JP7060525B2 - Ｈｔｒａ１の発現を調節するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド - Google Patents

Description

本発明は、ＨＴＲＡ１（高温要件Ａ１：High temperature requirement A1）に対して相補的であり、ＨＴＲＡ１の発現を調節するアンチセンスオリゴヌクレオチド（オリゴマー）に関する。ＨＴＲＡ１の発現を調節することは、様々な医的障害、例えば、加齢性黄斑変性などの黄斑変性、に有益である。

セリンプロテアーゼのヒト高温要件Ａ（ＨＴＲＡ）ファミリーは、遍在的に発現されるＰＤＺ－プロテアーゼである。このＰＤＺ－プロテアーゼは、プロテアーゼとシャペロンのデュアル機能を併用して、細胞外区画におけるタンパク質の恒常性維持に関与する。ＨＴＲＡハウスキーピングプロテアーゼは、細胞外マトリックスの編成、細胞増殖及び老化に関与している。ＨＴＲＡ活性の調節は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（Bakay et al. 2002, Neuromuscul. Disord. 12: 125-141）、変形性関節症などの関節炎（Grau et al. 2006, JBC 281: 6124-6129）、癌、家族性虚血性大脳小血管疾患及び加齢性黄斑変性症のほか、パーキンソン病及びアルツハイマー病をはじめとする重篤な疾患に関連している。ヒトＨＴＲＡ１には、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）結合ドメインが含まれている。ＩＧＦの利用性及び細胞成長の制御（Zumbrunn and Trueb, 1996, FEES Letters 398: 189-192）、及び腫瘍抑制特性の発呈が、提案されてきた。転移性メラノーマにおいてＨＴＲＡ１の発現は下方制御されるため、メラノーマの進行度が示される場合がある。転移性メラノーマ細胞株におけるＨＴＲＡ１が過剰発現したため、異種移植マウスモデルにおけるインビトロでの増殖及び浸潤が低減したと共に、腫瘍増殖も低減した（Baldi et al., 2002, Oncogene 21: 6684-6688）。また、卵巣癌においてもＨＴＲＡ１の発現が下方制御される。卵巣癌細胞株内では、ＨＴＲＡ１の過剰発現によって細胞死が誘発された一方、アンチセンスＨＴＲＡ１の発現によって足場非依存性増殖が促進された（Chien et al., 2004, Oncogene 23: 1636-1644）。

ＨＴＲＡ１は、ＩＧＦ経路に影響を及ぼすばかりでなく、成長因子のＴＧＦβファミリーを介したシグナル伝達の阻害も行う（Oka et al., 2004, Development 131: 1041-1053）。ＨＴＲＡ１は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）を開裂させる可能性があることから、ＨＴＲＡ１阻害剤は培養細胞内にアミロイドβ（Aβ）ペプチドを蓄積させる原因となる。それゆえ、ＨＴＲＡ１はアルツハイマー病にも関与している（Grau et al., 2005, Proc.Nat. Acad. Sci. USA. 102: 6021-6026）。

一方、ＨＴＲＡ１の上方制御が観察されており、これはデュシェンヌ型筋ジストロフィー（Bakay et al. 2002, Neuromuscul. Disord.12: 125-141）及び変形性関節症（Grau et al. 2006, JBC 281: 6124-6129）、並びにAMD（Fritsche, et al.Nat Gen 2013 45(4): 433-9）に関連していると思われる。

ＨＴＲＡ１プロモーター領域（ｒｓ１１２００６３８）における一塩基多型（ＳＮＰ）は、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）の発症リスクが１０倍増大することに関連している。そのうえ、ＨＴＲＡ１のＳＮＰは、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）の発症リスクの増大に関連するＡＲＭＳ２のＳＮＰ（ｒｓ１０４９０９２４）と連鎖不平衡にある。リスク対立遺伝子はＨＴＲＡ１のｍＲＮＡ及びタンパク質の発現が２～３倍増大することに関連しており、ＡＭＤ患者のドルーゼン内にはＨＴＲＡ１が存在している（Dewan et al., 2006, Science 314: 989-992; Yang et al., 2006, Science 314: 992-993）。様々な動物モデルによって確証されてきたように、マウスにおけるＨｔｒＡ１の過剰発現によってＡＭＤ様表現型が誘発される。ｈＨＴＲＡトランスジェニックマウス（Veierkottn, PlosOne 2011）によって解明されてきたように、ブルッフ膜の弾性薄層を劣化させた場合、脈絡膜血管異常が判別され（Jones, PNAS 2011）、且つポリープ状脈絡膜血管症（PCV）病変が増大する（Kumar, IOVS 2014）。加えて、これまでに報告されてきたように、ブルッフ膜に損傷のあるｈＨＴＲＡ１ Ｔｇマウスでは、タバコ煙に曝露させた際に、CNVが３倍増大することが認められた（Nakayama, IOVS 2014）。

６５歳を超える人々において不可逆的視力喪失の原因の首位を占めているのが、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）である。ＡＭＤの発症に伴い、眼の後部にある光感受性光受容体細胞、それらの細胞を代謝的に支持する下層色素上皮細胞、及びそれらの細胞によって提供される鮮明な中心視力が徐々に失われていく。ＡＭＤ発症リスクの主因子は加齢であり、５５歳を過ぎるとＡＭＤの発呈する確率は３倍に増すとされている。同様に、喫煙、光虹彩色（light iris color）、男女差（女性の方がリスクが高い）、肥満、及び紫外線照射の反復的曝露も、ＡＭＤリスクの増大に関わる。ＡＭＤの形態には、乾性ＡＭＤと湿性ＡＭＤの２通りがある。乾性ＡＭＤの場合、眼の黄斑にドルーゼンが出現し、黄斑の細胞が死滅して、視界がぼやける。乾性ＡＭＤは、１）初期、２）中期、及び３）進行型乾性ＡＭＤの、３段階で進行すると考えられている。また、これらの段階のいずれかにおいて、乾性ＡＭＤが湿性ＡＭＤに進行する可能性もある。湿性ＡＭＤ（別称：滲出型ＡＭＤ）は、病理学的な後区新血管形成に関連している。滲出型ＡＭＤにおいて見出される後区新血管形成（ＰＳＮＶ）は、病理学的脈絡膜血管新生として特徴付けられる。このプロセスで形成される異常な血管からの漏出物は、黄斑を損傷させ、視力を損ない、最終的には視覚消失に至らしめる。湿性ＡＭＤに対する治療戦略は僅かしか存在せず、しかもせいぜい症状緩和的であるにすぎない。したがって、湿性ＡＭＤ及び乾性ＡＭＤのような黄斑変性病態の治療に有効な薬物を提供することに関して医療ニーズが存在するが、それに対する対応は未だ為されていない。国際公開第２００８／０１３８９３号は、ＨＴＲＡ１遺伝子又はｍＲＮＡにハイブリダイズするアンチセンス配列を含んだ核酸分子を含む加齢性黄斑変性に罹患した被験者を治療する組成物に対する所有権を主張するものであるが、アンチセンス分子はいっさい開示されていない。

国際公開第２００９／００６４６０号には、ＨＴＲＡ１を標的化するｓｉＲＮＡ、及びＡＭＤの治療における低分子干渉ＲＮＡ（siRNA）の使用が提供されている。
発明の目的

本発明によって、インビボ又はインビトロでＨＴＲＡ１を調節するアンチセンスオリゴヌクレオチドが提供されている。ＨＴＲＡ１の阻害を効果的なものとするためにアンチセンスオリゴヌクレオチドが標的化しうるヒトＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡ（プレｍＲＮＡを含む）において存在する潜在性標的配列モチーフが、本発明によって同定された。本発明はまた、ＨＴＲＡ１を阻害する機能を有する効果的なアンチセンスオリゴヌクレオチド配列及び化合物、並びにＨＴＲＡ１を適応とする疾患又は障害の治療におけるＨＴＲＡ１の使用を提供するものである。

本発明は、哺乳動物のＨＴＲＡ１核酸を標的化するオリゴヌクレオチド、すなわち、ＨＴＲＡ１の発現を阻害する機能を有し、ＨＴＲＡ１の機能に関連する疾患を治療又は予防するオリゴヌクレオチドに関する。ＨＴＲＡ１を標的化するオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。すなわち、そのアンチオリゴヌクレオチドのＨＴＲＡ１核酸標的に対して相補的である。

本発明のオリゴヌクレオチドは、ナトリウム塩又はカリウム塩などの、医薬的に許容される塩の形態とされる場合がある。

したがって、本発明は、哺乳動物ＨＴＲＡ１核酸に対して少なくとも９０％の相補性を有する、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４、に対して完全に相補的である、１０～３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含んだアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。

更なる態様において、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチド、並びに医薬的に許容される希釈剤、溶媒、担体、塩及び／又はアジュバントを含む医薬組成物を提供する。

本発明によって、ＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば、ＬＮＡギャップマーオリゴヌクレオチドが提供されている。このＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＨＴＲＡ１核酸、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４からなる群から選択される配列、に対して少なくとも９０％の相補性を有する、例えば、完全に相補的である１０～３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むものである。

本発明は、配列番号１４７:
配列番号１４７：５’ＣＣＡＡＣＡＡＣＣＡＧＧＴＡＡＡＴＡＴＴＴＧ ３’
に対して少なくとも９０％、例えば１００％、相補的である１０～２２、例えば１２～２２ヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。

本発明によって、配列番号１４８～１５５からなる群から選択される配列に対して相補的である１０～１７個（例えば、１１個、１２個、１４個、１５個、１６個（例えば、１２～１６個もしくは１２～１７個）ヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドが提供されている。

本発明によって、配列番号１４８もしくは１５５に対して相補的である１０～１７個、例えば、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、例えば１２～１６個もしくは１２～１７個のヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドが提供されている。

本発明によって、１０～３０ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドが提供されている。前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１４７:
配列番号１４７：５’ＣＣＡＡＣＡＡＣＣＡＧＧＴＡＡＡＴＡＴＴＴＧ３’
に対して少なくとも９０％（例えば１００％）相補的である、１０～２２ヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域を含む。

本発明によって、１０～３０ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドが提供されており、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１４８～１５５から選択される配列内に存在する配列に対して相補的である少なくとも１０個、例えば少なくとも１２個の連続ヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域を含む。
本発明は、少なくとも１２ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１４６
配列番号１４６：５’ＴＴＴＡＣＣＴＧＧＴＴ３’
の連続配列を含む。

本発明は、実施例において提供されているオリゴヌクレオチドを提供する。本発明は、オリゴヌクレオチド、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。このオリゴヌクレオチドは、配列番号５～１４５からなる群から選択される配列内に存在する少なくとも１０個、例えば少なくとも１２個を含む。

本発明によって、本発明によるオリゴヌクレオチドを含むコンジュゲート、及び前記オリゴヌクレオチドに共有結合された少なくとも１つのコンジュゲート残基が提供されている。

本発明によって、本発明のオリゴヌクレオチド又はコンジュゲートの、医薬的に許容される塩が提供されている。

更なる態様において、本発明によって、本発明のオリゴヌクレオチド、コンジュゲート又は組成物を、発現している細胞におけるＨＴＲＡ１の発現を調節するため、前記細胞に対し有効量にて投与するインビボもしくはインビトロの方法が提供されている。

更なる態様において、本発明は、ＨＴＲＡ１のインビボ活性に関連する疾患、障害もしくは機能障害を治療又は予防するための方法を提供するものであり、本方法は、治療上もしくは予防上有効な量の本発明のオリゴヌクレオチド、又はそのコンジュゲートを、疾患、障害もしくは機能不全に罹患しているか又は感受性である被験者に投与することを含む。

更なる態様において、本発明のオリゴヌクレオチド又は組成物は、黄斑変性症及びＨＴＲＡ１が関与する他の障害の治療もしくは予防を目的に使用される。

本発明によって、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、変形性関節症などの関節炎、家族性虚血性大脳小血管疾患、アルツハイマー病及びパーキンソン病を含むリストから選択される疾患又は障害の治療に使用することを目的としたものである、本発明のオリゴヌクレオチド又はコンジュゲートが提供されている。

本発明によって、黄斑変性、例えば、湿性もしくは乾性加齢性黄斑変性、例えば、ｗＡＭＤ、ｄＡＭＤ、地理的萎縮、中間体ｄＡＭＤ、又は糖尿病性網膜症の治療に使用することを目的としたものである、本発明のオリゴヌクレオチド又はコンジュゲートが提供されている。

本発明によって、黄斑変性、例えば、湿性もしくは乾性加齢性黄斑変性、例えば、ｗＡＭＤ、ｄＡＭＤ、地理的萎縮、中間体ｄＡＭＤ、又は糖尿病性網膜症の治療を目的とした薬品製造用の本発明のオリゴヌクレオチド、コンジュゲート又は組成物の使用が提供されている。

本発明によって、本発明のオリゴヌクレオチド、コンジュゲート又は組成物の使用が提供されている。これらは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、変形性関節症などの関節炎、家族性虚血性大脳小血管疾患、アルツハイマー病及びパーキンソン病からなる群から選択される疾患もしくは障害の治療を目的とした医薬品製造用のものである。

本発明によって、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、変形性関節症などの関節炎、家族性虚血性大脳小血管疾患、アルツハイマー病及びパーキンソン病からなる群から選択される疾患又は障害に罹患している被験者の治療方法が提供されている。前記方法は、有効量の本発明のオリゴヌクレオチド、コンジュゲート又は組成物を被験者に投与する工程を含むものである。

本発明によって、黄斑変性症などの眼疾患、例えば、湿性もしくは乾性加齢性黄斑変性症（例えば、ｗＡＭＤ、ｄＡＭＤ、地理的萎縮、中間体ｄＡＭＤ）又は糖尿病性網膜症などに罹患している被験者の治療方法が提供されている。前記方法は、有効量の本発明のオリゴヌクレオチド、コンジュゲート又は組成物を、被験者に投与する工程を含むものである。

本発明によって、黄斑変性症などの眼疾患、例えば、湿性もしくは乾性加齢性黄斑変性症、例えば、ｗＡＭＤ、ｄＡＭＤ、地理的萎縮、中間体ｄＡＭＤ、又は糖尿病性網膜症などに罹患している被験者の治療方法が提供されている。前記方法は、本発明のオリゴヌクレオチドの少なくとも２つの投薬量又はその医薬的に許容される塩を約１０μｇ～２００μｇの投薬量にて眼内注射で投与することを含み、連続投与間の投薬間隔は少なくとも４週間もしくは少なくとも毎月とされる。

ｎ＝１２９のＨＴＲＡ１ ＬＮＡオリゴヌクレオチドのライブラリーを、Ｕ２５１細胞株及びＡＲＰＥ１９細胞株２５μＭにてスクリーニングした。リードアウト：ＨＴＲＡ１の定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）。３３０４２位～３３０６４位の間に位置するｎ＝６のオリゴは比較的活性であった。 ３３０４２～３３０６４ホットスポット中のｎ＝１１６のＨＴＲＡ１ ＬＮＡオリゴヌクレオチドのライブラリーを、Ｕ２５１細胞株及びＡＲＰＥ１９細胞株（それぞれ５μＭ及び２５μＭ）でスクリーニングした。以降の分析用に、ｎ＝７個のオリゴを選択した。リードアウト：ＨＴＲＡ１ ｑＰＣＲ。 ヒト初代ＲＰＥ細胞をＬＮＡオリゴヌクレオチド１３９．１及び１４３．１で処置した際の、ＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡレベルの用量応答である。 ラットのインビボ有効性試験、７日間の治療、硝子体内（IVT）投与、用量反応。 ラットのインビボ有効性試験、７日間の治療、硝子体内（IVT）投与、用量反応。リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、１４０．１又は１４３．１で処置されたラットの眼から採取された網膜試料を分析した。ＡはＨｔｒａ１のインシチュ・ハイブリダイゼーション（ISH）用ＲＮＡｓｃｏｐｅを実施した際の、代表的な試料を示す。 Ｂは結果の概要を表に示す。また、グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）の免疫組織染色（IHC）も実施した。反応性神経膠症及び網状線維症に対するマーカーが、ＧＦＡＰである。 ＣはＨｔｒａ１ ｑＰＣＲに供された網膜試料である。ＲＥ：右眼、ＬＥ：左眼。 オリゴ含量の生物分析を実施した際の、プロットされた生物分析及びｍＲＮＡの相対的な発現に対する用量反応曲線を示す。ＥＣ₅₀の測定をGraph Pad Primsで行った。ＰＢＳで処置された試料については、組織１ｇ当たりのオリゴ含量を０．０１μｇに設定した。 プルーフ・オブ・コンセプト（Poc）試験を受けたアルビノラットにおける青色光誘発性網膜変性である。青色光に曝露されてから１４日後の網膜電図Ａ波及びＢ波振幅の回復率（％）、群平均及び９５％信頼区間（CI）を、棒グラフに示す。研究動物ごとの右眼及び左眼の値の平均を、各データポイントに示す。ＩＳＨ用のRNAscope、網膜の２つの異なる領域を引用した例である。網膜試料のＨｔｒａ１ ｑＰＣＲである。薬物動態／薬力学（PK／PD）相関である。 プルーフ・オブ・コンセプト（Poc）試験を受けたアルビノラットにおける青色光誘発性網膜変性である。青色光に曝露されてから１４日後の網膜電図Ａ波及びＢ波振幅の回復率（％）、群平均及び９５％信頼区間（CI）を、棒グラフに示す。研究動物ごとの右眼及び左眼の値の平均を、各データポイントに示す。ＩＳＨ用のRNAscope、網膜の２つの異なる領域を引用した例である。網膜試料のＨｔｒａ１ ｑＰＣＲである。薬物動態／薬力学（PK／PD）相関である。 プルーフ・オブ・コンセプト（Poc）試験を受けたアルビノラットにおける青色光誘発性網膜変性である。青色光に曝露されてから１４日後の網膜電図Ａ波及びＢ波振幅の回復率（％）、群平均及び９５％信頼区間（CI）を、棒グラフに示す。研究動物ごとの右眼及び左眼の値の平均を、各データポイントに示す。ＩＳＨ用のRNAscope、網膜の２つの異なる領域を引用した例である。網膜試料のＨｔｒａ１ ｑＰＣＲである。薬物動態／薬力学（PK／PD）相関である。 プルーフ・オブ・コンセプト（Poc）試験を受けたアルビノラットにおける青色光誘発性網膜変性である。青色光に曝露されてから１４日後の網膜電図Ａ波及びＢ波振幅の回復率（％）、群平均及び９５％信頼区間（CI）を、棒グラフに示す。研究動物ごとの右眼及び左眼の値の平均を、各データポイントに示す。ＩＳＨ用のRNAscope、網膜の２つの異なる領域を引用した例である。網膜試料のＨｔｒａ１ ｑＰＣＲである。薬物動態／薬力学（ＰＫ／ＰＤ）相関である。 ラットにおけるインビボ有効性動態試験、硝子体内（IVT）投与、５０μｇ／片眼、３日間、７日間、１４日間の処置である。ＡはｑＰＣＲで測定された網膜内ＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡレベルであり、図７ＢはＩＳＨによって定量化されたＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡレベルである。Ａ、Ｂ及びＣに、残渣ＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡの発現レベルを対照（ＰＢＳで処置された細胞）の％として、個々の時点におけるオリゴ含有量とｑＰＣＲデータとを比較対照した用量反応曲線に示してある。 ラットにおけるインビボ有効性動態試験、硝子体内（IVT）投与、５０μｇ／片眼、３日間、７日間、１４日間の処置である。ＡはｑＰＣＲで測定された網膜内ＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡレベルであり、図７ＢはＩＳＨによって定量化されたＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡレベルである。Ａ、Ｂ及びＣに、残渣ＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡの発現レベルを対照（ＰＢＳで処置された細胞）の％として、個々の時点におけるオリゴ含有量とｑＰＣＲデータとを比較対照した用量反応曲線に示してある。 ラットにおけるインビボ有効性動態試験、硝子体内（IVT）投与、５０μｇ／片眼、３日間、７日間、１４日間の処置である。ＡはｑＰＣＲで測定された網膜内ＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡレベルであり、図７ＢはＩＳＨによって定量化されたＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡレベルである。Ａ、Ｂ及びＣに、残渣ＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡの発現レベルを対照（ＰＢＳで処置された細胞）の％として、個々の時点におけるオリゴ含有量とｑＰＣＲデータとを比較対照した用量反応曲線に示してある。 非ヒト霊長類（ＮＨＰ）に対する薬物動態／薬力学（PK／PD）試験。硝子体内（IVT）投与、２５μｇ／片眼。ＡはｑＰＣＲで測定された網膜内ＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡレベルである。ＢはＩＳＨによって例証されたＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡレベルである。Ｃ、Ｄは網膜及び硝子体の各々について免疫沈降－質量分析（ＩＰ－ＭＳ）で定量したＨＴＲＡ１タンパク質レベルである。ドット（．）は、個々の動物のデータを示す。エラーバーに、技術的複製（ｎ＝３）に対する標準偏差を示してある。 非ヒト霊長類（ＮＨＰ）に対する薬物動態／薬力学（PK／PD）試験。硝子体内（IVT）投与、２５μｇ／片眼。ＡはｑＰＣＲで測定された網膜内ＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡレベルである。ＢはＩＳＨによって例証されたＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡレベルである。Ｃ、Ｄは網膜及び硝子体の各々について免疫沈降－質量分析（ＩＰ－ＭＳ）で定量したＨＴＲＡ１タンパク質レベルである。ドット（．）は、個々の動物のデータを示す。エラーバーに、技術的複製（ｎ＝３）に対する標準偏差を示してある。 非ヒト霊長類（ＮＨＰ）に対する薬物動態／薬力学（PK／PD）試験。硝子体内（IVT）投与、２５μｇ／片眼。ＡはｑＰＣＲで測定された網膜内ＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡレベルである。ＢはＩＳＨによって例証されたＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡレベルである。Ｃ、Ｄは網膜及び硝子体の各々について免疫沈降－質量分析（ＩＰ－ＭＳ）で定量したＨＴＲＡ１タンパク質レベルである。ドット（．）は、個々の動物のデータを示す。エラーバーに、技術的複製（ｎ＝３）に対する標準偏差を示してある。 非ヒト霊長類（ＮＨＰ）に対する薬物動態／薬力学（PK／PD）試験。硝子体内（IVT）投与、２５μｇ／片眼。ＡはｑＰＣＲで測定された網膜内ＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡレベルである。ＢはＩＳＨによって例証されたＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡレベルである。Ｃ、Ｄは網膜及び硝子体の各々について免疫沈降－質量分析（ＩＰ－ＭＳ）で定量したＨＴＲＡ１タンパク質レベルである。ドット（．）は、個々の動物のデータを示す。エラーバーに、技術的複製（ｎ＝３）に対する標準偏差を示してある。 本発明の化合物（化合物番号１４３．１）。化合物は、ナトリウム塩又はカリウム塩などの医薬塩の形態とされる場合がある。 本発明の化合物（化合物番号１４５．３）。化合物は、ナトリウム塩又はカリウム塩などの医薬塩の形態とされる場合がある。 化合物１４３．１の医薬塩の例である。Ｍ⁺は、典型的には、例えばナトリウムイオン又はカリウムイオンのような、好適なカチオンである。オリゴヌクレオチドアニオンに対するカチオンの化学量論比は、使用されたカチオンの電荷に依存する。１つ、２つ又は３つの正電荷を有するカチオン（Ｍ⁺、Ｍ⁺⁺又はＭ⁺⁺⁺）が使用可能であれば好適である。例証の目的に、Ｎａ⁺又はＫ⁺のような正に荷電した単一の（一価）カチオンは、Ｃａ²⁺のような二価カチオンと比較して２倍必要とされる。 化合物１４５．３の医薬塩の例である。カチオンＭ⁺の説明については、図１１の図の凡例を参照のこと。

