에 설명한 바와 같이, HTRA1 과발현은 많은 안구 질환, 예컨대 AMD, 예컨대 초기 건성 AMD, 중기 건성 AMD 또는 후기 건성 AMD, 예컨대 지도모양위축과 연관된다. 따라서, 단계 ii)에서 본 발명의 방법은, 단계 i)에서 수득한 HTRA1 수준(예를 들어, HTRA1 단백질 수준)과, 안구 질환을 앓지 않거나 HTRA 1 유전자(HTRA 대조군 영역을 포함함)에서 질병 연관된 다형성을 갖는 건강한 개체(음성 대조군 개체)의 하나 이상의 기준 값, 또는 상기 건강한 개체(음성 대조군 개체)의 집단으로부터 수득한 평균 또는 평균 기준 값의 비교를 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 단계 ii)는 단계 ii)에서 수득한 HTRA1 수준(예를 들어, HTRA1 단백질 수준)과, HTRA1 연관된 안구 질환을 진단 받거나 HTRA1 과발현을 특징으로 하고/하거나 HTRA 1 유전자(HTRA 대조군 영역을 포함함)에서 질병 연관된 다형성을 갖는 것을 특징으로 하는 개체(즉, 양성 대조군)의 HTRA1 수준의 하나 이상의 기준 값의 비교를 포함할 수 있다. 음성 대조군 개체과 비교하여 상승되고/되거나 양성 대조군 값과 비슷하거나 동등한 HTRA1 수준은, 개체가 HTRA1 mRNA 길항제에 의한 치료에 적합할 가능성이 있거나 적합하다는 지표이다.
추가적 실시양태에서, 양성 및/또는 음성 대조군 값에 더하여, 동일한 개별적 개체로부터 이전에 수득한 값을 사용할 수 있다. 따라서, 기준 샘플은 동일한 개체로부터 이전에 수득한 역사적 값을 포함할 수 있다. 단계 i)에서 수득한 HTRA1 수준을 동일한 개체의 역사적 값과 비교함으로써 HTRA1 mRNA 길항제 요법의 효능의 모니터링이 가능해지고, 따라서 HTRA1 mRNA 길항제의 유효 투여량을 결정하는 데 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 일부 실시양태에서, HTRA1 mRNA 길항제 요법의 목적은 완전한 억제를 달성하기보다는 HTRA1 수준을 본질적으로 정상화시키는 것이다. 따라서, 본 발명의 방법 또는 용도는 HTRA1 치료 전에, 동안에 또는 후에 HTRA1 수준의 환자 모니터링을 위해 사용될 수 있고, 예를 들어, HTRA1 mRNA 길항제의 투약 투여량 사이에 사용되어 예를 들어, 치료의 효능을 최적화시키는 투여량의 조절을 가능하게 한다.
본 발명의 추가적 실시양태
1. HTRA1 mRNA 길항제 투여에 대한 개체의 치료의 적합성을 결정하는 방법으로서, 상기 방법은
i) 상기 개체로부터 수득한 안방수 또는 유리액의 샘플의 HTRA1의 수준을 결정하는 단계, 및
ii) 상기 단계 i)에서 수득한 HTRA1의 수준을 하나 이상의 기준 샘플 또는 기준 값과 비교하여 상기 개체가 HTRA1 mRNA 길항제에 의한 치료에 적합할 가능성이 있거나 적합한지를 결정하는 단계
를 포함하고,
상기 개체는 안구 질환, 예컨대 황반 변성을 앓거나 이의 발병 위험이 있는, 방법.
2. 안방수 또는 유리액의 샘플의 HTRA1의 수준이 상기 샘플의 HTRA1 단백질의 수준을 정량화함으로써 결정되는, 실시양태 1에 따른 방법.
3. HTRA1 단백질의 수준이 예컨대 특이적 항체를 사용하는 면역 분석을 사용하여 결정되는, 실시양태 2에 따른 방법.
4. HTRA1 단백질의 수준이 질량 분석을 사용하여, 예컨대 HTRA1 항체 포착 후에 LC-MS를 통해 결정되는, 실시양태 3에 따른 방법.
5. 하나 이상의 기준 샘플 또는 기준 값이 황반 변성을 앓는 대조군 개체로부터 수득되는, 실시양태 1 내지 4 중 어느 하나에 따른 방법.
6. 하나 이상의 기준 샘플 또는 기준 값이 황반 변성을 앓지 않는 대조군 개체로부터 수득되는, 실시양태 1 내지 5 중 어느 하나에 따른 방법.
7. 하나 이상의 기준 샘플이 치료의 적합성이 평가되는 동일한 개체로부터 이전에 수득한 값인, 실시양태 1 내지 6 중 어느 하나에 따른 방법.
8. 기준 값이 망막의 HTRA1 농도와 안방수 또는 유리액의 HTRA1 농도 사이의 상관관계를 모델링하는 데이터 세트로부터 유도되는, 실시양태 1 내지 7 중 어느 하나에 따른 방법.
9. HTRA1 mRNA 길항제가 HTRA1 mRNA 또는 pre-mRNA를 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, HTRA1 mRNA를 표적화하는 siRNA, 및 HTRA1 mRNA 또는 pre-mRNA를 표적화하는 리보자임으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 실시양태 1 내지 8 중 어느 하나에 따른 방법.
10. 개체가 망막, 예컨대 망막 상피 세포의 증진된 HTRA1 mRNA 또는 HTRA1 단백질 발현을 갖는, 실시양태 1 내지 9 중 어느 하나에 따른 방법.
11. 개체가 황반 변성 질환, 예컨대 연령-관련 황반 변성(AMD), 예컨대 습성(삼출성) AMD(예컨대 초기, 중기 및 후기 습성 AMD) 및 건성(비-삼출성) AMD(예컨대 초기, 중기 및 후기 건성 AMD(예를 들어, 지도모양위축(GA)); 당뇨병성 망막증(DR) 및 기타 허혈-관련 망막증; 내안구염; 포도막염; 맥락막 혈관신생(CNV); 미숙아 망막증(ROP); 폴립모양 맥락막 혈관병(PCV); 당뇨병성 황반 부종; 병리학적 근시; 본 힙펠-린도우병; 눈 히스토플라스마증; 망막중심정맥 폐색(CRVO); 각막 혈관신생; 및 망막 혈관신생으로 이루어진 군으로부터 선택된 안구 질환을 앓거나 이의 발병 위험이 있는, 실시양태 1 내지 10 중 어느 하나에 따른 방법.
12. 개체가 연령-관련 황반 변성(AMD), 예컨대 습성(삼출성) AMD(예컨대 초기, 중기 및 후기 습성 AMD), 건성(비-삼출성) AMD(예컨대 초기, 중기 및 후기 건성 AMD(예컨대 지도모양위축(GA))로 이루어진 군으로부터 선택된 AMD; 유리하게는 건성 AMD를 앓거나 이의 발병 위험이 있는, 실시양태 1 내지 11 중 어느 하나에 따른 방법.
13. 방법이 HTRA1 mRNA 길항제 투여에 적합한 투여량 양생법을 결정하기 위한 것인, 실시양태 1 내지 12 중 어느 하나에 따른 방법.
14. HTRA1 mRNA 길항제가 HTRA1 표적 핵산 서열, 예컨대 서열번호 1 또는 서열번호 2에 완전히 상보성인 10 내지 30개의 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함하는, 실시양태 1 내지 13 중 어느 하나에 따른 방법.
15. HTRA1 mRNA 길항제가 서열번호 7 또는 서열번호 16에 90% 이상 상보성, 예컨대 완전히 상보성인 12개 이상의 뉴클레오티드 길이의 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드이거나 이를 포함하는, 실시양태 1 내지 14 중 어느 하나에 따른 방법.
16. HTRA1 mRNA 길항제가 안티센스 올리고뉴클레오티드, 예컨대 LNA 갭머 올리고뉴클레오티드이거나 이를 포함하는, 실시양태 1 내지 15 중 어느 하나에 따른 방법.
17. HTRA1 mRNA 길항제가 하기 또는 이의 약학적으로 허용되는 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 실시양태 1 내지 16 중 어느 하나에 따른 방법:
5' TsAsTststsascscstsgsgstsTsGsTsT 3'(서열번호 13, #13,1),
5' AstsAsTststsascscstsgsgstsTsGsTsT 3'(서열번호 15, #15,3),
5' CsTsTsCststscstsastscstsas mcsgscsAsT 3'(서열번호 17, #17),
5' TsAsCsTststsasastsasgscsTsCsAsA 3'(서열번호 18, #18), 및
5' TsTsCstsastscstsas mcsgscsasTsTsG 3'(서열번호 19, #19)
상기 식에서, 대문자는 베타-D 옥시 LNA 뉴클레오시드 단위를 나타내고, 소문자는 DNA 뉴클레오시드 단위를 나타내고, 아래첨자 s는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기를 나타내고, mc는 5 메틸 사이토신 DNA 뉴클레오시드를 나타내고, 모든 LNA 사이토신은 5-메틸 사이토신이다.
18. 황반 변성을 앓거나 이의 발병의 위험이 있는 개체를 치료하는 방법으로서, 상기 방법이 실시양태 1 내지 17 중 어느 하나에 따른 방법을 수행하고 상기 개체에게 효과량의 HTRA1 mRNA 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 방법.
19. HTRA1 mRNA 길항제가 유리체내 투여를 통해 투여하기 위한 것인, 방법.
20. HTRA1 RNA 길항성 치료제에 대한 동반 진단제로서 HTRA1 항체의 용도.
21. HTRA1 RNA 길항성 치료제, 예컨대 이전 실시양태 중 어느 하나에 따른 HTRA1 mRNA 길항제의 효능에 대한 바이오마커로서 HTRA1 항체의 용도.
22. HTRA1 mRNA 길항제에 의한 치료를 받고 있거나 HTRA1 mRNA 길항제, 예컨대 이전 실시양태 중 어느 하나에 따른 HTRA1 mRNA 길항제에 의한 치료의 적합성에 대해 평가되고 있는 개체로부터 수득한 안방수 또는 유리액 샘플의 HTRA1 수준의 검출에서 HTRA1 항체의 용도.
23. HTRA1 mRNA 길항제, 예컨대 이전 실시양태 중 어느 하나에 따른 HTRA1 mRNA 길항제를 포함하는 치료제에 대한 개체의 가능한 반응을 결정하기 위한 바이오마커의 용도로서, 상기 바이오마커가, 건강한 개체의 기준 샘플로부터 수득한 HTRA1의 수준과 비교하여, 상기 개체의 안방수 또는 유리액으로부터 수득한 생물학적 샘플에서 상승된 수준의 HTRA1을 포함하는, 용도.
실시예
올리고뉴클레오티드 합성
올리고뉴클레오티드 합성은 일반적으로 당분야에 공지되어 있다. 적용될 수 있는 프로토콜이 후술된다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 사용된 장치, 지지체 및 농도의 면에서 방법을 약간 바꿈으로써 생산될 수 있다.
올리고뉴클레오티드를, 올리고메이커(Oligomaker) 48에 대한 포스포라미다이트 접근법을 1 μmol 규모로 사용하여 우리딘 유니버셜 지지체 상에서 합성하였다. 합성의 종료시, 올리고뉴클레오티드를, 60℃에서 5 내지 16시간 동안 수성 암모니아를 사용하여 고체 지지체로부터 절단하였다. 올리고뉴클레오티드를 역상 HPLC(RP-HPLC) 또는 고체 상 추출에 의해 정제하고, UPLC에 의해 특성규명하였고, 분자 질량을 또한 ESI-MS에 의해 확인하였다.
올리고뉴클레오티드의 신장
β-시아노에틸-포스포라미다이트(DNA-A(Bz), DNA-G(ibu), DNA-C(Bz), DNA-T, LNA-5-메틸-C(Bz), LNA-A(Bz), LNA-G(dmf) 또는 LNA-T)의 커플링을, 활성화제로서 아세토니트릴 중 DCI(4,5-다이시아노이미다졸)(0.25 M) 및 아세토니트릴 중 5'-O-DMT-보호된 아미다이트(0.1 M)의 용액을 사용하여 수행하였다. 최종 주기를 위해, 목적 변형을 갖는 포스포라미다이트, 예컨대 접합체 기를 부착하기 위한 C6 연결기 또는 접합체 기 자체를 사용할 수 있다. 포스포르티오에이트 연결기의 도입을 위한 티올화를, 잔탄 하이드라이드(아세토니트릴/피리딘 9:1 중 0.01 M)를 사용함으로써 수행하였다. 포스포르다이에스터 연결기를, THF/피리딘/물 7:2:1 중 0.02 M 요오드를 사용하여 도입할 수 있다. 나머지 시약은 올리고뉴클레오티드 합성에 전형적으로 사용되는 것이다.
고체 상 합성 후 접합을 위하여, 상업적으로 입수가능한 C6 아미노 연결기 포스포라미다이트를 고체 상 합성의 마지막 주기에 사용할 수 있고, 탈보호 및 고체 지지체로부터의 절단 후, 아미노연결되고 탈보호된 올리고뉴클레오티드를 단리하였다. 접합체를, 표준 합성 방법을 사용하는 작용기의 활성화에 의해 도입하였다.
RP-HPLC에 의한 정제
조질 화합물을 페노메넥스 주피터(Phenomenex Jupiter) C18 10 μ 150 x 10 mm 컬럼 상에서 분취 RP-HPLC에 의해 정제하였다. 0.1 M 암모늄 아세테이트 pH 8 및 아세토니트릴을 완충제로서 5 mL/분의 유량으로 사용하였다. 수집된 분획을 동결건조하여 정제된 화합물을 전형적으로 백색 고체로서 수득하였다.
실시예 1: 시노몰구스 원숭이(비-인간 영장류, NHP) 생체내 약동학 및 약력학(PK/PD) 연구, 21일의 처리, 유리체내(IVT) 주사, 단일 투여량
망막의 mRNA 및 망막 및 유리체의 단백질 수준 둘 다에서 녹다운이 위치 33042와 33064 사이의 인간 HTRA1 pre-mRNA의 "핫스팟(hotspot)"을 표적화하는 하나의 선택된 HTRA1 LNA 올리고뉴클레오티드(15.3)에 대해 관찰되었다(도 6 참조).
동물
모든 실험을 시노몰구스 원숭이(마카카 파시쿨라리스)에 대해 수행하였다.
화합물 및 투여 절차
시험 화합물 주사 전에 및 2일 후에 부프레놀핀 진통제를 투여하였다. 동물을 케타민 및 자일라진의 근육내 주사에 의해 마취시켰다. 시험 항목 및 음성 대조군(PBS)을 테트라카인 마취제의 국소 투여 후에 연구 제1일에 마취된 동물의 양쪽 눈에 유리체내 투여하였다(투여 당 50 μL).
안락사
인-라이프 상(in-life phase)의 말에(제22일) 모든 원숭이를 펜토바르비탈의 과투여량 복강내 주사에 의해 안락사시켰다.
qPCR에 의한 올리고 함량 측정 및 Htra1 RNA 발현의 정량화
안락사 직후에, 눈 조직을 얼음 위에서 신속하게 주의하여 해부하고 출하 전까지 -80℃에서 저장하였다. 망막 샘플을 700 μL MagNa 퓨어 96 LC RNA 단리 조직 완충제에 용해시키고 프리셀라이즈 에볼루션(precellys evolution) 균질기를 사용하여 2 ml 튜브 당 하나의 스테인리스강 비드를 첨가하여(2 x 1,5 min) 균질화시킨 후에, 실온에서 30분 동안 항온처리하였다. 샘플을 13000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 절반을 바이오분석을 위해 한쪽으로 치워 놓고 나머지 절반에 대해 RNA 추출을 바로 진행하였다.
바이오분석을 위해, 샘플을 혼성화 ELISA 방법에 의한 올리고 함량 측정을 위해 10 내지 50배 희석하였다. 비오티닐화된 LNA-포착 프로브 및 디곡시제닌-접합된 LNA-검출 프로브(둘 다 5xSSCT에서 35 nM, 각각 검출할 LNA 올리고뉴클레오티드 중 하나의 단부에 상보성임)를 희석된 균질물 또는 관련 있는 기준물질과 혼합하고 30분 동안 실온에서 항온처리한 후에, 스트렙타비딘-코팅된 ELISA 플레이트(Nunc 카탈로그 번호 436014)에 첨가하였다.
플레이트를 1시간 동안 실온에서 항온처리하고 2xSSCT(300 mM 염화 나트륨, 30 mM 시트르산 나트륨 및 0,05% v/v 트윈(Tween)-20, pH 7.0)에서 세척하였다. 포착된 LNA 듀플렉스를 알칼리성 포스파타제와 접합된 항-DIG 항체(로슈 어플라이드 사이언스(Roche Applied Science) 카탈로그 번호 11093274910) 및 알칼리성 포스파타제 기질 시스템(블루 포스 서브스트레이트(Blue Phos substrate), KPL 제품 코드 50-88-00)을 사용하여 검출하였다. 올리고 복합체의 양을 바이오테크(Biotek) 판독기 상에서 615 nm에서의 흡광도로서 측정하였다.
