CN109415732A - 用于调节htra1表达的反义寡核苷酸 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及与HTRA1互补的反义寡核苷酸(寡聚体)，其导致HTRA1表达的调节。HTRA1表达的调节有益于一系列医学病症，如黄斑变性，例如年龄相关性黄斑变性。

Description

用于调节HTRA1表达的反义寡核苷酸
发明领域
本发明涉及与HTRA1互补的反义寡核苷酸(寡聚体)，其导致HTRA1表达的调节。HTRA1表达的调节有益于一系列医学病症，如黄斑变性，例如年龄相关性黄斑变性。
背景
人高温需求A(human high temperature requirement A，HTRA)家族的丝氨酸蛋白酶是普遍表达的PDZ-蛋白酶，它通过组合蛋白酶和分子伴侣的双重功能参与维持细胞外区室的蛋白质稳态。HTRA管家蛋白酶涉及细胞外基质的组织，细胞增殖和衰老。HTRA活性的调节与严重疾病(包括迪谢内肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy)(Bakay等.2002，Neuromuscul.Disord.12：125-141)，关节炎，例如骨关节炎(Grau等.2006，JBC 281：6124-6129)，癌症，家族性缺血性脑小血管病以及年龄相关性黄斑变性，以及帕金森病和阿尔茨海默病)有关。人HTRA1含有胰岛素样生长因子(IGF)结合结构域。已经提出其调节IGF可用性和细胞生长(Zumbrunn和Trueb，1996，FEES Letters 398：189-192)并显示肿瘤抑制特性。HTRA1表达在转移性黑素瘤中下调，因此可以指示黑素瘤进展的程度。在异种移植小鼠模型中，HTRA1在转移性黑素瘤细胞系中的过表达降低体外增殖和侵袭，并且降低肿瘤生长(Baldi等.，2002，Oncogene 21：6684-6688)。HTRA1表达在卵巢癌中也下调。在卵巢癌细胞系中，HTRA1过表达诱导细胞死亡，而反义HTRA1表达促进锚定非依赖性生长(Chien等.，2004，Oncogene 23：1636-1644)。
除了其对IGF途径的影响之外，HTRA1还抑制TGFβ家族生长因子的信号传导(Oka等.，2004，Development 131：1041-1053)。HTRA1可切割淀粉样蛋白前体蛋白(APP)，HTRA1抑制剂引起Aβ肽在培养细胞中的积累。因此，HTRA1也与阿尔茨海默病有关(Grau等.，2005，Proc.Nat.Acad.Sci.USA.102：6021-6026)。
另一方面，已经观察到HTRA1上调并且似乎与迪谢内肌营养不良(Bakay等.2002，Neuromuscul.Disord.12：125-141)和骨关节炎(Grau等.2006，JBC 281：6124-6129)和AMD(Fritsche，等.Nat Gen 2013 45(4)：433-9.)有关。
HTRA1启动子区域(rs11200638)中的单核苷酸多态性(SNP)与发生年龄相关性黄斑变性(AMD)的风险增加10倍相关。此外，HTRA1 SNP与跟发生年龄相关性黄斑变性(AMD)的风险增加有关的ARMS2 SNP(rs10490924)处于连锁不平衡。风险等位基因与HTRA1 mRNA和蛋白质表达增加2-3倍相关，并且AMD患者的玻璃疣中存在HTRA1(Dewan等.，2006，Science314：989-992；Yang等.，2006，Science 314：992-993)。不同的动物模型已经证实HtrA1的过表达在小鼠中诱导AMD样表型。hHTRA转基因小鼠(Veierkottn，PlosOne 2011)揭示了Bruch膜弹性层的降解，确定脉络膜血管异常(Jones，PNAS 2011)并增加息肉状脉络膜血管病(Polypoidal choroidal vasculopathy，PCV)病变(Kumar，IOVS 2014)。此外，已报道hHTRA1 Tg小鼠中的Bruch膜损伤，这决定了接触香烟烟雾后增加CNV 3倍(Nakayama，IOVS2014)。
年龄相关性黄斑变性(AMD)是65岁以上人群不可逆转视力丧失的主要原因。随着AMD的发作，眼后部的光敏感光感受器细胞、在代谢上支持其的下层色素上皮细胞、及其提供的清晰的中心视觉逐渐丧失。年龄是AMD发病的主要危险因素：55岁以后发生AMD的可能性增加三倍。吸烟，浅的虹膜颜色，性别(女性风险更大)，肥胖以及反复暴露于UV辐射也会增加患AMD的风险。有两种形式的AMD：干性AMD和湿性AMD。在干性AMD中，玻璃疣出现在眼睛的黄斑中，黄斑中的细胞死亡，并且视力变得模糊。干性AMD可分三个阶段进展：1)早期，2)中间体，和3)晚期干性AMD。在任何这些阶段中，干性AMD也可以进展为湿性AMD。湿性AMD(也称为渗出性AMD)与病理性后段新血管形成有关。在渗出性AMD中发现的后段新生血管形成(PSNV)的特征在于病理性脉络膜新血管形成。在此过程中形成的异常血管的渗漏会破坏黄斑并损害视力，最终导致失明。湿性AMD的治疗策略很少，最好是治标治疗。因此，在提供治疗黄斑变性病症例如湿性和干性AMD的有效药物方面存在未满足的医学需求。WO 2008/013893要求保护一种用于治疗患有年龄相关性黄斑变性的受试者的组合物，其包含含有与HTRA1基因或mRNA杂交的反义序列的核酸分子：没有公开反义分子。WO2009/006460提供了靶向HTRA1的siRNA及其在治疗AMD中的用途。
本发明的目的
本发明提供了体内或体外调节HTRA1的反义寡核苷酸。本发明鉴定了存在于人HTRA1 mRNA(包括前mRNA)中的隐蔽靶序列基序，其可被反义寡核苷酸靶向以产生有效的HTRA1抑制。本发明还提供了能够抑制HTRA1的有效反义寡核苷酸序列和化合物，及其在治疗指示HTRA1的疾病或病症中的用途。
发明概述
本发明涉及靶向哺乳动物HTRA1核酸的寡核苷酸，即能够抑制HTRA1的表达并治疗或预防与HTRA1功能相关的疾病。靶向HTRA1的寡核苷酸是反义寡核苷酸，即与其HTRA1核酸靶标互补。
本发明的寡核苷酸可以是药学上可接受的盐的形式，例如钠盐或钾盐。
因此，本发明提供了反义寡核苷酸，其包含长度为10-30个核苷酸、具有至少90％互补性(如与哺乳动物HTRA1核酸如SEQ ID NO 1，SEQ ID NO 2，SEQ ID NO 3或SEQ ID NO4完全互补)的连续核苷酸序列。
在另一方面，本发明提供包含本发明的寡核苷酸和药学上可接受的稀释剂，载体，盐和/或佐剂的药物组合物。
本发明提供LNA反义寡核苷酸，如LNA缺口体(gapmer)寡核苷酸，其包含长度为10-30个核苷酸、具有至少90％互补性(如与HTRA1核酸如选自由SEQ ID NO 1，SEQ ID NO 2，SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4组成的组的序列完全互补)的连续核苷酸序列。
本发明提供了反义寡核苷酸，其包含与SEQ ID NO 147至少90％如100％互补的10-22个(如12-22个)核苷酸的连续核苷酸区域：
SEQ ID NO 147：5′CCAACAACCAGGTAAATATTTG 3′
本发明提供了反义寡核苷酸，其包含与选自由SEQ ID NO 148-155组成的组的序列互补的10-17个(如11，12，13，14，15，16，如12-16或12-17个)核苷酸的连续核苷酸区域。
本发明提供了反义寡核苷酸，其包含与SEQ ID NO 148或155互补的10-17个(如11，12，13，14，15，16，如12-16或12-17个)核苷酸的连续核苷酸区域。
本发明提供长度为10-30个核苷酸的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包含与SEQ ID NO 147至少90％如100％互补的10-22个核苷酸的连续核苷酸区域：
SEQ ID NO 147：5′CCAACAACCAGGTAAATATTTG 3′
本发明提供长度为10-30个核苷酸的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包含与选自SEQ ID NO 148-155的序列中呈现的序列互补的至少10个如至少12个连续核苷酸的连续核苷酸区域。
本发明提供长度至少为12个核苷酸的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包含SEQ ID NO 146的连续序列。
SEQ ID NO 146：5′TTTACCTGGTT 3′。
本发明提供了实施例中提供的寡核苷酸。本发明提供寡核苷酸，如反义寡核苷酸，其包含选自由SEQ ID NO 5-145组成的组的序列中呈现的至少10个如至少12个。
本发明提供了缀合物，其包含根据本发明的寡核苷酸，和至少一个与所述寡核苷酸共价连接的缀合物部分。
本发明提供了本发明的寡核苷酸或缀合物的药学上可接受的盐。
在另一方面，本发明提供了用于通过向表达HTRA1的细胞施用有效量的本发明的寡核苷酸，缀合物或组合物来调节所述细胞中HTRA1表达的体内或体外方法的方法。
在另一方面，本发明提供了治疗或预防与HTRA1的体内活性相关的疾病，病症或功能障碍的方法，其包括向患有或易患所述疾病，病症或功能障碍的受试者施用治疗或预防有效量的本发明的寡核苷酸或其缀合物。
在另一方面，本发明的寡核苷酸或组合物用于治疗或预防黄斑变性，以及涉及HTRA1的其他病症。
本发明提供了本发明的寡核苷酸或缀合物，其用于治疗选自包含以下项的列表的疾病或病症：迪谢内肌营养不良，关节炎如骨关节炎，家族性缺血性脑小血管病，阿尔茨海默病和帕金森氏病。
本发明提供了本发明的寡核苷酸或缀合物，其用于治疗黄斑变性，例如湿性或干性年龄相关性黄斑变性(例如wAMD，dAMD，地图状萎缩(geographic atrophy)，中间性dAMD(intermediate dAMD))或糖尿病视网膜病。
本发明提供了本发明的寡核苷酸，缀合物或组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗黄斑变性，如湿性或干性年龄相关性黄斑变性(如wAMD，dAMD，地图状萎缩，中间性dAMD)或糖尿病视网膜病。
本发明提供了本发明的寡核苷酸，缀合物或组合物在制备用于治疗选自由以下组成的组的疾病或病症的药物中的用途：迪谢内肌营养不良，关节炎如骨关节炎，家族性缺血性脑小血管病，阿尔茨海默病和帕金森氏病。
本发明提供治疗患有选自由以下组成的组的疾病或病症的受试者的方法：迪谢内肌营养不良，关节炎如骨关节炎，家族性缺血性脑小血管病，阿尔茨海默病和帕金森氏病，所述方法包括给所述受试者施用有效量的本发明的寡核苷酸，缀合物或组合物的步骤。
本发明提供治疗患有眼病如黄斑变性，如湿性或干性年龄相关性黄斑变性(例如wAMD，dAMD，地图状萎缩，中间性dAMD)或糖尿病视网膜病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本发明的寡核苷酸，缀合物或组合物的步骤。
本发明提供治疗患有眼病如黄斑变性，如湿性或干性年龄相关性黄斑变性(例如wAMD，dAMD，地图状萎缩，中间性dAMD)或糖尿病视网膜病的受试者的方法，所述方法包括以约10μg-200μg的剂量在眼内注射中施用至少两个剂量的本发明的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中连续施用间的剂量间隔为至少4周或至少一个月。
附图简述
图1.在U251和ARPE19细胞系中以25μM筛选n＝129个HTRA1 LNA寡核苷酸的文库。读出：HTRA1 qPCR。位于位置33042-33064之间的n＝6个寡核苷酸相对活跃。
图2.在U251和ARPE19细胞系中分别以5和25μM筛选33042-33064热点中n＝116个HTRA1 LNA寡核苷酸的文库。选择n＝7个寡核苷酸用于进一步分析。读出：HTRA1 qPCR。
图3.用LNA寡核苷酸139，1和143，1处理人原代RPE细胞后HTRA1 mRNA水平的剂量应答。
图5.大鼠体内功效研究，7天治疗，IVT施用，剂量应答。分析来自用PBS，140.1或143.1处理的大鼠眼睛的视网膜样品。进行Htra1 ISH RNAscope，在A)中是代表性样品中并且在B)中显示结果的概览表。还进行了GFAP IHC，GFAP是反应性神经胶质增生和视网膜纤维化的标志物。C)进行Htra1 qPCR的视网膜样品。RE：右眼，LE：左眼。D)进行寡核苷酸含量生物分析，并显示相比于相对mRNA表达绘制的生物分析的剂量应答曲线。EC50测定在GraphPad Prims中进行。对于PBS处理的样品，将寡核苷酸含量设定为0.01μg/g组织。
图6.白化鼠中的概念验证(Poc)研究，蓝光诱导的视网膜变性A)蓝光暴露后14天视网膜电图a波和b波振幅的恢复(％)。条棒表示组平均值和95％CI。每个数据点指示每只研究动物的右眼和左眼值的平均值。B)ISH RNA scope，来自视网膜的2个不同区域的实例。C)视网膜样品的Htra1 qPCR。D)PK PD相关性。
图7.大鼠体内功效动力学研究，IVT施用，50μg/眼，处理3，7，14天。A)通过qPCR在视网膜中测量的HTRA1 mRNA水平。B)通过ISH定量的HTRA1 mRNA水平。残留的HTRA1 mRNA表达水平显示为A和B中对照(PBS处理的细胞)的百分比，以及C)各个时间点的寡核苷酸含量相比于qPCR数据的剂量应答曲线。
图8.非人灵长类动物(NHP)PK/PD研究，IVT施用，25μg/眼。A)通过qPCR在视网膜中测量的HTRA1 mRNA水平。B)通过ISH显示的HTRA1 mRNA水平。C-D)通过IP-MS分别定量视网膜和玻璃体中的HTRA1蛋白水平。点显示个体动物的数据。误差条棒显示技术重复(n＝3)的标准偏差。
图9.本发明的化合物(化合物ID NO 143，1)。所述化合物可以是药用盐的形式，例如钠盐或钾盐。
图10.本发明的化合物(化合物ID No 145，3)。所述化合物可以是药用盐的形式，例如钠盐或钾盐。
图11.化合物143.1的药用盐的实例。M+是合适的阳离子，通常是正金属离子，例如是钠离子或钾离子。阳离子与寡核苷酸阴离子的化学计量比率将取决于所用阳离子的电荷。适当地，可以使用具有一个，两个或三个正电荷的阳离子(M+，M++或M+++)。为了说明的目的，与二价阳离子例如Ca2+相比，需要两倍的带单个+电荷的阳离子(单价)，如Na+或K+。
图12.化合物145.3的药用盐的实例。有关阳离子M+的说明，请参见图11的图例。
定义
寡核苷酸
如本文所用的术语“寡核苷酸”定义为本领域技术人员通常将其理解为包含两个或更多个共价连接的核苷的分子。这种共价结合的核苷也可称为核酸分子或寡聚体。寡核苷酸通常在实验室中通过固相化学合成然后纯化制备。当提及寡核苷酸的序列时，参考共价连接的核苷酸或核苷的核碱基部分或其修饰的序列或顺序。本发明的寡核苷酸是人造的，并且是化学合成的，并且通常是纯化或分离的。本发明的寡核苷酸可包含一种或多种经修饰的核苷或核苷酸。
反义寡核苷酸
如本文所用的术语“反义寡核苷酸”定义为能够通过与靶核酸杂交，特别是与靶核酸上的连续序列杂交来调节靶基因表达的寡核苷酸。反义寡核苷酸基本上不是双链的，并且因此不是siRNA。优选地，本发明的反义寡核苷酸是单链的。
连续核苷酸区域