定義
オリゴヌクレオチド
当業者に遍く理解されているように、本明細書中に用いられている「オリゴヌクレオチド」という用語は、２つ以上の共有結合されたヌクレオシドを含む分子として定義されている。また、そのような共有結合されたヌクレオシドは、核酸分子又はオリゴマーと呼ばれる場合もある。オリゴヌクレオチドは、実験室内で固相化学合成及び引き続いて精製を行うことによって作られるのが通例である。オリゴヌクレオチドの配列に関して言及されている場合、共有結合したヌクレオチドもしくはヌクレオシドの核酸塩基残基、又はその修飾物の配列もしくは順序を指すものとする。本発明のオリゴヌクレオチドは人造であって、化学的に合成されたものであり、精製又は単離されるのが通例である。本発明のオリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾ヌクレオシド又はヌクレオチドを含む場合がある。

アンチセンスオリゴヌクレオチド
本明細書中に用いられている「アンチセンスオリゴヌクレオチド」という用語は、標的核酸、とりわけ標的核酸上の隣接する配列、にハイブリダイズすることによって、標的遺伝子の発現を調節できるオリゴヌクレオチドとして定義されている。アンチセンスオリゴヌクレオチドは本質的に二本鎖ではないという点で、ｓｉＲＮＡとは異なる。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、一本鎖であることが好ましい。

連続ヌクレオチド領域
「連続ヌクレオチド領域」という用語は、標的核酸に対して相補的なオリゴヌクレオチドの領域を指し、この用語は、本明細書中の「連続ヌクレオチド配列」又は「連続核酸塩基配列」という用語及び「オリゴヌクレオチドモチーフ配列」という用語と同義に使用される場合がある。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチドは連続ヌクレオチド領域内に存在する。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは連続ヌクレオチド領域を含むだけでなく、任意に更なるヌクレオチド、例えば、連続ヌクレオチド配列に官能基を結合させるために使用可能なヌクレオチドリンカー領域、も含む場合がある。ヌクレオチドリンカー領域は、標的核酸に対して相補的な場合もあれば相補的でない場合もある。幾つかの実施形態において、連続ヌクレオチド領域のヌクレオチドどうしの間に存在するヌクレオシド間結合はいずれもホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。幾つかの実施形態において、連続ヌクレオチド領域は、１つ以上の糖修飾ヌクレオシドを含む。

ヌクレオチド
ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドのビルディングブロックであり、本発明の目的に合わせて、天然ヌクレオチド及び非天然ヌクレオチドの両方が含まれている。自然界のＤＮＡ及びＲＮＡヌクレオチドなどのヌクレオチドは、リボース糖残基、核酸塩基残基及び１つ以上のリン酸基（ヌクレオシド内に存在しないもの）を含む。ヌクレオシド及びヌクレオチドはまた、「単位」又は「モノマー」と同義的に呼ばれる場合もある。

修飾ヌクレオシド
本明細書中に用いられている「修飾ヌクレオシド」又は「ヌクレオシド修飾」という用語は、糖残基もしくは（ヌクレオ）塩基残基の１つ以上の修飾を導入することによって同等のＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドと比較して修飾されたヌクレオシドを指す。好ましい実施形態において、修飾ヌクレオシドは修飾糖残基を含む。修飾ヌクレオシドという用語は、本明細書中で「ヌクレオシド類似体」、修飾「単位」又は修飾「モノマー」という用語と同義に使用される場合もある。

修飾ヌクレオシド間結合
「修飾ヌクレオシド間結合」という用語は、２つのヌクレオシドを一体的に共有結合するホスホジエステル（ＰＯ）結合以外の結合として当業者に遍く理解されるものであるとして定義されている。修飾ヌクレオシド間結合を有するヌクレオチドはまた、「修飾ヌクレオチド」とも呼ばれる。幾つかの実施形態において、修飾ヌクレオシド間結合は、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を、ホスホジエステル結合と比較して増強させる。天然起源のオリゴヌクレオチドの場合、ヌクレオシド間結合にリン酸基が含まれるため、隣接するヌクレオシドどうしの間にホスホジエステル結合が生ずる。修飾ヌクレオシド間結合は、インビボでの使用に向けてオリゴヌクレオチドを安定化するのに特に有用であり、本発明のオリゴヌクレオチド内、例えば、ギャップマーオリゴヌクレオチドのギャップ領域内、並びに修飾ヌクレオシドの領域内、のＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシド領域においてヌクレアーゼが開裂するのを防ぐ役割を果たしうる。

一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１つ以上のヌクレオシド間結合を含む。このヌクレオシド間結合は、天然ホスホジエステルに対し、例えばヌクレアーゼ攻撃に対する耐性を強化した結合となるように、修飾を施したものである。ヌクレアーゼ耐性の定量化を目的に、オリゴヌクレオチドを血清中でインキュベートする場合もあれば、あるいはヌクレアーゼ耐性アッセイ（例えばヘビ毒ホスホジエステラーゼ（ＳＶＰＤ））を使用する場合もある。これらの方法は両方とも当該技術分野において周知である。オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を増強しうるヌクレオシド間結合は、オリゴヌクレオチドはヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合と呼ばれる。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合はいずれも修飾される。幾つかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドを非ヌクレオチド官能基（例えばコンジュゲート）に連結するヌクレオシドは、ホスホジエステルでありうることが、認識されるであろう。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合はいずれも、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合である。

幾つかの実施形態において、修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合とされる場合がある。幾つかの実施形態において、修飾されたヌクレオシド間結合は、本発明のオリゴヌクレオチド、例えばホスホロチオエート、のＲＮアーゼＨ補充と互換性がある。

幾つかの実施形態において、ヌクレオシド間結合は、イオウ（Ｓ）、例えばホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。

ホスホロチオエートヌクレオシド間結合は、ヌクレアーゼ耐性、有益な薬物動態を備え、しかも製造が容易であるという点で、特に有用である。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合はいずれも、ホスホロチオエートである。

核酸塩基
核酸塩基という用語は、核酸ハイブリダイゼーションにおいて水素結合を形成するヌクレオシド及びヌクレオチド内に存在するプリン（例えば、アデニン及びグアニン）、並びにピリミジン（例えば、ウラシル、チミン及びシトシン）残基を含む。本発明との関連において、核酸塩基という用語には、天然起源の核酸塩基とは異なるが、核酸ハイブリダイゼーションの間に機能する修飾核酸塩基も包含される。これに関連して、「核酸塩基」は、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチン及びヒポキサンチンのような天然起源の核酸塩基、並びに非天然起源の変種の両方を指す。そのような変種は、例えばHirao et al (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055及びBergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1. 4. 1に記載されている。

幾つかの実施形態では、核酸塩基部分は、プリン又はピリミジンを、置換プリン又は置換ピリミジンなどの修飾プリン又はピリミジン、例えばイソシトシン、シュードイソシトシン、５－メチルシトシン、５－チオゾロ－シトシン、５－プロピニル－シトシン、５－プロピニル－ウラシル、５－ブロモウラシル５－チアゾロ－ウラシル、２－チオ－ウラシル、２’－チオ－チミン、イノシン、ジアミノプリン、６－アミノプリン、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン及び２－クロロ－６－アミノプリンから選択される核酸塩基に変えることによって修飾される。

核酸塩基残基は、対応する各核酸塩基の英字コード、例えばＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃ又はＵで示すことができる。各文字は、任意に、同等な機能の改変核酸塩基を含みうる。例えば、例示的なオリゴヌクレオチドにおいて、核酸塩基残基はＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃ及び５－メチルシトシンから選択される。任意で、ＬＮＡギャップマーに、５－メチルシトシンＬＮＡヌクレオシドを使用しても差し支えない。幾つかの実施形態において、５’ｃｇ３’モチーフ内のシトシン核酸塩基は、５－メチルシトシンである。

修飾オリゴヌクレオチド
修飾オリゴヌクレオチドという用語は、１つ以上の糖修飾ヌクレオシド及び／又は修飾ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを表す。「キメラオリゴヌクレオチド」という用語は、修飾ヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドを表すために文献中に用いられている用語である。

相補性
相補性という用語は、ヌクレオシド／ヌクレオチドのワトソン－クリック塩基対形成能力を表す。ワトソン－クリック塩基対は、グアニン（Ｇ）－シトシン（Ｃ）、及びアデニン（Ａ）－チミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）である。オリゴヌクレオチドは、修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを含みうる。例えば、５－メチルシトシンはシトシンの代わりに使用されることがしばしばであり、そのため、相補性という用語は、非修飾核酸塩基と修飾核酸塩基との間のワトソンクリック塩基対を包含することが理解されるであろう（例えば、Hirao et al (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055及びBergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1. 4. 1を参照）。

本明細書中に用いられている用語「相補性（％）」は、別個の核酸分子（例えば標的核酸）の所与の位置にある連続ヌクレオチド配列に対して、所与の位置にて相補的な（すなわち、ワトソンクリック塩基対を形成する）、核酸分子（例えばオリゴヌクレオチド）中の連続ヌクレオチド領域又は配列のパーセントで表したヌクレオチドの数を指す。このパーセンテージは、アラインされた塩基の数を計数してから、２つの配列の間に対を形成するオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの総数で除算して１００を乗算することによって、計算される。そのような比較において、アラインされていない（塩基対を形成する）核酸塩基／ヌクレオチドは、ミスマッチと呼ばれる。

２つの配列間の相補性に言及されている場合、相補性の決定は、２つの配列のうちの短い方の長さ、例えば連続ヌクレオチド領域又は配列の長さ、にわたって測定されることが理解されるであろう。

「完全に相補的」という用語は、１００％の相補性を指す。項値（％）又はミスマッチの表示がない場合、相補的とは完全に相補的であることを意味する。

同一性
本明細書中に用いられている「同一性」という用語は、別個の核酸分子（例えば標的核酸）の所与の位置にある連続ヌクレオチド配列に対して、所与の位置にて同一な（すなわち、相補的ヌクレオシドと一緒になってワトソンクリック塩基対を形成できるという点で）、核酸分子（例えばオリゴヌクレオチド）中の連続ヌクレオチド配列のパーセントで表したヌクレオチドの数を指す。このパーセンテージは、ギャップを含む２つの配列間で同一なアラインされた塩基の数を計数してから、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの総数で除算して１００を乗算することによって、計算される。同一性（％）＝（一致×１００）／アラインされた領域の長さ（ギャップあり）。

オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域の同一性を定量化する場合、連続ヌクレオチド領域の長さにわたる同一性を計算する。したがって、オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列全体が連続ヌクレオチド領域である実施形態では、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列の長さにわたる同一性が計算される。この点で、連続ヌクレオチド領域領域は、基準核酸配列の領域と同一である場合もあれば、あるいは幾つかの実施形態では、基準核酸全体と同一である場合もある。別途指示のない限り、参照配列に対して１００％の同一性を有する配列は、同一であると称される。例えば、参照配列は、配列番号５～１４６及び１５６のうちのいずれか１つからなる群から選択可能である。

しかしながら、オリゴヌクレオチドが、連続ヌクレオチド領域（例えば領域Ｄ’又はＤ”）に隣接する追加的なヌクレオチドを含む場合、これらの隣接する追加的なヌクレオチドは、同一性を決定する際に無視しても差し支えない。幾つかの実施形態において、同一性は、オリゴヌクレオチド配列全体にわたって計算できる。
幾つかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号１５６：
配列番号１５６：５’ＣＡＡＡＴＡＴＴＴＡＣＣＴＧＧＴＴＧＴＴＧＧ ３’
に対して同一である連続ヌクレオチド領域１０～２２個の連続ヌクレオチドを含む。

幾つかの実施形態において、連続ヌクレオチド領域は、配列番号１５６の少なくとも１０個の連続ヌクレオチド、例えば、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個の連続ヌクレオチド、例えば、１２～２２個、例えば、１４～１８個の連続ヌクレオチドからなるか又はその連続ヌクレオチドを含む。
幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの連続配列全体は、少なくとも１０個の連続ヌクレオチド、例えば、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個の連続ヌクレオチド、例えば、１２～２２個、例えば、配列番号１５６の１４～１８個の連続ヌクレオチドからなるか又はその連続ヌクレオチドを含む。

幾つかの実施形態において、連続ヌクレオチド領域は、配列番号１５６の少なくとも１２個の連続ヌクレオチドである。幾つかの実施形態において、連続ヌクレオチド領域は、配列番号１５６の少なくとも１４個の連続ヌクレオチドである。幾つかの実施形態において、連続ヌクレオチド領域は、配列番号１５６の少なくとも１６連続ヌクレオチドである。

幾つかの実施形態において、連続ヌクレオチド領域は、配列番号１４３に対して同一である少なくとも１０個、１２個、１４個又は１６個の連続ヌクレオチドである。

幾つかの実施形態において、連続ヌクレオチド領域は、配列番号１４５に対して同一である少なくとも１０個、１２個、１４個又は１６個の連続ヌクレオチドである。

幾つかの実施形態において、連続ヌクレオチド領域は、配列番号１４３に対して同一である少なくとも１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個又は１６個の連続ヌクレオチドである。

幾つかの実施形態において、連続ヌクレオチド領域は、配列番号１４５に対して同一である少なくとも１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個又は１７個の連続ヌクレオチドである。

幾つかの実施形態において、連続ヌクレオチドは、配列番号１４３からなるか又はその配列番号を含む。

幾つかの実施形態において、連続ヌクレオチド領域は、配列番号１４５からなるか又はその配列番号を含む。

幾つかの実施形態において、連続ヌクレオチド領域は、配列番号１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４及び１４５からなる群から選択される配列に対して同一である少なくとも１０個、１２個、１４個又は１６個の連続ヌクレオチドである。幾つかの実施形態において、連続ヌクレオチド領域は、配列番号１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４及び１４５からなる群から選択される配列を含むか又はその配列からなる。

幾つかの実施形態において、連続ヌクレオチド領域は、配列番号１４６の配列：ＴＴＴＡＣＣＴＧＧＴＴを含む。

本発明は、配列番号１４６の配列：ＴＴＴＡＣＣＴＧＧＴＴを含む、１１～３０ヌクレオチド長、例えば１２～２０ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。

ハイブリダイゼーション
本明細書中に用いられている「ハイブリダイズする」又は「ハイブリダイズする」という用語は、反対側の鎖上の塩基対間に水素結合を形成し、それにより二本鎖を形成する、２つの核酸鎖（例えばオリゴヌクレオチド及び標的核酸）として理解すべきである。２つの核酸鎖間の結合の親和性は、ハイブリダイゼーションの強度である。これは、多くの場合、オリゴヌクレオチドの半分が標的核酸と一緒になって二本鎖を生ずる温度として定義される融解温度（Ｔ_m）という観点から記載される。生理学的条件において、Ｔ_mは、親和性に対して厳密には正比例しない（Mergny and Lacroix, 2003, Oligonucleotides 13: 515-537）。標準状態のギブス自由エネルギーΔＧ°は、結合親和性を精密化した表現であって、Ｒを気体定数とし、Ｔを絶対温度としたときに、反応の解離定数（Ｋ_d）に対し、ΔＧ°＝－ＲＴｌｎ（Ｋ_d）だけ関連する。ゆえに、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の反応のΔＧ°が極めて低いことに、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の強力なハイブリダイゼーションが反映されている。ΔＧ°は、反応の水性濃度を１Ｍ、ｐＨを７、及び温度を３７℃とした場合に関連するエネルギーである。標的核酸に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは自発的反応である。自発的反応の場合、ΔＧ°はゼロ未満となる。Hansen et al., 1965, Chem.Comm.36-38及びHoldgate et al., 2005, Drug Discov Todayに記載されているようにして、ΔＧ°を、例えば等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）法を用い、実験的に測定できる。市販の機器がΔＧ°の測定に利用可能であることは、当業者に理解されるであろう。同様に、SantaLucia, 1998, Proc Natl Acad Sci USA. 95: 1460-1465が記載しているような最近傍モデルを使用し、Sugimoto et al., 1995, Biochemistry 34: 11211-11216及びMcTigue et al., 2004, Biochemistry 43: 5388-5405が記載している適切に導出された熱力学的パラメーターを用いて、ΔＧ°を数値的に推定することもできる。本発明のオリゴヌクレオチドは、その意図された核酸標的をハイブリダイゼーションで調節することを可能にするため、１０～３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドの場合、－１０ｋｃａｌ未満の推定ΔＧ°値にて標的核酸にハイブリダイズする。幾つかの実施形態において、ハイブリダイゼーションの程度又は強度を、標準状態ギブス自由エネルギーΔＧ°で測定する。８～３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドの場合、－１０ｋｃａｌ未満、例えば－１５ｋｃａｌ未満、－２０ｋｃａｌ未満、及び－２５ｋｃａｌ未満など、の範囲の推定ΔＧ°値にて標的核酸にハイブリダイズしうる。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、－１０～－６０ｋｃａｌ、例えば、－１２～－４０、例えば、－１５～－３０ｋｃａｌ又は－１６～－２７ｋｃａｌ、例えば－１８～－２５ｋｃａｌ、の推定ΔＧ°値にて標的核酸にハイブリダイズする。

標的配列
オリゴヌクレオチドは、標的核酸分子の部分配列に対して相補的又はハイブリダイズする、連続ヌクレオチド領域を含む。本明細書中に用いられている「標的配列」という用語は、本発明のオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域又は配列に対して相補的な核酸塩基配列を含む、標的核酸内に存在するヌクレオチドの配列を指す。幾つかの実施形態において、標的配列は、本発明のオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域又は配列に対して相補的な標的核酸上の領域からなる。幾つかの実施形態において、標的配列は、単一のオリゴヌクレオチドの相補的配列よりも長く、例えば本発明の幾つかのオリゴヌクレオチドによって標的化される可能性のある、標的核酸の好ましい領域を表しうる。

本発明のオリゴヌクレオチドは、標的配列などの標的核酸に対して相補的な連続ヌクレオチド領域を含む。

オリゴヌクレオチドは、標的核酸分子内に存在する標的配列に対して相補的であるか又はそれにハイブリダイズする、少なくとも１０ヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域を含む。連続ヌクレオチド領域（及びひいてはその標的配列）は、少なくとも１０個の連続ヌクレオチド、例えば、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個の連続ヌクレオチド、例えば１２～２２個、１４～１８個の連続ヌクレオチドを含む。

