BR112020012523A2 - diagnóstico complementar para antagonistas de rna htra1 - Google Patents

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Rubén Alvarez Sánchez
Roberto Iacone
Peter Jakob
Jean-Luc Mary
Heidi Rye Hudlebusch
Thomas Peter John Dunkley
Corinne Stucki
Ulrich Luhmann
Carolin Willburger
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F. Hoffmann-La Roche Ag
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Abstract

A presente invenção refere-se ao uso de antagonistas do HTRA1 RNAm no tratamento de transtornos oculares, como degeneração macular, e o uso de níveis de HTRA1 no humor aquoso e vítreo como um biomarcador de diagnóstico para a adequação do tratamento de um indivíduo com um antagonista HTRA1 RNAm.

Description

"DIAGNÓSTICO COMPLEMENTAR PARA ANTAGONISTAS DE RNA HTRA1"
CAMPO DA INVENÇÃO
[0001] A presente invenção refere-se ao uso de antagonistas HTRA1 RNAm no tratamento de transtornos oculares, tais como degeneração macular, e o uso de níveis de HTRA1 no humor aquoso e vítreo como um biomarcador de diagnóstico para a adequação do tratamento de um indivíduo com uma antagonista HTRA1 RNAm.
ANTECEDENTES
[0002] A família humana de requisitos de alta temperatura A (HTRA) das serina-proteases é constituída ubiquitosamente por PDZ-proteases que estão envolvidas na manutenção da homeostase proteica em compartimentos extracelulares combinando as funções duplas de uma protease e uma proteína (chaperona). As proteases HTRA estão implicadas na organização da matriz extracelular, proliferação celular e envelhecimento. A modulação da atividade de HTRA está relacionada a doenças graves, incluindo a distrofia muscular de Duchenne (Bakay e outros, 2002, Neuromuscul. Disord. 12: 125-141), artrite, tal como osteoartrite (Grau e outros, 2006, JBC 281:6124-6129), câncer, doença cerebral isquêmica familiar de pequenos vasos e degeneração macular relacionada à idade, bem como doença de Parkinson e Alzheimer. A HTRA1 humana contém um domínio de ligação ao fator de crescimento semelhante à insulina (IGF). Foi proposto regular a disponibilidade de IGF e o crescimento celular (Zumbrunn e Trueb, 1996, FEES Letters 398: 189-192) e exibir propriedades supressoras de tumores. A expressão de HTRA1 é infrarregulada no melanoma metastático e, portanto, pode indicar o grau de progressão do melanoma. A superexpressão de HTRA1 em uma linha celular de melanoma metastático reduziu a proliferação e invasão in vitro e reduziu o crescimento de tumores em um modelo de camundongo xenoenxerto (Baldi e outros, 2002, Oncogene 21: 6684-6688). A expressão de HTRA1 também é infrarregulada no câncer de ovário. Nas linhagens celulares de câncer de ovário, a superexpressão de HTRA1 induz a morte celular, enquanto a expressão antissentido de HTRA1 promoveu um crescimento independente da ancoragem (Chien e outros, 2004, Oncogene 23:1636-1644).
[0003] Além do seu efeito na via do IGF, a HTRA1 também inibe a sinalização pela família TGFβ de fatores de crescimento (Oka e outros, 2004, Development 131: 1041- 1053). A HTRA1 pode clivar a proteína precursora de amilóide (APP) e os inibidores de HTRA1 causam o acúmulo de peptídeo Aβ nas células cultivadas. Assim, a HTRA1 também está implicada na doença de Alzheimer (Grau e outros, 2005, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 102: 6021-6026).
[0004] Além disso, a suprarregulação de HTRA1 foi observada e parece estar associada à distrofia muscular de Duchenne (Bakay e outros, 2002, Neuromuscul. Disord. 12: 125-141) e osteoartrite (Grau e outros, 2006, JBC 281: 6124-6129) e AMD (Fritsche, e outros, Nat Gen 2013 45 (4): 433-9).
[0005] Um polimorfismo de nucleotídeo único (SNR) na região promotora HTRA1 (rs1 1200638) está associado a um aumento de 10 vezes o risco de desenvolver degeneração macular relacionada à idade (AMD). Além disso, HTRA1 SNPs estão em desequilíbrio de ligação com ARMS2 SNP (rs10490924) associado ao aumento do risco de desenvolver degeneração macular relacionada à idade (AMD). O alelo de risco está associado a um aumento de 2-3 vezes em HTRA1 RNAm e na expressão de proteínas, e a HTRA1 está presente nas glândulas em pacientes com AMD (Dewan e outros, 2006, Science 314: 989-992; Yang e outros, 2006, Science 314: 992-993). A superexpressão de HTRA1 induz fenótipo do tipo AMD em camundongos. O camundongo transgênico hHTRA (Veierkottn, PlosOne 2011) revela degradação da lâmina elástica da membrana de Bruch, determina anormalidades vasculares coróides (Jones, PNAS 2011) e aumenta as lesões de vasculopatia polipoide coroidal (PCV) (Kumar, IOVS 2014). Além disso, foi relatado que os danos à membrana de Bruch em camundongos hHTRA 1 Tg, que determinam a exposição à fumaça do cigarro, aumentam 3 vezes CNV (Nakayama, IOVS 2014);
[0006] A degeneração macular relacionada à idade (AMD) é a principal causa de perda irreversível da visão em pessoas com mais de 65 anos. Com o início da AMD, ocorre uma perda gradual das células fotorreceptoras sensíveis à luz na parte posterior do olho, as células epiteliais pigmentares subjacentes que as sustentam metabolicamente e a nítida visão central que elas fornecem. A idade é o principal fator de risco para o aparecimento da AMD: a probabilidade de desenvolver AMD triplica após os 55 anos. Fumar, cor da íris clara, sexo (as mulheres correm maior risco), obesidade e exposição repetida à radiação UV também aumentam o risco de AMD. A progressão da AMD pode ser definida em três etapas: 1) AMD inicial, 2) intermediária e 3) AMD avançada. Existem duas formas de AMD avançada: AMD seca (também chamada atrofia geográfica, GA) e AMD úmida
(também conhecida como AMD exsudativa). A AMD seca é caracterizada pela perda de fotorreceptores e células epiteliais do pigmento da retina, levando à perda visual. A AMD úmida está associada à neovascularização coroidal patológica (também conhecida como sub-retiniana). O vazamento de vasos sanguíneos anormais que se formam nesse processo danifica a mácula e prejudica a visão, levando à cegueira. Em alguns casos, os pacientes podem apresentar patologias associadas aos dois tipos de AMD avançada. As estratégias de tratamento para a AMD úmida requerem injeções frequentes no olho e concentram-se principalmente em retardar a progressão da doença. Atualmente, nenhum tratamento aprovado está disponível para AMD seca.
[0007] O documento WO2017/075212 refere-se geralmente a anticorpos anti-HTRA1 e métodos de utilização dos mesmos, incluindo o uso de um anticorpo anti-HTRA1 como biomarcador para seleção de pacientes. Tosi e outros, IOVS 20017, p162 - 167 relatam concentração elevada de HTRA1 no humor aquoso de pacientes com degeneração macular relacionada à idade neovascular e que os níveis de HTRA1 no humor aquoso são normalizados após o tratamento com ranibizumabe e anticorpo que visa o VEGF-A.
[0008] O documento WO 2008/013893 reivindica uma composição para o tratamento de um indivíduo que sofre de degeneração macular relacionada à idade compreendendo moléculas de ácido nucleico compreendendo uma sequência antissentido que hibrida com o gene HTRA1 ou RNAm: Nenhuma molécula antissentido é divulgada. O documento W02009/006460 fornece siRNAs direcionados a HTRA1 e seu uso no tratamento da AMD. Os documentos PCT/EP2017/065937 e
EP17173964.2, ambos incorporados por referência na sua totalidade, divulgam oligonucleotídeos antissentido que são potentes inibidores in vivo de HTRA1 RNAm e seu uso terapêutico, incluindo o uso para tratar a degeneração macular.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0009] Os inventores determinaram que existe uma correlação direta entre a inibição de HTRA1 RNAm nas células epiteliais da retina de indivíduos tratados com antagonistas HTRA1 RNAm e o nível de proteína HTRA1 no humor aquoso e vítreo dos indivíduos. A correlação direta permite o uso de HTRA1 como biomarcador para uso diagnóstico ou prognóstico para determinar a adequação de um indivíduo ao tratamento com um antagonista HTRA1 RNAm, bem como um diagnóstico complementar com terapêutica antagonista HTRA1 RNAm, por exemplo, no monitoramento de pacientes.
[0010] A invenção fornece um método para determinar a adequação do tratamento de um indivíduo para administração com um antagonista HTRA1 RNAm, o referido método compreendendo as etapas de: i) determinar o nível de HTRA1 em uma amostra de humor aquoso ou vítreo obtida do indivíduo ii) comparar o nível de HTRA1 obtido na etapa i) com uma ou mais amostras ou valores de referência; determinar se é provável que o indivíduo é ou possa ser adequado para o tratamento com o antagonista HTRA1 RNAm, em que o indivíduo está sofrendo ou corre o risco de desenvolver um transtorno ocular, como degeneração macular.
[0011] A invenção fornece um método de diagnóstico ou prognóstico para determinar a adequação do tratamento de um indivíduo para administração com um antagonista HTRA1 RNAm, o referido método compreendendo as etapas de: i) determinar o nível de HTRA1 em uma amostra de humor aquoso ou vítreo obtida do indivíduo ii) comparar o nível de HTRA1 obtido na etapa i) com uma ou mais amostras ou valores de referência; determinar se é provável que o indivíduo é ou possa ser adequado para o tratamento com o antagonista HTRA1 RNAm, em que o indivíduo está sofrendo ou corre o risco de desenvolver um transtorno ocular, tal como degeneração macular.
[0012] A invenção fornece um método para determinar o regime de dose adequado para - um antagonista HTRA1 RNAm, para um indivíduo que necessita de tratamento com o antagonista HTRA1 RNAm, o referido método compreendendo as etapas de: i) determinar o nível de HTRA1 em uma amostra de humor aquoso ou vítreo obtida do indivíduo ii) comparar o nível de HTRA1 obtido na etapa i) com uma ou mais amostras ou valores de referência; determinar se é provável que o indivíduo é ou possa ser adequado para o tratamento com o antagonista HTRA1 RNAm, em que o indivíduo está sofrendo ou corre o risco de desenvolver um transtorno ocular, como degeneração macular.
[0013] Vantajosamente, a amostra obtida do indivíduo referido no método ou uso da invenção é uma amostra do humor aquoso do indivíduo.
[0014] A invenção fornece um método de tratamento de um indivíduo que necessita de tratamento com um antagonista HTRA1 RNAm, por exemplo, um indivíduo que sofre ou corre o risco de desenvolver degeneração macular, o referido método compreendendo: i) determinar o nível de HTRA1 em uma amostra de humor aquoso ou vítreo obtido do indivíduo ii) comparar o nível de HTRA1 obtido na etapa i) com uma ou mais amostras ou valores de referência; iii) determinar se é provável que o indivíduo é ou possa ser adequado para o tratamento com o antagonista HTRA1 RNAm, iv) administrar uma quantidade eficaz de um antagonista HTRA1 RNAm ao indivíduo.
[0015] A invenção fornece o uso de um anticorpo HTRA1 como um diagnóstico complementar para uma terapêutica antagonista HTRA1 RNAm.
[0016] A invenção prevê o uso de um anticorpo HTRA1 na detecção de níveis de HTRA1 em uma amostra de humor aquoso ou humor vítreo obtida de um indivíduo que está em tratamento com um antagonista HTRA1 RNAm ou está sendo avaliado quanto à adequação do tratamento com um antagonista HTRA1 RNAm.
[0017] A invenção fornece o uso de um biomarcador para determinar a resposta provável de um indivíduo a um agente terapêutico compreendendo um antagonista HTRA1 RNAm, em que o biomarcador compreende um nível elevado de HTRA1 em uma amostra biológica obtida a partir do humor aquoso ou humor vítreo do indivíduo, em comparação com o nível de HTRA1 obtido a partir de uma amostra de referência de um indivíduo saudável.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0018] Figura 1: Um antagonista oligonucleotídeo antissentido de LNA exemplar de HTRA1 (SEQ ID NO 13, Composto ID #13,1)
[0019] Figura 2: Um antagonista oligonucleotídico antissentido de LNA exemplar de HTRA1 (SEQ ID NO 15, Composto ID #15,3)
[0020] Figura 3: Um antagonista oligonucleotídeo antissentido de LNA exemplar de HTRA1 (SEQ ID 17, Composto ID #17)
[0021] Figura 4: Um antagonista oligonucleotídeo antissentido de LNA exemplar de HTRA1 (SEQ ID NO 18, Composto ID #18)
[0022] Figura 5: Um antagonista oligonucleotídeo antissentido de LNA exemplar de HTRA1 (SEQ ID NO 19, Composto ID #19)
[0023] Figura 6: Estudo de PK/PD de primata não humano (NHP) usando o composto mostrado na figura 2 (Composto ID #15,3) - vide o exemplo 1, administração de IVT, 25 µg/olho. A) nível de HTRA1 RNAm medido na retina por qPCR. B) nível de HTRA1 RNAm ilustrado por ISH. CD) Quantificação do nível de proteína HTRA1 na retina e no vítreo, respectivamente, por IP-MS. Os pontos mostram dados para animais individuais. As barras de erro mostram desvios padrão para réplicas técnicas (n=3).
[0024] Figura 7. Estudo NHP PK/PD (Exemplo 2) usando os compostos mostrados na figura 3 (Composto ID #73,1), 4 (Composto ID #86) e 5 (Composto ID #67): administração IVT, 25 µg/olho. A) nível de HTRA1 RNAm medido na retina por qPCR. B) teor de oligo na retina medido por oligo ELISA. C) nível de HTRA1 RNAm ilustrado por ISH. D-E) Quantificação do nível de proteína HTRA1 na retina e no vítreo, respectivamente, por IP-MS. Os pontos mostram dados para animais individuais. As barras de erro mostram erros padrão para réplicas técnicas (n=3). F-G) Redução do nível de proteína HTRA1 na retina e no vítreo, respectivamente ilustradas por western blot.
[0025] Figura 8. Quantificação de proteínas HTRA1 - Imunocaptura e abordagem por LC-MS. 8A - esquema da abordagem, 8B – quantificação por LC-MS dos níveis de proteína HTRA na retina, humor vítreo e aquoso após administração de compostos antissentido de LNA direcionados a HTRA1 RNAm. 8C - Redução da proteína HTRA1 na retina, humor vítreo e aquoso. 8D. Análise de PD em amostras seriais de humor aquoso colhidas 2, 7, 14 e 21 dias após uma única dose de IVT de 25 µg.
[0026] Figura 9A. Os compostos #15,3 e #17 foram administrados intravítreamente em macacos cinomolgos e amostras de humor aquoso foram coletadas nos dias 3, 8, 15 e 22 após a injeção. As proteínas de amostras não diluídas foram analisadas por eletroforese capilar usando um dispositivo Peggy Sue (Protein Simple). A HTRA1 foi detectada usando um antissoro policlonal de coelho personalizado. São apresentados dados dos animais #J60154 (Veículo), J60158 (C. Id #15,3), J60162 (C. Id #17).
[0027] Figura 9B. As intensidades de sinal foram quantificadas por comparação com a proteína HTRA1 recombinante purificada (mutante S328A) (Origene, #TP700208). A curva de calibração é mostrada no presente documento.
[0028] Figura 9C. Painel superior: A concentração calculada de humor aquoso de HTRA1 de cada animal foi plotada contra o tempo após a injeção. Painel inferior: foi determinada a concentração média de HTRA1 para o grupo veículo em cada momento e calculada a concentração relativa correspondente nos animais tratados. Círculo aberto: valor individual, círculo fechado: média do grupo. É indicada uma porcentagem de redução de HTRA1 no dia 22.
[0029] Figura 10. HTRA1 RNAm foi plotado contra os níveis de proteína HTRA1 no humor aquoso (diamantes azuis) ou na retina (quadrados vermelhos) em macacos cinomolgos tratados com várias moléculas de LNA direcionadas ao transcrito de HTRA1. Os valores são expressos como porcentagem normalizada para controles PBS.
[0030] Figura 11. Correlação da proteína HTRA1 no humor aquoso com a proteína (A) HTRA1 na retina e (B) HTRA1 RNAm na retina em macacos cinomolgos tratados com várias moléculas de LNA direcionadas ao transcrito de HTRA1. Os valores são expressos como porcentagem normalizada para controles PBS.
[0031] Figura 12A. Níveis médios de proteína HTRA1, dia 36, após aplicação de LNA por IVT Porcentagens de supressão de HTRA1 indicadas em azul. Barras de erro: grupo sd.
[0032] Figura 12B. Concentrações de HTRA1 nos tecidos oculares posteriores versus humor aquoso (AH) nos animais de controle (o) e tratados com LNA (●).
[0033] Figura 13. Dinâmica da concentração de HTRA1 no humor aquoso. Símbolo preenchido: tratamento ativo, símbolos vazios: tratamento do veículo. Valores normalizados individuais.
[0034] Figura 14. Níveis de expressão de HTRA1 RNAm nos diferentes compartimentos com e sem tratamento com LNA. Os níveis de HTRA1 RNAm são mostrados como leituras por kilobase por milhão de leituras sequenciais (RPKM). As barras de erro representam o desvio padrão em torno do RPKM médio de pelo menos 3 animais. Asteriscos representam significância estatística (taxa de descoberta falsa <0,05). Os números acima das barras mostram uma diminuição percentual dos níveis de HTRA1 RNAm.
DEFINIÇÕES E DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0035] Na presente descrição, o termo "alquila", sozinho ou em combinação, significa um grupo alquila de cadeia linear ou cadeia ramificada com 1 a 8 átomos de carbono, particularmente um grupo alquila de cadeia linear ou ramificada com 1 a 6 átomos de carbono e mais particularmente um grupo alquila de cadeia linear ou ramificada com 1 a 4 átomos de carbono. Exemplos de grupos alquila C1-C8 de cadeia linear e ramificada são metila, etila, propila, isopropila, butila, isobutila, t-butila, as pentilas isoméricas, hexilas isoméricas, heptilas isoméricas e octilas isoméricas, particularmente metila, etila, propila, butila e pentila. Exemplos particulares de alquila são metila, etila e propila.
[0036] O termo "cicloalquila", sozinho ou em combinação, significa um anel cicloalquila com 3 a 8 átomos de carbono e particularmente um anel cicloalquila com 3 a 6 átomos de carbono. Exemplos de cicloalquila são ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclo-hexila,
ciclo-heptila e ciclooctila, mais particularmente ciclopropila e ciclobutila. Um exemplo particular de "cicloalquila" é ciclopropila.
[0037] O termo "alcóxi", sozinho ou em combinação, significa um grupo da fórmula alquil-O- no qual o termo "alquila" tem o significado anteriormente atribuído, como metóxi, etóxi, n-propóxi, isopropóxi, n- butóxi, isobutóxi, sec-butóxi e t-butóxi. "Alcóxi" específico é metóxi e etóxi. Metoxietóxi é um exemplo particular de "alcoxialcóxi".
[0038] O termo "óxi", sozinho ou em combinação, significa o grupo -O-.
[0039] O termo "alquenila", sozinho ou em combinação, significa um resíduo de hidrocarboneto de cadeia linear ou ramificada compreendendo uma ligação olefínica e até 8, preferencialmente até 6, particular e preferivelmente até 4 átomos de carbono. Exemplos de grupos alquenila são etenila, 1-propenila, 2-propenila, isopropenila, 1-butenila, 2-butenila, 3-butenila e isobutenila.
[0040] O termo "alquinila", sozinho ou em combinação, significa um resíduo de hidrocarboneto de cadeia linear ou ramificada que compreende uma ligação tripla e até 8, de preferência até 6, de preferência até 6, particularmente preferido até 4 átomos de carbono.
[0041] Os termos "halogênio" ou "halo", isoladamente ou em combinação, significam flúor, cloro, bromo ou iodo e, particularmente, flúor, cloro ou bromo, mais particularmente flúor. O termo "halo", em combinação com outro grupo, denota a substituição do referido grupo por pelo menos um halogênio, particularmente substituído por um a cinco halogênios, particularmente um a quatro halogênios, isto é, um, dois, três ou quatro halogênios.
[0042] O termo "haloalquila", sozinho ou em combinação, denota um grupo alquila substituído por pelo menos um halogênio, particularmente substituído por um a cinco halogênios, particularmente um a três halogênios. Exemplos de haloalquila incluem monoflúor-, diflúor- ou triflúor-metila, - etila ou -propila, por exemplo 3,3,3- triflúorpropila, 2-fluoretila, 2,2,2-triflúoretila, fluormetila ou triflúormetila. Fluormetila, diflúormetila e triflúormetila são particularmente "haloalquila".
[0043] O termo "halocicloalquila", sozinho ou em combinação, denota um grupo cicloalquila como definido acima substituído por pelo menos um halogênio, particularmente substituído por um a cinco halogênios, particularmente um a três halogênios. Exemplo particular de "halocicloalquila" é halociclopropila, em particular flúor ciclopropila, diflúor ciclociclopropila e triflúor ciclopropila.
[0044] Os termos "hidroxila" e "hidróxi", isoladamente ou em combinação, significam o grupo -OH.