RNA 추출을 위해, 세포 RNA 대량 키트(05467535001, 로슈)를 하기 프로그램에 의해 MagNA 퓨어 96 시스템에 사용하였다: DNAse 처리를 포함하여 제조회사의 설명서에 따르는 조직 FF 표준 LV3.1. RNA 품질 관리 및 농도를 Eon 판독기(바이오테크)에 의해 측정하였다. RNA 농도를 샘플에 대해 정규화시키고, 후속적 cDNA 합성 및 qPCR을 qScript XLT 1-단계 RT-qPCR ToughMix Low ROX, 95134-100(퀀타 바이오사이언시즈(Quanta Biosciences))을 사용하여 1-단계 반응으로 수행하였다. 하기 TaqMan 프라이머 검정을 싱글플렉스 반응으로 사용하였다: Htra1, Mf01016150_, Mf01016152_m1 및 Rh02799527_m1 및 하우스키핑 유전자, ARFGAP2, Mf01058488_g1 및 Rh01058485_m1, 및 ARL1, Mf02795431_m1(라이프 테크놀로지스(Life Technologies)). qPCR 분석을 ViiA7 기계(라이프 테크놀로지스) 상에서 실행하였다. 눈/군: n=3 눈. 각각의 눈을 개별적인 샘플로서 처리하였다. 상대적 Htra1 mRNA 발현 수준을 대조군(PBS)의 %로서 나타냈다.
조직학
안구를 제거하고 10% 중성 완충된 포말린에 24시간 동안 고정시키고 다듬고 파라핀에 내장시켰다.
ISH 분석을 위해, 포말린-고정되고 파라핀-내장된 망막 조직 절편(4 μm 두께)을 RNAscope 2.5 VS 프로브- Mmu-HTRA1, REF 486979(어드밴스드 셀 다이아그노스틱 인코포레이티드(Advanced Cell Diagnostics, Inc.))를 사용하여 완전히 자동화된 벤타나 디스커버리 울트라(Ventana Dicovery ULTRA) 염색 모듈(절차: mRNA 디스커버리 울트라 레드 4.0 - v0.00.0152)을 사용하여 처리하였다. 사용된 색소원은 패스트레드(Fastred), 헤마톡실린(Hematoxylin) II 대비염색제이다.
플레이트-기반 면역침강 질량 분석(IP-MS) 접근법을 사용한 HTRA1 단백질 정량화
샘플 준비, 망막
프리셀라이즈 24(5500, 15초, 2회의 사이클)를 사용하여 망막을 프로테아제 억제제(Complete EDTA-프리, 로슈)를 갖는 4-부피(w/v)의 RIPA 완충제(50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.25% 데옥시콜산, 1% NP-40, 1 mM EDTA, 밀리포어(Millipore))에 균질화시켰다. 균질물을 원심분리하고(13,000 rpm, 3분), 상청액의 단백질 함량을 결정하였다(피어스(Pierce) BCA 단백질 검정).
샘플 준비, 유리체
유리액(300 μl)을 프로테아제 억제제(Complete EDTA-프리, 로슈)를 갖는 5x RIPA 완충제(최종 농도: 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.25% 데옥시콜산, 1% NP-40, 1 mM EDTA)로 희석하고, 프리셀라이즈 24(5500, 15초, 2회의 사이클)를 사용하여 균질화시켰다. 균질물을 원심분리하고(13,000 rpm, 3분), 상청액의 단백질 함량을 결정하였다(피어스 BCA 단백질 검정).
플레이트-기반 HTRA1 면역침강 및 트립신에 의한 소화
96 웰 플레이트(Nunc MaxiSorp)를 항-HTRA1 마우스 단클론성 항체(R&D MAB2916, 50 μl PBS 중에 500 ng/웰)로 코팅하고 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 플레이트를 2회 PBS(200 μl)로 세척하고 PBS 중의 3%(w/v) BSA로 30분 동안 20℃에서 차단시킨 후에, 2회 PBS 세척이 뒤따랐다. 샘플(50 μl PBS 중의 75 μg 망막, 100 μg 유리체)을 무작위화시키고 플레이트에 첨가한 후에, 밤새 4℃에서 진탕기(150 rpm) 상에서 항온처리하였다. 이어서, 플레이트를 2회 PBS로 세척하고 1회 물로 세척하였다. 이어서, 50 mM TEAB 중의 10 mM DTT(30 μl)를 각각의 웰에 첨가한 후에, 1시간 동안 20℃에서 항온처리하여 시스테인 설프히드릴을 환원시켰다. 이어서, 50 mM TEAB 중의 150 mM 요오도아세트아미드(5 μl)를 각각의 웰에 첨가한 후에, 30분 동안 20℃에서 암실에서 항온처리하여 시스테인 설프히드릴을 차단하였다. 10 μl의 소화 용액을 각각의 웰에 첨가한 후에(최종 농도: 1.24 ng/μl 트립신, 20 fmol/μl BSA 펩티드, 26 fmol/μl 동위원소-표지된 HTRA1 펩티드, 1 fmol/μl iRT 펩티드, Biognosys), 밤새 20℃에서 항온처리하였다.
표적화된 질량 분석(선택된 반응 모니터링, SRM)에 의한 HTRA1 펩티드 정량화
질량 분석을 TSQ 퀀티바(Quantiva) 삼중 사극 질량 분석기에 커플링된 얼티메이트(Ultimate) RSLCnano LC(써모 사이언티픽) 상에서 수행하였다. 샘플(20 μL)을 IP에 사용된 96 웰 플레이트로부터 직접 주입하고 5 μL/분으로 6분 동안 로딩 완충제(0.5% v/v 폼산, 2% v/v CAN) 중에 Acclaim Pepmap 100 트랩 컬럼(100 μm x 2 cm, C18, 5 μm, 100 A, 써모 사이언티픽) 상에 적재하였다. 이어서, 펩티드를 250 nL/분의 유속에서 하기 구배를 사용하여 40℃로 가열된 통합된 전자분무 이미터(emitter)를 갖춘 PepMap Easy-SPRAY 분석용 컬럼(75 μm x 15 cm, 3 μm, 100 A, 써모 사이언티픽) 상에서 분해하였다: 6분, 98% 완충제 A(2% ACN, 0.1% 폼산), 2% 완충제 B(ACN + 0.1% 폼산); 36분, 30% 완충제 B; 41분, 60% 완충제 B; 43분, 80% 완충제 B; 49분, 80% 완충제 B; 50분, 2% 완충제 B. TSQ 퀀티바를 하기 파라미터를 사용하여 SRM 모드로 작동시켰다: 사이클 시간, 1.5초; 스프레이 전압, 1800 V; 충돌 기체 압력, 2 mTorr; Q1 및 Q3 분해, 0.7 FWHM; 이온 수송 튜브 온도 300℃. SRM 전이를 HTRA1 펩티드 "LHRPPVIVLQR" 및 내부 표준으로서 사용된 동위원소-표지된(L-[U-13C, U-15N]R) 합성 버전에 대해 획득하였다. 데이터 분석을 스카이라인 (Skyline) 버전 3.6을 사용하여 수행하였다.
실시예 2: 시노몰구스 원숭이 생체내 약동학 및 약력학 연구, 21일의 처리, 유리체내(IVT) 주사, 단일 투여량
망막의 mRNA 및 망막 및 유리체의 단백질 수준 둘 다에서 녹다운이 위치 53113과 53384 사이의 인간 HTRA1 pre-mRNA의 "핫스팟"을 표적화하는 3개의 HTRA1 LNA 올리고뉴클레오티드에 대해 관찰되었다.
동물
모든 실험을 시노몰구스 원숭이(마카카 파시쿨라리스)에 대해 수행하였다.
연구 군 각각에 4개의 동물이 포함되어 총 20마리가 사용되었다.
화합물 및 투여 절차
시험 화합물 주사 전에 및 2일 후에 부프레놀핀 진통제를 투여하였다. 동물을 케타민 및 자일라진의 근육내 주사에 의해 마취시켰다. 시험 항목 및 음성 대조군(PBS)을 테트라카인 마취제의 국소 투여 후에 연구 제1일에 마취된 동물의 양쪽 눈에 유리체내 투여하였다(투여 당 50 μL).
안락사
인-라이프 상의 말에(제22일) 모든 원숭이를 펜토바르비탈의 과투여량 복강내 주사에 의해 안락사시켰다.
qPCR에 의한 올리고 함량 측정 및 Htra1 RNA 발현의 정량화
안락사 직후에, 눈 조직을 얼음 위에서 신속하게 주의하여 해부하고 출하 전까지 -80℃에서 저장하였다. 망막 샘플을 700 μL MagNa 퓨어 96 LC RNA 단리 조직 완충제에 용해시키고 프리셀라이즈 에볼루션 균질기를 사용하여 2 ml 튜브 당 하나의 스테인리스강 비드를 첨가하여(2 x 1,5 min) 균질화시킨 후에, 실온에서 30분 동안 항온처리하였다. 샘플을 13000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 절반을 바이오분석을 위해 한쪽으로 치워 놓고 나머지 절반에 대해 RNA 추출을 바로 진행하였다.
바이오분석을 위해, 샘플을 혼성화 ELISA 방법에 의한 올리고 함량 측정을 위해 10 내지 50배 희석하였다. 비오티닐화된 LNA-포착 프로브 및 디곡시제닌-접합된 LNA-검출 프로브(둘 다 5xSSCT에서 35 nM, 각각 검출할 LNA 올리고뉴클레오티드 중 하나의 단부에 상보성임)를 희석된 균질물 또는 관련 있는 기준물질과 혼합하고 30분 동안 실온에서 항온처리한 후에, 스트렙타비딘-코팅된 ELISA 플레이트(Nunc 카탈로그 번호 436014)에 첨가하였다.
플레이트를 1시간 동안 실온에서 항온처리하고 2xSSCT(300 mM 염화 나트륨, 30 mM 시트르산 나트륨 및 0,05% v/v 트윈-20, pH 7.0)에서 세척하였다. 포착된 LNA 듀플렉스를 알칼리성 포스파타제와 접합된 항-DIG 항체(로슈 어플라이드 사이언스 카탈로그 번호 11093274910) 및 알칼리성 포스파타제 기질 시스템(블루 포스 서브스트레이트, KPL 제품 코드 50-88-00)을 사용하여 검출하였다. 올리고 복합체의 양을 바이오테크 판독기 상에서 615 nm에서의 흡광도로서 측정하였다.
RNA 추출을 위해, 세포 RNA 대량 키트(05467535001, 로슈)를 하기 프로그램에 의해 MagNA 퓨어 96 시스템에 사용하였다: DNAse 처리를 포함하여 제조회사의 설명서에 따르는 조직 FF 표준 LV3.1. RNA 품질 관리 및 농도를 Eon 판독기(바이오테크)에 의해 측정하였다. RNA 농도를 샘플에 대해 정규화시키고, 후속적 cDNA 합성 및 qPCR을 qScript XLT 1-단계 RT-qPCR ToughMix Low ROX, 95134-100(퀀타 바이오사이언시즈)을 사용하여 1-단계 반응으로 수행하였다. 하기 TaqMan 프라이머 검정을 싱글플렉스 반응으로 사용하였다: Htra1, Mf01016150_, Mf01016152_m1 및 Rh02799527_m1 및 하우스키핑 유전자, ARFGAP2, Mf01058488_g1 및 Rh01058485_m1, 및 ARL1, Mf02795431_m1(라이프 테크놀로지스). qPCR 분석을 ViiA7 기계(라이프 테크놀로지스) 상에서 실행하였다. 눈/군: n=3 눈. 각각의 눈을 개별적인 샘플로서 처리하였다. 상대적 Htra1 mRNA 발현 수준을 대조군(PBS)의 %로서 나타냈다.
조직학
안구를 제거하고 10% 중성 완충된 포말린에 24시간 동안 고정시키고 다듬고 파라핀에 내장시켰다.
ISH 분석을 위해, 포말린-고정되고 파라핀-내장된 시아노 망막 조직 절편(4 μm 두께)를, RNAscope 2.5 VS 프로브- Mmu-HTRA1, REF 486979(어드밴스드 셀 다이아그노스틱 인코포레이티드)를 사용하여 완전히 자동화된 벤타나 디스커버리 울트라 염색 모듈(절차: mRNA 디스커버리 울트라 레드 4.0 - v0.00.0152)을 사용하여 처리하였다. 사용된 색소원은 패스트레드, 헤마톡실린 II 대비염색제이다.
플레이트-기반 면역침강 질량 분석(IP-MS) 접근법을 사용한 HTRA1 단백질 정량화
샘플 준비, 망막
프리셀라이즈 24(5500, 15초, 2회의 사이클)를 사용하여 망막을 프로테아제 억제제(Complete EDTA-프리, 로슈)를 갖는 4-부피(w/v)의 RIPA 완충제(50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.25% 데옥시콜산, 1% NP-40, 1 mM EDTA, 밀리포어)에 균질화시켰다. 균질물을 원심분리하고(13,000 rpm, 3분), 상청액의 단백질 함량을 결정하였다(피어스 BCA 단백질 검정).
샘플 준비, 유리체
유리액(300 μl)을 프로테아제 억제제(Complete EDTA-프리, 로슈)를 갖는 5x RIPA 완충제(최종 농도: 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.25% 데옥시콜산, 1% NP-40, 1 mM EDTA)로 희석하고, 프리셀라이즈 24(5500, 15초, 2회의 사이클)를 사용하여 균질화시켰다. 균질물을 원심분리하고(13,000 rpm, 3분), 상청액의 단백질 함량을 결정하였다(피어스 BCA 단백질 검정).
플레이트-기반 HTRA1 면역침강 및 트립신에 의한 소화
96 웰 플레이트(Nunc MaxiSorp)를 항-HTRA1 마우스 단클론성 항체(R&D MAB2916, 50 μl PBS 중에 500 ng/웰)로 코팅하고 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 플레이트를 2회 PBS(200 μl)로 세척하고 PBS 중의 3%(w/v) BSA로 30분 동안 20℃에서 차단시킨 후에, 2회 PBS 세척이 뒤따랐다. 샘플(50 μl PBS 중의 75 μg 망막, 100 μg 유리체)을 무작위화시키고 플레이트에 첨가한 후에, 밤새 4℃에서 진탕기(150 rpm) 상에서 항온처리하였다. 이어서, 플레이트를 2회 PBS로 세척하고 1회 물로 세척하였다. 이어서, 50 mM TEAB 중의 10 mM DTT(30 μl)를 각각의 웰에 첨가한 후에, 1시간 동안 20℃에서 항온처리하여 시스테인 설프히드릴을 환원시켰다. 이어서, 50 mM TEAB 중의 150 mM 요오도아세트아미드(5 μl)를 각각의 웰에 첨가한 후에, 30분 동안 20℃에서 암실에서 항온처리하여 시스테인 설프히드릴을 차단하였다. 10 μl의 소화 용액을 각각의 웰에 첨가한 후에(최종 농도: 1.24 ng/μl 트립신, 20 fmol/μl BSA 펩티드, 26 fmol/μl 동위원소-표지된 HTRA1 펩티드, 1 fmol/μl iRT 펩티드, Biognosys), 밤새 20℃에서 항온처리하였다.
표적화된 질량 분석(선택된 반응 모니터링, SRM)에 의한 HTRA1 펩티드 정량화
질량 분석을 TSQ 퀀티바 삼중 사극 질량 분석기에 커플링된 얼티메이트 RSLCnano LC(써모 사이언티픽) 상에서 수행하였다. 샘플(20 μL)을 IP에 사용된 96 웰 플레이트로부터 직접 주입하고 5 μL/분으로 6분 동안 로딩 완충제(0.5% v/v 폼산, 2% v/v CAN) 중에 Acclaim Pepmap 100 트랩 컬럼(100 μm x 2 cm, C18, 5 μm, 100 A, 써모 사이언티픽) 상에 적재하였다. 이어서, 펩티드를 250 nL/분의 유속에서 하기 구배를 사용하여 40℃로 가열된 통합된 전자분무 이미터를 갖춘 PepMap Easy-SPRAY 분석용 컬럼(75 μm x 15 cm, 3 μm, 100 A, 써모 사이언티픽) 상에서 분해하였다: 6분, 98% 완충제 A(2% ACN, 0.1% 폼산), 2% 완충제 B(ACN + 0.1% 폼산); 36분, 30% 완충제 B; 41분, 60% 완충제 B; 43분, 80% 완충제 B; 49분, 80% 완충제 B; 50분, 2% 완충제 B. TSQ 퀀티바를 하기 파라미터를 사용하여 SRM 모드로 작동시켰다: 사이클 시간, 1.5초; 스프레이 전압, 1800 V; 충돌 기체 압력, 2 mTorr; Q1 및 Q3 분해, 0.7 FWHM; 이온 수송 튜브 온도 300℃. SRM 전이를, HTRA1 펩티드 "LHRPPVIVLQR", 및 내부 표준으로서 사용된 동위원소-표지된 (L-[U-13C, U-15N]R) 합성 버전에 대해 획득하였다.
데이터 분석을 스카이라인 버전 3.6을 사용하여 수행하였다.