幾つかの実施形態において、標的配列は配列番号１４７であるか、あるいはその配列番号内に存在する。

幾つかの実施形態において、標的配列は、
配列番号１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４及び１５５：
配列番号１４８：ＡＡＣＡＡＣＣＡＧＧＴＡＡＡＴＡ
配列番号１４９：ＣＡＡＣＣＡＧＧＴＡＡＡＴＡＴＴＴＧ
配列番号１５０：ＣＣＡＡＣＡＡＣＣＡＧＧＴＡＡＡ
配列番号１５１：ＡＡＣＣＡＧＧＴＡＡＡＴＡＴＴＴＧＧ
配列番号１５２：ＡＣＡＡＣＣＡＧＧＴＡＡＡＴＡＴＴＴＧＧ
配列番号１５３：ＣＡＡＣＡＡＣＣＡＧＧＴＡＡＡＴＡＴ
配列番号１５４：ＡＣＡＡＣＣＡＧＧＴＡＡＡＴＡＴ
配列番号１５５：ＡＡＣＡＡＣＣＡＧＧＴＡＡＡＴＡＴ
からなる群から選択される。

本発明によって、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号１４７及び１４８～１５５から選択される配列内に存在する配列に対して相補的な少なくとも１０個の連続ヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域を含む、１０～３０ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドが提供されている。

本発明によって、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号１４７及び１４８～１５５から選択される配列内に存在する配列に対して相補的な少なくとも１２個の連続ヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域を含む、１２～３０ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドが提供されている。

本発明によって、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号１４７及び１４８～１５５から選択される配列内に存在する配列に対して相補的な少なくとも１４個の連続ヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域を含む、１４～３０ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドが提供されている。

本発明は、配列番号１４８～１５５から選択される配列に対して相補的である連続ヌクレオチド領域からなるか又はその連続ヌクレオチド領域を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。

標的配列は標的核酸の部分配列とされる場合がある。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド領域は、配列番号１４８～１５４からなる群から選択される配列などのＨＴＲＡ１部分配列に対して完全に相補的であるか、あるいはそのＨＴＲＡ１部分配列に対するミスマッチを１つ又は２つのみ含む。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド領域は、配列番号１４７のＨＴＲＡ１部分配列に対して完全に相補的であるか、又はそのＨＴＲＡ１部分配列に対するミスマッチを１つもしくは２つのみ含む。

標的細胞
本明細書中に使用される標的細胞という用語は、標的核酸を発現する細胞を指す。幾つかの実施形態において、標的細胞はインビボ又はインビトロとされる場合がある。幾つかの実施形態において、標的細胞は、哺乳動物細胞（例えば、マウス細胞又はラット細胞などのげっ歯類細胞であるか、あるいはサル細胞又はヒト細胞などの霊長類細胞）である。幾つかの実施形態において、細胞は、ブタ細胞、イヌ細胞又はウサギ細胞とされる場合がある。幾つかの実施形態において、標的細胞は、網膜色素上皮（ＰＲＥ）細胞などの網膜細胞とされる場合がある。幾つかの実施形態において、細胞は、ＲＰＥ細胞、双極細胞、アマクリン細胞、内皮細胞、神経節細胞及び小膠細胞からなる群から選択される。インビトロ評価用の標的細胞は、初代細胞又は株化細胞、例えば、Ｕ２５１、ＡＲＰＥ１９、ＨＥＫ２９３もしくはラットＣ６細胞、とされる場合がある。

標的核酸
本発明によると、標的核酸は、哺乳動物のＨＴＲＡ１をコードする核酸である。例えば遺伝子、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ及びプレｍＲＮＡ、成熟ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ配列でありうる。したがって、標的はＨＴＲＡ１標的核酸と呼ばれる場合がある。

標的核酸は、特にヒトＨＴＲＡ１のような哺乳動物のＨＴＲＡ１をコードするＨＴＲＡ１タンパク質であるのが好適である（例えばヒト及びラットＨＴＲＡ１の、ｍＲＮＡ並びにプレｍＲＮＡ配列が記載されている表１及び表２を参照）。

幾つかの実施形態において、標的核酸は、配列番号：１、２、３及び４、又はその天然起源の変種（例えば、哺乳動物ＨＴＲＡ１タンパク質をコードする配列）からなる群から選択される。

標的細胞は、ＨＴＲＡ１標的核酸を発現している細胞である。好ましい実施形態において、標的核酸は、ＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡ、例えば、ＨＴＲＡ１のプレｍＲＮＡ、又はＨＴＲＡ１の成熟ｍＲＮＡである。ＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡのポリＡテールは典型的に、アンチセンスオリゴヌクレオチドターゲティングを無視する。

本発明のオリゴヌクレオチドを研究又は診断において使用する場合、標的核酸を、ｃＤＮＡもしくはＤＮＡとする場合もあれば、又はＲＮＡ由来の合成核酸とする場合もある。

標的配列は標的核酸の部分配列とされる場合がある。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド領域は、ＨＴＲＡ１部分配列、例えば、配列番号１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４及び１５５からなる群から選択される配列に対して完全に相補的であるか、又は単にそのＨＴＲＡ１部分配列に対して１つもしくは２つのミスマッチを含む。

標的又はその部分配列に対する相補性は、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド領域の長さにわたって測定される。

インビボ又はインビトロで用いられた場合、本発明のオリゴヌクレオチドは典型的に、ＨＴＲＡ１標的核酸を発現している細胞内のＨＴＲＡ１標的核酸の発現を阻害する機能を有する。本発明のオリゴヌクレオチドの核酸塩基の連続配列は典型的に、任意で１もしくは２のミスマッチを除き、オリゴヌクレオチドの長さにわたって測定した場合にＨＴＲＡ１標的核酸に対して相補的であり、任意の官能基、例えば、コンジュゲート又は他の非相補的な末端ヌクレオチド（例えば、領域Ｄ）にオリゴヌクレオチドを連結しうるヌクレオチドベースのリンカー領域を任意に除外する。幾つかの実施形態において、標的核酸は、ＲＮＡ又はＤＮＡ、例えば、成熟ｍＲＮＡもしくはプレｍＲＮＡなどのメッセンジャーＲＮＡでありうる。幾つかの実施形態において、標的核酸は、ヒトＨＴＲＡ１などの哺乳動物ＨＴＲＡ１タンパク質をコードするＲＮＡ又はＤＮＡ、例えば配列番号１（ＮＭ＿００２７７５．４、ＧＩ：１９００１４５７５）などのヒトＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡ配列として開示されているものである。例示的な標的核酸に関する詳細情報は、表１及び表２に記載されている。

Ｆｗｄ＝フォワード鎖。ゲノム座標に、プレｍＲＮＡ配列（ゲノム配列）が提供されている。
ＮＣＢＩのリファレンスには、ｍＲＮＡ配列（ｃＤＮＡ配列）が記載されている。

^*国立バイオテクノロジー情報センター（The National Center for Biotechnology Information）の参照配列データベースは、ゲノム、転写産物及びタンパク質を含む、包括的な統合型の非冗長且つ注釈豊富な参照配列セットであり、www.ncbi.nlm.nih.gov／refseqでホストされている。

天然起源の変種
「天然起源の変種」という用語は、標的核酸と同じ遺伝子座に由来するＨＴＲＡ１遺伝子又は転写物の変種ではあるが、例えば、遺伝暗号の縮重によって同じアミノ酸をコードする多様なコドンを生ずるのが原因で、あるいは、プレｍＲＮＡの選択的スプライシング、又は一塩基多型などの多型、及び対立遺伝子の変種が存在するのが原因で、異なりうるものを指す。ゆえに、本発明のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドに対して充分相補的な配列が存在することを根拠とし、標的核酸及びその天然に存在する変種を標的化しうる。幾つかの実施形態において、天然起源の変種は、配列番号１、２、３もしくは４からなる群から選択される標的核酸などの哺乳動物ＨＴＲＡ１標的核酸に対して少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の相同性を有する。

発現の調節
本明細書で使用される「発現の調節」という用語は、オリゴヌクレオチドを投与される前のＨＴＲＡ１の量と比べてＨＴＲＡ１の量を変化させるオリゴヌクレオチドの能力に関する総称として理解すべきである。代替的に、本発明のオリゴヌクレオチドを投与されない対照実験を参照することにより、発現の調節を算定する場合もある。１つのタイプの調節は、オリゴヌクレオチドがｍＲＮＡの分解又は転写の遮断によってＨＴＲＡ１の発現を阻害、下方制御、減少、抑制、除去、中断、ブロック、防止、低減、低下、回避又は停止させる能力である。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＨＴＲＡ１の発現を阻害、下方制御、低減、抑制、除去、中断、ブロック、予防、軽減、低下、回避また停止させる機能を有する。

高親和性修飾ヌクレオシド
高親和性修飾ヌクレオシドは、オリゴヌクレオチド内に組み込まれた場合、例えば融解温度（Ｔ^m）で測定されるように、その相補的標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性を増強させる修飾ヌクレオチドである。本発明の高親和性修飾ヌクレオシドは、融解温度を、好ましくは修飾ヌクレオシド当たり＋０．５～＋１２℃、より好ましくは＋１．５～＋１０℃、最も好ましくは＋３～＋８℃上昇させる。当該技術分野において多数の高親和性修飾ヌクレオシドが公知である。高親和性修飾ヌクレオシドとしては、例えば、多くの２’置換ヌクレオシド及びロックド核酸（ＬＮＡ）が挙げられる。Acid Res., 1997, 25, 4429-4443及びUhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213を参照）。

糖修飾
本発明のオリゴマーは、ＤＮＡ及びＲＮＡに見られるリボース糖残基と比較して、修飾糖残基、すなわち糖残基の修飾を有する１つ以上のヌクレオシドを含む場合がある。

主に親和性及び／又はヌクレアーゼ耐性などのオリゴヌクレオチドの特定の特性を改善することを目的に、リボース糖残基を修飾した多数のヌクレオシドが製造されてきた。

そのような修飾としては、リボース環構造が修飾されているもの、例えばヘキソース環（ＨＮＡもしくは二環式環で置換したもの）、典型的には、リボース環（ＬＮＡ）上のＣ₂炭素とＣ₄炭素との間のビラジカル（biradicle）架橋、又は典型的にはＣ₂炭素とＣ₃炭素との間の結合を欠く非結合リボース環（例えばＵＮＡ）を有するものが挙げられる。他の糖修飾ヌクレオシドには、例えばビシクロヘキソース核酸（国際公開第２０１１／０１７５２１号）又は三環式核酸（国際公開第２０１３／１５４７９８号）が含まれる。また、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）又はモルホリノ核酸の場合、修飾ヌクレオシドには、糖残基が非糖残基で置換されているヌクレオシドが含まれる。

糖修飾はまた、リボース環上の置換基を水素以外の基、又はＤＮＡ及びＲＮＡヌクレオシドにおいて天然に見出される２’－ＯＨ基に変更することによって為された修飾も含まれる。置換基は、例えば、２’位、３’位、４’位又は５'位に導入することが可能である。また、修飾糖残基を有するヌクレオシドには、２’置換ヌクレオシドなどの２’修飾ヌクレオシドも含まれる。２’置換ヌクレオシドの開発にかなりの焦点が当てられてきたのが実情であり、オリゴヌクレオチド内に多数の２’置換ヌクレオシドを組み込むことによって、例えばヌクレオシド耐性及び親和性が増強されるなどの有益な特性が得られることが見出された。

２’修飾ヌクレオシド
２’糖修飾ヌクレオシドは、２’位にＨ又は－ＯＨ以外の置換基を有する（２’置換ヌクレオシド）であるか又は２’結合ビラジカル（biradicle）を含むヌクレオシドであり、２’置換ヌクレオシドとＬＮＡ（２’－４’ビラジカル架橋）ヌクレオシドとを含む。例えば、２’修飾糖は、オリゴヌクレオチドに対する結合親和性の増強及び／又はヌクレアーゼ耐性を増強させる可能性がある。２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＲＮＡ、及び２’－Ｆ－ＡＮＡヌクレオシドは、２’置換修飾ヌクレオシドの例である。更なる例については、例えば、Freier & Altmann; Nucl.Acid Res., 1997, 25, 4429-4443、及びUhlmann; Curr.Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213、及びDeleavey and Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937を参照。以下は、幾つかの２’置換修飾ヌクレオシドの例である。

ロックド核酸ヌクレオシド（ＬＮＡ）
ＬＮＡヌクレオシドは、ヌクレオチドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’との間にリンカー基（ビラジカル又はブリッジと呼ばれる）を含む、修飾ヌクレオシドである。これらのヌクレオシドは、文献中で架橋核酸又は二環式核酸（ＢＮＡ）とも称されている。

幾つかの実施形態において、本発明のオリゴマーの修飾ヌクレオシド又はＬＮＡヌクレオシドは、式Ｉ又はＩＩの一般構造を有する。

式中：Ｗは－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｎ（Ｒ^a）－、－Ｃ（Ｒ^aＲ^b）－から選択され（例えば、幾つかの実施形態では－Ｏ－であり）、
Ｂは核酸塩基残基を示し、
Ｚは隣接するヌクレオシドへのヌクレオシド間結合、又は５’末端基を示し、
Ｚ^*は、隣接ヌクレオシド、又は３’－末端基へのヌクレオシド間結合を示し、
Ｘは、－Ｃ（Ｒ^aＲ^b）－、－Ｃ（Ｒ^a）＝Ｃ（Ｒ^b）－、－Ｃ（Ｒ^a）＝Ｎ－、－Ｏ－、－Ｓｉ（Ｒ^a）₂－、－Ｓ－、－ＳＯ₂－、－Ｎ（Ｒ^a）－、及び＞Ｃ＝Ｚからなる群から選択される基を示す。

幾つかの実施形態において、Ｘは、－Ｏ－、－Ｓ－、ＮＨ－、ＮＲ^aＲ^b、－ＣＨ₂－、ＣＲ^aＲ^b、－Ｃ（＝ＣＨ₂）－、及び－Ｃ（＝ＣＲ^aＲ^b）－からなる群から選択される。

幾つかの実施形態において、Ｘは、－Ｏ－
Ｙは－Ｃ（Ｒ^aＲ^b）－、－Ｃ（Ｒ^a）＝Ｃ（Ｒ^b）－、－Ｃ（Ｒ^a）＝Ｎ－、－Ｏ－、－Ｓｉ（Ｒ^a）₂－、－Ｓ－、－ＳＯ₂－、－Ｎ（Ｒ^a）－、及び＞Ｃ＝Ｚからなる群から選択される基を示す。

幾つかの実施形態において、Ｙは－ＣＨ₂－、－Ｃ（Ｒ^aＲ^b）－、－ＣＨ₂ＣＨ₂－、－Ｃ（Ｒ^aＲ^b）－Ｃ（Ｒ^aＲ^b）－、－ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂－、－Ｃ（Ｒ^aＲ^b）Ｃ（Ｒ^aＲ^b）Ｃ（Ｒ^aＲ^b）－、－Ｃ（Ｒ^a）＝Ｃ（Ｒ^b）－、及び－Ｃ（Ｒ^a）＝Ｎ－からなる群から選択される。

幾つかの実施形態において、Ｙは－ＣＨ₂－、－ＣＨＲ^a－、－ＣＨＣＨ₃－、ＣＲ^aＲ^b－からなる群から選択されるか、
あるいは－Ｘ－Ｙ－が一体的に、－Ｃ（Ｒ^aＲ^b）－、－Ｃ（Ｒ^a）＝Ｃ（Ｒ^b）－、－Ｃ（Ｒ^a）＝Ｎ－、－Ｏ－、－Ｓｉ（Ｒ^a）₂－、－Ｓ－、－ＳＯ₂－、－Ｎ（Ｒ^a）－、及び＞Ｃ＝Ｚからなる群から選択される１つ、２つ又は３つの基／原子からなる２価のリンカー基（別称：ラジカル）を示す。

幾つかの実施形態において、－Ｘ－Ｙ－は、－Ｘ－ＣＨ₂－、－Ｘ－ＣＲ^aＲ^b－、－Ｘ－ＣＨＲ^a-、－Ｘ－Ｃ（ＨＣＨ₃）－、－Ｏ－Ｙ－、－Ｏ－ＣＨ₂－、－Ｓ－ＣＨ₂－、－ＮＨ－ＣＨ₂－、－Ｏ－ＣＨＣＨ₃－、－ＣＨ₂－Ｏ－ＣＨ₂、－Ｏ－ＣＨ（ＣＨ₃ＣＨ₃）－、－Ｏ－ＣＨ₂－ＣＨ₂－、ＯＣＨ₂－ＣＨ₂－ＣＨ₂－、－Ｏ－ＣＨ₂ＯＣＨ₂－、－Ｏ－ＮＣＨ₂－、－Ｃ（＝ＣＨ₂）－ＣＨ₂－、－ＮＲ^a－ＣＨ₂－、Ｎ－Ｏ－ＣＨ₂、－Ｓ－ＣＲ^aＲ^b－及び－Ｓ－ＣＨＲ^a－からなる群から選択されるビラジカルを示す。

幾つかの実施形態において、－Ｘ－Ｙ－は、－Ｏ－ＣＨ₂－又は－Ｏ－ＣＨ（ＣＨ₃）－を示す。
式中：Ｚは、－Ｏ－、－Ｓ－、及び－Ｎ（Ｒ^a）－から選択され、
且つＲ^a及び、存在する場合Ｒ^bはそれぞれ独立に、水素、任意に置換されたＣ_1-6－アルキル、任意に置換されたＣ_2-6－アルケニル、任意に置換されたＣ_2-6－アルキニル、ヒドロキシ、任意に置換されたＣ_1-6－アルコキシ、Ｃ_2-6－アルコキシアルキル、Ｃ_2-6－アルケニルオキシ、カルボキシ、Ｃ_1-6－アルコキシカルボニル、Ｃ_1-6－アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ－カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ－カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ及びジ（Ｃ_1-6－アルキル）アミノ、カルバモイル、モノ及びジ（Ｃ_1-6－アルキル）－アミノ－カルボニル、アミノ－Ｃ_1-6－アルキル－アミノカルボニル、モノ及びジ（Ｃ_1-6－アルキル）アミノ－Ｃ_1-6－アルキル－アミノカルボニル、Ｃ_1-6－アルキル－カルボニルアミノ、カルバミド、Ｃ_1-6－アルカノイルオキシ、スルホノ、Ｃ_1-6－アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、Ｃ_1-6－アルキルチオ、ハロゲンから選択され、アリール及びヘテロアリールは任意に置換可能であり、且つ２つのジェミナル置換基Ｒ^a及びＲ^bは一体的に、任意に置換されたメチレン（＝ＣＨ₂）を示す場合があり、全てのキラル中心に対してＲ又はＳ配向のいずれかに非対称基を見出すことが可能である。
Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁵及びＲ^5*は独立に、水素、任意に置換されたＣ_1-6－アルキル、任意に置換されたＣ_2-6－アルケニル、任意に置換されたＣ_2-6－アルキニル、ヒドロキシ、Ｃ_1-6－アルコキシ、Ｃ_2-6－アルコキシアルキル、Ｃ_2-6－アルケニルオキシ、カルボキシ、Ｃ_1-6－アルコキシカルボニル、Ｃ_1-6－アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ－カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ－カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ及びジ（Ｃ_1-6－アルキル）アミノ、カルバモイル、モノ及びジ（Ｃ_1-6－アルキル）－アミノ－カルボニル、アミノ－Ｃ_1-6－アルキル－アミノカルボニル、モノ及びジ（Ｃ_1-6－アルキル）アミノ－Ｃ_1-6－アルキル－アミノカルボニル、Ｃ_1-6－アルキル－カルボニルアミノ、カルバミド、Ｃ_1-6－アルカノイルオキシ、スルホノ、Ｃ_1-6－アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、Ｃ_1-6－アルキルチオ、ハロゲンからなる群から選択され、アリール及びヘテロアリールは任意に置換可能であり、且つ２つのジェミナル置換基は一体的にオキソ、チオキソ、イミノ、又は任意に置換されたメチレンを示しうる。

幾つかの実施形態において、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁵及びＲ^5*は独立にＣ_1-6アルキル、例えば、メチル及び水素などから選択される。

幾つかの実施形態において、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁵及びＲ^5*はいずれも水素である。

幾つかの実施形態において、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³はいずれも水素であり、且つＲ⁵及びＲ^5*のいずれか一方もまた水素であり、且つＲ⁵及びＲ^5*のうちの他方は水素以外、例えばメチルなどのＣ_1-6アルキルである。

幾つかの実施形態において、Ｒ^aは、水素又はメチルのいずれかである。幾つかの実施形態において、Ｒ^bが存在する場合は、水素又はメチルのいずれかである。

幾つかの実施形態において、Ｒ^a及びＲ^bのうちの一方又は両方は、水素である。

幾つかの実施形態において、Ｒ^a及びＲ^bのうちの一方は水素であり、且つ他方は水素以外である。

幾つかの実施形態において、Ｒ^a及びＲ^bのうちのうちの一方はメチルであり、且つ他方は水素である。

幾つかの実施形態において、Ｒ^a及びＲ^bの両方はメチルである。

幾つかの実施形態において、ビラジカル－Ｘ－Ｙ－は、－Ｏ－ＣＨ₂－であり、ＷはＯであり、且つＲ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁵及びＲ^5*の全部がいずれも水素である。そのようなＬＮＡヌクレオシドは、いずれも本明細書において参照により援用されている国際公開第９９／０１４２２６号、国際公開第００／６６６０４号、国際公開第９８／０３９３５２号及び国際公開第２００４／０４６１６０号に開示されており、β－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシド及びα－Ｌ－オキシＬＮＡヌクレオシドとして遍く知られているものが挙げられる。