[0045] Os termos "tiohidroxila" e "tiohidróxi", isoladamente ou em combinação, significam o grupo -SH.
[0046] O termo "carbonila", sozinho ou em combinação, significa o grupo -C(O)-.
[0047] O termo "carbóxi" ou "carboxila", sozinho ou em combinação, significa o grupo -COOH.
[0048] O termo "amino", sozinho ou em combinação, significa o grupo amino primário (-NH2), o grupo amino secundário (-NH-) ou o grupo amino terciário (-N-).
[0049] O termo "alquilamino", sozinho ou em combinação, significa um grupo amino como definido acima substituído por um ou dois grupos alquila como definido acima.
[0050] O termo "sulfonila", sozinho ou em combinação, significa o grupo -SO2.
[0051] O termo "sulfinila", sozinho ou em combinação, significa o grupo -SO-.
[0052] O termo "sulfanila", sozinho ou em combinação, significa o grupo -S-.
[0053] O termo "ciano", sozinho ou em combinação, significa o grupo -CN.
[0054] O termo "azido", sozinho ou em combinação, significa o grupo -N3.
[0055] O termo "nitro", sozinho ou em combinação, significa o grupo NO2.
[0056] O termo "formila", sozinho ou em combinação, significa o grupo -C(O)H.
[0057] O termo "carbamoíla", sozinho ou em combinação, significa o grupo -C(O)NH2.
[0058] O termo "cabamido", sozinho ou em combinação, significa o grupo -NH-C(O)-NH2.
[0059] O termo "arila", sozinho ou em combinação, denota um sistema de anel monociclo ou bicíclico carbocíclico aromático monovalente compreendendo 6 a 10 átomos no anel de carbono, opcionalmente substituído com 1 a 3 substituintes independentemente selecionados a partir de halogênio, hidroxila, alquila, alquenila, alquinila, alcóxi, alcoxialquila, alquenilóxi, carboxila,
alcoxicarbonila, alquilcarbonila e formila. Exemplos de arila incluem fenila e naftila, em particular fenila.
[0060] O termo "heteroarila", sozinho ou em combinação, indica um sistema de anel monocíclico heterocíclico aromático monovalente ou bicíclico de 5 a 12 átomos no anel, compreendendo 1, 2, 3 ou 4 heteroátomos selecionados dentre N, O e S, os átomos restantes do anel sendo carbono, opcionalmente substituído com 1 a 3 substituintes selecionados independentemente a partir de halogênio, hidroxila, alquila, alquenila, alquinila, alcóxi, alcoxialquila, alquenilóxi, carboxila, alcoxicarbonila, alquilcarbonila e formila. Exemplos de heteroarila incluem pirrolila, furanila, tienila, imidazolila, oxazolila, tiazolila, triazolila, oxadiazolila, tiadiazolila, tetrazolila, piridinila, pirazinila, pirazolila, piridazinila, pirimidinol, triazinila, benzidina, isoindolila, isobenzofuranila, benzimidazolila, benzoxazolila, benzoisoxazolila, benzotiazolila, benzoisotiazolila, benzooxadiazolila, benzotiadiazolila, benzotriazolila, purinila, quinolinila, isoquinolinila, quinazolinila, quinazolinila, acrazolinila, quinazolinila, acrazinila, quinazolinila, acrazinila, quinazolinila, acrazinila, quinazolinila, acrazinila, quinazolinila, acrazinila, quinazolinila, acrazinila ou benzoisoxazolila.
[0061] O termo "heterociclila", sozinho ou em combinação, significa um sistema de anel mono- ou bicíclico monovalente, saturado ou parcialmente insaturado, de 4 a 12, em particular de 4 a 9 átomos no anel, compreendendo 1, 2, 3 ou 4 heteroátomos no anel selecionados a partir de N,
O e S, os átomos restantes do anel sendo carbono, opcionalmente substituído com 1 a 3 substituintes selecionados independentemente a partir de halogênio, hidroxila, alquila, alquenila, alquinila, alcóxi, alcoxialquila, alquenilóxi, carboxila, alcoxicarbonila, alquilcarbonila e formila. Exemplos de heterociclila saturada monocíclica são azetidinila, pirrolidinila, tetra- hidrofuranila, tetra-hidro-tienila, pirazolidinila, imidazolidinila, oxazolidinila, isoxazolidinila, tiazolidinila, piperidinila, tetra-hidropiranil-tetra- hidrotinopiranol, 1-azepanila, diazepanila, homopiperazinila ou oxazepanila. Exemplos de heterocicloalquila bicíclica saturada são 8-aza-biciclo [3.2.1] octila, quinuclidinila, 8-oxa-3-aza-biciclo [3.2.1] octila, 9-aza-biciclo [3.3.1] nonila, 3-oxa-9-aza-biciclo [3.3.1] nonila, ou 3-tia-9-aza-biciclo [3.3.1] nonila. Exemplos de heterocicloalquila parcialmente insaturado são di-hidrofurila, imidazolinila, di-hidro-oxazolila, tetra- hidro-piridinila ou di-hidropiranila.
[0062] O termo "sais farmaceuticamente aceitáveis" refere-se aos sais que retêm a eficácia biológica e as propriedades das bases livres ou ácidos livres, que não são biologicamente ou de outra forma indesejáveis. Os sais são formados com ácidos inorgânicos, como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, particularmente ácido clorídrico e ácidos orgânicos, como ácido acético, ácido propiônico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido maleico ácido malônico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzóico,
ácido cinâmico, ácido mandélico, ácido metanossulfônico, ácido etanossulfônico, ácido p-toluenossulfônico, ácido salicílico, N-acetilcisteína. Além disso, estes sais podem ser preparados a partir da adição de uma base inorgânica ou de uma base orgânica ao ácido livre. Os sais derivados de uma base inorgânica incluem, mas não se limitam aos sais de sódio, potássio, lítio, amônio, cálcio, magnésio. Os sais derivados de bases orgânicas incluem, entre outros, sais de aminas primárias, secundárias e terciárias, aminas substituídas, incluindo aminas substituídas naturalmente, aminas cíclicas e resinas básicas de troca iônica, como isopropilamina, trimetilamina, dietilamina, trietilamina, tripropilamina, resinas de etanolamina, lisina, arginina, N-etilpiperidina, piperidina, poliamina. O oligonucleotídeo da invenção também pode estar presente na forma de íons dipolares. Sais farmaceuticamente aceitáveis particularmente preferidos da invenção são os sais de ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico e ácido metanossulfônico.
[0063] O termo "grupo protetor", sozinho ou em combinação, significa um grupo que bloqueia seletivamente um local reativo em um composto multifuncional, de modo que uma reação química possa ser realizada seletivamente em outro local reativo não protegido. Grupos de proteção podem ser removidos. Grupos protetores exemplares são grupos protetores de amino, grupos protetores carbóxi ou grupos protetores hidróxi.
[0064] O "grupo protetor hidroxila" é um grupo protetor do grupo hidroxila e também é usado para proteger os grupos tiol. Exemplos de grupos protetores de hidroxila são acetila (Ac), benzoila (Bz), benzila (Bn), éter b- metoxietoximetílico (MEM), dimetoxitritila (ou bis- (4- metoxifenil) fenilmetil) (DMT), trimetoxitritil (ou tris- (4-metoxifenil) fenilmetil) (TMT), éter metoximetílico (MOM), metoxitritil [(4- metoxifenil) difenilmetil (MMT), éter p-metoxibenzílico (PMB), éter metiltiometílico, pivaloil (Piv), tetra-hidropiranil (THP) tetra-hidrofurano (THF), tritila ou trifenilmetila (Tr), éter silílico (por exemplo, trimetilsilila (TMS), t-butildimetilsilila (TBDMS), éter tri-isopropilsililoximetila (TOM) e tri- isopropilsilila (TIPS) e éteres metílicos), éteres etoxietílicos (EE). Exemplos particulares de grupo protetor de hidroxila são DMT e TMT, em particular DMT.
[0065] Se um dos materiais de partida ou compostos da invenção contiver um ou mais grupos funcionais que não são estáveis ou são reativos nas condições de reação de uma ou mais etapas da reação, grupos de proteção apropriados (como descrito, por exemplo, em "Protective Groups in Organic Chemistry" por T.W. Greene e P.G.M Wuts, 3ª Edição, 1999, Wiley, Nova Iorque) podem ser introduzidos antes da crítico de aplicação de métodos bem conhecidos na arte. Esses grupos protetores podem ser removidos em uma etapa posterior da síntese usando métodos padrão descritos na literatura. Exemplos de grupos de proteção são t- butoxicarbonila (Boc), carbamato de 9-fluorenilmetila (Fmoc), carbamato de 2-trimetilsililetila (Teoc), carbobenziloxi (Cbz) e p-metoxibenziloxicarbonila (Moz).
[0066] Os compostos descritos no presente documento podem conter vários centros assimétricos e podem estar presentes na forma de enantiômeros opticamente puros,
misturas de enantiômeros tais como, por exemplo, racematos, misturas de diastereoisômeros, racematos diastereoisoméricos ou misturas de racematos diastereoisoméricos.
[0067] Uma "quantidade eficaz" de um agente, por exemplo, uma formulação farmacêutica, refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para alcançar o resultado terapêutico ou profilático desejado. Oligonucleotídeo
[0068] O termo "oligonucleotídeo", conforme empregado no presente documento, é definido como geralmente é entendido pelo versado na técnica, como uma molécula compreendendo dois ou mais nucleosídeos covalentemente ligados. Esses nucleosídeos ligados covalentemente também podem ser referidos como moléculas de ácido nucleico ou oligômeros. Os oligonucleotídeos são comumente produzidos em laboratório por síntese química em fase sólida seguida de purificação. Quando se refere a uma sequência do oligonucleotídeo, é feita referência à sequência ou ordem das frações de nucleobases, ou modificações das mesmas, dos nucleotídeos ou nucleosídeos ligados covalentemente. Um oligonucleotídeo é fabricado pelo homem e é quimicamente sintetizado e é tipicamente purificado ou isolado. O oligonucleotídeo pode compreender um ou mais nucleosídeos ou nucleotídeos modificados.
[0069] Os antagonistas HTRA1 RNA referidos na presente invenção podem ser oligonucleotídeos, como siRNAs ou oligonucleotídeos antissentido, que são capazes de modular a expressão do ácido nucleico alvo HTRA1. Uma modulação através de um antagonista HTRA1 RNA inclui a capacidade de inibir, regular, reduzir, suprimir, remover, parar, bloquear, impedir, diminuir, abaixar, evitar ou terminar a expressão de HTRA1, por exemplo, por degradação do RNAm ou bloqueio da transcrição ou via "splicing" alternativo doe HTRA1 pré-RNAm (modulação de emenda de HTRA1 pré-RNAm). siRNAs e shRNAs
[0070] Em algumas modalidades, o antagonista HTRA1 RNAm é um siRNA ou um shRNA.
[0071] Um siRNA é um complexo duplo de cadeia dupla, compreendendo uma cadeia de sentido e antissentido que juntas formam uma região duplex de 18 a 25 pares de bases. A cadeia antissentido dos siRNAs que têm como alvo a HTRA1 são complementares ao ácido nucleico alvo de HTRA1, como a HTRA1 RNAm. O documento US2007185317 revela siRNAs visando HTRA1.
[0072] Um RNA em hairpin curto ou RNA em hairpin pequeno (shRNA/Vetor Hairpin) é uma molécula de RNA artificial com uma curva fechada em hairpin que pode ser usada para silenciar a expressão do gene alvo por interferência de RNA (RNAi). A expressão de shRNA nas células é tipicamente realizada através da liberação de plasmídeos ou através de vetores virais ou bacterianos. Oligonucleotídeos Antissentido
[0073] Vantajosamente, o antagonista HTRA1 RNAm é um oligonucleotídeo antissentido que tem como alvo um ácido nucleico de HTRA1.
[0074] O termo "oligonucleotídeo antissentido", conforme usado no presente documento, é definido como oligonucleotídeos capazes de modular a expressão de um gene alvo por hibridação com um ácido nucleico alvo, em particular com uma sequência contígua em um ácido nucleico alvo, em uma célula que está expressando o ácido nucleico alvo. Os oligonucleotídeos antissentido não são essencialmente de fita dupla e, portanto, não são siRNAs ou shRNAs. De preferência, os oligonucleotídeos antissentido da presente invenção são de cadeia simples. Entende-se que os oligonucleotídeos de fita simples da presente invenção podem formar hairpins ou estruturas duplex intermoleculares (duplex entre duas moléculas do mesmo oligonucleotídeo), desde que o grau de auto-complementaridade intra ou inter seja menor que 50% em toda a totalidade comprimento do oligonucleotídeo. O oligonucleotídeo antissentido da invenção é fabricado pelo homem e é quimicamente sintetizado e é tipicamente purificado ou isolado. O oligonucleotídeo antissentido da invenção pode compreender um ou mais nucleosídeos ou nucleotídeos modificados. Sequência Nucleotídica Contígua
[0075] O termo "sequência nucleotídica contígua" refere-se à região do oligonucleotídeo que é complementar ao ácido nucleico alvo. O termo é empregado no presente documento de forma intercambiável com o termo "sequência nucleobase contígua" e o termo "sequência do motivo oligonucleotídico". Em algumas modalidades, todos os nucleotídeos do oligonucleotídeo constituem a sequência nucleotídica contígua. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo compreende a sequência nucleotídica contígua, como uma região gapmer de F-G-F', e pode opcionalmente compreender nucleotídeos adicionais, por exemplo, uma região de ligação nucleotídica que pode ser usada para conectar um grupo funcional à sequência de nucleotídeo contíguo. A região ligante de nucleotídeo pode ou não ser complementar ao ácido nucleico alvo. Nucleotídeos
[0076] Os nucleotídeos são os blocos de construção de oligonucleotídeos e polinucleotídeos e, para os fins da presente invenção, incluem nucleotídeos de ocorrência natural e não natural. Na natureza, nucleotídeos, como nucleotídeos de DNA e RNA, compreendem uma fração da açúcar ribose, uma fração de nucleobase e um ou mais grupos fosfato (que está ausente nos nucleosídeos). Nucleosídeos e nucleotídeos também podem ser intercambiavelmente referidos como "unidades" ou "monômeros". Nucleosídeo Modificado
[0077] O termo "nucleosídeo modificado" ou "modificação de nucleosídeo", conforme empregado no presente documento, refere-se aos nucleosídeos modificados em comparação com o nucleosídeo equivalente de DNA ou RNA pela introdução de uma ou mais modificações da fração açúcar ou na fração base (núcleo). Numa forma de realização preferida, o nucleosídeo modificado compreende uma fração da açúcar modificado. O termo nucleosídeo modificado também pode ser empregado no presente documento de forma intercambiável com o termo "análogo de nucleosídeo" ou "unidades" modificadas ou "monômeros" modificados. Os nucleosídeos com uma fração de açúcar de DNA ou RNA não modificado são denominados no presente documento nucleosídeos de DNA ou RNA. Os nucleossídeos com modificações na região base do nucleosídeo de DNA ou RNA ainda são geralmente denominados DNA ou RNA se permitirem o emparelhamento de bases Watson Crick. Ligação Internucleosídeo Modificada
[0078] O termo "ligação internucleosídeo modificada" é definido como geralmente entendido pelo versado na técnica como ligações diferentes das ligações fosfodiéster (PO), que covalentemente acopla dois nucleosídeos. Os oligonucleotídeos da invenção podem, portanto, compreender ligações internucleosídicas modificadas. Em algumas modalidades, a ligação internucleosídeo modificada aumenta a resistência à nuclease do oligonucleotídeo em comparação com uma ligação fosfodiéster. Para oligonucleotídeos de ocorrência natural, a ligação internucleosídeo inclui grupos fosfato, criando uma ligação fosfodiéster entre os nucleosídeos adjacentes. As ligações internucleosídicas modificadas são particularmente úteis na estabilização de oligonucleotídeos para uso in vivo e podem servir para proteger contra a clivagem de nucleases em regiões de nucleosídeos de DNA ou RNA no oligonucleotídeo da invenção, por exemplo, na região lacuna de um oligonucleotídeo gapmer, bem como em regiões de nucleosídeos modificados, como a região F e F'.
[0079] Em uma modalidade, o oligonucleotídeo compreende uma ou mais ligações internucleosídicas modificadas a partir do fosfodiéster natural, uma ou mais ligações internucleosídicas modificadas que são, por exemplo, mais resistentes ao ataque da nuclease. A resistência à nuclease pode ser determinada através da incubação do oligonucleotídeo no soro sanguíneo ou utilizando um ensaio de resistência à nuclease (por exemplo, fosfodiesterase de veneno de cobra (SVPD)), ambos bem conhecidos na técnica. As ligações internucleosídicas que são capazes de aumentar a resistência à nuclease de um oligonucleotídeo são referidas como ligações internucleosídicas resistentes à nuclease. Em algumas modalidades, pelo menos 50% das ligações internucleosídicas no oligonucleotídeo, ou sequência nucleotídica contígua dos mesmos, são modificadas, como pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 75%, como pelo menos 80% ou tais como pelo menos 90% das ligações internucleosídicas no oligonucleotídeo, ou sequência nucleotídica contígua dos mesmos, são ligações internucleosídicas resistentes à nuclease. Em algumas modalidades, todas as ligações internucleosídicas do oligonucleotídeo, ou sua sequência nucleotídica contígua, são ligações internucleosídicas resistentes à nuclease. Será reconhecido que, em algumas modalidades, os nucleosídeos que ligam o oligonucleotídeo da invenção a um grupo funcional não nucleotídeo, como um conjugado, podem ser fosfodiéster. Uma ligação internucleosídeo modificada preferida para uso no oligonucleotídeo da invenção é fosforotioato.
[0080] As ligações internucleosídicas de fosforotioato são particularmente úteis devido à resistência às nucleases, farmacocinética benéfica e facilidade de fabricação. Em algumas modalidades, pelo menos 50% das ligações internucleosídicas no oligonucleotídeo, ou sequência nucleotídica contígua dos mesmos, são fosforotioato, como pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 70%, como pelo menos 75%, como pelo menos 80 % ou tais como pelo menos 90% das ligações internucleosídicas no oligonucleotídeo, ou sequência nucleotídica contígua do mesmo, são fosforotioato. Em algumas modalidades, todas as ligações internucleosídicas do oligonucleotídeo, ou sequência nucleotídica contígua do mesmo, são fosforotioato. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo da invenção compreende ligações internucleosídicas de fosforotioato e pelo menos uma ligação fosfodiéster, como 2, 3 ou 4 ligações fosfodiéster, além das ligações fosforoditioato. Num oligonucleotídeo gapmer, as ligações fosfodiéster, quando presentes, não estão adequadamente localizadas entre nucleosídeos de DNA contíguos na região G de gap.
[0081] Ligações resistentes a nucleases, como ligações fosforotioato, são particularmente úteis em regiões oligonucleotídicas capazes de recrutar nucleases quando se forma um duplex com o ácido nucleico alvo, como a região G para gapmers. As ligações de fosforotioato podem, no entanto, também ser úteis em regiões que não recrutam nucleases e/ou regiões que aumentam a afinidade, como as regiões F e F' para gapmers. Os oligonucleotídeos Gapmer podem, em algumas modalidades, compreender uma ou mais ligações fosfodiéster na região F ou F' ou ambas as regiões F e F', onde todas as ligações internucleosídicas na região G podem ser fosforotioato.
[0082] Vantajosamente, todas as ligações internucleosídicas na sequência nucleotídica contígua do oligonucleotídeo, ou todas as ligações internucleosídicas do oligonucleotídeo, são ligações fosforotioato.
[0083] Reconhece-se que, como revelado no documento EP 2 742 135, os oligonucleotídeos antissentido podem compreender outras ligações internucleosídicas (que não sejam fosfodiéster e fosforotioato), por exemplo, internucleosídeos de alquila fosfonato/metil fosfonato, que de acordo com o documento EP 2 742 135 podem ser tolerados, por exemplo, em outro modo, o fosforotioato de DNA na região do gap. Nucleobase
[0084] O termo nucleobase inclui a fração purina (por exemplo, adenina e guanina) e pirimidina (por exemplo, uracila, timina e citosina) presente em nucleosídeos e nucleotídeos que formam ligações de hidrogênio na hibridação de ácidos nucleicos. No contexto da presente invenção, o termo nucleobase também abrange nucleobases modificadas que podem diferir das nucleobases que ocorrem naturalmente, mas são funcionais durante a hibridação de ácidos nucleicos. Nesse contexto, "nucleobase" refere-se a nucleobases de ocorrência natural, como adenina, guanina, citosina, timidina, uracila, xantina e hipoxantina, bem como variantes de ocorrência não natural. Tais variantes são, por exemplo, descritas em Hirao e outros, (2012) Accounts of Chemical Research vol. 45 página 2055 e Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1.
[0085] Em algumas modalidades, a fração nucleobase é modificada alterando a purina ou pirimidina em uma purina ou pirimidina modificada, como purina substituída ou pirimidina substituída, como uma nucleobase selecionada a partir de isocitosina, pseudoisocitosina, 5- metil citosina, 5-tiozol-citosina, 5-propinil-citosina, 5-
propinil-uracila, 5-bromouracil 5-tiazol-uracila, 2-tio- uracila, 2'-tio-timina, inosina, diaminopurina, 6- aminopurina, 2-aminopurina, 2,6-diaminopurina e 2-cloro-6- aminopurina.