术语“连续核苷酸区域”是指寡核苷酸与靶核酸互补的区域。该术语在本文中可与术语“连续核苷酸序列”或“连续核碱基序列”和术语“寡核苷酸基序序列”互换使用。在一些实施方案中，寡核苷酸的所有核苷酸都存在于连续的核苷酸区域中。在一些实施方案中，寡核苷酸包含连续核苷酸区域，并且任选地包含其他核苷酸，例如可用于将官能团连接至连续核苷酸序列的核苷酸接头区域。核苷酸接头区域可以与靶核酸互补或可以不互补。在一些实施方案中，存在于连续核苷酸区域的核苷酸之间的核苷间连接(intemucleosidelinkage)全部是硫代磷酸酯核苷间连接。在一些实施方案中，连续核苷酸区域包含一个或多个糖修饰的核苷。
核苷酸
核苷酸是寡核苷酸和多核苷酸的构建单元，并且出于本发明的目的，核苷酸包括天然存在的和非天然存在的核苷酸。在自然界中，核苷酸例如DNA和RNA核苷酸包含核糖部分，核碱基部分和一个或多个磷酸基团(其在核苷中不存在)。核苷和核苷酸也可互换地称为“单元”或“单体”。
经修饰的核苷
如本文所用的术语“修饰的核苷”或“核苷修饰”是指通过引入糖部分或(核)碱基部分的一个或多个修饰而与等同的DNA或RNA核苷相比经修饰的核苷。在优选的实施方案中，经修饰的核苷包含经修饰的糖部分。术语经修饰的核苷在本文中也可与术语“核苷类似物”或经修饰的“单元”或经修饰的“单体”互换使用。
经修饰的核苷间连接
如本领域技术人员通常理解的，术语“经修饰的核苷间连接”定义为磷酸二酯(PO)连接以外的连接，其将两个核苷共价偶联在一起。具有经修饰的核苷间连接的核苷酸也称为“经修饰的核苷酸”。在一些实施方案中，与磷酸二酯连接相比，经修饰的核苷间连接增加了寡核苷酸的核酸酶抗性。对于天然存在的寡核苷酸，核苷间连接包括在相邻核苷之间产生磷酸二酯键的磷酸基团。经修饰的核苷间连接特别适用于稳定体内使用的寡核苷酸，并且可用于保护本发明寡核苷酸中DNA或RNA核苷区域(例如在缺口体寡核苷酸的缺口区域内，以及在经修饰的核苷区域中)的核酸酶切割。
在一个实施方案中，寡核苷酸包含从天然磷酸二酯修饰为例如对核酸酶攻击更具抗性的连接的一个或多个核苷间连接。核酸酶抗性可以通过在血清中孵育寡核苷酸或通过使用核酸酶抗性测定(例如蛇毒磷酸二酯酶(SVPD))来确定，两者都是本领域熟知的。能够增强寡核苷酸的核酸酶抗性的核苷间连接被称为核酸酶抗性核苷间连接。在一些实施方案中，寡核苷酸的所有核苷间连接或其连续核苷酸序列都被修饰。应当认识到，在一些实施方案中，将本发明的寡核苷酸与非核苷酸官能团(例如缀合物)连接的核苷可以是磷酸二酯。在一些实施方案中，寡核苷酸的所有核苷间连接或其连续核苷酸序列是核酸酶抗性的核苷间连接。
在一些实施方案中，经修饰的核苷间连接可以是硫代磷酸酯核苷间连接。在一些实施方案中，经修饰的核苷间连接与本发明的寡核苷酸的RNaseH募集相容，例如硫代磷酸酯。
在一些实施方案中，核苷间连接包含硫(S)，例如硫代磷酸酯核苷间连接。
由于核酸酶抗性，有益的药学动力学和易于制造，硫代磷酸酯核苷间连接特别有用。在一些实施方案中，寡核苷酸的所有核苷间连接或其连续核苷酸序列是硫代磷酸酯。
碱基
术语核碱基包括存在于核苷和核苷酸中的嘌呤(例如腺嘌呤和鸟嘌呤)和嘧啶(例如尿嘧啶，胸腺嘧啶和胞嘧啶)部分，其在核酸杂交中形成氢键。在本发明的上下文中，术语核碱基还包括修饰的核碱基，其可以不同于天然存在的核碱基，但在核酸杂交期间是有功能的。在本文中，“核碱基”是指天然存在的核碱基如腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶，胸腺嘧啶，尿嘧啶，黄嘌呤和次黄嘌呤，以及非天然存在的变体。这些变体例如描述于Hirao等(2012)Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055和Bergstrom(2009)CurrentProtocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl.37 1.4.1。
在一些实施方案中，通过将嘌呤或嘧啶改变为经修饰的嘌呤或嘧啶(例如经取代的嘌呤或经取代的嘧啶，如选自异胞嘧啶，假异胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，5-噻唑并-胞嘧啶，5-丙炔基-胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-噻唑并-尿嘧啶，2-硫代-尿嘧啶，2′硫代-胸腺嘧啶，肌苷，二氨基嘌呤，6-氨基嘌呤，2-氨基嘌呤，2，6-二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤的核碱基)来修饰核碱基部分。
核碱基部分可以用每个相应核碱基的字母代码表示，例如，A，T，G，C或U，其中每个字母可任选地包括具有等同功能的经修饰的核碱基。例如，在示例性寡核苷酸中，核碱基部分选自A，T，G，C和5-甲基胞嘧啶。任选地，对于LNA缺口体，可以使用5-甲基胞嘧啶LNA核苷。在一些实施方案中，5′cg3′基序中的胞嘧啶核碱基是5-甲基胞嘧啶。
经修饰的寡核苷酸
术语经修饰的寡核苷酸描述了包含一个或多个糖修饰的核苷和/或修饰的核苷间连接的寡核苷酸。术语嵌合寡核苷酸是在文献中用于描述具有经修饰的核苷的寡核苷酸的术语。
互补性
术语互补性描述了核苷/核苷酸沃森-克里克碱基配对的能力。沃森-克里克碱基对是鸟嘌呤(G)-胞嘧啶(C)和腺嘌呤(A)-胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)。应当理解，寡核苷酸可以包含具有经修饰的核碱基的核苷，例如通常使用5-甲基胞嘧啶代替胞嘧啶，因此术语互补包括在未经修饰和经修饰的核碱基之间的沃森-克里克碱基配对(参见例如Hirao等(2012)Accounts of Chemical Research vol 45page 2055和Bergstrom(2009)CurrentProtocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl.37 1.4.1)。
如本文所用，术语“％互补”是指核酸分子(例如寡核苷酸)中连续核苷酸区域或序列的核苷酸数百分比，其在给定位置与单独的核酸分子(例如靶核酸)的给定位置处的连续核苷酸序列互补(即形成沃森-克里克碱基对)。通过计数在两个序列之间形成对的对齐碱基的数目，除以寡核苷酸中的核苷酸总数并乘以100来计算百分比。在这种比较中，不对齐(不形成碱基对)的核碱基/核苷酸被称为错配。
应当理解，当提及两个序列之间的互补性时，在两个序列中较短的序列的长度上(例如连续核苷酸区域或序列的长度)测量互补性的确定。
术语“完全互补”是指100％的互补性。在没有％术语值或不匹配指示的情况下，互补意味着完全互补。
同一性
本文使用的术语“同一性”是指核酸分子(例如寡核苷酸)中连续核苷酸序列的核苷酸数百分比，其在给定位置与单独的核酸分子(例如靶核酸)的给定位置处的连续核苷酸序列相同(即在与互补核苷形成沃森-克里克碱基对的能力方面)。通过计算两个序列之间相同的对齐碱基数(包括缺口)除以寡核苷酸中的核苷酸总数并乘以100来计算百分比。同一性百分比＝(匹配x 100)/对齐区域(带有缺口)的长度。
当确定寡核苷酸的连续核苷酸区域的同一性时，在连续核苷酸区域的长度上计算同一性。在寡核苷酸的整个连续核苷酸序列是连续核苷酸区域的实施方案中，因此在寡核苷酸的核苷酸序列的长度上计算同一性。在这方面，连续核苷酸区域可以与参考核酸序列的区域相同，或者在一些实施方案中，可以与整个参考核酸相同。除非另有说明，否则与参考序列具有100％同一性的序列被称为相同。例如，参考序列可以选自由以下组成的组：SEQID NO 5-146和156中的任何一个。
然而，如果寡核苷酸包含位于连续核苷酸区域(例如区域D′或D″)侧翼的另外的核苷酸，则在确定同一性时可忽略这些另外的侧翼核苷酸。在一些实施方案中，可以在整个寡核苷酸序列上计算同一性。
在一些实施方案中，本发明的反义寡核苷酸寡核苷酸包含10-22个连续核苷酸的连续核苷酸区域，其与SEQ ID NO 156相同：
SEQ ID NO 156：5′CAAATATTTACCTGGTTGTTGG 3′
在一些实施方案中，连续核苷酸区域包含SEQ ID NO 156的至少10个连续核苷酸或由其组成，例如11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22个连续核苷酸，例如12-22个例如14-18个连续核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸的整个连续序列包含SEQ ID NO 156的至少10个连续核苷酸或由其组成，例如11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22个连续核苷酸，例如12-22个例如14-18个连续核苷酸。
在一些实施方案中，连续核苷酸区域是SEQ ID NO 156的至少12个连续核苷酸。在一些实施方案中，连续核苷酸区域是SEQ ID NO 156的至少14个连续核苷酸。在一些实施方案中，连续核苷酸区域是SEQ ID NO 156的至少16个连续核苷酸。
在一些实施方案中，连续核苷酸区域是与SEQ ID NO 143相同的至少10，12，14或16个连续核苷酸。
在一些实施方案中，连续核苷酸区域是与SEQ ID NO 145相同的至少10，12，14或16个连续核苷酸。
在一些实施方案中，连续核苷酸区域是SEQ ID NO 143的至少10，11，12，13，14，15或16个连续核苷酸。
在一些实施方案中，连续核苷酸区域是与SEQ ID NO 145相同的至少10，11，12，13，14，15，16或17个连续核苷酸。
在一些实施方案中，连续核苷酸由SEQ ID NO 143组成或包含SEQ ID NO 143。
在一些实施方案中，连续核苷酸区域由SEQ ID NO 145组成或包含SEQ ID NO145。
在一些实施方案中，连续核苷酸区域是与选自由SEQ ID NO 138，139，140，141，142，143，144和145组成的组的序列相同的至少10，12，14或16个连续核苷酸。在一些实施方案中，连续核苷酸区包含选自由SEQ ID NO 138，139，140，141，142，143，144和145组成的组的序列或由其组成。
在一些实施方案中，连续核苷酸区域包含序列SEQ ID NO 146：TTTACCTGGTT。
本发明提供长度为11-30个核苷酸如长度为12-20个核苷酸的反义寡核苷酸，其包含序列SEQ ID NO 146：TTTACCTGGTT。
杂交
如本文所用的术语“进行杂交”或“杂交”应理解为两条核酸链(例如寡核苷酸和靶核酸)在相对链上的碱基对之间形成氢键，从而形成双链体。两条核酸链之间结合的亲和力是杂交的强度。通常用熔解温度(Tm)来描述，其定义为一半寡核苷酸与靶核酸双链体化的温度。在生理条件下，Tm与亲和力不严格成比例(Mergny和Lacroix，2003，Oligonucleotides 13：515-537)。标准状态吉布斯自由能ΔG是结合亲和力的更准确表示，并且通过ΔG＝-RTln(Kd)，与反应的解离常数(Kd)相关，其中R是气体常数，并且T是绝对温度。因此，寡核苷酸和靶核酸之间反应的非常低的ΔG反映了寡核苷酸和靶核酸之间的强杂交。ΔG是与水溶液浓度为1M，pH为7，温度为37℃的反应相关的能量。寡核苷酸与靶核酸的杂交是自发反应，并且对于自发反应，ΔG小于零。ΔG可以通过实验测量，例如，通过使用如Hansen等.，1965，Chem.Comm.36-38和Holdgate等，2005，Drug Discov Today中所述的等温滴定量热法(ITC)。技术人员将知道商业设备可用于ΔG测量。ΔG也可以通过使用SantaLucia，1998，Proc Natl Acad Sci USA.95：1460-1465中描述的最近邻模型，使用Sugimoto等.，1995，Biochemistry 34：11211-11216和McTigue等.，2004，Biochemistry43：5388-5405中描述的适当衍生的热力学参数进行数值估计。为了具有通过杂交调节其预期核酸靶标的可能性，本发明的寡核苷酸与靶核酸杂交，对于长度为10-30个核苷酸的寡核苷酸，估计的ΔG值低于-10kcal。在一些实施方案中，通过标准状态吉布斯自由能ΔG测量杂交的程度或强度。寡核苷酸可以与靶核酸杂交，其中对于长度8-30个核苷酸的寡核苷酸，估计的ΔG值低于-10kcal，例如低于-15kcal，例如低于-20kcal，并且例如低于-25kcal。在一些实施方案中，寡核苷酸与靶核酸杂交，估计的ΔG值为-10至-60kcal，例如-12至-40kcal，例如-15至-30kcal或-16至-27kcal，例如-18至-25kcal。
靶序列
寡核苷酸包含与靶核酸分子的子序列互补或杂交的连续核苷酸区域。如本文所用的术语“靶序列”是指靶核酸中存在的核苷酸序列，其包含与本发明的寡核苷酸的连续核苷酸区域或序列互补的核碱基序列。在一些实施方案中，靶序列由靶核酸上与本发明的寡核苷酸的连续核苷酸区域或序列互补的区域组成。在一些实施方案中，靶序列比单个寡核苷酸的互补序列长，并且可以例如代表可以被本发明的若干种寡核苷酸靶向的靶核酸的优选区域。
本发明的寡核苷酸包含与靶核酸例如靶序列互补的连续核苷酸区域。
寡核苷酸包含至少10个核苷酸的连续核苷酸区域，其与靶核酸分子中存在的靶序列互补或杂交。连续核苷酸区域(以及因此靶序列)包含至少10个连续核苷酸，例如11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22个连续核苷酸，例如12-22，例如14-18个连续的核苷酸。
在一些实施方案中，靶序列是或存在于SEQ ID NO 147中。
在一些实施方案中，靶序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO 148，149，150，151，152，153，154和155：
SEQ ID NO 148：AACAACCAGGTAAATA
SEQ ID NO 149：CAACCAGGTAAATATTTG
SEQ ID NO 150：CCAACAACCAGGTAAA
SEQ ID NO 151：AACCAGGTAAATATTTGG
SEQ ID NO 152：ACAACCAGGTAAATATTTGG
SEQ ID NO 153：CAACAACCAGGTAAATAT
SEQ ID NO 154：ACAACCAGGTAAATAT
SEQ ID NO 155：AACAACCAGGTAAATAT
本发明提供长度为10-30个核苷酸的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包含与选自SEQ ID NO 147&148-155的序列中存在的序列互补的至少10个连续核苷酸的连续核苷酸区域。
本发明提供长度为12-30个核苷酸的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包含与选自SEQ ID NO 147&148-155的序列中存在的序列互补的至少12个连续核苷酸的连续核苷酸区域。
本发明提供长度为14-30个核苷酸的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包含与选自SEQ ID NO 147&148-155的序列中存在的序列互补的至少14个连续核苷酸的连续核苷酸区域。
本发明提供了反义寡核苷酸，其包含与选自SEQ ID NO 148-155的序列互补的连续核苷酸区域或由其组成。
靶序列可以是靶核酸的子序列。在一些实施方案中，寡核苷酸或连续核苷酸区与HTRA1子序列(例如选自由SEQ ID NO 148-154组成的组的序列)完全互补或仅包含一个或两个错配。在一些实施方案中，寡核苷酸或连续核苷酸区域与HTRA1子序列SEQ ID NO 147完全互补或仅包含一个或两个错配。