웨스턴 블롯
0.5 프리셀라이즈 프리셀라이즈 튜브(CK14_0.5 ml, 베르탱 테크놀로지스(Bertin Technologies))의 절개한 망막 샘플을 프로테아제 억제제(Complete EDTA-프리 프로테아제-억제제 미니(Mini), 11 836 170 001, 로슈)를 함유하는 RIPA 용해 완충제(20-188, 밀리포어)에서 용해시키고 균질화시켰다.
유리체 샘플을 0.5 프리셀라이즈 튜브(CK14_0.5 ml, 베르탱 테크놀로지스)에 첨가하고, 프로테아제 억제제(Complete EDTA-프리 프로테아제-억제제 미니, 11 836 170 001, 로슈)를 함유하는 1/4x RIPA 용해 완충제(20-188, 밀리포어)에서 용해시키고 균질화시켰다.
샘플(망막 20 μg 단백질, 유리체 40 μg 단백질)을 환원 조건 하에 4 내지 15% 구배 겔(#567-8084 바이오-라드(Bio-Rad)) 상에서 분석하고, 바이오-라드의 트랜스-블롯(Trans-Blot) 터보 장치를 사용하여 니트로셀룰로스(#170-4159 바이오-라드) 상에 옮겼다.
일차 항체: 토끼 항-인간 HTRA1(SF1)은 사샤 파우저(Sascha Fauser, 쾰른 대학교)의 귀중한 기증품인 마우스 항-인간 Gapdh(#98795 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))였다. 이차 항체: 염소 항-토끼 800CW 및 염소 항-마우스 680RD를 Li-Cor로부터 입수하였다.
블롯을 Li-Cor의 오디시(Odyssee) CLX 상에서 이미지화하고 분석하였다.
실시예 3: 시노몰구스 원숭이 생체내 평가: 안방수의 HTRA1 단백질 결정, 및 망막에서 HTRA1 mRNA와 단백질 억제의 비교
실험 방법론: 실시예 2 참조. 안방수 샘플을 채취하고, 샘플을 실시예 2 유리액 샘플에 따라 제조하였다. 시노몰구스 원숭이 안방수 샘플(AH)을 분석 방법론에 대한 크기-기반 분석에 의해 분석하였다: 모세관 전기영동 시스템(페기 수(상표), 프로틴심플).
샘플을 얼음 상에서 해동하고 희석하지 않고 사용하였다. 정량화를 위한, 재조합 HTRA1- S328A 돌연변이체(오리진 #TP700208). 제제는 제공업체에 의해 기재된 바와 같았다.
일차 토끼 항-인간 HTRA 항체 SF1을 사샤 프라우저 교수가 제공하였고 1:300으로 희석하여 사용하였다. 모든 다른 시약은 프로틴심플로부터 입수하였다.
샘플을 12 내지 230 kDa 분리 모듈을 사용하여 기술 3중 복제물로 검량 곡선으로 2회 처리하였다. 피크 아래 면적을 Xlfit(IDBS 소프트웨어)를 사용하여 컴퓨터 처리하고 분석하였다.
결과
도 9a는 화합물 번호 15,3 및 17을 투여 받은 원숭이의 안방수의 HTRA1 단백질 수준의 시각화를 나타내되, 샘플은 주사 3일, 8일, 15일 및 22일 후에 채취되었다. 도 9b는 HTRA1 단백질 수준을 계산하는 데 사용된 검량 곡선을 제공한다. 도 9c 내지 9e는 주사 후 시간에 대해 플롯팅된 별개의 동물의 안방수의 계산된 HTRA1 수준을 제공한다.
도 10은 안방수의 HTRA1 단백질의 수준과 망막의 HTRA1 mRNA의 수준 사이에 직접적인 상관관계를 나타낸다. 따라서, 안방수 HTRA1 단백질 수준은 HTRA1 망막 mRNA 수준 또는 HTRA1 망막 mRNA 억제에 대한 바이오마커로서 사용될 수 있다.
도 11은 망막의 HTRA1 mRNA 억제와 안방수의 HTRA1 단백질 수준 사이에 상관관계만큼 강하지 않지만 망막의 HTRA1 단백질 수준과 안방수의 HTRA1 단백질 수준 사이에 상관관계가 존재함을 나타내고, 이는 안방수 HTRA1 단백질 수준이 HTRA1 mRNA 길항제에 대한 바이오마커로서 특히 적합함을 시사한다.
실시예 4: 시노몰구스 원숭이 생체내 약동학 및 약력학 연구, 36일의 처리, 유리체내(IVT) 주사, 단일 투여량
HTRA1 LNA 노출된 동물의 안방수의 HTRA1 단백질의 동력학을 36일 동안 조사하고, 잔여 HTRA1 단백질 함량을 사후 상이한 눈 조직 구획물(유리체, 신경 망막, 망막 색소 상피(RPE) 및 맥락막)에서 시험하였다. HTRA1 mRNA 억제를 말단 샘플에서 평가하였다.
동물
모든 실험을 수컷 시노몰구스 원숭이(마카카 파시쿨라리스)에 대해 찰스 리버 래보래토리즈 몬트리얼 유엘씨(Charles Rivers Laboratories Montreal ULC, 캐나다 센느빌 소재) 시설에서 수행하였다.
화합물 및 투여 절차
국소 항생제(토브라마이신(tobramycin))를 각각의 주사 2일 전에 2회 및 2일 후에 2회 양눈에 적용하였다. 투여 전에, 금식시킨 동물에게 케타민(5 mg/kg) 및 덱스메테도미딘(dexmetedomidine)(0.01 mg/kg)의 진정제 칵테일의 근육내 주사를 제공한 후에, 이소플루란(isoflurane)/산소 혼합물을 마스크를 통해 제공하였다. 국소 마취제(0.5% 프로파라카인(proparacaine))를 50 μl 중의 100 μg 시험 물품 또는 비히클(포스페이트 완충된 염수)의 양쪽 유리체내 주사 전에 각각의 눈에 주입하였다. 산동제 액적(1% 트로피카미드(tropicamide))을 필요에 따라 각각의 눈에 적용하였다. 투여 절차를 완료한 후에, 동물에게 0.1 mg/kg 아티파메졸(atipamezole)(덱스메테도미딘에 대한 역전 현상제(reversal agent))의 근육내 주사를 제공하였다.
절차의 제0일에, 4마리의 동물에게 50 μl 중의 100 μg HTRA1 LNA #18을 양쪽에 주사하고, 4마리 동물에게 동일한 부피의 비히클을 주사하였다.
안방수 샘플링
동물을 각각 2개의 대조군 및 2개의 처리된 원숭이를 포함하는 2개의 군으로 분할하였다. 안방수 샘플을 기선(모든 동물); 제3일 및 제18일(군1); 제11일 및 제25일(군 2), 제32일(모든 동물), 및 안락사 후 제36일에 수집하였다. 동물을 화합물 적용과 동일한 절차에 따라 마취시키고, 30 내지 40 μl의 안방수를 산동 후에 샘플링하고 -80℃에서 동결상태로 저장하였다.
안락사
제36일에, 금식시킨 동물을 케타민 및 이소플루란으로 마취시키고, 대동맥 및 대정맥을 클램핑시키고, 상체의 경심 관류를 포스페이트 완충된 염수에 의해 수행하였다. 씻어낸 안구를 제거하고 부착 조직으로부터 세정하고, 200 μl의 안방수를 샘플링하였다. 좌안을 RNA 생산을 위해 추가로 처리하고, 우안을 단백질 분석을 위해 추가로 처리하였다. 안방수의 HTRA1 단백질을 해부된 좌안 및 우안으로부터 측정하였다.
HTRA1 단백질 분석을 위한 샘플 처리
마지막 수집을 위해, 0.2 ml 이하의 안방수를 30G, 1/2" 니들을 갖는 초미세 인슐린 시린지에 의해 수집하였다. 안구를 부착 근육으로부터 세정하고 각막 가장자리보다 3 mm 뒤에 원주 절개에 의해 정면으로 개방하였다. 유리체를 제거하고 조직이 니들이 부재하는 3 cc 시린지를 통과하도록 하여(3회 통과) 균질화시키고 원심분리하고(3분, 16,000xg, 4℃) 동결상태로 저장하였다. 신경 망막을 아래에 있는 RPE로부터 주의하여 벗겨 제거하고 드라이 아이스 상에서 스냅 동결하였다. 이어서, 개방된 컵을 정면이 위로 오게 유지하고 프로테아제 억제제(cOmplete(상표) EDTA-프리 프로테아제 억제제 칵테일, 미니, 로슈, 1 정제/10 ml)를 함유하는 1 ml RIPA 완충제(밀리포어, 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.25% 데옥시콜산, 1% NP-40, 1mM EDTA)로 충전하고, 회전 플랫폼(200 rpm) 상에서 5분 동안 진탕하였다. 생성된 RPE 용해물을 원심분리(3분, 16,000xg, 4℃)에 의해 세정하고 동결상태로 저장하였다. 남아있는 배부 아이 컵을 포스페이트 완충된 염수로 씻어내고, 조직 플랫 및 부르크막을 놓을 수 있도록 4개의 절개가 이루어졌고, 부착성 맥락막을 벗겨냈다. 맥락막을, 중간에 얼음 상에서 냉각하면서, 제노 그라인더(Geno Grinder)(1500 rpm, 2분)를 3회 사용하여 프로테아제 억제제를 함유하는 RIPA 완충제에 4 ml/g 조직으로 균질화시켰다. 잔해를 원심분리에 의해 제거하고 추출물을 저장하였다(3분, 16,000xg, 4℃).
유리액을 프로테아제 억제제(Complete EDTA-프리, 로슈)를 함유하는 5x RIPA 완충제(최종 농도: 50 mM TrisHCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.25% 데옥시콜산, 1% NP-40, 1 mM EDTA)로 희석하고, 프리셀라이즈 24(5500 rpm, 15초, 2회의 사이클)를 사용하여 균질화시켰다. 균질물을 원심분리하였다(16,000xg, 3분). 신경 망막 및 맥락막 추출물의 단백질 함량을 기준으로 혈청 알부민을 사용하여 피어스(미국 락포드 소재)의 비신초닌산(bicinchoninic acid) 방법 및 시약을 사용하여 측정하였다.
RNA 생산을 위한 샘플 처리
RNA 생산을 위해, 초기 절개 단계가 단백질 절차와 유사하였다.
벗겨낸 망막을 균질화 용기에 옮기고, 10 μl /mg 조직 균질화 완충제를 첨가하였다(맥스웰(Maxwell) RNA 단리 키트, 프로메가(Promega)). 상기 물질을 1500 rpm에서 2분의 3주기 동안 제노 그라인더에서 처리하였다. 생성된 용해물을 추가적 처리 전까지 -80℃에서 저장하였다.
신경 망막 제거 후에, 개방된 컵을 RNA 보호 세포 시약(퀴아젠(Qiagen))으로 충전하고 회전 플랫폼(400 rpm) 상에서 4℃에서 진탕하였다. 생성된 RPE 세포 현탁액을 10분 후에 수집하고 700 g에서 5분 동안 원심분리하고 200 μl 맥스웰 균질화 완충제에 용해시켰다. 용해물을 추가적 처리 전까지 -80℃에서 저장하였다.
갓 생산한 RNA 보호물을 아이 컵에 첨가하고, 이를 추가적 10분 동안 진탕하여 남아 있는 RPE 세포를 제거하고, 폐기하였다. 조직 플랫 및 부르크막을 놓을 수 있도록 4개의 절개가 이루어졌고, 부착성 맥락막을 벗겨내고 추가적 처리 전까지 동결상태로 저장하였다. 균질화를 위해, 동결된 맥락막을 해동 없이 프로메가 균질화 완충제(10 μl/mg 조직)에 첨가하고 조직 라이서(Lyser) II(레치(Retsch))에서 20 Hz에서 2분의 3주기 동안 처리하였다.
RNA를 맥스웰 RNA 단리 로봇 및 해당하는 시약(프로메가)을 제공업체의 지시서에 따라 사용하여 용해물로부터 정제하였다.
RNA 품질을 평가하고, 수량을 엑스페리온(Experion) 장치(바이오라드) 상에서 모세관 전기영동에 의해 측정하였다.
RNA 서열분석을 사용하는 HTRA1 mRNA 정량화
400 ng의 전체 RNA를 TruSeq(상표) 스트랜디드 mRNA 라이브러리 프렙 키트(일루미나(lllumina) 20020594)를 사용하여 mRNA 서열분석 라이브러리를 생산하는 데 사용하였다. 라이브러리를 일루미나 HiSeq 4000 시퀀서(2 x 50 bp) 상에서 서열분석하였다. 베이스 콜링을 일루미나의 BCL 투 FASTQ 파일 컨버터 bcl2fastq v2.17.1.14에 의해 수행하였다(https://support.illumina.com/downloads.html). 유전자 발현 수준을 평가하기 위해, 페어링된-단부 RNASeq 리드(read)를 디폴트 맵핑 파라미터를 사용하여 STAR 얼라이너 버전 2.5.2a에 의해 마카카 파시쿨라리스 게놈(macFas5, WashU)에 대해 맵핑하였다(문헌[Dobin et al. 2013]). 유전자의 모든 RefSeq 전사 변이체의 맵핑된 리드의 수(카운트)를 SAMTOOLS 소프트웨어를 사용하여 단일 값으로 합하고(문헌[Li et al. 2009]) rpkms로서 정규화하였다(number of mapped reads per kilibase transcript per million sequenced reads, 문헌[Mortazavi et al. 2008]).
모세관 전기영동 기반 방법을 사용한 HTRA1 단백질 정량화
[상이한 눈 구획물의 단백질을 제공업체에 의해 기재된 바와 같이 페기 수 장치(프로틴 심플(미국 캘리포니아주 산호세 소재)) 상에서 12 내지230 kDa 분리 매트릭스를 사용하여 모세관 전기영동에 의해 분석하였다. 인간 재조합 6His 태그된-HTRA1 S328A(알디 바이오테크(RD Biotech, 프랑스 소재)) 샘플(62.5-.0.12ng /ml)을 정량화와 동시에 분석하였다. HTRA1 단백질을 사샤 파우저 교수가 제공한 토끼 항-인간 HTRA1 항혈청 SF1(희석 1:300)을 사용하여 검출하였다. 5.5 ng/ml HTRA1을 함유하는 시노몰구스 RPE 용해물을 사용하여 분석 재현성을 평가하는 데 사용하였다.
예비 실험(나타내지 않음)이 매트릭스 효과를 배제하였기 때문에, 샘플을 HTRA1 억제의 최적 정량화를 가능하게 하는 가능한 최고 농도에서 분석하였다. 안방수 샘플을 희석하지 않고 사용한 반면에, 세정된 균질화된 유리체 샘플을 프로테아제 억제제를 함유하는 RIPA 완충제에 80%로 희석하였다. 신경 망막, RPE 및 맥락막 용해물의 농도는 0.5 mg 전체 단백질 /ml로 조정되었다.
연구에 걸쳐, 분석내 변이는 9.1%였고, 분석간 변이는 21%였다. 비교가능성을 개선하기 위해, 각각의 조직의 모든 샘플을 단일 수행으로 분석하였다. 안방수를 제외하고, 샘플을 상이한 시점에서 수집하고, 이때 이를 마지막 샘플과 구별되는 수행으로 분석하였다.
결과 1: 상이한 조직 구획물의 HTRA1 단백질 억제, 사후, LNA 적용 32일 후
최고 HTRA1농도가 맥락막 용해물(PBS 군: 28 ng/mg 전체 단백질 sd=2.2)에서 발견되었고, LNA 단독 처리는 이러한 해부 영역 내에서 약간의 억제를 야기하였다(LNA 군에서 16% 감소: 24 ng/mg 전체 단백질 sd=3.5).
측정된 최저 HTRA1 농도는 RPE 용해물(PBS 군: 5.2 ng/mg 전체 단백질 sd=0.4)에 존재하였고, 유의미한 개입의 영향이 존재하였다(55% 감소, LNA 군: 2.4 ng/mg 전체 단백질 sd=0.2).
최고 개입의 영향은 신경 망막, 유리체 및 안방수(AH)에서 관찰되었고, 비히클 처리된 동물보다 평균 HTRA1 수준이 각각 76%, 84% 및 74% 낮았다. 상이한 구획물의 군 평균 억제를 도 12a에 나타냈다.
대조군에서 결정된 HTRA1 값의 분산에도 불구하고, 유리체, 망막 및 RPE에서 측정된 Htra1 농도는 안방수에서 측정된 수준에 부합하고; 이는 표적 결합 바이오마커로서 잠재적 유용성을 시사한다. 조직 HTRA1 수준과 안방수 수준 사이의 상관관계를 도 12b에 도시하였다.
결과 2: 안방수의 HTRA1 단백질 농도의 동력학
하나의 기선 샘플은 불충분한 샘플 유용성 때문에 측정되지 않았고, 동물(비히클 처리, 군 1)을 현재 분석으로부터 배제하였다.
