定義 寡核苷酸
如本文所用之術語「寡核苷酸」定義為，熟習此項技術者將其理解為包含兩個或多於兩個共價鍵聯之核苷之分子。此類共價鍵結核苷亦可稱為核酸分子或寡聚物。寡核苷酸通常在實驗室中藉由固相化學合成隨後純化而製得。當提及寡核苷酸之序列時，提及共價鍵聯核苷酸或核苷之核鹼基部分或其修飾的序列或順序。本發明之寡核苷酸係人造的，且係化學合成的，且通常經純化或分離。本發明之寡核苷酸可包含一或多種經修飾之核苷或核苷酸。
反股寡核苷酸
如本文所用之術語「反股寡核苷酸」定義為能夠藉由雜交至標靶核酸、尤其雜交至標靶核酸上之連續序列而調節標靶基因表現的寡核苷酸。反股寡核苷酸基本上不為雙股，且因此不為siRNA。較佳地，本發明之反股寡核苷酸係單股。
連續核苷酸區
術語「連續核苷酸區」係指寡核苷酸中與標靶核酸互補之區。該術語可在本文中與術語「連續核苷酸序列」或「連續核鹼基序列」及術語「寡核苷酸基元序列」互換使用。在一些實施例中，寡核苷酸之所有核苷酸以連續核苷酸區存在。在一些實施例中，寡核苷酸包含連續核苷酸區且可視情況包含其他核苷酸，例如可用以使官能基連接至連續核苷酸序列的核苷酸連接子區。核苷酸連接子區可與標靶核酸互補或可能不與其互補。在一些實施例中，存在於連續核苷酸區之核苷酸之間的核苷間鍵均為硫代磷酸酯核苷間鍵。在一些實施例中，連續核苷酸區包含一或多種糖經修飾之核苷。
核苷酸
核苷酸係寡核苷酸及聚核苷酸之構築嵌段，且出於本發明之目的包括天然存在及非天然存在之核苷酸兩者。在本質上，核苷酸(諸如DNA及RNA核苷酸)包含核糖部分、核鹼基部分及一或多個磷酸酯基(其不存在於核苷中)。核苷及核苷酸亦可互換地稱作「單元」或「單體」。
經修飾之核苷
如本文所用之術語「經修飾之核苷」或「核苷修飾」係指與當量DNA或RNA核苷相比，藉由引入一或多個糖部分或(核)鹼基部分之修飾而經修飾的核苷。在一較佳實施例中，經修飾之核苷包含經修飾之糖部分。術語經修飾之核苷亦可在本文中與術語「核苷類似物」或經修飾之「單元」或經修飾之「單體」互換使用。
經修飾核苷間鍵
術語「經修飾核苷間鍵」定義為，熟習此項技術者一般理解為除磷酸二酯(PO)鍵以外之鍵，其將兩個核苷共價地偶合在一起。具有經修飾核苷間鍵之核苷酸亦稱為「經修飾之核苷酸」。在一些實施例中，與磷酸二酯鍵相比，經修飾核苷間鍵提高寡核苷酸對核酸酶之耐性。對於天然存在之寡核苷酸，核苷間鍵包括在相鄰核苷之間產生磷酸二酯鍵之磷酸酯基。對於活體內用途，經修飾核苷間鍵尤其適用於使寡核苷酸穩定，且可用以保護本發明之寡核苷酸中之DNA或RNA核苷區(例如在間隔體寡核苷酸之間隔區內，以及在經修飾核苷中)免受核酸酶裂解。 在一實施例中，寡核苷酸包含一或多種經修飾之核苷間鍵，自天然磷酸二酯至例如對核酸酶侵襲更具耐性之鍵。對核酸酶之耐性可藉由使寡核苷酸在血清中培育，或藉由使用核酸酶耐性分析(例如蛇毒液磷酸二酯酶(SVPD))測定，均在此項技術中熟知。能夠增強寡核苷酸對核酸酶之耐性之核苷間鍵稱為耐核酸酶核苷間鍵。在一些實施例中，寡核苷酸或其連續核苷酸序列之所有核苷間鍵經修飾。將認識到，在一些實施例中將本發明之寡核苷酸鍵聯至非核苷酸官能基(諸如共軛物)之核苷可為磷酸二酯。在一些實施例中，寡核苷酸或其連續核苷酸序列之所有核苷間鍵係耐核酸酶核苷間鍵。 在一些實施例中經修飾之核苷間鍵可為硫代磷酸酯核苷間鍵。在一些實施例中，經修飾核苷間鍵與本發明之寡核苷酸之核糖核酸酶H募集(例如硫代磷酸酯)相容。 在一些實施例中，核苷間鍵包含硫(S)，諸如硫代磷酸酯核苷間鍵。 硫代磷酸酯核苷間鍵係尤其適用的，此係因為核酸酶耐性、有益的藥代動力學及製造簡易性。在一些實施例中，寡核苷酸或其連續核苷酸序列之所有核苷間鍵係硫代磷酸酯。
核鹼基
術語核鹼基包括存在於核苷及核苷酸中之嘌呤(例如腺嘌呤及鳥嘌呤)及嘧啶(例如尿嘧啶、胸腺嘧啶及胞嘧啶)部分，其在核酸雜交中形成氫鍵。在本發明之上下文中術語核鹼基亦涵蓋經修飾核鹼基，其可不同於天然存在之核鹼基，但在核酸雜交期間具有功能性。在此上下文中「核鹼基」係指天然存在之核鹼基(諸如腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸苷、尿嘧啶、黃嘌呤及次黃嘌呤)以及非天然存在之變體兩者。此類變體例如描述於Hirao等人 (2012) Accounts of Chemical Research 第45卷第2055頁及Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1中。 在一些實施例中核鹼基部分藉由將嘌呤或嘧啶改變成經修飾之嘌呤或嘧啶而經修飾，經修飾之嘌呤或嘧啶為諸如經取代之嘌呤或經取代之嘧啶，諸如選自以下之核鹼基：異胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑并-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、5-溴尿嘧啶5-噻唑并-尿嘧啶、2-硫基-尿嘧啶、2'-硫基-胸腺嘧啶、肌苷、二胺基嘌呤、6-胺基嘌呤、2-胺基嘌呤、2,6-二胺基嘌呤及2-氯-6-胺基嘌呤。 核鹼基部分可藉由用於各對應核鹼基之字母代碼指示，例如A、T、G、C或U，其中各字母可視情況包括具有等效功能之經修飾核鹼基。舉例而言，在例示性寡核苷酸中，核鹼基部分選自A、T、G、C及5-甲基胞嘧啶。視情況，對於LNA間隔體，可使用5-甲基胞嘧啶LNA核苷。在一些實施例中，5'cg3'基元中之胞嘧啶核鹼基係5-甲基胞嘧啶。
經修飾寡核苷酸
術語經修飾寡核苷酸描述包含一或多個糖經修飾核苷及/或經修飾核苷間鍵之寡核苷酸。術語「嵌合」寡核苷酸係已在文獻中用以描述具有經修飾核苷之寡核苷酸之術語。
互補性
術語互補性描述核苷/核苷酸之沃森-克里克鹼基配對(Watson-Crick base-pairing)之能力。沃森-克里克鹼基對係鳥嘌呤(G)-胞嘧啶(C)及腺嘌呤(A)-胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)。將理解寡核苷酸可包含具有經修飾核鹼基之核苷，例如通常使用5-甲基胞嘧啶替代胞嘧啶，且因而術語互補性涵蓋未經修飾及經修飾核鹼基之間的沃森克里克鹼基配對(參看例如Hirao 等人 (2012) Accounts of Chemical Research 第45卷第2055頁及Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1)。 如本文所用之術語「互補%」係指核酸分子(例如寡核苷酸)中給定位置處連續核苷酸區或序列與獨立核酸分子(例如標靶核酸)之給定位置處之連續核苷酸序列互補(即與其形成沃森克里克鹼基對)的核苷酸數目的百分比。該百分比藉由以下計算，計數在兩個序列之間形成對之對準鹼基之數目，除以寡核苷酸中核苷酸之總數且乘以100。在該比對中，未對準(形成鹼基對)之核鹼基/核苷酸稱為錯配。 將理解當提及兩個序列之間的互補性時，互補性之測定在兩個序列之較短序列的整個長度中量測，諸如連續核苷酸區或序列之長度。 術語「完全互補」係指100%互補。在不存在術語值%或不存在指示錯配之情況下，互補意謂完全互補。
一致性
如本文所用之術語「一致性」係指核酸分子(例如寡核苷酸)中給定位置處連續核苷酸序列與獨立核酸分子(例如標靶核酸)之給定位置處之連續核苷酸序列一致(即其與互補核苷形成沃森克里克鹼基對之能力一致)的核苷酸數目的百分比。該百分比藉由以下計算，計數在兩個序列之間一致的對準鹼基(包括間隔)的數目，除以寡核苷酸中核苷酸之總數且乘以100。一致性% = (匹配 × 100)/對準區(及間隔)之長度。 當測定寡核苷酸之連續核苷酸區之一致性時，在連續核苷酸區之整個長度中計算一致性。在寡核苷酸之整個連續核苷酸序列係連續核苷酸區之實施例中，因此在寡核苷酸之核苷酸序列之整個長度中計算一致性。就此而言連續核苷酸區可與參考核酸序列之區一致，或在一些實施例中可與整個參考核酸一致。除非另外指示，否則與參考序列具有100%一致性之序列稱為一致的。舉例而言，參考序列可選自由SEQ ID NO 5-146及156中之任一者組成之群。 然而，若寡核苷酸包含側接連續核苷酸區之額外核苷酸(例如區D'或D")，則在測定一致性時此等額外側接核苷酸可忽略。在一些實施例中，可在整個寡核苷酸序列中計算一致性。 在一些實施例中，本發明之反股寡核苷酸包含具有10-22個連續核苷酸之連續核苷酸區，該區與SEQ ID NO 156一致： SEQ ID NO 156：5' CAAATATTTACCTGGTTGTTGG 3' 在一些實施例中，連續核苷酸區由SEQ ID NO 156之至少10個連續核苷酸、諸如11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22個連續核苷酸、諸如12-22、諸如14-18個連續核苷酸組成，或包含該等連續核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸之整個連續序列由SEQ ID NO 156之至少10個連續核苷酸、諸如11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22個連續核苷酸、諸如12-22、諸如14-18個連續核苷酸組成，或包含該等連續核苷酸。 在一些實施例中，連續核苷酸區係SEQ ID NO 156之至少12個連續核苷酸。在一些實施例中，連續核苷酸區係SEQ ID NO 156之至少14個連續核苷酸。在一些實施例中，連續核苷酸區係SEQ ID NO 156之至少16個連續核苷酸。 在一些實施例中，連續核苷酸區係至少10、12、14或16個與SEQ ID NO 143一致之連續核苷酸。 在一些實施例中，連續核苷酸區係至少10、12、14或16個與SEQ ID NO 145一致之連續核苷酸。 在一些實施例中，連續核苷酸區係至少10、11、12、13、14、15或16個與SEQ ID NO 143一致之連續核苷酸。 在一些實施例中，連續核苷酸區係至少10、11、12、13、14、15、16或17個與SEQ ID NO 145一致之連續核苷酸。 在一些實施例中，連續核苷酸由SEQ ID NO 143組成或包含SEQ ID NO 143。 在一些實施例中，連續核苷酸區由SEQ ID NO 145組成或包含SEQ ID NO 145。 在一些實施例中，連續核苷酸區係至少10、12、14或16個與選自由以下組成之群的序列一致的連續核苷酸：SEQ ID NO 138、139、140、141、142、143、144及145。在一些實施例中，連續核苷酸區包含選自由以下組成之群的序列或由該序列組成：SEQ ID NO 138、139、140、141、142、143、144及145。 在一些實施例中，連續核苷酸區包含序列SEQ ID NO 146：TTTACCTGGTT。 本發明提供11-30個核苷酸長度、諸如12-20個核苷酸長度之反股寡核苷酸，其包含序列SEQ ID NO 146：TTTACCTGGTT。
雜交
如本文所用之術語「雜交(hybridizing/hybridize)」理解為兩個核酸股(例如寡核苷酸及標靶核酸)在對置股上之鹼基對之間形成氫鍵，由此形成雙螺旋體。兩個核酸股之間的結合親和力係雜交的強度。通常描述，就熔融溫度(T
m
)而言定義為一半寡核苷酸與標靶核酸成雙螺旋時之溫度。在生理條件下T
m
不與親和力嚴格成比例(Mergny及Lacroix, 2003,Oligonucleotides 13:515-537)。標準狀態吉布斯(Gibbs)自由能ΔG°係結合親和力之更精確表示，且經由ΔG° = -RTln(K
d
)與反應之解離常數(K
d
)相關，其中R係氣體常數且T係絕對溫度。因此，寡核苷酸與標靶核酸之間的反應的極低ΔG°反映寡核苷酸與標靶核酸之間的強雜交。ΔG°係與水性濃度為1 M、pH為7且溫度為37℃之反應相關之能量。寡核苷酸雜交至標靶核酸係自發反應，且對於自發反應ΔG°小於零。ΔG°可以實驗方式量測，例如藉由使用等溫滴定量熱法(isothermal titration calorimetry；ITC)，如Hansen 等人, 1965,
Chem . Comm .
36-38及Holdgate 等人, 2005,
Drug Discov Today
中所描述。熟習此項技術者將知曉商業設備可供用於ΔG°量測。ΔG°亦可藉由使用如SantaLucia, 1998,
Proc Natl Acad Sci USA .
95: 1460-1465所描述之最近鄰模型，使用由Sugimoto 等人, 1995,
Biochemistry
34:11211-11216及McTigue 等人, 2004,
Biochemistry
43:5388-5405描述之恰當導出的熱力學參數而在數值上估計。為了具有藉由雜交調節本發明之寡核苷酸既定核酸標靶之可能性，本發明之寡核苷酸針對10-30個核苷酸長度之寡核苷酸雜交至ΔG°估計值低於-10千卡(kcal)之標靶核酸。在一些實施例中雜交度或雜交強度藉由標準狀態吉布斯自由能ΔG°量測。針對8-30個核苷酸長度之寡核苷酸，寡核苷酸可雜交至ΔG°估計值低於-10千卡範圍、諸如低於-15千卡、諸如低於-20千卡及諸如低於-25千卡之標靶核酸。在一些實施例中，寡核苷酸雜交至ΔG°估計值為-10至-60千卡、諸如-12至-40、諸如-15至-30千卡或‑16至-27千卡諸如-18至-25千卡的標靶核酸。
標靶序列
寡核苷酸包含連續核苷酸區，該區與標靶核酸分子之子序列互補或雜交。如本文所用之術語「標靶序列」係指存在於標靶核酸中之核苷酸之序列，該序列包含與本發明之寡核苷酸之連續核苷酸區或序列互補的核鹼基序列。在一些實施例中，標靶序列由標靶核酸上之區構成，該區與本發明之寡核苷酸之連續核苷酸區或序列互補。在一些實施例中，標靶序列長於單個寡核苷酸之互補序列，且可例如代表標靶核酸之較佳區，該區可經由本發明之若干寡核苷酸靶向。 本發明之寡核苷酸包含與標靶核酸(諸如標靶序列)互補之連續核苷酸區。 寡核苷酸包含具有至少10個核苷酸之連續核苷酸區，該區與存在於標靶核酸分子中之標靶序列互補或雜交。連續核苷酸區(及因此標靶序列)包含至少10個連續核苷酸、諸如11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22個連續核苷酸、諸如12-22、諸如14-18個連續核苷酸。 在一些實施例中標靶序列係SEQ ID NO 147或存在於SEQ ID NO 147內。 在一些實施例中標靶序列選自由以下組成之群 SEQ ID NO 148、149、150、151、152、153、154及155： SEQ ID NO 148：AACAACCAGGTAAATA SEQ ID NO 149：CAACCAGGTAAATATTTG SEQ ID NO 150：CCAACAACCAGGTAAA SEQ ID NO 151：AACCAGGTAAATATTTGG SEQ ID NO 152：ACAACCAGGTAAATATTTGG SEQ ID NO 153：CAACAACCAGGTAAATAT SEQ ID NO 154：ACAACCAGGTAAATAT SEQ ID NO 155：AACAACCAGGTAAATAT 本發明提供具有10-30個核苷酸長度之反股寡核苷酸，其中該反股寡核苷酸包含具有至少10個連續核苷酸之連續核苷酸區，該區與存在於選自SEQ ID NO 147及148-155之序列中之序列互補。 本發明提供具有12-30個核苷酸長度之反股寡核苷酸，其中該反股寡核苷酸包含具有至少12個連續核苷酸之連續核苷酸區，該區與存在於選自SEQ ID NO 147及148-155之序列中之序列互補。 本發明提供具有14-30個核苷酸長度之反股寡核苷酸，其中該反股寡核苷酸包含具有至少14個連續核苷酸之連續核苷酸區，該區與存在於選自SEQ ID NO 147及148-155之序列中之序列互補。 本發明提供由連續核苷酸區組成或包含該區之反股寡核苷酸，該區與選自SEQ ID NO 148-155之序列互補。 標靶序列可為標靶核酸之子序列。在一些實施例中，寡核苷酸或連續核苷酸區與HTRA1子序列(諸如選自由SEQ ID NO 148-154組成之群的序列)完全互補，或僅包含一或兩個錯配。在一些實施例中，寡核苷酸或連續核苷酸區與HTRA1子序列SEQ ID NO 147完全互補，或僅包含一或兩個錯配。
靶細胞
如本文所用之術語靶細胞係指表現標靶核酸之細胞。在一些實施例中靶細胞可在活體內或活體外。在一些實施例中靶細胞係哺乳動物細胞，諸如嚙齒動物細胞(諸如小鼠細胞，或大鼠細胞)，或靈長類動物細胞(諸如猴細胞或人類細胞)。在一些實施例中，細胞可為豬細胞、狗細胞或兔細胞。在一些實施例中靶細胞可為視網膜細胞，諸如視網膜色素上皮(PRE)細胞。在一些實施例中細胞選自由以下組成之群：RPE細胞、雙極細胞、無軸突神經細胞、內皮細胞、神經節細胞及微神經膠質細胞。用於活體外分析時，靶細胞可為初級細胞或建立之細胞株，諸如U251、ARPE19、HEK293或大鼠C6細胞。
標靶核酸
根據本發明，標靶核酸係編碼哺乳動物HTRA1之核酸，且可為例如基因、RNA、mRNA及前體mRNA、成熟mRNA或cDNA序列。標靶可因此稱作HTRA1標靶核酸。 適合地，標靶核酸編碼HTRA1蛋白質，尤其哺乳動物HTRA1，諸如人類HTRA1 (參看例如表1及表2，其提供人類及大鼠HTRA1之mRNA及前體mRNA序列)。 在一些實施例中，標靶核酸選自由以下組成之群：SEQ ID NO：1、2、3及4，或其天然存在之變體(例如編碼哺乳動物HTRA1蛋白質之序列)。 靶細胞係表現HTRA1標靶核酸之細胞。在較佳實施例中標靶核酸係HTRA1 mRNA，諸如HTRA1前體mRNA或HTRA1成熟mRNA。靶向反股寡核苷酸時，通常忽略HTRA1 mRNA之聚A尾。 若在研究或診斷中採用本發明之寡核苷酸，則標靶核酸可為cDNA或衍生自DNA或RNA之合成核酸。 標靶序列可為標靶核酸之子序列。在一些實施例中，寡核苷酸或連續核苷酸區與HTRA1子序列(諸如選自由SEQ ID NO 148、149、150、151、152、153、154及155組成之群的序列)完全互補，或僅包含一或兩個錯配。 在寡核苷酸或其連續核苷酸區之整個長度中量測與標靶或其子序列之互補性。 對於活體內或活體外應用，本發明之寡核苷酸通常能夠在表現HTRA1標靶核酸之細胞中抑制HTRA1標靶核酸之表現。本發明之寡核苷酸之核鹼基的連續序列通常與HTRA1標靶核酸互補，如在寡核苷酸之整個長度中量測，視情況除了一或兩個錯配之外，且視情況排除可鍵聯寡核苷酸至視情況存在之官能基(諸如共軛物)的基於核苷酸之連接子區域，或其他非互補末端核苷酸(例如D區)。在一些實施例中，標靶核酸可為RNA或DNA，諸如信使RNA，諸如成熟mRNA或前體mRNA。在一些實施例中標靶核酸係編碼哺乳動物HTRA1蛋白質(諸如人類HTRA1)之RNA或DNA，例如人類HTRA1 mRNA序列，諸如揭示為SEQ ID NO 1 (NM_002775.4，GI：190014575)之序列。例示性標靶核酸之其他資訊提供於表1及表2中。
表 1.
人類及大鼠HTRA1之基因組及總成資訊。
Fwd = 正股。基因組座標提供前體mRNA序列(基因組序列)。NCBI參考提供mRNA序列(cDNA序列)。 *美國國家生物技術信息中心(The National Center for Biotechnology Information)參考序列資料庫係包括基因組、轉錄物及蛋白質之參考序列之全面的、整合的、非冗餘的、充分註釋的集合。其在www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq託管。
表 2.