幾つかの実施形態において、ビラジカル－Ｘ－Ｙ－は、－Ｓ－ＣＨ₂－であり、ＷはＯであり、且つＲ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁵及びＲ^5*の全部がいずれも水素である。そのようなチオＬＮＡヌクレオシドは、国際公開第９９／０１４２２６号及び国際公開第２００４／０４６１６０号に開示されており、これらの文献は本明細書において参照により援用されている。

幾つかの実施形態において、ビラジカル－Ｘ－Ｙ－は、－ＮＨ－ＣＨ₂－であり、ＷはＯであり、且つＲ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁵及びＲ^5*の全部がいずれも水素である。そのようなアミノＬＮＡヌクレオシドは、国際公開第９９／０１４２２６号及び国際公開第２００４／０４６１６０号に開示されており、これらの文献は本明細書において参照により援用されている。

幾つかの実施形態において、ビラジカル－Ｘ－Ｙ－は、－Ｏ－ＣＨ₂－ＣＨ₂－又は－Ｏ－ＣＨ₂－ＣＨ₂－ＣＨ₂－であり、ＷはＯであり、且つＲ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁵及びＲ^5*の全部がいずれも水素である。そのようなＬＮＡヌクレオシドは、本明細書において参照により援用されている国際公開第００／０４７５９９号及びMorita et al, Bioorganic及びMed. Chem. Lett.12 73－76に開示されており、２’－Ｏ－４’Ｃ－エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）として一般に知られているものが含まれる。

幾つかの実施形態において、ビラジカル－Ｘ－Ｙ－は－Ｏ－ＣＨ₂－であり、ＷはＯであり、且つＲ¹、Ｒ²、Ｒ³の全部、並びにＲ⁵及びＲ^5*のうちの一方は水素であり、且つＲ⁵及びＲ^5*のうちの他方は水素以外、例えばメチルなどのＣ_1-6アルキルである。そのような５’置換ＬＮＡヌクレオシドは、国際公開第２００７／１３４１８１号に開示されており、これらの文献は本明細書において参照により援用されている。

幾つかの実施形態において、ビラジカル－Ｘ－Ｙ－は－Ｏ－ＣＲ^aＲ^b－であり、Ｒ^a及びＲ^bのうちの一方又は両方は水素以外、例えばメチルであり、ＷはＯであり、且つＲ¹、Ｒ²、Ｒ³の全部、並びにＲ⁵及びＲ^5*のうちの一方は水素であり、且つＲ⁵及びＲ^5*のうちの他方は水素以外、例えばメチルなどのＣ_1-6アルキルである。そのようなビス修飾ＬＮＡヌクレオシドは、国際公開第２０１０／０７７５７８号に開示されており、これらの文献は本明細書において参照により援用されている。

幾つかの実施形態において、ビラジカル－Ｘ－Ｙ－は、２価のリンカー基－Ｏ－ＣＨ（ＣＨ₂ＯＣＨ₃）－（２’Ｏ－メトキシエチル二環式核酸を示す―Seth at al., 2010, J. Org. Chem. Vol 75（5） pp.1569-81）。幾つかの実施形態において、ビラジカル－Ｘ－Ｙ－は、２価のリンカー基－Ｏ－ＣＨ（ＣＨ₂ＣＨ₃）－（２’Ｏ－エチル二環式核酸を示す―Seth at al., 2010, J. Org. Chem. Vol 75（5） pp.1569-81）。幾つかの実施形態において、ビラジカル－Ｘ－Ｙ－は、－Ｏ－ＣＨＲ^a－であり、ＷはＯであり、且つＲ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁵及びＲ^5*の全部がいずれも水素である。そのような６’置換ＬＮＡヌクレオシドは、国際公開第１００３６６９８号及び国際公開第０７０９００７１号に開示されており、これらの文献は両方とも本明細書において参照により援用されている。

幾つかの実施形態において、ビラジカル－Ｘ－Ｙ－は、－Ｏ－ＣＨ（ＣＨ₂ＯＣＨ₃）－であり、ＷはＯであり、且つＲ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁵及びＲ^5*の全部がいずれも水素である。そのようなＬＮＡヌクレオシドはまた当該技術分野において環状ＭＯＥ（ｃＭＯＥ）としても知られており、且つ国際公開第０７０９００７１号に開示されている。

幾つかの実施形態において、ビラジカル－Ｘ－Ｙ－は、Ｒ－立体配座又はＳ－立体配座にある２価のリンカー基－Ｏ－ＣＨ（ＣＨ₃）－を示す。幾つかの実施形態において、ビラジカル－Ｘ－Ｙ－は一体的に、２価のリンカー基－Ｏ－ＣＨ₂－Ｏ－ＣＨ₂－を示す（Seth at al., 2010, J. Org. Chem）。幾つかの実施形態において、ビラジカル－Ｘ－Ｙ－は、－Ｏ－ＣＨ（ＣＨ₃）－であり、ＷはＯであり、且つＲ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁵及びＲ^5*の全部がいずれも水素である。また、そのような６’メチルＬＮＡヌクレオシドは当該技術分野においてｃＥＴヌクレオシドとしても知られており、（Ｓ）ｃＥＴ又は（Ｒ）ｃＥＴ立体異性体のいずれかであると考えられる。国際公開第０７０９００７１号（β－Ｄ）及び国際公開第２０１０／０３６６９８号（α－Ｌ）に開示されており、これらの文献は両方とも本明細書において参照により援用されている。

幾つかの実施形態において、ビラジカル－Ｘ－Ｙ－は－Ｏ－ＣＲ^aＲ^b－であり、Ｒ^a又はＲ^bはいずれも水素でなく、ＷはＯであり、且つＲ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁵及びＲ^5*の全部がいずれも水素である。幾つかの実施形態において、Ｒ^a及びＲ^bは両方ともメチルである。そのような６’ジ置換ＬＮＡヌクレオシドは国際公開第２００９００６４７８号に開示されており、これらの文献は本明細書において参照により援用されている。

幾つかの実施形態において、ビラジカル－Ｘ－Ｙ－は、－Ｓ－ＣＨＲ^a－であり、ＷはＯであり、且つＲ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁵及びＲ^5*の全部がいずれも水素である。そのような６’置換チオＬＮＡヌクレオシドは、国際公開第１１１５６２０２号に開示されており、これらの文献は本明細書において参照により援用されている。幾つかの6’置換チオＬＮＡ実施形態において、Ｒ^aはメチルである。

幾つかの実施形態において、ビラジカル－Ｘ－Ｙ－は、－Ｃ（＝ＣＨ２）－Ｃ（Ｒ^aＲ^b）－（例えば、－Ｃ（＝ＣＨ₂）－ＣＨ₂－、又は－Ｃ（＝ＣＨ₂）－ＣＨ（ＣＨ₃）－であり、ＷはＯであり、且つＲ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁵及びＲ^5*の全部がいずれも水素である。そのようなビニルカルボＬＮＡヌクレオシドは、国際公開第０８１５４４０１号及び国際公開第０９０６７６４７号に開示されており、これらの文献は両方とも本明細書において参照により援用されている。

幾つかの実施形態において、ビラジカル－Ｘ－Ｙ－は、－Ｎ（－ＯＲ^a）－であり、ＷはＯであり、且つＲ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁵及びＲ^5*の全部がいずれも水素である。幾つかの実施形態において、Ｒ^aは、Ｃ_1-6アルキル、例えばメチルである。そのようなＬＮＡヌクレオシドはまた、Ｎ置換ＬＮＡとしても知られており、且つ国際公開第２００８／１５０７２９号に開示されており、これらの文献は本明細書において参照により援用されている。幾つかの実施形態において、ビラジカル－Ｘ－Ｙ－は一体的に、２価のリンカー基－Ｏ－ＮＲ^a－ＣＨ₃－を示す（Seth at al., 2010, J. Org. Chem）。幾つかの実施形態において、ビラジカル－Ｘ－Ｙ－は、－Ｎ（Ｒ^a）－であり、ＷはＯであり、且つＲ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁵及びＲ^5*の全部がいずれも水素である。幾つかの実施形態において、Ｒ^aは、Ｃ_1-6アルキル、例えばメチルである。

幾つかの実施形態において、Ｒ⁵及びＲ^5*のうちの一方又は両方は、水素であり、且つ置換されている場合、Ｒ⁵及びＲ^5*のうちの他方は、例えばメチルなどのＣ_1-6アルキルである。そのような実施形態において、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³が水素である場合があり、且つビラジカル－Ｘ－Ｙ－は－Ｏ－ＣＨ２－又は－Ｏ－Ｃ（ＨＣＲ^a）－、例えば－Ｏ－Ｃ（ＨＣＨ３）－から選択される場合がある。

幾つかの実施形態において、ビラジカルは、－ＣＲ^aＲ^b－Ｏ－ＣＲ^aＲ^b－、例えば、ＣＨ₂－Ｏ－ＣＨ₂－であり、ＷはＯであり、且つＲ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁵及びＲ^5*の全部がいずれも水素である。幾つかの実施形態において、Ｒ^aは、Ｃ_1-6アルキル、例えばメチルである。そのようなＬＮＡヌクレオシドはまた、立体配座的に制約されたヌクレオチド（ＣＲＮ）としても知られており、且つ国際公開第２０１３０３６８６８号に開示されており、これらの文献は本明細書において参照により援用されている。

幾つかの実施形態において、ビラジカルは、－Ｏ－ＣＲ^aＲ^b－Ｏ－ＣＲ^aＲ^b－（例えば、Ｏ－ＣＨ₂－Ｏ－ＣＨ₂－であり、ＷはＯであり、且つＲ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁵及びＲ^5*の全部がいずれも水素である。幾つかの実施形態において、Ｒ^aは、Ｃ_1-6アルキル、例えばメチルである。そのようなＬＮＡヌクレオシドはまた、ＣＯＣヌクレオチドとしても知られており、且つMitsuoka et al., Nucleic Acids Research 2009 37(4), 1225-1238に開示されている。これらの文献は本明細書において参照により援用されている。

指定されない限り、ＬＮＡヌクレオシドはβ－Ｄ又はα－Ｌ立体異性体でありうることが認識されるであろう。

ＬＮＡヌクレオシドの例は、スキーム１に示されている。
スキーム１

実施例に例証されているように、本発明の幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチド内のＬＮＡヌクレオシドはβ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡヌクレオシドである。

ヌクレアーゼ媒介性分解
ヌクレアーゼ媒介性分解とは、そのような配列一緒になって二本鎖を形成するとき、相補的ヌクレオチド配列の分解を媒介できるオリゴヌクレオチドを指す。

幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、本発明のオリゴヌクレオチドがヌクレアーゼ、特にエンドヌクレアーゼ、好ましくはエンドヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、例えばＲＮアーゼＨを補充する機能を有する標的核酸のヌクレアーゼ媒介性分解を介して機能しうる。ヌクレアーゼ媒介機構を介して作用するオリゴヌクレオチドのデザインの例は、典型的には少なくとも５個又は６個のＤＮＡヌクレオシドを含み、且つ親和性増強ヌクレオシド、例えばギャップマー、ヘッドマー及びテールマーの領域を介して片側もしくは両側に隣接している、オリゴヌクレオチドである。

ＲＮアーゼＨの活性及び補充
アンチセンスオリゴヌクレオチドのＲＮアーゼＨの活性は、相補的ＲＮＡ分子との二本鎖の場合にＲＮアーゼＨを補充する機能を有することを指す。国際公開第０１／２３６１３号には、ＲＮアーゼＨの補充能力を定量化するために使用可能なＲＮアーゼＨ活性を測定するためのインビトロ方法が提供されている。オリゴヌクレオチドは典型的には、相補的な標的核酸配列と共に提供されていると想定した場合、ｐｍｏｌ／ｌ／分で測定される初期速度が、試験対象の修飾オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するが、但しオリゴヌクレオチド中の全てのモノマー間にホスホロチオエート結合を有するＤＮＡモノマーのみを含有するオリゴヌクレオチドを用い、且つ国際公開第０１／２３６１３号（本明細書において参照により援用されている）の実施例９１～９５により提供されている方法論を用いて測定された初期速度の、少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％又は２０％超であるときに、ＲＮアーゼＨを補充する機能を有すると見なされる。

ギャップマー
本明細書中に用いられている「ギャップマー」という用語は、１つ以上の親和性増強修飾ヌクレオシド（フランクもしくはウイング）を含む領域を介して５’及び３’に隣接するＲＮアーゼＨ補充オリゴヌクレオチド（ギャップ）の領域を含んだアンチセンスオリゴヌクレオチドを指す。本明細書中に記載されているギャップマーデザインには様々な種類がある。ヘッドマー及びテールマーは、フランクの１つが欠落した、すなわち、オリゴヌクレオチドの末端のうちの一方のみが親和性増強修飾ヌクレオシドを含む、ＲＮアーゼＨを補充する機能を有するオリゴヌクレオチドである。ヘッドマーの場合、３’フランクが欠落しており（すなわち、５’フランクが親和性修飾ヌクレオシドを含み）、テールマーの場合、５’フランクが欠落している（すなわち、３’フランクが親和性修飾ヌクレオシドを含む）。

ＬＮＡギャップマー
ＬＮＡギャップマーという用語は、親和性増強修飾ヌクレオシドのうちの少なくとも１つがＬＮＡヌクレオシドである、ギャップマーオリゴヌクレオチドをいう。

混合ウイングギャップマー
混合ウイングギャップマーという用語は、フランク領域が少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシド及び少なくとも１つの非ＬＮＡ修飾ヌクレオシド、例えば、少なくとも１つのＤＮＡヌクレオシド又は少なくとも１つの２’置換修飾ヌクレオシド、例えば２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＲＮＡ及び２’－Ｆ－ＡＮＡヌクレオシド（類）である、ＬＮＡギャップマーを指す。幾つかの実施形態において、混合ウイングギャップマーの一方のフランクはＬＮＡヌクレオシド（例えば５’又は３’）を含み、他方のフランク（それぞれ３’又は５’）は２’置換修飾ヌクレオシドを含む。

コンジュゲート
本明細書中に用いられている「コンジュゲート」という用語は、非ヌクレオチド残基（コンジュゲート残基、又は領域Ｃもしくは第３の領域）に共有結合しているオリゴヌクレオチドを指す。

本明細書中に用いられている「コンジュゲート」という用語は、非ヌクレオチド残基（コンジュゲート残基、又は領域Ｃもしくは第３の領域）に共有結合しているオリゴヌクレオチドを指す。

幾つかの実施形態において、非ヌクレオチド残基は、酵素、抗体又は抗体フラグメント又はペプチドなどのタンパク質；脂質、リン脂質、ステロールなどの親油性残基；ポリエチレングリコール又はポリプロピレングリコールなどのポリマー；受容体リガンド；小分子；レポーター分子；及び非ヌクレオシド炭水化物からなる群から選択される。

リンカー
連結基又はリンカーは、１つ以上の共有結合を介して関心対象の或る化学基もしくはセグメントを関心対象の別の化学基もしくはセグメントに連結する、２つの原子間の結合である。コンジュゲート残基は、オリゴヌクレオチドに対し直接的に、又は連結残基（例えば、リンカー又はテザー）を介して結合しうる。リンカーは、第３の領域（例えばコンジュゲート残基）を、オリゴヌクレオチド、例えば領域Ａ又はＣの末端に共有結合するのに役立つ。

本発明の幾つかの実施形態において、本発明のコンジュゲート又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、オリゴヌクレオチドとコンジュゲート残基との間に位置するリンカー領域を任意に含みうる。幾つかの実施形態において、コンジュゲートとオリゴヌクレオチドとの間のリンカーは生物学的に開裂可能である。

生物学的に開裂可能なリンカーは、通常遭遇する又は哺乳動物の体内で遭遇するものと類似の条件下で開裂可能な生理学的に不安定な結合を含むか又はその結合からなる。生理的に不安定なリンカーが化学変換（例えば開裂）を受ける条件としては、ｐＨ、温度、酸化的もしくは還元的条件、又は薬剤などの化学的条件、並びに哺乳動物細胞に見られる、又はそれに類似の塩濃度が挙げられる。哺乳動物の細胞内条件としては、タンパク質分解酵素、哺乳動物細胞内に通常存在する加水分解酵素又はヌクレアーゼなどからの酵素活性の存在も挙げられる。一実施形態において、生物学的に開裂可能なリンカーは、Ｓ１ヌクレアーゼ開裂を受けやすい。好ましい実施形態において、ヌクレアーゼ感受性リンカーは、１～１０個のヌクレオシド、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個もしくは１０個のヌクレオシド、より好ましくは２～６個のヌクレオシド、最も好ましくは２～４個の結合ヌクレオシドを含み、このヌクレオシドは、少なくとも２つの連続ホスホジエステル結合、例えば少なくとも３個、４個又は５個の連続ホスホジエステル結合を含む。ヌクレオシドはＤＮＡ又はＲＮＡであることが好ましい。ホスホジエステル含有生分解性リンカーは、国際公開第２０１４／０７６１９５号（本明細書において参照により援用されている）に更に詳細に記載されており、本明細書中で領域Ｄとして言及される場合がある。

コンジュゲートはまた、非生体開裂性リンカーを介してオリゴヌクレオチドに連結されてもよく、又は幾つかの実施形態において、コンジュゲートは、生体開裂性リンカーに共有結合している非開裂性リンカーを含む場合がある。必ずしも生物学的に開裂可能である必要はないが、主に、コンジュゲート残基をオリゴヌクレオチド又は生物学的に開裂可能なリンカーに共有結合させるのに役立つ。そのようなリンカーは、エチレングリコール、アミノ酸単位もしくはアミノアルキル基などの繰り返し単位の、鎖状構造又はオリゴマーを含む場合がある。幾つかの実施形態において、リンカー（領域Ｙ）は、アミノアルキル、例えば、Ｃ₆～Ｃ₁₂アミノアルキル基などのＣ₂～Ｃ₃₆アミノアルキル基である。幾つかの実施形態において、リンカー（領域Ｙ）は、Ｃ６アミノアルキル基である。コンジュゲートリンカー基は、アミノ修飾オリゴヌクレオチド、及びコンジュゲート基上の活性化エステル基を使用してオリゴヌクレオチドにルーチン的に結合可能である。

処置
本明細書中に用いられている「治療」という用語は、既存の疾患（例えば、本明細書中に言及されるような疾患もしくは障害）の治療、又は疾患予防、すなわち予防処置の両方を指す。したがって、幾つかの実施形態において本明細書中に言及されている治療は予防処置的でありうることが認識されるであろう。

発明の詳細な説明

本発明のオリゴヌクレオチド
本発明は、ＨＴＲＡ１の発現を阻害する機能を有するオリゴヌクレオチドに関する。この調節は、ＨＴＲＡ１をコードするか又はＨＴＲＡ１の調節に関与する標的核酸とハイブリダイズさせることによって、達成することが可能である。標的核酸は、哺乳動物ＨＴＲＡ１配列、例えば、配列ＩＤ１、２、３又は４からなる群から選択される配列でありうる。

本発明のオリゴヌクレオチドは、ＨＴＲＡ１（例えば哺乳動物ＨＴＲＡ１）を標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。

幾つかの実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的の発現を阻害又は下方制御によって調節する機能を有する。そのような調節によって、標的の正常な発現レベルと比較して発現が少なくとも２０％阻害され、標的の通常の発現レベルと比較して例えば少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％阻害されることが好ましい。幾つかの実施形態において、本発明の化合物は、ＡＲＰＥ－１９細胞を用いて、ＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡの発現レベルをインビトロで少なくとも６０％又は７０％まで阻害できる可能性がある。幾つかの実施形態において、本発明の化合物は、ＲＰＥ－１９細胞を用いて、ＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡの発現レベルをＡインビトロで少なくとも６０％又は７０％まで阻害できる可能性がある。幾つかの実施形態において、本発明の化合物は、ＡＲＰＥ－１９細胞を用いて、ＨＴＲＡ１タンパク質の発現レベルをインビトロで少なくとも５０％まで阻害できる可能性がある。実施例は、ＨＴＲＡ１ ＲＮＡ又はタンパク質の阻害の測定に使用可能なアッセイを提供するものが好適である（例えば実施例３）。標的調節は、オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列と標的核酸との間のハイブリダイゼーションによって誘発される。幾つかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間のミスマッチを含む。ミスマッチにもかかわらず、標的核酸へのハイブリダイゼーションは、ＨＴＲＡ１の発現の所望の調節を示すうえで依然として充分でありうる。ミスマッチに起因する結合親和性の低下は、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチド数を増加させることによって、且つ／あるいは標的への結合親和性を増強する機能を有する修飾ヌクレオシド、例えば、オリゴヌクレオチド配列内に存在する、ＬＮＡなどの２’修飾ヌクレオシドの数を増加させることによって、補償するのが有利であると思われる。