안방수의 기선 HTRA1 단백질 농도는 불균일하였고(4.32 ng/ml 표준 편차(sd) 0.98 ng/ml), 처리 군에서 값이 더 높았다. (활성제 처리 3.65 ng/ml sd 0.18 ng/ml, 비히클 5.23 ng/ml sd 0.82 ng/ml). IVT 3일 후에 모든 군에서 HTRA1 농도 증가의 경향이 존재하였다(활성제 처리: n=2, + 51% 및 +54%; 비히클 n =1, +42%). 따라서, 개입의 효과는 개별적 기선 값 및 시간 매칭된 비히클 군에 대해 정규화한 후에 분석되었다. 처리는 제3일에 효과를 가지지 않았으나, 안방수 HTRA1 농도는 제11일에서(52%) 제36일에 66% 억제에 도달한 효과로 감소하였다. 데이터를 도 13에 나타냈다.
결과 3: 상이한 조직 구획물의 HTRA1 mRNA 억제, 사후, LNA 적용 32일 후
HTRA1 mRNA 수준을, 8마리의 동물(비히클 군의 4마리 동물, 및 LNA 처리된 군의 4마리 동물)의 좌안으로부터 절개된 망막, RPE 및 맥락막의 RNA 서열분석에 의해 측정하였다. 129,876,690개의 리드의 평균을 샘플마다 생성하였고, 122,038,760개의 맵핑된 리드의 평균을 샘플마다 생성하였다. 품질 관리 척도 통과 실패로 인해, 하나의 망막 샘플을 비히클 및 LNA 군으로부터 배제하였고, 하나의 RPE 샘플을 비히클 군으로부터 배제하였다. 나머지 샘플에서, HTRA1 mRNA 수준은 LNA 처리시 망막에서 유의미하고 크게 감소하였다(비히클 군과 비교하여 LNA 군에서 80% 감소). 약간 낮은(60%) 유의미한 감소가 LNA 처리시 RPE에서 관찰되었다맥락막에서는 유의미한 감소 없음이 기록되었다(도 14 참조).
결론
시노몰구스 원숭이에서 100 μg HTRA1 LNA의 단일 유리체내 주사는 노출 36일 후에 신경 망막에서 80% 감소된 HTRA1 mRNA 발현 및 망막 색소 상피에서 60% 감소를 야기하였다. 부합하게, HTRA1 단백질 감소는 각각 신경 망막 및 RPE에서 76% 및 55%였고, 이는 탐구한 상이한 눈 구획물에서 지속된 약물 활성 및 약물의 넓은 분포 및 효능을 나타낸다. 예상되는 바와 같이, 혈액-망막 장벽 때문에, 맥락막에 올리고뉴클레오티드가 단지 최소로 도달하였다. 결과적으로, HTRA1 mRNA의 유의미한 감소가 상기 조직에서 관찰되지 않았다. 중요하게는, 이들 데이터는 AMD 발병에서 중심이 되는 역할을 하는 RPE 층에서 유의미하고 장기적인 효과를 보여준다. mRNA에서 HTRA1의 억제와 단백질 수준 사이의 강한 상관관계는 국소 HTRA1 합성이 안구 단백질 풀의 주요한 공급원이고, 혈액-유도된 HTRA1의 비는 무시해도 될 정도임을 나타낸다.
본질적으로 세포를 미함유하는 유리체 및 안방수에서 HTRA1 단백질 수준은 신경 망막(각각 r84% 및 74%)과 유사한 정도로 감소되었고, 이는 이들 생체 유체의 단백질 농도가 후안부에서 개입의 효능을 평가하는 데 사용될 수 있음을 나타낸다. 안방수에서의 감소는 제11일 전에 검출되지 않았고, 이는 이러한 구획물에서 지연된 작용의 개시 및/또는 낮은 HTRA1 단백질 턴오버(turnover)를 나타낸다.
참고문헌
Dobin et al. 2013, Bioinformatics 29 : "STAR : ultrafast universal RNA-seq aligner"
Li et al. 2009, Bioinformatics 25: "The Sequence Alignment/Map format and SAMtools"
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<150> EP17209535.8
<151> 2017-12-21
<150> EP18209473.0
<151> 2018-11-30
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<170> PatentIn version 3.5
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1 5 10 15
Ala Ala Pro Ala Ser Ala Gln Leu Ser Arg Ala Gly Arg Ser Ala Pro
20 25 30
Leu Ala Ala Gly Cys Pro Asp Arg Cys Glu Pro Ala Arg Cys Pro Pro
35 40 45
Gln Pro Glu His Cys Glu Gly Gly Arg Ala Arg Asp Ala Cys Gly Cys
50 55 60
Cys Glu Val Cys Gly Ala Pro Glu Gly Ala Ala Cys Gly Leu Gln Glu
65 70 75 80
Gly Pro Cys Gly Glu Gly Leu Gln Cys Val Val Pro Phe Gly Val Pro
85 90 95
Ala Ser Ala Thr Val Arg Arg Arg Ala Gln Ala Gly Leu Cys Val Cys
100 105 110
Ala Ser Ser Glu Pro Val Cys Gly Ser Asp Ala Asn Thr Tyr Ala Asn
115 120 125
Leu Cys Gln Leu Arg Ala Ala Ser Arg Arg Ser Glu Arg Leu His Arg
130 135 140
Pro Pro Val Ile Val Leu Gln Arg Gly Ala Cys Gly Gln Gly Gln Glu
145 150 155 160
Asp Pro Asn Ser Leu Arg His Lys Tyr Asn Phe Ile Ala Asp Val Val
165 170 175
Glu Lys Ile Ala Pro Ala Val Val His Ile Glu Leu Phe Arg Lys Leu
180 185 190
Pro Phe Ser Lys Arg Glu Val Pro Val Ala Ser Gly Ser Gly Phe Ile
195 200 205
Val Ser Glu Asp Gly Leu Ile Val Thr Asn Ala His Val Val Thr Asn
210 215 220
Lys His Arg Val Lys Val Glu Leu Lys Asn Gly Ala Thr Tyr Glu Ala
225 230 235 240
Lys Ile Lys Asp Val Asp Glu Lys Ala Asp Ile Ala Leu Ile Lys Ile
245 250 255
Asp His Gln Gly Lys Leu Pro Val Leu Leu Leu Gly Arg Ser Ser Glu
260 265 270
Leu Arg Pro Gly Glu Phe Val Val Ala Ile Gly Ser Pro Phe Ser Leu
275 280 285
Gln Asn Thr Val Thr Thr Gly Ile Val Ser Thr Thr Gln Arg Gly Gly
290 295 300
Lys Glu Leu Gly Leu Arg Asn Ser Asp Met Asp Tyr Ile Gln Thr Asp
305 310 315 320
Ala Ile Ile Asn Tyr Gly Asn Ser Gly Gly Pro Leu Val Asn Leu Asp
325 330 335
Gly Glu Val Ile Gly Ile Asn Thr Leu Lys Val Thr Ala Gly Ile Ser
340 345 350
Phe Ala Ile Pro Ser Asp Lys Ile Lys Lys Phe Leu Thr Glu Ser His
355 360 365
Asp Arg Gln Ala Lys Gly Lys Ala Ile Thr Lys Lys Lys Tyr Ile Gly
370 375 380
Ile Arg Met Met Ser Leu Thr Ser Ser Lys Ala Lys Glu Leu Lys Asp
385 390 395 400
Arg His Arg Asp Phe Pro Asp Val Ile Ser Gly Ala Tyr Ile Ile Glu
405 410 415
Val Ile Pro Asp Thr Pro Ala Glu Ala Gly Gly Leu Lys Glu Asn Asp
420 425 430
Val Ile Ile Ser Ile Asn Gly Gln Ser Val Val Ser Ala Asn Asp Val
435 440 445
Ser Asp Val Ile Lys Arg Glu Ser Thr Leu Asn Met Val Val Arg Arg
450 455 460
Gly Asn Glu Asp Ile Met Ile Thr Val Ile Pro Glu Glu Ile Asp Pro
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Leu Ala Ala Pro Ala Ser Ala Gln Leu Ser Arg Ala Gly Arg Ser Pro
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cgcccgcctc ggcgcagctg tcccgggccg gccgctcggc gcctttggcc gccgggtgcc 240
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tgcaggaggg cccgtgcggc gaggggctgc agtgcgtggt gcccttcggg gtgccagcct 420
cggccacggt gcggcggcgc gcgcaggccg gcctctgtgt gtgcgccagc agcgagccgg 480
tgtgcggcag cgacgccaac acctacgcca acctgtgcca gctgcgcgcc gccagccgcc 540
gctccgagag gctgcaccgg ccgccggtca tcgtcctgca gcgcggagcc tgcggccaag 600
ggcaggaaga tcccaacagt ttgcgccata aatataactt tatcgcggac gtggtggaga 660
agatcgcccc tgccgtggtt catatcgaat tgtttcgcaa gcttccgttt tctaaacgag 720
aggtgccggt ggctagtggg tctgggttta ttgtgtcgga agatggactg atcgtgacaa 780
atgcccacgt ggtgaccaac aagcaccggg tcaaagttga gctgaagaac ggtgccactt 840
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ctgggaattg gcgcctcgca gagcggcttc aggaccacaa gaagtcattt cggttgcttt 1020
ttcttctatt tacgtcctcc gtccccttta aaattcactg ctttgatcac gggaccgctc 1080
agtgaaaact gtatgtaact cttttggaaa ggaacagtgt ttgccggccc gccccggagt 1140
ttctccaaaa agtctacccc gagcagggaa cggtttggca ccgctctcgt ttcggcggcg 1200
ttgctgcctg tcttgctttc ctcgttttga gccagcccta caaaaatgaa agtggctcct 1260
tttgaataag ctgaatcggg ctttggatca cgaaatctgc agaggcggag aagggaccgg 1320
gttagtgatg aggaagaagt ctacccctct gttcctacag ccgcacacag gacctgttct 1380
ggcaggggag acggtggtga tgggggaagg agtggaatgg agcaatgtct aactctctcg 1440
cgggaccttc cggagagatg ctcctcatct tcaggcagag gccatgtgga aaaataatat 1500
cgagttcagc agcggccagc cccgcgttgt aggaaccaga cagcggggct tggcagtgcg 1560
cttgggcgca gccgtgccgc tgctgccgga ccccagtgct gcctcctcaa cacgggcagt 1620
gccaggagag gggcataggg gagcacagtg cagagggact ggtctagagt ttactttata 1680
ggaatatggt tcggtgtgac caactagggc ttagcatagt ttggcttacg tggacgggaa 1740
gatgccagag ccgaactggg tgaaattcga gattgcgtat ttcaccaaca caggagcaca 1800
gccctcggga aactcagcct agtcaggcag tagagagttg tcccggagag aagtgatcct 1860
gcagactcga gaaggggcat gatgatagca cacgtctgtt gagcacccag tctgtgtgcc 1920
gggtgtgtta cctctgtgac ctcatttggt caaacgagga ggcagttgct cctctctctc 1980
tctttttttt tcttaagaga cagggtctcc ctctgtcgcc catgctggag tgtagtggtg 2040
tgatcatggc tcactgcagc ctccgacccc tgggctcaat gattctcctg cttcagcctc 2100
ccaagtggct gggactacag gcggatgcca ccacacccag cttctcattc ccgttttaca 2160
gatagcggag ctaaggttga aaaacttgcc caaggtcatt cagctggaat ttaaacccag 2220
acagcctcat tcagaggagt cagcccagca cttaactcca agggtgtggg agaggggtca 2280
ggtgctgtaa atttcctggt gggctggacg tgcatccccc tcagagctgg gaacagcata 2340
cacaaagcct aagacttgtt tggaggtgaa tagatcagtg tggctgggga acgttttggg 2400
agggcagcag gagtgagcca ggctggtggc ccagagtccc agggctgaag aggctggctg 2460
tgccccgtgc cctgtgcgca gatgttcttg aactggagca actcaaagcc tagtgtagtg 2520
tagggctgac ctagcagtgg agtgcggaat gcatccaggg tggagagttt agactactgc 2580
aataatctgg gtgtgaggcg acaacattga aaaagcatgt ttttgtccaa aacaagccag 2640
ctgttactgg tctcgctgtt tgtggtctca tcgcacgggg tcctgagttg ctggcaccat 2700
gcgagccgcc taatttattg ctagtgaggc aagttgctta acaagttttg gagttggctg 2760
agtccctgtg tggaggaaaa caggtccccc attggccatc gggctcacag cgggcccccg 2820
gtgtaccagt gaggggacag ccacagaggg ataagcatgg tggctttgaa aggagggaga 2880
gacagagtgg gtacaatgct tttcttatcc ctccctcctt cttttgcaaa tatttattga 2940
gctctgtagg gtgtctgaca ccgtttgcat gtttgtctgt ctggcacatc ggaggtactt 3000
ggtacgagtg gattagtgaa tgaataaatg aatgaatgaa gacaaacggg aggtgcttgc 3060
gatacacagc cattctgttt ttccttagtg gaaggcactg ctttgctgcg ccccctctct 3120
ggatctcaca ctccaccctt gacttttcgg aggtgtttcc gaggacaggc gcctgggagc 3180
cagcagactt cattcagtcc aagccaggct ccaggactca acagctggtg cccacgggca 3240
ggtcacttga cgtcactgtt aaatgaggtg aattggctgc ctgctctggc tggaagattg 3300
gcgggagagt cactttagct gccatggaca tgagcctttt ctaggggtgc cacttgacta 3360
gaggcctgga gttggagcaa gtcatacacg gatctggaga cagagctctc gaggcaggag 3420
cgggtgctgc gatttcaaat attataaggt ggctttgtct ggggcagagc atgccagggg 3480
atgagaggta gaaatgtcat cagatcaggg gtccccaggg aggtgactag cactttgggt 3540
cacagtagat ctttggatag aggaacatgt caccattcaa aggaaagcac tttcatctgt 3600
aagctgttta ttgaatagac ctcagagaac atctctgctc accgctctgg aaatgaaggc 3660
aaatcatcta tttcagaagt caatgcactg gcagggtttg gatgggaaag tatacaattc 3720
agctagagaa caaagatctg tcatctccag ctgtactggt cagatgatta caaaaaagaa 3780
aggaattgaa atactaatag ggtactaata atgagggcta acatatatgt tgtgcttatt 3840
ctatgccggg tgcatactaa ttcatttgat cctccggaca gtcctatgag tgagtgctgt 3900
agtcttccct gggttacagc tgggcagcta agtcacagag aagtaccttg ctcaggactg 3960
gtggtcccac acaactggat ggagagcctc gttcataacc accatgctgt gctgttgaca 4020
gagcaacaga gattttaaac caaccccagc taagccccag ctaatagctg aaataaacag 4080
ggctccagat ggctgtggct tagagatgga acaggacaga tcacagcctt cactctgcag 4140
gctcaggagc ctgaagacaa ggttgcctcc agttgccgtc agtgcagccc tcactaaaga 4200
aaagcaaaaa gagccgaggg actgtaggaa ggctgtttcc aagccagaga tccagacaaa 4260
ctgctcttga agagagaaag cccttccaga ttcccccatg tcccaaaaga ccagccggga 4320
ttccggacct ctgctaaaac atggacaaga agccaggaac gagacctgaa acagacttcc 4380
caaacagcag aagcctcatc catttctcct gctagtacat cctccaggaa agcccaccct 4440
actccatgca gcagcccaga caagcttgga ggtctgcaag ctgcaggggt gcccagaaac 4500
tccacccctg gaggttttta ggatcgcctg ctcctggtct caccccagag cctctaaagg 4560
cagaggctgt atgtacatac ctggtgaaga accaagggct tagatggttg ctttacttct 4620
tggagccctg gaatgtttgt aaaatttact tttttttttg agacagtgtc tcgttctgtc 4680
gcctacgctg gagtgcagtg gcgcgatctc ggctcactgc aagctccacc tcccgggttc 4740
atgccattct cctgccttag cctccagagt agctgggact acaggcaccc gccaccacgc 4800
ccagctaatt tttttgtatt ttttggtaga gacggggttt caccgtgtta gccaggatgg 4860
tctccatctc ctgaccttgt gatccgcccg ctttggcctc ccaaagtgct gggattacag 4920
gagtgagcca ctgcacccgt gccaaaatgt actttattta ggtgactctt tcgtgggaac 4980
ctcaaacaag caatcattgc tagctgagtg ctgaccctgt actgagctct ggggagacag 5040
ggttgaataa aacaaagtca ctgcccacag gtaacttata ttcaatacaa tgggggaaaa 5100
tacaatcact gcttccctgg ggttgtattt ttccattgtt aaagtgggca gtttgctcga 5160
gagtcatttt cactattggc aattcaaata caccttttgt cagttaaaaa acaagtgtgc 5220
cagggacctg agcttcatct tagggcaggg tgggtggaaa catttgtgag tctccagctt 5280
ttagtcacct gaaacttgga aacttggagg tcttttgagc agtttatgag tctctgcctg 5340
ctctggtcgg ctgccttctt ttattgctct gttggttttg ctaaagagtt aaaatattaa 5400
ggcttcataa aattaggaag ttaacaagct caaaaaccaa gtgtttgagt tacttcattc 5460
cactgagaga gctgtaaatg ggttgcattg gaacttaaaa taactgcatt gagtaagtga 5520
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ggattctccg tttggagctg tgtgatcctg gatgagtttc atgccttgga ttcagaaatc 5640
agactttcca tgagcttata tttcaagtga ataaatagct ctggtcaggc ttaatttgaa 5700
gaagaagtaa gcttggcagt gggtgagggt tccttggaag gccaactggg gcggaggggc 5760
tgagggcaag cggctctggc ccttcctggg gtgttacctg accaggtaac agctccctcg 5820
acctctcgga gcctcggcag tgaggggatt gggccagttg atctctgagg ctccttttaa 5880
ctagaatggt ctgggatttt tctaagaaaa caagtctttg aggaggttgt ggtcacctca 5940
ttcctaattt aaagcctggg gaggcttcct tatgagctac ttctttttcc taaattattg 6000
atggttaaag ccaaggctgg catcgaatag atgtgatcca tcttgagcct ggttgctttg 6060
tgtttcagct ttgtactggc tgctgaagtc cccgggagac cacaggggtg acatgttcat 6120
ctccaagaga tgagcttcca cgagactcat accccttgct ccttccctgg ggctccaagg 6180
cctttgggtc atctgaagtg agataccctt gtgtcatttc atcttttcct tctccacctt 6240
ctctgccgtt aaaaaaaaaa gaagaaagag aaaaatccta ttaatagaga aaccgagaag 6300
tgtagccatt ctgaatgtgt ttccaaaagg ctcctggaag tggcatggaa gttacagtga 6360
ttcagcacta cttggtgacg tgtgcctaga accacagggg gacattagcc aggacaacac 6420
gcctcaggac agaagtaagt ggctgcgaag aggcatgtcc atcactgccg gaaagatgca 6480
gagttcagtt tttggagtca gtgctgagag ttccatttct aaattcattc agagcattta 6540