[0086] As frações de nucleobases podem ser indicadas pelo código da letra para cada nucleobase correspondente, por exemplo, A, T, G, C ou U, em que cada letra pode opcionalmente incluir nucleobases modificadas de função equivalente. Por exemplo, nos oligonucleotídeos exemplificados, as frações de nucleobases são selecionadas dentre A, T, G, C e 5-metil-citosina. Opcionalmente, para gapmers de LNA, podem ser utilizados nucleosídeos de 5- metil citosina LNA. Oligonucleotídeo Modificado
[0087] O termo oligonucleotídeo modificado descreve um oligonucleotídeo compreendendo um ou mais nucleosídeos modificados por açúcar e/ou ligações internucleosídicas modificadas. O termo oligonucleotídeo quimérico é um termo que tem sido utilizado na literatura para descrever oligonucleotídeos com nucleosídeos modificados. Complementaridade
[0088] O termo "complementaridade" descreve a capacidade de emparelhamento de bases Watson-Crick de nucleosídeos/nucleotídeos. Os pares de bases Watson-Crick são guanina (G)-citosina (C) e adenina (A) - timina (T)/uracila (U). Será entendido que os oligonucleotídeos podem compreender nucleosídeos com nucleobases modificadas, por exemplo, 5-metil-citosina é frequentemente usada no lugar da citosina e, como tal, o termo complementaridade abrange o pareamento de bases de Watson Crick entre nucleobases não modificadas e modificadas (vide, por exemplo, Hirao e outros, (2012) Accounts of Chemical Research vol. 45 página 2055 e Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1).
[0089] O termo "% complementar", conforme empregado no presente documento, refere-se à pró-fração de nucleotídeos (em porcentagem) de uma sequência nucleotídica contígua em uma molécula de ácido nucleico (por exemplo, oligonucleotídeo) que através da sequência nucleotídica contígua são complementares a uma sequência de referência (por exemplo, uma sequência alvo ou motivo de sequência). A porcentagem de complementaridade é assim calculada contando o número de nucleobases alinhadas que são complementares (do par de bases Watson Crick) entre as duas sequências (quando alinhadas com a sequência alvo 5'-3' e a sequência oligonucleotídica de 3'-5'), dividindo esse número pelo número total de nucleotídeos no oligonucleotídeo e multiplicando por 100. Nessa comparação, uma nucleobase/nucleotídeo que não se alinha (forma um par de bases) é denominada de incompatibilidade. Não são permitidas inserções e deleções no cálculo da % de complementaridade de uma sequência nucleotídica contígua. Será entendido que, na determinação da complementaridade, as modificações químicas das nucleobases são desconsideradas, desde que a capacidade funcional da nucleobase para formar o emparelhamento de bases Watson Crick seja mantida (por exemplo, 5'-metil-citosina é considerada idêntica a uma citosina para fins de calculando% de identidade). O termo "totalmente complementar" refere-se a 100% de complementaridade. Identidade
[0090] O termo "Identidade", conforme empregado no presente documento, refere-se à pró-fração de nucleotídeos (expressa em porcentagem) de uma sequência nucleotídica contígua em uma molécula de ácido nucleico (por exemplo, oligonucleotídeo) que através da sequência nucleotídica contígua são idênticos a uma sequência de referência (por exemplo, um motivo de sequência). A porcentagem de identidade é assim calculada contando o número de bases alinhadas que são idênticas (uma correspondência) entre duas sequências (na sequência nucleotídica contígua do composto da invenção e na sequência de referência), dividindo esse número pelo número total de nucleotídeos no oligonucleotídeo e multiplicando por 100. Portanto, a Porcentagem de Identidade = (correspondência x 100)/Comprimento da região alinhada (por exemplo, a sequência nucleotídica contígua). Não são permitidas inserções e deleções no cálculo da porcentagem de identidade de uma sequência nucleotídica contígua. Será entendido que, ao determinar a identidade, as modificações químicas das nucleobases são desconsideradas desde que a capacidade funcional da nucleobase para formar o emparelhamento de bases Watson Crick seja mantida (por exemplo, 5-metil citosina é considerada idêntica a uma citosina para fins de cálculo de % de identidade). Hibridização
[0091] O termo "hibridação" ou "hibridiza", conforme empregado no presente documento deve ser entendido como duas cadeias de ácidos nucleicos (por exemplo, um oligonucleotídeo e um ácido nucleico alvo) formando ligações de hidrogênio entre pares de bases em cadeias opostas, formando assim um duplex.
A afinidade da ligação entre duas cadeias de ácidos nucleicos é a força da hibridação.
É frequentemente descrito em termos da temperatura de fusão (Tm) definida como a temperatura na qual metade dos oligonucleotídeos são duplexados com o ácido nucleico alvo.
Em condições fisiológicas, não é estritamente proporcional à afinidade (Mergny e Lacroix, 2003, Oligonucleotides 13: 515-537). O estado padrão de energia livre de Gibbs ΔG° é uma representação mais precisa da afinidade de ligação e está relacionado à constante de dissociação (Kd) da reação por ΔG° = -RTIn (Kd), onde R é a constante de gás e T é a temperatura absoluta.
Portanto, um ΔG° muito baixo da reação entre um oligonucleotídeo e o ácido nucleico alvo reflete uma forte hibridação entre o oligonucleotídeo e o ácido nucleico alvo.
ΔG° é a energia associada a uma reação em que as concentrações aquosas são 1M, o pH é 7 e a temperatura é 37°C.
A hibridação de oligonucleotídeos em relação a um ácido nucleico alvo é uma reação espontânea e para reações espontâneas ΔG° é menor que zero.
O AG° pode ser medido experimentalmente, por exemplo, pelo uso do método de calorimetria de titulação isotérmica (ITC), como descrito em Hansen e outros, 1965, Chem.
Comm. 36-38 e Holdgate e outros, 2005, Drug Discov Today.
O versado na técnica saberá que o equipamento comercial está disponível para medições de ΔG°. O ΔG° também pode ser estimado numericamente usando o modelo de vizinho mais próximo, conforme descrito por SantaLucia, 1998, Proc Natl Acad Sci USA. 95: 1460-1465, utilizando parâmetros termodinâmicos derivados adequadamente descritos por Sugimoto e outros, 1995, Biochemistry 34:11211-11216 e McTigue e outros, 2004, Biochemistry 43: 5388-5405. Para ter a possibilidade de modular seu alvo de ácido nucleico pretendido por hibridação, os oligonucleotídeos da presente invenção hibridizam com um ácido nucleico alvo com valores estimados de ΔG° abaixo de -10 kcal para oligonucleotídeos com 10 a 30 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, o grau ou a força da hibridação é medida pelo estado padrão de energia livre de Gibbs ΔG°. Os oligonucleotídeos podem hibridar com um ácido nucleico alvo com valores estimados de ΔG° abaixo da faixa de -10 kcal, como abaixo de -15 kcal, como abaixo de -20 kcal e abaixo de -25 kcal para oligonucleotídeos com 8 a 30 nucleotídeos em comprimento. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos hibridizam com um ácido nucleico alvo com um valor estimado de ΔG° de -10 a -60 kcal, como -12 a -40, como de -15 a -30 kcal ou de 16 a -27 kcal, como -18 a -25 kcal. Sequência Alvo
[0092] O termo "sequência alvo", conforme empregado no presente documento, refere-se a uma sequência de nucleotídeos presentes no ácido nucleico alvo que compreende a sequência de nucleobases que é complementar ao oligonucleotídeo antissentido da invenção. Em algumas modalidades, a sequência alvo consiste em uma região no ácido nucleico alvo com uma sequência de nucleobases que é complementar à sequência nucleotídica contígua do oligonucleotídeo antissentido da invenção. Esta região do ácido nucleico alvo pode ser intercambiável como a sequência nucleotídica alvo, sequência alvo ou região alvo. Em algumas modalidades, a sequência alvo é mais longa que a sequência complementar contígua de um único oligonucleotídeo e pode, por exemplo, representar uma região preferida do ácido nucleico alvo que pode ser direcionada por vários oligonucleotídeos da invenção.
[0093] O oligonucleotídeo antissentido da invenção compreende uma sequência nucleotídica contígua que é complementar ao ácido nucleico alvo, tal como uma sequência alvo descrita no presente documento. A sequência alvo à qual o oligonucleotídeo é complementar geralmente compreende uma sequência de nucleobases contígua de pelo menos 10 nucleotídeos. A sequência nucleotídica contígua está entre 10 a 50 nucleotídeos, como 12 a 30, como 14 a 20, como 15 a 18 nucleotídeos contíguos. Célula Alvo
[0094] O termo "célula alvo", conforme empregado no presente documento, refere-se a uma célula que está expressando o ácido nucleico alvo. Em algumas modalidades, a célula alvo pode ser in vivo ou in vitro. Em algumas modalidades, a célula alvo é uma célula de mamífero, como uma célula de roedor, como uma célula de camundongo ou uma célula de rato, ou uma célula de primata, como uma célula de macaco ou uma célula humana. Nucleosídeos modificados de alta afinidade
[0095] Um nucleosídeo modificado de alta afinidade é um nucleotídeo modificado que, quando incorporado ao oligonucleotídeo aumenta a afinidade do oligonucleotídeo para seu alvo complementar, por exemplo, medido pela temperatura de fusão (Tm). Um nucleosídeo modificado de alta afinidade da presente invenção resulta preferencialmente em um aumento na temperatura de fusão entre +0,5 e +12°C, mais preferencialmente entre +1,5 e + 10°C e mais preferencialmente entre +3 e +8°C por nucleosídeo modificado. Inúmeros nucleosídeos modificados de alta afinidade são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, muitos nucleosídeos 2' substituídos, bem como ácidos nucleicos bloqueados (LNA) (vide por exemplo Freier e Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 e Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3 (2), 293-213). Modificações do açúcar
[0096] O oligômero da invenção pode compreender um ou mais nucleosídeos que possuem uma fração da açúcar modificada, isto é, uma modificação da fração da açúcar quando comparada à fração da açúcar ribose encontrada no DNA e no RNA.
[0097] Inúmeros nucleosídeos com modificação da fração da açúcar ribose foram feitos, principalmente com o objetivo de melhorar certas propriedades dos oligonucleotídeos, como afinidade e/ou resistência à nuclease.
[0098] Tais modificações incluem aquelas em que a estrutura do anel ribose é modificada, por exemplo, por substituição por um anel hexose (HNA) ou um anel bicíclico, que normalmente possui uma ponte de birradícula entre os carbonos C2 e C4 no anel ribose (LNA) ou um anel ribose não ligado que normalmente não possui uma ligação entre os carbonos C2 e C3 c (por exemplo, UNA). Outros nucleosídeos modificados com açúcar incluem, por exemplo, ácidos nucleicos de biciclohexose (WO2011/017521) ou ácidos nucleicos tricíclicos (WO2013/154798). Os nucleosídeos modificados também incluem nucleosídeos onde a fração do açúcar é substituída por uma fração que não seja de açúcar, por exemplo, no caso de ácidos nucleicos peptídicos (RNA) ou ácidos nucleicos de morfolino. Nucleosídeos 2' modificados
[0099] Um nucleosídeo 2' modificado com açúcar é um nucleosídeo que possui um substituinte diferente de H ou -OH na posição 21 (nucleosídeo substituído 2 ') ou compreende uma biradícula ligada a 21 capaz de formar uma ponte entre o carbono 21 e um segundo carbono no anel ribose, tal como nucleosídeos LNA (ponte de 2'-4' biradículas).
[00100] De fato, muito foco foi gasto no desenvolvimento de nucleosídeos 2' substituídos, e vários nucleosídeos 2' substituídos têm propriedades benéficas quando incorporados aos oligonucleotídeos. Por exemplo, o açúcar 2' modificado pode fornecer afinidade de ligação aprimorada e/ou resistência à nuclease aumentada ao oligonucleotídeo. Exemplos de nucleosídeos 2' substituídos modificados são nucleosídeo 2'-O-alquil-RNA, 2'-O-metil- RNA, 2'-alcóxi-RNA, 2'-O-metoxietil-RNA (MOE), 2'-amino- DNA, 2'-Flúor-RNA e 2'-F-ANA. Para mais exemplos, consulte por exemplo, Freier e Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 e Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213 e Deleavey e Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937. Abaixo estão ilustrações de alguns nucleosídeos 2' substituídos modificados.
2'-O-Me 2'F-RNA 2'F-ANA 2'-O-MOE 2'-O-Alila 2'-O-Etilamina
[00101] Em relação à presente invenção, nucleosídeos modificados com açúcar 2' substituído não incluem nucleosídeos em ponte 2' tais como LNA. Ácido Nuclear Bloqueado (LNA)
[00102] Um "nucleosídeo LNA" é um nucleosídeo 2' modificado que compreende uma ligação birradical os C2' e C4' do anel de açúcar ribose do referido nucleosídeo (também conhecido como "ponte 2'-4'"), que restringe ou bloqueia a conformação do anel ribose. Estes nucleosídeos são também denominados ácido nucleico em ponte ou ácido nucleico bicíclico (BNA) na literatura. O bloqueio da conformação da ribose está associado a uma afinidade aumentada de hibridação (estabilização duplex) quando o LNA é incorporado em um oligonucleotídeo para uma molécula de RNA ou DNA complementar. Isso pode ser determinado rotineiramente medindo a temperatura de fusão do oligonucleotídeo/complemento duplex.
[00103] Exemplos de nucleosídeos de LNA não limitativos são revelados nos documentos WO 99/014226, WO 00/66604, WO 98/039352, WO 2004/046160, WO 00/047599, WO 2007/134181, WO 2010/077578, WO 2010/036698, WO 2007/090071, WO 2009/006478, WO 2011/156202, WO 2008/154401, WO 2009/067647, WO 2008/150729, Morita e outros, Bioorganic & Med. Chem. Lett. 12, 73-76, Seth e outros, J. Org. Chem. 2010, Vol 75 (5) pp. 1569-81, e Mitsuoka e outros, Nucleic Acids Research 2009, 37 (4), 1225-1238, e Wan e Seth, J. Medical Chemistry 2016, 59, 9645-9667.
[00104] Outros nucleosídeos de LNA exemplares não limitativos são revelados no Esquema 1.
[00105] Os nucleosídeos específicos de LNA são beta-D-óxi-LNA, 6'-metil-beta-D-óxi LNA, tais como (S) -6’- metil-beta-D-óxi-LNA (ScET) e ENA. Um LNA particularmente vantajoso é o beta-D-óxi-LNA, como utilizado nos compostos dos exemplos. Atividade e Recrutamento RNase H
[00106] A atividade da RNase H de um oligonucleotídeo antissentido refere-se à sua capacidade de recrutar a RNase H quando em um duplex com uma molécula de RNA complementar. O documento WO01/23613 fornece métodos in vitro para determinar a atividade da RNaseH, que pode ser usada para determinar a capacidade de recrutar a RNaseH. Tipicamente, um oligonucleotídeo é considerado capaz de recrutar RNase H se, quando fornecido com uma sequência alvo complementar de ácido nucleico, tiver uma taxa inicial, medida em pmol/l/min., de pelo menos 5%, como pelo menos 10% ou mais de 20% da taxa inicial determinada ao usar um oligonucleotídeo com a mesma sequência de bases que o oligonucleotídeo modificado sendo testado, mas contendo apenas monômeros de DNA com ligações de fosforotioato entre todos os monômeros no oligonucleotídeo e usando a metodologia fornecida pelos Exemplos 91 - 95 do documento WO01/23613 (incorporado ao presente documento como referência). Para utilização na determinação da atividade da RHase H, a RNase H1 humana recombinante está disponível na Lubio Science GmbH, Lucerne, Suíça. Gapmer
[00107] O oligonucleotídeo antissentido, ou sua sequência nucleotídica contígua, pode ser um gapmer. Os gapmers antissentido são comumente usados para inibir um ácido nucleico alvo via degradação mediada pela RNase H. Um oligonucleotídeo gapmer compreende pelo menos três regiões estruturais distintas, um flanco 5', um gap e um flanco 3', F-G-F' na orientação '5 -> 3'. A região "gap" (G) compreende um trecho de nucleotídeos de DNA contíguos que permitem ao oligonucleotídeo recrutar a RNase H. A região do gap é flanqueada por uma região de flanqueamento 5' (F) compreendendo um ou mais nucleosídeos modificados por açúcar, vantajosamente nucleosídeos modificados por açúcar de alta afinidade e por uma região de flanqueamento 3' (F') compreendendo um ou mais nucleosídeos modificados com açúcar, com vantagem os nucleosídeos modificados com açúcar de alta afinidade. Os referidos um ou mais nucleosídeos modificados com açúcar na região F e F' aumentam a afinidade do oligonucleotídeo para o ácido nucleico alvo (isto é, são nucleosídeos modificados com açúcar que aumentam a afinidade). Em algumas modalidades, o um ou mais nucleosídeos modificados por açúcar na região F e F' são 2 nucleosídeos modificados por açúcar, como modificações de açúcar de alta afinidade 2', como selecionados independentemente de LNA e 2'-MOE.
[00108] Em um projeto de gapmer, os a maioria dos nucleosídeos 5' e 3' da região de gap são nucleosídeos de DNA e estão posicionados adjacentes a um nucleosídeo modificado por açúcar dos 5'(F) ou 3'(F'), respectivamente. Os flancos podem ainda ser definidos por ter pelo menos um nucleosídeo modificado por açúcar na extremidade mais distante da região de gap, ou seja, na extremidade 5' do flanco 5' e na extremidade 3' do flanco 3'.
[00109] As regiões F-G-F' formam uma sequência nucleotídica contígua. Os oligonucleotídeos antissentido da invenção, ou a sequência nucleotídica contígua dos mesmos, podem compreender uma região gapmer de fórmula F-G-F'.
[00110] O comprimento total do projeto gapmer F- G-F' pode ser, por exemplo, 12 a 32 nucleosídeos, como 13 a 24, como 14 a 22 nucleosídeos, como 14 a 17, como 16 a 18 nucleosídeos.
[00111] A título de exemplo, o oligonucleotídeo gapmer da presente invenção pode ser representado pelas seguintes fórmulas: F1-8-G5-16-F'1-8, tais como F1-8-G7-16-F'2-8 com a condição de que o comprimento total das regiões gapmer F-G-F' seja pelo menos 12, tal como pelo menos 14 nucleotídeos de comprimento.
[00112] As regiões F, G e F' são ainda definidas abaixo e podem ser incorporadas na fórmula F-G-F'. Gapmer - Região G
[00113] A região G (região gap) do gapmer é uma região de nucleosídeos que permite ao oligonucleotídeo recrutar RNaseH, como a RNase H1 humana, tipicamente nucleosídeos de DNA. A RNaseH é uma enzima celular que reconhece o duplex entre o DNA e o RNA, e quebra enzimaticamente a molécula de RNA. Adequadamente, os gapmers podem ter uma região de gap (G) de pelo menos 5 ou 6 nucleosídeos de DNA contíguos, como 5 - 16 nucleosídeos de DNA contíguos, como 6 - 15 nucleosídeos de DNA contíguos, como 7-14 nucleosídeos de DNA contíguos, como 8 - 12 nucleotídeos de DNA contíguos, como 8 - 12 nucleotídeos de DNA contíguos de comprimento. A região gap G pode, em algumas modalidades consistir em 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 nucleosídeos de DNA contíguos. O DNA da citosina (C) na região gap pode, em alguns casos, ser metilado, tais resíduos são indicados como 5-metil- citosina (mecC ou com um e em vez de um c). A metilação do DNA da citosina no intervalo é vantajosa se, por exemplo, houver dinucleotídeos no intervalo para reduzir a toxicidade potencial, a modificação não tem impacto significativo na eficácia dos oligonucleotídeos.
[00114] Em algumas modalidades, a região gap G pode consistir em 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 nucleosídeos de DNA ligados ao fosforotioato contíguo. Em algumas modalidades, todas as ligações internucleosídicas no intervalo são ligações fosforotioato.