靶细胞
如本文所用的术语靶细胞是指表达靶核酸的细胞。在一些实施方案中，靶细胞可以是在体内或体外。在一些实施方案中，靶细胞是哺乳动物细胞，例如啮齿动物细胞，例如小鼠细胞，或大鼠细胞，或灵长类动物细胞，例如猴细胞或人细胞。在一些实施方案中，细胞可以是猪细胞，狗细胞或兔细胞。在一些实施方案中，靶细胞可以是视网膜细胞，例如视网膜色素上皮细胞(PRE)。在一些实施方案中，细胞选自由以下组成的组：RPE细胞，双极细胞，无长突细胞，内皮细胞，神经节细胞和小胶质细胞。对于体外评估，靶细胞可以是原代细胞或已建立的细胞系，例如U251，ARPE19，HEK293或大鼠C6细胞。
靶核酸
根据本发明，靶核酸是编码哺乳动物HTRA1的核酸，并且可以是例如基因，RNA，mRNA和前mRNA，成熟mRNA或cDNA序列。因此，靶标可以称为HTRA1靶核酸。
合适地，靶核酸编码HTRA1蛋白，特别是哺乳动物HTRA1，例如人HTRA1(参见例如表1&2，其提供人和大鼠HTRA1的mRNA和前mRNA序列)。
在一些实施方案中，靶核酸选自由以下组成的组：SEQ ID NO：1，2，3和4，或其天然存在的变体(例如编码哺乳动物HTRA1蛋白的序列)。
靶细胞是表达HTRA1靶核酸的细胞。在优选的实施方案中，靶核酸是HTRA1 mRNA，例如HTRA1前mRNA或HTRA1成熟mRNA。对于反义寡核苷酸靶向，通常忽略HTRA1 mRNA的polyA尾。
如果在研究或诊断中使用本发明的寡核苷酸，则靶核酸可以是cDNA或衍生自DNA或RNA的合成核酸。
靶序列可以是靶核酸的子序列。在一些实施方案中，寡核苷酸或连续核苷酸区与HTRA1子序列(例如选自由SEQ ID NO 148，149，150，151，152，153，154和155组成的组的序列)完全互补或仅包含一个或两个错配。
在寡核苷酸或其连续核苷酸区域的长度上测量与靶标或其子序列的互补性。
对于体内或体外应用，本发明的寡核苷酸通常能够抑制HTRA1靶核酸在表达HTRA1靶核酸的细胞中的表达。如在寡核苷酸的整个长度上测量的，本发明的寡核苷酸的连续核碱基序列通常与HTRA1靶核酸互补，任选地除了一个或两个错配，并且任选地排除可以将寡核苷酸与任选的官能团如缀合物连接的基于核苷酸的接头区域或其他非互补末端核苷酸(例如区域D)。在一些实施方案中，靶核酸可以是RNA或DNA，例如信使RNA，例如成熟mRNA或前mRNA。在一些实施方案中，靶核酸是RNA或DNA，其编码哺乳动物HTRA1蛋白，例如人HTRA1，例如人HTRA1 mRNA序列，例如SEQ ID NO 1(NM_002775.4，GI：190014575)所公开的。表1和2中提供了关于示例性靶核酸的进一步信息。
表1.人和大鼠HTRA1的基因组和组装信息
Fwd＝正向链。基因组坐标提供前mRNA序列(基因组序列)。NCBI参考提供mRNA序列(cDNA序列)。
*National Center for Biotechnology Information参考序列数据库是一套全面，综合，非冗余，注释良好的参考序列，包括基因组，转录本和蛋白质。其服务器在www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq。
表2.人和大鼠HTRA1的序列详细信息
天然存在的变体
术语“天然存在的变体”是指HTRA1基因或转录本的变体，其源自与靶核酸相同的遗传基因座，但是例如由于以下而不同：遗传密码的简并性(导致编码相同氨基酸的密码子的多样性)，或由于前mRNA的可变剪接，或多态性的存在，例如单核苷酸多态性和等位基因变体。基于寡核苷酸的足够互补序列的存在，本发明的寡核苷酸因此可以靶向靶核酸及其天然存在的变体。在一些实施方案中，天然存在的变体与哺乳动物HTRA1靶核酸(例如选自由SEQ ID NO 1，2，3，或4组成的组的靶核酸)具有至少95％，例如至少98％或至少99％的同源性。
表达的调节
如本文所用的术语“表达的调节”应理解为当与施用寡核苷酸之前的HTRA1的量相比时寡核苷酸改变HTRA1的量的能力的总称。备选地，可以通过参考不施用本发明的寡核苷酸的对照实验来确定表达的调节。一种类型的调节是寡核苷酸例如通过mRNA的降解或转录的阻断抑制，下调，减少，阻遏，去除，阻止，阻断，预防，减轻，降低，避免或终止HTRA1表达的能力。本发明的反义寡核苷酸能够抑制，下调，减少，阻遏，去除，阻止，阻断，预防，减轻，降低，避免或终止HTRA1的表达。
经高亲和力修饰的核苷
经高亲和力修饰的核苷是经修饰的核苷酸，当其掺入寡核苷酸时增强例如通过熔解温度(Tm)测量的寡核苷酸对其互补靶标的亲和力。本发明的经高亲和力修饰的核苷优选导致熔解温度增加+0.5至+12℃，更优选+1.5至+10℃，最优选+3℃至+8℃/经修饰的核苷。许多经高亲和力修饰的核苷是本领域已知的，包括例如许多经2′取代的核苷以及锁定核酸(locked nucleic acid，LNA)(参见例如Freier&Altmann；Nucl.Acid Res.，1997，25，4429-4443和Uhlmann；Curr.Opinion in Drug Development，2000，3(2)，293-213)。
糖修饰
本发明的寡聚物可包含一个或多个核苷，其具有经修饰的糖部分，即与DNA和RNA中发现的核糖部分相比时糖部分的修饰。
已经制备了许多具有核糖部分修饰的核苷，主要是为了改善寡核苷酸的某些性质，例如亲和力和/或核酸酶抗性。
这些修饰包括核糖环结构被修饰(例如通过用己糖环(HNA)或双环替代)的那些，其通常在核糖环(LNA)上的C2和C4碳之间具有双基桥，或通常缺乏C2和C3碳之间的键的未连接的核糖环(例如UNA)。其他经糖修饰的核苷包括例如双环己糖核酸(WO2011/017521)或三环核酸(WO2013/154798)。经修饰的核苷还包括以下核苷，其中例如在肽核酸(PNA)或吗啉代核酸的情况下糖部分被非糖部分替代。
糖修饰还包括通过将核糖环上的取代基改变为除氢以外的基团或天然存在于DNA和RNA核苷中的2′-OH基团而进行的修饰。取代基可以例如在2′，3′，4′或5′位置引入。具有经修饰的糖部分的核苷还包括经2′修饰的核苷，例如经2′取代的核苷。实际上，已经将很多注意力集中在开发经2′取代的核苷上，并且已发现许多经2′取代的核苷在掺入寡核苷酸时具有有益的性质，例如增强的核苷抗性和增强的亲和力。
经2′修饰的核苷
经2′糖修饰的核苷是以下核苷，其在2′位置具有除H或-OH之外的取代基(经2′取代的核苷)或包含2′连接的双基，并且包括经2′取代的核苷和LNA(2′-4′双基桥接)核苷。例如，经2′修饰的糖可以为寡核苷酸提供增强的结合亲和力和/或增加的核酸酶抗性。经2′取代的修饰的核苷的实例是2′-O-烷基-RNA，2′-O-甲基-RNA，2′-烷氧基-RNA，2′-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)，2′-氨基-DNA，2′-氟-RNA和2′-F-ANA核苷。有关更多示例，请查看例如Freier&Altmann；Nucl.Acid Res.，1997，25，4429-4443和Uhlmann；Curr.Opinion in DrugDevelopment，2000，3(2)，293-213，以及Deleavey和Damha，Chemistry and Biology 2012，19，937。以下是一些经2′取代的修饰的核苷的图示。
锁定核酸核苷(LNA).
LNA核苷是经修饰的核苷，其包含核苷酸的核糖糖环的C2′和C4′之间的连接基团(称为双基(biradicle)或桥)。这些核苷在文献中也称为桥接核酸或二环核酸(BNA)。
在一些实施方案中，本发明的寡聚物的经修饰的核苷或LNA核苷具有式I或II的一般结构：
其中W选自-O-，-S-，-N(Ra)-，-C(RaRb)-，例如，在一些实施方案中选自-O-；
B表示核碱基部分；
Z表示与相邻核苷的核苷间连接或5′末端基团；
Z*表示与相邻核苷的核苷间连接或3′末端基团；
X表示选自由以下组成的列表的基团：-C(RaRb)-，-C(Ra)＝C(Rb)-，-C(Ra)＝N-，-O-，-Si(Ra)2-，-S-，-SO2-，-N(Ra)-，和＞C＝Z
在一些实施方案中，X选自由以下组成的组：-O-，-S-，NH-，NRaRb，-CH2-，CRaRb，-C(＝CH2)-，和-C(＝CRaRb)-
在一些实施方案中，X是-O-
Y表示选自由以下组成的组的基团：-C(RaRb)-，-C(Ra)＝C(Rb)-，-C(Ra)＝N-，-O-，-Si(Ra)2-，-S-，-SO2-，-N(Ra)-，和＞C＝Z
在一些实施方案中，Y选自由以下组成的组：-CH2-，-C(RaRb)-，-CH2CH2-，-C(RaRb)-C(RaRb)-，-CH2CH2CH2-，-C(RaRb)C(RaRb)C(RaRb)-，-C(Ra)＝C(Rb)-，和-C(Ra)＝N-
在一些实施方案中，Y选自由以下组成的组：-CH2-，-CHRa-，-CHCH3-，CRaRb-
或-X-Y-一起表示二价接头基团(也称为基)一起表示由1，2或3个基团/原子组成的二价接头基团，所述二价接头基团选自由以下组成的组：-C(RaRb)-，-C(Ra)＝C(Rb)-，-C(Ra)＝N-，-O-，-Si(Ra)2-，-S-，-SO2-，-N(Ra)-，和＞C＝Z，
在一些实施方案中，-X-Y-表示选自由以下组成的组的双基：-X-CH2-，-X-CRaRb-，-X-CHRa-，-X-C(HCH3)-，-O-Y-，-O-CH2-，-S-CH2-，-NH-CH2-，-O-CHCH3-，-CH2-O-CH2，-O-CH(CH3CH3)-，-O-CH2-CH2-，OCH2-CH2-CH2-，-O-CH2OCH2-，-O-NCH2-，-C(＝CH2)-CH2-，-NRa-CH2-，N-O-CH2，-S-CRaRb-和-S-CHRa-。
在一些实施方案中，-X-Y-表示-O-CH2-或-O-CH(CH3)-。
其中Z选自-O-，-S-，和-N(Ra)-，
并且Ra和存在时的Rb各自独立地选自氢，任选取代的C1-6-烷基，任选取代的C2-6-链烯基，任选取代的C2-6-炔基，羟基，任选取代的C1-6-烷氧基，C2-6-烷氧基烷基，C2-6-链烯氧基，羧基，C1-6-烷氧基羰基，C1-6-烷基羰基，甲酰基，芳基，芳氧基-羰基，芳氧基，芳基羰基，杂芳基，杂芳氧基-羰基，杂芳氧基，杂芳基羰基，氨基，单-和二(C1-6-烷基)氨基，氨基甲酰基，单-和二(C1-6-烷基)-氨基-羰基，氨基-C1-6-烷基-氨基羰基，单-和二(C1-6-烷基)氨基-C1-6-烷基-氨基羰基，C1-6-烷基-羰基氨基，脲基，C1-6-烷酰氧基，磺酰基，C1-6-烷基磺酰氧基，硝基，叠氮基，硫烷基，C1-6-烷硫基，卤素，其中芳基和杂芳基可任选被取代，并且其中两个孪位取代基Ra和Rb一起可表示任选取代的亚甲基(＝CH2)，其中对于所有手性中心，可以发现处于R或S取向的不对称基团。
其中R1，R2，R3，R5和R5*独立地选自由以下组成的组：氢，任选取代的C1-6烷基，任选取代的C2-6-链烯基，任选取代的C2-6-炔基，羟基，C1-6-烷氧基，C2-6-烷氧基烷基，C2-6-链烯氧基，羧基，C1-6-烷氧基羰基，C1-6-烷基羰基，甲酰基，芳基，芳氧基-羰基，芳氧基，芳基羰基，杂芳基，杂芳氧基-羰基，杂芳氧基，杂芳基羰基，氨基，单-和二(C1-6-烷基)氨基，氨基甲酰基，单-和二(C1-6-烷基)-氨基-羰基，氨基-C1-6-烷基-氨基羰基，单-和二(C1-6-烷基)氨基-C1-6-烷基-氨基羰基，C1-6-烷基-羰基氨基，脲基，C1-6-烷酰氧基，磺酰基，C1-6-烷基磺酰氧基，硝基，叠氮基，硫烷基，C1-6-烷硫基，卤素，其中芳基和杂芳基可任选被取代，并且其中两个孪位取代基一起可表示氧代，硫代，亚氨基，或任选取代的亚甲基。
在一些实施方案中，R1，R2，R3，R5和R5*独立地选自C1-6烷基，例如甲基和氢。
在一些实施方案中，R1，R2，R3，R5和R5*都是氢。
在一些实施方案中，R1，R2，R3都是氢，并且R5和R5*之一是氢并且R5和R5*中的另一个不是氢，例如C1-6烷基，例如甲基。
在一些实施方案中，Ra是氢或甲基。在一些实施方案中，当存在时，Rb为氢或甲基。
在一些实施方案中，Ra和Rb中的之一或两者是氢。
在一些实施方案中，Ra和Rb之一是氢，另一个不是氢。
在一些实施方案中，Ra和Rb之一是甲基，并且另一个是氢。
在一些实施方案中，Ra和Rb均为甲基。
在一些实施方案中，双基-X-Y-是-O-CH2-，W是O，并且所有R1，R2，R3，R5和R5*都是氢。这种LNA核苷在WO99/014226，WO00/66604，WO98/039352和WO2004/046160(它们都通过引用并入本文)中公开，并且包括通常称为β-D-氧基LNA和α-L-氧基LNA核苷的物质。
在一些实施方案中，双基-X-Y-是-S-CH2-，W是O，并且所有R1，R2，R3，R5和R5*都是氢。这种硫代LNA核苷在WO99/014226和WO2004/046160中公开，其通过引用并入本文。
在一些实施方案中，双基-X-Y-是-NH-CH2-，W是O，并且所有R1，R2，R3，R5和R5*都是氢。此类氨基LNA核苷在WO99/014226和WO2004/046160中公开，其通过引用并入本文。
在一些实施方案中，双基-X-Y-是-O-CH2-CH2-或-O-CH2-CH2-CH2-，W是O，并且所有R1，R2，R3，R5和R5*都是氢。这种LNA核苷公开于WO00/047599和Morita等，Bioorganic&Med.Chem.Lett.1273-76(其通过引用并入本文)，并且包括通常称为2′-O-4′C-亚乙基桥接核酸(ENA)的化合物。
在一些实施方案中，双基-X-Y-是-O-CH2-，W是O，并且R1，R2，R3中所有和R5与R5*之一是氢，并且R5与R5*中的另一个不是氢，例如如C1-6烷基，如甲基。这种经5′取代的LNA核苷在WO2007/134181(其通过引用并入本文)中公开。
在一些实施方案中，双基-X-Y-是-O-CRaRb-，其中Ra和Rb中的一者或两者不是氢，例如是甲基，W是O，并且R1，R2，R3中所有和R5与R5*之一是氢，并且R5与R5*中的另一个不是氢，例如是C1-6烷基，例如甲基。这种经双修饰的LNA核苷在WO2010/077578(其通过引用并入本文)中公开。
在一些实施方案中，双基-X-Y-表示二价接头基团-O-CH(CH2OCH3)-(2′O-甲氧基乙基二环核酸-Seth等.，2010，J.Org.Chem.Vol 75(5)pp.1569-81)。在一些实施方案中，双基-X-Y-表示二价接头基团-O-CH(CH2CH3)-(2′O-乙基二环核酸-Seth等.，2010，J.Org.Chem.Vol 75(5)pp.1569-81)。在一些实施方案中，双基-X-Y-是-O-CHRa-，W是O，并且所有R1，R2，R3，R5和R5*都是氢。这种经6′取代的LNA核苷在WO10036698和WO07090071(它们都通过引用并入本文)中公开。
在一些实施方案中，双基-X-Y-是-O-CH(CH2OCH3)-，W是O，并且所有R1，R2，R3，R5和R5*都是氢。这种LNA核苷在本领域内也称为环状MOE(cMOE)，并公开于WO07090071中。