tttaacacct actgtgtgct cagaagtgta tcaggtatgg ggactcagag gtaagggctg 6600
gtggcccctg atctcaaggt actcgtggta gatagtatga tgctcagctt aagggctggg 6660
cttctgaagt cggattgcca ttttctggat gtgtggtgtt tcttgggtga cttcatctct 6720
aagtctcagt ttccccatca gtaagataag agaagtaata gcagatacat acgtagctct 6780
tagggcattg cagaatggaa ggacctcctt atatgaaacg caaagcactg tgcctgatgc 6840
attgctagaa ctcaggcaat attagcgtgt tgtcattgtc atcatcatca tcatcatcat 6900
catcatcatc atcatcatct tcaaggcact gacaaaggag tcagctgtgt gggaggagtg 6960
ctgggacact cttgtctccc tggggatgag gtgggtgggt gggttaggaa atcttcacag 7020
agaaggaggg tgatgtgaga cttctgtccg ggagctgact cggaatttgc catctaatat 7080
gttggaaaag gttctctggg cagaggtatc caaagtcact ttgcctgtca ccctttgagg 7140
tcccagttgt tgcctatatc atgtgaccag tgtgtggctt ctcttgaatt aagagctgca 7200
tgtctggact gcctgggatt ttacagatgt catctcgtta actctccctg gagcttgtga 7260
cacccaggag atggcagttt atagaagccc tggcaccttc ttgaatgatg cttggtttgg 7320
tttctatgca ctgggaattc ctcacaagga aagatttgtc acatcttaag gaaggaaaaa 7380
aaggcaaatt tgggagtcca tggataccct attattttag attccaggac aaattgtcga 7440
ataagcacgt ttcataaaaa caatcctccg cagcatcccg tgacagcagc tggtccctcg 7500
ccacaggata attatgtctc cttgtgcaca caaaagtctc cgagggcata ttgttgtggc 7560
tggagtttct gataatttcc aaattgaaca acctcagtcc taatgagtca gaggcttgtg 7620
caatattttc aaacctcagg aacatctttt tcattagttg tgcaataaag atggtaggcc 7680
tatctctgtg atgagctgtt tttttttctc aaagtttgat gagattcgcc gtagaattcc 7740
ttctcacata gtcttgggca agattttacc cgatcttcca acacatgagt catctcatat 7800
cctgtgacta agaagagctg tctctttggt gccagttttc taagtgcagt caccacttga 7860
tggagacgga tggacacagt tgggattgcc caggcagatg ggcaatcttg ccagctagac 7920
ataggggagg gaagcctcaa tgttcagcgg tcacatctgc ttttctgtgg cacagagtga 7980
gctatacagg aatattgtat tctccaggac agttagggca gtgggaaatg tcatcaaaca 8040
gaacagtgac ccaaagagcc actgccactg ggtgctctgt gggagctggg cactgtgctc 8100
attgtgttat gggccttgct ttgttcttac cttgtagcca cccagagagg cagggcatta 8160
tccttgcttc ctagctgagg ccacagaaga ggctcctaga ggttagctgt aacttgtcca 8220
aggccagcca gtgcaaggag gcagagccag gatttgagcc catgtctgtt tcactcccaa 8280
actattcttc agatttcttt aagtcaagtg ttatttagaa atgttttgtt tattcatcaa 8340
atatttggtg ggtgtttcca gctatctttc tgttattaat ttctagttta attctattgt 8400
gggctgagaa tatattttgt atgatttcta ttctattacg tttgttaggg tgtattttct 8460
ggtctagaat gtggtctgtc ttggtgagtg ttccctgtgt gcttgagagg aatgtgtgtt 8520
ctgtcattgt tgaatggagt gttctataaa tgtcacttag gtctagtgga ttgatagtgc 8580
ggttcaggtc aactgtatcc ttcctgattt tctgcctact gatctatcaa ttcctgaaag 8640
agaagtgttg acgtctcctg agtctattct gaaacactga attgcggtct ccatgatgaa 8700
ccactagagt tagaaaacct gggtcctagc cccatttggg cctttgggat gactcccttc 8760
tgcctcagtt tcctcatcta caacaggggg acaatgatgc tgcctaggag acatcagcag 8820
gatactgtga aagtccagtg gcataagggg tatggaggag cttcgtcaac tcctaaagct 8880
tcagtgctag gaatcctaaa gcattgaaat ccaaagatat aaggaatatg aaggagtttt 8940
gtcaattcct aatgcttcag tgctaggaat cctaaagcat taaagtccaa tgatataagg 9000
aatatgaagg agctttgtca actcctaaag cttcaatgct aggaatccta aagcattgaa 9060
gtccagtgat ataaggaata tgaaggagtt ttatcaactc ccaatgcttc agtgctagga 9120
atcctaaagc actgaagtcc aatgatacaa ggaatatgaa ggagctttgt caactcctaa 9180
agcttcagtg ctttaggagt cctaaagcat tgaagctgta agagattagg acctctagtt 9240
ggcaattcca gactcttcca ggactcctga tagagccaac accaagaata gtgaagccag 9300
aaggatggaa atagtaaaat gcctcctggg tgtcaaagca tgggtctcct ctgggcatgt 9360
tctcttgtcc tactgagaca tgatagctct tggccaaagt gactgaactt gaccctctgt 9420
ttcaggaagg ccaaatgcag ggttcactac catcatgtcc aagggcagat gcgttggtcc 9480
agaacatcag catcccaatc attataccaa gcaaacagcc gtctctgcct gcaccgtgga 9540
gagcacacgc tcctcctggg gtggcctgca tcctgtgttc ttctcaggcc gactttctgt 9600
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ttctccacca gcatttgtgg ctctgaaaaa tatagcccag tgtggtttag ccccactgga 9720
tgaaacccag taggaaaagt ctgataatag cagaagacgc acaggaggaa gagtgaggat 9780
ttgagagcat ctgggaagga ccatgtgcct ggatatcgtt ctgtctgtgg gattctgtga 9840
cacttgtcat ttacagtctg ttcccatgga attctcatca ttggccaaac atatagtcct 9900
tctgtcctct gaaaaatatc attctgctcc gacctttcac acccatctct gaccacatca 9960
actccctgtt tgcatgcatc ttgtggatga aggacaccac tttacctgta aagacactgg 10020
tggcttccca aagccaccaa ctgacttgta gagaagacag aatcccagag tatgaaacct 10080
gagggtgaag ggtcctggca ggtcctagag ctcaaccctt cacttcacag gtggggaaac 10140
tgagggagcc aatgggaaca tgactctcac aagctgcaca gctcatctgt aggggccagt 10200
gtggagtctg tttgtcctga gacccagggc tgagcctttg agccctccgc atctcagccg 10260
catcctcctg ttggagcagt taggtgtttg ggagaggcca cggtccatgc tcatggtttt 10320
cctgtaaggc tggagaaaca ggccttgttc ccttagtctc tctaatcaaa atgaggttgc 10380
agaaaaccct tctccctact tctccctaaa ataatttcct tgggttagaa gatgactaaa 10440
agactattca tccgatgact gatgtctccc ttcaagagtt ataagcacat ataaatgcct 10500
ttgaatggta attataataa ttttgctgaa gggaaaatat cagtataaat atcatggtgg 10560
acacatggaa tgaggactga gatgctttca tgtcttttca gctgtggtta gattttcttt 10620
aagcagaata tacaagtttt tcctctccta gcataaggac tctttttttt tgtatctttt 10680
ctctctactt tttagacatg atggaaaatg catttataca tttgatgaca tattgtacta 10740
tctcagttgt ttaaaattat aaatgtaatt taatcatatg aaaaattaag aaaagaagat 10800
tcatatttca ccatcatctc cccagaaata tcatttcttt attactatta ttattattat 10860
tattattatt attattatta ttattatttt gagacagggt cttgctccat cacccaggct 10920
ggagtaaggg gcacgatctt gactccctgc aacctccacc tcccaggttc aagcagttct 10980
catgcctcag cctcctcagt agctgggatt acaggcctgc accaccacac ccagctacct 11040
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cctcaagtga ttggcctgct tcagcctccc aaagtgtggg gattacaggc atgagctacc 11160
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ccctgttcac atccatttgg gccaaggttg caatgttaaa caatcctgag atggacattt 11280
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acatagttgt tctggaagag gcatcttttc ccagtaaagc caaagatgca gatctaggct 13500
gtgcttgtga ctgacagcac agtgaggggt tcacagccag ctggccaggt gccccccgaa 13560
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cccctctgtg cccatgtccc cggcgccctg gaatgtgcag taccagcagc agcgattaga 14280
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cccagaccag tgctgggccg ggctctgggc tggagccgtg gctgacaagt ttccttggaa 14400
tttaatggag cgggccagac agcatgcagc cactcaaact gaaaacctgg gaaagaaatg 14460
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caggcaaccc ctcttgcaga caggaggccc cctccccttt cgcttcatgc ctcactggcc 14580
attaggaacc ttttaaaact gatttctctc ctgaccctca gagagaacat agtccaagtt 14640
ccctggagga ggaggaagcg ctctgtgttt ctctgcagtt cacggctcag ttaaatgcag 14700
cctacgtgct gtctttcccc actcctctgc ctgctcccgt tgtgcttctc atgatcattc 14760
tcaaattcag cgagaaacct cacaaaggga gcttttctta gggaagagtc atccttggcc 14820
tcccgaatgt ggaccagccc ctctccccag ctgcacagca tcaggttagt taaccacctg 14880
cctccatctg ggtcctgtct ggacaggcct actcacacct gctgcaggca tccaacttgc 14940
cctcaggtgc ctgtggctcg tccagagggg tggagcccac attccagtcc tgacaggtaa 15000
agttcagtgg cggggaccct gcatttagtg taaagatcaa tattccaggt cctctcttcc 15060
tgccacccag cgactggccg tttgcaggca ctcggtccca gttgtcctgg gcctgcagcc 15120
cttgcattct ctctgctttg tctctgctat tgcacccctg ccccatcaga aatgcaggtg 15180
ggggggcctt ccgctgggac agtgagagac tgggtagtaa ggggagcgct agagggatgg 15240
ttgcgcttgc atccagccct gactgcattc gctctccccc gcctctctgt gaaggtgctg 15300
agctgtgagt ggaaccaagt ggatgagagt ggccttgggc acctgccgat aaatttcccg 15360
gtgtgtcttc tcctcctggg agtcccatct ggatttgggt ctggatttat ttattcagca 15420
agtagcctct ttatagttac tttttttttt tttttttttt tgagatggag tttcactttg 15480
tcacccaggc tggagtgcac tggcgcaatc ttggctcact gcaagctccg ccttccaggt 15540
tcacgccatt ctcctgcctc agcctcccga gtagctggga ccacaggtgc ctgccaccat 15600
gcctggctaa ttttttgtat ttttagtaga gactgggttt cactgtgtta gccaggacgg 15660
tctcgatctc ctgacctcat gatctgccca ccttggcctc ccaaagcgct gggattacag 15720
gtgtgagcca ccatgcccgg cctgtagtta cttttaattt agccatgctc ggggctgaag 15780
gggatgccaa agaaatataa gatgagcccc tcagacggct aaagatgaag atgaggcctc 15840
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tgctggactg ggaaagtact gatggcagct gaggagtgtg tcccagactt cactgagcca 16020
ttcccaaaga ttattccaag ttctcctgac actgcactgg aggcctgctg tgctggcctt 16080
ctttatttac agtttctgac tggtgtctag cagccctgcc agagagagcg gcagtgtgtc 16140
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ttgctgcctg gcccttcaag tgaggatggg acatgctatc cattggcctt aatttccaac 16320
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cgctgacaga cctgcccagt ttcttagctc atcccggcct ccatcctggt gagcagacac 16500
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tggaagagac attagaatgt aaatgtgagg aagcgtcagc atgaggggct tgcctgggct 16740
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ttgacagatt tttttttttt ttttttgaga cggactctca ctctgttgcc caggctggag 16920
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gcctcagcct cccgagtagc tgggactaca ggcgcctgcc accacgcctg gctaattttt 17040
tgtattttta gtagagacag ggtttcaccg tgttagccag gatggtctcg atttcctgac 17100
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tgcttttctg tgctaaatct ggatttgggg tattaaatca aatgaatttg aaatgcaggc 17280
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aagggcccca catactcatt ttgtactggg tactgcatat tatgtagcta gtcttgaatc 17460
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ctgcgttctg ttttccaaat tagctctacg tatcaactca gctgagaaat tggaagcggg 17640
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ttttttcatc tttctgtaga ctggtgatga gatgcaccct gcaggcttgc aggcttgcag 17940
gagtaattaa aggtaatatt tgtgcctatt attgggcttg acatatagta gatgctctac 18000
aataaataga tcctattatt cttattgata atattatttt attgctaaca ttgaaggttg 18060
ggtgggattt gactagctgg aggcgaggag aatgagatca tccaggccgg aaggaaaaga 18120
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tgtgccccaa agtggcatta tcagttaggg ggagacactg aagacagagg tgaggcctgc 18360
ctgaattagc gtagagtggg attcttggaa gcttcagaag cttgagaaga gccacttgga 18420
ggtgttgaaa tgcacctggg agggacgtgg ggacccagct ctgggctgag agctgggaga 18480
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cctataggca tagctctggt gtcctgctgg cgtggcgtga gtgcccctca tgctgggagc 19140
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atttttgtgt ggtacatgct ttttatcaca gtgactgcca gaaatccaac ttcatatgga 20820
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ctgaagctta tctacactgc ctacgtctgt tttcttccac cttgaaagaa gttgttgaaa 21660
gtaattaaga agtattatgt gtaaaactcc agggatgatg tgcttcaagg aagcaacatt 21720
tatgaagttg tgtgcttgac tagtagttta taaagaggaa agacgaatca tttattgtct 21780
tgggattgaa tcttggcaat ttttaaacta taaagttaca ggaaatgttg gctgctctta 21840
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atccatctct ataaattgtt gtaacttacc attttacaaa tcttagttac tcagtttttc 21960
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tactctggat tgtctaggct ctgtgctctc cacatatatt tttgaaatag tttgtgaatt 22080
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ggtggtaaga ataggggatg agtgagatgt gaattaggat ccccacagca agccctgcct 42900
cgtaactttc tgatgggttt tcaatgtgtg gtgaagcaga cgcctgctgg gcccccttcc 42960
tgagttgagt ttgacctcct gcctcctgtc tatctccttg ggcagccagg ccaccccgct 43020
ccattaacct gtgccacccc atccctttac ctgtcgcaag cccagccctg aaggcctcaa 43080
aggcctggtc ttccagccag tccagggcct gaagggatgg cagtgtccct ggtggacctc 43140
ccctggtgtg gcctagtgca catcccagcc ctgcctcctg ccccgcctgc acgccatgag 43200
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gctgagtaga gatgcggcag gcctgcacct ccccgcagct gccctgcatg ctccagcctc 43380
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agatgctcac agcaaaacca acacctagat ggtgcttaca ggagccagcg ggtattcaaa 43560
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catgttgttc agggcagctg ctcgttctaa gtgaataaag gctgaaggaa ctcgggaggt 44280
ctgctcggct ccgaggaagg cagagaggga aagggccccg atgccttccc tgatagagct 44340
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gtgcacatga tgagtcgggg caggtttcac tgcctgtagc ttgggatcct tccctggggc 44760
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gtcctgcccg cagcaaaggg atgttagttg tgagctcagt tccccaccgg gcctggtgtt 45060