人類及大鼠HTRA1之序列詳情。
天然存在之變體
術語「天然存在之變體」係指HTRA1基因或轉錄物之變體，其源自與標靶核酸相同之基因座，但可例如藉助於基因密碼之簡併而不同，該簡併導致大量密碼子編碼相同胺基酸，或歸因於前體mRNA之替代性拼接、或存在多型性(諸如單核苷酸多型性)及對偶基因變體而不同。基於存在寡核苷酸之充足互補序列，本發明之寡核苷酸可因此靶向標靶核酸及其天然存在之變體。在一些實施例中，天然存在之變體與哺乳動物HTRA1標靶核酸(諸如選自由SEQ ID NO 1、2、3或4組成之群的標靶核酸)具有至少95%、諸如至少98%或至少99%同源性。
表現之調節
如本文所用之術語「表現之調節」理解為總體術語：當與投與寡核苷酸之前的HTRA1的量相比時，寡核苷酸更改HTRA1的量的能力。替代地表現之調節可藉由參考不投與本發明之寡核苷酸的對照實驗來測定。調節之一種類型係寡核苷酸例如藉由使mRNA降解或阻斷轉錄而抑制、下調、減少、遏制、移除、停止、阻斷、預防、減輕、降低、避免或終止HTRA1表現的能力。本發明之反股寡核苷酸能夠抑制、下調、減少、遏制、移除、停止、阻斷、預防、減輕、降低、避免或終止HTRA1表現。
高親和力經修飾核苷
高親和力經修飾核苷係經修飾之核苷酸，其在併入至寡核苷酸中時增強寡核苷酸對其互補標靶之親和力，例如如藉由熔融溫度(T
m
)所量測。本發明之高親和力經修飾核苷較佳導致熔融溫度升高如下，每個經修飾核苷，在+ 0.5至+ 12℃之間、更佳在+ 1.5至+ 10℃之間且最佳在+ 3至+8℃之間。眾多高親和力經修飾核苷在此項技術中已知，且包括例如多種2'經取代之核苷以及鎖核酸(locked nucleic acid；LNA) (參看例如Freier及Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443及Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213)。
糖修飾
本發明之寡聚物可包含一或多個具有經修飾糖部分(亦即當與在DNA及RNA中發現之核糖部分相比時糖部分之修飾)之核苷。 已製備眾多具有核糖部分之修飾之核苷，其首要目的在於改良寡核苷酸之某些特性，諸如親和力及/或對核酸酶之耐性。 此類修飾包括其中核糖環結構經修飾之彼等，例如藉由用以下替代：己醣環(HNA)；或雙環，其通常在核糖環(LNA)上之C2與C4碳原子之間具有雙基團(biradicle)橋；或非連鎖核糖環，其通常缺乏C2與C3碳原子之間的鍵(例如UNA)。其他糖經修飾之核苷包括例如雙環己醣核酸(WO2011/017521)或三環核酸(WO2013/154798)。經修飾核苷亦包括其中糖部分經非糖部分替代的核苷，例如在肽核酸(PNA)或N-嗎啉基核酸之情形下。 糖修飾亦包括經由將核糖環上之取代基改變成除氫以外之基團，或DNA及RNA核苷中天然發現之2'-OH基團而得到的修飾。取代基可例如在2'、3'、4'或5'位置處引入。具有經修飾糖部分之核苷亦包括2'經修飾核苷，諸如2'經取代核苷。實際上，在研發2'經取代核苷上已花費大量注意力，且已發現大量2'經取代核苷在併入至寡核苷酸中時具有有益特性，諸如增強的核苷的耐性及增強的親和力。
2' 經修飾核苷。
2'糖經修飾核苷係在2'位置處具有除H或-OH以外之取代基之核苷(2'經取代核苷)，或包含2'鍵聯雙基團之核苷，且包括2'經取代核苷及LNA (2'-4'雙基團橋接)核苷。舉例而言，2'經修飾糖可向寡核苷酸提供增強的結合親和力及/或增加的對核酸酶的耐性。2'經取代修飾核苷之實例係2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA (MOE)、2'-胺基-DNA、2'-氟基-RNA及2'-F-ANA核苷。對於其他實例，請參看例如Freier及Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443及Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213，以及Deleavey及Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937。下方係一些2'經取代修飾核苷之圖示。
鎖核酸核苷 ( LNA )
LNA核苷係在核苷酸之核糖環之C2'與C4'之間包含連接基團(稱為雙基團或橋)的經修飾核苷。此等核苷在文獻中亦稱為橋接核酸或雙環核酸(BNA)。 在一些實施例中，本發明之寡聚物之經修飾核苷或LNA核苷具有式I或式II之通式結構：
或
β-D α-L 式I 式II 其中W選自-O-、-S-、-N(R
a
)-、-C(R
a
R
b
)-，諸如，在一些實施例中-O-； B指代核鹼基部分； Z指代與相鄰核苷之核苷間鍵，或5'-端基； Z*指代與相鄰核苷之核苷間鍵，或3'-端基； X指代選自由以下組成之清單的基團：-C(R
a
R
b
)-、-C(R
a
)=C(R
b
)-、-C(R
a
)=N-、-O-、-Si(R
a
)
2
-、-S-、-SO
2
-、-N(R
a
)-及＞C=Z 在一些實施例中，X選自由以下組成之群：-O-、-S-、NH-、NR
a
R
b
、-CH
2
-、CR
a
R
b
、-C(=CH
2
)-及-C(=CR
a
R
b
)- 在一些實施例中，X係-O- Y指代選自由以下組成之群的基團：-C(R
a
R
b
)-、-C(R
a
)=C(R
b
)-、-C(R
a
)=N-、-O-、-Si(R
a
)
2
-、-S-、-SO
2
-、-N(R
a
)-及＞C=Z 在一些實施例中，Y選自由以下組成之群：-CH
2
-、-C(R
a
R
b
)-、-CH
2
CH
2
-、-C(R
a
R
b
)-C(R
a
R
b
)-、-CH
2
CH
2
CH
2
-、-C(R
a
R
b
)C(R
a
R
b
)C(R
a
R
b
)-、-C(R
a
)=C(R
b
)-及-C(R
a
)=N- 在一些實施例中，Y選自由以下組成之群：-CH
2
-、-CHR
a
-、-CHCH
3
-、CR
a
R
b
- 或-X-Y-一起指代二價連接基團(亦稱作基團)，一起指代由選自由以下組成之群的1、2或3個基團/原子組成的二價連接基團：-C(R
a
R
b
)-、-C(R
a
)=C(R
b
)-、-C(R
a
)=N-、-O-、-Si(R
a
)
2
-、-S-、-SO
2
-、-N(R
a
)-及＞C=Z， 在一些實施例中，-X-Y-指代選自由以下組成之群的雙基團：-X-CH
2
-、-X-CR
a
R
b
-、-X-CHR
a -
、-X-C(HCH
3
)
-
、-O-Y-、-O-CH
2
-、-S-CH
2
-、-NH-CH
2
-、-O-CHCH
3
-、-CH
2
-O-CH
2
、-O-CH(CH
3
CH
3
)-、-O-CH
2
-CH
2
-、OCH
2
-CH
2
-CH
2
-、-O-CH
2
OCH
2
-、-O-NCH
2
-、-C(=CH
2
)-CH
2
-、-NR
a
-CH
2
-、N-O-CH
2
、-S-CR
a
R
b
-及-S-CHR
a
-。 在一些實施例中-X-Y-指代-O-CH
2
-或-O-CH(CH
3
)-。 其中Z選自-O-、-S-及-N(R
a
)-， 且R
a
及(當存在時)R
b
各自獨立地選自氫、視情況經取代之C
1 - 6
烷基、視情況經取代之C
2 - 6
烯基、視情況經取代之C
2 - 6
炔基、羥基、視情況經取代之C
1 - 6
烷氧基、C
2 - 6
烷氧基烷基、C
2 - 6
烯基氧基、羧基、C
1 - 6
烷氧基羰基、C
1 - 6
烷基羰基、甲醯基、芳基、芳氧基-羰基、芳氧基、芳基羰基、雜芳基、雜芳氧基-羰基、雜芳氧基、雜芳基羰基、胺基、單及二(C
1 - 6
烷基)胺基、胺甲醯基、單及二(C
1 - 6
烷基)-胺基-羰基、胺基-C
1 - 6
烷基-胺基羰基、單及二(C
1 - 6
烷基)胺基-C
1 - 6
烷基-胺基羰基、C
1 - 6
烷基-羰胺基、胺甲醯胺基、C
1 - 6
烷醯基氧基、磺醯基(sulphono)、C
1 - 6
烷基磺醯基氧基、硝基、疊氮基、硫基、C
1 - 6
烷硫基、鹵素，其中芳基及雜芳基可視情況經取代，且其中兩個成對取代基R
a
及R
b
一起可指代視情況經取代之亞甲基(=CH
2
)，其中對於所有對掌性中心，可在
R
或
S
定向中發現不對稱基團。 其中R
1
、R
2
、R
3
、R
5
及R
5 *
獨立地選自由以下組成之群：氫、視情況經取代之C
1 - 6
烷基、視情況經取代之C
2 - 6
烯基、視情況經取代之C
2 - 6
炔基、羥基、C
1 - 6
烷氧基、C
2 - 6
烷氧基烷基、C
2 - 6
烯基氧基、羧基、C
1 - 6
烷氧基羰基、C
1 - 6
烷基羰基、甲醯基、芳基、芳氧基-羰基、芳氧基、芳基羰基、雜芳基、雜芳氧基-羰基、雜芳氧基、雜芳基羰基、胺基、單及二(C
1 - 6
烷基)胺基、胺甲醯基、單及二(C
1 - 6
烷基)-胺基-羰基、胺基-C
1 - 6
烷基-胺基羰基、單及二(C
1 - 6
烷基)胺基-C
1 - 6
烷基-胺基羰基、C
1 - 6
烷基-羰胺基、胺甲醯胺基、C
1 - 6
烷醯基氧基、磺醯基、C
1 - 6
烷基磺醯基氧基、硝基、疊氮基、硫基、C
1 - 6
烷硫基、鹵素，其中芳基及雜芳基可視情況經取代，且其中兩個成對取代基一起可指代酮基、硫酮基、亞胺基或視情況經取代之亞甲基。 在一些實施例中R
1
、R
2
、R
3
、R
5
及R
5 *
獨立地選自C
1 - 6
烷基，諸如甲基，及氫。 在一些實施例中R
1
、R
2
、R
3
、R
5
及R
5 *
皆為氫。 在一些實施例中R
1
、R
2
、R
3
皆為氫，且R
5
及R
5 *
中之一者亦為氫且R
5
及R
5 *
中之另一者不為氫，諸如C
1 - 6
烷基(諸如甲基)。 在一些實施例中，R
a
係氫或甲基。在一些實施例中，(當存在時)R
b
係氫或甲基。 在一些實施例中，R
a
及R
b
中之一者或兩者係氫 在一些實施例中，R
a
及R
b
中之一者係氫且另一者不為氫 在一些實施例中，R
a
及R
b
中之一者係甲基且另一者係氫 在一些實施例中，R
a
及R
b
兩者均為甲基。 在一些實施例中，雙基團-X-Y-係-O-CH
2
-，W係O，且R
1
、R
2
、R
3
、R
5
及R
5 *
中所有皆為氫。此類LNA核苷揭示於WO99/014226、WO00/66604、WO98/039352及WO2004/046160中，其皆以引用之方式併入本文中，且包括該等LNA核苷通常稱為β-D-氧基LNA及α-L-氧基LNA核苷。 在一些實施例中，雙基團-X-Y-係-S-CH
2
-，W係O，且R
1
、R
2
、R
3
、R
5
及R
5 *
中所有皆為氫。此類硫基LNA核苷揭示於WO99/014226及WO2004/046160中，其以引用之方式併入本文中。 在一些實施例中，雙基團-X-Y-係-NH-CH
2
-，W係O，且R
1
、R
2
、R
3
、R
5
及R
5 *
中所有皆為氫。此類胺基LNA核苷揭示於WO99/014226及WO2004/046160中，其以引用之方式併入本文中。 在一些實施例中，雙基團-X-Y-係-O-CH
2
-CH
2
-或-O-CH
2
-CH
2
-CH
2
-，W係O，且R
1
、R
2
、R
3
、R
5
及R
5 *
中所有皆為氫。此類LNA核苷揭示於WO00/047599及Morita 等人, Bioorganic & Med.Chem. Lett. 12 73-76中，其以引用之方式併入本文中，且包括此類LNA核苷通常稱為2'-O-4'C-乙烯橋接核酸(ENA)。 在一些實施例中，雙基團-X-Y-係-O-CH
2
-，W係O，且R
1
、R
2
、R
3
中所有，及R
5
及R
5 *
中之一者係氫，且R
5
及R
5 *
中之另一者不為氫，諸如C
1 - 6
烷基(諸如甲基)。此類5'經取代LNA核苷揭示於WO2007/134181中，其以引用之方式併入本文中。 在一些實施例中，雙基團-X-Y-係-O-CR
a
R
b
-，其中R
a
及R
b
中之一者或兩者不為氫，諸如甲基，W係O，且R
1
、R
2
、R
3
中所有，及R
5
及R
5 *
中之一者係氫，且R
5
及R
5 *
中之另一者不為氫，諸如C
1 - 6
烷基(諸如甲基)。此類雙修飾LNA核苷揭示於WO2010/077578中，其以引用之方式併入本文中。 在一些實施例中，雙基團-X-Y-指代二價連接基團-O-CH(CH
2
OCH
3
)-(2'O-甲氧基乙基雙環核酸-Seth等人, 2010, J. Org. Chem. 第75(5)卷 第1569-81頁)。在一些實施例中，雙基團-X-Y-指代二價連接基團-O-CH(CH
2
CH
3
)-(2'O-乙基雙環核酸-Seth等人, 2010, J. Org. Chem. 第75(5)卷 第1569-81頁)。在一些實施例中，雙基團-X-Y-係-O-CHR
a
-，W係O，且R
1
、R
2
、R
3
、R
5
及R
5 *
中所有皆為氫。此類6'經取代LNA核苷揭示於WO10036698及WO07090071中，其均以引用之方式併入本文中。 在一些實施例中，雙基團-X-Y-係-O-CH(CH
2
OCH
3
)-，W係O，且R
1
、R
2
、R
3
、R
5
及R
5 *
中所有皆為氫。此類LNA核苷在此項技術中亦稱為環狀MOE (cMOE)且揭示於WO07090071中。 在一些實施例中，雙基團-X-Y-指代二價連接基團-O-CH(CH
3
)-。-呈R或S組態。在一些實施例中，雙基團-X-Y-一起指代二價連接基團-O-CH
2
-O-CH
2
- (Seth 等人, 2010, J. Org. Chem)。在一些實施例中，雙基團-X-Y-係-O-CH(CH
3
)-，W係O，且R
1
、R
2
、R
3
、R
5
及R
5 *
中所有皆為氫。此類6'甲基LNA核苷在此項技術中亦稱為cET核苷，且可為(S)cET或(R)cET立體異構體，如揭示於WO07090071 (β-D)及WO2010/036698 (α-L)中，其均以引用之方式併入本文中)。 在一些實施例中，雙基團-X-Y-係-O-CR
a
R
b
-，其中在R
a
或R
b
中均不為氫，W係O，且R
1
、R
2
、R
3
、R
5
及R
5 *
中所有皆為氫。在一些實施例中，R
a
及R
b
均為甲基。此類6'經二取代之LNA核苷揭示於WO 2009006478中，其以引用之方式併入本文中。 在一些實施例中，雙基團-X-Y-係-S-CHR
a
-，W係O，且R
1
、R
2
、R
3
、R
5
及R
5 *
中所有皆為氫。此類6'經取代硫基LNA核苷揭示於WO11156202中，其以引用之方式併入本文中。在一些6'經取代硫基LNA實施例中R
a
係甲基。 在一些實施例中，雙基團-X-Y-係-C(=CH2)-C(R
a
R
b
)-，諸如-C(=CH
2
)-CH
2
-，或-C(=CH
2
)-CH(CH
3
)-，W係O，且R
1
、R
2
、R
3
、R
5
及R
5 *
中所有皆為氫。此類乙烯基碳LNA核苷揭示於WO08154401及WO09067647中，其均以引用之方式併入本文中。 在一些實施例中，雙基團-X-Y-係-N(-OR
a
)-，W係O，且R
1
、R
2
、R
3
、R
5
及R
5 *
中所有皆為氫。在一些實施例中R
a
係C
1 - 6
烷基，諸如甲基。此類LNA核苷亦稱為N經取代LNA，且揭示於WO2008/150729中，其以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，雙基團-X-Y-一起指代二價連接基團-O-NR
a
-CH
3
- (Seth 等人, 2010, J. Org. Chem)。在一些實施例中，雙基團-X-Y-係-N(R
a
)-，W係O，且R
1
、R
2
、R
3
、R
5
及R
5 *
中所有皆為氫。在一些實施例中R
a
係C
1 - 6
烷基，諸如甲基。 在一些實施例中，R
5
及R
5 *
中之一者或兩者係氫，且在經取代時R
5
及R
5 *
中之另一者係C
1 - 6
烷基，諸如甲基。在此類實施例中，R
1
、R
2
、R
3
可皆為氫，且雙基團-X-Y-可選自-O-CH2-或-O-C(HCR
a
)-，諸如-O-C(HCH3)-。 在一些實施例中，雙基團係-CR
a
R
b
-O-CR
a
R
b
-，諸如CH
2
-O-CH
2
-，W係O且R
1
、R
2
、R
3
、R
5
及R
5 *
中所有皆為氫。在一些實施例中R
a
係C
1 - 6
烷基，諸如甲基。此類LNA核苷亦稱為構形受限核苷酸(conformationally restricted nucleotide；CRN)且揭示於WO2013036868中，其以引用之方式併入本文中。 在一些實施例中，雙基團係-O-CR
a
R
b
-O-CR
a
R
b
-，諸如O-CH
2
-O-CH
2
-，W係O且R
1
、R
2
、R
3
、R
5
及R
5 *
中所有皆為氫。在一些實施例中R
a
係C
1 - 6
烷基，諸如甲基。此類LNA核苷亦稱為COC核苷酸且揭示於Mitsuoka 等人, Nucleic Acids Research 2009 37(4), 1225-1238中，其以引用之方式併入本文中。 將認識到，除非指定，否則LNA核苷可呈β-D或α-L立體異構形式。 LNA核苷之實例展現於方案1中。 方案1
如實例中所說明，在本發明之一些實施例中，寡核苷酸中之LNA核苷係β-D-氧基-LNA核苷。
核酸酶介導之降解
核酸酶介導之降解係指當與互補核苷酸序列形成雙螺旋體時，能夠介導互補核苷酸序列之降解的寡核苷酸。 在一些實施例中，寡核苷酸可經由核酸酶介導之標靶核酸之降解起作用，其中本發明之寡核苷酸能夠募集核酸酶，特定言之及核酸內切酶，較佳地內切核糖核酸酶(核糖核酸酶)，諸如核糖核酸酶H。經由核酸酶介導之機制操作之寡核苷酸設計之實例係通常包含具有至少5或6個DNA核苷且藉由親和力增強核苷(例如間隔體、頭體(headmer)、尾體(tailmer))側接在一側或兩側的區的寡核苷酸。
核糖核酸酶 H 活性及募集
反股寡核苷酸之核糖核酸酶H活性係指當與互補RNA分子成雙螺旋體時，反股寡核苷酸募集核糖核酸酶H之能力。WO01/23613提供用於測定核糖核酸酶H活性之活體外方法，其可用於測定募集核糖核酸酶H之能力。若在提供互補標靶核酸序列時，募集之初始速率(如以pmol/l/min為單位量測)為在使用與所測試之經修飾寡核苷酸具有相同鹼基序列，但僅含有DNA單體(其中硫代磷酸酯鍵在寡核苷酸中之所有單體之間)之寡核苷酸，且使用由WO01/23613 (以引用之方式併入本文中)之實例91-95提供之方法進行測定時的初始速率的至少5%、諸如至少10%或大於20%，則通常認為寡核苷酸能夠募集核糖核酸酶H。
間隔體
如本文所用之術語間隔體係指反股寡核苷酸，其包含核糖核酸酶H募集寡核苷酸之區(間隔)，該區藉由包含一或多個親和力增強經修飾核苷之區(側接(flank)或翼(wing))側接5'及3'。本文中描述多種間隔體設計。頭體及尾體係在側接中之一者缺失，亦即寡核苷酸之僅一個端部包含親和力增強經修飾核苷之情況下，能夠募集核糖核酸酶H的寡核苷酸。對於頭體，3'側接缺失(亦即5'側接包含親和力增強經修飾核苷)，且對於尾體，5'側接缺失(亦即3'側接包含親和力增強經修飾核苷)。
LNA 間隔體
術語LNA間隔體係間隔體寡核苷酸，在該間隔體寡核苷酸中親和力增強經修飾核苷中之至少一者係LNA核苷。
混合翼間隔體
術語混合翼間隔體係指LNA間隔體，在該LNA間隔體中側接區包含至少一個LNA核苷及至少一個非LNA經修飾核苷，諸如至少一個DNA核苷或至少一個2'經取代修飾核苷，諸如，例如2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA (MOE)、2'-胺基-DNA、2'-氟基-RNA及2'-F-ANA核苷。在一些實施例中，混合翼間隔體具有一個包含LNA核苷之側接(例如5'或3')，且另一個側接(對應地3'或5')包含2'經取代修飾核苷。
共軛物
如本文所用之術語共軛物係指共價鍵聯至非核苷酸部分(共軛部分或區C或第三區)之寡核苷酸。 如本文所用之術語共軛物係指共價鍵聯至非核苷酸部分(共軛部分或區C或第三區)之寡核苷酸。 在一些實施例中，非核苷酸部分選自由以下組成之群：蛋白質，諸如酶、抗體或抗體片段或肽；親脂部分，諸如脂質、磷脂、固醇；聚合物，諸如聚乙二醇或聚丙二醇；受體配位體；小分子；報導基因分子；及非核苷碳水化合物。
連接子