[00115] Embora os gapmers tradicionais possuam uma região de gap de DNA, existem inúmeros exemplos de nucleosídeos modificados que permitem o recrutamento de RNaseH quando são utilizados na região de gap. Os nucleosídeos modificados que foram relatados como capazes de recrutar RNaseH quando incluídos em uma região de gap incluem, por exemplo, alfa-L-LNA, DNA alquilado em C4'(como descrito em PCT/EP2009/050349 e Vester e outros, Bioorg. Med. Chem. Lett. 18 (2008) 2296 - 2300, ambos aqui incorporados como referência), nucleosídeos derivados de arabinose como ANA e 2'F-ANA (Mangos e outros, 2003 J. AM. CHEM. SOC. 125, 654-661), UNA (ácido nucleico desbloqueado) (como descrito em Fluiter e outros, Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039 aqui incorporado como referência). O UNA é um ácido nucleico desbloqueado, normalmente onde a ligação entre C2 e C3 da ribose foi removida, formando um resíduo de "açúcar" desbloqueado. Os nucleosídeos modificados usados em tais gapmers podem ser nucleosídeos que adotam uma estrutura 2' endo (semelhante a DNA) quando introduzidos na região de gap, isto é, modificações que permitem o recrutamento de RNaseH). Em algumas modalidades, a região Gap de DNA (G) descrita no presente documento pode opcionalmente conter 1 a 3 nucleosídeos modificados por açúcar que adotam uma estrutura 2' endo (semelhante a DNA) quando introduzida na região gap. Região G - “Separador de Gap”
[00116] Alternativamente, existem inúmeros relatórios da inserção de um nucleosídeo modificado que confere uma conformação de 3' à região de gap dos gapmers, mantendo certa atividade da RNaseH. Esses gapmers com uma região de gap compreendendo um ou mais nucleosídeos 3' endo modificados são referidos como gapmers de "quebra-gap" ou "gap interrompido", vide, por exemplo, WO2013/022984. Os oligonucleotídeos que quebram gap retêm região suficiente de nucleosídeos de DNA dentro da região de gap para permitir o recrutamento de RNaseH. A capacidade do projeto de oligonucleotídeo do quebra-gap de recrutar RNaseH é tipicamente sequência ou mesmo composto específico - vide Rukov e outros, 2015 Nucl. Acids Res. Vol. 43 pp. 8476- 8487, que descreve oligonucleotídeos "quebra-gap" que recrutam RNaseH que, em alguns casos, fornecem uma clivagem mais específica do RNA alvo. Os nucleosídeos modificados usados dentro da região de gap dos oligonucleotídeos de quebra de gaps podem, por exemplo, ser nucleosídeos modificados que conferem uma 3' endo confirmação, esses nucleosídeos 2'-O-metil (OMe) ou 2'-O-MOE (MOE) ou nucleosídeos beta-D LNA (a ponte entre C2' e C4' do anel de açúcar ribose de um nucleosídeo está na conformação beta), como nucleosídeos beta-D-óxi LNA ou ScET.
[00117] Assim como nos gapmers que contêm a região G descrita acima, a região de gapmers de quebra-gap ou gap-rompidos tem um nucleosídeo de DNA na extremidade 5' do gap (adjacente ao nucleosídeo 3' da região F) e um nucleosídeo de DNA na extremidade 3' do intervalo (adjacente ao nucleosídeo 5' da região F'). Gapmers que compreendem um gap rompido normalmente retêm uma região de pelo menos 3 ou 4 nucleosídeos de DNA contíguos na extremidade 5' ou na extremidade 3' da região de gap.
[00118] Exemplos de projetos para oligonucleotídeos de quebra-gap incluem: F1-8-[D3-4-E1-D 3-4] -F'1-8 F1-8-[D1-4-E1-D 3-4] -F'1-8 F1-8-[D3-4-E1-D 1-4] -F'1-8 em que a região G está entre parênteses [Dn-Er- Dm], D é uma sequência contígua de nucleosídeos de DNA, E é um nucleosídeo modificado (o nucleosídeo quebra-gap ou gap- rompimento) e F e F' são as regiões de flanqueamento como definido no presente documento e com a condição de que o comprimento total das regiões gapmer FG-F' seja pelo menos 12, tal como pelo menos 14 nucleotídeos de comprimento.
[00119] Em algumas modalidades, a região G de um gapmer rompido com gap compreende pelo menos 6 nucleosídeos de DNA, tais como 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 nucleosídeos de DNA. Como descrito acima, os nucleosídeos de DNA podem ser contíguos ou opcionalmente podem ser intercalados com um ou mais nucleosídeos modificados, com a condição de que a região G de gap seja capaz de mediar o recrutamento de RNaseH. Gapmer - Regiões De flanqueamento, F e F'
[00120] A região F é posicionada imediatamente adjacente ao nucleosídeo de DNA 5' da região G. A maior parte dos nucleotídeos 3' da região F é constituída por um nucleosídeo modificado por açúcar, tal como um nucleosídeo modificado por açúcar de alta afinidade, por exemplo, um nucleosídeo 2' substituído, tal como um nucleosídeo MOE ou um nucleosídeo LNA.
[00121] A região F' é posicionada imediatamente adjacente ao nucleosídeo de DNA 3' da região G. A maioria dos nucleotídeos 5' d região F' é um nucleosídeo modificado por açúcar, como um nucleosídeo modificado por açúcar de alta afinidade, por exemplo, um nucleosídeo substituído com 2', como um nucleosídeo MOE ou um nucleosídeo LNA.
[00122] A região F tem 1-8 nucleotídeos contíguos de comprimento, como 2-6, como 3-4 nucleotídeos contíguos de comprimento. Vantajosamente, a maioria dos nucleosídeos 5' da região F é um nucleosídeo modificado por açúcar. Em algumas modalidades, a maioria dos dois 5' nucleosídeos da região F são nucleosídeos modificados por açúcar. Em algumas modalidades, a maioria dos 5' nucleosídeos da região F é um nucleosídeo LNA. Em algumas modalidades, a maioria os dois 5' nucleosídeos da região F são nucleosídeos de LNA. Em algumas modalidades, a maioria dos dois 5' nucleosídeos da região F são 2' nucleosídeos de nucleosídeos substituídos, como dois 3' MOE nucleosídeos. Em algumas modalidades, a maioria dos 5' nucleosídeos da região F é um nucleosídeo 2' substituído, como um nucleosídeo MOE.
[00123] A região F' tem comprimento de 2-8 nucleotídeos contíguos, tal como 3-6, como 4-5 nucleotídeos contíguos de comprimento. Vantajosamente, a modalidades da maioria de 3' nucleosídeos da região F' é um nucleosídeo modificado por açúcar. Em algumas modalidades, os dois 3 'mais nucleosídeos da região F' são nucleosídeos modificados por açúcar. Em algumas modalidades, os dois nucleotídeos mais 3' da região F são nucleosídeos de LNA. Em algumas modalidades, a maioria dos 3' nucleosídeos da região F' é constituída por um nucleosídeo LNA. Em algumas modalidades, a maioria dos dois 3' nucleosídeos da região F' é constituída por nucleosídeos 2' substituídos, tais como dois 3' nucleosídeos de MOE. Em algumas modalidades, a maioria dos 3' nucleosídeos da região F' é constituída por um nucleosídeo 2' substituído, como um nucleosídeo MOE.
[00124] Deve-se notar que, quando o comprimento da região F ou F',é um, é vantajosamente um nucleosídeo LNA.
[00125] Em algumas modalidades, as regiões F e F' consistem independentemente ou compreendem uma sequência contígua de nucleosídeos modificados por açúcar. Em algumas modalidades, os nucleosídeos modificados em açúcar da região F podem ser selecionados independentemente a partir de unidades 2'-O-alquil-RNA, unidades 2'-O-metil-RNA, unidades 2'-amino-DNA, unidades 2'-flúor-DNA, 2'-alcóxi- RNA, unidades MOE, unidades LNA, unidades de ácido nucleico arabino (ANA) e unidades 2'-flúor-ANA.
[00126] Em algumas modalidades, a região F e F' compreende independentemente LNA e um nucleotídeo modificado 2' substituído (projeto de asa mista).
[00127] Em algumas modalidades, as regiões F e F' consistem em apenas um tipo de nucleosídeo modificado por açúcar, como apenas MOE ou apenas LNA beta-D-óxi ou apenas ScET. Tais projetos também são denominados flancos uniformes ou projeto gapmer uniforme.
[00128] Em algumas modalidades, todos os nucleosídeos da região F ou F', ou F e F' são nucleosídeos LNA, como selecionados independentemente de nucleosídeos beta-D-óxi LNA, ENA ou ScET. Em algumas modalidades, a região F consiste em 1-5, como 2-4, como 3-4, como 1, 2, 3, 4 ou 5 nucleosídeos LNA contíguos. Em algumas modalidades, todos os nucleosídeos da região F e F' são nucleosídeos beta-D-óxi LNA.
[00129] Em algumas modalidades, todos os nucleosídeos da região F ou F', ou F e F' são nucleosídeos 2' substituídos, como nucleosídeos OMe ou MOE. Em algumas modalidades, a região F consiste em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 nucleosídeos OMe ou MOE contíguos. Em algumas modalidades apenas uma das regiões de flanqueamento pode consistir em nucleosídeos 2' substituídos, como nucleosídeos OMe ou MOE. Em algumas modalidades, é a região de flanqueamento 5'(F) que consiste em nucleosídeos 2' substituídos, como nucleosídeos OMe ou MOE, enquanto a região de flanqueamento
3' (F') compreende pelo menos um nucleosídeo LNA, como LNA beta-D-óxi nucleosídeos ou cET nucleosídeos. Em algumas modalidades, é a região de flanqueamento 3'(F') que consiste em nucleosídeos 2' substituídos, como nucleosídeos OMe ou MOE, enquanto a região de flanqueamento 5'(F) compreende pelo menos um nucleosídeo LNA, como LNA beta-D- oxi nucleosídeos ou cET nucleosídeos.
[00130] Em algumas modalidades, todos os nucleosídeos modificados da região F e F' são nucleosídeos LNA, como selecionados independentemente a partir de nucleosídeos beta-D-óxi LNA, ENA ou ScET, em que a região F ou F' ou F e F' pode opcionalmente compreender nucleosídeos de DNA (um flanco alternado, veja a definição deles para mais detalhes). Em algumas modalidades, todos os nucleosídeos modificados da região F e F' são nucleosídeos beta-D-óxi LNA, em que a região F ou F', ou F e F' pode opcionalmente compreender nucleosídeos de DNA (um flanco alternado, vide a definição destes para mais detalhes).
[00131] Em algumas modalidades, a maioria dos nucleosídeos 5' e a maioria dos nucleosídeos 3' da região F e F' são nucleosídeos LNA, tais como nucleosídeos beta-D- óxi LNA ou nucleosídeos ScET.
[00132] Em algumas modalidades, a ligação internucleosídeo entre a região F e a região G é uma ligação internucleosídeo fosforotioato. Em algumas modalidades, a ligação internucleosídeo entre a região F' e a região G é uma ligação internucleosídeo fosforotioato. Em algumas modalidades, as ligações internucleosídicas entre os nucleosídeos da região F ou F', F e F' são ligações internucleosídicas de fosforotioato.
[00133] Projetos de gapmer adicionais são revelados nos documentos WO 2004/046160, WO 2007/146511 e WO 2008/113832, aqui incorporados como referência. Gapmer de LNA
[00134] Um gapmer de LNA é um gapmer em que um ou ambos da região F e F' compreendem ou consistem em nucleosídeos de LNA. Um gapmer beta-D-óxi é um gapmer em que um ou ambos da região F e F' compreendem ou consistem em nucleosídeos LNA beta-D-óxi.
[00135] Em algumas modalidades, o gapmer de LNA possui a fórmula: [LNA]1-5- [região G] - [LNA]1-5, em que a região G é como definida na definição da região Gapmer G. Gampers de MOE
[00136] Um gapmer de MOE é um gapmer em que as regiões F e F' consistem em nucleosídeos MOE. Em algumas modalidades, o gapmer de MOE é de projeto [MOE], ou seja, [Região G] - [MOE] 1-8, tal como [MOE] 2-7- [Região G] 5-16- [MOE] 2-7, como [MOE] 3-6- [Região G] - [MOE] 3-6, em que a região G é como definida na definição do Gapmer. Os gapmers MOE com um projeto 5-10-5 (MOE-DNA-MOE) têm sido amplamente utilizados na arte. Gapmer de Asa Mista
[00137] Um gapmer de asa mista é um gapmer de LNA, em que uma ou ambas as regiões F e F' compreendem um nucleosídeo substituído 2', como um nucleosídeo substituído 2', selecionado independentemente do grupo que consiste em unidades 2'-O-alquil-RNA, Unidades 2'-O-metil-RNA, 2'- amino-DNA, 2'-flúor-DNA, 2'-alcóxi-RNA, unidades MOE, unidades de ácido nucleico arabino (ANA) e 2'-flúor-ANA, como um nucleosídeo MOE. Em algumas modalidades em que pelo menos uma das regiões F e F', ou ambas as regiões F e F' compreendem pelo menos um nucleosídeo de LNA, os nucleosídeos restantes da região F e F' são selecionados independentemente do grupo que consiste em MOE e LNA. Em algumas modalidades em que pelo menos uma das regiões F e F', ou ambas as regiões F e F' compreendem pelo menos dois nucleosídeos de LNA, os demais nucleosídeos da região F e F' são selecionados independentemente do grupo que consiste em MOE e LNA. Em algumas modalidades de asa mista, um ou ambos da região F e F' podem ainda compreender um ou mais nucleosídeos de DNA.
[00138] Os projetos de gapmer de asa mista são revelados nos documentos WO 2008/049085 e WO 2012/109395, os quais são incorporados ao presente documento como referência. Gapmers Alternativos de Flanco
[00139] As regiões de flanqueamento podem compreender tanto o nucleosídeo LNA quanto o DNA e são denominadas "flancos alternados", pois compreendem um motivo alternado de nucleosídeos LNA-DNA-LNA. Os espaçadores que compreendem esses flancos alternados são referidos como "separadores de flancos alternados". "Gapmers de flanco alternativos" são, assim, oligonucleotídeos gapmer de LNA, em que pelo menos um dos flancos (F ou F') compreende DNA além do (s) nucleosídeo (s) de LNA. Em algumas modalidades, pelo menos uma das regiões F ou F', ou ambas as regiões F e F', compreendem nucleosídeos de LNA e nucleosídeos de DNA. Em tais modalidades, a região de flanqueamento F ou F', ou ambas F e F' compreendem pelo menos três nucleosídeos, em que a maioria dos nucleosídeos 5' e 3' da região F e/ou F's são nucleosídeos LNA.
[00140] Os gapmers de LNA de flanco alternado são revelados no documento WO 2016/127002.
[00141] Oligonucleotídeos com flancos alternados são oligonucleotídeos gapmer de LNA, em que pelo menos um dos flancos (F ou F') compreende DNA além do (s) nucleosídeo (s) de LNA. Em algumas modalidades, pelo menos uma das regiões F ou F', ou ambas as regiões F e F', compreendem nucleosídeos de LNA e nucleosídeos de DNA. Em tais modalidades, a região de flanqueamento F ou F', ou ambas F e F' compreendem pelo menos três nucleosídeos, em que a maioria dos nucleosídeos 5' e 3' da região F e/ou F' são nucleosídeos LNA.
[00142] Em algumas modalidades, pelo menos uma das regiões F ou F', ou ambas as regiões F e F', compreendem nucleosídeos de LNA e nucleosídeos de DNA. Em tais modalidades, a região de flanqueamento F ou F', ou ambas F e F' compreendem pelo menos três nucleosídeos, em que a maioria dos nucleosídeos 5' e 3' da região F ou F' são nucleosídeos de LNA e os. As regiões de flanqueamento que compreendem LNA e nucleosídeo de DNA são referidas como flancos alternados, pois compreendem um motivo alternado de nucleosídeos de LNA-DNA-LNA. Os gapmers de LNA de flanco alternado são revelados no documento WO2016/127002.
[00143] Uma região de flanco alternado pode compreender até 3 nucleosídeos de DNA contíguos, como 1 a 2 ou 1 ou 2 ou 3 nucleosídeos de DNA contíguos.
[00144] O flanco alternado pode ser anotado como uma série de números inteiros, representando um número de nucleosídeos LNA (L) seguido por um número de nucleosídeos DNA (D), por exemplo: [L] l-3- [D] l-4- [L] l-3 [L] 1-2- [D] 1-2- [L] 1-2- [D] 1-2- [L] 1-2
[00145] Em projetos de oligonucleotídeos, estes serão frequentemente representados como números, tais que 2-2-1 representa 5'[L] 2- [D] 2- [L] 3' e 1-1-1-1-1 representa 5'[L] - [D] - [L] - [D] - [L] 3'. O comprimento do flanco (região F e F') em oligonucleotídeos com flancos alternados pode ser independentemente de 3 a 10 nucleosídeos, como 4 a 8, como 5 a 6 nucleosídeos, como 4, 5, 6 ou 7 nucleosídeos modificados. Em algumas modalidades, apenas um dos flancos do oligonucleotídeo gapmer está alternando, enquanto o outro é constituído por nucleotídeos de LNA. Pode ser vantajoso ter pelo menos dois nucleosídeos LNA na extremidade 3 do flanco 3'(F'), para conferir resistência adicional à exonuclease. Alguns exemplos de oligonucleotídeos com flancos alternados são: [L]1-5- [D] 1-4- [L] 1-3- [G] 5-16- [L] 2-6 [L] 1-2- [D] 1-2- [L] 1-2- [D] 1-2- [L] 1-2- [G] 5-16- [L] 1-2- [D] 1-3- [L]2-4 [L] 1-5- [G] 5-i6- [L] - [D] - [L] - [D] - [L]2 com a condição de que o comprimento total do gapmer seja de pelo menos 12, como pelo menos 14 nucleotídeos de comprimento. Região D' ou D" em um Oligonucleotídeo
[00146] O oligonucleotídeo da invenção pode compreender, em algumas modalidades, ou consistir na sequência nucleotídica contígua do oligonucleotídeo que é complementar ao ácido nucleico alvo, como o gapmer F-G-F' e mais nucleotídeos 5' e/ou 3'. Os outros nucleosídeos 5' e/ou 3' podem ou não ser totalmente complementares ao ácido nucleico alvo. Tais nucleosídeos 5' e/ou 3' adicionais podem ser referidos como região D' e D" neste documento.
[00147] A adição da região D' ou D" pode ser usada com a finalidade de unir a sequência nucleotídica contígua, como o gapmer, a uma fração conjugada ou outro grupo funcional. Quando utilizado para unir a sequência nucleotídica contígua a uma fração conjugada, pode servir como um ligante bioclivável. Alternativamente, pode ser usado para fornecer proteção à exonucleoase ou para facilitar a síntese ou fabricação.
[00148] A região D' e D” pode ser anexada à extremidade 5' da região F ou à extremidade 3' da região F', respectivamente, para gerar projetos das seguintes fórmulas D'-F-G-F', F-G-F'-D” ou D'-F-G-F'-D". Neste caso, F-G-F' é a fração gapmer do oligonucleotídeo e a região D' ou D" constituem uma parte separada do oligonucleotídeo.
[00149] A região D' ou D" pode compreender independentemente ou consistir em 1, 2, 3, 4 ou 5 nucleotídeos adicionais, que podem ser complementares ou não complementares ao ácido nucleico alvo. O nucleotídeo adjacente à região F ou F' não é um nucleotídeo modificado com açúcar, como um DNA ou RNA ou versões modificadas com base destes. A região D' ou D' pode servir como um ligante bioclivável suscetível a nuclease (vide definição de ligantes). Em algumas modalidades, os nucleotídeos finais adicionais de 5' e/ou 3' estão ligados a ligações fosfodiéster e são DNA ou RNA. Os ligantes biocliváveis à base de nucleotídeos adequados para uso como região D' ou
D" são revelados no documento WO 2014/076195, que inclui a título de exemplo um dinucleotídeo de DNA ligado a fosfodiéster. O uso de ligantes biocliváveis em construções de poli-oligonucleotídeo é revelado no documento WO 2015/1 13922, onde eles são usados para ligar várias construções antissentido (por exemplo, regiões gapmer) dentro de um único oligonucleotídeo.
[00150] Em uma modalidade, o oligonucleotídeo da invenção compreende uma região D' e/ou D" além da sequência nucleotídica contígua que constitui o gapmer.
[00151] Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo da presente invenção pode ser representado pelas seguintes fórmulas: F-G-F'; em particular F1-8-G5-16-F'2-8 D'-F-G-F', em particular D'1-3-F1-8 -G5-16-F'2-8 F-G-F'-D", em particular F1-8-G5-16-F'2-8-D"1-3 D'-F-G-F'-D", em particular D'1-3- F1-8-G5-16-F'2-8- D"1-3
[00152] Em algumas modalidades, a ligação internucleosídeo posicionado entre a região D' e a região F é uma ligação fosfodiéster. Em algumas modalidades, a ligação internucleosídeo posicionada entre a região F' e a região D" é uma ligação fosfodiéster. Conjugado
[00153] O termo conjugado como empregado no presente documento refere-se a um oligonucleotídeo que está covalentemente ligado a uma fração não nucleotídica (fração conjugada ou região C ou terceira região). A conjugação do oligonucleotídeo da invenção a uma ou mais frações não nucleotídicas pode melhorar a farmacologia do oligonucleotídeo, por exemplo, afetando a atividade, distribuição celular, captação celular ou estabilidade do oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, a fração conjugada modifica ou aprimora as propriedades farmacocinéticas do oligonucleotídeo, melhorando a distribuição celular, biodisponibilidade, metabolismo, excreção, permeabilidade e/ou captação celular do oligonucleotídeo. Em particular, o conjugado pode direcionar o oligonucleotídeo para um órgão, tecido ou tipo de célula específico e, assim, aumentar a eficácia do oligonucleotídeo nesse órgão, tecido ou tipo de célula. Ao mesmo tempo que o conjugado pode servir para reduzir a atividade do oligonucleotídeo em tipos de células, tecidos ou órgãos não alvo, por exemplo, atividade fora do alvo ou atividade em tipos de células, tecidos ou órgãos não alvo. Os documentos WO 93/07883 e WO2013/033230 fornecem frações conjugadas adequadas, que são incorporadas ao presente documento como referência. Frações conjugadas adequadas adicionais são aquelas capazes de se ligar ao receptor de asialoglicoproteína (ASGPr). Em particular, as frações conjugadas de N-acetilgalactosamina trivalente são adequadas para ligação ao ASGPr, vide, por exemplo, documentos WO 2014/076196, WO 2014/207232 e WO 2014/179620 (incorporados ao presente documento como referência, em particular, Figura 13 do documento WO2014/076196 ou reivindicações 158-164 do WO2014/179620).