本発明の一態様は、配列番号１、２、３及び４からなる群から選択される核酸などのＨＴＲＡ１標的配列に対して少なくとも９０％相補的である、例えば、ＨＴＲＡ１標的配列に対して完全に相補的である、１０～３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド領域を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。

幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、標的核酸の領域に対して少なくとも９０％相補的、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％もしくは１００％相補的である連続配列を含む。

幾つかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列が標的核酸の領域に対して完全に相補的（１００％相補的）である場合もあれば、あるいは、幾つかの実施形態では、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間に１つ又は２つのミスマッチを含む場合もある。

幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチド、又はその少なくとも１２ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、配列番号１４７の領域に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に（すなわち１００％）相補的である。

幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチド、又はその少なくとも１２ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、配列番号１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４及び１５５からなる群から選択される配列の領域に対して少なくとも９０％相補的、例えば、完全に（すなわち１００％）相補的である。

幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチド、又はその少なくとも１４ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、配列ＩＤ１４７、又は配列番号１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４及び１５５からなる群から選択される配列に対して完全に（すなわち１００％）相補的である。

幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチド、又はその少なくとも１６ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、配列ＩＤ１４７、又は配列番号１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４及び１５５からなる群から選択される配列に対して完全に（すなわち１００％）相補的である。

幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド領域は、配列番号１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４及び１５５からなる群から選択される配列に対して完全に（すなわち１００％）相補的である。

幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド領域は、配列番号１４３、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４４及び１４５
配列番号１４３：ＴＡＴＴＴＡＣＣＴＧＧＴＴＧＴＴ
配列番号１３８：ＣＡＡＡＴＡＴＴＴＡＣＣＴＧＧＴＴＧ
配列番号１３９：ＴＴＴＡＣＣＴＧＧＴＴＧＴＴＧＧ
配列番号１４０：ＣＣＡＡＡＴＡＴＴＴＡＣＣＴＧＧＴＴ
配列番号１４１：ＣＣＡＡＡＴＡＴＴＴＡＣＣＴＧＧＴＴＧＴ
配列番号１４２：ＡＴＡＴＴＴＡＣＣＴＧＧＴＴＧＴＴＧ
配列番号１４４：ＡＴＡＴＴＴＡＣＣＴＧＧＴＴＧＴ
配列番号１４５：ＡＴＡＴＴＴＡＣＣＴＧＧＴＴＧＴＴ
からなる群から選択される配列を含むか又はその配列からなる。

オリゴヌクレオチドモチーフ配列は、例えば、ヌクレアーゼ耐性及び／又は標的核酸に対する結合親和性を増強するように修飾できることが理解される。修飾は、「定義」及び「オリゴヌクレオチドのデザイン」の節に記載されている。

本発明のオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド領域は、幾つかの実施形態において、標的核酸の領域に対して完全に相補的（１００％相補的）であり、あるいは幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間に１つ又は２つのミスマッチを含む場合がある。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチド、又はその少なくとも１２ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、標的核酸配列に対して少なくとも９０％相補的、例えば、完全に（すなわち１００％）相補的である。

幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチド、又はその少なくとも１２ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、配列番号５～１０７もしくは配列番号１０８～１３７からなる群から選択される配列に対して１００％の同一性を有する。

幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチド、又はその少なくとも１４ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、配列番号５～１０７もしくは配列番号１０８～１３７からなる群から選択される配列に対して１００％の同一性を有する。

幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチド、又は少なくとも１６ヌクレオチドのその連続ヌクレオチド配列は、配列番号５～１０７、又は配列番号１０８～１３７からなる群から選択される配列に対して１００％の同一性を有する。

幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド領域は、配列番号５～１０７もしくは配列番号１０８～１３７から選択される配列を含むか又はその配列からなる。

幾つかの実施形態において、本発明の化合物は、以下からなる群から選択される。

配列中：大文字はβ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、全てのＬＮＡシトシンは５－メチルシトシン（上付き文字^mで示す）であり、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表す。全てのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である（下付き文字_sで示してある）。

オリゴヌクレオチドのデザイン
オリゴヌクレオチドのデザインは、オリゴヌクレオチド配列中のヌクレオシド糖修飾のパターンを指す。本発明のオリゴヌクレオチドは、糖修飾ヌクレオシドを含み、且つまた、ＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドを含む場合もある。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは糖修飾ヌクレオシド及びＤＮＡヌクレオシドを含む。本発明のオリゴヌクレオチドに修飾ヌクレオシドを取り込むことによって、標的核酸に対するオリゴヌクレオチドの親和性を増強することが可能である。その事例において、修飾ヌクレオシドは、親和性増強修飾ヌクレオチドと称される場合がある。

或る実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１個の修飾ヌクレオシド、例えば、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５又は少なくとも１６個の修飾ヌクレオシドを含む。或る実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１～１０個の修飾ヌクレオシド、例えば、２～９個の修飾ヌクレオシド、３～８個の修飾ヌクレオシド、４～７個の修飾ヌクレオシド、６個又は７個の修飾ヌクレオシドを含む。或る実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは修飾を含む場合があり、この修飾は独立に、これら３つのタイプの修飾（修飾糖、修飾核酸塩基及び修飾ヌクレオシド間結合）又はそれらの組み合わせから選択される。オリゴヌクレオチドは１つ以上の糖修飾ヌクレオシド、例えば、糖修飾ヌクレオシドを含むことが好ましい。本発明のオリゴヌクレオチドは、独立に、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’－フルオロ－ＡＮＡ及びＬＮＡヌクレオシドからなる群から選択される１つ以上の２’糖修飾ヌクレオシドを含むことが好ましい。１つ以上の修飾ヌクレオシドがＬＮＡであることは、更により好ましい。

幾つかの実施形態において、修飾ヌクレオシドのうち少なくとも１個は、ロックド核酸（ＬＮＡ）であり、例えば修飾ヌクレオシドのうち少なくとも２個（少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個もしくは少なくとも８個）はＬＮＡである。更に別の実施形態において、全ての修飾ヌクレオシドはＬＮＡである。

更なる実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合を含む。好ましい実施形態において、隣接ヌクレオチド配列内のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート又はボラノホスフェートのヌクレオシド間結合である。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの連続配列内の全てのヌクレオチド間結合はホスホロチオエート結合である。

本発明のオリゴヌクレオチドの幾つかの実施形態において、少なくとも１つの修飾ヌクレオシドを含み、この修飾ヌクレオシドは２’－ＭＯＥ－ＲＮＡ、例えば２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個もしくは１０個の２’－ＭＯＥ－ＲＮＡヌクレオシド単位である。幾つかの実施形態において、前記修飾ヌクレオシドのうちの少なくとも１つは２’－フルオロＤＮＡ、例えば２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個もしくは１０個の２’－フルオロ－ＤＮＡヌクレオシド単位である。

幾つかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個もしくは８個のＬＮＡ単位などの少なくとも１つのＬＮＡ単位、例えば２～６個のＬＮＡ単位、３～７個のＬＮＡ単位、４～８個のＬＮＡ単位又は３個、４個、５個、６個、７個のＬＮＡ単位などを含む。幾つかの実施形態において、全ての修飾ヌクレオシドはＬＮＡヌクレオシドである。幾つかの実施形態において、全てのＬＮＡシトシン単位は５－メチル－シトシンである。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド領域は、ヌクレオチド配列の５’末端に少なくとも１つのＬＮＡ単位を有し、且つ３’末端に少なくとも２つのＬＮＡ単位を有する。幾つかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチド内に存在する全てのシトシン核酸塩基は、５－メチル－シトシンである。

幾つかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＬＮＡ単位及び少なくとも１つの２’置換修飾ヌクレオシドを含む。

本発明の幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、２’糖修飾ヌクレオシド及びＤＮＡ単位の両方を含む。

本発明の一実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＲＮアーゼＨを補充する機能を有する。

本発明のオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド領域は、幾つかの実施形態において、ギャップマーオリゴヌクレオチドである。

ギャップマーデザイン
幾つかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド領域は、本明細書中で単に「ギャップマー」とも呼ばれる、ギャップマーデザイン又はギャップマー構造を有する。ギャップマー構造において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも５つの個別の構造領域、５’フランク、ギャップ及び３’フランク、Ｆ－Ｇ－Ｆ’を「５’→３’」の配向にて含む。このデザインにおいて、フランキング領域Ｆ及びＦ’（別称：ウイング領域）は、領域Ｇに隣接する少なくとも１つの糖修飾ヌクレオシドを含み、幾つかの実施形態において、２～７個の糖修飾ヌクレオシドの連続ストレッチ、又は糖修飾及びＤＮＡヌクレオシドの連続ストレッチ（糖修飾及びＤＮＡヌクレオシドの両方を含む混合ウイング）を含む場合がある。結果として、ギャップ領域に隣接する５’フランキング領域及び３’フランキング領域のヌクレオシドは、２’修飾ヌクレオシドなどの糖修飾ヌクレオシドである。オリゴヌクレオチドがＨＴＲＡ１標的核酸と二重鎖を成す場合、ギャップ領域Ｇは、ＲＮアーゼＨを補充する機能を有するヌクレオチドの連続ストレッチを含む。幾つかの実施形態において、領域Ｇは、５～１６個のＤＮＡヌクレオシドの連続ストレッチを含む。ギャップマー領域Ｆ－Ｇ－Ｆ’は、ＨＴＲＡ１標的核酸に対して相補的であり、それゆえ、オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域でありうる。

領域Ｇの５’末端及び３’末端に隣接する領域Ｆ及びＦ’は、１つ以上の親和性増強修飾ヌクレオシドを含む場合がある。幾つかの実施形態において、３’フランクに含まれるＬＮＡヌクレオシドは少なくとも１つであり、少なくとも２つのＬＮＡヌクレオシドが含まれることが好ましい。幾つかの実施形態において、５’フランクは、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシドを含む。幾つかの実施形態では、５’フランキング領域及び３’フランキング領域の両方が、ＬＮＡヌクレオシドを含む。幾つかの実施形態では、フランキング領域の全てのヌクレオシドが、ＬＮＡヌクレオシドである。他の実施形態において、フランキング領域は、ＬＮＡヌクレオシド及びＤＮＡヌクレオシドなどの他のヌクレオシド（混合フランク）の両方、並びに／又は２’置換ヌクレオシドなどの非ＬＮＡ修飾ヌクレオシドを含む場合がある。この事例において、ギャップは、５’及び３’末端にＬＮＡ、例えばβ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡなどの親和性増強修飾ヌクレオシドが隣接する少なくとも５つのＲＮアーゼＨ補充ヌクレオシド（５～１６個のＤＮＡヌクレオシドなど）の連続配列として定義される。

領域Ｆ
領域Ｇの５末端に結合された領域Ｆ（５’フランクもしくは５’ウイング）は、少なくとも１つの糖修飾ヌクレオシド、例えば、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個の修飾ヌクレオシドを含むか、含有するか、又はその糖修飾ヌクレオシドからなる。幾つかの実施形態において、領域Ｆは、１～７個の修飾ヌクレオシド、例えば２～６個の修飾ヌクレオシド、例えば２～５個の修飾ヌクレオシド、例えば２～４個の修飾ヌクレオシド、例えば１～３個の修飾ヌクレオシド、例えば１個、２個、３個もしくは４個の修飾ヌクレオシドを含むか、又はその修飾ヌクレオシドからなる。

或る実施形態では、領域Ｆ内の修飾ヌクレオシドのうちの１つ以上又は全部が、２’修飾ヌクレオシドである。

更なる実施形態において、領域Ｆの１つ以上の２’修飾ヌクレオシドは、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ単位、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ単位、２’－フルオロ－ＤＮＡ単位、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、ＭＯＥ単位、ＬＮＡ単位、アラビノ核酸（ＡＮＡ）単位及び２’－フルオロ－ＡＮＡ単位から選択される。

本発明の一実施形態では、領域Ｆ内の全ての修飾ヌクレオシドはＬＮＡヌクレオシドである。更なる実施形態において、領域ＦのＬＮＡヌクレオシドは独立に、β－Ｄ立体配座又はα－Ｌ立体配座のいずれかにおける、オキシ－ＬＮＡ、チオ－ＬＮＡ、アミノ－ＬＮＡ、ｃＥＴ及び／もしくはＥＮＡ、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。好ましい実施形態において、領域Ｆは、連続配列の５’末端に少なくとも１つのβ－Ｄ－オキシＬＮＡ単位を有する。

領域Ｇ
領域Ｇ（ギャップ領域）は、ＲＮアーゼＨを補充する機能を有する５～１６個の連続ＤＮＡヌクレオシドを含むか、含有するか、又はその連続ＤＮＡヌクレオシドからなる場合がある。更なる実施形態において、領域Ｇは、ＲＮアーゼＨを補充する機能を有する５～１２個、もしくは６～１０個、もしくは７～９個、例えば８個、の連続ヌクレオチド単位を含むか、含有するか、又はその連続ヌクレオチド単位からなる。

更に別の実施形態では、領域Ｇ内の少なくとも１つのヌクレオシド単位が、ＤＮＡヌクレオシド単位、例えば４～２０個又は６～１８個、５～１６個など、のＤＮＡ単位であり、幾つかの実施形態では、領域Ｇ内の全てのヌクレオシドがＤＮＡ単位である。

更なる実施形態において、領域Ｇは、ＤＮＡと、ＲＮアーゼＨの開裂を媒介しうる他のヌクレオシドとの混合物からなる場合がある。幾つかの実施形態において、領域Ｇのヌクレオシドの少なくとも５０％は、ＤＮＡで占められる、例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％がＤＮＡで占められる。

領域Ｆ’
領域Ｇの３つの端部に付着された領域Ｆ’（３’フランクもしくは３’ウイング）は、少なくとも１つの糖修飾ヌクレオシド、例えば、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個の修飾ヌクレオシドを含むか、含有するか、又はその糖修飾ヌクレオシドからなる。幾つかの実施形態において、領域Ｆ’は、１～７個の修飾ヌクレオシド、例えば、２～６個の修飾ヌクレオシド、２～５個の修飾ヌクレオシド、２～４個の修飾ヌクレオシド、１～３個の修飾ヌクレオシド、１個、２個、３個もしくは４個の修飾ヌクレオシドを含むか又はその修飾ヌクレオシドからなる。

或る実施形態では、領域Ｆ’の修飾ヌクレオシドの１つ以上又は全部が、２’修飾ヌクレオシドである。

更なる実施形態において、領域Ｆ’内の１つ以上の２’修飾ヌクレオシドは、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ単位、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ単位、２’－フルオロ－ＤＮＡ単位、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、ＭＯＥ単位、ＬＮＡ単位、アラビノ核酸（ＡＮＡ）単位及び２’－フルオロ－ＡＮＡ単位から選択される。

本発明の一実施形態では、領域Ｆ’内の全ての修飾ヌクレオシドが、ＬＮＡヌクレオシドである。更なる実施形態において、領域Ｆ’内のＬＮＡヌクレオシドは独立に、β－Ｄ又はα－Ｌ立体配座のいずれかにおけるオキシ－ＬＮＡ、チオ－ＬＮＡ、アミノ－ＬＮＡ、ｃＥＴ、及び／もしくはＥＮＡ、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。好ましい実施形態において、領域Ｆ’は、連続配列の５’末端に少なくとも１つのβ－Ｄ－オキシＬＮＡ単位を有する。

領域Ｄ、Ｄ’及びＤ”
本発明のオリゴヌクレオチドは、標的核酸に対して相補的である連続ヌクレオチド領域を含む。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、本明細書中で領域Ｄと称される連続ヌクレオチド領域の５’及び／又は３’に位置する追加的なヌクレオチドを更に含む場合がある。領域Ｄ’及びＤ”はそれぞれ、領域Ｆの５’末端又は領域Ｆ’の３’末端に結合することが可能である。Ｄ領域（領域Ｄ’又はＤ”）は、幾つかの実施形態では、標的核酸に対して相補的な連続ヌクレオチド配列の一部を形成する場合があり、あるいは他の実施形態では、標的核酸に対して非相補的である場合がある。

幾つかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、連続ヌクレオチド領域、及び任意で１～５個の追加的な５’ヌクレオチド（領域Ｄ’）からなるか又はその５’ヌクレオチドを含む。

幾つかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、連続ヌクレオチド領域、及び任意で１～５個の追加的な３’ヌクレオチド（領域Ｄ”）からなるか又はその３’ヌクレオチドを含む。

領域Ｄ’又はＤ”は独立に１個、２個、３個、４個もしくは５個の追加的なヌクレオチドを含む場合があり、このヌクレオチド標的核酸に対して相補的又は非相補的でありうる。この点に関して、幾つかの実施形態における本発明のオリゴヌクレオチドは、追加的なヌクレオチドを介して５’及び／又は３’末端に隣接する標的を調節する機能を有する連続ヌクレオチド配列を含む場合がある。そのような追加的なヌクレオチドは、ヌクレアーゼ感受性の生体開裂性リンカーとして機能しうるため、本発明のオリゴヌクレオチドに対しコンジュゲート残基などの官能基を結合させる目的に使用される場合がある。幾つかの実施形態において、追加的な５’、及び／もしくは３’末端ヌクレオチドは、ホスホジエステル結合で連結され、ＤＮＡ又はＲＮＡでありうる。別の実施形態では、追加的な５’及び／又は３’末端ヌクレオチドは、例えば、ヌクレアーゼの安定性増強、又は合成の容易化を目的に取り入れられる場合のある、修飾ヌクレオチドである。幾つかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、連続ヌクレオチド領域だけでなく、領域Ｄ’及び／又はＤ”も含む。

幾つかの実施形態において、本発明のギャップマーオリゴヌクレオチドは、以下の式で表すことができる。
Ｆ－Ｇ－Ｆ’；特にＦ_1-7－Ｇ_4-12~Ｆ’_1-7
Ｄ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’、特にＤ’_1-3－Ｆ_1-7－Ｇ_4-12~Ｆ’_1-7
Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ”、特にＦ_1-7－Ｇ_4-12~Ｆ’_1-7－Ｄ”_1-3
Ｄ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ”、特にＤ’_1-3－Ｆ_1-7－Ｇ_4-12~Ｆ’_1-7－Ｄ”_1-3

製造方法
更なる態様において、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドを製造する方法を提供する。本方法は、ヌクレオチド単位を反応させることによって、オリゴヌクレオチド内に含まれる共有結合された連続ヌクレオチド単位を形成することを含む。本方法は、フォフォラミダイト化学を用いるものであるのが好ましい（例えば、Caruthers et al, 1987, Methods in Enzymology vol. 154, pages 287-313を参照）。更なる実施形態において、本方法は更に、連続ヌクレオチド配列をコンジュゲート残基（リガンド）と反応させることを含む。更なる態様では、本発明のオリゴヌクレオチド又は共役オリゴヌクレオチドを、医薬的に許容される希釈剤、溶媒、担体、塩及び／もしくはアジュバントと混合することを含む、本発明の組成物の製造方法が提供されている。

医薬塩
本発明のオリゴヌクレオチドは、治療剤として用いることを目的に、ナトリウム塩又はカリウム塩などの好適な医薬塩として提供される場合がある。幾つかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドはナトリウム塩である。

医薬組成物
更なる態様において、本発明は、前述のオリゴヌクレオチド、及び／又はオリゴヌクレオチドコンジュゲート、並びに医薬的に許容される希釈剤、溶媒、担体、塩及び／又はアジュバントのいずれかを含む医薬組成物を提供する。医薬的に許容される希釈剤は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。医薬的に許容される塩としては、限定されないが、ナトリウム及びカリウム塩が挙げられる。幾つかの実施形態において、医薬的に許容される希釈剤は、滅菌リン酸緩衝生理食塩水である。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、５０～３００μＭの濃度の医薬的に許容される希釈剤中に使用される。本発明のオリゴヌクレオチドの幾つかの実施形態において、１０～１０００μｇの用量で投与される。

本明細書において参照により援用されている国際公開第２００７／０３１０９１号には、医薬的に許容される希釈剤、担体及びアジュバントの好適且つ好ましい例が提供されている。また、国際公開第２００７／０３１０９１号には、好適な投薬量、製剤、投与経路、組成物、剤形、他の治療剤との組み合わせ、プロドラッグ製剤も提供されている。

本発明のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートを、医薬的に許容される活性物質又は不活性物質と混合することによって、医薬組成物又は製剤を調製することが可能である。医薬組成物の製剤のための組成物及び方法は、限定されないが、投与経路、疾患の程度、又は投与すべき用量をはじめとする幾つかの基準に依存する。

幾つかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、プロドラッグである。特に、オリゴヌクレオチドコンジュゲートに関して、プロドラッグが作用部位、例えば標的細胞、に送達されると、コンジュゲート残基はオリゴヌクレオチドから開裂される。

用途
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、診断薬、治療薬及び予防のための研究試薬として利用できる。

そのようなオリゴヌクレオチドを研究に用いることで、細胞（例えばインビトロ細胞培養物）、及び実験動物におけるＨＴＲＡ１タンパク質の合成を特異的に調節し、それにより、標的の機能分析又はその有用性の評価を、治療介入の標的として容易化することが可能である。典型的には、タンパク質を産生するｍＲＮＡを分解又は阻害し、それにより、タンパク質形成を妨げるか、あるいはタンパク質を産生する遺伝子もしくはｍＲＮＡのモジュレーターを分解又は阻害することによって、標的調節が達成される。