鍵或連接子係兩個原子之間的連接，該連接經由一或多個共價鍵將相關之一個化學基團或片段鍵聯至相關之另一個化學基團或片段。共軛部分可直接或藉由鍵聯部分(例如連接子或繫栓)連接至寡核苷酸。連接子用以共價連接第三區(例如共軛部分)至寡核苷酸(例如區A或C之末端)。 在本發明之一些實施例中，本發明之共軛物或寡核苷酸共軛物可視情況包含安置於寡核苷酸與共軛部分之間的連接子區。在一些實施例中，共軛物與寡核苷酸之間的連接子係生物可裂解的。 包含生理上不穩定鍵或由該鍵組成的生物可裂解連接子在哺乳動物身體內通常遭遇之條件或類似於哺乳動物身體內遭遇之條件下可裂解。生理上不穩定連接子經歷化學轉化(例如裂解)之條件包括化學條件，諸如pH、溫度、氧化或還原條件或試劑，及哺乳動物細胞中發現的鹽濃度或類似於哺乳動物細胞中遇到的鹽濃度。哺乳動物細胞內條件亦包括通常存在於哺乳動物細胞中(諸如來自蛋白水解酶或水解酶或核酸酶)之酶活性之現狀。在一個實施例中生物可裂解連接子對S1核酸酶裂解敏感。在一較佳實施例中，對核酸酶敏感的連接子包含1與10個之間核苷，諸如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷，更佳2與6個之間核苷且最佳2與4個之間鍵聯核苷，該等核苷包含至少兩個連續磷酸二酯鍵，諸如至少3或4或5個連續磷酸二酯鍵。較佳地核苷係DNA或RNA。含有生物可裂解連接子之磷酸二酯更詳細地描述於WO 2014/076195中(其以引用之方式併入本文中)，且在本文可指區D。 共軛物亦可經由生物不可裂解連接子鍵聯至寡核苷酸，或在一些實施例中共軛物可包含共價連接至生物可裂解連接子的不可裂解連接子。連接子未必係生物可裂解，但主要用以共價連接共軛部分至寡核苷酸或生物可裂解連接子。此類連接子可包含鏈結構或重複單元之寡聚物，重複單元係諸如乙二醇、胺基酸單元或胺基烷基。在一些實施例中連接子(區Y)係胺基烷基，諸如C
2
-C
36
胺基烷基，包括例如C
6
至C
12
胺基烷基。在一些實施例中連接子(區Y)係C
6
胺基烷基。共軛物連接基團可通常經由使用胺基經修飾寡核苷酸、及共軛基團上之活化酯基連接至寡核苷酸。
治療
如本文所用之術語『治療』係指治療現有疾病(例如如本文所提及之疾病或病症)或預防疾病(亦即防治)兩者。因此將認識到，如本文中所提及之治療在一些實施例中可為預防性的。
本發明之詳細描述 本發明之寡核苷酸
本發明係關於能夠抑制HTRA1表現之寡核苷酸。調節可藉由雜交至編碼HTRA1之標靶核酸或涉及調控HTRA1之標靶核酸來達成。標靶核酸可為哺乳動物HTRA 1序列，諸如選自由SEQ ID 1、2、3或4組成之群的序列。 本發明之寡核苷酸係靶向HTRA1、諸如哺乳動物HTRA1之反股寡核苷酸。 在一些實施例中本發明之反股寡核苷酸能夠經由抑制或下調標靶之表現而調節標靶表現。較佳地，此類調節產生與標靶之正常表現水準相比表現之至少20%抑制，諸如與標靶之正常表現水準相比至少30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%抑制。在一些實施例中，在活體外使用ARPE-19細胞，本發明之化合物可能夠抑制HTRA1 mRNA之表現水準至少60%或70%。在一些實施例中，在活體外使用ARPE-19細胞，本發明之化合物可能夠抑制
HTRA1
mRNA之表現水準至少60%或70%。在一些實施例中，在活體外使用ARPE-19細胞，本發明之化合物可能夠抑制HTRA1蛋白質之表現水準至少50%。適合地，實例提供可用以量測HTRA1 RNA或蛋白質抑制(例如實例3)之分析。標靶調節藉由寡核苷酸之連續核苷酸序列與標靶核酸之間的雜交觸發。在一些實施例中，本發明之寡核苷酸在寡核苷酸與標靶核酸之間包含錯配。儘管存在錯配，但與標靶核酸之雜交仍可足以展示HTRA1表現之所需調節。由錯配產生之減少的結合親和力宜可藉由寡核苷酸中增加的核苷酸數目及/或增加的能夠提高與標靶的結合親和力的經修飾核苷(諸如2'經修飾核苷，包括寡核苷酸序列內存在之LNA)數目來補償。 本發明之一態樣係關於反股寡核苷酸，其包含具有10至30個核苷酸長度之連續核苷酸區，該區具有與HTRA1標靶序列之至少90%互補性，諸如與HTRA1標靶序列(例如選自由SEQ ID NO 1、2、3及4組成之群的核酸)完全互補。 在一些實施例中，寡核苷酸包含連續序列，該序列與標靶核酸之區至少90%互補，諸如至少91%、諸如至少92%、諸如至少93%、諸如至少94%、諸如至少95%、諸如至少96%、諸如至少97%、諸如至少98%或100%互補。 在一些實施例中，本發明之寡核苷酸或其連續核苷酸序列與標靶核酸之區完全互補(100%互補)，或在一些實施例中在寡核苷酸與標靶核酸之間可包含一或兩個錯配。 在一些實施例中，寡核苷酸或其至少12個核苷酸之連續核苷酸序列與SEQ ID NO 147之區至少90%互補，諸如完全(或100%)互補。 在一些實施例中，寡核苷酸或其至少12個核苷酸之連續核苷酸序列與選自由SEQ ID NO 148、149、150、151、152、153、154及155組成之群的序列的區至少90%互補，諸如完全(或100%)互補。 在一些實施例中，寡核苷酸或其至少14個核苷酸之連續核苷酸序列與SEQ ID 147，或選自由SEQ ID NO 148、149、150、151、152、153、154及155組成之群的序列完全(或100%)互補。 在一些實施例中，寡核苷酸或其至少16個核苷酸之連續核苷酸序列與SEQ ID 147，或選自由SEQ ID NO 148、149、150、151、152、153、154及155組成之群的序列完全(或100%)互補。 在一些實施例中，寡核苷酸或其連續核苷酸區與選自由SEQ ID NO 148、149、150、151、152、153、154及155組成之群的序列完全(或100%)互補。 在一些實施例中，寡核苷酸或其連續核苷酸區包含選自由SEQ ID NO 143、138、139、140、141、142、144及145組成之群的序列或由該序列組成： SEQ ID NO 143：TATTTACCTGGTTGTT SEQ ID NO 138：CAAATATTTACCTGGTTG SEQ ID NO 139：TTTACCTGGTTGTTGG SEQ ID NO 140：CCAAATATTTACCTGGTT SEQ ID NO 141：CCAAATATTTACCTGGTTGT SEQ ID NO 142：ATATTTACCTGGTTGTTG SEQ ID NO 144：ATATTTACCTGGTTGT SEQ ID NO 145：ATATTTACCTGGTTGTT 應理解寡核苷酸基元序列可經修飾以例如提高對核酸酶之耐性及/或與標靶核酸之結合親和力。修飾描述於定義及「寡核苷酸設計」部分中。 在一些實施例中，本發明之寡核苷酸或其連續核苷酸區與標靶核酸之區完全互補(100%互補)，或在一些實施例中在寡核苷酸與標靶核酸之間可包含一或兩個錯配。在一些實施例中，寡核苷酸或其至少12個核苷酸之連續核苷酸序列與標靶核酸序列至少90%互補，諸如完全(或100%)互補。 在一些實施例中，寡核苷酸或其至少12個核苷酸之連續核苷酸序列與選自由SEQ ID NO 5-107、或SEQ ID NO 108-137組成之群的序列具有100%一致性。 在一些實施例中，寡核苷酸或其至少14個核苷酸之連續核苷酸序列與選自由SEQ ID NO 5-107、或SEQ ID NO 108-137組成之群的序列具有100%一致性。 在一些實施例中，寡核苷酸或其至少16個核苷酸之連續核苷酸序列與選自由SEQ ID NO 5-107、或SEQ ID NO 108-137組成之群的序列具有100%一致性。 在一些實施例中，寡核苷酸或其連續核苷酸區包含選自SEQ ID NO 5-107或SEQ ID NO 108-137之序列或由該序列組成。 在一些實施例中，本發明之化合物選自由以下組成之群：
其中大寫字母表示β-D-氧基LNA核苷，所有LNA胞嘧啶均為5-甲基胞嘧啶(如藉由上標
m
所指示)，小寫字母表示DNA核苷。所有核苷間鍵係硫代磷酸酯核苷間鍵(如藉由下標
s
所指示)。
寡核苷酸設計
寡核苷酸設計係指寡核苷酸序列中核苷糖修飾之樣式。本發明之寡核苷酸包含糖經修飾核苷且亦可包含DNA或RNA核苷。在一些實施例中，寡核苷酸包含糖經修飾核苷及DNA核苷。將經修飾核苷併入至本發明之寡核苷酸中可增強寡核苷酸對標靶核酸之親和力。在彼情況下，經修飾核苷可稱作親和力增強經修飾核苷酸。 在一實施例中，寡核苷酸包含至少1個經修飾核苷，諸如至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15或至少16個經修飾核苷。在一實施例中，寡核苷酸包含1至10個經修飾核苷，諸如2至9個經修飾核苷，諸如3至8個經修飾核苷，諸如4至7個經修飾核苷，諸如6或7個經修飾核苷。在一實施例中，本發明之寡核苷酸可包含修飾，該等修飾獨立地選自此等三種類型之修飾(經修飾糖、經修飾核鹼基及經修飾核苷間鍵)或其組合。較佳地寡核苷酸包含一或多個糖經修飾之核苷，諸如2'糖經修飾之核苷。較佳地本發明之寡核苷酸包含一或多個2'糖經修飾之核苷，其獨立地選自由以下組成之群：2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA、2'-胺基-DNA、2'-氟基-DNA、阿拉伯糖核酸(arabino nucleic acid；ANA)、2'-氟基-ANA及LNA核苷。甚至更佳地該一或多個經修飾核苷係LNA。 在一些實施例中，至少1個經修飾核苷係鎖核酸(LNA)，諸如至少2、諸如至少3、至少4、至少5、至少6、至少7或至少8個經修飾核苷係LNA。在又另一實施例中所有經修飾核苷係LNA。 在另一實施例中寡核苷酸包含至少一個經修飾核苷間鍵。在一較佳實施例中，連續核苷酸序列內之核苷間鍵係硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯核苷間鍵。在一些實施例中，寡核苷酸之連續序列中之所有核苷酸間鍵係硫代磷酸酯鍵。 在一些實施例中，本發明之寡核苷酸包含至少一個經修飾核苷，其係2'-MOE-RNA，諸如2、3、4、5、6、7、8、9或10個2'-MOE-RNA核苷單元。在一些實施例中，該等經修飾核苷中之至少一者係2'-氟基DNA，諸如2、3、4、5、6、7、8、9或10個2'-氟基-DNA核苷單元。 在一些實施例中，本發明之寡核苷酸包含至少一個LNA單元，諸如1、2、3、4、5、6、7或8個LNA單元，諸如2至6個LNA單元，諸如3至7個LNA單元，4至8個LNA單元或3、4、5、6或7個LNA單元。在一些實施例中，所有經修飾核苷係LNA核苷。在一些實施例中，所有LNA胞嘧啶單元係5-甲基-胞嘧啶。在一些實施例中，寡核苷酸或其連續核苷酸區在核苷酸序列之5'端具有至少1個LNA單元，且在3'端至少2個LNA單元。在一些實施例中，所有存在於本發明之寡核苷酸中之胞嘧啶核鹼基係5-甲基-胞嘧啶。 在一些實施例中，本發明之寡核苷酸包含至少一個LNA單元及至少一個2'經取代修飾核苷。 在本發明之一些實施例中，寡核苷酸包含2'糖經修飾核苷及DNA單元兩者。 在本發明之一實施例中本發明之寡核苷酸能夠募集核糖核酸酶H。 在一些實施例中，本發明之寡核苷酸或其連續核苷酸區係間隔體寡核苷酸。
間隔體設計
在一些實施例中，本發明之寡核苷酸或其連續核苷酸區具有間隔體設計或在本文中僅稱為「間隔體」之結構。在間隔體結構中，寡核苷酸包含至少三個相異結構區，5'-側接、間隔及3'-側接，F-G-F'，呈『5→3』定向。在此設計中，側接區F及F' (亦稱為翼區)包含至少一個糖經修飾核苷，該核苷鄰近區G，且在一些實施例中可包含2-7個糖經修飾核苷之連續延伸，或糖經修飾及DNA核苷之連續延伸(包含糖經修飾及DNA核苷兩者之混合翼)。因此，5'側接區及3'側接區之鄰近間隔區之核苷係糖經修飾核苷，諸如2'經修飾核苷。間隔區G包含在寡核苷酸與HTRA1標靶核酸成雙螺旋體時能夠募集核糖核酸酶H之核苷酸之連續延伸。在一些實施例中，區G包含5-16個DNA核苷之連續延伸。間隔體區F-G-F'與HTRA1標靶核酸互補，且可因此係寡核苷酸之連續核苷酸區。 側接區G之5'及3'端之區F及F'可包含一或多個親和力增強經修飾核苷。在一些實施例中，3'側接包含至少一個LNA核苷，較佳至少2個LNA核苷。在一些實施例中，5'側接包含至少一個LNA核苷。在一些實施例中，5'及3'側接區均包含LNA核苷。在一些實施例中，側接區中之所有核苷係LNA核苷。在其他實施例中，側接區可包含LNA核苷及其他核苷兩者(混合側接)，諸如DNA核苷及/或非LNA經修飾核苷，諸如2'經取代核苷。在此情形下間隔定義為具有至少5個核糖核酸酶H募集核苷(諸如5-16個DNA核苷)，藉由親和力增強經修飾核苷(諸如LNA，諸如β-D-氧基-LNA)側接於5'及3'端之連續序列。
區 F
連接至區G之5'端之區F (5'側接或5'翼)包含、含有至少一個糖經修飾核苷或由其組成，諸如至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7個經修飾核苷。在一些實施例中，區F包含1至7個經修飾核苷或由該等核苷組成，諸如2至6個經修飾核苷，諸如2至5個經修飾核苷，諸如2至4個經修飾核苷，諸如1至3個經修飾核苷，諸如1、2、3或4個經修飾核苷。 在一實施例中，區F中之一或多個或所有經修飾核苷係2'經修飾核苷。 在另一實施例中，區F中之2'經修飾核苷中之一或多者選自2'-O-烷基-RNA單元、2'-O-甲基-RNA、2'-胺基-DNA單元、2'-氟基-DNA單元、2'-烷氧基-RNA、MOE單元、LNA單元、阿拉伯糖核酸(ANA)單元及2'-氟基-ANA單元。 在本發明之一個實施例中，區F中之所有經修飾核苷係LNA核苷。在另一實施例中，區F中之LNA核苷獨立地選自由以下組成之群：氧基-LNA、硫基-LNA、胺基-LNA、cET及/或ENA，呈β-D或α-L組態或其組合。在一較佳實施例中，區F在連續序列之5'端具有至少1個β-D-氧基LNA單元。
區 G
區G (間隔區)可包含、含有5-16個能夠募集核糖核酸酶H之連續DNA核苷或由該等核苷組成。在另一實施例中，區G包含、含有5至12個、或6至10個或7至9個、諸如8個能夠募集核糖核酸酶H之連續核苷酸單元或由該等單元組成。 在又另一實施例中，區G中之至少一個核苷單元係DNA核苷單元，諸如4至20或6至18個DNA單元，諸如5至16個，在一些實施例中，區G之所有核苷係DNA單元。 在其他實施例中，區G可由DNA及能夠介導核糖核酸酶H裂解之其他核苷之混合物組成。在一些實施例中，區G之至少50%之核苷係DNA，諸如至少60%、至少70%或至少80%、或至少90%DNA。
區 F'
連接至區G之3'端之區F' (3'側接或3'翼)包含、含有至少一個糖經修飾核苷或由其組成，諸如至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7個經修飾核苷。在一些實施例中，區F'包含1至7個經修飾核苷或由該等核苷組成，諸如2至6個經修飾核苷，諸如2至5個經修飾核苷，諸如2至4個經修飾核苷，諸如1至3個經修飾核苷，諸如1、2、3或4個經修飾核苷。 在一實施例中，區F'中之一或多個或所有經修飾核苷係2'經修飾核苷。 在另一實施例中，區F'中之2'經修飾核苷中之一或多者選自2'-O-烷基-RNA單元、2'-O-甲基-RNA、2'-胺基-DNA單元、2'-氟基-DNA單元、2'-烷氧基-RNA、MOE單元、LNA單元、阿拉伯糖核酸(ANA)單元及2'-氟基-ANA單元。 在本發明之一個實施例中，區F'中之所有經修飾核苷係LNA核苷。在另一實施例中，區F'中之LNA核苷獨立地選自由以下組成之群：氧基-LNA、硫基-LNA、胺基-LNA、cET及/或ENA，呈β-D或α-L組態或其組合。在一較佳實施例中，區F'在連續序列之5'端具有至少1個β-D-氧基LNA單元。
區 D 、 D' 及 D"
本發明之寡核苷酸包含與標靶核酸互補之連續核苷酸區。在一些實施例中，寡核苷酸可進一步包含相對於連續核苷酸區定位於5'及/或3'之其他核苷酸，其在本文稱為區D。區D'及D"可分別連接至區F之5'端或區F'之3'端。在一些實施例中，D區(區D'或D")可形成與標靶核酸互補之連續核苷酸序列之部分，或在其他實施例中D區可與標靶核酸不互補。 在一些實施例中，本發明之寡核苷酸由連續核苷酸區及視情況存在之1-5個額外5'核苷酸(區D')組成或包含該連續核苷酸區及該等核苷酸。 在一些實施例中，本發明之寡核苷酸由連續核苷酸區及視情況存在之1-5個額外3'核苷酸(區D")組成或包含該連續核苷酸區及該等核苷酸。 區D'或D"可獨立地包含1、2、3、4或5個額外核苷酸，該等核苷酸可與標靶核酸互補或不互補。就此而言在一些實施例中，本發明之寡核苷酸可包含能夠調節藉由額外核苷酸側接於5'及/或3'端之標靶的連續核苷酸序列。此類額外核苷酸可充當對核酸酶敏感之生物可裂解連接子，且可因此用以將官能基(諸如共軛部分)連接至本發明之寡核苷酸。在一些實施例中，額外5'及/或3'端核苷酸與磷酸二酯鍵鍵聯，且可為DNA或RNA。在另一實施例中，額外5'及/或3'端核苷酸係經修飾之核苷酸，其可例如經包括以增強核酸酶穩定性或用於合成之簡易性。在一些實施例中，本發明之寡核苷酸包含區D'及/或D"以及連續核苷酸區。 在一些實施例中，本發明之間隔體寡核苷酸可由下式表示： F-G-F'；尤其F
1-7
-G
4-12
-F'
1-7
D'-F-G-F'，尤其D'
1-3
-F
1-7
-G
4-12
-F'
1-7
F-G-F'-D"，尤其F
1-7
-G
4-12
-F'
1-7
-D"
1-3
D'-F-G-F'-D"，尤其D'
1-3
-F
1-7
-G
4-12
-F'
1-7
-D"
1-3 製造方法
在另一態樣中，本發明提供用於製造本發明之寡核苷酸之方法，其包含使核苷酸單元反應且因此形成包含於寡核苷酸中之共價鍵聯連續核苷酸單元。較佳地，該方法使用胺基磷酸酯化學方法(參看例如Caruthers等人, 1987, Methods in Enzymology 第154卷, 第287-313頁)。在另一實施例中，該方法進一步包含使連續核苷酸序列與共軛部分(配位體)反應。在另一態樣中提供用於製造本發明之組合物之方法，其包含混合本發明之寡核苷酸或共軛寡核苷酸與醫藥學上可接受之稀釋劑、溶劑、載劑、鹽及/或佐劑。
醫藥鹽
用於作為治療性之用途，本發明之寡核苷酸可呈適合之醫藥鹽之形式提供，諸如鈉鹽或鉀鹽。在一些實施例中本發明之寡核苷酸係鈉鹽。
醫藥組合物
在另一態樣中，本發明提供醫藥組合物，其包含前述寡核苷酸及/或寡核苷酸共軛物中之任一者及醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑、鹽及/或佐劑。醫藥學上可接受之稀釋劑包括磷酸鹽-緩衝鹽水(PBS)及醫藥學上可接受之鹽，包括但不限於鈉鹽及鉀鹽。在一些實施例中，醫藥學上可接受之稀釋劑係無菌磷酸鹽緩衝鹽水。在一些實施例中，寡核苷酸用於濃度為50-300 µM溶液之醫藥學上可接受之稀釋劑中。在一些實施例中，本發明之寡核苷酸以10-1000 µg之劑量投與。 WO 2007/031091提供醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑及佐劑之適合及較佳實例(以引用之方式併入本文中)。WO2007/031091中亦提供適合之劑量、調配物、投與途徑、組合物、劑型、與其他治療劑之組合、前藥調配物。 本發明之寡核苷酸或寡核苷酸共軛物可與醫藥學上可接受之活性或惰性物質混合用於製備醫藥組合物或調配物。用於調配醫藥組合物之組合物及方法視多個指標而定，包括但不限於投與途徑、疾病程度或待投與之劑量。 在一些實施例中，本發明之寡核苷酸或寡核苷酸共軛物係前藥。特定言之關於寡核苷酸共軛物，在前藥傳遞至作用部位，例如靶細胞時，共軛部分自寡核苷酸解離。
應用
本發明之寡核苷酸可用作例如，診斷、治療及預防之研究試劑。 在研究中，此類寡核苷酸可用以特異性調節細胞(例如活體外細胞培養物)及實驗動物中HTRA1蛋白質之合成，進而有助於對標靶之功能分析或評估其作為治療性干預之標靶的有效性。通常標靶調節藉由降低或抑制mRNA生成蛋白質，進而防止蛋白質形成來實現，或藉由降低或抑制基因或mRNA生成蛋白質的調節劑來實現。 在診斷中，寡核苷酸可用以藉由northern印跡、原位雜交或類似技術偵測及定量細胞及組織中之HTRA1表現。 對於治療，疑似患有疾病或病症之動物或人類可藉由調節HTRA1表現來治療。 本發明提供用於治療或預防疾病之方法，其包含向患有疾病或對疾病敏感之個體投與治療或預防有效量之本發明的寡核苷酸、寡核苷酸共軛物或醫藥組合物。 本發明亦係關於如本文所定義用作藥物之寡核苷酸、組合物或共軛物。 根據本發明之寡核苷酸、寡核苷酸共軛物或醫藥組合物通常以有效量投與。 本發明亦提供本發明之寡核苷酸或寡核苷酸共軛物之用途，如所描述用於製造用於治療如本文中所提及之病症的藥物，或用於治療如本文中所提及的如病症的方法。 如本文中所提及之疾病或病症與HTRA1表現相關。在一些實施例中，疾病或病症可與HTRA1基因中，或蛋白質產物與HTRA1相關或相互作用的基因中的突變相關聯。因此，在一些實施例中，標靶核酸係HTRA1序列之突變形式，且在其他實施例中，標靶核酸係HTRA1序列之調節劑。 本發明之方法較佳用於治療或預防抵抗由HTRA1之異常水準及/或活性導致之疾病。 本發明進一步係關於如本文所定義之寡核苷酸、寡核苷酸共軛物或醫藥組合物之用途，其用於製造用於治療HTRA1之異常水準及/或活性的藥物。 在一個實施例中，本發明係關於寡核苷酸、寡核苷酸共軛物或醫藥組合物，其用於治療選自以下之疾病或病症：眼部病症，諸如黃斑變性，包括年齡相關黃斑變性(AMD)，諸如乾性AMD或濕性AMD，及糖尿病性視網膜病變。在一些實施例中，本發明之寡核苷酸共軛物或醫藥組合物可用於治療地圖狀萎縮或中期dAMD。在阿茲海默氏病及帕金森氏病中亦已指示HTRA1，且因此在一些實施例中，本發明之寡核苷酸共軛物或醫藥組合物可用於治療阿茲海默氏病或帕金森氏病。在杜興氏肌肉萎縮症、關節炎(諸如骨關節炎)、家族性缺血性大腦小血管疾病中亦已指示HTRA1，且因此在一些實施例中，本發明之寡核苷酸共軛物或醫藥組合物可用於治療杜興氏肌肉萎縮症、關節炎(諸如骨關節炎)或家族性缺血性大腦小血管疾病。