[00154] Os conjugados de oligonucleotídeo e sua síntese também foram relatados em revisões abrangentes de Manoharan em Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications, S.T. Crooke, ed., Cap. 16,
Marcel Dekker, Inc., 2001 e Manoharan, Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 2002, 12, 103, cada um dos quais é incorporado ao documento como referência na sua totalidade.
[00155] Em uma modalidade, a fração não nucleotídica (fração conjugada) é selecionada do grupo que consiste em carboidratos, ligantes receptores da superfície celular, substâncias medicamentosas, hormônios, substâncias lipofílicas, polímeros, proteínas, peptídeos, toxinas (por exemplo, toxinas bacterianas), vitaminas, proteínas virais (por exemplo, capsídeos) ou combinações das mesmas. Ligantes
[00156] Uma ligação ou ligante é uma conexão entre dois átomos que liga um grupo químico ou segmento de interesse a outro grupo químico ou segmento de interesse por meio de uma ou mais ligações covalentes. As frações conjugadas podem ser ligadas ao oligonucleotídeo diretamente ou através de uma fração de ligação (por exemplo, ligante ou corrente). Os ligantes servem para conectar covalentemente uma terceira região, por exemplo, uma fração conjugada (Região C), para uma primeira região, por exemplo, uma sequência oligonucleotídica ou nucleotídica contígua complementar ao ácido nucleico alvo (região A), conectando desse modo um dos terminais da região A a C.
[00157] Em algumas modalidades da invenção, o conjugado ou conjugado de oligonucleotídeo da invenção pode compreender, opcionalmente,e uma região ligante (segunda região ou região B e/ou região Y) que está posicionada entre o oligonucleotídeo ou a sequência nucleotídica contígua complementar ao ácido nucleico alvo (região A ou primeira região) e a fração conjugada (região C ou terceira região).
[00158] A região B refere-se a ligantes biocliváveis que compreendem ou consistem em uma ligação fisiologicamente lábil que é clivável em condições normalmente encontradas ou análogas às encontradas dentro de um corpo de mamífero. As condições nas quais os ligantes fisiologicamente instáveis sofrem transformação química (por exemplo, clivagem) incluem condições químicas como pH, temperatura, condições ou agentes oxidativos ou redutores e concentração de sal encontrada ou análoga à encontrada nas células de mamíferos. As condições intracelulares de mamíferos também incluem a presença de atividade enzimática normalmente presente em uma célula de mamífero, como a partir de enzimas proteolíticas ou enzimas hidrolíticas ou nucleases. Em uma modalidade, o ligante bioclivável é suscetível à clivagem de nuclease S1. Em uma modalidade preferida, o ligante suscetível à nuclease compreende entre 1 e 10 nucleosídeos, como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 nucleosídeos, mais preferencialmente entre 2 e 6 nucleosídeos e mais preferencialmente entre 2 e 4 nucleosídeos ligados compreendendo pelo menos duas ligações fosfodiéster consecutivas, tais como pelo menos 3 ou 4 ou 5 ligações fosfodiéster consecutivas. Preferencialmente, os nucleosídeos são DNA ou RNA. Fosfodiéster contendo ligantes biocliváveis são descritos em mais detalhes no documento WO 2014/076195 (incorporado ao presente documento como referência).
[00159] Os conjugados também podem ser ligados ao oligonucleotídeo por meio de ligantes não biocliváveis, ou em algumas modalidades o conjugado pode compreender um ligante não clivável que é covalentemente ligado ao ligante bioclivável (região Y). Ligantes que não são necessariamente biocliváveis, mas servem principalmente para conectar covalentemente uma fração conjugada (região C ou terceira região) a um oligonucleotídeo (região A ou primeira região), podem compreender uma estrutura de cadeia ou um oligômero de unidades repetidas, como etileno glicol, unidades de aminoácidos ou grupos aminoalquila Os conjugados oligonucleotídicos da presente invenção podem ser construídos dos seguintes elementos regionais A-C, ABC, ABYC, AYBC ou AYC. Em algumas modalidades, o ligante não clivável (região Y) é um aminoalquila, como um grupo aminoalquila C2 - C36, incluindo, por exemplo, grupos aminoalquila C6 a C12. Numa modalidade preferida, o ligante (região Y) é um grupo aminoalquila C6. Grupos ligantes conjugados podem ser rotineiramente ligados a um oligonucleotídeo através do uso de um oligonucleotídeo amino modificado e um grupo éster ativado no grupo conjugado. HTRA1
[00160] O termo "HTRA1", conforme usado neste documento, refere-se a qualquer nativo, um mamífero, tal como uma proteína A1 de requisito de alta temperatura de primatas ou humanos de qualquer fonte de mamíferos, incluindo primatas (por exemplo, humanos) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), exceto quando indicado. O termo abrange HTRA1 não processo "completo", bem como qualquer forma de HTRA1 resultante do processamento na célula. O termo também abrange variantes de HTRA1 que ocorrem naturalmente, por exemplo, variantes de emenda ou variantes alélicas. O número de acesso UniProt para HTRA1 humano é Q92743. A sequência de aminoácidos de um HTRA1 humano exemplar é mostrada na SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO 1:
MQIPRAALLPLLLLLLAAPASAQLSRAGRSAPLAAGCPDRCEPARCPPQPEHCEGGRAR DACGCCEVCGAPEGAACGLQEGPCGEGLQCVVPFGVPASATVRRRAQAGLCVCASSEPV CGSDANTYANLCQLRAASRRSERLHRPPVIVLQRGACGQGQEDPNSLRHKYNFIADVVE KIAPAVVHIELFRKLPFSKREVPVASGSGFIVSEDGLIVTNAHVVTNKHRVKVELKNGA TYEAKIKDVDEKADIALIKIDHQGKLPVLLLGRSSELRPGEFVVAIGSPFSLQNTVTTG IVSTTQRGGKELGLRNSDMDYIQTDAIINYGNSGGPLVNLDGEVIGINTLKVTAGISFA IPSDKIKKFLTESHDRQAKGKAITKKKYIGIRMMSLTSSKAKELKDRHRDFPDVISGAY IIEVIPDTPAEAGGLKENDVIISINGQSVVSANDVSDVIKRESTLNMVVRRGNEDIMIT VIPEEIDP
[00161] A sequência de aminoácidos de um exemplar primata HTRA1 é mostrada em SEQ ID NO: 2 {Macaca fascicularis). Uma sequência de aminoácidos HTRA1 de Macaca mulatta é divulgada no número de acesso universal H9FX91). SEQ ID NO 2
MQIPRAALLPLLLLLLLAAPASAQLSRAGRSPEHCEGGRARDACGCCEVCGAPEGAACG LQEGPCGEGLQCVVPFGVPASATVRRRAQAGLCVCASNEPVCGSDANTYANLCQLRAAS RRSERLHRPPVIVLQRGACGQGQEDPNSLRHKYNFIADVVEKIAPAVVHIELFRKLPFS KREVPVASGSGFIVSEDGLIVTNAHVVTNKHRVKVELKNGATYEAKIKDVDEKADIALI KIDHQGKLPVLLLGRSSELRPGEFVVAIGSPFSLQNTVTTGIVSTTQRGGKELGLRNSD MDYIQTDAIINYGNSGGPLVNLDGEVIGINTLKVTAGISFAIPSDKIKKFLTESHDRQA KGKAITKKKYIGIRMMSLTSSKAKELKDRHRDFPDVISGAYIIEVIPDTPAEAGGLKEN DVIISIN GQSVVSANDVSDVIKRESTLNMVVRRGNEDIMITVIPEEIDP
[00162] HTRA1 também é conhecido na técnica como protease, serina, 11 (ligação a IGF) (PRSS11), ARMD7, HTRA e IGFBP5-protease. O termo "HTRA1" também abrange "variantes de HTRA1", que significa um polipeptídeo HTRA1 ativo tendo pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência de aminoácidos com um polipeptídeo HTRA1 de sequência nativa, como SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO 2. Normalmente, uma variante HTRA1 terá pelo menos cerca de 95% de identidade de sequência de aminoácidos ou pelo menos cerca de 98% de identidade de sequência de aminoácidos ou pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência nativa de HTRA1, por exemplo, SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO 2.
[00163] O termo "antagonista de RNAm de HTRA 1" é usado para se referir a um antagonista HTRA1 que tem como alvo um ácido nucleico do HTRA1, como um RNAm, incluindo o HTRA1 RNAm ou o pré-RNAm. Em algumas modalidades, o antagonista HTRA1 RNAm é um oligonucleotídeo antissentido ou um siRNA e shRNA ou uma ribozima.
[00164] Um antagonista HTRA1 RNAm é capaz de inibir a expressão do ácido nucleico alvo do HTRA1 em uma célula que está expressando o ácido nucleico alvo do HTRA1. Vantajosamente, o antagonista HTRA1 RNAm é ou compreende um oligonucleotídeo em que a sequência contígua de nucleobases do oligonucleotídeo é complementar, tal como totalmente complementar ao ácido nucleico alvo do HTRA1, conforme medido ao longo do comprimento do oligonucleotídeo ou sequência nucleotídica contígua do mesmo. O ácido nucleico alvo do HTRA1 pode ser, em algumas modalidades, um RNA ou DNA, como um RNA mensageiro, como um RNAm maduro ou um pré- RNAm. Em algumas modalidades, o ácido nucleico alvo é um RNA que codifica a proteína HTRA1 de mamífero, como HTRA1 humano, por exemplo. A sequência de HTRA1 RNAm humano, tal como a divulgada como SEQ ID NO 3 ou 4. Informações adicionais sobre ácidos nucleicos alvo exemplares são fornecidas nas tabelas 1 e 2. Tabela 1. Informações sobre genoma e montagem de humanos e Cyno HTRA1. Espécies Chr. Fila- Coordenadas Conjunto Sequência mento Genômicas Referência Início Fim NCBI* Número Acesso para RNAm Humano 10 direto 1224615 1225149 GRCh38.p2 NM_002775.4 25 08 liberação 107 cinomolgo 9 direto 1217649 1218175 Macaca- NC_022280.1* 94 18 fascicula- * ris 5.0 direto=filamento direto. As coordenadas genômicas fornecem a sequência pré-RNAm (sequência genômica). A referência NCBI fornece a sequência de RNAm (Sequência DNAc). *The National Center for Biotechnology Information reference sequence database é um conjunto abrangente, integrado, não redundante e bem anotado das sequências de referência, incluindo genômica, transcrição e proteína. Está hospedado em www.ncbi.nlm.nih.aov/refseg. ** Na sequência de referência NCBI, há um trecho de 100 nucleotídeos da posição 126 para a posição 227 cuja identidade não é conhecida. Nas SEQs ID NOs 5 e 6, esse trecho foi substituído pelos nucleotídeos que aparecem nas sequências de HTRA1 pré-RNAm de Macaca mulatta e humana nessa região. Tabela 2. Detalhes da sequência para HTRA1 humano e macaco cinomolgo Espécie Tipo de Comprimento SEQ ID NO
RNA
Humana RNAm 2138 3 Humana Pré-RNAm 53384 4 Macaco RNAm 2123 5 cinomolgo Macaco Pré-RNAm 52575 6 cinomolgo Antagonistas de Oligonucleotídeos de HTRA1
[00165] Os documentos PCT/EP2017/065937 e EP17173964.2, ambos incorporados como referência em sua totalidade, divulgam inúmeros oligonucleotídeos antissentido que são potentes inibidores in vivo de HTRA1 RNAm e seu uso terapêutico, incluindo o uso para tratar a degeneração macular, que pode ser usada na presente invenção.
[00166] Os antagonistas HTRA1 RNAm podem ser oligonucleotídeos antissentido ou siRNAs que compreendem uma sequência nucleotídica contígua de 10 a 30 nucleotídeos de comprimento com pelo menos 90% de complementaridade, como totalmente complementar, a um ácido nucleico de HTRA1 de mamífero, como SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 ou SEQ ID NO 6.
[00167] Vantajosamente, o antagonista HTRA1 RNAm é um oligonucleotídeo antissentido de LNA, como um oligonucleotídeo gapmer de LNA.
[00168] Em algumas modalidades, os antagonistas do HTRA1 RNAm, tal como o oligonucleotídeo antissentido incluindo o oligonucleotídeo antissentido LNA ou oligonucleotídeo gapmer, compreende uma região nucleotídica contígua de 10 a 22 nucleotídeos que são pelo menos 90%, como complementaridade a 100% da SEQ ID NO 7:
SEQ ID NO 7: 5' CCAACAACCAGGTAAATATTTG 3'
[00169] Em algumas modalidades, os antagonistas do HTRA1 RNAm, como o oligonucleotídeo antissentido ou siRNA; tal como um oligonucleotídeo antissentido LNA ou oligonucleotídeo de gapmer, compreende uma região nucleotídica contígua de pelo menos 12 nucleotídeos contíguos de comprimento presente em uma sequência selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO 8: CAAAT ATTT ACCTGGTTG SEQ ID NO 9: TTTACCTGGTTGTTGG SEQ ID NO 10: CCAAATATTTACCTGGTT SEQ ID NO 11: CCAAATATTTACCTGGTTGT SEQ ID NO 12: ATTTACCTGGTTGTTG SEQ ID NO 13: TATTTACCTGGTTGTT SEQ ID NO 14: ATATTTACCTGGTTGT, e SEQ ID NO 15: ATATTTACCTGGTTGTT.
[00170] Em algumas modalidades, o antagonista HTRA1 RNAm (oligonucleotídeo antissentido) é ou compreende um oligonucleotídeo selecionado do grupo selecionado a partir de: CsAsAsAstsastststsascscstsgsGsTsTsG (SEQ ID NO 8, Comp #8.1) TsTstsascscsts9s9ststs9stsTsGsG (SEQ ID NO 9, Comp #9.1) CsCsAsAsastsastststsascscstsgsGsTsT (SEQ ID NO 10, Comp #10.1) CsCsAsasastsastststsascscsts9s9ststsGsT (SEQ ID NO 11,Comp #11.1) AsTsAstststsascscstsgsgststsgsTsTsG (SEQ ID NO 12, Comp #12.1) TsAsTststsascscstsgsgstsTsGsTsT (SEQ ID NO 13, Comp #13.1) TsAstststsascscstsgsGstsTsgsTsT (SEQ ID NO 13, Comp #13.2) TsAsTststsascscstsgsgsTsTsgsTsT (SEQ ID NO 13, Comp #13.3) AsTsAsTststsascscstsgsgsTsTsGsT (SEQ ID NO 14, Comp #14.1) AstsAsTsTstsascscstsgsgstsTsGsT (SEQ ID NO 14, Comp #14.2)
AstsAsTststsascscstsgsgsTsTsgsTsT (SEQ ID NO 15, Comp #15.1) AsTsAstststsascscstsgsGstsTsgsTsT (SEQ ID NO 15, Comp #15.2) AstsAsTststsascscstsgsgstsTsGsTsT (SEQ ID NO 15, Comp #15.3)
[00171] Em que uma letra maiúscula representa uma unidade nucleosídeo beta-D óxi LNA, uma letra minúscula representa uma unidade nucleosídeo DNA, o índice s representa uma ligação internucleosídeo fosforotioato, em que todas as citosinas LNA são 5-metil citosina.
[00172] Em algumas modalidades, o antagonista de RNAm HTRA 1 é ou compreende o oligonucleotídeo antissentido de LNA da fórmula TsAsTststsascscstsgsgstsTsGsTsT 3' (SEQ ID NO 13) ou 5' AstsAsTstsascscstssgststsGsTsT 3' (SEQ ID NO 15) em que, uma letra maiúscula representa uma unidade nucleosídeo beta-D óxi LNA, uma letra minúscula representa uma unidade de DNA de nucleosídeo, subscrito s representa uma ligação internucleosídeo fosforotioato, em que todas as citosinas LNA são 5-metil citosina, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00173] Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo antissentido tem 10 - 30 nucleotídeos de comprimento, em que o referido oligonucleotídeo antissentido tem como alvo um ácido nucleico HTRA1 e compreende uma região nucleotídica contígua de 10 - 22 nucleotídeos que são pelo menos 90%, como complementaridade a 100% da SEQ ID NO 16.
SEQ ID NO 16:
GACAGTCAGCATTTGTCTCCTCCTTTAACTGAGTCATCATCTTAGTCCAACTAATGCAG TCGATACAATGCGTAGATAGAAGAAGCCCCACGGGAGCCAGGATGGGACTGGTCGTGTT TGTGCTTTTCTCCAAGTCAGCACCCAAAGGTCAATGCACAGAGACCCCGGGTGGGTGA GCGCTGGCTTCTCAAACGGCCGAAGTTGCCTCTTTTAGGAATCTCTTTGGAATTGGGAG
CACGATGACTCTGAGTTTGAGCTATTAAAGTACTTCTTAC em algumas modalidades, o oligonucleotídeo antissentido é ou compreende uma região nucleotídica contígua selecionada de qualquer uma das SEQ ID NO 17, 18 e 19, ou pelo menos 12 nucleotídeos contíguos das mesmas: CTTCTTCTATCTACGCAT (SEQ ID NO 17) TACTTTAATAGCTCAA (SEQ ID NO 18) TTCTATCTACGCATTG (SEQ ID NO 19)
[00174] Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo antissentido é ou compreende uma região nucleotídica contígua selecionada dentre: CTTCttctatctacgcAT (SEQ ID NO 17), TACTttaatagcTCAA (SEQ ID NO 18), e TTCtatctacgcaTTG (SEQ ID NO 19); em que letras maiúsculas são nucleotídeos de LNA e letras minúsculas são nucleosídeos de DNA e resíduos de citosina são opcionalmente 5-metil citosina.
[00175] Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo antissentido é ou compreende uma região nucleotídica contígua selecionada a partir de: m CsTsTsmCststsCstsastsCstsasmCsgsCsAsT (SEQ ID NO 17, C ID #17), TsAsmCsTststsasastsasgsCsTsmCsAsA (SEQ ID NO 18, C ID #18), TsTsmCstsastsCstsasmcsgsCsasTsTsG (SEQ ID NO 19, C ID #19), em que as letras maiúsculas representam nucleosídeos LNA beta-D-óxi, as letras minúsculas são nucleosídeos DNA, o subscrito s representa uma ligação internucleosídeo m fosforotioato e C representa 5 nucleosídeos LNA beta-D-óxi m metil-citosina beta, e c representa 5 nucleosídeos de DNA de metil citosina.
[00176] Vide figuras 1, 2, 3, 4 e 5 para exemplos de compostos oligonucleotídeos antissentido de LNA que são antagonistas HTRA1 RNAm para uso de acordo com a presente invenção ou nos métodos de acordo com a presente invenção. Transtornos Oculares e HTRA1 Associadas
[00177] O termo "transtorno associado à HTRA1", como empregado no presente documento, refere-se no sentido mais amplo a qualquer transtorno ou condição associada à expressão ou atividades de HTRA1, incluindo atividades ou expressão anormais de HTRA1. Em algumas modalidades, os transtornos associados ao HTRA1 estão associados aos níveis ou atividade excessivos de HTRA1 nos quais sintomas atípicos podem se manifestar devido aos níveis ou atividade de HTRA1 localmente (por exemplo, em um olho) e/ou sistemicamente no corpo. Transtornos associados a HTRA1 exemplares incluem transtornos oculares associados a HTRA1, que incluem, entre outros, degeneração macular relacionada à idade (AMD), incluindo AMD úmida (exsudativa) (incluindo AMD úmida precoce, intermediária e avançada) e AMD seca (não-exsudativa) (incluindo AMD seca precoce, intermediária e avançada (por exemplo, atrofia geográfica (GA)).
[00178] Como empregado no presente documento, o termo "transtorno ocular" inclui, mas não está limitado aos transtornos oculares, incluindo doenças degenerativas maculares, como degeneração macular relacionada à idade (AMD), incluindo AMD úmida (exsudativa) (incluindo, AMD precoce, intermediária e AMD úmida avançada) e AMD seca (não exsudativa) (incluindo AMD seca precoce, intermediária e avançada (por exemplo, atrofia geográfica (GA)); retinopatia diabética (DR) e outras retinopatias relaciondas à isquemia; endoftalmite; uveíte; neovascularização coróide (CNV); retinopatia da prematuridade (ROP); vasculopatia coroidal polipoidal (PCV); edema macular diabético; miopia patológica; doença de von Hippel-Lindau; histoplasmose do olho; Oclusão de Veia Central da Retina (OVCR); neovascularização da córnea; e neovascularização da retina. Em algumas modalidades, o transtorno ocular é AMD (por exemplo, GA). O Indivíduo
[00179] Um "indivíduo" é um mamífero. Mamíferos incluem primatas (por exemplo, humanos e primatas não humanos, como macacos) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos). Em certas modalidades, o indivíduo ou indivíduo é um humano. Um "indivíduo" pode ser um "paciente" - um paciente é um indivíduo humano que precisa de tratamento e pode ser um indivíduo com um transtorno relacionado ao HTRA1, como um transtorno ocular, um indivíduo com risco de desenvolver um transtorno relacionado ao HTRA1, como um transtorno ocular.