ノーザンブロッティング、インシチュ・ハイブリダイゼーション又は類似の技術を介して細胞及び組織内でのＨＴＲＡ１の発現を検出し定量することを目的に、診断にオリゴヌクレオチドが使用される場合もある。

治療用に、疾患又は障害を有する疑いのある動物又はヒトは、ＨＴＲＡ１の発現を調節することによって治療可能である。

本発明は、疾患を治療もしくは予防するための方法を提供する。本方法は、治療上もしくは予防上有効な量のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート、又は本発明の医薬組成物を、疾患に罹患しているか又は罹患しがちな被験者に投与することを含む。

本発明はまた、医薬品として用いるための、本明細書中に定義されているオリゴヌクレオチド、組成物又はコンジュゲートにも関する。

本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート又は医薬組成物は典型的に、有効量にて投与される。

本発明はまた、本明細書中に言及されている障害を治療するための薬剤の製造、又は本明細書中に言及されている障害を治療するための方法に関して記載されている、本発明のオリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドコンジュゲートの使用を提供する。

本明細書中に言及されている疾患又は障害は、ＨＴＲＡ１の発現に関連する。幾つかの実施形態において、疾患又は障害は、ＨＴＲＡ１遺伝子における突然変異、又はそのタンパク質産物がＨＴＲＡ１と関連もしくは相互作用する遺伝子における突然変異と関連する場合がある。したがって、幾つかの実施形態において、標的核酸は、ＨＴＲＡ１配列の変異型であり、他の実施形態では、標的核酸は、ＨＴＲＡ１配列のレギュレーターである。

本発明の方法は、ＨＴＲＡ１のレベル及び／又は活性が異常になった場合に引き起こされる疾患の治療又は予防を目的に使用するのが好ましい。

本発明は更に、ＨＴＲＡ１のレベル及び／又は活性の異常の治療を目的とした薬品製造用の本明細書中に定義されているオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート又は医薬組成物の使用に関する。

一実施形態では、本発明は、乾性ＡＭＤもしくは湿性ＡＭＤなどの加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）などの黄斑変性症、及び糖尿病性網膜症をはじめとする眼疾患から選択される疾患もしくは障害の治療に使用することを目的としたものである、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート又は医薬組成物に関する。幾つかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドコンジュゲート又は医薬組成物は、地理学的萎縮もしくは中間体ｄＡＭＤの治療において使用される場合がある。ＨＴＲＡ１は、アルツハイマー病及びパーキンソン病においても適応とされており、したがって、幾つかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドコンジュゲート又は医薬組成物は、アルツハイマー病又はパーキンソン病の治療において使用される場合がある。ＨＴＲＡ１は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、変形性関節症などの関節炎、家族性虚血性大脳小血管疾患においても適応とされている。それゆえ、幾つかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドコンジュゲート又は医薬組成物は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、変形性関節症などの関節炎、又は家族性虚血性大脳小血管疾患において使用される場合がある。

投与
本発明のオリゴヌクレオチド又は医薬組成物は、局所的に（例えば、皮膚、吸入、眼又は耳に）、あるいは経腸（例えば、経口又は胃腸管経由で）、あるいは非経口（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、大脳内、脳室内又は髄腔内に）投与することが可能である。

幾つかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチド、コンジュゲート又は医薬組成物は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内もしくは筋肉内注射又は注入、くも膜下腔内又は頭蓋内、例えば、髄腔内又は頭蓋内、脳室内もしくは脳室内投与など、の経路を含む、非経口経路によって投与される。幾つかの実施形態において、活性オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、静脈内投与される。別の実施形態において、活性オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、皮下投与する。

黄斑変性症、例えばＡＭＤ（湿性又は乾性）などの眼疾患の治療用に、眼内注射が用いられる場合もある。

幾つかの実施形態において、本発明の化合物、又はその医薬的に許容される塩は、約５０μｇ～約１５０μｇ／片眼、例えば約１００μｇ／片眼（約１０μｇ～約２００μｇ／片眼）の用量の眼内注射によって投与される。幾つかの実施形態において、投薬間隔、すなわち連続投薬の間の期間は少なくとも毎月１回、例えば、少なくとも２か月毎に１回、又は少なくとも３か月毎に１回、である。

併用療法
幾つかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート又は医薬組成物は、他の治療剤との併用治療に使用することを目的としたものである。治療剤は、例えば、上記疾患又は障害に対する標準治療とされる場合がある。

本発明の実施形態
実施形態１
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号１４７：
配列番号１４７：５’ＣＣＡＡＣＡＡＣＣＡＧＧＴＡＡＡＴＡＴＴＴＧ３’に対して少なくとも９０％、例えば１００％、相補的である１０～２２個のヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域を含む、１０～３０ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

実施形態２
アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡの発現を阻害する機能を有する、実施形態１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

実施形態３
連続ヌクレオチド領域が、配列番号１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４及び１４５：
配列番号１３８：ＣＡＡＡＴＡＴＴＴＡＣＣＴＧＧＴＴＧ
配列番号１３９：ＴＴＴＡＣＣＴＧＧＴＴＧＴＴＧＧ
配列番号１４０：ＣＣＡＡＡＴＡＴＴＴＡＣＣＴＧＧＴＴ
配列番号１４１：ＣＣＡＡＡＴＡＴＴＴＡＣＣＴＧＧＴＴＧＴ
配列番号１４２：ＡＴＡＴＴＴＡＣＣＴＧＧＴＴＧＴＴＧ
配列番号１４３：ＴＡＴＴＴＡＣＣＴＧＧＴＴＧＴＴ
配列番号１４４：ＡＴＡＴＴＴＡＣＣＴＧＧＴＴＧＴ
配列番号１４５：ＡＴＡＴＴＴＡＣＣＴＧＧＴＴＧＴＴ
からなる群から選択される配列内に存在する配列と同一である、実施形態１又は２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
実施形態４
連続ヌクレオチド領域が、配列番号１４６：
配列番号１４６：ＴＴＴＡＣＣＴＧＧＴＴ
の配列を含む、実施形態１から３の何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

実施形態５
オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域が、配列番号１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４及び１４５のいずれか１つから選択される配列からなるか又はその配列を含む、実施形態１から４の何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

実施形態６
オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域が、１つ以上の２’糖修飾ヌクレオシドを含む、実施形態１から５の何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

実施形態７
１つ以上の２’糖修飾ヌクレオシドが独立に２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＤＮＡ、アラビノ核酸（ANA）、２’－フルオロ－ANA及びＬＮＡヌクレオシドからなる群から選択される、実施形態６に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

実施形態８
１つ以上の修飾ヌクレオシドがＬＮＡヌクレオシドである、実施形態５～７のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

実施形態９
オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域が、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合、例えば１つ以上のホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む、実施形態１から８の何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

実施形態１０
連続ヌクレオチド領域内の全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、実施形態９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

実施形態１１
オリゴヌクレオチドが、ＲＮアーゼＨを補充する機能を有する、実施形態１から１０の何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

実施形態１２
オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列が、ギャップマーであるか又はそのギャップマーを含む、実施形態１から１１の何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

実施形態１３
オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列が、式５’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－３’のギャップマーであり、領域Ｆ及びＦ’は独立に１～７個の糖修飾ヌクレオシドを含み、且つＧが、ＲＮアーゼＨを補充する機能を有する領域６～１６個のヌクレオシドであり、領域Ｇに隣接する領域Ｆ及びＦ’のヌクレオシドが糖修飾ヌクレオシドである、実施形態１１又は１２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

実施形態１４
領域Ｇが６～１６個のＤＮＡヌクレオシドからなるか又はそのＤＮＡヌクレオシドを含む、実施形態１３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

実施形態１５
領域Ｆ及びＦ’がそれぞれ少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシドを含む、実施形態１３又は１４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

実施形態１６
Ｃ_sＡ_sＡ_sＡ_sｔ_sａ_sｔ_sｔ_sｔ_sａ_sｃ_sｃ_sｔ_sｇ_sＧ_sＴ_sＴ_sＧ（配列番号１３８、化合物番号１３８．１）
Ｔ_sＴ_sｔ_sａ_sｃ_sｃ_sｔ_sｇ_sｇ_sｔ_sｔ_sｇ_sｔ_sＴ_sＧ_sＧ（配列番号１３９、化合物番号１３９．１）
Ｃ_sＣ_sＡ_sＡ_sａ_sｔ_sａ_sｔ_sｔ_sｔ_sａ_sｃ_sｃ_sｔ_sｇ_sＧ_sＴ_sＴ（配列番号１４０、化合物番号１４０．１）
Ｃ_sＣ_sＡ_sａ_sａ_sｔ_sａ_sｔ_sｔ_sｔ_sａ_sｃ_sｃ_sｔ_sｇ_sｇ_sｔ_sｔ_sＧ_sＴ（配列番号１４１、化合物番号１４１．１）
Ａ_sＴ_sＡ_sｔ_sｔ_sｔ_sａ_sｃ_sｃ_sｔ_sｇ_sｇ_sｔ_sｔ_sｇ_sＴ_sＴ_sＧ（配列番号１４２、化合物番号１４２．１）
Ｔ_sＡ_sＴ_sｔ_sｔ_sａ_sｃ_sｃ_sｔ_sｇ_sｇ_sｔ_sＴ_sＧ_sＴ_sＴ（配列番号１４３、化合物番号１４３．１）
Ｔ_sＡ_sｔ_sｔ_sｔ_sａ_sｃ_sｃ_sｔ_sｇ_sＧ_sｔ_sＴ_sｇ_sＴ_sＴ（配列番号１４３、化合物番号１４３．２）
Ｔ_sＡ_sＴ_sｔ_sｔ_sａ_sｃ_sｃ_sｔ_sｇ_sｇ_sＴ_sＴ_sｇ_sＴ_sＴ（配列番号１４３、化合物番号１４３．３）
Ａ_sＴ_sＡ_sＴ_sｔ_sｔ_sａ_sｃ_sｃ_sｔ_sｇ_sｇ_sＴ_sＴ_sＧ_sＴ（配列番号１４４、化合物番号１４４．１）
Ａ_sｔ_sＡ_sＴ_sＴ_sｔ_sａ_sｃ_sｃ_sｔ_sｇ_sｇ_sｔ_sＴ_sＧ_sＴ（配列番号１４４、化合物番号１４４．２）
Ａ_sｔ_sＡ_sＴ_sｔ_sｔ_sａ_sｃ_sｃ_sｔ_sｇ_sＧ_sＴ_sＴ_sｇ_sＴ_sＴ（配列番号１４５、化合物番号１４５．１）
Ａ_sＴ_sＡ_sｔ_sｔ_sｔ_sａ_sｃ_sｃ_sｔ_sｇ_sＧ_sｔ_sＴ_sｇ_sＴ_sＴ（配列番号１４５、化合物番号１４５．２）
Ａ_sｔ_sＡ_sＴ_sｔ_sｔ_sａ_sｃ_sｃ_sｔ_sｇ_sｇ_sｔ_sＴ_sＧ_sＴ_sＴ（配列番号１４５、化合物番号１４５．３）
から選択される群から選択される、実施形態１から１５の何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

配列中：大文字はＬＮＡヌクレオシド単位を表し、小文字はＤＮＡヌクレオシド単位を表し、下付き文字ｓはホスホロチオエートヌクレオシド間結合を表し、全てのＬＮＡシトシンは５－メチルシトシンとする。

実施形態１７
ＬＮＡヌクレオシドがいずれもβ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドである、実施形態１６に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

実施形態１８
実施形態１から１７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、及び前記オリゴヌクレオチドに共有結合された少なくとも１つのコンジュゲート残基を含む、コンジュゲート。

実施形態１９
実施形態１から１７に記載のオリゴヌクレオチド又は実施形態１８に記載のコンジュゲート、並びに医薬的に許容される希釈剤、溶媒、担体、塩及び／又はアジュバントを含む医薬組成物。

実施形態２０
ＨＴＲＡ１を発現する標的細胞におけるＨＴＲＡ１の発現を調節するためのインビボ又はインビトロ方法であって、実施形態１から１７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、又は実施形態１８に記載のコンジュゲート、又は実施形態１９に記載の医薬組成物を、前記細胞に対し有効量にて投与することを含む、前記方法。

実施形態２１
治療上もしくは予防上有効な量の実施形態１から１７の何れか一項に記載のオリゴヌクレオチド、実施形態１８に記載のコンジュゲート、又は実施形態１９に記載の医薬組成物を、疾患に罹患しているか又は罹患しがちな被験者に投与することを含む、疾患を治療もしくは予防するための方法。

実施形態２２
本疾患が、黄斑変性（例えば、湿性ＡＭＤ、乾性ＡＭＤ、地理的萎縮、中間体ｄＡＭＤ、糖尿病性網膜症）、パーキンソン病、アルツハイマー病、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、変形性関節症などの関節炎、及び家族性虚血性大脳小血管疾患からなる群から選択される、実施形態２１に記載の方法。

実施形態２３
薬品中に用いるための、実施形態１から１７の何れか一項に記載のオリゴヌクレオチド、又は実施形態１８に記載のコンジュゲート、又は実施形態１９に記載の医薬組成物。

実施形態２４
黄斑変性（例えば、湿性ＡＭＤ、乾性ＡＭＤ、地理的萎縮、中間体ｄＡＭＤ、糖尿病性網膜症）、パーキンソン病、アルツハイマー病、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、変形性関節症などの関節炎、及び家族性虚血性大脳小血管疾患からなる群から選択される疾患の治療もしくは予防に用いるための、実施形態１から１７の何れか一項に記載のオリゴヌクレオチド、又は実施形態１８に記載のコンジュゲート、又は実施形態１９に記載の医薬組成物の使用。

実施形態２５
黄斑変性（例えば、湿性ＡＭＤ、乾性ＡＭＤ、地理的萎縮、中間体ｄＡＭＤ、糖尿病性網膜症）、パーキンソン病、アルツハイマー病、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、変形性関節症などの関節炎、及び家族性虚血性大脳小血管疾患からなる群から選択される疾患の治療もしくは予防を目的とした医薬品調製用の、実施形態１から１７に記載のオリゴヌクレオチド、又は実施形態１８に記載のコンジュゲート、又は実施形態１９に記載の医薬組成物の使用。

材料及び方法
オリゴヌクレオチドの合成
オリゴヌクレオチドの合成は、当該技術分野において遍く知られている。適用可能なプロトコルについては後述する。本発明のオリゴヌクレオチドは、使用された装置、支持体及び濃度の点で僅かに異なる方法で製造されたものであってもよい。

Oligomaker 48で、ホスホルアミダイトアプローチを用いてウリジンユニバーサル支持体上で１μｍｏｌスケールにてオリゴヌクレオチドを合成する。合成終了時に、水性アンモニアを６０℃にて５～１６時間用い、固体支持体からオリゴヌクレオチドを開裂させる。逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）又は固相抽出によってオリゴヌクレオチドを精製し、ＵＰＬＣによって特性評価して、ＥＳＩ－ＭＳを介して分子量を更に確証する。

オリゴヌクレオチドの伸長：
β－シアノエチル－ホスホラミダイト（ＤＮＡ－Ａ（Ｂｚ）、ＤＮＡ－Ｇ（ｉｂｕ）、ＤＮＡ－Ｃ（Ｂｚ）、ＤＮＡ－Ｔ、ＬＮＡ－５－メチル－Ｃ（Ｂｚ）、ＬＮＡ－Ａ（Ｂｚ）、ＬＮＡ－Ｇ（ｄｍｆ）、ＬＮＡ－Ｔ）の連結は、０．１Ｍの５’－Ｏ－ＤＭＴ－保護アミダイトアセトニトリル溶液、及び活性化剤としてのＤＣＩ（４，５－ジシアノイミダゾール）アセトニトリル（０．２５Ｍ）溶液を用いて実施する。最終サイクル用に、所望の修飾を有するホスホラミダイト、例えば、コンジュゲート基を結合させるためのＣ６リンカー、又はそのようなコンジュゲート基、を使用してもよい。チオール化によるホスホロチオエート結合の導入は、水素化キサンタン（アセトニトリル／ピリジンを９：１とした０．０１Ｍ溶液）を用いて実施する。ホスホジエステル結合は、ヨウ素をＴＨＦ／ピリジン／水が７：２：１中に溶かした０．０２Ｍ溶液を用いて導入できる。残りの試薬は、オリゴヌクレオチド合成に用いられる典型的な試薬である。

固相合成後の共役用に、市販のＣ６アミノリンカーフォルフォラアミダイトを固相合成の最後のサイクルで用い、脱保護して固体支持体から開裂させた後、アミノ結合脱保護オリゴヌクレオチドを単離することが可能である。標準的な合成方法を用い、官能基を活性化することによってコンジュゲートを導入する。

ＲＰ－ＨＰＬＣによる精製：
Phenomenex Jupiter C18の１０μ１５０×１０ｍｍカラム上で、分取ＲＰ－ＨＰＬＣによって粗化合物を精製する。０．１Ｍ酢酸アンモニウムｐＨ８及びアセトニトリルを、５ｍＬ／分の流速で緩衝液として使用する。収集された画分を凍結乾燥すると、精製化合物が典型的には白色固体として得られる。

略語：
ＤＣＩ：４，５－ジシアノイミダゾール
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＤＭＴ：４，４’－ジメトキシトリチル
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
Ｂｚ：ベンゾイル
Ｉｂｕ：イソブチリル
ＲＰ－ＨＰＬＣ：逆相高速液体クロマトグラフィー

Ｔ_mアッセイ：
オリゴヌクレオチド及びＲＮＡ標的（リン酸結合、ＰＯ）二本鎖を５００ｍｌのＲＮアーゼフリー水中に入れて３ｍＭになるように希釈し、５００ｍｌの２×Ｔ_m緩衝液（２００ｍＭのＮａＣｌ、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、２０ｍＭのリン酸、ｐＨ７．０）と混合する。溶液を３分間９５℃に加熱し、次いで室温で３０分間アニールさせる。PE Templabソフトウェア（Perkin Elmer）を用い、ペルチェ温度プログラマーＰＴＰ６付きLambda 40 UV／VIS分光光度計で、二本鎖融解温度（Ｔｍ）を測定する。温度を２０℃から９５℃に上昇させ、次いで再度２５℃に低下させて、２６０ｎｍにて吸光度を連続的に記録した。融解及びアニーリングの両方に対して一次導関数及び極大値を用い、二次Ｔ_mを評価する。

実施例１：Ｃ６細胞株におけるラットＨｔｒａ１を標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドの、単回投与濃度でのインビトロ有効性試験
ラットのＣ６細胞株をＡＴＣＣから購入し、サプライヤーの推奨事項に準じて加湿インキュベーター内で、３７℃、５％ＣＯ₂で維持した。アッセイ用に、９６マルチウェルプレート内の培養培地に、１５００個のＣ６細胞／ウェルを播種した。細胞を２時間インキュベートした後、オリゴヌクレオチドを溶解させたＰＢＳ溶液を加えた。オリゴヌクレオチドの濃度：２５μＭ。オリゴヌクレオチドを加えてから４日後に細胞を回収した。PureLink Pro 96 RNA精製キット（Ambionをメーカーの指示に従って）を使用して、ＲＮＡを抽出した。次いで、Ｍ－ＭＬＴ逆転写酵素、ランダムデカマーRETROscript、ＲＮアーゼ阻害剤（Ambionををメーカーの指示に従って）を使用し、１００ｍＭのｄＮＴＰセットＰＣＲグレード（Invitrogen）、及びＤＮアーゼ／ＲＮアーゼフリー水（Gibco）を用いて、ｃＤＮＡを合成した。遺伝子発現分析用に、TaqMan Fast Advanced Master Mix (2X)（Ambion）を用いて、ｑＰＣＲをデュプレックスセットアップで行った。ｑＰＣＲに使用されたＴａｑＭａｎプライマーアッセイは以下のとおりである。
Ｈｔｒａ１、Ｒｎ００５８１８７０＿ｍ１（FAM-MGB）；ハウスキーピング遺伝子、Ｔｂｐ、Ｒｎ０１４５５６４６＿ｍ１（VIC-MGB）。プライマーセットはいずれもLife Technologiesから購入されたものである。表中のＨｔｒａ１ ｍＲＮＡの相対的な発現レベルは、対照（ＰＢＳで処理された細胞）の％として示してある。

使用されたメチオリゴヌクレオチドは下掲のとおりである。

化合物に関して：大文字はＬＮＡヌクレオシド（β－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドが使用されていること）を表し、全てのＬＮＡシトシンは５－メチルシトシンであり、小文字はＤＮＡヌクレオシドであり、上付き文字^mで始まるＤＮＡシトシンは５－メチルＣ－ＤＮＡヌクレオシドを表す。ヌクレオシド間結合はいずれもホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。