投與
本發明之寡核苷酸或醫藥組合物可局部(諸如，至皮膚、吸入、經眼或經耳)、或經腸(諸如，經口或藉由胃腸道)或非經腸(諸如，靜脈內、皮下、肌肉內、腦內、腦室內或鞘內)投與。 在一些實施例中，本發明之寡核苷酸、共軛物或醫藥組合物藉由非經腸途徑投與，包括靜脈內、動脈內、皮下、腹膜內或肌肉內注射或輸液、鞘內或顱內、例如腦內或室內投與。在一些實施例中，活性寡核苷酸或寡核苷酸共軛物經靜脈內投與。在另一實施例中，活性寡核苷酸或寡核苷酸共軛物經皮下投與。 為了用於治療眼部病症，諸如黃斑變性，例如AMD (濕性或乾性)，可使用眼內注射。 在一些實施例中，本發明之化合物或其醫藥學上可接受之鹽經由眼內注射，以每個眼約10 µg至約200 µg、諸如每個眼約50 µg至約150 µg、諸如每個眼約100 µg之劑量投與。在一些實施例中，劑量區間，亦即連續給藥之間的時間段係至少每月一次，諸如至少每兩月一次，或至少每三月一次。
組合療法
在一些實施例中，本發明之寡核苷酸、寡核苷酸共軛物或醫藥組成物用於與另一種治療劑組合治療。治療劑可例如係用於上文所述之疾病或病症之護理的標準物。
本發明之實施例
1. 一種具有10-30個核苷酸長度之反股寡核苷酸，其中該反股寡核苷酸包含具有10-22個核苷酸之連續核苷酸區，該區與SEQ ID NO 147至少90%諸如100%互補： SEQ ID NO 147：5' CCAACAACCAGGTAAATATTTG 3' 2. 如實施例1之反股寡核苷酸，其中該反股寡核苷酸能夠抑制HTRA1 mRNA表現。 3. 如實施例1或2之反股寡核苷酸，其中該連續核苷酸區與存在於選自由SEQ ID NO 138、139、140、141、142、143、144及145組成之群的序列中的序列一致： SEQ ID NO 138：CAAATATTTACCTGGTTG SEQ ID NO 139：TTTACCTGGTTGTTGG SEQ ID NO 140：CCAAATATTTACCTGGTT SEQ ID NO 141：CCAAATATTTACCTGGTTGT SEQ ID NO 142：ATATTTACCTGGTTGTTG SEQ ID NO 143：TATTTACCTGGTTGTT SEQ ID NO 144：ATATTTACCTGGTTGT SEQ ID NO 145：ATATTTACCTGGTTGTT 4. 如實施例1至3中任一項之反股寡核苷酸，其中該連續核苷酸區包含序列SEQ ID NO 146： SEQ ID NO 146：TTTACCTGGTT 5. 如實施例1至4中任一項之反股寡核苷酸，其中該寡核苷酸之連續核苷酸區由選自SEQ ID NO 138、139、140、141、142、143、144及145中之任一者的序列組成或包含該序列。 6. 如實施例1至5中任一項之反股寡核苷酸，其中該寡核苷酸之連續核苷酸區包含一或多個2'糖經修飾核苷。 7. 如實施例6之反股寡核苷酸，其中該一或多個2'糖經修飾核苷獨立地選自由以下組成之群：2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA、2'-胺基-DNA、2'-氟基-DNA、阿拉伯糖核酸(ANA)、2'-氟基-ANA及LNA核苷。 8. 如實施例5至7中任一項之反股寡核苷酸，其中該一或多個經修飾核苷係LNA核苷。 9. 如實施例1至8中任一項之反股寡核苷酸，其中該寡核苷酸之連續核苷酸區包含至少一個經修飾核苷間鍵，諸如一或多個硫代磷酸酯核苷間鍵。 10. 如實施例9之反股寡核苷酸，其中該連續核苷酸區內之所有核苷間鍵係硫代磷酸酯核苷間鍵。 11. 如實施例1至10中任一項之反股寡核苷酸，其中該寡核苷酸能夠募集核糖核酸酶H。 12. 如實施例1至11中任一項之反股寡核苷酸，其中該寡核苷酸或其連續核苷酸序列係或包含間隔體。 13. 如實施例11或12之反股寡核苷酸，其中該寡核苷酸或其連續核苷酸序列係式5'-F-G-F'-3'之間隔體，其中區F及F'獨立地包含1至7個糖經修飾核苷，且G係能夠募集核糖核酸酶H之6至16個核苷之區，其中區F及F'之鄰近區G之核苷係糖經修飾核苷。 14. 如實施例13之反股寡核苷酸，其中區G由6至16個DNA核苷組成或包含該等核苷。 15. 如實施例13或14之反股寡核苷酸，其中區F及F'各自包含至少一個LNA核苷。 16. 如實施例1至15中任一項之反股寡核苷酸，其選自選自以下之群： C
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G (SEQ ID NO 138，化合物編號138,1) T
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G (SEQ ID NO 139，化合物編號139,1) C
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T (SEQ ID NO 140，化合物編號140,1) C
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T (SEQ ID NO 141，化合物編號141,1) A
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G (SEQ ID NO 142，化合物編號142,1) T
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T (SEQ ID NO 143，化合物編號143,1) T
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T (SEQ ID NO 143，化合物編號143,2) T
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T (SEQ ID NO 143，化合物編號143,3) A
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T (SEQ ID NO 144，化合物編號144,1) A
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T (SEQ ID NO 144，化合物編號144,2) A
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T (SEQ ID NO 145，化合物編號145,1) A
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T (SEQ ID NO 145，化合物編號145,2) A
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T (SEQ ID NO 145，化合物編號145,3) 其中大寫字母表示LNA核苷單元，小寫字母表示DNA核苷單元，下標s表示硫代磷酸酯核苷間鍵聯，其中所有LNA胞嘧啶均為5-甲基胞嘧啶。 17. 如實施例16之反股寡核苷酸，其中該等LNA核苷均為β-D-氧基LNA核苷。 18. 一種共軛物，其包含如實施例1至17中任一項之寡核苷酸，及至少一個共價連接至該寡核苷酸之共軛部分。 19. 一種醫藥組合物，其包含如實施例1至17之寡核苷酸或如實施例18之共軛物，及醫藥學上可接受之稀釋劑、溶劑、載劑、鹽及/或佐劑。 20. 一種於表現HTRA1之靶細胞中調節HTRA1表現之活體內或活體外方法，該方法包含以有效量向該細胞投與如實施例1至17中任一項之寡核苷酸或如實施例18之共軛物或如實施例19之醫藥組合物。 21. 一種用於治療或預防疾病之方法，其包含向患有疾病或對疾病敏感之個體投與治療或預防有效量之如實施例1至17中任一項之寡核苷酸或如實施例18之共軛物或如實施例19之醫藥組合物。 22. 如實施例21之方法，其中該疾病選自由以下組成之群：黃斑變性(諸如濕性AMD、乾性AMD、地圖狀萎縮、中期dAMD、糖尿病性視網膜病變)、帕金森氏病、阿茲海默氏病、杜興氏肌肉萎縮症、關節炎(諸如骨關節炎)及家族性缺血性大腦小血管疾病。 23. 如實施例1至17中任一項之寡核苷酸或如實施例18之共軛物或如實施例19之醫藥組合物，其用於醫學。 24. 如實施例1至17中任一項之寡核苷酸或如實施例18之共軛物或如實施例19之醫藥組合物，其用於治療或預防選自由以下組成之群的疾病：黃斑變性(諸如濕性AMD、乾性AMD、地圖狀萎縮、中期dAMD、糖尿病性視網膜病變)、帕金森氏病、阿茲海默氏病、杜興氏肌肉萎縮症、關節炎(諸如骨關節炎)及家族性缺血性大腦小血管疾病。 25. 一種如實施例1至17中任一項之寡核苷酸或如實施例18之共軛物或如實施例19之醫藥組合物的用途，其用於製備用於治療或預防選自由以下組成之群的疾病之藥物：黃斑變性(諸如濕性AMD、乾性AMD、地圖狀萎縮、中期dAMD、糖尿病性視網膜病變)、帕金森氏病、阿茲海默氏病、杜興氏肌肉萎縮症、關節炎(諸如骨關節炎)及家族性缺血性大腦小血管疾病。
實例 材料及方法 寡核苷酸合成
寡核苷酸合成在此項技術中總體上已知。下方係可應用之方案。本發明之寡核苷酸可已藉由在裝置、載體及所用濃度方面略微改變方法而製備。 寡核苷酸使用胺基磷酸酯方法在Oligomaker 48上在尿苷通用載體上以1 μmol等級合成。在合成結束時，在60℃下使用氨水持續5-16小時使寡核苷酸自固體載體解離。寡核苷酸藉由逆相HPLC (RP-HPLC)或固相萃取純化，且藉由UPLC特徵化，且分子量藉由ESI-MS進一步確認。
寡核苷酸之延長：
β-氰基乙基-胺基磷酸酯之偶合(DNA-A (Bz)、DNA-G (ibu)、DNA-C (Bz)、DNA-T、LNA-5-甲基-C (Bz)、LNA-A(Bz)、LNA-G (dmf)、LNA-T)藉由使用0.1 M之5'-O-DMT-受保護胺基酸酯於乙腈中之溶液及DCI (4,5-二氰基咪唑)於乙腈(0.25 M)中作為活化劑來進行。對於最終循環，可使用具有所需修飾之胺基磷酸酯，例如用於連接共軛基團或如所指的共軛基團的C6連接子。用於引入硫代磷酸酯鍵之硫醇化藉由使用氫化黃原素(xanthane hydride) (0.01 M於9:1之乙腈/吡啶中)進行。磷酸二酯鍵可使用0.02 M碘於7:2:1之THF/吡啶/水中來引入。剩餘試劑係通常用於寡核苷酸合成之試劑。 對於後固相合成共軛，在固相合成之最終循環中可使用市售C6胺基連接子胺基磷酸酯，且在去除保護基及自固體載體解離之後，胺基鍵聯之去保護寡核苷酸經分離。共軛物經由使用標準合成方法活化官能基來引入。
藉由 RP - HPLC 純化 ：
粗製化合物藉由預備之RP-HPLC在Phenomenex Jupiter C18 10µ 150 × 10 mm管柱上純化。0.1 M pH 8之乙酸銨及乙腈以5 mL/min之流動速率用作緩衝液。將收集之部分凍乾，得到通常呈白色固體狀之經純化化合物。
縮寫 ：
DCI： 4,5-二氰基咪唑 DCM： 二氯甲烷 DMF： 二甲基甲醯胺 DMT： 4,4'-二甲氧基三苯甲基 THF： 四氫呋喃 Bz： 苯甲醯基 Ibu： 異丁醯基 RP-HPLC： 逆相高效液相層析
Tm 分析 ：
寡核苷酸及RNA標靶(磷酸酯鍵聯，PO)雙螺旋體在500 ml無核糖核酸酶之水中稀釋至3 mM，且與500 ml 2 × T
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-緩衝液(200 mM NaCl、0.2 mM EDTA、20mM磷酸鈉，pH 7.0)混合。溶液加熱至95℃ 3 min且隨後使其在室溫下退火30 min。雙螺旋體熔融溫度(T
m
)在配備有帕爾貼(Peltier)溫度程式設計器PTP6之Lambda 40 UV/VIS分光光度計上使用PE Templab軟體(Perkin Elmer)量測。溫度自20℃斜升至95℃且隨後降至25℃，在260 nm下記錄吸光值。熔融及退火兩者之一階導數及局部最大值用以分析雙螺旋體T
m
。
實例 1 ： 在 C6 細胞株中在單次劑量濃度下測試反股寡核苷酸靶向 大 鼠 Htra1 之 活體外功效 .
大鼠C6細胞株購自ATCC且如由供應商推薦保持於37℃下具有5% CO
2
之含濕氣培育箱中。針對分析，在培養基中在96多孔盤中接種1500個C6細胞/孔。細胞培育2小時，隨後添加溶解於PBS中之寡核苷酸。寡核苷酸濃度：25 µM。在添加寡核苷酸4天之後，收集細胞。RNA使用PureLink Pro 96 RNA純化套組(Ambion，根據製造商說明)提取。cDNA隨後使用M-MLT逆轉錄酶、無規十聚體(decamer)RETROscript、核糖核酸酶抑制劑(Ambion，根據製造商說明)及100mM dNTP組PCR級(Invitrogen)以及無脫氧核糖核酸酶/核糖核酸酶之水(Gibco)來合成。分析基因表現時，使用TagMan Fast Advanced Master Mix (2×) (Ambion)在雙股(doublex)設定中進行qPCR。針對qPCR使用以下TaqMan引子分析：Htra1，Rn00581870_m1 (FAM-MGB)及管家基因，Tbp，Rn01455646_m1 (VIC-MGB)。所有引子組皆購自Life Technologies。表中之相對Htra1 mRNA表現水準展示為對照(PBS處理之細胞)之%。
所用寡核苷酸：
對於化合物：大寫字母表示LNA核苷(使用β-D-氧基LNA核苷)，所有LNA胞嘧啶均為5-甲基胞嘧啶，小寫字母表示DNA核苷，前方有上標
m
之DNA胞嘧啶表示5-甲基C-DNA核苷。所有核苷間鍵係硫代磷酸酯核苷間鍵。
實例 2 : 在 C6 細胞株中在劑量反應曲線下測試所選擇寡核苷酸靶向 大 鼠 Htra1 之 活體外效能及功效 .
大鼠C6細胞株描述於實例1中。分析如實例1中所描述進行。寡核苷酸濃度：自50 µM，半對數(half-log)稀釋，8個點。在添加寡核苷酸4天之後，收集細胞。RNA提取、cDNA合成及qPCR如實例1中所描述進行。n = 2次生物重複。EC
50
測定在GraphPad Prism6中進行。在50 µM寡核苷酸處理下之相對Htra1 mRNA水準在表中展示為對照(PBS)之%。亦測試額外引子組(Htra1，Rn00668987_m1 [FAM-MGB]對比Ppia，Rn006900933_m1 [VIC-MGB]及Hprt，Rn01527840_m1 [VIC-MGB])，且使用彼等引子觀測到相同趨勢(資料未示出)。
實例 3 在 U251 細胞株中在單次劑量濃度下測試寡核苷酸靶向人類 HTRA1 之 活體外功效 .
人類神經膠母細胞瘤U251細胞株購自ECACC且如由供應商推薦保持於37℃下具有5% CO
2
之含濕氣培育箱中。針對分析，在饑餓培養基(培養基由供應商推薦，除了1% FBS而非10%以外)中在96多孔盤中接種15000個U251細胞/孔。細胞培育24小時，隨後添加溶解於PBS中之寡核苷酸。寡核苷酸濃度：5 µM。在添加化合物3-4天之後，移除培養基且添加新培養基(無寡核苷酸)。在添加寡核苷酸6天之後，收集細胞。RNA使用PureLink Pro 96 RNA純化套組(Ambion，根據製造商說明)提取。cDNA隨後使用M-MLT逆轉錄酶、無規十聚體RETROscript、核糖核酸酶抑制劑(Ambion，根據製造商說明)及100mM dNTP組PCR級(Invitrogen)以及無脫氧核糖核酸酶/核糖核酸酶之水(Gibco)來合成。對於基因表現分析，使用TagMan Fast Advanced Master Mix (2×) (Ambion)在雙股(doublex)設定中進行qPCR。針對qPCR使用以下TaqMan引子分析：HTRA1，Hs01016151_ m1 (FAM-MGB)及管家基因，TBP，Hs4326322E (VIC-MGB)來自Life Technologies。表中之相對HTRA1 mRNA表現水準展示為對照(PBS處理之細胞)之%。
對於化合物：大寫字母表示LNA核苷(使用β-D-氧基LNA核苷)，所有LNA胞嘧啶均為5-甲基胞嘧啶，小寫字母表示DNA核苷，前方有上標
m
之DNA胞嘧啶表示5-甲基C-DNA核苷。所有核苷間鍵係硫代磷酸酯核苷間鍵。
實例 4 在 ARPE19 及 U251 細胞株中在 2 個 濃度下測試寡核苷酸之庫靶向人類 HTRA1 mRNA 之 活體外功效 .
針對HTRA1鑑別有前景之「熱點」區。在U251及ARPE19細胞株中篩查n = 129 個人類/犬/大鼠HTRA1 LNA寡核苷酸之庫。根據此庫吾等鑑別出一系列在位點33042-33064之間靶向人類HTRA1前體mRNA (SEQ ID NO2)之活性寡核苷酸，如圖1中所示。 人類視網膜色素上皮ARPE19細胞株購自ATCC且在37℃下具有5% CO
2
之含濕氣培育箱中保持於DMEM-F12 (Sigma，D8437)、10% FBS、1%青黴素/鏈黴素(pen/strep)中。U251細胞株描述於實例3中。針對分析，在培養基(除了5% FBS而非10%以外)中在96多孔盤中接種5000個ARPE19細胞/孔。細胞培育1小時，隨後添加溶解於PBS中之寡核苷酸。在添加寡核苷酸4天之後，收集細胞。關於U251細胞株之分析如實例3中所描述進行。寡核苷酸濃度：25及2.5 µM。RNA使用RNeasy 96 Biorobot 8000套組(Qiagen，根據製造商說明)提取。cDNA隨後使用Retroscript cDNA合成套組(ThermoFisher，根據製造商說明)合成。對於基因表現分析，qPCR使用Fluidigm Biomark系統進行。針對qPCR使用以下TaqMan引子分析：HTRA1，Hs01016151_m1及管家基因，TBP，Hs99999910_m1及PPIA，Hs99999904_m1，來自Life Technologies。n = 2次生物重複。相對HTRA1 mRNA表現水準在表中展示為對照(PBS)之%。亦測試額外HTRA1引子組(Hs00170197_m1)且觀測到相同趨勢(資料未示出)。
對於化合物：大寫字母表示LNA核苷(使用β-D-氧基LNA核苷)，所有LNA胞嘧啶均為5-甲基胞嘧啶，小寫字母表示DNA核苷。所有核苷間鍵係硫代磷酸酯核苷間鍵。
實例 5 ， 在 大 鼠 C6 細胞株中在單次劑量濃度下測試所選擇人類 / 大 鼠 HTRA1 靶向 LNA 寡核苷酸 之 活體外功效 .
大鼠C6細胞株描述於實例1中。分析如實例1中所描述進行。寡核苷酸濃度：25µM。n = 2次生物重複。表中之相對Htra1 mRNA表現水準展示為對照(PBS處理之細胞)之%。
實例 6 ，在 ARPE19 、 U251 及 C6 細胞株中在劑量反應中測試所選擇人類 / 犬 / 大 鼠 LNA 寡核苷酸之活體外效能及功效 .
ARPE19、U251及C6細胞株分別描述於實例4、3及1中。針對分析，在供應商推薦之培養基中在96多孔盤中接種2000個U251或ARPE19細胞/孔。細胞培育2小時，隨後添加溶解於PBS中之寡核苷酸。C6細胞株分析如實例1-2中所描述進行。寡核苷酸濃度：自50 µM，半對數稀釋，8個點。在添加寡核苷酸4天之後，收集細胞。針對所有細胞株，RNA提取、cDNA合成及qPCR如實例1中所描述進行。針對U251及ARPE19細胞使用以下TaqMan引子分析：HTRA1，Hs01016151_m1 (FAM-MGB)及管家基因，TBP，Hs4326322E (VIC-MGB)。所有引子組皆購自Life Technologies。n = 2次生物重複。EC50測定在Graph Pad Prism6中進行。在50 µM寡核苷酸處理下之相對HTRA1 mRNA水準在表中展示為對照(PBS)之%。
實例 7 ，在 ARPE19 及 U251 細胞株中在單次劑量濃度下測試所選擇人類 HTRA1 靶向 寡核苷酸之活體外功效 .
ARPE19及U251細胞株及分析描述於實例6中。RNA提取如實例1中所描述進行，cDNA合成及qPCR使用qScript XLT一步RT-qPCR ToughMix Low ROX，95134-100 (Quanta Biosciences)進行。針對U251及ARPE19細胞在douplex設置中使用以下TaqMan引子分析：HTRA1，Hs01016151_m1 (FAM-MGB)及管家基因，GAPDH，Hs4310884E (VIC-MGB)。所有引子組皆購自Life Technologies。n = 1次生物重複。表中之相對HTRA1 mRNA表現水準展示為對照(PBS處理之細胞)之%。亦針對U251測試額外引子組(HTRA1，Hs00170197_m1 [FAM-MGB]對比TBP Hs4326322E [VIC-MGB])，且使用彼等引子觀測到相同趨勢(資料未示出)。參看圖2。
實例 8 ，在 人類初級 RPE 細胞中測試活體外功效及效能 .