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taggtcattt gtttttatct atgtatacgc tgttttttgt ttgtttgttt gttgtttgtt 45960
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gaggggtcca gaccaggatt tgagccgcaa cctcagtgta cccttctgtg gcccttcctg 48480
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<210> 5
<211> 2123
<212> DNA
<213> Macaca fascicularis
<400> 5
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aaaacaaatg taatgctgca gatccgcagg cagaagctct gcccttctgt atcctatgta 1800
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<210> 6
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<212> DNA
<213> Macaca fascicularis
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tttttctatt tgcttcctcc gtccccttta aaatgcatta ctttgatcac gggaccgctc 1080
cgtgaaaact gtatgtaact cttttggaaa ggaagagtgt ttgccggccc ccgccggagt 1140
ttccccaaaa agtctacccc gggcagggaa cggtttggca tcgcactcgt ttcggcggcg 1200
ttgctgcctg tgttgctttc ctcgttttga gccagcccta caaaaatgaa agtggctcct 1260
tttgaataag ctgaatcggg ctttggatca cgaaatctgc agaggcgtag aagggaccgg 1320
gttagtaatg aggaaggagc ctacccctcc ctcctgccgc acacaggacc tgttcggcag 1380
gggagatggt ggtgatgggg gcaggagtgg agtggagcaa tgtctaactc tctcgcggga 1440
ccttccggag agatgcttcc catcttcagg cagaggccat gtggaagaat aatatcgagt 1500
tcagcggcgg ccagtcccgc ggtgtagaac cagccagcgg ggcttggcag tgcgcttagg 1560
cgcagccatg cggctgctgc ccgaccccag cgctgcctcc tcaactcggg cagtgccagg 1620
agaggggcat aggagagcac agtgcagagg gactggtcta gattttactt tataggaata 1680
tggttcagta tgaccaacta ggacttggca tagtttggct tacatggacc ggaaggtgcc 1740
agagccgaat tgggtgaaat tcgagattgt gtatttcact aacgcaggag cacagccctc 1800
gggaaactca gcctagttag gcagtagaga gttgtcccgg agacaagtga tcccgcagac 1860
tagagaatgg gcatgatgat agcacacgcc tattgagcac tcagtctgtg tgccgggtgt 1920
gttacctctg tgacctcatt tggtctcacg aggagggagt ttctcctctc tctctctctc 1980
tttttcttct taagagacag ggtctccctc tgtcgcccag gctggagtat agtggtgtga 2040
tcatggctca ctgcagcctc ccacccctgg actcaatgat tctcctgctt cagcctccca 2100
agtggctggg gctacaggcg gatgccacca cacccagctt ctcattcctg ttttacagat 2160
agcggaactt aggttgaaaa acttgcccaa ggtcactcag ctggagttta aacccagata 2220
gcctcattca gaggagtcag gccagcactt aactccaagg gtgtgggaga ggggtcaggt 2280
gctgtaaatt tccgggtggg ttggacgtgc atccccctca gagccgggaa cagcatacac 2340
aaagcctaag acttgtttgg aggtgaatag atcagtgtgg ctgggggatg tttggggagg 2400
gcagcaggag tgagccaggc tgctggccca gagtcccagg gctgaagagg ctggctgtgc 2460
cccgggccct gtgtgcagat gttcttgaac tggggcaact caaagcctag tgtagtgtag 2520
ggctgaccta gcagtggtgt gcggaatgca tccagggtgg agagtttaga ctactgcaat 2580
aatctgggtg tgaggcaaca acattgaaaa agcatgtttt tgtccaaaac aagccagctg 2640
ttactggtct cgctgtttgt ggtctcattg cacggggtcc tgagttgctg gcaccatgcg 2700
agtcgcctaa tttattgcta gtgaggcaag ttgcttaata agctttggag ttggctgagt 2760
ccctgtgtgg aggaaaacag gtcccccatt ggccatcagg ctcacggcgg gccccggtgt 2820
accagtgagg ggacagccac agagggataa gcatggtggc tttgaaagga gggagagaca 2880
gagtgggtac aatgctgttt ttatccctcc ctccttcttt tgcaaatatt tgttgagctc 2940
cgtagggtgt ctgacaccgt ttgcatgttt gtctggcaca ccagaggcac ttggtacgag 3000
tggattagtg aatgaataaa tgaatgaatg aagacaaatg ggaggtgctt tcgatacaca 3060
gccattctgt ttttccttag tggaaggcac tgctttgctg cgccccctct ctggatctca 3120
ctctccaccc ttgactttcc ggaggtgttt ccgaggacag gcgcctggga gccagcagac 3180
ttcattcagt ccaagccagg ctccaggact cagcagctgg tgcctacggg caggtcactt 3240
gacgtcactg ttaaatgagg tgaattggct gcctgctctg gctcgaagat tggcgggaga 3300
gctactttag ctgcaatgga catgagcctt ttcatggggt gccacttgac tagaggcctg 3360
aagttggagc aaggcacaca cagatctgaa gacagagctc tcgaggcagg agcgggtgct 3420
gtgatttcaa atattacaag gaggctttgt ctggggcaga gcatgcgagg ggatgagagg 3480
tagaaatgtc atcagatcag gggtctccag gcaggtgacc agtactttgg gtcatggtag 3540
atctttggat agaggaacgt gtcaccattc aaaggaaggt actttcattt gtaagctgtt 3600
taatgaatag acctcagaga acatctctgc tcaccgctct ggaaatgaag gcaaatcatc 3660
tatttcagaa gtcaatgcac tggcagggtt tggatggcaa agtatacaat tcaactagag 3720
aacaaagatc tgtcatctcc agctctgctg gtcagatgat tacaaaaaag aaagggattg 3780
aaatactaat aggatacaaa taatgagggc taacatatat gttgtgctta ttctgtgctg 3840
ggtgcatact aactcatttg atcctcctga cagtcctgtg agtgagtgct gtagtcttcc 3900
ctgggttaca gctgggcaac taagtcacag agcagtacct tgctcaggac tgctggtccc 3960
acacaactgg atccagagtc tcgttcataa ccagcatgcc gtgccgttga cagagcaaca 4020
gagattataa accaccccca gctaagcccc agctaatagc tgaaatcaac agagctccag 4080
atggctgtgg ccttgagatg aaacaggaca gatcacagcc ctcactcagc aggctcaggt 4140
tgacagggtt gcctccagtt gccatcagtg cagccctcac taaagaaaag caaaaagaac 4200
cgagggactg taggaaagct gtttccacgc cagagatcca gacagcaaac tgctcttgaa 4260
gagagaaagc ccttccggat tcccccatgt cccaaaagac cagccacgat tccagacctc 4320
tgctaaaaca cggacaagaa gccaggatca aaacctgaaa cagacttccc aaacagcaga 4380
accctcatcc atttctcctc ctagtacatc ctccaggaaa ggccacccga ctcctgacag 4440
gagcccagac aagcttggag gtctgcaagc tgcaggggtg cccagaaact ccgcctctgg 4500
tggtttttag tattgcctgc tcctggtctc accccagagc ctctgaaggc agaggctgta 4560
cgtacatacc tggtgaagaa ccaagggctt agacggttgc tttacttctt ggaggcctgg 4620
atggtttgta aaatttattt atttattaat tttttttttt tgaaacagag tcttgctctg 4680
tcgcccaggc tggagtgcag tggcgcgatc tcggctcact gcaagctctg agacctcgcg 4740
agttcacgcc attctcctgc ctcagcctcc caagtagctg ggactgcagg cacccgccac 4800
catgcccggc taattttttt ttgtattttt tagtagatac gaggtttcac cgtgttagcc 4860
aggatggtct tgatctcctg acctcgtgat ccgcctgcct tggcctccca aagtgctggg 4920
attacaggtg tgagccactg cgccggccca aaatgtactt tatttaggtg attctttcat 4980
gggagcctca aacaagcaat cattgttagc tgagtgctga ccctgtgctg agctctgggg 5040
agacagggtt gaataaaaca aagtcactgc ccacagggaa cttacattca atacattcag 5100
tgcaatcact gcttccccag gttgcatttt tccattgtta gagtgggcgg tttgctagag 5160
agtcatttcc actgttggca attcaaatac accttttgtc acttaaaaaa caggtgtgcc 5220
gggacctgag cttcatctta gggtaggatg ggtggaaaca gttgtgagtc tccagttttt 5280
agtcacccga aacttggaaa cttggaattc ttttgagcag tttatgaggc tctgcctgct 5340
ctggtcagct gccttctttt attgctctgt tggttttgct aaagagttaa aatattaagg 5400
tttcgtgaaa ttaggacgtt aacaagctca aaaaccaagt gtctgagtta cttcattcca 5460
ctgagagagc tgtaaatggg ttgcattgga acttaaaata actgcattga gtaagcgatg 5520
gtggcgggca ccatgagcta actgtggtca gaagcctgac agcctctgct ttggggctgg 5580
attctccgtt tggagctgtg tgatcctgga cgagtttcat gccttggatt tagaaatcag 5640
actttccatg agcttatatt tcaagtgaat aaatagctct ggtcaggctt agtttgaaga 5700
agaagtgagc ttggcagtgg gtgagggttc ctcggaaggc cagctggggt ggaggggctg 5760
aggacaagcg gctctggccc ttcccgggtt gttacctgat caggtaacgg ctccctcgac 5820
ctcttgcagc ctcggcagta aggggattgg gccagttgat ctctgaggct ccttttaact 5880
ggaatggtct gtgattcttg taagaaaaca agtctctgag gaggttgtgg tcgcctcatt 5940
cctaatttaa aggttgggaa ggcttcctta agagctactt ctttttccta aattattgac 6000
ggttaaagcc aaggctggca tcgaatggat gtgatccatc ttgagcctgg ttgctttgtg 6060
tttcagcttt gtactggctg ctgaaagtcc ccaggagacc acaggggtga catgttcatc 6120
cccaagagat gagcttccaa gagcctcata cctcttgctc cttccctgga gcctccaggc 6180
ctttgggtag tcggaagtga gatacctttg tgtcatttca tcttttccat ctccaccttc 6240
tctgccattg aaaaaaaaaa aaaaggaaag aaaaatccta ttaatagaga aaccgagaag 6300
tgtagccatt ctgaatgtgt ttccaaaagg ctcctggaag tggcatggaa gttggagtga 6360
ttcagcacta cttggtgacg tgtgcctaga accatagggg gacattagcc aggacaacac 6420
gcctcaggac agaagtaagt ggctgtgaag aggcatgtcc gtcactgctg gaaaggcgca 6480
gagttcagct tttggagtca atgctgagag ttccacttct aaattcattc agagcattta 6540
tttaacacct actgtgtgct tcgaagtgta ccaggtacgg ggactcagag gtaaggacta 6600
gtggcccctg atctcaaggt actggtggta gatagtgtga tgctcagctt aagggctggg 6660
cttctgaagt cggattacca ctttctgaat gtgtggcttt tcttgagtga cttcatctct 6720
aagtctcagt ttccccatca gtaagataat agaagtaata gcagatacat acatagctct 6780
tagggcattg cagaatggaa ggacctcctt atatgaaacg caaagcactg tgcctgatgc 6840
attgctagaa ctcaggcaat attagcatgt tgtcattatc attatcatca tcatcatctt 6900
caagacactg acaaaggagt cagctgtatg ggaagagtgc tgagacgctc ttgtctccct 6960
ggggatgagg tgggtgggtg ggttaggaaa ccttcacaga gaaggagggt gatgtgagac 7020
ttgtgtctgg gagctgactc ggaatttgcc atctactatg ttggaaaagg ttctctgggc 7080
agaggtatcc aaagttgcct tgactatcac cctctgaggt cccagttgtt gcctatatca 7140
tgtgaccagt gtgtggcttc tcttgaatta agagctgcat gtctggactg cctgggattt 7200
tacagatgtc atcttgttaa ctcttcctgg agcttgtgac acccagaaga tggcagttta 7260
tagaagccct gggaccttct tgaatgatgc ttggtttggt ttccatgctc tgggaattcc 7320
tcacaaggaa agatttgtca catcttaagg aaggaaaaaa aggcaaattt gggagtccat 7380
ggatacccta ttattttaga ttccaggaca aattgtcgaa taagcacatt tcataaaaac 7440
aatcctccgc agcatcccgt gacagcagct ggtccctcac cacaggataa ttatgtctcc 7500
ttgtgcacac aaaagtctcc gagggcatat tgttgtggct ggagtttctg ataatttcca 7560
aattgaacaa cctcagtcct aatgagtcag aagcttgtgc aatattttca aacctcagga 7620
acatcttttt cattagttgt gcaataaaga tagtaggcct atctctgtga tgagctgttt 7680
tttttttttc tcaaagtttg atgagattcg ctgtagaatt ccttctcaca tagtcttggg 7740
caagatttta cccgatcttc caacacatga gtcatatcat atcctgtgac taagaagagc 7800
tgtctctttg gtgccagttt tgtaagcaca gtcaccactt ggtggagacg gatggacaca 7860
gttgggattg cccaggcaga tgggcagtct tgccaagcag acatagggga gggaaggctc 7920
aatgttcagc ggtcacatct gcttttctgt ggcagagtga gctatacagg aatattgtat 7980
tctccaggac agttagggca gtgggaaatg tcaccaaaca gaacagtgac ccaaagagct 8040
gctgccactg ggtgctctgt gggagctggg cactgtgctc tttgtgttat gggccttgct 8100
ttgttcttaa cttgtagcca cccagagagg tagggcatta gccttgcttc ctagctgaga 8160
ctacagaaga ggctcctaga ggttagctgt aatttgtcca aggtcagcca gtgcaaggag 8220
gcagagccag gatttgagcc catgtctgtc tcactcccaa actattcttc agatttcttt 8280
aagtcaagtg ttatttagaa atgttttgtt tattcgtcaa atatttggtg gatgtttcca 8340
gctatctttc ggttattaat ttctagttta attccattgt gggctgagaa catattttgt 8400
atgatttcta ttctattaca tttgttaggg ggtattttct ggtctagaat gtgatctgtc 8460
ttggtgagtg ttccctgtgt gcttgagaag aatgtgtgtt ctgtcgttgt tggatggagt 8520
attctataaa tgtcacttag gtctagtgga ttgatagtgc cattcaggtc aactgtatcc 8580
ttcctgattt tctgcctcct gatctatcag ttcctgaaag agaagtgctg acgtctcctg 8640
agtctattct gaaacactgg attgcggtct ccatgatgaa ccactagagt tagaaaacct 8700
gagtcctagc cccatttggg cctttgggat gactcccttc cacctcagtt tcctcaacta 8760
caacaggagg acgatgatgc ttcccaggag acatcaacag gatactgtga cataagggat 8820
atgaaggagc tttgtcaact cctaaagttt caatgctagg aatcctaaag cattgaagtc 8880
caatgatata aggaatatga aggagctttg tcaactccta aagcttcagt actgggaatc 8940
ctaaagcact gaagtccaat gatataagga atatgaagga gctttgtcaa tgcctaaaac 9000
ttcagtgctt caggagtcct aaagcattga agctttaaga gattaggacc tctagttgac 9060
aattccagac tcttccagga ctcctgatag agccaacacc aagaatagtg aagccggaag 9120
gatgcaaata gtaatatgtc tcctgggtgt caaagtgtgg gtctcctctg ggcatgttct 9180
cttgtcctac tgagacatga tagctcttgg ccaaagtgac tgaacttgac cctctgtttc 9240
aggaaggcca aatgcagggt tcaccactgt catgtccaag ggcagatgct ttggtccaga 9300
acatcagcat cccagtcatt ataccaagca agctgcaatc tctgcctgca ccgtggagag 9360
cgcacgctcc tcccagggtg gcctgcatcc tgtatcctgc atcctgtgtt cttctcaggc 9420
cgactttctg tttaatgttt gctggtcagg aaatggcctg agctgaggtt tctcagatcc 9480
cagcctgacc tttctccacc agcatttttg gctctgaaaa atatagccca gtgtggttta 9540
gccccactgg atgaaaccca ataggaaaag tctgataata gcagaggagg cgtaggagga 9600
agggtgagga tttgagagca tctgggatgg accatgtgtg tggatattgt tctgtctgtg 9660
ggattgtgtg acacttctca tttacagtct gttcccttgg aagtcccatc attggccaaa 9720
catatagtcc ttctgtcctc tgaaaagtat cattctgctc ctacctttga caaccatctc 9780
tgaccacatc aactccctgt tttcatgcat cttgtggatg aggacaccac cttacctgta 9840
aggacactgg tggcttccca aagccaccaa ctgacttgta gagaagacag aatcccagag 9900
tatgaagcct gagggtgaag ggtcctggca ggtcctagag cccaaccctt cacttcacag 9960
gtggggaaac tgagggagcc aatgggaaca tgactctcac aagccacaca gctcatctgt 10020
aggggccagt gtggagtctg tttatcttga gacccagggc tgagtctttg agccctcccc 10080
atctcagcca catcctcctg ttggagcagt taggtgtttg ggagaggcca tggtccatac 10140
tcatggtatt cctgtaaagc tggagaaaca ggccttgctc ccttagtctc tctaatcaaa 10200
atgaggttgc agaaaaccct tctccctact tctccctaaa ataatttcct tgggttagaa 10260
gatgactaaa aagctattca tctgatgact gatgtctccc ttcaagagtt ataagcacat 10320