実施例２：Ｃ６細胞株内のラットＨｔｒａ１を標的化する選択されたオリゴヌクレオチドの、インビトロ効力及び有効性試験の用量反応曲線
ラットＣ６細胞株は、実施例１に記載のものであった。アッセイは、実施例１に記載されているようにして実施された。オリゴヌクレオチドの濃度：５０μＭ～、半対数希釈、８ポイント。オリゴヌクレオチドを加えてから４日後に細胞を回収した。ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡの合成及びｑＰＣＲは、実施例１に記載されているようにして実施された。ｎ＝２×生物学的複製。ＥＣ₅₀の測定をGraphPad Prism 6で行った。５０μＭオリゴヌクレオチドで処理したときの、Ｈｔｒａ１のｍＲＮＡの相対的なレベルを、対照（ＰＢＳ）の％として表に示す。追加的なプライマーセット（Ｈｔｒａ１、Ｒｎ００６６８９８７＿ｍ１［FAM-MGB］とその対照とされたＰｐｉａ、Ｒｎ００６９００９３３＿ｍ１［VIC-MGB］及びＨｐｒｔ、Ｒｎ０１５２７８４０＿ｍ１［VIC-MGB］）に関しても同様に試験を実施し、これらのプライマーを用いて同じ傾向が観察された（データ不図示）。

実施例３：Ｕ２５１細胞株におけるヒトＨＴＲＡ１を標的化するオリゴヌクレオチドの、単回投与濃度でのインビトロ有効性試験
ヒト神経膠芽腫Ｕ２５１細胞株をＥＣＡＣＣから購入し、サプライヤーの推奨事項に従って加湿インキュベーター内で、３７℃、５％ＣＯ₂にて維持した。アッセイ用に、１５０００個のＵ２５１細胞／ウェルを、９６マルチウェルプレートに入れた飢餓培地（FBSを１０％でなく１％としたこと以外はサプライヤーによって推奨される培地）に播種した。細胞を２４時間インキュベートした後、オリゴヌクレオチドを溶解させたＰＢＳ溶液を加えた。オリゴヌクレオチドの濃度：５μＭ。化合物を添加してから３～４日後に、培地を除去し、新しい培地（オリゴヌクレオチドなし）を加えた。オリゴヌクレオチドを加えてから６日後に細胞を回収した。PureLink Pro 96 RNA精製キット（Ambionをメーカーの指示に従って）を使用して、ＲＮＡを抽出した。次いで、Ｍ－ＭＬＴ逆転写酵素、ランダムデカマーRETROscript、ＲＮアーゼ阻害剤（Ambionをメーカーの指示に従って）を使用し、１００ｍＭのｄＮＴＰセットＰＣＲグレード（Invitrogen）、及びＤＮアーゼ／ＲＮアーゼフリー水（Gibco）を用いて、ｃＤＮＡを合成した。遺伝子発現分析用に、TaqMan Fast Advanced Master Mix (2X)（Ambion）を用いて、ｑＰＣＲをデュプレックスセットアップで行った。ＴａｑＭａｎプライマーアッセイ後、ＨＴＲＡ１、Ｈｓ０１０１６１５１＿ｍ１（FAM-MGB）；ハウスキーピング遺伝子、ＴＢＰ、Ｈｓ４３２６３２２Ｅ（VIC-MGB）（Life Technologies製）を使用してｑＰＣＲを行った。表中のＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡの相対的な発現レベルは、対照（ＰＢＳで処置された細胞）の％として示してある。

化合物に関して：大文字はＬＮＡヌクレオシド（β－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドが使用されていること）を表し、全てのＬＮＡシトシンは５－メチルシトシンであり、小文字はＤＮＡヌクレオシドであり、上付き文字^mで始まるＤＮＡシトシンは５－メチルＣ－ＤＮＡヌクレオシドを表す。全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。

実施例４：ＡＲＰＥ１９及びＵ２５１細胞株内のヒトＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡを標的化するオリゴヌクレオチドライブラリーの、２通りの濃度でのインビトロ有効性試験
ＨＴＲＡ１に対する有望な「ホットスポット」領域の同定ｎ＝１２９のヒト／カニクイザル／ラットＨＴＲＡ１ ＬＮＡオリゴヌクレオチドのライブラリーを、Ｕ２５１及びＡＲＰＥ１９細胞株にてスクリーニングした。図１に示すように、本発明者らは、このライブラリーから３３０４２位から３３０６４位までのヒトＨＴＲＡ１プレｍＲＮＡ（配列番号２）を標的化する一連の活性オリゴヌクレオチドを同定した。

ヒト網膜色素上皮ＡＲＰＥ１９細胞株をＡＴＣＣから購入し、ＤＭＥＭ－Ｆ１２（Sigma、Ｄ８４３７）、１０％ＦＢＳ、１％ｐｅｎ/ｓｔｒｅｐ中に溶かし、３７°Ｃ、５％ＣＯ₂の加湿インキュベーター内で維持した。Ｕ２５１細胞株は、実施例３に記載のものであった。アッセイ用に、９６マルチウェルプレートに入れた培養培地（ただし、ＦＢＳは１０％ではなく５％のもの）中に、ＡＲＰＥ１９細胞を５０００／ウェルにて播種した。細胞を１時間インキュベートした後で、ＰＢＳ中に溶解されたオリゴヌクレオチドを加えた。オリゴヌクレオチドを加えてから４日後に細胞を回収した。Ｕ２５１細胞株を用いたアッセイを、実施例３に記載されているようにして実施した。オリゴヌクレオチドの濃度：２５及び２．５μＭ。RNeasy 96 Biorobot 8000キット（Qiagenを製造元の指示に従って）を、使用してＲＮＡを抽出した。次いで、Retroscript cDNA合成キット（ThermoFisherを、製造元の指示に従って）を使用してｃＤＮＡを合成した。遺伝子発現分析については、Pluidigm Biomarkシステムを使用して、ｑＰＣＲを実行された。ｑＰＣＲに使用されたＴａｑＭａｎプライマーアッセイは、以下のとおりである。ＨＴＲＡ１、Ｈｓ０１０１６１５１＿ｍ１；ハウスキーピング遺伝子ＴＢＰ、Ｈｓ９９９９９９１０＿ｍ１；ＰＰＩＡ、Ｈｓ９９９９９９０４＿ｍ１（Life Technologies製）。ｎ＝２×生物学的複製。ＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡの相対的な発現レベルは、表中に対照（ＰＢＳ）の％として示してある。追加的なＨＴＲＡ１プライマーセット（Ｈｓ００１７０１９７＿ｍ１）も試験し、同じ傾向が観察された（データ不図示）。

化合物に関して：大文字はＬＮＡヌクレオシド（β－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドが使用されていること）を表し、全てのＬＮＡシトシンは５－メチルシトシンであり、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表す。全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合。

実施例５：ラットＣ６細胞株におけるＬＮＡオリゴヌクレオチドを標的化する選択されたヒト／ラットＨＴＲＡ１の、単回投与濃度でのインビトロ有効性試験
ラットＣ６細胞株は、実施例１に記載のものであった。アッセイは、実施例１に記載されているようにして実施された。オリゴヌクレオチドの濃度：２５μＭ。ｎ＝２×生物学的複製。表中のＨｔｒａ１ ｍＲＮＡの相対的な発現レベルは、対照（ＰＢＳで処理された細胞）の％として示してある。

実施例６：用量反応において、ＡＲＰＥ１９、Ｕ２５１及びＣ６細胞株内の選択されたヒト／カニクイザル／ラットＬＮＡオリゴヌクレオチドのインビトロ効力及び有効性試験
ＡＲＰＥ１９、Ｕ２５１及びＣ６細胞株はそれぞれ、実施例４、実施例３及び実施例１に記載のものであった。アッセイ用に、サプライヤーによって推奨された９６マルチウェルプレートに入れた培養培地中に、２０００×Ｕ２５１又はＡＲＰＥ１９細胞／ウェルにて播種した。細胞を２時間インキュベートした後、オリゴヌクレオチドを溶解させたＰＢＳ溶液を加えた。Ｃ６細胞株アッセイは、実施例１～２に記載されているようにして実施された。オリゴヌクレオチドの濃度：５０μＭ～、半対数希釈、８ポイント。オリゴヌクレオチドを加えてから４日後に細胞を回収した。ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡの合成及びｑＰＣＲは、全ての細胞株を対象とし、実施例１に記載されているようにして実施された。Ｕ２５１及びＡＲＰＥ１９細胞に使用されたＴａｑＭａｎプライマーアッセイは以下のとおりである。
ＨＴＲＡ１、Ｈｓ０１０１６１５１＿ｍ１（FAM-MGB）；ハウスキーピング遺伝子、ＴＢＰ、Ｈｓ４３２６３２２Ｅ（VIC-MGB）。プライマーセットはいずれもLife Technologiesから購入されたものである。ｎ＝２×生物学的複製。ＥＣ₅₀の測定をGraphPad Prism 6で行った。５０μＭオリゴヌクレオチドで処理したときの、ＨＴＲＡ１のｍＲＮＡの相対的なレベルを、対照（ＰＢＳ）の％として表に示す。

実施例７：ＡＲＰＥ１９及びＵ２５１細胞株における選択されたヒトＨＴＲＡ１標的化オリゴヌクレオチドの、単回投与濃度でのインビトロ有効性試験
ＡＲＰＥ１９及びＵ２５１細胞株及びアッセイは、実施例６に記載のものであった。ＲＮＡ抽出を、実施例１に記載されているようにして実施した。ｃＤＮＡの合成及びｑＰＣＲを、qScript XLT one-step RT-qPCR ToughMix Low ROX, 95134-100（Quanta Biosciences）を使用して行った。デュプレックスセットアップでＵ２５１及びＡＲＰＥ１９細胞に使用されたＴａｑＭａｎプライマーアッセイは以下のとおりである。
ＨＴＲＡ１、Ｈｓ０１０１６１５１＿ｍ１（FAM-MGB）；ハウスキーピング遺伝子、ＧＡＰＤＨ、Ｈｓ４３１０８８４Ｅ（VIC-MGB）。プライマーセットはいずれもLife Technologiesから購入されたものであった。ｎ＝１生物学的複製。表中のＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡの相対的な発現レベルは、対照（ＰＢＳで処置された細胞）の％として示してある。また、追加的なプライマーセット（ＨＴＲＡ１、Ｈｓ００１７０１９７＿ｍ１［FAM-MGB］とその対照とされたＴＢＰ Ｈｓ４３２６３２２E［VIC-MGB］）に関してもＵ２５１を試験し、これらのプライマーを用いて同じ傾向が観察された（データ不図示）。図２を参照のこと。

実施例８：ヒト初代ＲＰＥ細胞におけるインビトロ有効性及び効力試験
ヒト初代網膜色素上皮（hpRPE）細胞は、Sciencell（カタログ番号６５４０）から購入されたものであった。アッセイ用に、ラミニン（Laminin 521、BioLaminaカタログ番号ＬＮ５２１－０３）でコーティングされた９６マルチウェルプレート内の培養培地（EpiCM、Sciencellカタログ番号４１０１）中に、ｈｐＲＰＥを５０００細胞／ウェルにて播種する。これらをこの培地中で１週間増殖させ、以下の培地：Ｎ１補助剤（Sigmaカタログ番号Ｎ－６５３０）を補給したＭＥＭα培地（Sigmaカタログ番号Ｍ－４５２６）、グルタミン－ペニシリン－ストレプトマイシン（Sigmaカタログ番号Ｇ－１１４６）、非必須アミノ酸（NEAA、Sigmaカタログ番号Ｍ－７１４５）、タウリン（Sigmaカタログ番号T－０６２５）、ヒドロコルチゾン（Sigmaカタログ番号Ｈ－０３９６６）、トリヨード－サイロニン（Sigmaカタログ番号Ｔ－５５１６）、及びウシ血清アルブミン（BSA、Sigmaカタログ番号Ａ－９６４７）を用いて２週間分化させる。細胞を、加湿インキュベーター内で３７℃、５％ＣＯ₂にて培養する。

実験の当日に、細胞を新鮮な分化培地と共に１時間インキュベートした後、オリゴヌクレオチドを加える。０日目及び４日目に、これらをＰＢＳ中に溶解させ、そのＰＢＳ溶液を細胞に塗布する。７日目に、β－メルカプト－エタノールを含むＲＬＴ緩衝液（Qiagenカタログ番号７９２１６）５０μｌを用いて、細胞を収集する。ＲＮＡの抽出を、DNアーゼI処理（カタログ番号７９２５４；ロット１５１０４２６７４）付属のQiagen RNeasy Mini Kit（カタログ番号７４１０４；ロット１５１０４８０７３）ユーザーズマニュアルに従って行う。ＲＮＡ品質管理を、Agilent Bioanalyzer Nano Kit（Agilent；カタログ番号５０６７－１５１１；ロット１４４６）を用いて行う。ｃＤＮＡへの全ＲＮＡの逆転写（ｃＤＮＡの合成）を、メーカーの指示に従い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチドベースのHigh Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（Thermo Fisher Scientific、カタログ番号４３６８８１４；ロット００３１４１５８）を用いて行う。ｃＤＮＡ試料の測定を、７９００ＨＴリアルタイムＰＣＲ装置（Thermo Fisher Scientific）上で、３８４ウェルプレートフォーマットで３回にわたって実施する。ｑＰＣＲに使用されたＴａｑＭａｎプライマーアッセイは以下のとおりである。
ＨＴＲＡ１、Ｈｓ０１０１６１５１＿ｍ１；Ｈｓ００１７０１９７＿ｍ１、ハウスキーピング遺伝子、ＧＡＰＤＨ、Ｈｓ９９９９９９０５＿ｍ１；ＰＰＩＡ、Ｈｓ９９９９９９０４＿ｍ１（Life Technologies製）。ｎ＝３生物学的複製。ＨＴＲＡ１ ｍＲＮＡの相対的な発現レベルは、表中に対照（ＰＢＳ）の％として示してある。図３を参照のこと。

実施例９：ラットのインビボ有効性試験、７日間の治療、硝子体内（ＩＶＴ）注射、３０μｇ／片眼
動物
着色されたブラウンノルウェーラットに対して実験を行った。試験の各群に動物５匹が含まれ、合計１５匹であった。

化合物及び投与手順
実験の開始に際して、動物をイソフルランで麻酔し、眼を消毒して拡張してから、片眼当たり３０μｇ（３μｌ中）の硝子体内注射を行った。

安楽死
生活相の終了時（７日目）に、全てのラットをＣＯ₂で安楽死させてから、解剖用に眼を摘出した。網膜、強膜及び硝子体液を、更なる分析用に採取した。

ＨＴＲＡ１ ＲＮＡ発現の定量
網膜試料を解剖した。ラット網膜急速凍結組織を凍結保存し、試験施設においてＲＬＴ溶解緩衝液（Qiagen RNeasy Mini Kit）中に溶解させ、ＲＮＡ抽出を、ＤＮアーゼＩ処理（カタログ番号７９２５４、ロット１５１０４８６１３）を含むQiagen RNeasy Mini Kit（カタログ番号７４１０４；ロット１５１０３９８５２）の使用説明書に従って続行した。ＲＮＡ品質管理は、Agilent Bioanalyzer Nano Kit（Agilent；カタログ番号５０６７－１５１１；ロット１４４６）を用いて実行された。ｃＤＮＡへの全ＲＮＡの逆転写（ｃＤＮＡの合成）は、メーカーの指示に従い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチドベースのHigh Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（Thermo Fisher Scientific、カタログ番号４３６８８１４、ロット００３１４１５８）を使用して実行された。ｃＤＮＡ試料の測定を、７９００ＨＴリアルタイムＰＣＲ装置（Thermo Fisher Scientific）上で、３８４ウェルプレートフォーマットにて３回実施した。ｑＰＣＲに使用されたＴａｑＭａｎプライマーアッセイは、以下のとおりである。Ｈｔｒａ１、Ｒｎ００５８１８７０＿ｍ１；ハウスキーピング遺伝子、Ｇａｐｄｈ、Ｒｎ０１７７５７６３＿ｇ１；Ｔｂｐ、Ｒｎ０１４５５６４６＿ｍ１（Life Technologies製）。ラット／群：５、ｎ＝１０及び.各眼を個々の試料として処置した。Ｈｔｒａ１ ｍＲＮＡの相対的な発現レベルは、対照（ＰＢＳ）の％として示してある。図４を参照のこと。

実施例１０：ラットのインビボ有効性試験、７日間の処置、硝子体内（ＩＶＴ）注射、用量反応
動物
全ての実験を、着色されたブラウンノルウェーラットに対して行った。試験の各群に動物１７匹が含まれ、合計３４匹であった。

化合物及び投与手順
キシラジンとケタミンとの混合物を、動物に筋肉内注射して麻酔した。試験１日目に、麻酔動物の両眼に対し、試験アイテム及び陰性対照（ＰＢＳ）を（投与当たり３μＬ）硝子体内投与した。

安楽死
生活相の終了時（８日目）に、ペントバルビタールの腹腔内及び過剰投与により安楽死させた。

オリゴ含量測定、及びＨＴＲＡ１ ＲＮＡ発現の定量
低用量群及び中用量群の全ての動物、並びに高用量群及びＰＢＳ群の最初の５匹の動物の、両方の眼球を生物分析に使用した。安楽死の直後に、硝子体（Ｖ）、網膜（Ｒ）及び脈絡膜（ＣＨ）を氷上で迅速且つ慎重に解剖し、出荷まで－８０℃で貯蔵した。網膜試料をMagNa Pure 96 LC RNA Isolation Tissue Buffer７０μＬ中に溶解し、２ｍLのチューブに１個のステンレス鋼ビーズを添加し、Precellys Evolutionホモジナイザーを使用して２×１．５分間、ホモジナイズし、続いて室温で３０分間インキュベートしてホモジナイズした。試料を１３０００ｒｐｍで５分間遠心した。半分は生物分析用に取っておき、残りの半分に対しては直接的にＲＮＡ抽出を続行した。

生物分析に備えて、ハイブリダイゼーションＥＬＩＳＡ法によるオリゴ含有量測定用に試料を１０～５０倍希釈した。ビオチン化ＬＮＡ捕捉プローブ及びジゴキシゲニン共役ＬＮＡ検出プローブ（両方とも５×ＳＳＣＴ中３５ｎＭで、それぞれ検出対象とされたＬＮＡオリゴヌクレオチドの一端に対して相補的なもの）を、希釈ホモジネート又は関連標準と混合し、室温で３０分間インキュベートした後、ストレプトアビジン被覆ＥＬＩＳＡプレート（Nuncカタログ番号４３６０１４）に加えた。

プレートを室温で１時間インキュベートし、２×ＳＳＣＴ（３００ｍＭ塩化ナトリウム、３０ｍＭクエン酸ナトリウム、及び０．０５％ｖ／ｖのTween-20、ｐＨ７．０）中で洗浄した。捕捉されたＬＮＡ二本鎖を、アルカリホスファターゼ（Roche Applied Scienceカタログ番号１１０９３２７４９１０）及びアルカリホスファターゼ基質系（BluePhos基質、KPL製品コード５０－８８－００）と共役された抗ＤＩＧ抗体を使用して、検出した。Biotekリーダーで、オリゴ複合体の量を６１５ｎｍでの吸光度として測定した。

ＲＮＡ抽出用に、Tissue FF standard LV3.1プログラムを用いたMagNA Pure 96システムで、Cellular RNA Large Volume Kit（０５４６７５３５００１、Roche）を、メーカーの指示に従って使用した。これには、ＤＮアーゼ処理が含まれる。ＲＮＡ品質管理及び濃度をEon Reader（Biotek）で測定した。試料中のＲＮＡ濃度を正規化し、以降のｃＤＮＡの合成及びｑＰＣＲを、qScript XLT one-step RT-qPCR ToughMix Low ROX, 95134-100（Quanta Biosciences）を使用して、一段階の反応で実行した。デュプレックス反応に使用されたＴａｑＭａｎプライマーアッセイは、以下のとおりである。Ｈｔｒａ１、Ｒｎ００５８１８７０＿ｍ１；Ｒｎ００６６８９８７＿ｍ１；ハウスキーピング遺伝子、ＨＰＲＴ、Ｒｎ０１５２７８４０＿ｍ１；Ｔｂｐ、Ｒｎ０１４５５６４６＿ｍ１（Life Technologies製）。ｑＰＣＲ分析は、ViiA７機（Life Technologies）上で行った。ラット／群：５、ｎ＝１０眼。各眼を個々の試料として扱った。Ｈｔｒａ１ ｍＲＮＡの相対的な発現レベルは、対照（ＰＢＳ）の％として示してある。

組織学的検査
高用量の残りの動物２匹及びＰＢＳ動物の、両方の眼球を取り出して１０％中性緩衝ホルマリン中に２４時間固定してから、トリミングしてパラフィン中に包埋した。

ＩＳＨ分析用に、RNAscope 2.5 VS Probe-Mmu-HTRA1(Cat No. 440959、Advanced Cell Diagnostics)を使用して、完全自動Ventana Dicovery ULTRA染色モジュール（プロシージャ：mRNA Discovery Ultra Red 4.0-v0.00.0152）を用いて、4μｍ厚のホルマリン固定パラフィン包埋ラット網膜組織切片を処理した。使用されたクロモゲンは、Fastred、ヘマトキシリンＩＩ対比染色である。