人類初級視網膜色素上皮(hpRPE)細胞購自Sciencell (目錄號6540)。針對分析，在培養基(EpiCM，Sciencell目錄號4101)中在層黏連蛋白(層黏連蛋白521，BioLamina目錄號LN521-03)塗佈之96多孔盤中接種5000個hpRPE細胞/孔。其藉由此培養基擴增一週，且使用以下培養基分化2週：補充有N1補充劑(Sigma目錄號N-6530)、麩醯胺酸-青黴素-鏈黴素(Sigma目錄號G-1146)、非必需胺基酸(NEAA，Sigma目錄號M-7145)、牛磺酸(Sigma目錄號T-0625)、氫皮質酮(Sigma目錄號H-03966)、三碘-甲狀腺胺酸(Sigma目錄號T-5516)及牛血清白蛋白(BSA，Sigma目錄號A-9647)之MEM α培養基(Sigma目錄號M-4526)。細胞於37℃下具有5% CO
2
之含濕氣培育箱中培養。 在實驗當天，細胞用新鮮分化培養基培育1小時，隨後添加寡核苷酸。此等寡核苷酸溶解於PBS中且在第0天及第4天塗覆在細胞上。在第7天，細胞用50 µl具有β-巰基-乙醇之RLT緩衝液(Qiagen目錄號79216)收集。RNA之提取根據Qiagen RNeasy微型套組(目錄號74104；批號151048073)之使用者手冊進行，該微型套組包括脫氧核糖核酸酶I處理(目錄號79254；批號151042674)。RNA品質控制藉由Agilent生物分析儀奈米套組(Agilent；目錄號5067-1511；批號1446)進行。總RNA逆轉錄成cDNA (cDNA合成)使用基於無規六聚體寡核苷酸之高容量cDNA逆轉錄套組，根據製造商說明(Thermo Fisher Scientific，目錄號4368814；批號00314158)進行。cDNA樣品之量測以一式三份在7900HT即時PCR儀器(Thermo Fisher Scientific)上在384孔盤形式中進行。針對qPCR使用以下TaqMan引子分析：HTRA1，Hs01016151_m1及Hs00170197_m1，管家基因，GAPDH，Hs99999905_m1及PPIA，Hs99999904_m1，來自Life Technologies。n = 3次生物重複。相對HTRA1 mRNA表現水準在表中展示為對照(PBS)之%。參見圖3。
實例 9 . 大 鼠活體內功效研究 ， 7 天處理 ， 玻璃體內 ( IVT ) 注射 ， 30 µ g / 眼 . 動物
對色素雄性褐色挪威大鼠(Brown Norway rat)執行實驗。在各組研究中包括5個動物，總共15個。
化合物及給藥程序
為起始實驗，用異氟烷麻醉動物，眼睛經消毒及擴張，隨後玻璃體內注射每眼30 µg (於3 µl中)。
安樂死
在活體階段結束時(第7天)所有大鼠藉由CO
2
安樂死，隨後收集眼睛用於解剖。獲取視網膜、鞏膜及玻璃體流體用於進一步分析。
HTRA1 RNA 表現之量化
解剖視網膜樣品。大鼠視網膜急速冷凍組織保持冷凍且在測試設施中溶解於RLT溶解緩衝液(Qiagen RNeasy微型套組)中，且根據Qiagen RNeasy微型套組(目錄號74104；批號151039852)之使用者手冊繼續RNA提取，該微型套組包括脫氧核糖核酸酶I處理(目錄號79254；批號151048613)。RNA品質控制藉由Agilent生物分析儀奈米套組(Agilent；目錄號5067-1511；批號1446)進行。總RNA逆轉錄成cDNA (cDNA合成)使用基於無規六聚體寡核苷酸之高容量cDNA逆轉錄套組，根據製造商說明(Thermo Fisher Scientific，目錄號4368814，批號00314158)進行。cDNA樣品之量測以一式三份在7900HT 即時PCR儀器(Thermo Fisher Scientific)上在384孔盤形式中進行。針對qPCR使用以下TaqMan引子分析：Htra1，Rn00581870_m1及管家基因，Gapdh，Rn01775763_g1及Tbp，Rn01455646_m1，來自Life Technologies。大鼠/組：5個，n = 10個眼。各眼視為單獨樣品。相對Htra1 mRNA表現水準展示為對照(PBS)之%。參看圖4。
實例 10 大 鼠活體內功效研究 ， 7 天處理 ， 玻璃體內 ( IVT ) 注射 ， 劑量反應 . 動物
所有實驗皆對色素褐色挪威大鼠執行。在各組研究中包括17個動物，總共34個。
化合物及給藥程序
動物藉由肌肉內注射甲苯噻嗪與氯胺酮之混合物麻醉。在研究第1天在麻醉動物兩個眼中均玻璃體內投與測試物件及陰性對照(PBS) (每次投與3 µL)。
安樂死
在活體階段結束時(第8天)藉由腹膜內注射過度劑量戊巴比妥(pentobarbital)安樂死。
寡核苷酸含量量測及 Htra1 RNA 表現之量化
在低劑量及中間劑量組中之所有動物中，以及來自來自高劑量及PBS組之5個第一動物的兩個眼球用於生物分析。緊接在安樂死之後，在冰上快速且謹慎地解剖出玻璃體(V)、視網膜(R)及脈絡膜(CH)，且儲存於-80℃下直至運送為止。視網膜樣品溶解於700 µL MagNa純96 LC RNA分離組織緩衝劑中，且藉由每2 ml管添加1個不鏽鋼珠粒，使用precellys evolution均質機均質化2 × 1.5 min，隨後在RT下培育30 min。樣品以13000 rpm離心5 min。保留一半用於生物分析，且針對另一半直接繼續RNA提取 對於生物分析，將樣品稀釋10-50倍用於藉由雜交ELISA方法之寡核苷酸含量量測。生物素標記之LNA擷取探針及地高辛(digoxigenin)-共軛LNA偵測探針(兩者均為35 nM於5×SSCT中，各者與待偵測之LNA寡核苷酸之一個末端互補)與經稀釋之勻漿或相關之標準物混合，在RT下培育30分鐘，且隨後添加至抗生蛋白鏈菌素(streptavidine)塗佈之ELISA盤(Nunc目錄號436014)。 盤在RT下培育1小時，在2×SSCT (300 mM氯化鈉、30 mM檸檬酸鈉及0.05% v/v Tween-20，pH 7.0)中洗滌擷取之LNA雙螺旋使用與鹼性磷酸酶(Roche Applied Science目錄號11093274910)共軛之抗DIG抗體及鹼性磷酸酶基質系統(Blue Phos基質，KPL產品碼50-88-00)偵測。寡核苷酸錯合物之量在Biotek讀取器上量測為615 nm下之吸收度。 對於RNA提取，在MagNA純96系統中藉由程式：Tissue FF標準LV3.1根據製造商說明使用細胞RNA大容量套組(05467535001，Roche)，包括脫氧核糖核酸酶處理。RNA品質控制及濃度用Eon讀取器(Biotek)量測。RNA濃度在整個樣品中標準化，且後續cDNA合成及qPCR在一步反應中使用qScript XLT一步RT-qPCR ToughMix Low ROX，95134-100 (Quanta Biosciences)進行。在雙螺旋體反應中使用以下TaqMan引子分析：Htra1，Rn00581870_m1及Rn00668987_m1及管家基因，HPRT，Rn01527840_m1及Tbp, Rn01455646_m1，來自Life Technologies。qPCR分析在ViiA7機器(Life Technologies)上執行。大鼠/組：5個，n = 10個眼。各眼視為單獨樣品。相對Htra1 mRNA表現水準展示為對照(PBS)之%。
組織學
移除高劑量之2個其餘動物及PBS動物之兩個眼球，且固定於10%中性緩衝福馬林中24小時，修整且嵌入於石蠟中。 針對ISH分析，福馬林固定、嵌入石蠟之大鼠視網膜組織4 μm厚截面使用完全自動化Ventana Dicovery ULTRA染色模組(程序：mRNA Discovery Ultra Red 4.0 - v0.00.0152)使用RNAscope 2.5 VS 探針-Rn-HTRA1 (目錄號440959，Advanced Cell Diagnostic)處理。所用色原體係堅牢紅(Fastred)，蘇木精II對比染色。
實施例 11
PoC研究，藍光誘發白化病大鼠中之視網膜退化。
動物
所有實驗皆對白化病史泊格多利大鼠(Sprague-Dawley rats)執行。在各組研究中包括16個動物，總共42個。
化合物及給藥程序
動物藉由肌肉內注射甲苯噻嗪與氯胺酮之混合物麻醉。在研究-3天在麻醉動物兩個眼中均玻璃體內投與測試物件及陰性對照(PBS) (每次投與3 µL)。 陽性對照物件(PBN)在第0天以2.5 mL/kg之劑量體積使用安裝於1 mL塑膠注射器上之25-規格針頭避光腹膜內注射4次(起始曝光之前0.5 h，起始曝光之後2 h及4 h，及恰好在曝光結束時)。
曝光
使大鼠在黑暗中適應36小時，且隨後在透明塑膠籠中曝露於連續藍色螢光(400-540 nm)6小時。在曝光之後，將大鼠置放於黑暗房間中24小時，隨後返回至標準環狀光條件。
視網膜電流圖 ( ERG )
在黑暗適應隔夜之後在基線及在第14天在兩個眼上記錄視網膜電流圖(ERG)。針對記錄之各ERG量測A波及b波振幅。
安樂死
在活體階段結束時(第14天)，麻醉動物且藉由腹膜內注射過度劑量戊巴比妥安樂死。
外核層 ( Outer Nuclear layer ； ONL ) 厚度量測
自各組之10個主要動物去除兩個眼球，固定於Bouin Hollande溶液中且嵌入於石蠟中。沿豎直經線切割薄截面(5至7 µm厚)且藉由三色染色法-梅森(Trichrome-Masson)染色。在視網膜各部分(優及劣)中自視神經至周圍視網膜在七個點量測ONL厚度(每250 µm)。在各點量測外核層之厚度且計算曲線下面積(area under the curve；AUC)。
寡核苷酸含量量測及 Htra1 RNA 表現之量化
來自測試對象及PBS組之4隻平行試驗動物(satellite animal)之兩個眼球用於生物分析。緊接在安樂死之後，在冰上快速且謹慎地解剖出玻璃體(V)、視網膜(R)及脈絡膜(CH)，且儲存於-80℃下直至運送為止。視網膜樣品溶解於700 µL MagNa純96 LC RNA分離組織緩衝劑中，且藉由每2 ml管添加1個不鏽鋼珠粒，使用precellys evolution均質機均質化2 × 1.5 min，隨後在RT下培育30 min。樣品以13000 rpm離心5 min。保留一半用於生物分析，且針對另一半直接繼續RNA提取。 對於生物分析，將樣品稀釋10-50倍用於藉由雜交ELISA方法之寡核苷酸含量量測。生物素標記之LNA擷取探針及地高辛(digoxigenin)-共軛LNA偵測探針(兩者均為35 nM於5×SSCT中，各者與待偵測之LNA寡核苷酸之一個末端互補)與經稀釋之勻漿或相關之標準物混合，在RT下培育30分鐘，且隨後添加至抗生蛋白鏈菌素塗佈之ELISA盤(Nunc目錄號436014)。 盤在RT下培育1小時，在2×SSCT (300 mM氯化鈉、30 mM檸檬酸鈉及0.05% v/v Tween-20，pH 7.0)中洗滌擷取之LNA雙螺旋使用與鹼性磷酸酶(Roche Applied Science目錄號11093274910)共軛之抗DIG抗體及鹼性磷酸酶基質系統(Blue Phos基質，KPL產品碼50-88-00)偵測。寡核苷酸錯合物之量在Biotek讀取器上量測為615 nm下之吸收度。 對於RNA提取，在MagNA純96系統中藉由程式：Tissue FF標準LV3.1根據製造商說明使用細胞RNA大容量套組(05467535001，Roche)，包括脫氧核糖核酸酶處理。RNA品質控制及濃度用Eon讀取器(Biotek)量測。RNA濃度在整個樣品中標準化，且後續cDNA合成及qPCR在一步反應中使用qScript XLT一步RT-qPCR ToughMix Low ROX，95134-100 (Quanta Biosciences)進行。在雙螺旋體反應中使用以下TaqMan引子分析：Htra1，Rn00581870_m1及Rn00668987_m1及管家基因，HPRT，Rn01527840_m1及Tbp, Rn01455646_m1，來自Life Technologies。qPCR分析在ViiA7機器(Life Technologies)上執行。大鼠/組：5個，n = 10個眼。各眼視為單獨樣品。相對Htra1 mRNA表現水準展示為對照(PBS)之%。
組織學
移除來自測試對象及PBS組之其餘2隻平行試驗動物(satellite animal)之兩個眼球，且固定於10%中性緩衝福馬林中24小時，修整且嵌入於石蠟中。ISH RNAscope如實例10中所描述進行。
實例 12 ，大 鼠活體內功效動力研究 ， 3 、 7 及 14 天處理 ， 玻璃體內 ( IVT ) 注射 ， 單次劑量 .
針對2種所選擇之在位置33042-33064 (SEQ ID NO 147)之間靶向人類HTRA1前體mRNA中之「熱點」的HTRA1 LNA寡核苷酸，在視網膜中觀測mRNA水準下之阻斷基因表現(Knockdown；KD)。此在qPCR及ISH讀取兩者之情況下觀測(參看圖7A及/B及下表)。
阻斷基因表現之變化相對較大，參看表中所列之標準差。變化似乎在投與水準下，其可在針對寡核苷酸含量對比殘餘HTRA1 mRNA水準繪製劑量反應曲線時看出(參看圖7C)。
動物
所有實驗皆對白化病史泊格多利大鼠執行。
化合物及給藥程序
動物在異氟烷中麻醉。在研究第1天在麻醉動物兩個眼中均玻璃體內投與測試物件及陰性對照(PBS) (每次投與3 µL)。
安樂死
在活體階段結束時(研究第4、8或15天)，將大鼠麻醉且藉由斷頭術處死。
寡核苷酸含量量測及 Htra1 RNA 表現之量化
寡核苷酸含量量測及Htra1 mRNA表現之量化如實例10中所描述進行。 相對殘餘Htra1 mRNA表現水準展示為對照(PBS)之%。
組織學
組織學如實例10中所描述進行。
實例 13. 食蟹獼猴 ( 非人類靈長類 ， NHP ) 活體內藥代動力學及藥物效應動力學 ( PK / PD ) 研究 ， 21 天處理 ， 玻璃體內 ( IVT ) 注射 ， 單次劑量 .
針對1種所選擇之在位置33042-33064之間靶向人類HTRA1前體mRNA中之「熱點」的HTRA1 LNA寡核苷酸145.3，在視網膜中在mRNA下及在視網膜及玻璃體中在蛋白質水準下觀測阻斷基因表現(參看圖8)。
動物
所有實驗皆對食蟹獼猴(
Macaca fascicularis
)執行。
化合物及給藥程序
丁基原啡因鎮痛在測試化合物注射之前及兩天之後投與。動物藉由肌肉內注射氯胺酮及甲苯噻嗪麻醉。在研究第1天在局部施用四卡因(tetracaine)麻醉劑之後在麻醉動物兩個眼中均玻璃體內投與測試物件及陰性對照(PBS) (每次投與50 µL)。
安樂死
在活體階段結束時(第22天)所有猴藉由腹膜內注射過度劑量戊巴比妥安樂死。
寡核苷酸含量量測及藉由 qPCR 之 Htra1 RNA 表現之量化
緊接在安樂死之後，在冰上快速且謹慎地解剖出眼組織且儲存於-80℃下直至運送為止。視網膜樣品溶解於700 µL MagNa純96 LC RNA分離組織緩衝劑中，且藉由每2 ml管添加1個不鏽鋼珠粒，使用precellys evolution均質機均質化2 × 1.5 min，隨後在RT下培育30 min。樣品以13000 rpm離心5 min。保留一半用於生物分析，且針對另一半直接繼續RNA提取。 對於生物分析，將樣品稀釋10-50倍用於藉由雜交ELISA方法之寡核苷酸含量量測。生物素標記之LNA擷取探針及地高辛(digoxigenin)-共軛LNA偵測探針(兩者均為35 nM於5×SSCT中，各者與待偵測之LNA寡核苷酸之一個末端互補)與經稀釋之勻漿或相關之標準物混合，在RT下培育30分鐘，且隨後添加至抗生蛋白鏈菌素塗佈之ELISA盤(Nunc目錄號436014)。 盤在RT下培育1小時，在2×SSCT (300 mM氯化鈉、30 mM檸檬酸鈉及0.05% v/v Tween-20，pH 7.0)中洗滌擷取之LNA雙螺旋使用與鹼性磷酸酶(Roche Applied Science目錄號11093274910)共軛之抗DIG抗體及鹼性磷酸酶基質系統(Blue Phos基質，KPL產品碼50-88-00)偵測。寡核苷酸錯合物之量在Biotek讀取器上量測為615 nm下之吸收度。 對於RNA提取，在MagNA純96系統中藉由程式：Tissue FF標準LV3.1根據製造商說明使用細胞RNA大容量套組(05467535001，Roche)，包括脫氧核糖核酸酶處理。RNA品質控制及濃度用Eon讀取器(Biotek)量測。RNA濃度在整個樣品中標準化，且後續cDNA合成及qPCR在一步反應中使用qScript XLT一步RT-qPCR ToughMix Low ROX，95134-100 (Quanta Biosciences)進行。在單股(singplex)反應中使用以下TaqMan引子分析：Htra1，Mf01016150_，Mf01016152_m1及Rh02799527_m1及管家基因，ARFGAP2，Mf01058488_g1及Rh01058485_m1，及ARL1，Mf02795431_m1，來自Life Technologies。qPCR分析在ViiA7機器(Life Technologies)上執行。眼/組：n = 3個眼。各眼視為單獨樣品。相對Htra1 mRNA表現水準展示為對照(PBS)之%。
組織學
移除眼球且固定於10%中性緩衝福馬林中24小時，修整且嵌入於石蠟中。 針對ISH分析，福馬林固定、嵌入石蠟之視網膜組織4 μm厚截面使用完全自動化Ventana Dicovery ULTRA染色模組(程序：mRNA Discovery Ultra Red 4.0 - v0.00.0152)使用RNAscope 2.5 VS 探針-Mmu-HTRA1，REF 486979，Advanced Cell Diagnostics, Inc.處理。所用色原體係堅牢紅，蘇木精II對比染色。
使用盤基免疫沈澱質譜 ( IP - MS ) 方法之 HTRA1 蛋白質量化 樣品製備 ， 視網膜
視網膜在具有蛋白酶抑制劑(完全無EDTA，Roche)之4個體積(w/v)之RIPA緩衝液(50 mM Tris-HCl，pH 7.4，150 mM NaCl，0.25%去氧膽酸，1% NP-40，1mM EDTA，Millipore)中使用Precellys 24 (5500，15 s，2次循環)均質化。將勻漿離心(13,000 rpm，3 min)且測定上清液之蛋白質含量(Pierce BCA蛋白質分析)。
樣品製備 ， 玻璃體
玻璃體液(300 μl)用具有蛋白酶抑制劑(完全無EDTA，Roche)之5 × RIPA緩衝液(最終濃度：50 mM Tris-HCl，pH 7.4，150 mM NaCl，0.25%去氧膽酸，1% NP-40，1mM EDTA)稀釋，且使用Precellys 24 (5500，15 s，2次循環)均質化。將勻漿離心(13,000 rpm，3 min)且測定上清液之蛋白質含量(Pierce BCA蛋白質分析)。
盤基 HTRA1 免疫沈澱及胰蛋白酶分解
96孔盤(Nunc MaxiSorp)塗佈有抗HTRA1小鼠單株抗體(R&D MAB2916，於50 μl PBS中500 ng/孔)且在4℃下培育隔夜。盤用PBS (200 μl)洗滌兩次，且在20℃下藉由於PBS中之3% (w/v)BSA阻斷30 min，隨後兩次PBS洗滌。使樣品(於50 μl PBS中75 μg視網膜、100 μg玻璃體)隨機化且添加至盤，隨後在振盪器(150 rpm)上在4℃下隔夜培育。盤隨後用PBS洗滌兩次且用水洗滌一次。隨後將於50 mM TEAB (30 μl)中之10 mM DTT添加至各孔，隨後在20℃下培育1 h，以減少半胱胺酸硫氫基。隨後將於50 mM TEAB (5 μl)中之150 mM碘乙醯胺添加至各孔，隨後在20℃下在暗處培育30 min，以便阻斷半胱胺酸硫氫基。將10 μl 分解溶液添加至各孔(最終濃度：1.24 ng/μl胰蛋白酶，20 fmol/μl BSA肽，26 fmol/μl同位素標記之HTRA1肽，1 fmol/μl iRT肽，Biognosys)，隨後在20℃下培育隔夜。
藉由定向 質譜 ( 選擇反應監測， SRM ) 之 HTRA1 肽量化
質譜分析在連接至TSQ Quantiva三重四極質譜儀(Thermo Scientific)之Ultimate RSLCnano LC上進行。樣品(20 μL)直接自96孔盤注射用於IP，且在加樣緩衝液(0.5% v/v甲酸，2% v/v ACN)中以5 μL/min持續6 min裝載於Acclaim Pepmap 100阱管柱(100 μm × 2 cm，C18，5 μm，100 Å，Thermo Scientific)上。肽隨後在PepMap Easy-SPRAY分析型管柱(75 μm × 15 cm，3 μm，100 Å，Thermo Scientific)上分解，其中積體電噴射發射器使用以下梯度以250 nL/min之速率加熱至40℃：6 min，98%緩衝液A (2% ACN，0.1%甲酸)，2%緩衝液B (ACN + 0.1%甲酸)；36 min，30%緩衝液B；41 min，60%緩衝液B；43 min，80%緩衝液B；49 min，80%緩衝液B；50 min，2%緩衝液B。TSQ Quantiva在SRM模式下用以下參數操作：循環時間，1.5 s；噴射電壓，1800 V；碰撞氣體壓力，2毫托(mTorr)；Q1及Q3解析度，0.7 FWHM；離子轉移管溫度300℃。針對HTRA1肽「LHRPPVIVLQR」及同位素標記(L-[U-13C, U-15N]R)合成型式(其使用內標)獲取SRM躍遷。使用Skyline 3.6版進行資料分析。
鎖核酸核苷 ( LNA )
LNA核苷係在核苷酸之核糖環之C2'與C4'之間包含連接基團(稱為雙基團或橋)的經修飾核苷。此等核苷在文獻中亦稱為橋接核酸或雙環核酸(BNA)。 在一些實施例中，本發明之寡聚物之經修飾核苷或LNA核苷具有式I或式II之通式結構：
或
β-D α-L 式I 式II 其中W選自-O-、-S-、-N(Ra
)-、-C(Ra
Rb
)-，諸如，在一些實施例中-O-； B指代核鹼基部分； Z指代與相鄰核苷之核苷間鍵，或5'-端基； Z*指代與相鄰核苷之核苷間鍵，或3'-端基； X指代選自由以下組成之清單的基團：-C(Ra
Rb
)-、-C(Ra
)=C(Rb
)-、-C(Ra
)=N-、-O-、-Si(Ra
)2
-、-S-、-SO2
-、-N(Ra
)-及＞C=Z 在一些實施例中，X選自由以下組成之群：-O-、-S-、NH-、NRa
Rb
、-CH2
-、CRa
Rb
、-C(=CH2
)-及-C(=CRa
Rb
)- 在一些實施例中，X係-O- Y指代選自由以下組成之群的基團：-C(Ra
Rb
)-、-C(Ra
)=C(Rb
)-、-C(Ra
)=N-、-O-、-Si(Ra
)2
-、-S-、-SO2
-、-N(Ra
)-及＞C=Z 在一些實施例中，Y選自由以下組成之群：-CH2
-、-C(Ra
Rb
)-、-CH2
CH2
-、-C(Ra
Rb
)-C(Ra
Rb
)-、-CH2
CH2
CH2
-、-C(Ra
Rb
)C(Ra
Rb
)C(Ra
Rb
)-、-C(Ra
)=C(Rb
)-及-C(Ra
)=N- 在一些實施例中，Y選自由以下組成之群：-CH2
-、-CHRa
-、-CHCH3
-、CRa
Rb
- 或-X-Y-一起指代二價連接基團(亦稱作基團)，一起指代由選自由以下組成之群的1、2或3個基團/原子組成的二價連接基團：-C(Ra
Rb
)-、-C(Ra
)=C(Rb
)-、-C(Ra
)=N-、-O-、-Si(Ra
)2
-、-S-、-SO2
-、-N(Ra