在一些实施方案中，双基-X-Y-表示二价接头基团-O-CH(CH3)-.-处于R-或S-构型。在一些实施方案中，双基-X-Y-一起表示二价接头基团-O-CH2-O-CH2-(Seth at al.，2010，J.Org.Chem)。在一些实施方案中，双基-X-Y-是-O-CH(CH3)-，W是O，并且所有R1，R2，R3，R5和R5*都是氢。这种6′甲基LNA核苷在本领域中也称为cET核苷，并且可以是(S)cET或(R)cET立体异构体，如WO07090071(β-D)和WO2010/036698(α-L)(其均通过引用并入本文)中所公开的。
在一些实施方案中，双基-X-Y-是-O-CRaRb-，其中Ra或Rb均不是氢，W是O，并且所有R1，R2，R3，R5和R5*都是氢。在一些实施方案中，Ra和Rb均为甲基。这种经6′二取代的LNA核苷在WO 2009006478(其通过引用并入本文)中公开。
在一些实施方案中，双基-X-Y-是-S-CHRa-，W是O，并且所有R1，R2，R3，R5和R5*都是氢。这种经6′取代的硫代LNA核苷在WO11156202(其通过引用并入本文)中公开。在一些经6′取代的硫代LNA实施方案中，Ra是甲基。
在一些实施方案中，双基-X-Y-是-C(＝CH2)-C(RaRb)-，例如-C(＝CH2)-CH2-，或-C(＝CH2)-CH(CH3)-，W是O，并且所有R1，R2，R3，R5和R5*都是氢。这种乙烯基碳载LNA核苷在WO08154401和WO09067647(其两者通过引用并入本文)中公开。
在一些实施方案中，双基-X-Y-是-N(-ORa)-，W是O，并且所有R1，R2，R3，R3和R5*都是氢。在一些实施方案中，Ra是C1-6烷基，例如甲基。这种LNA核苷也称为N取代的LNA，并且在WO2008/150729(其通过引用并入本文)中公开。在一些实施方案中，双基-X-Y-一起表示二价接头接基团-O-NRa-CH3-(Seth等.，2010，J.Org.Chem)。在一些实施方案中，双基-X-Y-是一N(Ra)-，W是O，并且所有R1，R2，R3，R5和R5*都是氢。在一些实施方案中，Ra是C1-6烷基，例如甲基。
在一些实施方案中，R5和R5*中的一者或两者是氢，并且当被取代时，R5和R5*中的另一个是C1-6烷基，例如甲基。在这样的实施方案中，R1，R2，R3可以全部是氢，并且双基-X-Y-可以选自-O-CH2-或-O-C(HCRa)-，例如-O-C(HCH3)-。
在一些实施方案中，所述双基是-CRaRb-O-CRaRb-，例如CH2-O-CH2-，W是O且所有R1，R2，R3，R5和R5*都是氢。在一些实施方案中，Ra是C1-6烷基，例如甲基。这种LNA核苷也称为构象限制性核苷酸(CRN)，并且在WO2013036868(其通过引用并入本文)中公开。
在一些实施方案中，所述双基是-O-CRaRb-O-CRaRb-，例如O-CH2-O-CH2-，W是O且所有R1，R2，R3，R5和R5*都是氢。在一些实施方案中，Ra是C1-6烷基，例如甲基。这种LNA核苷也称为COC核苷酸，并且在Mitsuoka等.，Nucleic Acids Research 2009 37(4)，1225-1238(其通过引用并入本文)中公开。
除非另有说明，否则将认识到LNA核苷可以是β-D或α-L立体异构体。
LNA核苷的实例在方案1中给出。
方案1
如实施例中所示，在本发明的一些实施方案中，寡核苷酸中的LNA核苷是β-D-氧基-LNA核苷。
核酸酶介导的降解
核酸酶介导的降解是指当与互补核苷酸序列形成双链体时能够介导所述互补核苷酸序列降解的寡核苷酸。
在一些实施方案中，寡核苷酸可通过核酸酶介导的靶核酸降解起作用，其中本发明的寡核苷酸能够募集核酸酶，特别是内切核酸酶，优选内切核糖核酸酶(RNase)，例如RNase H。通过核酸酶介导的机制起作用的寡核苷酸设计的实例是以下寡核苷酸，其通常包含至少5或6个DNA核苷的区域，并且在一侧或两侧侧接增强亲和力的核苷，例如缺口体，头体(headmer)和尾体(tailmer)。
RNase H活性和募集
反义寡核苷酸的RNase H活性是指其在与互补RNA分子的双链体中募集RNase H的能力。WO01/23613提供了用于测定RNaseH活性的体外方法，其可用于测定募集RNaseH的能力。通常如果是以下情况则认为寡核苷酸能够募集RNase H：当与互补靶核酸序列一起提供时所述寡核苷酸具有使用寡核苷酸(其与被测试的经修饰的寡核苷酸具有相同碱基序列但仅含有DNA单体，寡核苷酸中所有单体之间具有硫代磷酸酯键)以及使用WO01/23613(通过引用并入本文)的实施例91-95提供的方法测定的初始速率的至少5％，例如至少10％，或者20％以上的以pmol/1/min测量的初始速率。
缺口体(gapmer)
如本文所用的术语缺口体是指反义寡核苷酸，其包含RNase H募集寡核苷酸区域(缺口)，其5′和3′侧接包含一个或多个增强亲和力的经修饰的核苷的区域(侧翼或翼)。本文描述了各种缺口体设计。头体和尾体是能够募集RNase H的寡核苷酸，其中一个侧翼缺失，即寡核苷酸的仅一个末端包含增强亲和力的经修饰的核苷。对于头体，3′侧翼缺失(即5′侧翼包含增强亲和力的经修饰的核苷)，对于尾体，5′侧翼缺失(即3′侧翼包含增强亲和力的经修饰的核苷)。
LNA缺口体
术语LNA缺口体是缺口体寡核苷酸，其中至少一种增强亲和力的经修饰的核苷是LNA核苷。
混合翼缺口体
术语混合翼缺口体是指LNA缺口体，其中侧翼区包含至少一个LNA核苷和至少一个非LNA修饰的核苷，例如至少一个DNA核苷或至少一个经2′取代的修饰核苷，如，例如，2′-O-烷基-RNA，2′-O-甲基-RNA，2′-烷氧基-RNA，2′-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)，2′-氨基-DNA，2′-氟-RNA和2′-F-ANA核苷。在一些实施方案中，混合翼缺口体具有一个侧翼，其包含LNA核苷(例如5′或3′)，另一个侧翼(3′或5′分别)包含经2′取代的修饰核苷。
缀合物
如本文所用的术语缀合物是指与非核苷酸部分(缀合物部分或区域C或第三区域)共价连接的寡核苷酸。
如本文所用的术语缀合物是指与非核苷酸部分(缀合物部分或区域C或第三区域)共价连接的寡核苷酸。
在一些实施方案中，非核苷酸部分选自由以下组成的组：蛋白质，例如酶，抗体或抗体片段或肽；亲脂性部分，例如脂质，磷脂，甾醇；聚合物，例如聚乙二醇或聚丙二醇；受体配体；小分子；报告分子；和非核苷的碳水化合物。
接头
连接(linkage)或接头(linker)是两个原子之间的连接，其通过一个或多个共价键将一个化学基团或目标片段连接到另一个化学基团或目标片段。缀合物部分可以直接或通过连接部分(例如接头或连接子)与寡核苷酸连接。接头用于共价连接第三区域，例如，将缀合物部分连接至寡核苷酸(例如区域A或C的末端)。
在本发明的一些实施方案中，本发明的缀合物或寡核苷酸缀合物可任选地包含位于寡核苷酸和缀合物部分之间的接头区。在一些实施方案中，缀合物和寡核苷酸之间的接头是生物可切割的。
生物可切割的接头包含生理学不稳定的键或由其组成，所述生理学不稳定的键在通常遇到的或类似于在哺乳动物体内遇到的条件下可切割。生理学不稳定的接头经历化学转化(例如，切割)的条件包括化学条件，例如pH，温度，氧化或还原条件或试剂，以及与在哺乳动物细胞中遇到的或类似的盐浓度。哺乳动物细胞内条件还包括通常存在于哺乳动物细胞中的酶活性，例如蛋白水解酶或水解酶或核酸酶的酶活性。在一个实施方案中，生物可切割的接头易受S1核酸酶切割的影响。在优选的实施方案中，核酸酶敏感性接头包含1至10个核苷，例如1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个核苷，更优选2至6个核苷，最优选2至4个连接的核苷，其包含至少两个连续的磷酸二酯连接，例如至少3或4或5个连续的磷酸二酯连接。优选地，核苷是DNA或RNA。含有生物可切割的接头的磷酸二酯在WO2014/076195(通过引用结合于此)中有更详细的描述，并且可以在本文中称为区域D。
缀合物也可以通过非生物可切割的接头与寡核苷酸连接，或者在一些实施方案中，缀合物可以包含与生物可切割的接头共价附接的不可切割的接头。接头不一定是生物可切割的，但主要用于将缀合物部分共价连接至寡核苷酸或生物可切割的接头。这种接头可包含链结构或重复单元(例如乙二醇，氨基酸单元或氨基烷基)的低聚物。在一些实施方案中，接头(区域Y)是氨基烷基，例如C2-C36氨基烷基，包括例如C6至C12氨基烷基。在一些实施方案中，接头(区域Y)是C6氨基烷基。缀合物接头基团可以通过使用经氨基修饰的寡核苷酸和缀合物基团上的活化酯基团常规附接到寡核苷酸上。
治疗
本文所用的术语‘治疗’是指治疗现有疾病(例如本文所述的疾病或病症)或防止疾病，即预防。因此将认识到，在一些实施方案中，本文提及的治疗可以是预防性的。
发明详述
本发明的寡核苷酸
本发明涉及能够抑制HTRA1表达的寡核苷酸。调节可以通过与编码HTRA1或参与HTRA1的调节的靶核酸杂交来实现。靶核酸可以是哺乳动物HTRA1序列，例如选自由SEQ ID1，2，3或4组成的组的序列。
本发明的寡核苷酸是靶向HTRA1(例如哺乳动物HTRA1)的反义寡核苷酸。
在一些实施方案中，本发明的反义寡核苷酸能够通过抑制或下调靶标来调节靶标的表达。优选地，与靶标的正常表达水平相比，这种调节抑制表达至少20％，例如至少30％，40％，50％，60％，70％，80％或90％。在一些实施方案中，使用ARPE-19细胞，本发明化合物能够在体外使HTRA1 mRNA的表达水平抑制至少60％或70％。在一些实施方案中，使用ARPE-19细胞，本发明化合物能够在体外使HTRA1 mRNA的表达水平抑制至少60％或70％。在一些实施方案中，使用ARPE-19细胞，本发明化合物能够在体外使HTRA1蛋白的表达水平抑制至少50％。合适地，实施例提供了可用于测量HTRA1 RNA或蛋白抑制的测定(例如实施例3)。通过寡核苷酸的连续核苷酸序列与靶核酸之间的杂交触发靶标调节。在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸包含寡核苷酸和靶核酸之间的错配。尽管错配，与靶核酸的杂交仍可足以显示HTRA1表达的所期望的调节。由错配引起的结合亲和力降低可以有利地通过增加寡核苷酸中核苷酸的数量和/或增加能够增加对靶标的结合亲和力的经修饰的核苷(例如存在于寡核苷酸序列中的经2′修饰的核苷，包括LNA)的数量来补偿。
本发明的一个方面涉及反义寡核苷酸，其包含长度为10至30个核苷酸的与HTRA1靶序列具有至少90％的互补性(例如与HTRA1靶序列(例如选自由SEQ ID NO 1，2，3和4组成的组的核酸)完全互补)的连续核苷酸区域。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含与靶核酸的区域至少90％互补，例如至少91％，例如至少92％，例如至少93％，例如至少94％，例如至少的95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，或100％互补的连续序列。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸或其连续核苷酸序列与靶核酸的区域完全互补(100％互补)，或者在一些实施方案中，可以在寡核苷酸和靶核酸之间包含一个或两个错配。
在一些实施方案中，寡核苷酸或其至少12个核苷酸的连续核苷酸序列与SEQ IDNO 147的区域是至少90％互补的，例如完全(或100％)互补。
在一些实施方案中，寡核苷酸或其至少12个核苷酸的连续核苷酸序列与选自由SEQ ID NO 148，149，150，151，152，153，154和155组成的组中的序列的区域是至少90％互补的，例如完全(或100％)互补。
在一些实施方案中，寡核苷酸或其至少14个核苷酸的连续核苷酸序列与SEQ IDNO 147或选自由SEQ ID NO 148，149，150，151，152，153，154和155组成的组的序列是完全(或100％)互补。
在一些实施方案中，寡核苷酸或其至少16个核苷酸的连续核苷酸序列与SEQ IDNO 147或选自由SEQ ID NO 148，149，150，151，152，153，154和155组成的组中的序列是完全(或100％)互补。
在一些实施方案中，寡核苷酸或其连续核苷酸区域与选自由SEQ ID NO 148，149，150，151，152，153，154和155组成的组的序列是完全(或100％)互补。
在一些实施方案中，寡核苷酸或其连续核苷酸区域包含选自由SEQ ID NO 143，138，139，140，141，142，144和145组成的组的序列或由其组成：
SEQ ID NO 143：TATTTACCTGGTTGTT
SEQ ID NO 138：CAAATATTTACCTGGTTG
SEQ ID NO 139：TTTACCTGGTTGTTGG
SEQ ID NO 140：CCAAATATTTACCTGGTT
SEQ ID NO 141：CCAAATATTTACCTGGTTGT
SEQ ID NO 142：ATATTTACCTGGTTGTTG
SEQ ID NO 144：ATATTTACCTGGTTGT
SEQ ID NO 145：ATATTTACCTGGTTGTT
应当理解，可以修饰寡核苷酸基序序列以例如增加核酸酶抗性和/或对靶核酸的结合亲和力。修饰在定义和“寡核苷酸设计”部分中描述。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸或其连续核苷酸区域与靶核酸的区域完全互补(100％互补)，或者在一些实施方案中，可以在寡核苷酸和靶核酸之间包含一个或两个错配。在一些实施方案中，寡核苷酸或其至少12个核苷酸的连续核苷酸序列与靶核酸序列至少90％互补，例如完全(或100％)互补。
在一些实施方案中，寡核苷酸或其至少12个核苷酸的连续核苷酸序列与选自由SEQ ID NO 5-107或SEQ ID NO 108-137组成的组的序列具有100％的同一性。
在一些实施方案中，寡核苷酸或其至少14个核苷酸的连续核苷酸序列与选自由SEQ ID NO 5-107或SEQ ID NO 108-137组成的组中的序列具有100％的同一性。
在一些实施方案中，寡核苷酸或其至少16个核苷酸的连续核苷酸序列与选自由SEQ ID NO 5-107或SEQ ID NO 108-137组成的组中的序列具有100％的同一性。
在一些实施方案中，寡核苷酸或其连续核苷酸区域包含选自SEQ ID NO 5-107或SEQ ID NO 108-137的序列或由其组成。
在一些实施方案中，本发明的化合物选自由以下组成的组：
其中大写字母代表β-D-氧基LNA核苷，所有LNA胞嘧啶均为5-甲基胞嘧啶(如上标m所示)，小写字母代表DNA核苷。所有核苷间连接都是硫代磷酸酯核苷间连接(如下标s所示)。
寡核苷酸设计
寡核苷酸设计是指寡核苷酸序列中核苷糖修饰的模式。本发明的寡核苷酸包含糖修饰的核苷，并且还可以包含DNA或RNA核苷。在一些实施方案中，寡核苷酸包含糖修饰的核苷和DNA核苷。将经修饰的核苷掺入本发明的寡核苷酸中可以增强寡核苷酸对靶核酸的亲和力。在那种情况下，经修饰的核苷可以称为经亲和力增强修饰的核苷酸。