[00180] Em algumas modalidades, o paciente é uma pessoa que foi diagnosticada com um transtorno ocular, como os listados aqui, como um transtorno ocular selecionado do grupo que consiste em AMD, retinopatia diabética, retinopatia da prematuridade ou vasculopatia coroidal polipoidal. Em algumas modalidades, o transtorno ocular é selecionado do grupo que consiste em AMD seca precoce, AMD seca intermediária ou AMD seca avançada. Em algumas modalidades, o transtorno ocular é atrofia geográfica.
[00181] Em algumas modalidades, o paciente é uma pessoa que foi identificada como tendo risco de desenvolver um transtorno ocular como os listados no presente documento, como um transtorno ocular selecionado do grupo que consiste em AMD, retinopatia diabética, retinopatia da prematuridade ou polipoide vasculopatia coroidal. Em algumas modalidades, o transtorno ocular é selecionado do grupo que consiste em AMD seca precoce, AMD seca intermediária ou AMD seca avançada. Em algumas modalidades, o transtorno ocular é atrofia geográfica.
[00182] Em algumas modalidades, o paciente é uma pessoa que teve níveis elevados de HTRA1 em seu humor aquoso ou vítreo. Em algumas modalidades, o paciente é uma pessoa que foi diagnosticada com um transtorno associado ao HTRA1 ou uma pessoa que foi identificada como tendo risco de desenvolver um transtorno associado ao HTRA1. O paciente pode, portanto, ser um indivíduo com níveis elevados de HTRA1 no humor aquoso ou vítreo e, opcionalmente, pode ser assintomático.
[00183] Em algumas modalidades, o paciente pode ser um indivíduo que possui um ou mais polimorfismos associados à doença no gene HTRA ou na sequência de controle HTRA1, como o polimorfismo do promotor de HTRA1 rs11200638 (G/A) (vide, por exemplo, DeWan e outros, Science 314 : 989-992, 2006, que é incorporado ao presente documento por referência na sua totalidade). O paciente pode, portanto, ser um indivíduo, que possui um polimorfismo associado à doença no gene HTRA1 ou na sequência de controle do HTRA1 e, opcionalmente, pode ser assintomático. Sais Farmacêuticos
[00184] Para uso como terapêutico, o antagonista
HTRA1 RNAm, como um oligonucleotídeo direcionado à HTRA1, usado de acordo com o método ou uso da invenção, pode ser fornecido como um sal farmacêutico adequado, como um sal de sódio ou potássio. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo da invenção é um sal de sódio. Composição Farmacêutica
[00185] Em um aspecto adicional, a invenção fornece composições farmacêuticas compreendendo qualquer um dos oligonucleotídeos e/ou conjugados de oligonucleotídeos acima mencionados e um diluente, veículo, sal e/ou adjuvante farmaceuticamente aceitável. Um diluente farmaceuticamente aceitável inclui solução salina tamponada com fosfato (PBS) e sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a, sais de sódio e potássio. Em algumas modalidades, o diluente farmaceuticamente aceitável é solução salina tamponada com fosfato estéril. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo é usado no diluente farmaceuticamente aceitável a uma concentração de solução de 50 - 300 µM. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo da invenção é administrado na dose de 10 – 1000 µg.
[00186] O documento WO 2007/031091 fornece exemplos adequados e preferidos de diluentes, veículos e adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis (aqui incorporados por referência). Dosagens, formulações, vias de administração, composições, formas de dosagem adequadas, combinações com outros agentes terapêuticos, formulações pró-droga também são fornecidas em WO2007/031091. Os oligonucleotídeos ou conjugados de oligonucleotídeos da invenção podem ser misturados com substâncias ativas ou inertes farmaceuticamente aceitáveis para a preparação de composições ou formulações farmacêuticas. As composições e métodos para a formulação de composições farmacêuticas dependem de vários critérios, incluindo, entre outros, via de administração, extensão da doença ou dose a ser administrada. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo ou conjugado de oligonucleotídeo da invenção é um pró-fármaco. Em particular no que diz respeito aos conjugados oligonucleotídicos, a fração conjugada é clivada do oligonucleotídeo uma vez que o pró-fármaco é entregue no local da ação, por exemplo, a célula alvo. Administração
[00187] Os antagonistas do HTRA1 RNAm podem ser administrados via tópica (como na pele, inalação, oftalmologia ou ótica) ou enteral (como oralmente ou através do trato gastrointestinal) ou parenteral (como intravenosa, subcutânea, intra-muscular, intracerebral, intracerebroventricular ou intratecal).
[00188] Em algumas modalidades, como antagonistas do HTRA1 RNAm, são administrados por uma via parentérica, incluindo injeção ou infusão intravenosa, intra-arterial, subcutânea, intra-peritoneal ou intramuscular, intratecal ou intracraniana, por exemplo, administração intracerebral ou intraventricular. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo ativo ou o conjugado de oligonucleotídeo é administrado por via intravenosa. Noutra modalidade, o oligonucleotídeo ativo ou o conjugado de oligonucleotídeo é administrado por via subcutânea.
[00189] Para uso no tratamento de transtornos oculares, podem ser usados antagonistas HTRA1 RNAm, por exemplo, os oligonucleotídeos de LNA descritos no presente documento como injeção intra-ocular.
[00190] Em algumas modalidades, o composto da invenção, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é administrado por meio de uma injeção intra-ocular em uma dose de cerca de 10 µg a cerca de 200 µg por olho, como cerca de 50 µg a cerca de 150 µg por olho, como cerca de 100 µg por olho. Em algumas modalidades, o intervalo de dosagem, isto é, o período de tempo entre dosagens consecutivas é pelo menos mensal, como pelo menos duas vezes por mês ou pelo menos uma vez a cada três meses. Determinação do Nível de HTRA1 em uma Amostra
[00191] Uma amostra do humor vítreo ou aquoso, vantajosamente o humor aquoso, é obtida do indivíduo. O nível de HTRA1 presente na amostra pode ser determinado por qualquer método conhecido na técnica, adequadamente através do uso de um anticorpo anti-HTRA1 em um imunoensaio ou através do uso de espectroscopia de massa.
[00192] Em algumas modalidades, os níveis de proteína HTRA1 são determinados usando espectrometria de massa.
[00193] Em algumas modalidades, o nível de proteína HTRA1 é determinado usando um ensaio imunológico, como o uso de um anticorpo específico para HTRA1.
[00194] Em algumas modalidades, os níveis de proteína HTRA1 são determinados usando a captura de anticorpo HTRA1 seguida por LC-MS.
[00195] Em algumas modalidades, os níveis de proteína HTRA1 são determinados via LC-MS de uma protease, por exemplo, tripsina, amostra de proteína digerida de
HTRA1 capturado por imunidade, obtida de uma amostra de humor vítreo ou aquoso do indivíduo. Outras proteases que podem ser usadas para digerir o HTRA1 imuno-capturado incluem LysC, AspN, GluC.
[00196] Em algumas modalidades, a proteína HTRA1 é imunocapturada a partir da amostra usando um anticorpo HTRA1, como por meio de um ensaio de imunossorvente ligado a enzima de imunocaptura (ELISA), ou via western blot. Comparação do Nível de HTRA1 com uma ou mais Amostras de Referência
[00197] Como explicado acima, a super expressão do HTRA1 está associada a inúmeras doenças oculares, incluindo a AMD, como a AMD seca precoce, a AMD seca intermediária ou a AMD seca avançada, como atrofia geográfica. O método da invenção na etapa ii) pode portanto, compreender uma comparação dos níveis de HTRA1 (por exemplo, Níveis de proteína HTRA1) obtidos na etapa i) com um ou mais valores de referência do nível HTRA1 em um indivíduo saudável (indivíduo controle negativo) que não sofre de uma doença ocular ou tem um polimorfismo associado à doença no gene HTRA1 (incluindo o Região de controle HTRA) ou um valor de referência médio ou médio obtido de uma população de indivíduos saudáveis (indivíduo de controle negativo). Alternativamente ou além disso, a etapa ii) pode compreender uma comparação dos níveis de HTRA1 (por exemplo, Níveis de proteína HTRA1) obtidos na etapa ii) com um ou mais valores de referência dos níveis de HTRA1 em um indivíduo que foi diagnosticado com uma doença ocular associada ao HTRA1 ou que foi caracterizada como HTRA1 superexpressivo e/ou foi caracterizada como tendo um polimorfismo associado à doença no gene HTRA 1 (incluindo a região de controle HTRA) - ou seja, um controle positivo. Um nível de HTRA1 que é elevado em comparação com o indivíduo de controle negativo e/ou é semelhante ou equivalente ao valor de controle positivo é uma indicação de que o indivíduo provavelmente é ou é adequado para o tratamento com o antagonista HTRA1 RNAm.
[00198] Em uma modalidade adicional, além dos valores de controle positivo e/ou negativo, os valores obtidos anteriormente do mesmo indivíduo podem ser usados. Essas amostras de referência podem, portanto, incluir um valor histórico, ou valores históricos, obtidos anteriormente do mesmo assunto. A comparação dos níveis de HTRA1 obtidos na etapa i) com os valores históricos do mesmo indivíduo permite o monitoramento da eficácia da terapia antagonista HTRA1 RNAm e, portanto, pode ser usada para determinar a dose eficaz provável do antagonista HTRA1 RNAm. A este respeito, em algumas modalidades, o objetivo da terapia antagonista HTRA1 RNAm é essencialmente normalizar os níveis de HTRA1 em vez de alcançar a inibição completa. O método ou uso da invenção pode portanto, ser utilizado para o monitoramento dos níveis de HTRA1 pelo paciente antes, durante ou após o tratamento com HTRA1 e, por exemplo, pode ser utilizado entre doses de administração do antagonista HTRA1 RNAm, por exemplo, para permitir a modulação do dosagem para otimizar a eficácia do tratamento.
FORMAS DE REALIZAÇÃO ADICIONAIS DA INVENÇÃO
[00199] 1. Método para determinar a adequação do tratamento de um indivíduo para administração com um antagonista HTRA1 RNAm, o referido método compreendendo as etapas de: i) determinar o nível de HTRA1 em uma amostra de humor aquoso ou vítreo obtida do indivíduo ii) comparar o nível de HTRA1 obtido na etapa i) com uma ou mais amostras ou valores de referência; determinar se é provável que o indivíduo seja ou possa ser adequado para o tratamento com o antagonista HTRA1 RNAm, em que o indivíduo está sofrendo ou corre o risco de desenvolver um transtorno ocular, como degeneração macular.
[00200] 2. O método de acordo com a modalidade 1, em que o nível de HTRA1 na amostra de humor aquoso ou humor vítreo é determinado pela quantificação do nível de proteína HTRA1 na amostra.
[00201] 3. O método de acordo com a modalidade 2, em que o nível de proteína HTRA1 é determinado usando um ensaio imunológico, como o uso de um anticorpo específico para HTRA1.
[00202] 4. O método de acordo com a modalidade 3, em que o nível de proteína HTRA1 é determinado usando espectrometria de massa, como por meio da captura de anticorpo HTRA1, seguido por LC-MS.
[00203] 5. O método de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma amostras de referência ou valores de referência são obtidos de um indivíduo de controle que sofre de degeneração macular.
[00204] 6. O método de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 5, em que pelo menos uma das amostras de referência ou valores de referência são obtidos de um indivíduo de controle que não sofre de degeneração macular.
[00205] 7. O método de acordo com qualquer uma das modalidades 1-6, em que pelo menos uma das amostras de referência é um valor previamente obtido do mesmo indivíduo cuja adequação ao tratamento está sendo avaliada.
[00206] 8. O método de acordo com qualquer uma das modalidades 1 - 7, em que os valores de referência são derivados de um conjunto de dados modelando a correlação entre a concentração de HTRA1 na retina e a concentração de HTRA1 no humor aquoso ou humor vítreo.
[00207] 9. O método de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o antagonista HTRA1 RNAm é selecionado do grupo que consiste em um oligonucleotídeo antissentido direcionado ao RNAm ou pré-HTRA1 RNAm, um siRNA direcionado ao HTRA1 RNAm, uma ribozima direcionada ao HTRA1 RNAm ou pré-RNAm.
[00208] 10. O método de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 9, em que o método se destina a determinar se o indivíduo tem uma expressão aprimorada de HTRA1 RNAm ou de proteína HTRA1 na retina, como células epiteliais da retina.
[00209] 11. O método de acordo com qualquer uma das modalidades 1 - 10, em que o indivíduo está sofrendo ou corre o risco de desenvolver um transtorno ocular selecionado do grupo que consiste em doenças degenerativas maculares, como degeneração macular relacionada à idade (AMD), incluindo AMD úmida (exsudativa) (incluindo AMD úmida precoce, intermediária e avançada) e AMD seca (não exsudativa) (incluindo AMD seca precoce, intermediária e avançada (por exemplo, atrofia geográfica (GA)); retinopatia diabética (DR) e outras isquemia relacionadas às retinopatias; endoftalmite; uveíte; neovascularização coróide (CNV); retinopatia da prematuridade (ROP); vasculopatia coroidal polipoidal (PCV); edema macular diabético; miopia patológica; doença de von Hippel-Lindau; histoplasmose ocular; oclusão da veia retiniana central (CRVO), neovascularização da córnea e neovascularização da retina.
[00210] 12. O método de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 11, em que o indivíduo está sofrendo ou corre o risco de desenvolver degeneração macular relacionada à idade (AMD), como a AMD selecionada do grupo que consiste em AMD úmida (exsudativa) (incluindo lesões precoces), AMD úmida intermediária e avançada), AMD seca (não exsudativa) (incluindo AMD seca precoce, intermediária e avançada (por exemplo, atrofia geográfica (GA)); vantajosamente AMD seca.
[00211] 13. O método de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 12, em que o método é para determinar o regime de dose adequado para a administração com o antagonista HTRA1 RNAm.
[00212] 14. O método de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 13, em que o antagonista HTRA1 RNAm é um oligonucleotídeo que compreende uma região nucleotídica contígua de 10 a 30 nucleotídeos que são totalmente complementares a uma sequência de ácido nucleico alvo do HTRA1, como SEQ ID NO 1 ou SEQ ID NO 2.
[00213] 15. O método de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o antagonista HTRA1 RNAm é ou compreende um oligonucleotídeo que compreende uma sequência nucleotídica contígua de pelo menos 12 nucleotídeos de comprimento que são pelo menos 90 e complementares a, tal como totalmente complementares à SEQ ID NO 7 ou SEQ ID NO 16.
[00214] 16. O método de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 15, em que o antagonista HTRA1 RNAm é ou compreende um oligonucleotídeo antissentido, como um oligonucleotídeo gapmer LNA.
[00215] 17. O método de acordo com qualquer uma das modalidades 1 - 16, em que o antagonista HTRA1 RNAm é selecionado do grupo que consiste em: 5' TsAsTststsascscstsgsgstsTsGsTsT 3' (sEQ ID NO 13, #13.1) 5' AstsAsTststsascscstsgsgstsTsGsTsT 3' (SEQ ID NO 15, #15.3) 5' CsTsTsCststscstsastscstsasmcsgsCsAsT 3' (SEQ ID NO 17, #17), 5' TsAsCsTststsasastsasgscsTsCsAsA 3' (SEQ ID NO 18, #18); e 5' TsTsCstsastscstsasmcsgscsasTsTsG 3' (SEQ ID NO 19, #19),
[00216] em que uma letra maiúscula representa uma unidade de nucleosídeo beta-D óxi LNA, uma letra minúscula representa uma unidade de nucleosídeo de DNA, o subscrito s representa uma ligação internucleosídeo de fosforotioato, m c representa nucleosídeos de DNA de 5-metil-citosina e todas as citosinas de LNA são 5-metil-citosina; ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
[00217] 18. Um método para tratar um indivíduo que sofre ou corre o risco de desenvolver degeneração macular, o referido método compreendendo executar o método de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 17, e administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um antagonista HTRA1 RNAm.
[00218] 19. O método de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 17, em que o antagonista HTRA1 RNAm se destina a administração via administração intra-vitral.
[00219] 20. Uso de um anticorpo HTRA1 como diagnóstico complementar para uma terapêutica antagonista de RNA HTRA1.
[00220] 21. Uso de um anticorpo HTRA1 como biomarcador para a eficácia de um RNA HTRA1 terapêutico antagonista, tal como um antagonista HTRA1 RNAm, tal como de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes.
[00221] 22. O uso de um anticorpo HTRA1 na detecção de níveis de HTRA1 em uma amostra de humor aquoso ou humor vítreo obtido de um indivíduo em tratamento com um antagonista HTRA1 RNAm ou que está sendo avaliado quanto à adequação do tratamento com um antagonista HTRA1 RNAm, como de acordo com a qualquer uma das modalidades precedentes.
[00222] 22. Uso de um biomarcador para determinar a resposta provável de um indivíduo a um agente terapêutico compreendendo um antagonista HTRA1 RNAm, tal como de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes, em que o biomarcador compreende um nível elevado de HTRA1 em uma amostra biológica obtida a partir da solução aquosa de humor ou humor vítreo do indivíduo, em comparação com o nível de HTRA1 obtido de uma amostra de referência de um indivíduo saudável.
EXEMPLOS Síntese de oligonucleotídeos
[00223] A síntese de oligonucleotídeos é geralmente conhecida na técnica. A seguir se encontra um protocolo que pode ser aplicado. Os oligonucleotídeos da presente invenção podem ter sido produzidos por métodos ligeiramente variáveis em termos de aparelho, suporte e concentrações utilizados.
[00224] Os oligonucleotídeos são sintetizados em suportes universais de uridina utilizando a abordagem de fosforamiditas numa escala Oligomaker 48 à escala de 1 µmol. No final da síntese, os oligonucleotídeos são clivados do suporte sólido usando amônia aquosa por 5-16 horas a 60°C. Os oligonucleotídeos são purificados por HPLC de fase reversa (RP-HPLC) ou por extrações em fase sólida e caracterizados por UPLC, e a massa molecular é ainda confirmada por ESI-MS. Alongamento do Oligonucleotídeo:
[00225] O acoplamento de β-cianoetil- fosforamiditas (DNA-A (Bz), DNA-G (ibu), DNA-C (Bz), DNA-T, LNA-5-metil-C (Bz), LNA-A (Bz), LNA-G (dmf), LNA-T) é realizado usando uma solução de 0,1 M de amidita protegida com 5'-O-DMT em acetonitrila e DCI (4,5-dicianoimidazol) em acetonitrila (0,25 M) como activador. Para o ciclo final, pode ser utilizado uma fosforamidita com as modificações desejadas, por exemplo, um ligante C6 para anexar um grupo conjugado ou um grupo conjugado como tal. A tiolação para introdução de ligações de fosfortioato é realizada usando hidreto de xantano (0,01 M em acetonitrila/piridina 9:1). As ligações fosfordiéster podem ser introduzidas usando iodo 0,02 M em THF/piridina/água 7: 2: 1. O restante dos reagentes é constituído pelos que foram tipicamente usados para a síntese de oligonucleotídeos.
[00226] Para conjugação da síntese pós fase sólida, uma forforamidita de ligante amino C6 disponível comercialmente pode ser usada no último ciclo da síntese da fase sólida e após desprotecção e clivagem do suporte sólido, o oligonucleotídeo desprotegido é isolado. Os conjugados são introduzidos via ativação do grupo funcional usando métodos de síntese padrão. Purificação por RP-HPLC:
[00227] Os compostos brutos são purificados por RP-HPLC preparativa numa coluna Phenomenex Jupiter C18 10 µ 150x10 mm. São empregados 0,1 M acetato de amônio, pH 8 e acetonitrila como tampões a uma vazão de 5 mL/min. As frações recolhidas são liofilizadas para fornecer o composto purificado tipicamente como um sólido branco. Exemplo 1. Estudo de farmacocinética e farmacodinâmica (PK/PD) em macaco cinomolgo (primata não humano, NHP) in vivo, 21 dias de tratamento, injeção
[00228] Foi observado um knockdown para 1 oligonucleotídeo HTRA1 LNA selecionado, 15.3, visando o "ponto de acesso" no pré-HTRA1 RNAm humano entre a posição 33042 - 33064 tanto no RNAm na retina quanto no nível de proteínas na retina e no vítreo (vide a figura 6). Animais
[00229] Todas as experiências foram realizadas em macacos cinomolgos (Macaca fascicularis).
Compostos e procedimentos de dosagem
[00230] A analgesia com buprenorfina foi administrada antes e dois dias após a injeção do composto em teste. Os animais foram anestesiados com uma injeção intramuscular de cetamina e xilazina. O item de teste e o controle negativo (PBS) foram administrados intravítrea em ambos os olhos dos animais anestesiados (50 pL por administração) no dia 1 do estudo após a aplicação local do anestésico tetracaína. Eutanásia
[00231] No final da fase em vida (dia 22), todos os macacos foram sacrificados por injeção intraperitoneal de overdose de pentobarbital.
[00232] Medição do teor de oligo e quantificação da expressão do RNA HTRA 1 por qPCR imediatamente após a eutanásia, os tecidos oculares foram rápida e cuidadosamente dissecados no gelo e armazenados a -80°C até a remessa. A amostra de retina foi lisada em tampão de tecido de isolamento de RNA de LC MagNa Pure 96 LC e homogeneizada por adição de 1 esfera de aço inoxidável por tubo de 2 mL de 2 x 1, 5 min. usando um homogeneizador de evolução Precellys, seguido de 30 min. de incubação à temperatura ambiente. As amostras foram centrifugadas,
13.000 rpm, 5 min. Metade foi reservada para bioanálise e, para a outra metade, a extração de RNA foi continuada diretamente.