)-及＞C=Z， 在一些實施例中，-X-Y-指代選自由以下組成之群的雙基團：-X-CH2
-、-X-CRa
Rb
-、-X-CHRa -
、-X-C(HCH3
)-
、-O-Y-、-O-CH2
-、-S-CH2
-、-NH-CH2
-、-O-CHCH3
-、-CH2
-O-CH2
、-O-CH(CH3
CH3
)-、-O-CH2
-CH2
-、OCH2
-CH2
-CH2
-、-O-CH2
OCH2
-、-O-NCH2
-、-C(=CH2
)-CH2
-、-NRa
-CH2
-、N-O-CH2
、-S-CRa
Rb
-及-S-CHRa
-。 在一些實施例中-X-Y-指代-O-CH2
-或-O-CH(CH3
)-。 其中Z選自-O-、-S-及-N(Ra
)-， 且Ra
及(當存在時)Rb
各自獨立地選自氫、視情況經取代之C1 - 6
烷基、視情況經取代之C2 - 6
烯基、視情況經取代之C2 - 6
炔基、羥基、視情況經取代之C1 - 6
烷氧基、C2 - 6
烷氧基烷基、C2 - 6
烯基氧基、羧基、C1 - 6
烷氧基羰基、C1 - 6
烷基羰基、甲醯基、芳基、芳氧基-羰基、芳氧基、芳基羰基、雜芳基、雜芳氧基-羰基、雜芳氧基、雜芳基羰基、胺基、單及二(C1 - 6
烷基)胺基、胺甲醯基、單及二(C1 - 6
烷基)-胺基-羰基、胺基-C1 - 6
烷基-胺基羰基、單及二(C1 - 6
烷基)胺基-C1 - 6
烷基-胺基羰基、C1 - 6
烷基-羰胺基、胺甲醯胺基、C1 - 6
烷醯基氧基、磺醯基(sulphono)、C1 - 6
烷基磺醯基氧基、硝基、疊氮基、硫基、C1 - 6
烷硫基、鹵素，其中芳基及雜芳基可視情況經取代，且其中兩個成對取代基Ra
及Rb
一起可指代視情況經取代之亞甲基(=CH2
)，其中對於所有對掌性中心，可在R
或S
定向中發現不對稱基團。 其中R1
、R2
、R3
、R5
及R5 *
獨立地選自由以下組成之群：氫、視情況經取代之C1 - 6
烷基、視情況經取代之C2 - 6
烯基、視情況經取代之C2 - 6
炔基、羥基、C1 - 6
烷氧基、C2 - 6
烷氧基烷基、C2 - 6
烯基氧基、羧基、C1 - 6
烷氧基羰基、C1 - 6
烷基羰基、甲醯基、芳基、芳氧基-羰基、芳氧基、芳基羰基、雜芳基、雜芳氧基-羰基、雜芳氧基、雜芳基羰基、胺基、單及二(C1 - 6
烷基)胺基、胺甲醯基、單及二(C1 - 6
烷基)-胺基-羰基、胺基-C1 - 6
烷基-胺基羰基、單及二(C1 - 6
烷基)胺基-C1 - 6
烷基-胺基羰基、C1 - 6
烷基-羰胺基、胺甲醯胺基、C1 - 6
烷醯基氧基、磺醯基、C1 - 6
烷基磺醯基氧基、硝基、疊氮基、硫基、C1 - 6
烷硫基、鹵素，其中芳基及雜芳基可視情況經取代，且其中兩個成對取代基一起可指代酮基、硫酮基、亞胺基或視情況經取代之亞甲基。 在一些實施例中R1
、R2
、R3
、R5
及R5 *
獨立地選自C1 - 6
烷基，諸如甲基，及氫。 在一些實施例中R1
、R2
、R3
、R5
及R5 *
皆為氫。 在一些實施例中R1
、R2
、R3
皆為氫，且R5
及R5 *
中之一者亦為氫且R5
及R5 *
中之另一者不為氫，諸如C1 - 6
烷基(諸如甲基)。 在一些實施例中，Ra
係氫或甲基。在一些實施例中，(當存在時)Rb
係氫或甲基。 在一些實施例中，Ra
及Rb
中之一者或兩者係氫 在一些實施例中，Ra
及Rb
中之一者係氫且另一者不為氫 在一些實施例中，Ra
及Rb
中之一者係甲基且另一者係氫 在一些實施例中，Ra
及Rb
兩者均為甲基。 在一些實施例中，雙基團-X-Y-係-O-CH2
-，W係O，且R1
、R2
、R3
、R5
及R5 *
中所有皆為氫。此類LNA核苷揭示於WO99/014226、WO00/66604、WO98/039352及WO2004/046160中，其皆以引用之方式併入本文中，且包括該等LNA核苷通常稱為β-D-氧基LNA及α-L-氧基LNA核苷。 在一些實施例中，雙基團-X-Y-係-S-CH2
-，W係O，且R1
、R2
、R3
、R5
及R5 *
中所有皆為氫。此類硫基LNA核苷揭示於WO99/014226及WO2004/046160中，其以引用之方式併入本文中。 在一些實施例中，雙基團-X-Y-係-NH-CH2
-，W係O，且R1
、R2
、R3
、R5
及R5 *
中所有皆為氫。此類胺基LNA核苷揭示於WO99/014226及WO2004/046160中，其以引用之方式併入本文中。 在一些實施例中，雙基團-X-Y-係-O-CH2
-CH2
-或-O-CH2
-CH2
-CH2
-，W係O，且R1
、R2
、R3
、R5
及R5 *
中所有皆為氫。此類LNA核苷揭示於WO00/047599及Morita 等人, Bioorganic & Med.Chem. Lett. 12 73-76中，其以引用之方式併入本文中，且包括此類LNA核苷通常稱為2'-O-4'C-乙烯橋接核酸(ENA)。 在一些實施例中，雙基團-X-Y-係-O-CH2
-，W係O，且R1
、R2
、R3
中所有，及R5
及R5 *
中之一者係氫，且R5
及R5 *
中之另一者不為氫，諸如C1 - 6
烷基(諸如甲基)。此類5'經取代LNA核苷揭示於WO2007/134181中，其以引用之方式併入本文中。 在一些實施例中，雙基團-X-Y-係-O-CRa
Rb
-，其中Ra
及Rb
中之一者或兩者不為氫，諸如甲基，W係O，且R1
、R2
、R3
中所有，及R5
及R5 *
中之一者係氫，且R5
及R5 *
中之另一者不為氫，諸如C1 - 6
烷基(諸如甲基)。此類雙修飾LNA核苷揭示於WO2010/077578中，其以引用之方式併入本文中。 在一些實施例中，雙基團-X-Y-指代二價連接基團-O-CH(CH2
OCH3
)-(2'O-甲氧基乙基雙環核酸-Seth等人, 2010, J. Org. Chem. 第75(5)卷 第1569-81頁)。在一些實施例中，雙基團-X-Y-指代二價連接基團-O-CH(CH2
CH3
)-(2'O-乙基雙環核酸-Seth等人, 2010, J. Org. Chem. 第75(5)卷 第1569-81頁)。在一些實施例中，雙基團-X-Y-係-O-CHRa
-，W係O，且R1
、R2
、R3
、R5
及R5 *
中所有皆為氫。此類6'經取代LNA核苷揭示於WO10036698及WO07090071中，其均以引用之方式併入本文中。 在一些實施例中，雙基團-X-Y-係-O-CH(CH2
OCH3
)-，W係O，且R1
、R2
、R3
、R5
及R5 *
中所有皆為氫。此類LNA核苷在此項技術中亦稱為環狀MOE (cMOE)且揭示於WO07090071中。 在一些實施例中，雙基團-X-Y-指代二價連接基團-O-CH(CH3
)-。-呈R或S組態。在一些實施例中，雙基團-X-Y-一起指代二價連接基團-O-CH2
-O-CH2
- (Seth 等人, 2010, J. Org. Chem)。在一些實施例中，雙基團-X-Y-係-O-CH(CH3
)-，W係O，且R1
、R2
、R3
、R5
及R5 *
中所有皆為氫。此類6'甲基LNA核苷在此項技術中亦稱為cET核苷，且可為(S)cET或(R)cET立體異構體，如揭示於WO07090071 (β-D)及WO2010/036698 (α-L)中，其均以引用之方式併入本文中)。 在一些實施例中，雙基團-X-Y-係-O-CRa
Rb
-，其中在Ra
或Rb
中均不為氫，W係O，且R1
、R2
、R3
、R5
及R5 *
中所有皆為氫。在一些實施例中，Ra
及Rb
均為甲基。此類6'經二取代之LNA核苷揭示於WO 2009006478中，其以引用之方式併入本文中。 在一些實施例中，雙基團-X-Y-係-S-CHRa
-，W係O，且R1
、R2
、R3
、R5
及R5 *
中所有皆為氫。此類6'經取代硫基LNA核苷揭示於WO11156202中，其以引用之方式併入本文中。在一些6'經取代硫基LNA實施例中Ra
係甲基。 在一些實施例中，雙基團-X-Y-係-C(=CH2)-C(Ra
Rb
)-，諸如-C(=CH2
)-CH2
-，或-C(=CH2
)-CH(CH3
)-，W係O，且R1
、R2
、R3
、R5
及R5 *
中所有皆為氫。此類乙烯基碳LNA核苷揭示於WO08154401及WO09067647中，其均以引用之方式併入本文中。 在一些實施例中，雙基團-X-Y-係-N(-ORa
)-，W係O，且R1
、R2
、R3
、R5
及R5 *
中所有皆為氫。在一些實施例中Ra
係C1 - 6
烷基，諸如甲基。此類LNA核苷亦稱為N經取代LNA，且揭示於WO2008/150729中，其以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，雙基團-X-Y-一起指代二價連接基團-O-NRa
-CH3
- (Seth 等人, 2010, J. Org. Chem)。在一些實施例中，雙基團-X-Y-係-N(Ra
)-，W係O，且R1
、R2
、R3
、R5
及R5 *
中所有皆為氫。在一些實施例中Ra
係C1 - 6
烷基，諸如甲基。 在一些實施例中，R5
及R5 *
中之一者或兩者係氫，且在經取代時R5
及R5 *
中之另一者係C1 - 6
烷基，諸如甲基。在此類實施例中，R1
、R2
、R3
可皆為氫，且雙基團-X-Y-可選自-O-CH2-或-O-C(HCRa
)-，諸如-O-C(HCH3)-。 在一些實施例中，雙基團係-CRa
Rb
-O-CRa
Rb
-，諸如CH2
-O-CH2
-，W係O且R1
、R2
、R3
、R5
及R5 *
中所有皆為氫。在一些實施例中Ra
係C1 - 6
烷基，諸如甲基。此類LNA核苷亦稱為構形受限核苷酸(conformationally restricted nucleotide；CRN)且揭示於WO2013036868中，其以引用之方式併入本文中。 在一些實施例中，雙基團係-O-CRa
Rb
-O-CRa
Rb
-，諸如O-CH2
-O-CH2
-，W係O且R1
、R2
、R3
、R5
及R5 *
中所有皆為氫。在一些實施例中Ra
係C1 - 6
烷基，諸如甲基。此類LNA核苷亦稱為COC核苷酸且揭示於Mitsuoka 等人, Nucleic Acids Research 2009 37(4), 1225-1238中，其以引用之方式併入本文中。 將認識到，除非指定，否則LNA核苷可呈β-D或α-L立體異構形式。 LNA核苷之實例展現於方案1中。 方案1
如實例中所說明，在本發明之一些實施例中，寡核苷酸中之LNA核苷係β-D-氧基-LNA核苷。 核酸酶介導之降解
核酸酶介導之降解係指當與互補核苷酸序列形成雙螺旋體時，能夠介導互補核苷酸序列之降解的寡核苷酸。 在一些實施例中，寡核苷酸可經由核酸酶介導之標靶核酸之降解起作用，其中本發明之寡核苷酸能夠募集核酸酶，特定言之及核酸內切酶，較佳地內切核糖核酸酶(核糖核酸酶)，諸如核糖核酸酶H。經由核酸酶介導之機制操作之寡核苷酸設計之實例係通常包含具有至少5或6個DNA核苷且藉由親和力增強核苷(例如間隔體、頭體(headmer)、尾體(tailmer))側接在一側或兩側的區的寡核苷酸。 核糖核酸酶 H 活性及募集
反股寡核苷酸之核糖核酸酶H活性係指當與互補RNA分子成雙螺旋體時，反股寡核苷酸募集核糖核酸酶H之能力。WO01/23613提供用於測定核糖核酸酶H活性之活體外方法，其可用於測定募集核糖核酸酶H之能力。若在提供互補標靶核酸序列時，募集之初始速率(如以pmol/l/min為單位量測)為在使用與所測試之經修飾寡核苷酸具有相同鹼基序列，但僅含有DNA單體(其中硫代磷酸酯鍵在寡核苷酸中之所有單體之間)之寡核苷酸，且使用由WO01/23613 (以引用之方式併入本文中)之實例91-95提供之方法進行測定時的初始速率的至少5%、諸如至少10%或大於20%，則通常認為寡核苷酸能夠募集核糖核酸酶H。間隔體
如本文所用之術語間隔體係指反股寡核苷酸，其包含核糖核酸酶H募集寡核苷酸之區(間隔)，該區藉由包含一或多個親和力增強經修飾核苷之區(側接(flank)或翼(wing))側接5'及3'。本文中描述多種間隔體設計。頭體及尾體係在側接中之一者缺失，亦即寡核苷酸之僅一個端部包含親和力增強經修飾核苷之情況下，能夠募集核糖核酸酶H的寡核苷酸。對於頭體，3'側接缺失(亦即5'側接包含親和力增強經修飾核苷)，且對於尾體，5'側接缺失(亦即3'側接包含親和力增強經修飾核苷)。 LNA 間隔體
術語LNA間隔體係間隔體寡核苷酸，在該間隔體寡核苷酸中親和力增強經修飾核苷中之至少一者係LNA核苷。 混合翼間隔體
術語混合翼間隔體係指LNA間隔體，在該LNA間隔體中側接區包含至少一個LNA核苷及至少一個非LNA經修飾核苷，諸如至少一個DNA核苷或至少一個2'經取代修飾核苷，諸如，例如2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA (MOE)、2'-胺基-DNA、2'-氟基-RNA及2'-F-ANA核苷。在一些實施例中，混合翼間隔體具有一個包含LNA核苷之側接(例如5'或3')，且另一個側接(對應地3'或5')包含2'經取代修飾核苷。 共軛物
如本文所用之術語共軛物係指共價鍵聯至非核苷酸部分(共軛部分或區C或第三區)之寡核苷酸。 如本文所用之術語共軛物係指共價鍵聯至非核苷酸部分(共軛部分或區C或第三區)之寡核苷酸。 在一些實施例中，非核苷酸部分選自由以下組成之群：蛋白質，諸如酶、抗體或抗體片段或肽；親脂部分，諸如脂質、磷脂、固醇；聚合物，諸如聚乙二醇或聚丙二醇；受體配位體；小分子；報導基因分子；及非核苷碳水化合物。 連接子
鍵或連接子係兩個原子之間的連接，該連接經由一或多個共價鍵將相關之一個化學基團或片段鍵聯至相關之另一個化學基團或片段。共軛部分可直接或藉由鍵聯部分(例如連接子或繫栓)連接至寡核苷酸。連接子用以共價連接第三區(例如共軛部分)至寡核苷酸(例如區A或C之末端)。 在本發明之一些實施例中，本發明之共軛物或寡核苷酸共軛物可視情況包含安置於寡核苷酸與共軛部分之間的連接子區。在一些實施例中，共軛物與寡核苷酸之間的連接子係生物可裂解的。 包含生理上不穩定鍵或由該鍵組成的生物可裂解連接子在哺乳動物身體內通常遭遇之條件或類似於哺乳動物身體內遭遇之條件下可裂解。生理上不穩定連接子經歷化學轉化(例如裂解)之條件包括化學條件，諸如pH、溫度、氧化或還原條件或試劑，及哺乳動物細胞中發現的鹽濃度或類似於哺乳動物細胞中遇到的鹽濃度。哺乳動物細胞內條件亦包括通常存在於哺乳動物細胞中(諸如來自蛋白水解酶或水解酶或核酸酶)之酶活性之現狀。在一個實施例中生物可裂解連接子對S1核酸酶裂解敏感。在一較佳實施例中，對核酸酶敏感的連接子包含1與10個之間核苷，諸如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷，更佳2與6個之間核苷且最佳2與4個之間鍵聯核苷，該等核苷包含至少兩個連續磷酸二酯鍵，諸如至少3或4或5個連續磷酸二酯鍵。較佳地核苷係DNA或RNA。含有生物可裂解連接子之磷酸二酯更詳細地描述於WO 2014/076195中(其以引用之方式併入本文中)，且在本文可指區D。 共軛物亦可經由生物不可裂解連接子鍵聯至寡核苷酸，或在一些實施例中共軛物可包含共價連接至生物可裂解連接子的不可裂解連接子。連接子未必係生物可裂解，但主要用以共價連接共軛部分至寡核苷酸或生物可裂解連接子。此類連接子可包含鏈結構或重複單元之寡聚物，重複單元係諸如乙二醇、胺基酸單元或胺基烷基。在一些實施例中連接子(區Y)係胺基烷基，諸如C2
-C36
胺基烷基，包括例如C6
至C12
胺基烷基。在一些實施例中連接子(區Y)係C6
胺基烷基。共軛物連接基團可通常經由使用胺基經修飾寡核苷酸、及共軛基團上之活化酯基連接至寡核苷酸。 治療
如本文所用之術語『治療』係指治療現有疾病(例如如本文所提及之疾病或病症)或預防疾病(亦即防治)兩者。因此將認識到，如本文中所提及之治療在一些實施例中可為預防性的。本發明之詳細描述 本發明之寡核苷酸
本發明係關於能夠抑制HTRA1表現之寡核苷酸。調節可藉由雜交至編碼HTRA1之標靶核酸或涉及調控HTRA1之標靶核酸來達成。標靶核酸可為哺乳動物HTRA 1序列，諸如選自由SEQ ID 1、2、3或4組成之群的序列。 本發明之寡核苷酸係靶向HTRA1、諸如哺乳動物HTRA1之反股寡核苷酸。 在一些實施例中本發明之反股寡核苷酸能夠經由抑制或下調標靶之表現而調節標靶表現。較佳地，此類調節產生與標靶之正常表現水準相比表現之至少20%抑制，諸如與標靶之正常表現水準相比至少30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%抑制。在一些實施例中，在活體外使用ARPE-19細胞，本發明之化合物可能夠抑制HTRA1 mRNA之表現水準至少60%或70%。在一些實施例中，在活體外使用ARPE-19細胞，本發明之化合物可能夠抑制HTRA1
mRNA之表現水準至少60%或70%。在一些實施例中，在活體外使用ARPE-19細胞，本發明之化合物可能夠抑制HTRA1蛋白質之表現水準至少50%。適合地，實例提供可用以量測HTRA1 RNA或蛋白質抑制(例如實例3)之分析。標靶調節藉由寡核苷酸之連續核苷酸序列與標靶核酸之間的雜交觸發。在一些實施例中，本發明之寡核苷酸在寡核苷酸與標靶核酸之間包含錯配。儘管存在錯配，但與標靶核酸之雜交仍可足以展示HTRA1表現之所需調節。由錯配產生之減少的結合親和力宜可藉由寡核苷酸中增加的核苷酸數目及/或增加的能夠提高與標靶的結合親和力的經修飾核苷(諸如2'經修飾核苷，包括寡核苷酸序列內存在之LNA)數目來補償。 本發明之一態樣係關於反股寡核苷酸，其包含具有10至30個核苷酸長度之連續核苷酸區，該區具有與HTRA1標靶序列之至少90%互補性，諸如與HTRA1標靶序列(例如選自由SEQ ID NO 1、2、3及4組成之群的核酸)完全互補。 在一些實施例中，寡核苷酸包含連續序列，該序列與標靶核酸之區至少90%互補，諸如至少91%、諸如至少92%、諸如至少93%、諸如至少94%、諸如至少95%、諸如至少96%、諸如至少97%、諸如至少98%或100%互補。 在一些實施例中，本發明之寡核苷酸或其連續核苷酸序列與標靶核酸之區完全互補(100%互補)，或在一些實施例中在寡核苷酸與標靶核酸之間可包含一或兩個錯配。 在一些實施例中，寡核苷酸或其至少12個核苷酸之連續核苷酸序列與SEQ ID NO 147之區至少90%互補，諸如完全(或100%)互補。 在一些實施例中，寡核苷酸或其至少12個核苷酸之連續核苷酸序列與選自由SEQ ID NO 148、149、150、151、152、153、154及155組成之群的序列的區至少90%互補，諸如完全(或100%)互補。 在一些實施例中，寡核苷酸或其至少14個核苷酸之連續核苷酸序列與SEQ ID 147，或選自由SEQ ID NO 148、149、150、151、152、153、154及155組成之群的序列完全(或100%)互補。 在一些實施例中，寡核苷酸或其至少16個核苷酸之連續核苷酸序列與SEQ ID 147，或選自由SEQ ID NO 148、149、150、151、152、153、154及155組成之群的序列完全(或100%)互補。 在一些實施例中，寡核苷酸或其連續核苷酸區與選自由SEQ ID NO 148、149、150、151、152、153、154及155組成之群的序列完全(或100%)互補。 在一些實施例中，寡核苷酸或其連續核苷酸區包含選自由SEQ ID NO 143、138、139、140、141、142、144及145組成之群的序列或由該序列組成： SEQ ID NO 143：TATTTACCTGGTTGTT SEQ ID NO 138：CAAATATTTACCTGGTTG SEQ ID NO 139：TTTACCTGGTTGTTGG SEQ ID NO 140：CCAAATATTTACCTGGTT SEQ ID NO 141：CCAAATATTTACCTGGTTGT SEQ ID NO 142：ATATTTACCTGGTTGTTG SEQ ID NO 144：ATATTTACCTGGTTGT SEQ ID NO 145：ATATTTACCTGGTTGTT 應理解寡核苷酸基元序列可經修飾以例如提高對核酸酶之耐性及/或與標靶核酸之結合親和力。修飾描述於定義及「寡核苷酸設計」部分中。 在一些實施例中，本發明之寡核苷酸或其連續核苷酸區與標靶核酸之區完全互補(100%互補)，或在一些實施例中在寡核苷酸與標靶核酸之間可包含一或兩個錯配。在一些實施例中，寡核苷酸或其至少12個核苷酸之連續核苷酸序列與標靶核酸序列至少90%互補，諸如完全(或100%)互補。 在一些實施例中，寡核苷酸或其至少12個核苷酸之連續核苷酸序列與選自由SEQ ID NO 5-107、或SEQ ID NO 108-137組成之群的序列具有100%一致性。 在一些實施例中，寡核苷酸或其至少14個核苷酸之連續核苷酸序列與選自由SEQ ID NO 5-107、或SEQ ID NO 108-137組成之群的序列具有100%一致性。 在一些實施例中，寡核苷酸或其至少16個核苷酸之連續核苷酸序列與選自由SEQ ID NO 5-107、或SEQ ID NO 108-137組成之群的序列具有100%一致性。 在一些實施例中，寡核苷酸或其連續核苷酸區包含選自SEQ ID NO 5-107或SEQ ID NO 108-137之序列或由該序列組成。 在一些實施例中，本發明之化合物選自由以下組成之群：
其中大寫字母表示β-D-氧基LNA核苷，所有LNA胞嘧啶均為5-甲基胞嘧啶(如藉由上標m
所指示)，小寫字母表示DNA核苷。所有核苷間鍵係硫代磷酸酯核苷間鍵(如藉由下標s
所指示)。寡核苷酸設計
寡核苷酸設計係指寡核苷酸序列中核苷糖修飾之樣式。本發明之寡核苷酸包含糖經修飾核苷且亦可包含DNA或RNA核苷。在一些實施例中，寡核苷酸包含糖經修飾核苷及DNA核苷。將經修飾核苷併入至本發明之寡核苷酸中可增強寡核苷酸對標靶核酸之親和力。在彼情況下，經修飾核苷可稱作親和力增強經修飾核苷酸。 在一實施例中，寡核苷酸包含至少1個經修飾核苷，諸如至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15或至少16個經修飾核苷。在一實施例中，寡核苷酸包含1至10個經修飾核苷，諸如2至9個經修飾核苷，諸如3至8個經修飾核苷，諸如4至7個經修飾核苷，諸如6或7個經修飾核苷。在一實施例中，本發明之寡核苷酸可包含修飾，該等修飾獨立地選自此等三種類型之修飾(經修飾糖、經修飾核鹼基及經修飾核苷間鍵)或其組合。較佳地寡核苷酸包含一或多個糖經修飾之核苷，諸如2'糖經修飾之核苷。較佳地本發明之寡核苷酸包含一或多個2'糖經修飾之核苷，其獨立地選自由以下組成之群：2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA、2'-胺基-DNA、2'-氟基-DNA、阿拉伯糖核酸(arabino nucleic acid；ANA)、2'-氟基-ANA及LNA核苷。甚至更佳地該一或多個經修飾核苷係LNA。 在一些實施例中，至少1個經修飾核苷係鎖核酸(LNA)，諸如至少2、諸如至少3、至少4、至少5、至少6、至少7或至少8個經修飾核苷係LNA。在又另一實施例中所有經修飾核苷係LNA。 在另一實施例中寡核苷酸包含至少一個經修飾核苷間鍵。在一較佳實施例中，連續核苷酸序列內之核苷間鍵係硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯核苷間鍵。在一些實施例中，寡核苷酸之連續序列中之所有核苷酸間鍵係硫代磷酸酯鍵。 在一些實施例中，本發明之寡核苷酸包含至少一個經修飾核苷，其係2'-MOE-RNA，諸如2、3、4、5、6、7、8、9或10個2'-MOE-RNA核苷單元。在一些實施例中，該等經修飾核苷中之至少一者係2'-氟基DNA，諸如2、3、4、5、6、7、8、9或10個2'-氟基-DNA核苷單元。 在一些實施例中，本發明之寡核苷酸包含至少一個LNA單元，諸如1、2、3、4、5、6、7或8個LNA單元，諸如2至6個LNA單元，諸如3至7個LNA單元，4至8個LNA單元或3、4、5、6或7個LNA單元。在一些實施例中，所有經修飾核苷係LNA核苷。在一些實施例中，所有LNA胞嘧啶單元係5-甲基-胞嘧啶。在一些實施例中，寡核苷酸或其連續核苷酸區在核苷酸序列之5'端具有至少1個LNA單元，且在3'端至少2個LNA單元。在一些實施例中，所有存在於本發明之寡核苷酸中之胞嘧啶核鹼基係5-甲基-胞嘧啶。 在一些實施例中，本發明之寡核苷酸包含至少一個LNA單元及至少一個2'經取代修飾核苷。 在本發明之一些實施例中，寡核苷酸包含2'糖經修飾核苷及DNA單元兩者。 在本發明之一實施例中本發明之寡核苷酸能夠募集核糖核酸酶H。 在一些實施例中，本發明之寡核苷酸或其連續核苷酸區係間隔體寡核苷酸。 間隔體設計