在实施方案中，寡核苷酸包含至少1个经修饰的核苷，例如至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个，至少10个，至少11个，至少12个，至少13个，至少14个，至少15个或至少16个经修饰的核苷。在实施方案中，寡核苷酸包含1-10个经修饰的核苷，例如2至9个经修饰的核苷，例如3至8个经修饰的核苷，例如4至7个经修饰的核苷，例如6或7个经修饰的核苷。在一个实施方案中，本发明的寡核苷酸可包含修饰，其独立地选自这三种类型的修饰(经修饰的糖，经修饰的核碱基和经修饰的核苷间连接)或其组合。优选地，寡核苷酸包含一个或多个糖修饰的核苷，例如2′糖修饰的核苷。优选地，本发明的寡核苷酸包含一个或多个2′糖修饰的核苷，其独立地选自由以下组成的组：2′-O-烷基-RNA，2′-O-甲基-RNA，2′-烷氧基-RNA，2′-O-甲氧基乙基-RNA，2′-氨基-DNA，2′-氟-DNA，阿拉伯糖核酸(ANA)，2′-氟-ANA和LNA核苷。甚至更优选地，所述一个或多个经修饰的核苷是LNA。
在一些实施方案中，至少1个经修饰的核苷是锁定核酸(LNA)，例如至少2个，例如至少3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，或至少8个经修饰核苷是LNA。在又一个实施方案中，所有经修饰的核苷都是LNA。
在进一步的实施方案中，寡核苷酸包含至少一个经修饰的核苷间连接。在优选的实施方案中，连续核苷酸序列内的核苷间连接是硫代磷酸酯或硼烷磷酸核苷间连接。在一些实施方案中，寡核苷酸的连续序列中的所有核苷酸间连接都是硫代磷酸酯连接。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸包含至少一个经修饰的核苷，其是2′-MOE-RNA，例如2，3，4，5，6，7，8，9或10个2′-MOE-RNA核苷单位。在一些实施方案中，至少一个所述经修饰的核苷是2′-氟DNA，例如2，3，4，5，6，7，8，9或10个2′-氟-DNA核苷单元。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸包含至少一个LNA单元，例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个或8个LNA单元，例如2至6个LNA单元，例如3至7个LNA单元，4至8个LNA单元或3个，4个，5个，6个或7个LNA单元。在一些实施方案中，所有经修饰的核苷都是LNA核苷。在一些实施方案中，所有LNA胞嘧啶单元是5-甲基-胞嘧啶。在一些实施方案中，寡核苷酸或其连续核苷酸区域在核苷酸序列的5′末端具有至少1个LNA单元，在3′末端具有至少2个LNA单元。在一些实施方案中，存在于本发明的寡核苷酸中的所有胞嘧啶核碱基是5-甲基-胞嘧啶。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸包含至少一个LNA单元和至少一个2′取代的经修饰核苷。
在本发明的一些实施方案中，寡核苷酸包含2′糖修饰的核苷和DNA单元。
在本发明的一个实施方案中，本发明的寡核苷酸能够募集RNase H。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸或其连续核苷酸区域是缺口体寡核苷酸。
缺口体设计
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸或其连续核苷酸区域具有缺口体设计或结构，在本文中也称为“缺口体”。在缺口体结构中，寡核苷酸以5→3′方向包含至少三个不同的结构区域，5′-侧翼，缺口和3′-侧翼，F-G-F′。在该设计中，侧翼区域F和F′(也称为翼区)包含至少一个与区域G相邻的糖修饰的核苷，并且在一些实施方案中可以包含2-7个糖修饰的核苷的连续区段，或者是糖修饰的和DNA核苷的连续区段(包含糖修饰的和DNA核苷的混合翼)。因此，与缺口区域相邻的5′侧翼区和3′侧翼区的核苷是糖修饰的核苷，例如2′修饰的核苷。当寡核苷酸是与HTRA1靶核酸的双链体时，缺口区G包含连续的核苷酸区段，其能够募集RNase H。在一些实施方案中，区域G包含5-16个DNA核苷的连续区段。缺口体区F-G-F′与HTRA1靶核酸互补，因此可以是寡核苷酸的连续核苷酸区。
区域G的5′和3′末端侧翼的区域F和F′可包含一个或多个增强亲和力的经修饰的核苷。在一些实施方案中，3′侧翼包含至少一个LNA核苷，优选至少2个LNA核苷。在一些实施方案中，5′侧翼包含至少一个LNA核苷。在一些实施方案中，5′和3′侧翼区均包含LNA核苷。在一些实施方案中，侧翼区中的所有核苷都是LNA核苷。在其他实施方案中，侧翼区可以包含LNA核苷和其他核苷(混合侧翼)，例如DNA核苷和/或非LNA修饰的核苷，例如2′取代的核苷。在这种情况下，缺口被定义为至少5个募集RNase H的核苷(例如5-16个DNA核苷)的连续序列，其5′和3′末端的侧翼是增强亲和力的经修饰的核苷，例如LNA，例如β-D-氧基-LNA。
区域F
附接于区域G的5′末端的区域F(5′侧翼或5′翼)包含或含有至少一个糖修饰的核苷，例如至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少7个经修饰的核苷或由其组成。在一些实施方案中，区域F包含1至7个经修饰的核苷例如2至6个经修饰的核苷，例如2至5个经修饰的核苷，例如2至4个经修饰的核苷，例如1至3个经修饰的核苷，例如1，2，3或4个经修饰的核苷，或由其组成。
在一个实施方案中，区域F中的一个或多个或所有经修饰的核苷是2′修饰的核苷。
在另一个实施方案中，区域F中的2′修饰核苷中的一个或多个选自2′-O-烷基-RNA单元，2′-O-甲基-RNA，2′-氨基-DNA单元，2′-氟-DNA单元，2′-烷氧基-RNA，MOE单元，LNA单元，阿拉伯核酸(ANA)单元和2′-氟-ANA单元。
在本发明的一个实施方案中，区域F中的所有经修饰的核苷都是LNA核苷。在另一个实施方案中，区域F中的LNA核苷独立地选自由β-D或α-L构型的氧基-LNA，硫代-LNA，氨基-LNA，cET和/或ENA或其组合组成的组。在优选的实施方案中，区域F在连续序列的5′末端具有至少1个β-D-氧基LNA单元。
区域G
区域G(缺口区域)可包含或含有5-16个能够募集RNaseH的连续DNA核苷或由其组成。在另一个实施方案中，区域G包含或含有5至12个，或6至10个或7至9个例如8个能够募集RNaseH的连续核苷酸单元或由其组成。
在另一个实施方案中，区域G中的至少一个核苷单元是DNA核苷单元，例如4至20个或6至18个DNA单元，例如5至16个。在一些实施方案中，区域G的所有核苷是DNA单元。
在进一步的实施方案中，区域G可以由DNA和能够介导RNase H切割的其他核苷的混合物组成。在一些实施方案中，区域G的至少50％的核苷是DNA，例如至少60％，至少70％或至少80％，或至少90％的DNA。
区域F′
附接于区域G的3′末端的区域F′(3′侧翼或3′翼)包含或含有至少一个糖修饰的核苷，例如至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少7个经修饰的核苷或由其组成。在一些实施方案中，区域F′包含1至7个经修饰的核苷例如2至6个经修饰的核苷，例如2至5个经修饰的核苷，例如2至4个经修饰的核苷，例如1至3个经修饰的核苷，例如1，2，3或4个经修饰的核苷，或由其组成。
在一个实施方案中，区域F′中的一个或多个或所有经修饰的核苷是2′修饰的核苷。
在另一个实施方案中，区域F′中的2′修饰核苷中的一个或多个选自2′-O-烷基-RNA单元，2′-O-甲基-RNA，2′-氨基-DNA单元，2′-氟-DNA单元，2′-烷氧基-RNA，MOE单元，LNA单元，阿拉伯核酸(ANA)单元和2′-氟-ANA单元。
在本发明的一个实施方案中，区域F′中的所有经修饰的核苷都是LNA核苷。在另一个实施方案中，区域F′中的LNA核苷独立地选自由β-D或α-L构型的氧基-LNA，硫代-LNA，氨基-LNA，cET和/或ENA或其组合组成的组。在优选的实施方案中，区域F′在连续序列的5′末端具有至少1个β-D-氧基LNA单元。
区域D，D′和D″
本发明的寡核苷酸包含与靶核酸互补的连续核苷酸区域。在一些实施方案中，寡核苷酸可以进一步包含位于连续核苷酸区域5′和/或3′的另外的核苷酸，其在本文中称为区域D。区域D′和D″可以分别附接到区域F的5′末端或区域F′的3′末端。在一些实施方案中，D区域(区域D′或D″)可以形成与靶核酸互补的连续核苷酸序列的一部分，或者在其他实施方案中，D区域可以与靶核酸不互补。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸包含连续核苷酸区域和任选1-5个另外的5′核苷酸(区域D′)或由其组成。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸包含连续核苷酸区域和任选1-5个另外的3′核苷酸(区域D″)或由其组成。
区域D′或D″可以独立地包含1，2，3，4或5个另外的核苷酸，其可以与靶核酸互补或不互补。在这方面，本发明的寡核苷酸在一些实施方案中可以包含能够调节靶标的在5′和/或3′末端侧接另外的核苷酸的连续核苷酸序列。这些另外的核苷酸可以用作核酸酶敏感的生物可切割的接头，因此可以用于将诸如缀合物部分的官能团附接到本发明的寡核苷酸上。在一些实施方案中，另外的5′和/或3′末端核苷酸与磷酸二酯键连接，并且可以是DNA或RNA。在另一个实施方案中，另外的5′和/或3′末端核苷酸是经修饰的核苷酸，其可以例如被包括以增强核酸酶稳定性或为了易于合成。在一些实施方案中，除了连续核苷酸区域之外，本发明的寡核苷酸还包含区域D′和/或D″。
在一些实施方案中，本发明的缺口体寡核苷酸可由下式表示：
F-G-F′；特别是F1-7-G4-12-F′1-7
D′-F-G-F′，特别是D′1-3-F1-7-G4-12-F′1-7
F-G-F′-D″，特别是F1-7-G4-12-F′1-7-D″1-3
D′-F-G-F′-D″，特别是D′1-3-F1-7-G4-12-F′1-7-D″1-3
制备方法
在另一方面，本发明提供了制备本发明寡核苷酸的方法，其包括使核苷酸单元反应，从而形成寡核苷酸中包含的共价连接的连续核苷酸单元。优选地，所述方法使用亚磷酰胺化学(参见例如Caruthers等，1987，Methods in Enzymology vol.154，287-313页)。在另一个实施方案中，所述方法还包括使连续核苷酸序列与缀合部分(配体)反应。在另一方面，提供了制备本发明组合物的方法，其包括将本发明的寡核苷酸或缀合的寡核苷酸与药学上可接受的稀释剂，溶剂，载体，盐和/或佐剂混合。
药用盐
为了用作治疗剂，本发明的寡核苷酸可以作为合适的药用盐提供，例如钠盐或钾盐。在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸是钠盐。
药物组合物
在另一方面，本发明提供药物组合物，其包含任何上述寡核苷酸和/或寡核苷酸缀合物和药学上可接受的稀释剂，载体，盐和/或佐剂。药学上可接受的稀释剂包括磷酸盐缓冲盐水(PBS)和药学上可接受的盐，包括但不限于钠盐和钾盐。在一些实施方案中，药学上可接受的稀释剂是无菌磷酸盐缓冲盐水。在一些实施方案中，寡核苷酸以50μM-300μM溶液的浓度在药学上可接受的稀释剂中使用。在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸以10μg-1000μg的剂量施用。
WO 2007/031091(通过引用结合于此)提供了药学上可接受的稀释剂，载体和佐剂的合适且优选的实例。WO2007/031091中还提供了合适的剂量，制剂，施用途径，组合物，剂型，与其他治疗剂的组合，前药制剂。
本发明的寡核苷酸或寡核苷酸缀合物可以与药学上可接受的活性或惰性物质混合，用于制备药物组合物或制剂。用于配制药物组合物的组合物和方法取决于许多标准，包括但不限于施用途径，疾病程度或施用剂量。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸或寡核苷酸缀合物是前药。特别是对于寡核苷酸缀合物，一旦将前药递送至作用位点例如靶细胞，缀合物部分就被从寡核苷酸切割。
应用
本发明的寡核苷酸可用作研究试剂，例如用于诊断，治疗和预防。
在研究中，这种寡核苷酸可用于特异性调节细胞(例如体外细胞培养物)和实验动物中HTRA1蛋白的合成，从而促进靶标的功能分析或评估其作为治疗干预靶标的有用性。通常，通过降解或抑制产生蛋白质的mRNA来实现靶标调节，从而防止蛋白质形成或通过降解或抑制产生蛋白质的基因或mRNA的调节剂。
在诊断中，寡核苷酸可用于通过RNA印迹，原位杂交或类似技术检测和定量细胞和组织中的HTRA1表达。
对于治疗，怀疑患有疾病或病症的动物或人可以通过调节HTRA1的表达来治疗。
本发明提供治疗或预防疾病的方法，其包括向患有或易患该疾病的受试者施用治疗或预防有效量的本发明的寡核苷酸，寡核苷酸缀合物或药物组合物。
本发明还涉及如本文所定义的寡核苷酸，组合物或缀合物，其用作药物。
根据本发明的寡核苷酸，寡核苷酸缀合物或药物组合物通常以有效量施用。
本发明还提供了如本文所述的本发明的寡核苷酸或寡核苷酸缀合物在制备用于治疗本文所述病症的药物中或在用于治疗本文所述病症的方法中的用途。
如本文所提及的疾病或病症与HTRA1的表达有关。在一些实施方案中，疾病或病症可以与HTRA1基因或与蛋白质产物与HTRA1相关或相互作用的基因中的突变相关。因此，在一些实施方案中，靶核酸是HTRA1序列的突变形式，并且在其他实施方案中，靶核酸是HTRA1序列的调节物。
本发明的方法优选用于治疗或预防由HTRA1的异常水平和/或活性引起的疾病。
本发明还涉及如本文所定义的寡核苷酸，寡核苷酸缀合物或药物组合物在制备用于治疗HTRA1的异常水平和/或活性的药物中的用途。
在一个实施方案中，本发明涉及寡核苷酸，寡核苷酸缀合物或药物组合物，其用于治疗选自以下的疾病或病症：眼病，例如黄斑变性，包括年龄相关性黄斑变性(AMD)，例如干性AMD或湿性AMD，和糖尿病视网膜病。在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸缀合物或药物组合物可用于治疗地图状萎缩或中间性dAMD。HTRA1也已在阿尔茨海默病和帕金森病中指出，因此在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸缀合物或药物组合物可用于治疗阿尔茨海默病或帕金森病。HTRA1也已在迪谢内肌营养不良，关节炎例如骨关节炎，家族性缺血性脑小血管病中指出，因此在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸缀合物或药物组合物可用于治疗迪谢内肌营养不良，关节炎例如骨关节炎，或家族性缺血性脑小血管病。
施用
本发明的寡核苷酸或药物组合物可局部施用(例如至皮肤，吸入，经眼或经耳)或肠内(例如口服或通过胃肠道)或肠胃外(例如静脉内，皮下，肌内，脑内，脑室内或鞘内)。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸，缀合物或药物组合物通过肠胃外途径施用，包括静脉内，动脉内，皮下，腹膜内或肌内注射或输注，鞘内或颅内，例如脑内或心室内施用。在一些实施方案中，活性寡核苷酸或寡核苷酸缀合物是静脉内施用的。在另一个实施方案中，皮下施用活性寡核苷酸或寡核苷酸缀合物。
对于治疗眼疾病，例如黄斑变性，例如AMD(湿性或干性)，可以使用眼内注射。
在一些实施方案中，本发明化合物或其药学上可接受的盐通过眼内注射施用，剂量为每眼约10μg至约200μg，例如每眼约50μg至约150μg，例如每眼约100μg。在一些实施方案中，剂量间隔即连续给药之间的时间段是至少一个月，例如至少每两个月或至少每三个月一次。
组合疗法