実施例１１：プルーフ・オブ・コンセプト（Poc）試験を受けたアルビノラットにおける青色光誘発性網膜変性

動物
全ての実験をアルビノスプラーグドーリーラットに対して実施した。試験の各群に動物１６匹が含まれ、合計４２匹であった。

化合物及び投与手順
キシラジンとケタミンとの混合物を、動物に筋肉内注射して麻酔した。試験-３日目に、麻酔動物の両眼に対し、試験アイテム及び陰性対照（ＰＢＳ）を（投与当たり３μＬ）硝子体内投与した。
０日目に４回（露光を開始する０．５時間前、露光を開始してから２時間後及び４時間後t並びに露光終了直後に）、１ｍＬプラスチック製の遮光性注射器に取り付けられた２５ゲージ針を使用して、陽性対照アイテム（ＰＢＮ）を２．５ｍＬ／ｋｇの用量で腹腔内注射した。

露光
ラットを３６時間暗順応させてから、透明プラスチックケージ内で連続青色蛍光灯（４００～５４０ｎｍ）に６時間曝露させた。曝露後、ラットを２４時間暗室に入れてから、標準の循環光条件に戻した。

網膜電図（ＥＲＧ）
ベースライン時及び１４日目に、両眼を一晩暗順応させてから網膜電図（ＥＲＧ）を記録した。ＥＲＧ記録ごとに、Ａ波及びＢ波の振幅を測定した。

安楽死
生活相の終了時（１４日目）に、動物に麻酔をかけ、ペントバルビタールを腹腔内過剰投与して安楽死させた。

外側核層（ＯＮＬ）の厚さ測定
各群の主要動物１０匹から両方の眼球を摘出し、ブアンオランド（Bouin Hollande）溶液に固定して、パラフィンに包埋した。薄い切片（厚さ５～７μｍ）を垂直子午線に沿って切り取り、トリクロームマッソン（Trichrome-Masson）で染色した。網膜の各部分（上及び下）において、視神経から末梢網膜までの７点（２５０μｍごと）でＯＮＬの厚さを測定した。各点で外側核層の厚さを測定し、曲線下面積（ＡＵＣ）を計算した。

オリゴ含量測定、及びＨｔｒａ１ ＲＮＡ発現の定量
被験物質及びＰＢＳ群からのサテライト動物４匹の両方の眼球を、生物分析に使用した。安楽死の直後に、硝子体（Ｖ）、網膜（Ｒ）及び脈絡膜（ＣＨ）を氷上で迅速且つ慎重に解剖し、出荷まで－８０℃で貯蔵した。網膜試料をMagNa Pure 96 LC RNA Isolation Tissue Buffer７０μＬ中に溶解し、２ｍＬのチューブに１個のステンレス鋼ビーズを添加し、Precellys Evolutionホモジナイザーを使用して２×１．５分間ホモジナイズし、続いて室温で３０分間インキュベートしてホモジナイズした。試料を１３０００ｒｐｍで５分間遠心した。半分は生物分析用に取っておき、残りの半分に対しては直接的にＲＮＡ抽出を続行した。

生物分析に備えて、ハイブリダイゼーションＥＬＩＳＡ法によるオリゴ含有量測定用に試料を１０～５０倍希釈した。ビオチン化ＬＮＡ捕捉プローブ及びジゴキシゲニン共役ＬＮＡ検出プローブ（両方とも５×ＳＳＣＴ中３５ｎＭで、それぞれ検出対象とされたＬＮＡオリゴヌクレオチドの一端に対して相補的なもの）を、希釈ホモジネート又は関連標準と混合し、室温で３０分間インキュベートした後、ストレプトアビジン被覆ＥＬＩＳＡプレート（Nuncカタログ番号４３６０１４）に加えた。

プレートを室温で１時間インキュベートし、２×ＳＳＣＴ（３００ｍＭ塩化ナトリウム、３０ｍＭクエン酸ナトリウム、及び０．０５％ｖ／ｖのTween-20、ｐＨ７．０）中で洗浄した。捕捉されたＬＮＡ二本鎖を、アルカリホスファターゼ（Roche Applied Scienceカタログ番号１１０９３２７４９１０）及びアルカリホスファターゼ基質系（BluePhos基質、KPL製品コード５０－８８－００）と共役された抗ＤＩＧ抗体を使用して、検出した。Biotekリーダーで、オリゴ複合体の量を６１５ｎｍでの吸光度として測定した。

ＲＮＡ抽出用に、Tissue FF standard LV3.1プログラムを用いたMagNA Pure 96システムで、Cellular RNA Large Volume Kit（０５４６７５３５００１、Roche）を、メーカーの指示に従って使用した。これには、ＤＮアーゼ処理には含まれる。ＲＮＡ品質管理及び濃度をEon Reader（Biotek）で測定した。試料中のＲＮＡ濃度を正規化し、以降のｃＤＮＡの合成及びｑＰＣＲを、qScript XLT One-StepRT-qPCR ToughMix LowROX, 95134-100（Quanta Biosciences）を使用して、一段階の反応で実行した。デュプレックス反応に使用されたＴａｑＭａｎプライマーアッセイは、以下のとおりである。Ｈｔｒａ１、Ｒｎ００５８１８７０＿ｍ１；Ｒｎ００６６８９８７＿ｍ１；ハウスキーピング遺伝子、ＨＰＲＴ、Ｒｎ０１５２７８４０＿ｍ１；Ｔｂｐ、Ｒｎ０１４５５６４６＿ｍ１（Life Technologies製）。ｑＰＣＲ分析は、ViiA７機（Life Technologies）上で行った。ラット／群：５、ｎ＝１０×眼。各眼を個々の試料として処置した。Ｈｔｒａ１ ｍＲＮＡの相対的な発現レベルは、対照（ＰＢＳ）の％として示してある。

組織学的検査
被験物質及びＰＢＳ群からの残りの２匹のサテライト動物の両方の眼球を取り出し、１０％中性緩衝ホルマリン中で２４時間固定して、トリミングしてからパラフィン中に包埋した。ＩＳＨ用RNAscopeを、実施例１０に記載されているようにして実施した。

実施例１２：ラットのインビボ有効性動態研究、３日間、７日間及び１４日間の治療、硝子体内（ＩＶＴ）注射、単回投与
３３０４２位～３３０６４位（配列番号１４７）の間のヒトＨＴＲＡ１プレｍＲＮＡにおける「ホットスポット」を標的化する２つの選択されたＨＴＲＡ１ ＬＮＡオリゴヌクレオチドについて網膜内で、ｍＲＮＡレベルでのノックダウン（ＫＤ）が観察された。このノックダウンは、ｑＰＣＲ及びＩＳＨリードアウトの両方で観察された（図７Ａ及び図７Ｂ、並びに下表を参照）。

ノックダウンの変化は比較的大きい。表中の標準偏差を参照。この変化は、投与量レベルにおけるものと思われ、オリゴ含有量と残渣ＨＴＲＡ１ ＲＮＡレベルとを比較対照した用量反応曲線をプロットした際に見られる場合がある（図７Ｃ参照）。

動物
全ての実験をアルビノスプラーグドーリーラットに対して実施した。

化合物及び投与手順
動物をイソフルランで麻酔した。試験１日目に、麻酔動物の両眼に対し、試験アイテム及び陰性対照（ＰＢＳ）を（投与当たり３μＬ）硝子体内投与した。

安楽死
生活相の終了時（試験の４日目、８日目又は１５日目）にラットに麻酔をかけ、断頭して安楽死させた。

オリゴ含量測定、及びＨｔｒａ１ ｍＲＮＡ発現の定量
オリゴ含量測定、及びＨｔｒａ１ ｍＲＮＡ発現の定量を、実施例１０に記載されているようにして実行した。

残渣Ｈｔｒａ１ ｍＲＮＡの相対的な発現レベルは、対照（ＰＢＳ）の％として示してある。

組織学的検査
組織学的検査を、実施例１０に記載されているようにして実行した。

実施例１３：インビボ薬物動態学及び薬力学（ＰＫ／ＰＤ）試験におけるカニクイザル（非ヒト霊長類：ＮＨＰ）、２１日間の治療、硝子体内（ＩＶＴ）注射、単回投与
３３０４２位～３３０６４位のヒトＨＴＲＡ１プレｍＲＮＡの「ホットスポット」を標的化する１つの選択されたＨＴＲＡ１ ＬＮＡオリゴヌクレオチド１４５．３に関して、網膜内のｍＲＮＡレベル、並びに網膜及び硝子体内のタンパク質レベルの両方でノックダウンが観察された（図８参照）。

動物
全ての実験をカニクイザル（Cynomolgus monkeys）に対して行った（Macaca fascicularis）。

化合物及び投与手順
ブプレノルフィン鎮痛剤を、試験化合物を注射する前及び注射してから２日後に投与した。動物にケタミン及びキシラジンを筋肉内注射して麻酔した。テトラカイン麻酔薬の局所投与後１日目に、試験アイテム及び陰性対照（ＰＢＳ）を、（１回の投与につき５０μＬ）麻酔動物の両眼に硝子体内投与した。

安楽死
生活相の終了時（２２日目）に、全てのサルに対しペントバルビタールを腹腔内投与及び過剰投与して、安楽死させた。

ｑＰＣＲによるＨｔｒａ１ ＲＮＡ発現のオリゴ含量測定及び定量
安楽死させた直後に、眼組織を迅速且つ慎重に氷上で解剖して、出荷まで－８０℃で貯蔵した。網膜試料をMagNa Pure 96 LC RNA Isolation Tissue Buffer７０μＬ中に溶解し、２ｍＬのチューブに１個のステンレス鋼ビーズを添加し、Precellys Evolutionホモジナイザーを使用して２×１．５分間ホモジナイズし、続いて室温で３０分間インキュベートしてホモジナイズした。試料を１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。半分を生物分析用に取っておき、残りの半分に対してはＲＮＡ抽出を直接的に続行した。

生物分析に備えて、ハイブリダイゼーションＥＬＩＳＡ法によるオリゴ含有量測定用に試料を１０～５０倍希釈した。ビオチン化ＬＮＡ捕捉プローブ及びジゴキシゲニン共役ＬＮＡ検出プローブ（両方とも５×ＳＳＣＴ中３５ｎＭで、それぞれ検出対象とされたＬＮＡオリゴヌクレオチドの一端に対して相補的なもの）を、希釈ホモジネート又は関連標準と混合し、室温で３０分間インキュベートした後、ストレプトアビジン被覆ＥＬＩＳＡプレート（Nuncカタログ番号４３６０１４）に加えた。

プレートを室温で１時間インキュベートし、２×ＳＳＣＴ（３００ｍＭ塩化ナトリウム、３０ｍＭクエン酸ナトリウム、及び０．０５％ｖ／ｖのTween-20、ｐＨ７．０）中で洗浄した。捕捉されたＬＮＡ二本鎖を、アルカリホスファターゼ（Roche Applied Scienceカタログ番号１１０９３２７４９１０）及びアルカリホスファターゼ基質系（Blue Phos基質、KPL製品コード５０－８８－００）と共役された抗ＤＩＧ抗体を使用して、検出した。Biotekリーダーで、オリゴ複合体の量を６１５ｎｍでの吸光度として測定した。

ＲＮＡ抽出用に、Tissue FF standard LV3.1プログラムを用いたMagNA Pure 96システムで、Cellular RNA Large Volume Kit（０５４６７５３５００１、Roche）を、メーカーの指示に従って使用した。これにはＤＮアーゼ処理が含まれる。ＲＮＡ品質管理及び濃度を、Eon Reader（Biotek）を用いて測定した。試料中のＲＮＡ濃度を正規化し、以降のｃＤＮＡの合成及びｑＰＣＲを、qScript XLT one-step RT-qPCR ToughMix LowROX, 95134-100（Quanta Biosciences）を使用して、一段階の反応で実行した。シンプレックス反応に使用されたＴａｑＭａｎプライマーアッセイは、以下のとおりである。
Ｈｔｒａ１、Ｍｆ０１０１６１５０＿、Ｍｆ０１０１６１５２＿ｍ１；
Ｒｈ０２７９９５２７＿ｍ１；
ハウスキーピング遺伝子、ＡＲＦＧＡＰ２、Ｍｆ０１０５８４８８＿ｇ１；
Ｒｈ０１０５８４８５＿ｍ１；
ＡＲＬ１、Ｍｆ０２７９５４３１＿ｍ１（Life Technologies製）。ｑＰＣＲ分析は、ViiA7マシン（Life Technologies）上で行った。眼数／群：ｎ＝３×眼。各眼を個々の試料として処置した。Ｈｔｒａ１ ｍＲＮＡの相対的な発現レベルは、対照（ＰＢＳ）の％として示してある。

組織学的検査
眼球を取り出して１０％中性緩衝ホルマリン中に２４時間固定してから、トリミングしてパラフィン中に包埋した。

ＩＳＨ分析用に、RNAscope 2.5とその対照とされたProbe-Mmu-HTRA1、REF 486979、Advanced Cell Diagnostics, Inc.を使用して、完全自動Ventana Dicovery ULTRA染色モジュール（プロシージャ：mRNA Discovery Ultra Red 4.0-v0.00.0152）を用いて、４μｍ厚のホルマリン固定パラフィン包埋網膜組織切片を処置した。使用されたクロモゲンは、Fastred、ヘマトキシリンＩＩ対比染色である。

プレートベースの免疫沈降質量分析（ＩＰ－ＭＳ）アプローチを用いた、ＨＴＲＡ１タンパク質の定量
網膜の試料調製
網膜を４容量（ｗ／ｖ）のＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．２５％デオキシコール酸、１％ＮＰ－４０、１ｍＭのＥＤＴＡ、Millipore）中に入れ、Precellys 24（５５００、１５秒、２サイクル）を使用して、プロテアーゼ阻害剤（完全ＥＤＴＡフリー、Roche）とホモジナイズした。ホモジネートを（１３，０００ｒｐｍで３分）遠心分離し、上清のタンパク質含有量を測定した（Pierce BCAタンパク質アッセイ）。

硝子体の試料調製
硝子体液（３００μｌ）を５×ＲＩＰＡ緩衝液で希釈し（最終濃度：５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．２５％デオキシコール酸、１％ＮＰ－４０、１ｍＭのＥＤＴＡ）、Precellys 24（５５００、１５秒、２サイクル）を使用して、プロテアーゼ阻害剤（完全ＥＤＴＡフリー、Roche）とホモジナイズした。ホモジネートを（１３，０００ｒｐｍで３分）遠心分離し、上清のタンパク質含有量を測定した（Pierce BCAタンパク質アッセイ）。

プレートベースのＨＴＲＡ１免疫沈降とトリプシン消化
９６ウェルプレート（Nunc MaxiSorp）を抗ＨＴＲＡ１マウスモノクローナル抗体（R&D MAB2916、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）５０μｌ中に５００ｎｇ／ｗｅｌｌ溶解したもの）で５００ｎｇ／ウェルにてコーティングし、４℃にて一晩インキュベートした。プレートをＰＢＳ（２００μｌ）で２回洗浄し、３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡのＰＢＳ溶液で２０℃にて３０分間ブロックした後、ＰＢＳで２回洗浄した。試料（網膜７５μｇ、硝子体１００μｇをＰＢＳ ５０μｌ中に溶かしたもの）を無作為化してプレートに添加し、続いて振盪器（１５０ｒｐｍ）で４℃にて一晩インキュベートした。次いで、プレートをＰＢＳで２回洗浄し、水で１回洗浄した。続いて、１０ｍＭのＤＴＴ（３０μｌ）を溶かした５０ｍＭのＴＥＡＢ溶液を、各ウェルに加えてから、２０℃で１時間インキュベートして、システインスルフヒドリルを還元した。その後、１５０ｍＭのヨードアセトアミドを溶かした５０ｍＭのＴＥＡＢ（５μｌ）溶液を、各ウェルに加えてから、暗所で２０℃で３０分間インキュベートして、システインスルフヒドリルをブロックした。１０μｌの消化溶液（最終濃度：１．２４ｎｇ／μｌのトリプシン、２０ｆｍｏｌ／μｌのＢＳＡペプチド、２６ｆｍｏｌ／μｌの同位体標識ＨＴＲＡ１ペプチド、１ｆｍｏｌ／μｌのｉＲＴペプチド、Biognosys）を各ウェルに加えてから、２０℃で一晩インキュベートした。

標的質量分析によるＨＴＲＡ１ペプチドの定量（選択反応モニタリング、ＳＲＭ）
TSQ Quantiva三連四重極質量分析計（Thermo Scientific）に連結されたUltimate RSLCnano LCで、質量分析を行った。免疫沈降（IP）に使用した９６ウェルプレートから試料（２０μＬ）を直接的に注入し、Acclaim Pepmap 100トラップカラム（１００μｍ×２ｃｍ、Ｃ１８、５μｍ、１００Å、Thermo Scientific）のローディングバッファー（０．５％ｖ／ｖのギ酸、２％ｖ／ｖのＡＣＮ）中に、５μＬ／分で６分間ロードした。次いで、４０℃に加熱されたエレクトロスプレーエミッターを備えるPepMap Easy-SPRAY分析カラム（７５μｍ×１５ｃｍ、３μｍ、１００Å、Thermo Scientific）上で、ペプチドを分離させた。２５０ｎＬ／分の流速で以下の勾配：６分、９８％緩衝液Ａ（２％ＡＣＮ、０．１％ギ酸）、２％緩衝液Ｂ（ＡＣＮ＋０．１％ギ酸）；３６分、３０％緩衝液Ｂ；４１分、６０％緩衝液Ｂ；４３分、８０％緩衝液Ｂ；４９分、８０％緩衝液Ｂ；５０分、２％緩衝液Ｂ）を使用した。サイクルタイム１．５秒、スプレー電圧１８００Ｖ、衝突ガス圧力２ｍＴｏｒｒ、Ｑ１及びＱ３分解能０．７ＦＷＨＭ、イオン移動管温度３００℃のパラメータでTSQ QuantivaをＳＲＭモードにて動作させた。ＨＴＲＡ１ペプチド「ＬＨＲＰＰＶＩＶＬＱＲ」、及び内部標準として使用された同位体標識（Ｌ－［Ｕ－１３Ｃ、Ｕ－１５Ｎ］Ｒ）合成バージョンについて、ＳＲＭ移行を獲得した。データ分析を、Skylineバージョン３．６を使用して実行した。

Claims (18)

1. 式：T_sA_sT_st_st_sa_sc_sc_st_sg_sg_st_sT_sG_sT_sT (配列番号１４３）
   （式中、大文字がＬＮＡヌクレオシド単位を表し、小文字がＤＮＡヌクレオシド単位を表し、下付きのｓは、ホスホロチオエートのヌクレオシド間結合を表す）
   からなるアンチセンスオリゴヌクレオチド。
2. 前記ＬＮＡヌクレオシドが、全てβ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドである、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
3. 前記アンチセンスオリゴヌクレオシドが、以下の式：
   

   

   である、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
4. 請求項１～３のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの医薬として許容される塩。
5. 前記塩がナトリウム塩である、請求項４に記載の医薬として許容される塩。
6. 前記塩がカリウム塩である、請求項４に記載の医薬として許容される塩。
7. 請求項１～３のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド；及び医薬として許容される希釈剤、キャリア、塩及び／又はアジュバントを含む、医薬組成物。
8. 前記医薬組成物が、医薬として許容される希釈剤を含む、請求項７に記載の医薬組成物。
9. 前記医薬として許容される希釈剤が、リン酸緩衝生理食塩水である、請求項８に記載の医薬組成物。
10. 前記オリゴヌクレオチドが、医薬として許容される塩の形態である、請求項７～９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
11. 請求項４～６のいずれか一項に記載の医薬として許容される塩；及び医薬として許容される希釈剤、キャリア、塩及び／又はアジュバントを含む、医薬組成物。
12. 前記医薬として許容される塩が、ナトリウム塩又はカリウム塩である、請求項７～１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
13. 医薬において使用される、請求項１～３のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は請求項４～６のいずれか一項に記載の医薬として許容される塩、請求項７～１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
14. 黄斑変性の治療において使用するための、請求項１～３のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は請求項４～６のいずれか一項に記載の医薬として許容される塩、又は請求項７～１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
15. 前記黄斑変性が、ｗｅｔＡＭＤ、ｄｒｙＡＭＤ、地図状萎縮及び中間ｄＡＭＤから選ばれる、請求項１４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、医薬として許容される塩、又は医薬組成物。
16. 黄斑変性の治療又は予防のための医薬の製造のための、請求項１～３のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は請求項４～６のいずれか一項に記載の医薬として許容される塩、又は請求項７～１２のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
17. 前記黄斑変性が、ｗｅｔＡＭＤ、ｄｒｙＡＭＤ、地図状萎縮及び中間ｄＡＭＤから選ばれる、請求項１６に記載の使用。
18. ＨＴＲＡ１を発現する標的細胞におけるＨＴＲＡ１発現を調節するためのインビトロ方法であって、請求項１～３のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項４～６のいずれか一項に記載の医薬として許容される塩、又は請求項７～１２のいずれか一項に記載の医薬組成物を、前記細胞に有効な量で投与することを含む、前記方法。

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