在一些實施例中，本發明之寡核苷酸或其連續核苷酸區具有間隔體設計或在本文中僅稱為「間隔體」之結構。在間隔體結構中，寡核苷酸包含至少三個相異結構區，5'-側接、間隔及3'-側接，F-G-F'，呈『5→3』定向。在此設計中，側接區F及F' (亦稱為翼區)包含至少一個糖經修飾核苷，該核苷鄰近區G，且在一些實施例中可包含2-7個糖經修飾核苷之連續延伸，或糖經修飾及DNA核苷之連續延伸(包含糖經修飾及DNA核苷兩者之混合翼)。因此，5'側接區及3'側接區之鄰近間隔區之核苷係糖經修飾核苷，諸如2'經修飾核苷。間隔區G包含在寡核苷酸與HTRA1標靶核酸成雙螺旋體時能夠募集核糖核酸酶H之核苷酸之連續延伸。在一些實施例中，區G包含5-16個DNA核苷之連續延伸。間隔體區F-G-F'與HTRA1標靶核酸互補，且可因此係寡核苷酸之連續核苷酸區。 側接區G之5'及3'端之區F及F'可包含一或多個親和力增強經修飾核苷。在一些實施例中，3'側接包含至少一個LNA核苷，較佳至少2個LNA核苷。在一些實施例中，5'側接包含至少一個LNA核苷。在一些實施例中，5'及3'側接區均包含LNA核苷。在一些實施例中，側接區中之所有核苷係LNA核苷。在其他實施例中，側接區可包含LNA核苷及其他核苷兩者(混合側接)，諸如DNA核苷及/或非LNA經修飾核苷，諸如2'經取代核苷。在此情形下間隔定義為具有至少5個核糖核酸酶H募集核苷(諸如5-16個DNA核苷)，藉由親和力增強經修飾核苷(諸如LNA，諸如β-D-氧基-LNA)側接於5'及3'端之連續序列。區 F
連接至區G之5'端之區F (5'側接或5'翼)包含、含有至少一個糖經修飾核苷或由其組成，諸如至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7個經修飾核苷。在一些實施例中，區F包含1至7個經修飾核苷或由該等核苷組成，諸如2至6個經修飾核苷，諸如2至5個經修飾核苷，諸如2至4個經修飾核苷，諸如1至3個經修飾核苷，諸如1、2、3或4個經修飾核苷。 在一實施例中，區F中之一或多個或所有經修飾核苷係2'經修飾核苷。 在另一實施例中，區F中之2'經修飾核苷中之一或多者選自2'-O-烷基-RNA單元、2'-O-甲基-RNA、2'-胺基-DNA單元、2'-氟基-DNA單元、2'-烷氧基-RNA、MOE單元、LNA單元、阿拉伯糖核酸(ANA)單元及2'-氟基-ANA單元。 在本發明之一個實施例中，區F中之所有經修飾核苷係LNA核苷。在另一實施例中，區F中之LNA核苷獨立地選自由以下組成之群：氧基-LNA、硫基-LNA、胺基-LNA、cET及/或ENA，呈β-D或α-L組態或其組合。在一較佳實施例中，區F在連續序列之5'端具有至少1個β-D-氧基LNA單元。區 G
區G (間隔區)可包含、含有5-16個能夠募集核糖核酸酶H之連續DNA核苷或由該等核苷組成。在另一實施例中，區G包含、含有5至12個、或6至10個或7至9個、諸如8個能夠募集核糖核酸酶H之連續核苷酸單元或由該等單元組成。 在又另一實施例中，區G中之至少一個核苷單元係DNA核苷單元，諸如4至20或6至18個DNA單元，諸如5至16個，在一些實施例中，區G之所有核苷係DNA單元。 在其他實施例中，區G可由DNA及能夠介導核糖核酸酶H裂解之其他核苷之混合物組成。在一些實施例中，區G之至少50%之核苷係DNA，諸如至少60%、至少70%或至少80%、或至少90%DNA。區 F'
連接至區G之3'端之區F' (3'側接或3'翼)包含、含有至少一個糖經修飾核苷或由其組成，諸如至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7個經修飾核苷。在一些實施例中，區F'包含1至7個經修飾核苷或由該等核苷組成，諸如2至6個經修飾核苷，諸如2至5個經修飾核苷，諸如2至4個經修飾核苷，諸如1至3個經修飾核苷，諸如1、2、3或4個經修飾核苷。 在一實施例中，區F'中之一或多個或所有經修飾核苷係2'經修飾核苷。 在另一實施例中，區F'中之2'經修飾核苷中之一或多者選自2'-O-烷基-RNA單元、2'-O-甲基-RNA、2'-胺基-DNA單元、2'-氟基-DNA單元、2'-烷氧基-RNA、MOE單元、LNA單元、阿拉伯糖核酸(ANA)單元及2'-氟基-ANA單元。 在本發明之一個實施例中，區F'中之所有經修飾核苷係LNA核苷。在另一實施例中，區F'中之LNA核苷獨立地選自由以下組成之群：氧基-LNA、硫基-LNA、胺基-LNA、cET及/或ENA，呈β-D或α-L組態或其組合。在一較佳實施例中，區F'在連續序列之5'端具有至少1個β-D-氧基LNA單元。區 D 、 D' 及 D"
本發明之寡核苷酸包含與標靶核酸互補之連續核苷酸區。在一些實施例中，寡核苷酸可進一步包含相對於連續核苷酸區定位於5'及/或3'之其他核苷酸，其在本文稱為區D。區D'及D"可分別連接至區F之5'端或區F'之3'端。在一些實施例中，D區(區D'或D")可形成與標靶核酸互補之連續核苷酸序列之部分，或在其他實施例中D區可與標靶核酸不互補。 在一些實施例中，本發明之寡核苷酸由連續核苷酸區及視情況存在之1-5個額外5'核苷酸(區D')組成或包含該連續核苷酸區及該等核苷酸。 在一些實施例中，本發明之寡核苷酸由連續核苷酸區及視情況存在之1-5個額外3'核苷酸(區D")組成或包含該連續核苷酸區及該等核苷酸。 區D'或D"可獨立地包含1、2、3、4或5個額外核苷酸，該等核苷酸可與標靶核酸互補或不互補。就此而言在一些實施例中，本發明之寡核苷酸可包含能夠調節藉由額外核苷酸側接於5'及/或3'端之標靶的連續核苷酸序列。此類額外核苷酸可充當對核酸酶敏感之生物可裂解連接子，且可因此用以將官能基(諸如共軛部分)連接至本發明之寡核苷酸。在一些實施例中，額外5'及/或3'端核苷酸與磷酸二酯鍵鍵聯，且可為DNA或RNA。在另一實施例中，額外5'及/或3'端核苷酸係經修飾之核苷酸，其可例如經包括以增強核酸酶穩定性或用於合成之簡易性。在一些實施例中，本發明之寡核苷酸包含區D'及/或D"以及連續核苷酸區。 在一些實施例中，本發明之間隔體寡核苷酸可由下式表示： F-G-F'；尤其F1-7
-G4-12
-F'1-7
D'-F-G-F'，尤其D'1-3
-F1-7
-G4-12
-F'1-7
F-G-F'-D"，尤其F1-7
-G4-12
-F'1-7
-D"1-3
D'-F-G-F'-D"，尤其D'1-3
-F1-7
-G4-12
-F'1-7
-D"1-3 製造方法
在另一態樣中，本發明提供用於製造本發明之寡核苷酸之方法，其包含使核苷酸單元反應且因此形成包含於寡核苷酸中之共價鍵聯連續核苷酸單元。較佳地，該方法使用胺基磷酸酯化學方法(參看例如Caruthers等人, 1987, Methods in Enzymology 第154卷, 第287-313頁)。在另一實施例中，該方法進一步包含使連續核苷酸序列與共軛部分(配位體)反應。在另一態樣中提供用於製造本發明之組合物之方法，其包含混合本發明之寡核苷酸或共軛寡核苷酸與醫藥學上可接受之稀釋劑、溶劑、載劑、鹽及/或佐劑。醫藥鹽
用於作為治療性之用途，本發明之寡核苷酸可呈適合之醫藥鹽之形式提供，諸如鈉鹽或鉀鹽。在一些實施例中本發明之寡核苷酸係鈉鹽。醫藥組合物
在另一態樣中，本發明提供醫藥組合物，其包含前述寡核苷酸及/或寡核苷酸共軛物中之任一者及醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑、鹽及/或佐劑。醫藥學上可接受之稀釋劑包括磷酸鹽-緩衝鹽水(PBS)及醫藥學上可接受之鹽，包括但不限於鈉鹽及鉀鹽。在一些實施例中，醫藥學上可接受之稀釋劑係無菌磷酸鹽緩衝鹽水。在一些實施例中，寡核苷酸用於濃度為50-300 µM溶液之醫藥學上可接受之稀釋劑中。在一些實施例中，本發明之寡核苷酸以10-1000 µg之劑量投與。 WO 2007/031091提供醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑及佐劑之適合及較佳實例(以引用之方式併入本文中)。WO2007/031091中亦提供適合之劑量、調配物、投與途徑、組合物、劑型、與其他治療劑之組合、前藥調配物。 本發明之寡核苷酸或寡核苷酸共軛物可與醫藥學上可接受之活性或惰性物質混合用於製備醫藥組合物或調配物。用於調配醫藥組合物之組合物及方法視多個指標而定，包括但不限於投與途徑、疾病程度或待投與之劑量。 在一些實施例中，本發明之寡核苷酸或寡核苷酸共軛物係前藥。特定言之關於寡核苷酸共軛物，在前藥傳遞至作用部位，例如靶細胞時，共軛部分自寡核苷酸解離。應用
本發明之寡核苷酸可用作例如，診斷、治療及預防之研究試劑。 在研究中，此類寡核苷酸可用以特異性調節細胞(例如活體外細胞培養物)及實驗動物中HTRA1蛋白質之合成，進而有助於對標靶之功能分析或評估其作為治療性干預之標靶的有效性。通常標靶調節藉由降低或抑制mRNA生成蛋白質，進而防止蛋白質形成來實現，或藉由降低或抑制基因或mRNA生成蛋白質的調節劑來實現。 在診斷中，寡核苷酸可用以藉由northern印跡、原位雜交或類似技術偵測及定量細胞及組織中之HTRA1表現。 對於治療，疑似患有疾病或病症之動物或人類可藉由調節HTRA1表現來治療。 本發明提供用於治療或預防疾病之方法，其包含向患有疾病或對疾病敏感之個體投與治療或預防有效量之本發明的寡核苷酸、寡核苷酸共軛物或醫藥組合物。 本發明亦係關於如本文所定義用作藥物之寡核苷酸、組合物或共軛物。 根據本發明之寡核苷酸、寡核苷酸共軛物或醫藥組合物通常以有效量投與。 本發明亦提供本發明之寡核苷酸或寡核苷酸共軛物之用途，如所描述用於製造用於治療如本文中所提及之病症的藥物，或用於治療如本文中所提及的如病症的方法。 如本文中所提及之疾病或病症與HTRA1表現相關。在一些實施例中，疾病或病症可與HTRA1基因中，或蛋白質產物與HTRA1相關或相互作用的基因中的突變相關聯。因此，在一些實施例中，標靶核酸係HTRA1序列之突變形式，且在其他實施例中，標靶核酸係HTRA1序列之調節劑。 本發明之方法較佳用於治療或預防抵抗由HTRA1之異常水準及/或活性導致之疾病。 本發明進一步係關於如本文所定義之寡核苷酸、寡核苷酸共軛物或醫藥組合物之用途，其用於製造用於治療HTRA1之異常水準及/或活性的藥物。 在一個實施例中，本發明係關於寡核苷酸、寡核苷酸共軛物或醫藥組合物，其用於治療選自以下之疾病或病症：眼部病症，諸如黃斑變性，包括年齡相關黃斑變性(AMD)，諸如乾性AMD或濕性AMD，及糖尿病性視網膜病變。在一些實施例中，本發明之寡核苷酸共軛物或醫藥組合物可用於治療地圖狀萎縮或中期dAMD。在阿茲海默氏病及帕金森氏病中亦已指示HTRA1，且因此在一些實施例中，本發明之寡核苷酸共軛物或醫藥組合物可用於治療阿茲海默氏病或帕金森氏病。在杜興氏肌肉萎縮症、關節炎(諸如骨關節炎)、家族性缺血性大腦小血管疾病中亦已指示HTRA1，且因此在一些實施例中，本發明之寡核苷酸共軛物或醫藥組合物可用於治療杜興氏肌肉萎縮症、關節炎(諸如骨關節炎)或家族性缺血性大腦小血管疾病。投與
本發明之寡核苷酸或醫藥組合物可局部(諸如，至皮膚、吸入、經眼或經耳)、或經腸(諸如，經口或藉由胃腸道)或非經腸(諸如，靜脈內、皮下、肌肉內、腦內、腦室內或鞘內)投與。 在一些實施例中，本發明之寡核苷酸、共軛物或醫藥組合物藉由非經腸途徑投與，包括靜脈內、動脈內、皮下、腹膜內或肌肉內注射或輸液、鞘內或顱內、例如腦內或室內投與。在一些實施例中，活性寡核苷酸或寡核苷酸共軛物經靜脈內投與。在另一實施例中，活性寡核苷酸或寡核苷酸共軛物經皮下投與。 為了用於治療眼部病症，諸如黃斑變性，例如AMD (濕性或乾性)，可使用眼內注射。 在一些實施例中，本發明之化合物或其醫藥學上可接受之鹽經由眼內注射，以每個眼約10 µg至約200 µg、諸如每個眼約50 µg至約150 µg、諸如每個眼約100 µg之劑量投與。在一些實施例中，劑量區間，亦即連續給藥之間的時間段係至少每月一次，諸如至少每兩月一次，或至少每三月一次。組合療法
在一些實施例中，本發明之寡核苷酸、寡核苷酸共軛物或醫藥組成物用於與另一種治療劑組合治療。治療劑可例如係用於上文所述之疾病或病症之護理的標準物。本發明之實施例
1. 一種具有10-30個核苷酸長度之反股寡核苷酸，其中該反股寡核苷酸包含具有10-22個核苷酸之連續核苷酸區，該區與SEQ ID NO 147至少90%諸如100%互補： SEQ ID NO 147：5' CCAACAACCAGGTAAATATTTG 3' 2. 如實施例1之反股寡核苷酸，其中該反股寡核苷酸能夠抑制HTRA1 mRNA表現。 3. 如實施例1或2之反股寡核苷酸，其中該連續核苷酸區與存在於選自由SEQ ID NO 138、139、140、141、142、143、144及145組成之群的序列中的序列一致： SEQ ID NO 138：CAAATATTTACCTGGTTG SEQ ID NO 139：TTTACCTGGTTGTTGG SEQ ID NO 140：CCAAATATTTACCTGGTT SEQ ID NO 141：CCAAATATTTACCTGGTTGT SEQ ID NO 142：ATATTTACCTGGTTGTTG SEQ ID NO 143：TATTTACCTGGTTGTT SEQ ID NO 144：ATATTTACCTGGTTGT SEQ ID NO 145：ATATTTACCTGGTTGTT 4. 如實施例1至3中任一項之反股寡核苷酸，其中該連續核苷酸區包含序列SEQ ID NO 146： SEQ ID NO 146：TTTACCTGGTT 5. 如實施例1至4中任一項之反股寡核苷酸，其中該寡核苷酸之連續核苷酸區由選自SEQ ID NO 138、139、140、141、142、143、144及145中之任一者的序列組成或包含該序列。 6. 如實施例1至5中任一項之反股寡核苷酸，其中該寡核苷酸之連續核苷酸區包含一或多個2'糖經修飾核苷。 7. 如實施例6之反股寡核苷酸，其中該一或多個2'糖經修飾核苷獨立地選自由以下組成之群：2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA、2'-胺基-DNA、2'-氟基-DNA、阿拉伯糖核酸(ANA)、2'-氟基-ANA及LNA核苷。 8. 如實施例5至7中任一項之反股寡核苷酸，其中該一或多個經修飾核苷係LNA核苷。 9. 如實施例1至8中任一項之反股寡核苷酸，其中該寡核苷酸之連續核苷酸區包含至少一個經修飾核苷間鍵，諸如一或多個硫代磷酸酯核苷間鍵。 10. 如實施例9之反股寡核苷酸，其中該連續核苷酸區內之所有核苷間鍵係硫代磷酸酯核苷間鍵。 11. 如實施例1至10中任一項之反股寡核苷酸，其中該寡核苷酸能夠募集核糖核酸酶H。 12. 如實施例1至11中任一項之反股寡核苷酸，其中該寡核苷酸或其連續核苷酸序列係或包含間隔體。 13. 如實施例11或12之反股寡核苷酸，其中該寡核苷酸或其連續核苷酸序列係式5'-F-G-F'-3'之間隔體，其中區F及F'獨立地包含1至7個糖經修飾核苷，且G係能夠募集核糖核酸酶H之6至16個核苷之區，其中區F及F'之鄰近區G之核苷係糖經修飾核苷。 14. 如實施例13之反股寡核苷酸，其中區G由6至16個DNA核苷組成或包含該等核苷。 15. 如實施例13或14之反股寡核苷酸，其中區F及F'各自包含至少一個LNA核苷。 16. 如實施例1至15中任一項之反股寡核苷酸，其選自選自以下之群： Cs
As
As
As
ts
as
ts
ts
ts
as
cs
cs
ts
gs
Gs
Ts
Ts
G (SEQ ID NO 138，化合物編號138,1) Ts
Ts
ts
as
cs
cs
ts
gs
gs
ts
ts
gs
ts
Ts
Gs
G (SEQ ID NO 139，化合物編號139,1) Cs
Cs
As
As
as
ts
as
ts
ts
ts
as
cs
cs
ts
gs
Gs
Ts
T (SEQ ID NO 140，化合物編號140,1) Cs
Cs
As
as
as
ts
as
ts
ts
ts
as
cs
cs
ts
gs
gs
ts
ts
Gs
T (SEQ ID NO 141，化合物編號141,1) As
Ts
As
ts
ts
ts
as
cs
cs
ts
gs
gs
ts
ts
gs
Ts
Ts
G (SEQ ID NO 142，化合物編號142,1) Ts
As
Ts
ts
ts
as
cs
cs
ts
gs
gs
ts
Ts
Gs
Ts
T (SEQ ID NO 143，化合物編號143,1) Ts
As
ts
ts
ts
as
cs
cs
ts
gs
Gs
ts
Ts
gs
Ts
T (SEQ ID NO 143，化合物編號143,2) Ts
As
Ts
ts
ts
as
cs
cs
ts
gs
gs
Ts
Ts
gs
Ts
T (SEQ ID NO 143，化合物編號143,3) As
Ts
As
Ts
ts
ts
as
cs
cs
ts
gs
gs
Ts
Ts
Gs
T (SEQ ID NO 144，化合物編號144,1) As
ts
As
Ts
Ts
ts
as
cs
cs
ts
gs
gs
ts
Ts
Gs
T (SEQ ID NO 144，化合物編號144,2) As
ts
As
Ts
ts
ts
as
cs
cs
ts
gs
Gs
Ts
Ts
gs
Ts
T (SEQ ID NO 145，化合物編號145,1) As
Ts
As
ts
ts
ts
as
cs
cs
ts
gs
Gs
ts
Ts
gs
Ts
T (SEQ ID NO 145，化合物編號145,2) As
ts
As
Ts
ts
ts
as
cs
cs
ts
gs
gs
ts
Ts
Gs
Ts
T (SEQ ID NO 145，化合物編號145,3) 其中大寫字母表示LNA核苷單元，小寫字母表示DNA核苷單元，下標s表示硫代磷酸酯核苷間鍵聯，其中所有LNA胞嘧啶均為5-甲基胞嘧啶。 17. 如實施例16之反股寡核苷酸，其中該等LNA核苷均為β-D-氧基LNA核苷。 18. 一種共軛物，其包含如實施例1至17中任一項之寡核苷酸，及至少一個共價連接至該寡核苷酸之共軛部分。 19. 一種醫藥組合物，其包含如實施例1至17之寡核苷酸或如實施例18之共軛物，及醫藥學上可接受之稀釋劑、溶劑、載劑、鹽及/或佐劑。 20. 一種於表現HTRA1之靶細胞中調節HTRA1表現之活體內或活體外方法，該方法包含以有效量向該細胞投與如實施例1至17中任一項之寡核苷酸或如實施例18之共軛物或如實施例19之醫藥組合物。 21. 一種用於治療或預防疾病之方法，其包含向患有疾病或對疾病敏感之個體投與治療或預防有效量之如實施例1至17中任一項之寡核苷酸或如實施例18之共軛物或如實施例19之醫藥組合物。 22. 如實施例21之方法，其中該疾病選自由以下組成之群：黃斑變性(諸如濕性AMD、乾性AMD、地圖狀萎縮、中期dAMD、糖尿病性視網膜病變)、帕金森氏病、阿茲海默氏病、杜興氏肌肉萎縮症、關節炎(諸如骨關節炎)及家族性缺血性大腦小血管疾病。 23. 如實施例1至17中任一項之寡核苷酸或如實施例18之共軛物或如實施例19之醫藥組合物，其用於醫學。 24. 如實施例1至17中任一項之寡核苷酸或如實施例18之共軛物或如實施例19之醫藥組合物，其用於治療或預防選自由以下組成之群的疾病：黃斑變性(諸如濕性AMD、乾性AMD、地圖狀萎縮、中期dAMD、糖尿病性視網膜病變)、帕金森氏病、阿茲海默氏病、杜興氏肌肉萎縮症、關節炎(諸如骨關節炎)及家族性缺血性大腦小血管疾病。 25. 一種如實施例1至17中任一項之寡核苷酸或如實施例18之共軛物或如實施例19之醫藥組合物的用途，其用於製備用於治療或預防選自由以下組成之群的疾病之藥物：黃斑變性(諸如濕性AMD、乾性AMD、地圖狀萎縮、中期dAMD、糖尿病性視網膜病變)、帕金森氏病、阿茲海默氏病、杜興氏肌肉萎縮症、關節炎(諸如骨關節炎)及家族性缺血性大腦小血管疾病。實例 材料及方法 寡核苷酸合成
寡核苷酸合成在此項技術中總體上已知。下方係可應用之方案。本發明之寡核苷酸可已藉由在裝置、載體及所用濃度方面略微改變方法而製備。 寡核苷酸使用胺基磷酸酯方法在Oligomaker 48上在尿苷通用載體上以1 μmol等級合成。在合成結束時，在60℃下使用氨水持續5-16小時使寡核苷酸自固體載體解離。寡核苷酸藉由逆相HPLC (RP-HPLC)或固相萃取純化，且藉由UPLC特徵化，且分子量藉由ESI-MS進一步確認。寡核苷酸之延長：
β-氰基乙基-胺基磷酸酯之偶合(DNA-A (Bz)、DNA-G (ibu)、DNA-C (Bz)、DNA-T、LNA-5-甲基-C (Bz)、LNA-A(Bz)、LNA-G (dmf)、LNA-T)藉由使用0.1 M之5'-O-DMT-受保護胺基酸酯於乙腈中之溶液及DCI (4,5-二氰基咪唑)於乙腈(0.25 M)中作為活化劑來進行。對於最終循環，可使用具有所需修飾之胺基磷酸酯，例如用於連接共軛基團或如所指的共軛基團的C6連接子。用於引入硫代磷酸酯鍵之硫醇化藉由使用氫化黃原素(xanthane hydride) (0.01 M於9:1之乙腈/吡啶中)進行。磷酸二酯鍵可使用0.02 M碘於7:2:1之THF/吡啶/水中來引入。剩餘試劑係通常用於寡核苷酸合成之試劑。 對於後固相合成共軛，在固相合成之最終循環中可使用市售C6胺基連接子胺基磷酸酯，且在去除保護基及自固體載體解離之後，胺基鍵聯之去保護寡核苷酸經分離。共軛物經由使用標準合成方法活化官能基來引入。藉由 RP - HPLC 純化 ：
粗製化合物藉由預備之RP-HPLC在Phenomenex Jupiter C18 10µ 150 × 10 mm管柱上純化。0.1 M pH 8之乙酸銨及乙腈以5 mL/min之流動速率用作緩衝液。將收集之部分凍乾，得到通常呈白色固體狀之經純化化合物。縮寫 ：
DCI： 4,5-二氰基咪唑 DCM： 二氯甲烷 DMF： 二甲基甲醯胺 DMT： 4,4'-二甲氧基三苯甲基 THF： 四氫呋喃 Bz： 苯甲醯基 Ibu： 異丁醯基 RP-HPLC： 逆相高效液相層析 Tm 分析 ：
寡核苷酸及RNA標靶(磷酸酯鍵聯，PO)雙螺旋體在500 ml無核糖核酸酶之水中稀釋至3 mM，且與500 ml 2 × Tm
-緩衝液(200 mM NaCl、0.2 mM EDTA、20mM磷酸鈉，pH 7.0)混合。溶液加熱至95℃ 3 min且隨後使其在室溫下退火30 min。雙螺旋體熔融溫度(Tm
)在配備有帕爾貼(Peltier)溫度程式設計器PTP6之Lambda 40 UV/VIS分光光度計上使用PE Templab軟體(Perkin Elmer)量測。溫度自20℃斜升至95℃且隨後降至25℃，在260 nm下記錄吸光值。熔融及退火兩者之一階導數及局部最大值用以分析雙螺旋體Tm
。實例 1 ： 在 C6 細胞株中在單次劑量濃度下測試反股寡核苷酸靶向 大 鼠 Htra1 之 活體外功效 .