ataaatgcct ttgaatggta attataataa ttttgctgaa gggaaaatat cagtataaat 10380
atcatggtgg actcactgat gaatgaggac tgaaatgctt tcatgtcttt tcagctgtgg 10440
ttagattttc tttgagcaga gtatacaagt ttttcctctc ctagcataaa gacttttttt 10500
ttgtatcttt tctctctact gtttagacat gacagaaaat gcatttatac atttgatgac 10560
atattgtact atctcagttc tttaatatta taaatgtaat ttaattctat gaaaaattaa 10620
gaaaagaaga ttcatatttc accattacca tctctccaga aatactatta ttattattat 10680
tattttgaga cagagtcttg ctctgttgcc caggctggag tcaggggcac gatcttggct 10740
cactgaaacc tctacctccc aggttcaagc agttctcatg cctcagcctc ctcagtagct 10800
gggattacag gcccacacca ccacacccag ctacctttta tatttttaag tagagacagt 10860
tttgccatgt tggccaggct ggtctcgaac acctggcctc aagtgattgg cctgcttcgg 10920
cctcccaaag tatgggaatt acaggcatga gctactatgc ctggcctaat tccatcattt 10980
ctgtcccaag tgttgccacc atttggttaa ctgttcccct gtccacatcc atttaggcca 11040
aggttgcgat gttaaacaat cctgagatgg acattttcat gtttatggct atttctgtat 11100
ctagggtcat tctcttagga gaggtactaa gaagtacaga aactggaaag aaggatatgg 11160
aatttttatg gttctggtat aaattgccaa attattttcc agaaaggttg tagccatatt 11220
tgttgacatc agctctagaa tttcaacctc gtaagtcact gaaagaaatt atcccaaaag 11280
cagtccttca ggaataatgg aagaagatgg tgccgaaccc agccattctg ctcactgtta 11340
gattactttt ttggtcttac aggttacttt cattctcagg ttgattgctc ttaacagttg 11400
agcaatgttt ggggtagaat aatgagcact tttccaattt ggttctacct ggttgagttg 11460
tgatcacagg cagtctcacc tgggaggggc ttgggtggtt gtcagcttgt ccttccaaca 11520
ctcgcgtctc aggcgagcag cctgggacca gtgaggcgac ctgagggctg gaggtcacaa 11580
actaggaggt aacagagaac ccaggtctca ggaagcccag tccagggctc gctgcagtaa 11640
gcctctcgga tgccagctct gtccaggatg cgggaggagg ccagactgat ttggtctgtt 11700
ttgaaaagtg atgaaaatat ttattcaaat gttttgtaca cataggcaga agtataacag 11760
aagctgcata tacaaaatca ttttctagta gtcacattaa aaaagtaaaa agaaacaaag 11820
aacattattt ttctttttaa aacagcttta tcgagagata atttacatac tataaaattt 11880
accccaagtg tacaatttgc tgttcttatg tattcacaat catgcaccta tcactaccaa 11940
ctccagaaca ctttcatcac cctaaaaaga aaccccgtat ccattagtag ccaccacgta 12000
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tattctggac atttcatata aatggaatca aacaatacgt aactggcttc tgtgtcttag 12120
cataatgttt tcaaggttgt ccacgttgta gcagggatca ttatttcatt ccattttatg 12180
attaaaaata ggtcttttta tggatacagg gagaccagac ttctatttta tctcccctcc 12240
ctgatgggga atcctaattt cagcccggaa ggtcactgtg aaagtctaaa cgcacaggtg 12300
atactgactg gttccattgg aagaaactgt agcacctgac tcaggaagcc agcattaaaa 12360
ccaagaatat tctatacgga tggggattac gcactgaaag gaaaacatga ggaaatgcac 12420
ttttcagatt tattagatca cagaacttct ttggagctgg aaaggatttc ggaaaccgtc 12480
tagcctaccc cctcgtctta ccactgaggt aactgaggcc caggaagggg aagtggcttg 12540
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tctctgtttc acaagttccc gttgcatggg tgctgggtat tgcttgaaag gactggcctc 12660
ttccttgata caggggctcg ttcactgtca cctccctccc tcacgtctct tgtgcccctc 12720
tgcagccgca ggccctcctc ctgcaccagg ggggcacact caacccgggt gggcactgcc 12780
tcctagtctg cggccagagg ctgggaggct ggggagactg aacagccccg gcagctccag 12840
acataacaac ctatgttgag gagtcggtgc aggaagcgaa cccagctgag aaatctgcga 12900
aggtcaggac cggagccaga cgcttatcaa gaggaaagtt aatggtgttt ttgtgaactg 12960
agcagtcagc tgtttccctg aagataataa tagacacatc atgttgggca ttcaggaggc 13020
atctaaaaaa aaattgtgca gtggaattga ttggaagctt ttccctaata cataaaatag 13080
gccagaaaag actatcaaat gtaacagcac cgatcaaacc caagcactca ccatagatcc 13140
aagcaaggac tgaaaaacac gaattttttt tttttttttt tccgccagtg agtctgaaaa 13200
gtgattttca atgccaggcg cctttaaaca cagacaacat aaacaacaac atagttgttc 13260
tggagaaggc atcttttccc ggtaaagcca aagatgcaga tctaggctgt gcttgtgact 13320
gacagcacag agaggggttc acagccagct ggccaagtgc cccccgaaag cgcatttcga 13380
atctgctcta tttgagagag actgtcttag ccttgtttgg gaaagtcttc ctccttcact 13440
tcacctgcca cagacttttc caggcaccat ctgctgtagt cttggcccag tccctgcaac 13500
agttactgct gaaggcaccc gggacatgca agacggggga gcagcctgag gtctggcgtc 13560
cggcaagctt ttcccacttg gagccgtctg ggagactgtc ccggaaacag aagggctgcc 13620
aacacttgga agtgccaatg tggactgaaa gttgaggaca ggctccgggc tcccccacct 13680
cttcctcctt gattcattaa aaggaaagaa agaagccaca cgaaactctc ctgaatttca 13740
tttatttcta tacaaaagac agagcgtggt cattcatcat tcaaatttta acctttttag 13800
acaaataata attcctgctt gtgaattcag tgtattttaa caagaatagg tctgagggcc 13860
attggccatg ggagacaccg aaggctggct ttccttagat ttgcagacag tggccctgat 13920
ggtgcatagg gtttcaggtt tcctttagac ctcagctggc tgcctgtgcc accacttagc 13980
aatgccattg tctttcctgt gcattttctc tgcagagttc gaggaaatcc agtcgcgcag 14040
gcccctctgc ccccatgtcc ccggcgccct ggaatgtgca gtaccagcag cagcgattag 14100
aatgggggtc tggtttcccg gaatgtgcaa ggtctcactt ctgtttctgc tgcctccatg 14160
ccccagacca gtgctgggcc gggctctggg ctgcagccat ggctgacaag tttccttgga 14220
atttaatgga gcggggcaga cagcatgcag ccactcaaac tgaaaacttg ggaaagagat 14280
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cattaggaac cttttaaaat tggtttctct cctgaccctc tgagagaaca tagtccaagt 14460
tccctggagg aagaggaagc gctctgtttc tctgcaattc acggctcatt taaatgcagc 14520
ccacgtgctg tctctcccca ctcctctgcc tgctcccctt gtgcttctca tgatcattct 14580
caaatttagt gagaaacctc acaaagggag tttttcttag ggaaaagtca tccttggcct 14640
cctgaacgtg gaccagcccc tctccccagc tgcacagcat caggttagtt aaccacctgc 14700
ctccatctgg gtcctgtctg gacaggccta ctcacacctg ctgcaggcgt ccgacttgcc 14760
ctcaggtgcc tgtggctggt tcagaggggt ggagcccaca ttccagtcct gacagctaaa 14820
gttcagcgag aggaccctgc attcagtgta aagatcaata ttccaggtcc tctcttcctg 14880
ccacccagag actggccgtt tgcaggcact cggtcccagt tgccctgggc ctgcagccct 14940
tgcattctct ctgctttgtc tctgctgttg cacccctgcc ccatcacaga tgcaggttgg 15000
gggaccttcc gctgggaagt gagaggctgg gaagtaagag gagcactaga gggatggttg 15060
agctcgcatc cagccttgac tgcattcgct ctcccccacc tctctgtaaa ggtgctgagc 15120
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gcctcaggca accccacagg gaaagggtca cccactgtca gggcagacct ttaccatggc 42720
tgggtgacat gggctggctg tgggaaggtg gttggtggtt ccccctgttg gatttgcaca 42780
ggcccagatg ctcacagcaa aactaacacc tagatgatgc ttataggagc cagcgggtaa 42840
tcaaagagct gttcagatct tcatttgctt cgttctcaca gtggaccatt gaggtagctg 42900
tatgttagtc ccattttcca gatgggaaaa ctgaggacct gagtggtcgt aagctcaggc 42960
ccctatctaa atcacacagc ctggccccag gtctatgctc ttgaccatgg acagtgctct 43020
cctggtcctc ttggtatctg tgatctgagg gaccttcctc ctcctcagtc ttgtatagtc 43080
agttttaggt cttagactct ttcttcacat ccctttcttc tttcgggagc tctctcaccc 43140
agcaccttcc ttatctagta tgtgttgggg gatatttgtg gcatgatgtg gcgctgtgta 43200
gtggatgaga gagtctgttt ttccggtttc agccccaggt ttcaatccct gctctgtctc 43260
aagtcaccca gactcttgga ggctcagttt cctcatctgt taaatgggca tggtggtcac 43320
ctcacctcat cagctggtgt ctgctccatc cctggtggag gagatggctc aagtaacccc 43380
ttggttccac ctgccccacc ccactggtcc cctggctctt tcttttttga gatagacaaa 43440
cgtgaggctc tggatttgca gttcccacga gggctggggt ggctgtctgc tttctgggtc 43500
tggtccatgt tttccagggc agctgctcgt tctaagtgaa caaaggctga aggaactcag 43560
gaggtttgct cggctccgag gatggcagag agggaagggg tgccgatgcc ttccctgata 43620
gagctgggga ggcccttctg tggttccccc cagctccttg gcttgggtga ccctggagct 43680
gacttctgtt ccattttgtt gtgcagagtt gtttggggct cctggctctg cctggccttt 43740
gtgggccact ggagatcagg gcttctggag ttggccaatt agcccgccca gcccagggag 43800
cacaggtgtc tgatggaggg ccttttcagg agaggagaga tggcccgcct gttgggtctt 43860
gctgtcttgg gtcctggagg ccttgctgtc cccatgctcc atccatgccc ttgaccaatg 43920
tggccctgta ctcagcatag gcatgcacct gagtcagtgc aattccctgt ccacagagca 43980
ccccaaatat tccaggcctc aggatgggtg tgcacatgat gagccgggca ggtttcacca 44040
cctgtagctt gggatccttc ccggggcttg gttctcgaag gctgccccag gcagtcacac 44100
cccaaaccct aaattcatgt tgtcttcctc tgtctcttgg cctcaaggtt tcagagtgag 44160
tctgtgctga tagcttcaag atgtgatgag accccgactt ggcctccagt tccctcccca 44220
cggtttcctt ggcgtgtgtg cggcttcagt ggtcactggc tcccacacag cttgtaatgt 44280
gtggattacg ggtgggaggg aagtccggtc ctgcctgcag caaagggatg ttagtcgtga 44340
gctcagttcc ccatcgggcc tggtgtttcc aaatggcccg gcactgtccc tgcttggttt 44400
tccatgatat ctgtgccttt acccatttgg ttaaattaaa caaattcagc aatgccagcc 44460
attgtggttt cagggtaagt tgcctgtcct gctgcttggc cgctcctcag agctgcggcc 44520
gggagagttc gtggtcgcca tcggaagccc gttttccctt caaaacacag tcaccaccgg 44580
gatcgtgagc accacccagc gaggcggcaa agagctgggg ctccggaact cagacatgga 44640
ctacatccag accgacgcca tcatcaacgt gagcctctgt ccctctgcgg gtggggcttg 44700
gggcagggtt ttgccagagg agaggagtca gcatcggtct ctgacttcct tgtagtctgg 44760
gtgaaaggat ggaactagac caagccatgt ggatcctagt gccagcagca cgacaggggt 44820
cacacggcgg ggacagtgac actggagcag gtggacagcc agcctcctcc caggaggaag 44880
aagttgtgtt gggtgcttta gggtgattgc agttggcttc tgggcttcag agagaaaatc 44940
tccccattta cggcacctct aaaactttct gaaaattgtt aaggtcattt ttttccagca 45000
aaatattagg ttaatgggaa tgaatctcag agaagaatca tgccccacac tgtagacacc 45060
atgctcagga gacggccagg cagggacata gattggacca cgttatgaca caatttgtaa 45120
cctttccatt tctgtttaat tgcagtatgg aaactcggga ggcccgttag taaacctggt 45180
aacgtatttt aaacgttatg tcgtttgttt ttatttatgt acacactgtt tttgttttgt 45240
tttgtttttt gatgtagggg gtcttttcaa acataagctt gccaaagcgt gttatcaagt 45300
ttctttaaaa tgagctctgt gaatgtactg catgcttgca aatgacccta tggatctttt 45360
ctggaaagag taaggcaggc tggaggtgag ggttggaaat gttatgccag agagcacact 45420
tgtgtctcag agttacaggt aaacacagtg aaattcaggg ccaatgcagg agtaaggtga 45480
aggtcaccaa aagtgctggc cggtcactga aagagcctcc tccaaattaa atctcctggg 45540
ctgctgaagg agctggctgg gctcatacac actttctctt ggccaggaat cctcccttaa 45600
ggcctggctg gaatgaggag gagttaccca cccacaaaga tatcatttaa gtctaccctt 45660
aaatacttga gcagaaaaag tgaagcctta gaacatagac catcagcgct agagggcagc 45720
tccggggccg ttcatagagg gcagctccgg ggccatttgt aggggccgtc tttagtaagg 45780
ccttggcatc aggtactgac atcccagcac tcgtgggaag tgcgcacggg gcgatgtatc 45840
cccgcttggc agctttccct tcccagcaga ggggcagctg tgctcccagc tctgccctcc 45900
gcctcccccg cagcaccctg gggatggagt ggagacggct ttgcgggtaa tgaagcatga 45960
cagccctaag ctctagggtt gttccccctc aagtcagcag agtcatctta agatcattag 46020
aaatgagaga agcaggaagg tgtaggcagc cacctagagg actctgagcc tttggaaacg 46080
tattccttgt gaaacaggag caaataatat cgtgcatttt gaaactatct gtgcttaccg 46140
cgaggtgagc acccagtggc gacctggagt gtgtgcgatt cttccacagc tgcgcgtggc 46200
ctacgctgcc tgggtgtcct gatgcctctc tccctgctcc cccggggatc ccctccatgc 46260
agctccccgc ttcaatctct gaaatagctc agtgacttct ttcatgcaca ttctctttgg 46320
gggtgtacct gccggtaagc cttcacgatt cagcaagccg tgtccttctt gcctttcagg 46380
acggtgaagt gattggaatt aacactttga aagtgacagc tggaatctcc tttgcaatcc 46440
catctgataa gattaaaaag tttctcaccg agtcccatga ccgacaggcc aaaggtaggc 46500
aaggcccaca tagccccggg gactccggag attcggcctg aagctcaact gccctttggg 46560
aattggggaa gggaaaagtg gcagccccta agactagcca agccgtcttc gatccagaag 46620
tgaacaggaa tgcacattac taaatccctg gtagaaggtc acagacattg cgccattttt 46680
gtcctccgat catgacaatg tcacttgagt cagtctaata tgtaccagac acgatcctag 46740
gtgatttctg tccattattt cactttattt atgtatgtta cttaattctt ttgccctatc 46800
agttaggaat tactagtccc attttgctga tgagaaaaca ggttcaggga gatcattcta 46860
caaacattta ttgcctaagt caagcaggga gcttggcagt agactgccca actggagcct 46920
ggggctccgc tgaggccttt gccggtgtgt gtttatgttc tgttggggga tgggaaggct 46980
gacagtaaat aatcagacac attagatact attagtgctc ccaagaaaac agatcagggt 47040
ggctggcaag ggagtgactg gacaggcagt tggtagagat ggtgtggcca ggaaatgcct 47100
cccaaactga ggtctgagtg aggaggagcc agcaggtagg gatgtggggg gaacactcca 47160
gaaggaaaga cagaggactc agcatagctg agtgagcaca aggcccctgg agtggcctgg 47220
gggccggagc acagtgacag catggaggtc tctggggtgg aaagctcgcc aaggccaagc 47280
aagcaggctc acagcgggcc atggtgaggg gcctgggttg catcctaacc gcatttaaga 47340
acagggaagt tcatgatctg attgatgtca ctgaaaggac actctgatgg ttggggggag 47400
tctgctggag gagttgctgg aagttgggga ccggagaagg agctctccca gtcatctgga 47460
tgagacacgc tgggggctca gacaagggtg gtggcagtgg aggtgggaca gaggggtcac 47520
attccaggta tacatggggg tagcgcaagc ctggggaagg gccagctgtc aggatgaggc 47580
catgaggaat tgaggatcat gcccaggtat ctgaccatta actgaacgat gagactttcc 47640