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸，寡核苷酸缀合物或药物组合物用于与另一种治疗剂的组合治疗。所述治疗剂可以例如是上述疾病或病症的护理标准品。
本发明的实施方案
1.长度为10-30个核苷酸的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包含与SEQ IDNO 147至少90％例如100％互补的10-22个核苷酸的连续核苷酸区域：
SEQ ID NO 147：5′CCAACAACCAGGTAAATATTTG 3′
2.根据实施方案1的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸能够抑制HTRA1 mRNA的表达。
3.根据实施方案1或2的反义寡核苷酸，其中所述连续核苷酸区域与选自由SEQ IDNO 138，139，140，141，142，143，144和145组成的组的序列中呈现的序列相同：
SEQ ID NO 138：CAAATATTTACCTGGTTG
SEQ ID NO 139：TTTACCTGGTTGTTGG
SEQ ID NO 140：CCAAATATTTACCTGGTT
SEQ ID NO 141：CCAAATATTTACCTGGTTGT
SEQ ID NO 142：ATATTTACCTGGTTGTTG
SEQ ID NO 143：TATTTACCTGGTTGTT
SEQ ID NO 144：ATATTTACCTGGTTGT
SEQ ID NO 145：ATATTTACCTGGTTGTT
4.根据实施方案1-3中任一个的反义寡核苷酸，其中所述连续核苷酸区域包含序列SEQ ID NO：146：
SEQ ID NO 146：TTTACCTGGTT
5.根据实施方案1-4中任一个的反义寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的连续核苷酸区域包含选自SEQ ID NO 138，139，140，141，142，143，144和145中任一个的序列或由其组成。
6.根据实施方案1-5中任一个的反义寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的连续核苷酸区域包含一个或多个2′糖修饰的核苷。
7.根据实施方案6的反义寡核苷酸，其中所述一个或多个2′糖修饰的核苷独立地选自由以下组成的组：′-O-烷基-RNA，2′-O-甲基-RNA，2′-烷氧基-RNA，2′-O-甲氧基乙基-RNA，2′-氨基-DNA，2′-氟-DNA，阿拉伯糖核酸(ANA)，2′-氟-ANA和LNA核苷。
8.实施方案5-7中任一个的反义寡核苷酸，其中所述一个或多个经修饰的核苷是LNA核苷。
9.根据实施方案1-8中任一个的反义寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的连续核苷酸区域包含至少一个经修饰的核苷间连接，例如一个或多个硫代磷酸酯核苷间连接。
10.根据实施方案9的反义寡核苷酸，其中所述连续核苷酸区域内的所有核苷间连接是硫代磷酸酯核苷间连接。
11.根据实施方案1-10中任一个的反义寡核苷酸，其中所述寡核苷酸能够募集RNase H。
12.根据实施方案1-11中任一项的反义寡核苷酸，其中所述寡核苷酸或其连续核苷酸序列是缺口体或包含缺口体。
13.实施方案11或12的反义寡核苷酸，其中所述寡核苷酸或其连续核苷酸序列是式5′-F-G-F′-3′的缺口体，其中F和F′区独立地包含1-7个糖修饰的核苷，并且G是能够募集RNaseH的6-16个核苷的区域，其中与区域G相邻的区域F和F′的核苷是糖修饰的核苷。
14.根据实施方案13的反义寡核苷酸，其中区域G包含6-16个DNA核苷或由其组成。
15.根据实施方案13或14的反义寡核苷酸，其中区域F和F′各自包含至少一个LNA核苷。
16.根据实施方案1-15中任一个的反义寡核苷酸，其选自由以下各项组成的组：
CsAsAsAstsastststsascscstsgsGsTsTsG(SEQ ID NO 138，化合物#138，1)
TsTstsascscstsgsgststsgstsTsGsG(SEQ ID NO 139，化合物#139，1)
CsCsAsAsastsastststsascscstsgsGsTsT(SEQ ID NO 140，化合物#140，1)
CsCsAsasastsastststsascscstsgsgststsGsT(SEQ ID NO 141，化合物#141，1)
AsTsAstststsascscstsgsgststsgsTsTsG(SEQ ID NO 142，化合物#142，1)
TsAsTststsascscstsgsgstsTsGsTsT(SEQ ID NO 143，化合物#143，1)
TsAstststsascscstsgsGstsTsgsTsT(SEQ ID NO 143，化合物#143，2)
TsAsTststsascscstsgsgsTsTsgsTsT(SEQ ID NO 143，化合物#143，3)
AsTsAsTststsascscstsgsgsTsTsGsT(SEQ ID NO 144，化合物#144，1)
AstsAsTsTstsascscstsgsgstsTsGsT(SEQ ID NO 144，化合物#144，2)
AstsAsTststsascscstsgsGsTsTsgsTsT(SEQ ID NO 145，化合物#145，1)
AsTsAstststsascscstsgsGstsTsgsTsT(SEQ ID NO 145，化合物#145，2)
AstsAsTststsascscstsgsgstsTsGsTsT(SEQ ID NO 145，化合物#145，3)
其中大写字母代表LNA核苷单元，小写字母代表DNA核苷单元，下标s代表硫代磷酸酯核苷间连接，其中所有LNA胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。
17.根据实施方案16的反义寡核苷酸，其中所述LNA核苷都是β-D-氧基LNA核苷。
18.缀合物，其包含根据实施方案1-17中任一个的寡核苷酸和至少一个共价附接至所述寡核苷酸的缀合物部分。
19.药物组合物，其包含实施方案1-17的寡核苷酸或实施方案18的缀合物和药学上可接受的稀释剂，溶剂，载体，盐和/或佐剂。
20.用于调节表达HTRA1的靶细胞中HTRA1表达的体内或体外方法，所述方法包括向所述细胞施用有效量的实施方案1-17中任一个的寡核苷酸或根据实施方案18的缀合物或实施方案19的药物组合物。
21.治疗或预防疾病的方法，其包括向患有或易患疾病的受试者施用治疗或预防有效量的实施方案1-17中任一个的寡核苷酸或根据实施方案18的缀合物或实施方案19的药物组合物。
22.实施方案21的方法，其中所述疾病选自由以下各项组成的组：黄斑变性(例如湿性AMD，干性AMD，地图状萎缩，中间性dAMD，糖尿病视网膜病)，帕金森病，阿尔茨海默病，迪谢内肌营养不良，关节炎，例如骨关节炎，和家族性缺血性脑小血管病。
23.实施方案1-17中任一个的寡核苷酸或根据实施方案18的缀合物或实施方案19的药物组合物，用于在药物中使用。
24.实施方案1-17中任一个的寡核苷酸或根据实施方案18的缀合物或实施方案19的药物组合物，其用于治疗或预防选自由以下各项组成的组的疾病：黄斑变性(例如湿性AMD，干性AMD，地图状萎缩，中间性dAMD，糖尿病视网膜病)，帕金森病，阿尔茨海默病，迪谢内肌营养不良，关节炎，例如骨关节炎，和家族性缺血性脑小血管病。
25.实施方案1-17中任一个的寡核苷酸或根据实施方案18的缀合物或实施方案19的药物组合物用于制备用于治疗或预防选自由以下各项组成的组的疾病的药物的用途：黄斑变性(例如湿性AMD，干性AMD，地图状萎缩，中间性dAMD，糖尿病视网膜病)，帕金森病，阿尔茨海默病，迪谢内肌营养不良，关节炎，例如骨关节炎，和家族性缺血性脑小血管病。
实施例
材料和方法
寡核苷酸合成
寡核苷酸合成通常是本领域已知的。以下是可以应用的方案。本发明的寡核苷酸可以通过在所用的装置，支持物和浓度方面稍微变化的方法制备。
使用亚磷酰胺方法在1μmol规模的Oligomaker 48上在尿苷通用支持物上合成寡核苷酸。在合成结束时，使用氨水在60℃下5-16小时将寡核苷酸从固体支持物上切割。通过反相HPLC(RP-HPLC)或通过固相提取纯化寡核苷酸，并通过UPLC表征，并通过ESI-MS进一步确认分子量。
寡核苷酸的伸长：
β-氰基乙基-亚磷酰胺(DNA-A(Bz)，DNA-G(ibu)，DNA-C(Bz)，DNA-T，LNA-5-甲基-C(Bz)，LNA-A(Bz)，LNA-G(dmf)，LNA-T)的偶联通过使用0.1M的5′-O-DMT-保护的亚酰胺在乙腈中的溶液和DCI(4，5-二氰基咪唑)在乙腈(0.25M)中的溶液作为激活剂进行。对于最后的循环，可以使用具有所期望修饰(例如，用于附接缀合物基团或像这样的缀合物基团的C6接头)的亚磷酰胺。用于引入硫代磷酸酯连接的硫醇化通过使用黄原胶氢化物(在乙腈/吡啶9∶1中，0.01M)进行。可以使用在THF/吡啶/水7∶2∶1中的0.02M碘引入磷酸二酯连接。其余试剂是通常用于寡核苷酸合成的试剂。
对于后固相合成缀合，可以在固相合成的最后一个循环中使用市售的C6氨基接头亚磷酰胺，并且在从固体支持物脱保护和切割后，分离氨基连接的去保护的寡核苷酸。通过使用标准合成方法激活官能团引入缀合物。
通过RP-HPLC纯化：
通过制备型RP-HPLC在Phenomenex Jupiter C18 10μ 150x10mm柱上纯化粗化合物。使用pH 8的0.1M乙酸铵和乙腈作为缓冲液，流速为5mL/min。将收集的级分冻干，得到纯化的化合物，通常为白色固体。
缩写：
DCI：4，5-二氰基咪唑
DCM：二氯甲烷
DMF：二甲基甲酰胺
DMT：4，4′-二甲氧基三苯甲基
THF：四氢呋喃
Bz：苯甲酰基
Ibu：异丁酰基
RP-HPLC：反相高效液相色谱
Tm测定：
将寡核苷酸和RNA靶标(磷酸盐连接的，PO)双链体在500ml无RNase的水中稀释至3mM，并与500ml 2x Tm-缓冲液(200mM NaCl，0.2mM EDTA，20mM磷酸盐，pH 7.0)混合。将溶液加热至95℃3min，然后在室温下退火30min。双链体熔解温度(Tm)在配备有Peltier温度编程器PTP6的Lambda 40 UV/VIS分光光度计上使用PE Templab软件(Perkin Elmer)测量。温度从20℃上升到95℃然后下降到25℃，记录在260nm处的吸收。熔解和退火的一阶导数和局部最大值用于评估双链体Tm。
实施例1：在单剂量浓度下测试靶向大鼠Htra1的反义寡核苷酸在C6细胞系中的体外功效。
大鼠C6细胞系购自ATCC，并按照供应商的建议在37℃，5％CO2的潮湿培养箱中维持。对于测定，将1500个C6细胞/孔接种在96孔板中在培养基中。将细胞孵育2小时，然后添加溶解在PBS中的寡核苷酸。寡核苷酸的浓度：25μM。添加寡核苷酸后4天，收获细胞。使用PureLink Pro 96 RNA纯化试剂盒(Ambion，根据制造商的说明书)提取RNA。然后使用M-MLT逆转录酶，随机十聚体RETROscript，RNase抑制剂(Ambion，根据制造商的说明书)用100mMdNTP组(PCR级别，Invitrogen)和无DNase/RNase水(Gibco)合成cDNA。对于基因表达分析，使用TagMan Fast Advanced Master Mix(2X)(Ambion)在doublex设置中进行qPCR。以下TaqMan引物测定用于qPCR：Htra1，Rn00581870_m1(FAM-MGB)和管家基因，Tbp，Rn01455646_m1(VIC-MGB)。所有引物组均购自Life Technologies。表中的相对Htra1 mRNA表达水平显示为对照(PBS处理的细胞)的％。
使用的寡核苷酸：
对于化合物：大写字母代表LNA核苷(使用β-D-氧基LNA核苷)，所有LNA胞嘧啶均为5-甲基胞嘧啶，小写字母代表DNA核苷，前面带有上标m的DNA胞嘧啶代表5-甲基C-DNA核苷。所有核苷间连接都是硫代磷酸酯核苷间连接。
实施例2.以剂量应答曲线测试靶向大鼠Htra1的所选寡核苷酸在C6细胞系中的体外效力和功效。
大鼠C6细胞系描述于实施例1中。如实施例1中所述进行测定。寡核苷酸的浓度：自50μM起，半对数稀释，8个点。添加寡核苷酸后4天，收获细胞。如实施例1中所述进行RNA提取，cDNA合成和qPCR。n＝2个生物学重复。EC50测定在GraphPad Prism6中进行。用50μM寡核苷酸处理时的相对Htra1 mRNA水平在表中显示为对照(PBS)的％。还测试了另外的引物组(Htra1，Rn00668987_m1[FAM-MGB]对比Ppia，Rn006900933_m1[VIC-MGB]和Hprt，Rn01527840_m1[VIC-MGB])，并且使用所述引物观察到相同的趋势(数据未显示)。
实施例3以单剂量浓度测试靶向人HTRA1的寡核苷酸在U251细胞系中的体外功效。
人胶质母细胞瘤U251细胞系购自ECACC，并按照供应商的建议在37℃，5％CO2的潮湿培养箱中维持。对于测定，将15000个U251细胞/孔接种在96多孔板中在饥饿培养基中(供应商推荐的培养基，除了1％FBS而不是10％)。将细胞孵育24小时，然后添加溶解在PBS中的寡核苷酸。寡核苷酸的浓度：5μM。添加化合物后3-4天，除去培养基并添加新培养基(不含寡核苷酸)。添加寡核苷酸后6天，收获细胞。使用PureLink Pro 96 RNA纯化试剂盒(Ambion，根据制造商的说明书)提取RNA。然后使用M-MLT逆转录酶，随机十聚体RETROscript，RNase抑制剂(Ambion，根据制造商的说明书)用100mM dNTP组(PCR级别，Invitrogen)和无DNase/RNase水(Gibco)合成cDNA。对于基因表达分析，使用TagMan Fast Advanced Master Mix(2X)(Ambion)在doublex设置中进行qPCR。以下TaqMan引物测定用于qPCR：来自LifeTechnologies的HTRA1，Hs01016151_m1(FAM-MGB)和管家基因TBP，Hs4326322E(VIC-MGB)。表中的相对HTRA1 mRNA表达水平显示为对照(PBS处理的细胞)的％。
对于化合物：大写字母代表LNA核苷(使用β-D-氧基LNA核苷)，所有LNA胞嘧啶均为5-甲基胞嘧啶，小写字母代表DNA核苷，前面带有上标m的DNA胞嘧啶代表5-甲基C-DNA核苷。所有核苷间连接都是硫代磷酸酯核苷间连接。
实施例4以2种浓度测试靶向人HTRA1 mRNA的寡核苷酸文库在ARPE19和U251细胞系中的体外功效。
鉴定HTRA1有希望的“热点”区域。在U251和ARPE19细胞系中筛选n＝129个人/食蟹猴/大鼠HTRA1 LNA寡核苷酸的文库。从该文库中，我们鉴定了靶向人HTRA1前mRNA(SEQ IDNO 2)的位置33042-33064之间的一系列活性寡核苷酸，如图1所示。