[00233] Para a bioanálise, as amostras foram diluídas 10 a 50 vezes para as medições do teor de oligo com um método ELISA de hibridação. Uma sonda de captura de LNA biotinilada e uma sonda de detecção de LNA conjugada com digoxigenina (ambas 35nM em 5xSSCT, cada uma complementar a uma extremidade do oligonucleotídeo LNA a ser detectado) foram misturadas com os homogenatos diluídos ou padrões relevantes, incubados por 30 minutos em temperatura ambiente e depois adicionados às placas ELISA revestidas com estreptavidina (Número do catálogo 436014).
[00234] As placas foram incubadas por 1 hora em temperatura ambiente, lavadas em 2xSSCT (cloreto de sódio 300mM, citrato de sódio 30mM e Tween-20 a 0,05% v/v, pH 7,0). Os duplexes de LNA capturados foram detectados usando anticorpos anti-DIG conjugados com fosfatase alcalina (Roche Applied Science, número cat. 11093274910) e um sistema de substrato de fosfatase alcalina (substrato Blue Phos, código de produto KPL 50-88-00). A quantidade de complexos oligo foi medida como absorvância a 615 nm em um leitor Biotek.
[00235] Para extração de RNA, o kit de grande volume de RNA celular (05467535001, Roche) foi utilizado no sistema MagNA Pure 96 com o programa: Tissue FF standard LV3.1 de acordo com as instruções do fabricante, incluindo o tratamento com DNAse. O controle da qualidade do RNA e a concentração foram medidos com um leitor Eon (Biotek). A concentração de RNA foi normalizada entre as amostras e a subsequente síntese de DNAc e qPCR foi realizada em uma reação de uma etapa usando qScript XLT RT-qPCR ToughMix Low ROX, 95134-100 (Quanta Biosciences). Os seguintes ensaios de iniciador TaqMan foram usados em reações simples: HTRA1, Mf01016150_, Mf01016152_m1 e Rh02799527_m1 e genes de limpeza, ARFGAP2, Mf01058488_g1 e Rh01058485_m1 e ARL1, Mf02795431_ da Life Technologies. As análises de qPCR foram executadas em uma máquina ViiA7 (Life Technologies). Olhos/grupo: n = 3 olhos. Cada olho foi tratado como uma amostra individual. O nível de expressão relativo de RNAm de HTRA1 é mostrado como % de controle (PBS).
Histologia
[00236] Os globos oculares foram removidos e fixados em formalina tamponada neutra a 10% por 24 horas, aparados e embebidos em parafina.
[00237] Para a análise ISH, seções de tecido retina fixado em formalina e embebido em parafina com espessura de quatro µm foram processadas usando o Módulo de Coloração Ventana Dicovery ULTRA totalmente automatizado (Procedimento: mRNA Discovery Ultra Red 4.0 – v0.00.0152) usando o RNAscope 2.5 VS Probe- Mmu- HTRA1, REF 486979, Advanced Cell Diagnostics, Inc. O cromogênio usado é a contracorante Fastred, Hematoxilina II. Quantificação da Proteína HTRA1 usando uma Abordagem por Espectrometria de Massa por Imunoprecipitação em placas (IP-MS) Preparação de amostras, Retina
[00238] As retinas foram homogeneizadas em 4 volumes (p/v) de tampão RIPA (Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, ácido desoxicólico a 0,25%, N P-40 a 1% N P-40, EDTA 1 mM, Millipore) com inibidores de protease (Complete EDTA-free, Roche), usando um Precellys 24 (5500, 15 s, 2 ciclos). Os homogenatos foram centrifugados (13.000 rpm, 3 min.) e o conteúdo de proteínas dos sobrenadantes foi determinado (ensaio da proteína Pierce BCA) Preparação de Amostras, Vítreo
[00239] Os humores vítreos (300 µL) foram diluídos com 5x tampão RIPA (concentração final: Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, ácido desoxicólico 0,25%, ácido desoxicólico a 1% N P-40, EDTA 1 mM) com inibidores de protease (Complete EDTA-free, Roche) e homogeneizado usando um Precellys 24 (5500, 15 s, 2 ciclos). Os homogenatos foram centrifugados (13.000 rpm, 3 min.) e o conteúdo de proteína dos sobrenadantes foi determinado (ensaio da proteína Pierce BCA) Imunoprecipitação em Placa HTRA1 e digestão tríptica
[00240] Uma placa de 96 poços (Nunc MaxiSorp) foi revestida com anticorpo monoclonal de camundongo anti-HTRA1 (R&D MAB2916, 500 ng/poço em 50 µL de PBS) e incubada durante a noite a 4°C. A placa foi lavada duas vezes com PBS (200 µL) e bloqueada com BSA a 3% (p/v) em PBS por 30 min. a 20°C, seguida por duas lavagens com PBS. As amostras (75 µg de retina, 100 µg de vítreo em 50 µL de PBS) foram randomizadas e adicionadas à placa, seguidas de incubação durante a noite a 4°C em um agitador (150 rpm). A placa foi então lavada duas vezes com PBS e uma vez com água. DTT 10 mM em TEAB 50 mM (30 µL) foram então adicionados a cada poço, seguido de incubação por 1 h a 20°C para reduzir os sulfidrilos de cisteína. Iodoacetamida 150 mM em TEAB 50 mM (5 µL) foram então adicionados a cada poço, seguido de incubação por 30 min. a 20°C no escuro, a fim de bloquear a cisteína sulfidrila. Solução de digestão de 10 µL foi adicionada a cada poço (concentrações finais: 1,24 ng/µL de tripsina, peptídeos BSA de 20 fmol/µL, peptídeos HTRA1 marcados com isótopos 26 fmol/µL, peptídeos HTRA1 isotópicos, peptídeos 1 fmol/µL RT, Biognosys), seguido de incubação durante a noite a 20°C. Quantificação do Peptídeo HTRA1 por Espectrometria de Massa Direcionada (Monitoramento de Reação Selecionado, SRM)
[00241] A análise por espectrometria de massa foi realizada em um Ultimate RSLCnano LC acoplado a um espectrômetro de massa com triplo quadrupolo TSQ Quantiva (Thermo Scientific). Amostras (20 µL) foram injetadas diretamente da placa de 96 poços usada para IP e carregadas a 5 µL/min. por 6 min. em uma coluna de vedação Acclaim Pepmap 100 (100 µm x 2 cm, C18, 5 µm, 100 Å, Thermo Scientific) no tampão de carregamento (ácido fórmico a 0,5% v/v, ACN a 2% v/v). Os peptídeos foram então decompostos em uma coluna analítica PepMap Easy-SPRAY (75 µm x 15 cm, 3 µm, 100Å, Thermo Scientific) com emissor de electropulverização integrado aquecido a 40°C usando o seguinte gradiente a uma vazão de 250 nL/min. : 6 min., 98% de tampão A (2% de ACN, 0,1% de ácido fórmico), 2% de tampão B (ACN + 0,1% de ácido fórmico); 36 min., 30% de tampão B; 41 min., 60% de tampão B; 43 min., 80% de tampão B; 49 min., 80% de tampão B; 50 min., 2% de tampão B. O TSQ Quantiva foi operado no modo SRM com os seguintes parâmetros: tempo de ciclo, 1,5 s; tensão de pulverização,
1.800 V; pressão do gás de colisão, 2 mTorr; Resolução Q1 e Q3, 0,7 FWHM; temperatura do tubo de transferência de íons 300°C. As transições SRM foram adquiridas para o peptídeo HTRA1 "LHRPPVIVLQR" e uma versão sintética marcada com isótopo (L- [U-13C, U-15N] R), a qual foi utilizada como padrão interno. A análise dos dados foi realizada no Skyline versão 3.6.
Exemplo 2: Estudo de farmacocinética e farmacodinâmica in vivo de macaco cinomolgo, 21 dias de tratamento, injeção intravítrea (IVT), dose única
[00242] Foi observado um knockdown para 3 oligonucleotídeos HTRA1 LNA direcionados ao "ponto de acesso" no pré-HTRA1 RNAm humano entre a posição 53113 - 53384 tanto no RNAm na retina quanto no nível de proteínas na retina e no vítreo. Animais
[00243] Todas as experiências foram realizadas em macacos cinomolgos (Macaca fascicularis). Quatro animais foram incluídos em cada grupo do estudo, 20 no total. Compostos e procedimentos de dosagem
[00244] A analgesia com buprenorfina foi administrada antes e dois dias após a injeção do composto em teste. Os animais foram anestesiados com uma injeção intramuscular de cetamina e xilazina. O item de teste e o controle negativo (PBS) foram administrados intravítrea em ambos os olhos dos animais anestesiados (50 pL por administração) no dia 1 do estudo após a aplicação local do anestésico tetracaína. Eutanásia
[00245] No final da fase em vida (dia 22), todos os macacos foram sacrificados por injeção intraperitoneal de overdose de pentobarbital.
[00246] Medição do conteúdo de oligo e quantificação da expressão do RNA HTRAl por qPCR
[00247] Imediatamente após a eutanásia, os tecidos oculares foram rápida e cuidadosamente dissecados no gelo e armazenados a -80°C até a remessa. A amostra de retina foi lisada em 700 µL de tampão de isolamento de RNA de MagNa Pure 96 LC e homogeneizada por adição de 1 esfera de aço inoxidável por tubo de 2 mL 2 x 1, 5 min. usando um homogeneizador de evolução Precellys, seguido de 30 min. de incubação à temperatura ambiente. As amostras foram centrifugadas, 13.000 rpm, 5 min. Metade foi reservada para bioanálise e, para a outra metade, a extração de RNA foi continuada diretamente.
[00248] Para a bioanálise, as amostras foram diluídas 10 a 50 vezes para as medições do teor de oligo com um método ELISA de hibridação. Uma sonda de captura de LNA biotinilada e uma sonda de detecção de LNA conjugada com digoxigenina (ambas 35nM em 5xSSCT, cada uma complementar a uma extremidade do oligonucleotídeo LNA a ser detectado) foram misturadas com os homogenatos diluídos ou padrões relevantes, incubados por 30 minutos em temperatura ambiente e depois adicionados a placas ELISA revestidas com estreptavidina (Número cat. 436014).
[00249] As placas foram incubadas por 1 hora à temperatura ambiente, lavadas em 2xSSCT (cloreto de sódio 300mM, citrato de sódio 30 mM e Tween-20 a 0,05% v/v, pH 7,0). Os duplex de LNA capturados foram detectados usando anticorpos anti-DIG conjugados com fosfatase alcalina (Roche Applied Science, número cat. 11093274910) e um sistema de substrato de fosfatase alcalina (substrato Blue Phos, código de produto KPL 50-88-00). A quantidade de complexos oligo foi medida como absorvância a 615 nm em um leitor Biotek.
[00250] Para extração de RNA, o kit de grande volume de RNA celular (05467535001, Roche) foi utilizado no sistema MagNA Pure 96 com o programa: Tissue FF standard LV3.1 de acordo com as instruções do fabricante, incluindo o tratamento com DNAse. O controle da qualidade do RNA e a concentração foram medidos com um leitor Eon (Biotek). A concentração de RNA foi normalizada entre as amostras e a subsequente síntese de DNAc e qPCR foram realizadas em uma reação de uma etapa usando qScript XLT RT-qPCR ToughMix Low ROX, 95134-100 (Quanta Biosciences). Os seguintes ensaios de iniciador TaqMan foram usados em reações simples: HTRA1, Mf01016150_, Mf01016152_m1 e Rh02799527_m1 e genes de limpeza, ARFGAP2, Mf01058488_g1 e Rh01058485_m1 e ARL1, Mf02795431_ da Life Technologies. As análises de qPCR foram executadas em uma máquina ViiA7 (Life Technologies). Olhos/grupo: n = 3 olhos. Cada olho foi tratado como uma amostra individual. O nível de expressão relativo de RNAm de HTRAl é mostrado como % de controle (PBS). Histologia
[00251] Os globos oculares foram removidos e fixados em formalina tamponada neutra a 10% por 24 horas, aparados e embebidos em parafina.
[00252] Para a análise ISH, seções de tecido de retina de cyaomolgus fixado em formalina e embebido em parafina com 4 µm de espessura foram processadas usando o Módulo de coloração Ventana Dicovery ULTRA totalmente automatizado (Procedimento: RNAm Discovery Ultra Red 4.0 - vO.00.0152) usando o RNAscope 2.5 VS Probe-Mmu -HTRA1, REF 486979, Advanced Cell Diagnostics, Inc. O cromogênio usado é o contracorante Fastred, Hematoxilina II.
Quantificação da proteína HTRA1 usando uma abordagem por espectrometria de massa por imunoprecipitação em placas (IP-MS) Preparação da amostra, Retina
[00253] Retinas foram homogeneizadas em 4 volumes (p/v) de tampão RIPA (Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, ácido desoxicólico a 0,25%, NP-40 a 1%, EDTA 1 mM, Millipore) com inibidores de protease (sem EDTA completo, Roche) usando um Precellys 24 (5500, 15 s, 2 ciclos). Os homogenatos foram centrifugados (13.000 rpm, 3 min.) e o conteúdo de proteína dos sobrenadantes foi determinado (ensaio da proteína Pierce BCA) Preparação de Amostras, Vítreo
[00254] Os humores vítreos (300 µL) foram diluídos com 5x tampão RIPA (concentração final: Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, ácido desoxicólico 0,25%, ácido desoxicólico a 1% NP-40, EDTA 1 mM) com inibidores de protease (Completo Sem EDTA, Roche) e homogeneizado usando um Precellys 24 (5500, 15 s, 2 ciclos). Os homogenatos foram centrifugados (13.000 rpm, 3 min.) e o conteúdo de proteína dos sobrenadantes foi determinado (ensaio da proteína Pierce BCA) Imunoprecipitação de HTRA1 com base em placa e digestão tríptica
[00255] Uma placa de 96 poços (Nunc MaxiSorp) foi revestida com anticorpo monoclonal de camundongo anti-HTRA1 (R&D MAB2916, 500 ng/poço em 50 µL PBS) e incubada durante a noite a 4°C. A placa foi lavada duas vezes com PBS (200 mL) e bloqueada com BSA a 3% (p/v) em PBS por 30 min. a 20°C, seguida por duas lavagens com PBS. As amostras (75 µg de retina, 100 µg de vítreo em 50 µL de PBS) foram randomizadas e adicionadas à placa, seguido de incubação durante a noite a 4°C em um agitador (150 rpm). A placa foi então lavada duas vezes com PBS e uma vez com água. DTT 10 mM em TEAB 50 mM (30 µL) foram então adicionados a cada poço, seguido de incubação por 1 h a 20°C para reduzir as sulfidrilas de cisteína. Iodoacetamida 150 mM em TEAB 50 mM (5 µL) foram então adicionados a cada poço, seguido de incubação por 30 min. a 20°C no escuro, a fim de bloquear a cisteína sulfidrila. Solução de digestão de 10 µL foi adicionada a cada poço (concentrações finais: 1,24 ng/µL de tripsina, peptídeos BSA de 20 fmol/µL, peptídeos HTRA1 marcados com isótopos 26 fmol/µL, peptídeos iRT 1 fmol/µL, Biognosys), seguido de incubação durante a noite a 20°C. Quantificação do peptídeo HTRA1 por espectrometria de massa direcionada (monitoramento de reação selecionado, SRM)
[00256] A análise por espectrometria de massa foi realizada em um Ultimate RSLCnano LC acoplado a um espectrômetro de massa com triplo quadrupolo TSQ Quantiva (Thermo Scientific). Amostras (20 µL) foram injetadas diretamente da placa de 96 poços usada para IP e carregadas a 5 µL/min. por 6 min. em uma coluna de vedação Acclaim Pepmap 100 (100 µm x 2 cm, C18, 5 µm, 100 Å, Thermo Scientific) no tampão de carregamento (ácido fórmico a 0,5% v/v, ACN a 2% v/v). Os peptídeos foram então decompostos em uma coluna analítica PepMap Easy-SPRAY (75 µm x 15 cm, 3 µm, 100 Å, Thermo Scientific) com emissor de electropulverização aquecido a 40°C usando o seguinte gradiente a uma vazão de 250 nL/min.: 6 min., 98% tampão A (2% de ACN, 0,1% de ácido fórmico), 2% de tampão B (ACN + 0,1% de ácido fórmico); 36 min., 30% de tampão B; 41 min., 60% de tampão B; 43 min., 80% de tampão B; 49 min., 80% de tampão B; 50 min., 2% de tampão B. O TSQ Quantiva foi operado no modo SRM com os seguintes parâmetros: tempo de ciclo, 1,5 s; tensão de pulverização, 1800 V; pressão do gás de colisão, 2 mTorr; Resolução Q1 e Q3, 0,7 FWHM; temperatura do tubo de transferência de íons 300°C. As transições SRM foram adquiridas para o peptídeo HTRA1 "LHRPPVIVLQR" e uma versão sintética marcada com isótopo (L-[U-13C, U-15N]R), a qual foi utilizada como padrão interno. A análise dos dados foi realizada usando Skyline versão 3.6. Western blot
[00257] A amostra de retina dissecada em tubos de 0,5 Precellyses (CK14_0,5 mL, Bertin Technologies) foi lisada e homogeneizada em tampão de lise RIPA (20-188, Milipore) com inibidores de protease (inibidor de Proteases Mini completo sem EDTA, 11 836 170 001, Roche). Amostras vítreas foram adicionadas a tubos de 0,5 Precellyses (CK14_0,5 mL, Bertin Technologies) foram lisados e homogeneizados em 1/4x tampão de lise RIPA (20-188, Milipore) com inibidores de protease (Inibidor de Pproteasesmini completo sem EDTA, 11 836 170 001, Roche). As amostras (retina 20 µg de proteína, vítreo 40 µg de proteína) foram analisadas em gel de gradiente de 4-15% (# 567-8084 Bio-Rad) sob condições redutoras e transferidas em nitrocelulose (# 170-4159 Bio-Rad) usando um Trans-Blot Turbo Device da Bio-Rad.
[00258] Anticorpos primários: HTRA1 anti-humano de coelho (SF1) foi um presente gentil de Sascha Fauser (Universidade de Colônia), Gapdh anti-humano de camundongo (# 98795 Sigma-Aldrich). Anticorpo secundário: anti-coleho de cabra 800CW e anti-camundongo de cabra 680RD eram de Li- Cor, blot foi imageado e analisado em um Odyssee CLX da Li-
Cor. Exemplo 3 – Avaliação do Macaco cinomolgo in vivo: determinação da proteína HTRA1 no humor aquoso e comparação com o HTRA1 RNAm e inibição da proteína na retina
[00259] Metodologia Experimental: Vide o Exemplo
2. Foram colhidas amostras de humor aquoso e as amostras foram preparadas como de acordo com o exemplo 2 amostras de humor vítreo. As amostras de humor aquoso (AH) do macaco cinomolgo foram analisadas com um ensaio com base em tamanho em uma metodologia analítica: Sistema de Eletroforese Capilar (Peggy Sue™, Proteinsimple) As amostras foram descongeladas em gelo e usadas não diluídas. Para quantificação, mutante recombinante HTRA1-S328A (Origene # TP700208). A preparação foi como descrito pelo fornecedor. O anticorpo HTRA anti-humano SF1 de coelho primário foi fornecido pelo Prof. Dr. Sascha Fauser e usado diluído 1:300. Todos os outros reagentes eram da Proteinsimple.
[00260] As amostras foram processadas em técnica de triplicata, curva de calibração em duplicado usando um módulo de separação de 12 - 230 kDa. A área abaixo do pico foi calculada e analisada usando Xlfit (software IDBS). Resultados Grupo RNAm_retina Protein_retina Protein_AH PBS 82 101 95 PBS 107 99 118 #15,3 56 73 51 #15,3 52 53 68 #17 23 41 47 #17 26 44 44 #18 32 29 44
#18 23 28 64 #19 34 39 44 #19 34 61 42
[00261] A Figura 9A mostra uma visualização dos níveis de proteína HTRA1 no humor aquoso de macacos administrados com os compostos # 15,3 e # 17, com amostras colhidas nos dias 3, 8, 15 e 22 após a injeção. A Figura 9B fornece a curva de calibração usada no cálculo dos níveis de proteína HTRA1. A Figura 9C fornece os níveis calculados de HTRA1 a partir do humor aquoso de cada animal, plotados contra o tempo após a injeção.
[00262] A Figura 10 ilustra uma correlação direta entre o nível de proteína HTRA1 no humor aquoso e o nível de HTRA1 RNAm na retina. Os níveis de proteína HTRA1 de humor aquoso podem, portanto, ser utilizados como um biomarcador para os níveis de RNAm da retina HTRA1 ou inibição do HTRA1 RNAm da retina.