tgaggtcccc cagaggggag gggtccaaac caggattcga gccgcaacct ccgtgtgccc 47700
ttctgtggcc cttcctgcaa cctgggggat tgggccccca gcccctggtg tccccagcat 47760
acccaccaac tgggctgacc ttctgccgtc cctttgttgt ctcaccagga aaagccatca 47820
ccaagaagaa gtatattggt atccgaatga tgtcactcac gtccaggtgg gcaaacagga 47880
tgcgtgtgtg tgtcttaaat tttaataaac ctgaacttca gaaggtgctc acgggcaccc 47940
ctgaaagaga aagcttatgc agccttaaga catctcagtt tctgcttata atgaagtagc 48000
atcaggaaag aggacaggtc atcagccgtg gcccctttgt ttggttttat cctgtgtttc 48060
tgcattctga gctggttttc ttcattggcg gctggccctc cagtgtagaa ggttctgccc 48120
tcctctttga aggcaggcct gagcagtgcg tgtgtggtgg ggctgttgat tcattctggc 48180
tcatgtcttc cttaccccat attctgttga aacccacatt ccaggagggc cccaagcccc 48240
tcccacagct ctaggcactc tgctttcatt gctctgctct gcggcagctc gtgggccgtg 48300
gctgcaggaa tgccagggca ggcccagtgc agggaagtga atgactgatg tgcttgtttt 48360
ccccgagctg gtggaactgc ggcctgtggt tggcaggctc acggcatcct ggtgttttaa 48420
cctggatgaa aaattctggt gtaatctcgt gagtcctggt agtatagact caactggcgt 48480
ggctgaaact gtcagaggta aagtaggaaa agactagaat atactaacag gtagattaat 48540
gtgttcatta ctatgatgaa ttaatgattc actcactgtg aaagtattaa tatattttga 48600
tacacattat gaatgatggt ccctttcttc gcactccaga agatggagcc acttgtcaag 48660
gttaaagtgt ctcctcagtt gtttgccttt ggaactagaa ggtggaggga aagatgggag 48720
gcccttggcg cccagctccc tgggttcctg ttccagctct gatacttcct gccttgtgac 48780
cttgggaacg atatgacccc tgagtgcctc agtttcctcc tcttcaggat ggggatgaca 48840
gcgcaggtgc ttctggtggt agcggtgatc accagccaca gtgatgccag tcactatcta 48900
ggccgggtgc tttactgggg tgacctcatc tgatcctcac aactcatatt gtagggtact 48960
gttattatcc ccgtttcgca ggtgaggaaa tgaaggcaca gagaggttaa gcaaccgtct 49020
ggggtcacgc agctagcaaa tagcagagct agggctacaa accaggccaa ccactatact 49080
ttacggactc cttagtaata gctactgtta attaagaaat aataacaatg atgatggctg 49140
cgcattgctg gctcacacct gtaatcccag cactttggga ggctgaggcg ggcagatcag 49200
ttgaggccag gagttggaga tcagcctggc caatttgtga aaccctgtct ctactaaaaa 49260
tatgaaaaat ttagctgggc ttggtggcag gcacctgtaa tctcagctac tcgggtggct 49320
gaggcaggag aattgcttga acccaggaaa tagaggttgc agtgaactga gatcgtgcca 49380
ttgcactcca gcctgggtga tagagcaaga ctctgtctca aaaaaaaaaa aaaagaaaag 49440
aaaagaaaag aaataataat aatgatgaaa gcactttcct tgctgttacc aagtaaatct 49500
ttgactctgg tagagaggca attttaaaat aggatcagaa ctcctggagg aattttacat 49560
tagacccagg gagaagaagg gaactggtga gagcttgagt tttgcctggg gaaggactgg 49620
tgtctcttca cactaacacg ggtgcttttt ctctggagca gcaaagccaa agagctgaag 49680
gaccggcacc gggacttccc agacgtgatc tcaggagcgt atatcattga agtaattcct 49740
gataccccag cagaagcgtg agttagagtc attttccctt attttccctt ttcctaatat 49800
tcttgttgct cctgtagggg tagcaggaag agggagcgct gttccttttc tactggctca 49860
gatgacagtg ttgatccttg acagatgtgg tcggacgttg ctggtcattc ctgctggcca 49920
ggccttctga cctggctcgg cttgggactc atccatagga gggtgccttc tgtcttcaaa 49980
agtccttgct ccactaggac cctccagatg gacagagcaa tagcagactc ataatgagtc 50040
tctggctggc cagagagagg gtttcaggaa cagtgtcccc aagccctcac gtggtggtcc 50100
tgttctaggc ttcgggaccc ttctcctcct ggagtcttcc agattgtctc tgacagttag 50160
gcccatacct gtcaacacct ccagaaaaat aacccaagtg atatcaaagt aacatgacaa 50220
gaagtagctc aaccatccat cagggtttgt tacctgtatt ggaatatcca gaaaaaagtg 50280
ctagaccagg ggccagcaat tgtgccctgg ggctggatct ggcccactgc ctgcttttat 50340
atggagctgt ggactaagaa taatttttgc attttatttc tatttttact tattttttaa 50400
attttttatt ttcataggtt ttgggggaac aggttgtatt tggttacatg aataagttct 50460
ttggtggtga tttgtgagat tttggtgcac ccatcaccca agcagtatac actgaaccca 50520
atttgtagtc ttttatccct cacccctgtc ccagcctttc ccattgagtc cccagagtcc 50580
attgtataat tcttatgcct ttgtatcctc atagtttagc tcccacttat gagtgagaac 50640
atttaaatag ttgaaaaaat cctgaaataa gaatagcatt ttgtgacttg ttatatttgt 50700
atgcaattca aatttcagcg tccactgaaa tttggtttat gacatctttg gtggcttttg 50760
tgctggagca gccgagttga gtagcttcaa cagagaccat atatacggca aagcctaaaa 50820
tatttcctat ggacctcttt acagaaaaag tttgcagacc cttatgctgg cccatatgaa 50880
ggaccatgac agcgttttga cgctgaccta tataagagct acagttatag tggcaaccac 50940
acaaaggaag tgcctcttaa cagaagcatt ctgcccaccc ttgtaggaac tgcattctga 51000
gttgcaatac cctttataag caagttggcc atggtcacgc tacatggcag atagtacctg 51060
gtacatcctt ccccactttg gggtcaatct tgacctttga tctccttggg gtcataaggc 51120
catacaagtg ttagtaggca tttctagagt ggacataatg gatgagttag cctaaaaatc 51180
tcaaaaggag cccagcatca tggcacctgc ttgtaatccc agctattcag gaggctggag 51240
cagaaggatc ccttgagccc aggagttcaa gactagcttg ggcaacaaat gagaccccat 51300
ctcaaagaaa aaaaaaaagg tgggggaaga acattataat aataataata ataataataa 51360
aaaccttgat aagtatccag tctaccaatg gtttattttt tattttatta ttattatttt 51420
ttgagatgga atctcactct gttgcccagg ctggagtgca gtggcaaaat cttggcttac 51480
tgcaacctcc acctcctggg ttcaagtgaa tctcttgcct cagcctctga gtagctggga 51540
ttacaggtgc ccaccaccaa acctggctct tttgttttgt aattttagta gaaccagggc 51600
tttgccatgt tggccaggct ggtcttgaac tcctgacctc aggtcatcca cctgcctcag 51660
cctcccaaag tgctaggatt acaggcatga gccactgtgc ccggcccact gatggtttga 51720
attattctaa gttcaccacc atccaatcct gtttgctctg ggcttttagg ttctaaactg 51780
tgcctctgtc catgtaaagt cagatcagga ggaatggaga catgaaacat tgctattgtg 51840
tttccctttg tgttgcagtg gtggtctcaa ggaaaacgac gtcataatca gtatcaatgg 51900
acagtcggtg gtctccgcca atgacgtcag cgatgtcatt aaaagggaaa gcaccctgaa 51960
catggtggtc cgtaggggta acgaagacat catgatcaca gtgattcccg aagaaattga 52020
cccataggca gaggcatgag ctggacttca tgtttccctc aaagactctc ccgtggatga 52080
cggatgagga ctctgggctg ctggaatagg acactcaaga cttttgaccg ccattttgtt 52140
tgttcagtgg agactccctg gccaacagaa tccttcttga tagtttgcag gcaaaacaaa 52200
tgtaatgctg cagatccgca ggcagaagct ctgcccttct gtatcctatg tatgcagtgt 52260
gctttttctt gccagcttgg tccattcttg cttagacagc cagcatttgt ctcctccttt 52320
aactgagtca tcatcttaga ccaactaatg cagtcgatac aatgcgtaga tagaagaagc 52380
cccacgggag ccgggatggg acggggcgcg tttgtgcttt tctccaagtc agcacccaaa 52440
ggtcaatgca cagagacccc gggtgggtga acactggctt ctgaaatggc cagagttgac 52500
tcttttagga atctctttgg aactgggagc acgatgactc tgagtttgag ctattaaagt 52560
acttcttaca cattg 52575
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligo target sequence
<400> 7
ccaacaacca ggtaaatatt tg 22
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Oligonucleotide sequence
<400> 8
caaatattta cctggttg 18
<210> 9
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotide sequence
<400> 9
tttacctggt tgttgg 16
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotide sequence
<400> 10
ccaaatattt acctggtt 18
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotide sequence
<400> 11
ccaaatattt acctggttgt 20
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotide sequence
<400> 12
atatttacct ggttgttg 18
<210> 13
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotide sequence
<400> 13
tatttacctg gttgtt 16
<210> 14
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotide sequence
<400> 14
atatttacct ggttgt 16
<210> 15
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotide sequence
<400> 15
atatttacct ggttgtt 17
<210> 16
<211> 275
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 16
gacagtcagc atttgtctcc tcctttaact gagtcatcat cttagtccaa ctaatgcagt 60
cgatacaatg cgtagataga agaagcccca cgggagccag gatgggactg gtcgtgtttg 120
tgcttttctc caagtcagca cccaaaggtc aatgcacaga gaccccgggt gggtgagcgc 180
tggcttctca aacggccgaa gttgcctctt ttaggaatct ctttggaatt gggagcacga 240
tgactctgag tttgagctat taaagtactt cttac 275
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotide sequence
<400> 17
cttcttctat ctacgcat 18
<210> 18
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotide sequence
<400> 18
tactttaata gctcaa 16
<210> 19
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotide sequence
<400> 19
ttctatctac gcattg 16
Claims (23)
- HTRA1 mRNA 길항제 투여에 대한 개체의 치료의 적합성을 결정하는 방법으로서, 상기 방법이
i) 상기 개체로부터 수득한 안방수 또는 유리액의 샘플의 HTRA1의 수준을 결정하는 단계; 및
ii) 상기 단계 i)에서 수득한 HTRA1의 수준을 하나 이상의 기준 샘플 또는 기준 값과 비교하여 상기 개체가 HTRA1 mRNA 길항제에 의한 치료에 적합할 가능성이 있거나 적합한지를 결정하는 단계
를 포함하고,
상기 개체가 안구 질환, 예컨대 황반 변성을 앓거나 이의 발병 위험이 있는, 방법. - 제1항에 있어서,
안방수 또는 유리액의 샘플의 HTRA1의 수준이 상기 샘플의 HTRA1 단백질의 수준을 정량화함으로써 결정되는, 방법. - 제2항에 있어서,
HTRA1 단백질의 수준이 예컨대 HTRA1 특이적 항체를 사용하는 면역 분석을 사용하여 결정되는, 방법. - 제3항에 있어서,
HTRA1 단백질의 수준이 질량 분석을 사용하여 결정되는, 방법. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
하나 이상의 기준 샘플 또는 기준 값이 황반 변성을 앓는 대조군 개체로부터 수득되는, 방법. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
하나 이상의 기준 샘플 또는 기준 값이 황반 변성을 앓지 않는 대조군 개체로부터 수득되는, 방법. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
하나 이상의 기준 샘플이 치료의 적합성을 평가 받는 동일한 개체로부터 사전에 수득된 값인, 방법. - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
기준 값이 망막의 HTRA1 농도와 안방수 또는 유리액의 HTRA1 농도 사이의 상관관계를 모델링하는 데이터 세트로부터 유도되는, 방법. - 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
HTRA1 mRNA 길항제가 HTRA1 mRNA 또는 pre-mRNA를 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, HTRA1 mRNA를 표적화하는 siRNA, 및 HTRA1 mRNA 또는 pre-mRNA를 표적화하는 리보자임으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법. - 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
개체가 망막에서 증진된 HTRA1 발현을 갖는지를 결정하기 위한 것인 방법. - 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
개체가, 황반 변성 질환, 예컨대 초기, 중기 및 후기 습성 연령-관련 황반 변성(AMD)을 포함하는 습성(삼출성) AMD, 및 초기, 중기 및 후기 건성 AMD를 포함하는 건성(비-삼출성) AMD, 예를 들어, 지도모양위축(GA)을 포함하는 AMD; 당뇨병성 망막증(DR) 및 기타 허혈-관련 망막증; 내안구염; 포도막염; 맥락막 혈관신생(CNV); 미숙아 망막증(ROP); 폴립모양 맥락막 혈관병(PCV); 당뇨병성 황반 부종; 병리학적 근시; 본 힙펠-린도우병; 눈 히스토플라스마증; 망막중심정맥 폐색(CRVO); 각막 혈관신생; 및 망막 혈관신생으로 이루어진 군으로부터 선택된 안구 질환을 앓거나 이의 발병 위험이 있는, 방법. - 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
개체가, 연령-관련 황반 변성(AMD), 예컨대 초기, 중기 및 후기 습성 AMD를 포함하는 습성(삼출성) AMD, 및 초기, 중기 및 후기 건성 AMD, 예를 들어, 지도모양위축(GA)을 포함하는 건성(비-삼출성) AMD로 이루어진 군으로부터 선택된 AMD를 앓거나 이의 발병 위험이 있는, 방법. - 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
HTRA1 mRNA 길항제 투여에 적합한 투여량 양생법을 결정하기 위한 것인 방법. - 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
HTRA1 mRNA 길항제가, HTRA1 표적 핵산 서열, 예컨대 서열번호 1 또는 서열번호 2에 완전히 상보성인 10 내지 30개의 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함하는 올리고뉴클레오티드인, 방법. - 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
HTRA1 mRNA 길항제가, 서열번호 7 또는 서열번호 16에 90% 이상 상보성인, 예컨대 완전히 상보성인 12개 이상의 뉴클레오티드 길이의 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드이거나 이를 포함하는, 방법. - 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
HTRA1 mRNA 길항제가 안티센스 올리고뉴클레오티드, 예컨대 LNA 갭머 올리고뉴클레오티드이거나 이를 포함하는, 방법. - 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
HTRA1 mRNA 길항제가 하기 또는 이의 약학적으로 허용되는 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법:
5' TsAsTststsascscstsgsgstsTsGsTsT 3'(서열번호 13, #13,1),
5' AstsAsTststsascscstsgsgstsTsGsTsT 3'(서열번호 15, #15,3),
5' CsTsTsCststscstsastscstsas mcsgscsAsT 3'(서열번호 17, #17),
5' TsAsCsTststsasastsasgscsTsCsAsA 3'(서열번호 18, #18), 및
5' TsTsCstsastscstsas mcsgscsasTsTsG 3'(서열번호 19, #19)
상기 식에서,
대문자는 베타-D 옥시 LNA 뉴클레오시드 단위를 나타내고,
소문자는 DNA 뉴클레오시드 단위를 나타내고,
아래첨자 s는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기를 나타내고,
mc는 5 메틸 사이토신 DNA 뉴클레오시드를 나타내고,
모든 LNA 사이토신은 5-메틸 사이토신이다. - 황반 변성을 앓거나 이의 발병 위험이 있는 개체의 치료 방법으로서, 상기 방법이 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 방법을 수행하는 단계, 및 상기 개체에게 효과량의 HTRA1 mRNA 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
HTRA1 mRNA 길항제가 유리체내 투여를 통해 투여하기 위한 것인, 방법. - HTRA1 RNA 길항성 치료제에 대한 동반 진단제로서 HTRA1 항체의 용도.
- HTRA1 RNA 길항성 치료제, 예컨대 HTRA1 mRNA 길항제, 예컨대 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 HTRA1 mRNA 길항제의 효능에 대한 바이오마커로서 HTRA1 항체의 용도.
- HTRA1 mRNA 길항제에 의한 치료를 받고 있거나 HTRA1 mRNA 길항제, 예컨대 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 HTRA1 mRNA 길항제에 의한 치료의 적합성에 대해 평가되고 있는 개체로부터 수득한 안방수 또는 유리액 샘플의 HTRA1 수준의 검출에서 HTRA1 항체의 용도.
- HTRA1 mRNA 길항제, 예컨대 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 HTRA1 mRNA 길항제를 포함하는 치료제에 대한 개체의 가능한 반응을 결정하기 위한 바이오마커의 용도로서,
상기 바이오마커가, 건강한 개체의 기준 샘플로부터 수득한 HTRA1의 수준과 비교하여, 상기 개체의 안방수 또는 유리액으로부터 수득한 생물학적 샘플에서 상승된 수준의 HTRA1을 포함하는, 용도.
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