人视网膜色素上皮ARPE19细胞系购自ATCC并在37℃用5％CO2在潮湿的培养箱中在DMEM-F12(Sigma，D8437)，10％FBS，1％pen/strep中维持。U251细胞系描述于实施例3中。对于测定，将5000个ARPE19细胞/孔接种在96孔多孔板的培养基中(除了是5％FBS而不是10％)。将细胞孵育1小时，然后添加溶解在PBS中的寡核苷酸。添加寡核苷酸后4天，收获细胞。如实施例3中所述进行U251细胞系的测定。寡核苷酸的浓度：25μM和2.5μM。使用RNeasy96 Biorobot 8000试剂盒(Qiagen，根据制造商的说明书)提取RNA。然后使用RetroscriptcDNA合成试剂盒(ThermoFisher，根据制造商的说明书)合成cDNA。对于基因表达分析，使用Fluidigm Biomark系统进行qPCR。以下TaqMan引物测定用于qPCR：来自Life Technologies的HTRA1，Hs01016151_m1和管家基因，TBP，Hs99999910_m1和PPIA，Hs99999904_m1。n＝2个生物学重复。相对HTRA1 mRNA表达水平在表中显示为对照(PBS)的％。还测试了另外的HTRA1引物组(Hs00170197_m1)并观察到相同的趋势(数据未显示)。
对于化合物：大写字母代表LNA核苷(使用β-D-氧基LNA核苷)，所有LNA胞嘧啶均为5-甲基胞嘧啶，小写字母代表DNA核苷。所有核苷间连接都是硫代磷酸酯核苷间连接。
实施例5.以单剂量浓度测试选择的靶向人/大鼠HTRA1的LNA寡核苷酸在大鼠C6细胞系中的体外功效
大鼠C6细胞系描述于实施例1中。如实施例1中所述进行测定。寡核苷酸的浓度：25μM。n＝2个生物学重复。表中的相对Htra1 mRNA表达水平显示为对照(PBS处理的细胞)的％。
实施例6.以剂量应答测试选定的人/食蟹猴/大鼠LNA寡核苷酸在ARPE19，U251和C6细胞系中的体外效力和功效。
ARPE19，U251和C6细胞系分别描述于实施例4，3和1中。对于测定，将2000个U251或ARPE19细胞/孔接种在96多孔板中在供应商推荐的培养基中。将细胞孵育2小时，然后添加溶解在PBS中的寡核苷酸。如实施例1-2中所述进行C6细胞系测定。寡核苷酸的浓度：自50μM起，半对数稀释，8个点。添加寡核苷酸后4天，收获细胞。如实施例1中所述，对所有细胞系进行RNA提取，cDNA合成和qPCR。对于U251和ARPE19细胞使用以下TaqMan引物测定：HTRA1，Hs01016151_m1(FAM-MGB)和管家基因，TBP，Hs4326322E(VIC-MGB)。所有引物组均购自LifeTechnologies。n＝2个生物学重复。EC50测定在Graph Pad Prism6中进行。用50μM寡核苷酸处理时的相对HTRA1 mRNA水平在表中显示为对照(PBS)的％。
实施例7.以单剂量浓度测试选定的靶向人HTRA1的寡核苷酸在ARPE19和U251细胞系中的体外功效。
实施例6中描述了ARPE19和U251细胞系和测定。如实施例1中所述进行RNA提取，使用qScript XLT一步法RT-qPCR ToughMix Low ROX，95134-100(Quanta Biosciences)进行cDNA合成和qPCR。对于U251和ARPE19细胞，以douplex设置使用以下TaqMan引物测定：HTRA1，Hs01016151_m1(FAM-MGB)和管家基因，GAPDH，Hs4310884E(VIC-MGB)。所有引物组均购自Life Technologies。n＝1个生物学重复。表中的相对HTRA1 mRNA表达水平显示为对照(PBS处理的细胞)的％。还针对U251测试了另外的引物组(HTRA1，Hs00170197_m1[FAM-MGB]对比TBP Hs4326322E[VIC-MGB])，并且使用那些引物观察到相同的趋势(数据未显示)。见图2。
实施例8.测试在人原代RPE细胞中的体外功效和效力。
人原代视网膜色素上皮(hpRPE)细胞购自Sciencell(Cat#6540)。对于测定，将5000个hpRPE细胞/孔接种在层粘连蛋白(层粘连蛋白521，BioLamina Cat#LN521-03)包被的96多孔板中在培养基(EpiCM，Sciencell Cat#4101)中。使用此培养基将其扩增一周，并使用以下培养基进行分化2周：补充有N1补充剂(Sigma Cat#N-6530)，谷氨酰胺-青霉素-链霉素(Sigma Cat#G-1146)，非必需氨基酸(NEAA，Sigma Cat#M-7145)，牛磺酸(Sigma Cat#T-0625)，氢化可的松(Sigma Cat#H-03966)，三碘-甲状腺原氨素(Sigma Cat#T-5516)和牛血清白蛋白(BSA，Sigma Cat#A-9647)的MEM Alpha培养基(Sigma Cat#M-4526)。将细胞在37℃、5％CO2在潮湿的培养箱中培养。
在实验当天，在添加寡核苷酸之前，将细胞与新鲜分化培养基一起孵育1小时。将它们溶解在PBS中并在第0天和第4天施用于细胞。在第7天，用50μl含有β-巯基乙醇的RLT缓冲液(Qiagen Cat#79216)收获细胞。根据Qiagen RNeasy Mini Kit(Cat#74104；Lot151048073)的用户手册(包括DNase I处理(Cat#79254；Lot 151042674))进行RNA的提取。使用Agilent Bioanalyzer Nano Kit(Agilent；Cat#5067-1511；Lot 1446)进行RNA质量对照。根据制造商的说明书(Thermo Fisher Scientific，Cat#4368814；Lot 00314158)，使用基于随机六聚体寡核苷酸的高容量cDNA逆转录试剂盒(High Capacity cDNA ReverseTranscription Kit)将总RNA逆转录成cDNA(cDNA合成)。在7900HT实时PCR仪器(ThermoFisher Scientific)上以384孔板形式一式三份地进行cDNA样品的测量。以下TaqMan引物测定用于qPCR：来自Life Technologies的HTRA1，Hs01016151_m1和Hs00170197_m1，管家基因，GAPDH，Hs99999905_m1和PPIA，Hs99999904_m1。n＝3个生物学重复。相对HTRA1 mRNA表达水平在表中显示为对照(PBS)的％。见图3。
实施例9.大鼠体内功效研究，治疗7天，玻璃体内(IVT)注射，30μg/眼。
动物
在染色的雄性Brown Norway大鼠上进行实验。每个研究组中包括5只动物，共15只。
化合物和给药程序
为了开始实验，用异氟烷麻醉动物，对眼睛进行消毒和扩大，之后在玻璃体内注射30μg(3μl)/眼。
安乐死
在生命期结束时(第7天)，用CO2对所有大鼠实施安乐死，之后收获眼睛进行解剖。取视网膜，巩膜和玻璃体液进行进一步分析。
HTRA1 RNA表达的定量
解剖视网膜样品。将大鼠视网膜快速冷冻组织保持冷冻并在测试设备中在RLT裂解缓冲液(Qiagen RNeasy Mini Kit)中裂解，并根据Qiagen RNeasy Mini Kit(Cat#74104；Lot 151039852)的用户手册(包括DNase I处理(Cat#79254；Lot 151048613))继续RNA提取。使用Agilent Bioanalyzer Nano Kit(Agilent；Cat#5067-1511；Lot 1446)进行RNA质量对照。根据制造商的说明书(Thermo Fisher Scientific，Cat#4368814；Lot00314158)，使用基于随机六聚体寡核苷酸的高容量cDNA逆转录试剂盒(High CapacitycDNA Reverse Transcription Kit)将总RNA逆转录成cDNA(cDNA合成)。在7900HT实时PCR仪器(Thermo Fisher Scientific)上以384孔板形式一式三份地进行cDNA样品的测量。以下TaqMan引物测定用于qPCR：来自Life Technologies的Htra1，Rn00581870_m1和管家基因，Gapdh，Rn01775763_g1和Tbp，Rn01455646_m1。大鼠/组：5，n＝10个眼。将每个眼视为单独的样品。相对Htra1 mRNA表达水平显示为对照(PBS)的％。见图4。
实施例10大鼠体内功效研究，治疗7天，玻璃体内(IVT)注射，剂量应当。
动物
所有实验均在染色的Brown Norway大鼠上进行。每个研究组中包括17只动物，共34只。
化合物和给药程序
通过肌内注射甲苯噻嗪和氯胺酮的混合物麻醉动物。在研究第1天，在麻醉动物的双眼(每次施用3μL)玻璃体内施用测试物品和阴性对照(PBS)。
安乐死
在生命期结束时(第8天)通过腹膜内注射过量戊巴比妥安乐死。
寡核苷酸含量测量和Htra1 RNA表达的定量
低剂量和中剂量组的所有动物的两只眼球以及来自高剂量和PBS组的前5只动物的眼球都用于生物分析。安乐死后立即将玻璃体(V)，视网膜(R)和脉络膜(CH)快速小心地在冰上切片并储存在-80℃直至装运。将视网膜样品在700μL MagNa Pure 96 LC RNA分离组织缓冲液中裂解，并通过使用precellys进化均化器每2ml管加入1个不锈钢珠均质化2x1.5min，然后在室温下孵育30min。将样品离心，13000rpm，5min。将一半用于生物分析，另一半用于直接进行RNA提取。
对于生物分析，使用杂交ELISA方法将样品稀释10-50倍以进行寡核苷酸含量测量。将生物素化的LNA-捕获探针和地高辛缀合的LNA-检测探针(5xSSCT中的35nM，各自与待检测的LNA寡核苷酸的一端互补)与稀释的匀浆或相关标准物混合，在室温下孵育30min。然后加入链霉亲和素包被的ELISA板(Nunc目录号436014)中。
将板在室温下孵育1小时，在2xSSCT(300mM氯化钠，30mM柠檬酸钠和0.05％v/vTween-20，pH 7.0)中洗涤。使用与碱性磷酸酶(Roche Applied Sciencecat.No.11093274910)和碱性磷酸酶底物系统(Blue Phos底物，KPL产品代码50-88-00)缀合的抗DIG抗体检测捕获的LNA双链体。寡聚复合物的量在Biotek读数器上测量为615nm处的吸光度。
对于RNA提取，细胞RNA大容量试剂盒(05467535001，Roche)用于MagNA Pure 96系统，程序如下：组织FF标准LV3.1根据制造商的说明，包括DNAse处理。用Eon读数器(Biotek)测量RNA质量对照和浓度。将RNA浓度在样品间标准化，随后使用qScript XLT一步法RT-qPCR ToughMix Low ROX，95134-100(Quanta Biosciences)在一步反应中进行cDNA合成和qPCR。以下TaqMan引物测定用于双链体反应：来自Life Technologies的Htra1，Rn00581870_m1和Rn00668987_m1以及持家基因，HPRT，Rn01527840_m1和Tbp，Rn01455646_m1。qPCR分析在ViiA7机器(Life Technologies)上运行。大鼠/组：5，n＝10个眼。将每个眼视为单独的样品。相对Htra1 mRNA表达水平显示为对照(PBS)的％。
组织学
取出剩余的2只高剂量动物和PBS动物的双眼，并在10％中性缓冲福尔马林中固定24小时，修剪并包埋在石蜡中。
对于ISH分析，使用RNAscope 2.5VS Probe-Rn-HTRA1(Cat No.440959，AdvancedCell Diagnostic)，使用全自动Ventana Dicovery ULTRA染色模块(程序：mRNA DiscoveryUltra Red 4.0-v0.00.0152)处理4um厚的福尔马林固定，石蜡包埋的大鼠视网膜组织切片。使用的色原是Fastred苏木精II复染剂。
实施例11
PoC研究，蓝光诱导的白化大鼠视网膜变性
动物
所有实验均在白化Sprague-Dawley大鼠上进行。每组研究中包括16只动物，共42只。
化合物和给药程序
通过肌内注射甲苯噻嗪和氯胺酮的混合物麻醉动物。在研究第3天，在麻醉动物的双眼(每次施用3μL)玻璃体内施用测试物品和阴性对照(PBS)。
阳性对照物(PBN)在第0天使用安装在1mL-塑料注射器上的25号针头以剂量体积2.5mL/kg避光腹膜内注射4次(开始光暴露前0.5小时，开始光暴露后2小时和4小时以及光暴露结束后)。
光暴露
将大鼠暗适应36小时，然后在透明塑料笼中暴露于连续的蓝色荧光(400-540nm)6小时。暴露后，将大鼠置于暗室中24小时，然后返回标准循环光条件。
视网膜电图(ERG)
在过夜暗适应后，在基线和第14天对两只眼记录视网膜电图(ERG)。测量每个ERG记录的A波和b波振幅。
安乐死
在生命期结束时(第14天)，将动物麻醉并通过腹膜内注射过量戊巴比妥使其安乐死。
外核层(ONL)厚度测量
从每组的10只主要动物中取出双眼，将其固定在Bouin Hollande溶液中并包埋在石蜡中。沿垂直子午线切割薄切片(5至7μm厚)并用Trichrome-Masson染色。在视网膜的每个部分(上部和下部)中从视神经到周边视网膜的七个点(每250μm)测量ONL厚度。在每个点测量外核层的厚度，并计算曲线下面积(AUC)。
寡核苷酸含量测量和Htra1 RNA表达的定量
来自测试物品和PBS组的4只随伴(satellite)动物的双眼用于生物分析。安乐死后立即将玻璃体(V)，视网膜(R)和脉络膜(CH)快速小心地在冰上切片并储存在-80℃直至装运。将视网膜样品在700μL MagNa Pure 96 LC RNA分离组织缓冲液中裂解，并通过使用precellys进化均化器每2ml管加入1个不锈钢珠均质化2x 1.5min，然后在室温下孵育30min。将样品离心，13000rpm，5min。将一半用于生物分析，另一半用于直接进行RNA提取。。
对于生物分析，使用杂交ELISA方法将样品稀释10-50倍以进行寡核苷酸含量测量。将生物素化的LNA-捕获探针和地高辛缀合的LNA-检测探针(5xSSCT中的35nM，各自与待检测的LNA寡核苷酸的一端互补)与稀释的匀浆或相关标准物混合，在室温下孵育30min。然后加入链霉亲和素包被的ELISA板(Nunc目录号436014)中。
将板在室温下孵育1小时，在2xSSCT(300mM氯化钠，30mM柠檬酸钠和0.05％v/vTween-20，pH 7.0)中洗涤。使用与碱性磷酸酶(Roche Applied Sciencecat.No.11093274910)和碱性磷酸酶底物系统(Blue Phos底物，KPL产品代码50-88-00)缀合的抗DIG抗体检测捕获的LNA双链体。寡聚复合物的量在Biotek读数器上测量为615nm处的吸光度。
对于RNA提取，细胞RNA大容量试剂盒(05467535001，Roche)用于MagNA Pure 96系统，程序如下：组织FF标准LV3.1根据制造商的说明，包括DNAse处理。用Eon读数器(Biotek)测量RNA质量对照和浓度。将RNA浓度在样品间标准化，随后使用qScript XLT一步法RT-qPCR ToughMix Low ROX，95134-100(Quanta Biosciences)在一步反应中进行cDNA合成和qPCR。以下TaqMan引物测定用于双链体反应：来自Life Technologies的Htra1，Rn00581870_m1和Rn00668987_m1以及持家基因，HPRT，Rn01527840_m1和Tbp，Rn01455646_m1。qPCR分析在ViiA7机器(Life Technologies)上运行。大鼠/组：5，n＝10个眼。将每个眼视为单独的样品。相对Htra1 mRNA表达水平显示为对照(PBS)的％。
组织学
取出来自测试物品和PBS组的剩余2只随伴动物的双眼，并在10％中性缓冲福尔马林中固定24小时，修剪并包埋在石蜡中。如实施例10中所述进行ISH RNAscope。