[00263] A Figura 11 ilustra que também há uma correlação entre os níveis de proteína HTRA1 na retina e os níveis de proteína HTRA1 no humor aquoso, embora a correlação não tenha sido, neste experimento, tão forte quanto a correlação entre a inibição do HTRA1 RNAm na retina e os níveis de proteína HTRA1 no humor aquoso, indicando que os níveis de proteína HTRA1 do humor aquoso são particularmente adequados como biomarcador para antagonistas do HTRA1 RNAm. Exemplo 4: Estudo de farmacocinética e farmacodinâmica in vivo de macaco cinomolgo, 36 dias de tratamento, injeção intravítrea (IVT), dose única
[00264] A dinâmica da proteína HTRA1 no humor aquoso dos animais expostos ao HTRA1 LNA foi investigada por 36 dias e o conteúdo residual da proteína HTRA1 foi examinado post mortem em diferentes compartimentos do tecido ocular (vítreo, retina neural, epitélio pigmentar da retina (EPR) e coróide). A supressão do HTRA1 RNAm foi avaliada em amostras terminais. Animais
[00265] Todas as experiências foram realizadas em macacos cinomolgos (Macaca fascicularis), nas instalações da Charles Rivers Laboratories Montreal ULC em Sennville, Canadá. Compostos e procedimentos de dosagem
[00266] Um antibiótico tópico (tobramicina) foi aplicado a ambos os olhos duas vezes no dia anterior e duas vezes no dia após cada injeção. Antes da dosagem, os animais em jejum receberam uma injeção intramuscular de um coquetel sedativo de cetamina (5 mg/kg) e dexmetedomidina (0,01 mg/kg), seguido de mistura de isoflurano/oxigênio através de uma máscara. Um anestésico tópico (proparacaína a 0,5%) foi instilado em cada olho antes da injeção intravítrea bilateral do item de teste de 100 µg em 50 µL ou veículo (solução salina tamponada com fosfato). Gotas midriáticas (tropicamida a 1%) foram aplicadas a cada olho, conforme necessário. Após a conclusão do procedimento de dosagem, os animais receberam uma injeção intramuscular de 0,1 mg/kg de atipamezol, um agente de reversão para dexmetedomidina. No dia 0 do procedimento, 4 animais foram injetados bilateralmente com 100 µg HTRA1 LNA # 18 em 50 µL e 4 animais com o mesmo volume do veículo. Amostra de humor aquoso
[00267] Os animais foram divididos em dois grupos compreendendo cada um dos dois controles e dois macacos tratados. Amostras de humor aquoso foram coletadas na linha de base (todos os animais); dia 3 e dia 18, (grupo); dia 11, dia 25, (grupo 2) dia 32 (todos os animais) e após a eutanásia dia 36. Os animais foram anestesiados de acordo com o mesmo procedimento utilizado para a aplicação do composto e o humor aquoso de 30-40 µL foi amostrado após midríase e armazenados congelados a -80°C. Eutanásia
[00268] No dia 36, os animais em jejum foram anestesiados com cetamina e isoflurano, a veia aorta e veia cava foram pinçadas e perfusão transcardial da parte superior do corpo foi realizada com solução salina tamponada com fosfato. Os globos oculares lavados foram removidos e limpos do tecido aderente e 200 µL do humor aquoso foi amostrado. O olho esquerdo foi posteriormente processado para preparação de RNA e o olho direito para análise de proteínas. A proteína HTRA1 no humor aquoso foi medida no olho esquerdo e direito na necropsia. Processamento de amostras para análise de proteínas HTRA1
[00269] Para coleta terminal, até 0,2 ml de humor aquoso foram colhidos com uma seringa de insulina ultrafina com uma agulha 30G, 1/2". O globo ocular foi limpo do músculo aderente e aberto frontalmente por uma incisão circunferencial 3 mm posterior ao limbo da córnea. O vítreo foi removido, homogeneizado forçando o tecido (3 passagens) através de uma seringa de 3 cm³ sem agulha, centrifugado (3 min. 16.000xg a 4°C) e armazenado congelado. A retina neural foi cuidadosamente retirada do EPR subjacente e congelada rapidamente em gelo seco. O copo aberto foi então mantido frontalmente para cima, preenchido com 1 mL de tampão RIPA (Millipore, Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, ácido desoxicólico a 0,25%, ácido desoxicólico a 0,25%, N P-40 a 1%, EDTA 1 mM) contendo inibidores de protease (coquetel inibidor de protease livre de complete™ EDTA, mini, Roche, 1 comprimido/10 mL), agitou-se em uma plataforma rotativa (200rpm) por 5 minutos. O lisado de EPR resultante foi eliminado por centrifugação (3 min. 16.000xg a 4°C) e armazenado congelado. O copo ocular posterior restante foi lavado com soro fisiológico tamponado com fosfato, quatro incisões foram feitas para deixar o tecido plano e a membrana de Bruch e a coróide aderente foi removido. O coróide foi homogeneizado em 4 mL por grama de tampão RIPA de tecido contendo inibidor de protease usando um Geno Grinder (1500 rpm por 2 min.) 3 vezes com o resfriamento em gelo. Os detritos foram removidos por centrifugação e o extrato armazenado (3 min. 16.000xg a 4°C).
[00270] Os humores vítreos foram diluídos com 5x tampão RIPA (concentração final: TrisHCl 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, ácido desoxicólico a 0,25%, NP-40 a 1%, EDTA 1 mM) com inibidores de protease (sem Complete EDTA, Roche) e homogeneizado usando um Precellys 24 (5500 rpm, 15 s, 2 ciclos). Os homogenatos foram centrifugados (16.000xg, 3 min.). O conteúdo proteico da retina neural e do extrato coróide foram medidos usando o método do ácido bicinconínico e reagentes de Pierce (Rockford EUA) usando albumina sérica como padrão. Processamento de amostras para preparação de RNA
[00271] Para a preparação do RNA, as etapas iniciais de dissecção foram semelhantes ao procedimento de proteína. A retina descascada foi transferida para um vaso de homogeneização, 10 L/mg de tampão de homogeneização de tecido foram adicionados (kit de isolamento de RNA Maxwell, Promega). O material foi processado em um moedor Geno por três ciclos de 2 minutos a 1.500rpm. O lisado resultante foi armazenado a -80°C até processamento adicional.
[00272] Após a remoção da retina neural, o copo aberto foi preenchido com reagente RNA protect Cell (Qiagen), agitado em uma plataforma rotativa (400 rpm) a 4°C. A suspensão de células RPE resultante foi colhida após 10 minutos, centrifugada 700 g por 5 minutos e lisada em 200 µL de tampão de homogeneização Maxwell. O lisado foi armazenado a -80°C até processamento adicional. Adicionou- se RNA fresco ao copo ocular, que foi agitado por mais 10 minutos para remover as células RPE restantes e descartado. Foram feitas quatro incisões, permitindo colocar o tecido na superfície e a membrana de Bruch e a coróide aderente foi retirada e armazenada congelada até o processamento posterior. Para homogeneização, a coróide congelada foi adicionada sem descongelamento ao tampão de homogeneização Promega (10 µL/mg de tecido) e processada em Tissue Lyser II (Retsch) por 3 ciclos de 2 min. a 20Hz.
[00273] O RNA foi purificado a partir do lisado usando um robô de isolamento de RNA Maxwell e reagentes correspondentes (Promega) de acordo com as instruções do fornecedor.
[00274] A qualidade do RNA foi avaliada e a quantidade medida por eletroforese capilar em um dispositivo Experion (BioRad). Quantificação de HTRA1 RNAm usando sequenciamento de RNA
[00275] Foram empregados 400 ng de RNA total para preparar bibliotecas de sequenciamento de RNAm usando o kit de preparação da biblioteca de TruSeq™ Stranded RNAm Stranded (Illumina 20020594). As bibliotecas foram sequenciadas em um sequenciador HiSeq 4000 (2 x 50 pb). A chamada de base foi realizada com o conversor de arquivos BCL para FASTQ bcl2fastq v2.17.1.14 da Illumina (htps: //support.illumina.com/downloads.html). Para estimar os níveis de expressão gênica, as leituras RNASeq emparelhadas foram mapeadas para o genoma de Macaca fascicularis (macFas5 de WashU) com o alinhador STAR versão 2.5. 2a usando parâmetros de mapeamento padrão (Dobin e outros, 2013). O número de leituras mapeadas para todas as variantes de transcrição RefSeq de um gene (contagens) foi combinado em um único valor usando o software SAMTOOLS (Li e outros, 2009) e normalizado como rpkms (número de leituras mapeadas por transcrição de kilobase por milhão de leituras sequenciais, Mortazavi e outros, 2008). Quantificação da proteína HTRA1 usando o método baseado em eletroforese capilar
[00276] As proteínas de diferentes compartimentos oculares foram analisadas por eletroforese capilar usando uma matriz de separação de 12-230 kDa em um dispositivo Peggy Sue (Protein Simple, San Jose, Califórnia, USA), conforme descrito pelo fornecedor. As amostras recombinantes humanas de 6His marcadas com -HTRA1 S328A (RD Biotech, França) (62,5-0,12 ng/mL) foram analisadas em paralelo para quantificação. A proteína HTRA1 foi detectada usando um antissoro SF1 anti-humano HTRA1 de coelho (diluição 1:300), fornecido pelo Prof. Dr. Sascha Fauser. O lisado de RPE de Cynomolgous, contendo HTRA1s de 5,5 ng/mL, foi utilizado para avaliar a reprodutibilidade do ensaio.
[00277] Como as experiências preliminares (não mostradas) excluíram um efeito da matriz, as amostras foram analisadas na concentração mais alta possível, permitindo a quantificação ótima da supressão de HTRA1. Amostras de humor aquoso foram utilizadas não diluídas; enquanto as amostras vítreas homogeneizadas limpas foram diluídas em 80% em tampão RIPA contendo inibidores de protease. As concentrações de retina neural, EPR e lisados coróides foram ajustadas para 0,5 mg de proteína total/mL. Ao longo do estudo, a variação intra-ensaio foi de 9,1% e a variação inter-ensaio de 21%. Para melhorar a comparabilidade, todas as amostras de cada tecido foram analisadas em uma única execução. Com exceção das amostras de humor aquoso coletadas em diferentes momentos, as quais foram analisadas em uma corrida distinta das amostras terminais. Resultados 1: Supressão da proteína HTRA1 em diferentes compartimentos teciduais, post mortem, 32 dias após a aplicação do LNA:
[00278] As maiores concentrações de HTRA1 foram encontradas nos lisados coróides (grupo PBS: 28 ng/mg de proteína total sd = 2,2), e o tratamento com LNA causou apenas uma leve supressão nessa região anatômica (diminuição de 16% no grupo LNA: 24 ng/mg total proteína sd = 3,5). As concentrações mais baixas de HTRA1 medidas foram nos lisados de EPR (grupo PBS: 5,2 ng/mg de proteína total sd = 0,4), com impacto significativo da intervenção
(diminuição de 55%, grupo LNA: 2,4 ng/mg de proteína total sd = 0,2).
[00279] O maior impacto da intervenção foi observado na retina neural; humor vítreo e aquoso (HA) com níveis médios de HTRA1 76; 84; e 74% menor que nos animais tratados com veículo, respectivamente. A supressão média do grupo nos diferentes compartimentos é mostrada na figura 12A.
[00280] Apesar da dispersão dos valores de HTRA1 determinados no grupo controle, as concentrações de HTRAl medidas no vítreo, retina e EPR estavam, em geral, de acordo com os níveis medidos no humor aquoso; sugerindo potencial utilidade como biomarcador de engajamento alvo. Correlação entre o nível de HTRA1 no tecido e os níveis de humor aquoso ilustrados na figura 12B. Resultados 2: Dinâmica da concentração da proteína HTRA1 no Humor Aquoso
[00281] Uma amostra da linha de base não pôde ser medida devido à disponibilidade insuficiente da amostra e o animal (tratamento do veículo, Grupo 1) foi excluído da análise atual.
[00282] A concentração inicial da proteína HTRA1 no humor aquoso foi heterogênea (desvio padrão de 4,32 ng/mL (dp) 0,98 ng/mL) com valores mais altos no grupo de tratamento. (Tratamento ativo 3,65 ng/Ll sd 0,18 ng/mL, veículo 5,23ng/mL sd 0,82 ng/mL). Houve uma tendência para um aumento na concentração de HTRA1 em ambos os grupos no dia 3 após a IVT (tratamento ativo: n = 2, + 51% e + 54%; Veículo n = 1, + 42%). Portanto, o efeito da intervenção foi analisado após a normalização para os valores basais individuais e para o grupo de veículos com o mesmo tempo. O tratamento não teve efeito no dia 3, mas a concentração de humor aquoso de HTRA1 foi reduzida a partir do dia 11 (52%), um efeito que atingiu 66% de supressão no dia 36. Os dados são mostrados na figura 13. Resultados 3: Supressão do HTRA1 RNAm em diferentes compartimentos teciduais, post mortem, 32 dias após a aplicação do LNA
[00283] Os níveis de HTRA1 RNAm foram medidos por sequenciação de RNA na retina, EPR e coróide dissecado do olho esquerdo de oito animais (4 animais no grupo veículo e 4 animais no grupo tratado com LNA). Uma média de
129.876.690 leituras foi gerada por amostra, com uma média de 122.038.760 leituras mapeadas por amostra. Uma amostra de retina foi excluída dos grupos veículo e LNA e uma amostra de EPR foi excluída do grupo veículo devido à falha na aprovação das medidas de controle de qualidade. Nas amostras restantes, os níveis de HTRA1 RNAm foram reduzidos de forma significativa e robusta na retina após o tratamento com LNA (diminuição de 80% no grupo LNA versus o grupo veículo). Uma diminuição ligeiramente menor (60%), mas significativa, foi observada no EPR após o tratamento com LNA. Nenhuma redução significativa foi observada na coróide (vide figura 14). Conclusão
[00284] A injeção intravítrea única de 100 µg de HTRA1 LNA em macacos Cynomolgous levou a 80% de expressão de HTRA1 RNAm reduzida na retina neural e 60% de redução no epitélio pigmentar da retina 36 dias após a exposição. Correspondentemente, a redução da proteína HTRA1 foi de 76%
e 55% na retina neural e no EPR, indicando uma atividade sustentada do medicamento e ampla distribuição e eficácia do medicamento nos diferentes compartimentos oculares explorados. Como esperado, devido à barreira da retina no sangue, a coróide foi atingida minimamente pelo oligonucleotídeo. Consequentemente, não foi observada redução significativa do HTRA1 RNAm neste tecido. É importante ressaltar que esses dados mostram um impacto significativo e prolongado na camada RPE, desempenhando um papel fundamental na patogênese da AMD. A forte correlação entre a supressão de HTRA1 no RNAm e os níveis de proteína indica que a síntese local de HTRA1 é a principal fonte do pool de proteínas oculares e a pró-fração de HTRA1 derivado do sangue é insignificante. Os níveis de proteína HTRA1 nos humores vítreo e aquoso essencialmente livres de células foram reduzidos em uma extensão semelhante à retina neural (r84% e 74%, respectivamente), indicando que as concentrações de proteínas nesses biofluidos podem ser usadas para avaliar a eficácia da intervenção na parte de trás do olho. A diminuição do humor aquoso não pôde ser detectada antes do dia1 1, ilustrando um início de ação tardio e/ou baixa rotatividade de proteínas HTRA1 neste compartimento. Referências
[00285] Dobin e outros, 2013, Bioinformatics 29: “STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner" Li e outros, 2009, Bioinformatics 25: "The Sequence Alignment/Map format and SAMtools" Mortazavi e outros, 2008. Nature Methods 5: "Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA- Seq".

Claims (23)

REIVINDICAÇÕES
1. Método para determinar a adequação do tratamento de um indivíduo para administração com um antagonista HTRA1 RNAm, o referido método compreendendo as etapas de: i) determinar o nível de HTRA1 em uma amostra de humor aquoso ou vítreo obtido do indivíduo ii) comparar o nível de HTRA1 obtido na etapa i) com uma ou mais amostras ou valores de referência; determinar se é provável que o indivíduo seja ou possa ser adequado para o tratamento com o antagonista HTRA1 RNAm, em que o indivíduo sofre ou corre o risco de desenvolver um transtorno ocular, como degeneração macular.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o nível de HTRA1 na amostra de humor aquoso ou humor vítreo é determinado pela quantificação do nível de proteína HTRA1 na amostra.
3. Método de acordo com a reivindicação 2, em que o nível de proteína HTRA1 é determinado usando um ensaio imunológico, como o uso de um anticorpo específico para HTRA1.
4. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o nível de proteína HTRA1 é determinado usando espectrometria de massa.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que pelo menos uma das amostras ou valores de referência é obtido de um indivíduo de controle que sofre de degeneração macular.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que pelo menos uma das amostras ou valores de referência é obtido de um indivíduo de controle que não sofre de degeneração macular.
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que pelo menos uma das amostras de referência é um valor previamente obtido do mesmo indivíduo cuja adequação do tratamento está sendo avaliada.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que os valores de referência são derivados de um conjunto de dados modelando a correlação entre a concentração de HTRA1 na retina e a concentração de HTRA1 no humor aquoso ou humor vítreo.
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que o antagonista HTRA1 RNAm é selecionado do grupo que consiste em um oligonucleotídeo antissentido direcionado ao HTRA1 RNAm ou pré-RNAm, um siRNA direcionado ao HTRA1 RNAm, uma ribozima direcionada ao HTRA1 RNAm ou pré-RNAm.
10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que o método se destina a determinar se o indivíduo tem uma expressão de HTRA1 aprimorada na retina.
11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que o indivíduo sofre ou corre o risco de desenvolver um transtorno ocular selecionado do grupo que consiste em doenças degenerativas maculares, como degeneração macular relacionada à idade (AMD), incluindo AMD úmida (exsudativa) (incluindo AMD úmida precoce, intermediária e avançada) e AMD seca (não exsudativa) (incluindo AMD seca precoce, intermediária e avançada (por exemplo, atrofia geográfica (GA)); retinopatia diabética (DR) e outras retinopatias relacionadas às isquemias; endoftalmite; uveíte; neovascularização coróide (CNV); retinopatia da prematuridade (ROP); vasculopatia coroidal polipoidal (PCV); edema macular diabético; miopia patológica; doença de von Hippel-Lindau; histoplasmose ocular; oclusão da veia retiniana central), neovascularização da córnea e neovascularização da retina.
12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que o indivíduo sofre ou corre o risco de desenvolver degeneração macular relacionada à idade (AMD), como a AMD selecionada do grupo que consiste em AMD úmida (exsudativa), AMD úmida intermediária e avançada), AMD seca (não exsudativa) (incluindo AMD seca precoce, intermediária e avançada (por exemplo, atrofia geográfica (GA)).
13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em que o método se destina a determinar o regime de dose adequado para a administração com o antagonista HTRA1 RNAm.
14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, em que o antagonista HTRA1 RNAm é um oligonucleotídeo que compreende uma região nucleotídica contígua de 10 a 30 nucleotídeos que são totalmente complementares a uma sequência de ácido nucleico alvo do HTRA1, como SEQ ID NO 1 ou SEQ ID NO 2.
15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, em que o antagonista HTRA1 RNAm é ou compreende um oligonucleotídeo que compreende uma sequência nucleotídica contígua de pelo menos 12 nucleotídeos de comprimento que são pelo menos 90 e complementares, como totalmente complementares à SEQ ID NO 7 ou SEQ ID NO 16.
16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, em que o antagonista HTRA1 RNAm é ou compreende um oligonucleotídeo antissentido, tal como um oligonucleotídeo gapmer LNA.
17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, em que o antagonista HTRA1 RNAm é selecionado a partir do grupo que consiste em: 5' TsAsTststsascscstsgsgstsTsGsTsT 3' (sEQ ID NO 13, #13.1) 5' AstsAsTststsascscstsgsgstsTsGsTsT 3' (SEQ ID NO 15, #15.3) 5' CsTsTsCststscstsastscstsasmcsgsCsAsT 3' (SEQ ID NO 17, #17), 5' TsAsCsTststsasastsasgscsTsCsAsA 3' (SEQ ID NO 18, #18); e 5' TsTsCstsastscstsasmcsgscsasTsTsG 3' (SEQ ID NO 19, #19), em que uma letra maiúscula representa uma unidade nucleosídeo beta-D óxi LNA, uma letra minúscula representa uma unidade nucleosídeo de DNA, o subscrito s representa m uma ligação internucleosídeo fosforotioato, c representa nucleotídeos de DNA 5 metil citosina e todas as citosinas LNA são 5-metil citosina; ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
18. Método para tratar um indivíduo que sofre ou corre o risco de desenvolver degeneração macular, o referido método compreende executar o método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17 e administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um antagonista HTRA1 RNAm.
19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, em que o antagonista HTRA1 RNAm é para administração via administração intra-vitral.
20. Uso de um anticorpo HTRA1 como diagnóstico complementar para uma terapêutica antagonista de RNA HTRA1.
21. Uso de um anticorpo HTRA1 como biomarcador para a eficácia de um terapêutico antagonista de RNA HTRA1, tal como um antagonista HTRA1 RNAm, tal como de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes.
22. Uso de um anticorpo HTRA1 na detecção de níveis de HTRA1 em uma amostra de humor aquoso ou humor vítreo obtido de um indivíduo em tratamento com um antagonista HTRA1 RNAm ou que esteja sendo avaliado quanto à adequação do tratamento com um antagonista HTRA1 RNAm, como de acordo com a qualquer uma das reivindicações precedentes.
23. Uso de um biomarcador para determinar a resposta provável de um indivíduo a um agente terapêutico compreendendo um antagonista HTRA1 RNAm, tal como de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o biomarcador compreende um nível elevado de HTRA1 em uma amostra biológica obtida a partir de humor aquoso ou humor vítreo do indivíduo, em comparação com o nível de HTRA1 obtido de uma amostra de referência de um indivíduo saudável.
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