实施例12.大鼠体内功效动力学研究，治疗3，7和14天，玻璃体内(IVT)注射，单剂量
在视网膜中观察到针对靶向人HTRA1前mRNA的位置33042-33064(SEQ ID NO 147)之间的“热点”的2个选择的HTRA1 LNA寡核苷酸的mRNA水平的敲低(KD)。qPCR和ISH读数都观察到这一点(参见图7A和/B以及下表)。
敲低的变化相对较大，参见表中列出的标准偏差。当绘制寡核苷酸含量相比于残留HTRA1 mRNA水平的剂量应答曲线时，可以看出该变化表现为处于施用水平(参见图7C)。
动物
所有实验均在白化Sprague-Dawley大鼠上进行。
化合物和给药程序
动物在异氟醚中麻醉。在研究第1天，在麻醉动物的双眼玻璃体内施用(每次施用3μL)测试物品和阴性对照(PBS)。
安乐死
在生命期结束时(研究第4，8或15天)，将大鼠麻醉并通过断头术实施安乐死。
寡核苷酸含量测量和Htra1 RNA表达的定量
如实施例10中所述进行寡核苷酸含量测量和Htra1 mRNA表达的定量。
相对残留Htra1 mRNA表达水平显示为对照(PBS)的％。
组织学
如实施例10中所述进行组织学。
实施例13.食蟹猴(非人灵长类动物，NHP)体内药代动力学和药效学(PK/PD)研究，治疗21天，玻璃体内注射(IVT)，单剂量。
对于1个选定的HTRA1 LNA寡核苷酸145.3(靶向人HTRA1前mRNA中位置33042-33064的“热点”)，观察到的视网膜中的mRNA和视网膜与玻璃体中的蛋白质水平的敲低(参见图8)。
动物
所有实验均在食蟹猴(Macaca fascicularis)上进行。
化合物和给药程序
在测试化合物注射之前和之后两天施用丁丙诺啡镇痛。用肌内注射氯胺酮(ketamine)和甲苯噻嗪(xylazine)麻醉动物。在研究第1天在局部施用丁卡因(tetracaine)麻醉剂后，在麻醉动物的双眼玻璃体内施用(每次施用50μL)测试物品和阴性对照(PBS)。
安乐死
在生命期结束时(第22天)通过腹膜内注射过量戊巴比妥将所有猴子安乐死。
通过qPCR的寡核苷酸含量测量和Htra1 RNA表达定量
安乐死后立即将眼组织快速小心地在冰上切片并储存在-80℃直至装运。将视网膜样品在700μL MagNa Pure 96 LC RNA分离组织缓冲液中裂解，并通过使用precellys进化均化器每2ml管加入1个不锈钢珠均质化2x 1.5min，然后在室温下孵育30min。将样品离心，13000rpm，5min。将一半用于生物分析，另一半用于直接进行RNA提取。
对于生物分析，使用杂交ELISA方法将样品稀释10-50倍以进行寡核苷酸含量测量。将生物素化的LNA-捕获探针和地高辛缀合的LNA-检测探针(5xSSCT中的35nM，各自与待检测的LNA寡核苷酸的一端互补)与稀释的匀浆或相关标准物混合，在室温下孵育30min。然后加入链霉亲和素包被的ELISA板(Nunc目录号436014)中。
将板在室温下孵育1小时，在2xSSCT(300mM氯化钠，30mM柠檬酸钠和0.05％v/vTween-20，pH 7.0)中洗涤。使用与碱性磷酸酶(Roche Applied Sciencecat.No.11093274910)和碱性磷酸酶底物系统(Blue Phos底物，KPL产品代码50-88-00)缀合的抗DIG抗体检测捕获的LNA双链体。寡聚复合物的量在Biotek读数器上测量为615nm处的吸光度。
对于RNA提取，细胞RNA大容量试剂盒(05467535001，Roche)用于MagNA Pure 96系统，程序如下：组织FF标准LV3.1根据制造商的说明，包括DNAse处理。用Eon读数器(Biotek)测量RNA质量对照和浓度。将RNA浓度在样品间标准化，随后使用qScript XLT一步法RT-qPCR ToughMix Low ROX，95134-100(Quanta Biosciences)在一步反应中进行cDNA合成和qPCR。以下TaqMan引物测定用于单链体反应：来自Life Technologies的Htra1，Mf01016150_，Mf01016152_m1和Rh02799527_m1以及持家基因，ARFGAP2，Mf01058488_g1和Rh01058485_m1，以及ARL1，Mf02795431_m1。qPCR分析在ViiA7机器(Life Technologies)上运行。眼/组：n＝3个眼。将每个眼视为单独的样品。相对Htra1 mRNA表达水平显示为对照(PBS)的％。
组织学
取出眼球并在10％中性缓冲福尔马林中固定24小时，修剪并包埋在石蜡中。
对于ISH分析，使用RNAscope 2.5 VS Probe-Mmu-HTRA1(REF 486979，AdvancedCell Diagnostics，Inc.)，使用全自动Ventana Dicovery ULTRA染色模块(程序：mRNADiscovery Ultra Red 4.0-v0.00.0152)处理4μm厚的福尔马林固定，石蜡包埋的视网膜组织切片。使用的色原是Fastred苏木精II复染剂。
使用基于板的免疫沉淀质谱(IP-MS)方法定量HTRA1蛋白
样品制备，视网膜
将视网膜在4倍体积(w/v)的具有蛋白酶抑制剂(完全无EDTA，Roche)的RIPA缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.4，150mM NaCl，0.25％脱氧胆酸，1％NP-40，1mM EDTA，Millipore)中使用Precellys 24均质化(5500，15s，2个循环)。将匀浆物离心(13,000rpm，3min)并测定上清液的蛋白质含量(Pierce BCA蛋白质测定)
样品制备，玻璃体
将玻璃体液(300μl)用具有蛋白酶抑制剂(完全无EDTA，Roche)的5x RIPA缓冲液(终浓度：50mM Tris-HCl，pH 7.4，150mM NaCl，0.25％脱氧胆酸，1％NP-40，1mM EDTA)稀释并使用Precellys 24均质化(5500，15s，2个循环)。将匀浆物离心(13,000rpm，3min)并测定上清液的蛋白质含量(Pierce BCA蛋白质测定)
基于板的HTRA1免疫沉淀和胰蛋白酶消化
用抗HTRA1小鼠单克隆抗体(R&D MAB2916，在50μl PBS中，500ng/孔)包被96孔板(Nunc MaxiSorp)，并在4℃孵育过夜。将板用PBS(200μl)洗涤两次，并用在PBS中的3％(w/v)BSA在20℃封闭30min，然后进行两次PBS洗涤。将样品(75μg视网膜，100μg玻璃体，在50μlPBS中)随机化并加入板中，然后在4℃在摇床(150rpm)上孵育过夜。然后将板用PBS洗涤两次并用水洗涤一次。然后向每个孔中加入在50mM TEAB中的10mM DTT(30μl)，然后在20℃孵育1小时以还原半胱氨酸巯基。然后向每个孔中加入在50mM TEAB中的150mM碘乙酰胺(5μl)，然后在黑暗中于20℃孵育30min以阻断半胱氨酸巯基。向每个孔中加入10μl消化溶液(终浓度：1.24ng/μl胰蛋白酶，20fmol/μl BSA肽，26fmol/μl同位素标记的HTRA1肽，1fmol/μl iRT肽，Biognosys)，然后在20℃孵育过夜。
通过靶向质谱法的HTRA1肽定量(选择的反应监测，SRM)
在与TSQ Quantiva三重四极杆质谱仪(Thermo Scientific)偶联的UltimateRSLCnano LC上进行质谱分析。样品(20μL)直接从用于IP的96孔板注射，并在上样缓冲液(0.5％v/v甲酸，2％v/v ACN)中以5μL/min加载到Acclaim Pepmap 100捕获柱(100μm x2cm，C18，5μm，Thermo Scientific)上6min。然后将肽在具有加热至40℃的集成电喷雾发射器的PepMap Easy-SPRAY分析柱(75μm x 15cm，3μm，Thermo Scientific)上使用以下梯度以250nL/min的流速分离：6min，98％缓冲液A(2％ACN，0.1％甲酸)，2％缓冲液B(ACN+0.1％甲酸)；36min，30％缓冲液B；41min，60％缓冲液B；43min，80％缓冲液B；49min，80％缓冲液B；50min，2％缓冲液B。TSQ Quantiva在SRM模式下运行，其具有以下参数：循环时间，1.5s；喷雾电压，1800V；碰撞气压，2mTorr；Q1和Q3分辨率，0.7FWHM；离子传输管温度300℃。获得HTRA1肽“LHRPPVIVLQR”和同位素标记的(L-[U-13C，U-15N]R)合成形式(其用作内标)的SRM转换。使用Skyline版本3.6进行数据分析。

Claims (17)

1.长度为10-30个核苷酸的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸靶向HTRA1核酸并包含与SEQ ID NO 147至少90％例如100％互补的10-22个核苷酸的连续核苷酸区域：
SEQ ID NO 147：5′CCAACAACCAGGTAAATATTTG 3′。
2.根据权利要求1或2的反义寡核苷酸，其中所述连续核苷酸区域与选自由SEQ ID NO138，139，140，141，142，143，144和145组成的组的序列中呈现的序列相同：
SEQ ID NO 138：CAAATATTTACCTGGTTG
SEQ ID NO 139：TTTACCTGGTTGTTGG
SEQ ID NO 140：CCAAATATTTACCTGGTT
SEQ ID NO 141：CCAAATATTTACCTGGTTGT
SEQ ID NO 142：ATATTTACCTGGTTGTTG
SEQ ID NO 143：TATTTACCTGGTTGTT
SEQ ID NO 144：ATATTTACCTGGTTGT
SEQ ID NO 145：ATATTTACCTGGTTGTT。
3.根据权利要求1-3中任一项的反义寡核苷酸，其中所述连续核苷酸区域包含序列SEQID NO：146：
SEQ ID NO 146：TTTACCTGGTT。
4.根据权利要求1-4中任一项的反义寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的连续核苷酸区域包含选自SEQ ID NO 138，139，140，141，142，143，144和145中任一个的序列或由其组成。
5.根据权利要求1-5中任一项的反义寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的连续核苷酸区域包含一个或多个2′糖修饰的核苷，例如独立地选自由以下组成的组的一个或多个2′糖修饰的核苷：2′-O-烷基-RNA，2′-O-甲基-RNA，2′-烷氧基-RNA，2′-O-甲氧基乙基-RNA，2′-氨基-DNA，2′-氟-DNA，阿拉伯糖核酸(ANA)，2′-氟-ANA和LNA核苷。
6.根据权利要求1-5中任一项的反义寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的连续核苷酸区域包含至少一个经修饰的核苷间连接，例如一个或多个硫代磷酸酯核苷间连接，或者例如所述连续核苷酸区域内的所有核苷间连接是硫代磷酸酯核苷间连接。
7.根据权利要求1-6中任一项的反义寡核苷酸，其中所述寡核苷酸或其连续核苷酸序列是或包含缺口体，例如式5′-F-G-F′-3′的缺口体，其中区域F和F′独立地包含1-7个糖修饰的核苷，并且G是能够募集RNaseH的6-16个核苷的区域，其中与区域G相邻的区域F和F′的核苷是糖修饰的核苷。
8.根据权利要求7的反义寡核苷酸，其中区域F和F′中的至少一者或两者各自包含至少一个LNA核苷。
9.根据权利要求1-8中任一项的反义寡核苷酸，其选自选自以下的组：
CsAsAsAstsastststsascscstsgsGsTsTsG(SEQ ID NO 138，化合物#138，1)
TsTstsascscstsgsgststsgstsTsGsG(SEQ ID NO 139，化合物#139，1)
CsCsAsAsastsastststsascscstsgsGsTsT(SEQ ID NO 140，化合物#140，1)
CsCsAsasastsastststsascscstsgsgststsGsT(SEQ ID NO 141，化合物#141，1)
AsTsAstststsascscstsgsgststsgsTsTsG(SEQ ID NO 142，化合物#142，1)
TsAsTststsascscstsgsgstsTsGsTsT(SEQ ID NO 143，化合物#143，1)
TsAstststsascscstsgsGstsTsgsTsT(SEQ ID NO 143，化合物#143，2)
TsAsTststsascscstsgsgsTsTsgsTsT(SEQ ID NO 143，化合物#143，3)
AsTsAsTststsascscstsgsgsTsTsGsT(SEQ ID NO 144，化合物#144，1)
AstsAsTsTstsascscstsgsgstsTsGsT(SEQ ID NO 144，化合物#144，2)
AstsAsTststsascscstsgsGsTsTsgsTsT(SEQ ID NO 145，化合物#145，1)
AsTsAstststsascscstsgsGstsTsgsTsT(SEQ ID NO 145，化合物#145，2)
AstsAsTststsascscstsgsgstsTsGsTsT(SEQ ID NO 145，化合物#145，3)
其中大写字母代表LNA核苷单元，小写字母代表DNA核苷单元，s代表硫代磷酸酯核苷间连接，其中所有LNA胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。
10.根据权利要求9的反义寡核苷酸，其中所述LNA核苷都是β-D-氧基LNA核苷。
11.缀合物，其包含根据权利要求1-10中任一个的寡核苷酸和至少一个共价附接至所述寡核苷酸的缀合物部分。
12.药物组合物，其包含权利要求1-10的寡核苷酸或权利要求11的缀合物和药学上可接受的稀释剂，溶剂，载体，盐和/或佐剂。
13.用于调节表达HTRA1的靶细胞中HTRA1表达的体内或体外方法，所述方法包括向所述细胞施用有效量的权利要求1-10中任一项的寡核苷酸或根据权利要求11的缀合物或权利要求12的药物组合物。
14.治疗或预防疾病的方法，其包括向患有或易患疾病的受试者施用治疗或预防有效量的权利要求1-10中任一项的寡核苷酸或根据权利要求11的缀合物或权利要求12的药物组合物。
15.权利要求1-10中任一项的寡核苷酸或根据权利要求11的缀合物或权利要求12的药物组合物，其用于在药物中使用。
16.权利要求1-10中任一项的寡核苷酸或根据权利要求11的缀合物或权利要求12的药物组合物，其用于治疗或预防选自由以下各项组成的组的疾病：黄斑变性(例如湿性AMD，干性AMD，地图状萎缩，中间性dAMD，糖尿病视网膜病)，帕金森病，阿尔茨海默病，迪谢内肌营养不良，关节炎，例如骨关节炎，和家族性缺血性脑小血管病。
17.权利要求1-10的寡核苷酸或根据权利要求11的缀合物或权利要求12的药物组合物用于制备药物的用途，所述药物用于治疗或预防选自由以下各项组成的组的疾病：黄斑变性(例如湿性AMD，干性AMD，地图状萎缩，中间性dAMD，糖尿病视网膜病)，帕金森病，阿尔茨海默病，迪谢内肌营养不良，关节炎，例如骨关节炎，和家族性缺血性脑小血管病。
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