大鼠C6細胞株購自ATCC且如由供應商推薦保持於37℃下具有5% CO2
之含濕氣培育箱中。針對分析，在培養基中在96多孔盤中接種1500個C6細胞/孔。細胞培育2小時，隨後添加溶解於PBS中之寡核苷酸。寡核苷酸濃度：25 µM。在添加寡核苷酸4天之後，收集細胞。RNA使用PureLink Pro 96 RNA純化套組(Ambion，根據製造商說明)提取。cDNA隨後使用M-MLT逆轉錄酶、無規十聚體(decamer)RETROscript、核糖核酸酶抑制劑(Ambion，根據製造商說明)及100mM dNTP組PCR級(Invitrogen)以及無脫氧核糖核酸酶/核糖核酸酶之水(Gibco)來合成。分析基因表現時，使用TagMan Fast Advanced Master Mix (2×) (Ambion)在雙股(doublex)設定中進行qPCR。針對qPCR使用以下TaqMan引子分析：Htra1，Rn00581870_m1 (FAM-MGB)及管家基因，Tbp，Rn01455646_m1 (VIC-MGB)。所有引子組皆購自Life Technologies。表中之相對Htra1 mRNA表現水準展示為對照(PBS處理之細胞)之%。所用寡核苷酸：
對於化合物：大寫字母表示LNA核苷(使用β-D-氧基LNA核苷)，所有LNA胞嘧啶均為5-甲基胞嘧啶，小寫字母表示DNA核苷，前方有上標m
之DNA胞嘧啶表示5-甲基C-DNA核苷。所有核苷間鍵係硫代磷酸酯核苷間鍵。實例 2 : 在 C6 細胞株中在劑量反應曲線下測試所選擇寡核苷酸靶向 大 鼠 Htra1 之 活體外效能及功效 .
大鼠C6細胞株描述於實例1中。分析如實例1中所描述進行。寡核苷酸濃度：自50 µM，半對數(half-log)稀釋，8個點。在添加寡核苷酸4天之後，收集細胞。RNA提取、cDNA合成及qPCR如實例1中所描述進行。n = 2次生物重複。EC50
測定在GraphPad Prism6中進行。在50 µM寡核苷酸處理下之相對Htra1 mRNA水準在表中展示為對照(PBS)之%。亦測試額外引子組(Htra1，Rn00668987_m1 [FAM-MGB]對比Ppia，Rn006900933_m1 [VIC-MGB]及Hprt，Rn01527840_m1 [VIC-MGB])，且使用彼等引子觀測到相同趨勢(資料未示出)。實例 3 在 U251 細胞株中在單次劑量濃度下測試寡核苷酸靶向人類 HTRA1 之 活體外功效 .
人類神經膠母細胞瘤U251細胞株購自ECACC且如由供應商推薦保持於37℃下具有5% CO2
之含濕氣培育箱中。針對分析，在饑餓培養基(培養基由供應商推薦，除了1% FBS而非10%以外)中在96多孔盤中接種15000個U251細胞/孔。細胞培育24小時，隨後添加溶解於PBS中之寡核苷酸。寡核苷酸濃度：5 µM。在添加化合物3-4天之後，移除培養基且添加新培養基(無寡核苷酸)。在添加寡核苷酸6天之後，收集細胞。RNA使用PureLink Pro 96 RNA純化套組(Ambion，根據製造商說明)提取。cDNA隨後使用M-MLT逆轉錄酶、無規十聚體RETROscript、核糖核酸酶抑制劑(Ambion，根據製造商說明)及100mM dNTP組PCR級(Invitrogen)以及無脫氧核糖核酸酶/核糖核酸酶之水(Gibco)來合成。對於基因表現分析，使用TagMan Fast Advanced Master Mix (2×) (Ambion)在雙股(doublex)設定中進行qPCR。針對qPCR使用以下TaqMan引子分析：HTRA1，Hs01016151_ m1 (FAM-MGB)及管家基因，TBP，Hs4326322E (VIC-MGB)來自Life Technologies。表中之相對HTRA1 mRNA表現水準展示為對照(PBS處理之細胞)之%。
對於化合物：大寫字母表示LNA核苷(使用β-D-氧基LNA核苷)，所有LNA胞嘧啶均為5-甲基胞嘧啶，小寫字母表示DNA核苷，前方有上標m
之DNA胞嘧啶表示5-甲基C-DNA核苷。所有核苷間鍵係硫代磷酸酯核苷間鍵。實例 4 在 ARPE19 及 U251 細胞株中在 2 個 濃度下測試寡核苷酸之庫靶向人類 HTRA1 mRNA 之 活體外功效 .
針對HTRA1鑑別有前景之「熱點」區。在U251及ARPE19細胞株中篩查n = 129 個人類/犬/大鼠HTRA1 LNA寡核苷酸之庫。根據此庫吾等鑑別出一系列在位點33042-33064之間靶向人類HTRA1前體mRNA (SEQ ID NO2)之活性寡核苷酸，如圖1中所示。 人類視網膜色素上皮ARPE19細胞株購自ATCC且在37℃下具有5% CO2
之含濕氣培育箱中保持於DMEM-F12 (Sigma，D8437)、10% FBS、1%青黴素/鏈黴素(pen/strep)中。U251細胞株描述於實例3中。針對分析，在培養基(除了5% FBS而非10%以外)中在96多孔盤中接種5000個ARPE19細胞/孔。細胞培育1小時，隨後添加溶解於PBS中之寡核苷酸。在添加寡核苷酸4天之後，收集細胞。關於U251細胞株之分析如實例3中所描述進行。寡核苷酸濃度：25及2.5 µM。RNA使用RNeasy 96 Biorobot 8000套組(Qiagen，根據製造商說明)提取。cDNA隨後使用Retroscript cDNA合成套組(ThermoFisher，根據製造商說明)合成。對於基因表現分析，qPCR使用Fluidigm Biomark系統進行。針對qPCR使用以下TaqMan引子分析：HTRA1，Hs01016151_m1及管家基因，TBP，Hs99999910_m1及PPIA，Hs99999904_m1，來自Life Technologies。n = 2次生物重複。相對HTRA1 mRNA表現水準在表中展示為對照(PBS)之%。亦測試額外HTRA1引子組(Hs00170197_m1)且觀測到相同趨勢(資料未示出)。
對於化合物：大寫字母表示LNA核苷(使用β-D-氧基LNA核苷)，所有LNA胞嘧啶均為5-甲基胞嘧啶，小寫字母表示DNA核苷。所有核苷間鍵係硫代磷酸酯核苷間鍵。實例 5 ， 在 大 鼠 C6 細胞株中在單次劑量濃度下測試所選擇人類 / 大 鼠 HTRA1 靶向 LNA 寡核苷酸 之 活體外功效 .
大鼠C6細胞株描述於實例1中。分析如實例1中所描述進行。寡核苷酸濃度：25µM。n = 2次生物重複。表中之相對Htra1 mRNA表現水準展示為對照(PBS處理之細胞)之%。實例 6 ，在 ARPE19 、 U251 及 C6 細胞株中在劑量反應中測試所選擇人類 / 犬 / 大 鼠 LNA 寡核苷酸之活體外效能及功效 .
ARPE19、U251及C6細胞株分別描述於實例4、3及1中。針對分析，在供應商推薦之培養基中在96多孔盤中接種2000個U251或ARPE19細胞/孔。細胞培育2小時，隨後添加溶解於PBS中之寡核苷酸。C6細胞株分析如實例1-2中所描述進行。寡核苷酸濃度：自50 µM，半對數稀釋，8個點。在添加寡核苷酸4天之後，收集細胞。針對所有細胞株，RNA提取、cDNA合成及qPCR如實例1中所描述進行。針對U251及ARPE19細胞使用以下TaqMan引子分析：HTRA1，Hs01016151_m1 (FAM-MGB)及管家基因，TBP，Hs4326322E (VIC-MGB)。所有引子組皆購自Life Technologies。n = 2次生物重複。EC50測定在Graph Pad Prism6中進行。在50 µM寡核苷酸處理下之相對HTRA1 mRNA水準在表中展示為對照(PBS)之%。實例 7 ，在 ARPE19 及 U251 細胞株中在單次劑量濃度下測試所選擇人類 HTRA1 靶向 寡核苷酸之活體外功效 .
ARPE19及U251細胞株及分析描述於實例6中。RNA提取如實例1中所描述進行，cDNA合成及qPCR使用qScript XLT一步RT-qPCR ToughMix Low ROX，95134-100 (Quanta Biosciences)進行。針對U251及ARPE19細胞在douplex設置中使用以下TaqMan引子分析：HTRA1，Hs01016151_m1 (FAM-MGB)及管家基因，GAPDH，Hs4310884E (VIC-MGB)。所有引子組皆購自Life Technologies。n = 1次生物重複。表中之相對HTRA1 mRNA表現水準展示為對照(PBS處理之細胞)之%。亦針對U251測試額外引子組(HTRA1，Hs00170197_m1 [FAM-MGB]對比TBP Hs4326322E [VIC-MGB])，且使用彼等引子觀測到相同趨勢(資料未示出)。參看圖2。實例 8 ，在 人類初級 RPE 細胞中測試活體外功效及效能 .
人類初級視網膜色素上皮(hpRPE)細胞購自Sciencell (目錄號6540)。針對分析，在培養基(EpiCM，Sciencell目錄號4101)中在層黏連蛋白(層黏連蛋白521，BioLamina目錄號LN521-03)塗佈之96多孔盤中接種5000個hpRPE細胞/孔。其藉由此培養基擴增一週，且使用以下培養基分化2週：補充有N1補充劑(Sigma目錄號N-6530)、麩醯胺酸-青黴素-鏈黴素(Sigma目錄號G-1146)、非必需胺基酸(NEAA，Sigma目錄號M-7145)、牛磺酸(Sigma目錄號T-0625)、氫皮質酮(Sigma目錄號H-03966)、三碘-甲狀腺胺酸(Sigma目錄號T-5516)及牛血清白蛋白(BSA，Sigma目錄號A-9647)之MEM α培養基(Sigma目錄號M-4526)。細胞於37℃下具有5% CO2
之含濕氣培育箱中培養。 在實驗當天，細胞用新鮮分化培養基培育1小時，隨後添加寡核苷酸。此等寡核苷酸溶解於PBS中且在第0天及第4天塗覆在細胞上。在第7天，細胞用50 µl具有β-巰基-乙醇之RLT緩衝液(Qiagen目錄號79216)收集。RNA之提取根據Qiagen RNeasy微型套組(目錄號74104；批號151048073)之使用者手冊進行，該微型套組包括脫氧核糖核酸酶I處理(目錄號79254；批號151042674)。RNA品質控制藉由Agilent生物分析儀奈米套組(Agilent；目錄號5067-1511；批號1446)進行。總RNA逆轉錄成cDNA (cDNA合成)使用基於無規六聚體寡核苷酸之高容量cDNA逆轉錄套組，根據製造商說明(Thermo Fisher Scientific，目錄號4368814；批號00314158)進行。cDNA樣品之量測以一式三份在7900HT即時PCR儀器(Thermo Fisher Scientific)上在384孔盤形式中進行。針對qPCR使用以下TaqMan引子分析：HTRA1，Hs01016151_m1及Hs00170197_m1，管家基因，GAPDH，Hs99999905_m1及PPIA，Hs99999904_m1，來自Life Technologies。n = 3次生物重複。相對HTRA1 mRNA表現水準在表中展示為對照(PBS)之%。參見圖3。實例 9 . 大 鼠活體內功效研究 ， 7 天處理 ， 玻璃體內 ( IVT ) 注射 ， 30 µ g / 眼 . 動物
對色素雄性褐色挪威大鼠(Brown Norway rat)執行實驗。在各組研究中包括5個動物，總共15個。化合物及給藥程序
為起始實驗，用異氟烷麻醉動物，眼睛經消毒及擴張，隨後玻璃體內注射每眼30 µg (於3 µl中)。安樂死
在活體階段結束時(第7天)所有大鼠藉由CO2
安樂死，隨後收集眼睛用於解剖。獲取視網膜、鞏膜及玻璃體流體用於進一步分析。HTRA1 RNA 表現之量化
解剖視網膜樣品。大鼠視網膜急速冷凍組織保持冷凍且在測試設施中溶解於RLT溶解緩衝液(Qiagen RNeasy微型套組)中，且根據Qiagen RNeasy微型套組(目錄號74104；批號151039852)之使用者手冊繼續RNA提取，該微型套組包括脫氧核糖核酸酶I處理(目錄號79254；批號151048613)。RNA品質控制藉由Agilent生物分析儀奈米套組(Agilent；目錄號5067-1511；批號1446)進行。總RNA逆轉錄成cDNA (cDNA合成)使用基於無規六聚體寡核苷酸之高容量cDNA逆轉錄套組，根據製造商說明(Thermo Fisher Scientific，目錄號4368814，批號00314158)進行。cDNA樣品之量測以一式三份在7900HT 即時PCR儀器(Thermo Fisher Scientific)上在384孔盤形式中進行。針對qPCR使用以下TaqMan引子分析：Htra1，Rn00581870_m1及管家基因，Gapdh，Rn01775763_g1及Tbp，Rn01455646_m1，來自Life Technologies。大鼠/組：5個，n = 10個眼。各眼視為單獨樣品。相對Htra1 mRNA表現水準展示為對照(PBS)之%。參看圖4。實例 10 大 鼠活體內功效研究 ， 7 天處理 ， 玻璃體內 ( IVT ) 注射 ， 劑量反應 . 動物
所有實驗皆對色素褐色挪威大鼠執行。在各組研究中包括17個動物，總共34個。化合物及給藥程序
動物藉由肌肉內注射甲苯噻嗪與氯胺酮之混合物麻醉。在研究第1天在麻醉動物兩個眼中均玻璃體內投與測試物件及陰性對照(PBS) (每次投與3 µL)。安樂死
在活體階段結束時(第8天)藉由腹膜內注射過度劑量戊巴比妥(pentobarbital)安樂死。寡核苷酸含量量測及 Htra1 RNA 表現之量化
在低劑量及中間劑量組中之所有動物中，以及來自來自高劑量及PBS組之5個第一動物的兩個眼球用於生物分析。緊接在安樂死之後，在冰上快速且謹慎地解剖出玻璃體(V)、視網膜(R)及脈絡膜(CH)，且儲存於-80℃下直至運送為止。視網膜樣品溶解於700 µL MagNa純96 LC RNA分離組織緩衝劑中，且藉由每2 ml管添加1個不鏽鋼珠粒，使用precellys evolution均質機均質化2 × 1.5 min，隨後在RT下培育30 min。樣品以13000 rpm離心5 min。保留一半用於生物分析，且針對另一半直接繼續RNA提取 對於生物分析，將樣品稀釋10-50倍用於藉由雜交ELISA方法之寡核苷酸含量量測。生物素標記之LNA擷取探針及地高辛(digoxigenin)-共軛LNA偵測探針(兩者均為35 nM於5×SSCT中，各者與待偵測之LNA寡核苷酸之一個末端互補)與經稀釋之勻漿或相關之標準物混合，在RT下培育30分鐘，且隨後添加至抗生蛋白鏈菌素(streptavidine)塗佈之ELISA盤(Nunc目錄號436014)。 盤在RT下培育1小時，在2×SSCT (300 mM氯化鈉、30 mM檸檬酸鈉及0.05% v/v Tween-20，pH 7.0)中洗滌擷取之LNA雙螺旋使用與鹼性磷酸酶(Roche Applied Science目錄號11093274910)共軛之抗DIG抗體及鹼性磷酸酶基質系統(Blue Phos基質，KPL產品碼50-88-00)偵測。寡核苷酸錯合物之量在Biotek讀取器上量測為615 nm下之吸收度。 對於RNA提取，在MagNA純96系統中藉由程式：Tissue FF標準LV3.1根據製造商說明使用細胞RNA大容量套組(05467535001，Roche)，包括脫氧核糖核酸酶處理。RNA品質控制及濃度用Eon讀取器(Biotek)量測。RNA濃度在整個樣品中標準化，且後續cDNA合成及qPCR在一步反應中使用qScript XLT一步RT-qPCR ToughMix Low ROX，95134-100 (Quanta Biosciences)進行。在雙螺旋體反應中使用以下TaqMan引子分析：Htra1，Rn00581870_m1及Rn00668987_m1及管家基因，HPRT，Rn01527840_m1及Tbp, Rn01455646_m1，來自Life Technologies。qPCR分析在ViiA7機器(Life Technologies)上執行。大鼠/組：5個，n = 10個眼。各眼視為單獨樣品。相對Htra1 mRNA表現水準展示為對照(PBS)之%。組織學
移除高劑量之2個其餘動物及PBS動物之兩個眼球，且固定於10%中性緩衝福馬林中24小時，修整且嵌入於石蠟中。 針對ISH分析，福馬林固定、嵌入石蠟之大鼠視網膜組織4 μm厚截面使用完全自動化Ventana Dicovery ULTRA染色模組(程序：mRNA Discovery Ultra Red 4.0 - v0.00.0152)使用RNAscope 2.5 VS 探針-Rn-HTRA1 (目錄號440959，Advanced Cell Diagnostic)處理。所用色原體係堅牢紅(Fastred)，蘇木精II對比染色。實施例 11
PoC研究，藍光誘發白化病大鼠中之視網膜退化。動物
所有實驗皆對白化病史泊格多利大鼠(Sprague-Dawley rats)執行。在各組研究中包括16個動物，總共42個。化合物及給藥程序
動物藉由肌肉內注射甲苯噻嗪與氯胺酮之混合物麻醉。在研究-3天在麻醉動物兩個眼中均玻璃體內投與測試物件及陰性對照(PBS) (每次投與3 µL)。 陽性對照物件(PBN)在第0天以2.5 mL/kg之劑量體積使用安裝於1 mL塑膠注射器上之25-規格針頭避光腹膜內注射4次(起始曝光之前0.5 h，起始曝光之後2 h及4 h，及恰好在曝光結束時)。曝光
使大鼠在黑暗中適應36小時，且隨後在透明塑膠籠中曝露於連續藍色螢光(400-540 nm)6小時。在曝光之後，將大鼠置放於黑暗房間中24小時，隨後返回至標準環狀光條件。視網膜電流圖 ( ERG )
在黑暗適應隔夜之後在基線及在第14天在兩個眼上記錄視網膜電流圖(ERG)。針對記錄之各ERG量測A波及b波振幅。安樂死
在活體階段結束時(第14天)，麻醉動物且藉由腹膜內注射過度劑量戊巴比妥安樂死。外核層 ( Outer Nuclear layer ； ONL ) 厚度量測
自各組之10個主要動物去除兩個眼球，固定於Bouin Hollande溶液中且嵌入於石蠟中。沿豎直經線切割薄截面(5至7 µm厚)且藉由三色染色法-梅森(Trichrome-Masson)染色。在視網膜各部分(優及劣)中自視神經至周圍視網膜在七個點量測ONL厚度(每250 µm)。在各點量測外核層之厚度且計算曲線下面積(area under the curve；AUC)。寡核苷酸含量量測及 Htra1 RNA 表現之量化
來自測試對象及PBS組之4隻平行試驗動物(satellite animal)之兩個眼球用於生物分析。緊接在安樂死之後，在冰上快速且謹慎地解剖出玻璃體(V)、視網膜(R)及脈絡膜(CH)，且儲存於-80℃下直至運送為止。視網膜樣品溶解於700 µL MagNa純96 LC RNA分離組織緩衝劑中，且藉由每2 ml管添加1個不鏽鋼珠粒，使用precellys evolution均質機均質化2 × 1.5 min，隨後在RT下培育30 min。樣品以13000 rpm離心5 min。保留一半用於生物分析，且針對另一半直接繼續RNA提取。 對於生物分析，將樣品稀釋10-50倍用於藉由雜交ELISA方法之寡核苷酸含量量測。生物素標記之LNA擷取探針及地高辛(digoxigenin)-共軛LNA偵測探針(兩者均為35 nM於5×SSCT中，各者與待偵測之LNA寡核苷酸之一個末端互補)與經稀釋之勻漿或相關之標準物混合，在RT下培育30分鐘，且隨後添加至抗生蛋白鏈菌素塗佈之ELISA盤(Nunc目錄號436014)。 盤在RT下培育1小時，在2×SSCT (300 mM氯化鈉、30 mM檸檬酸鈉及0.05% v/v Tween-20，pH 7.0)中洗滌擷取之LNA雙螺旋使用與鹼性磷酸酶(Roche Applied Science目錄號11093274910)共軛之抗DIG抗體及鹼性磷酸酶基質系統(Blue Phos基質，KPL產品碼50-88-00)偵測。寡核苷酸錯合物之量在Biotek讀取器上量測為615 nm下之吸收度。 對於RNA提取，在MagNA純96系統中藉由程式：Tissue FF標準LV3.1根據製造商說明使用細胞RNA大容量套組(05467535001，Roche)，包括脫氧核糖核酸酶處理。RNA品質控制及濃度用Eon讀取器(Biotek)量測。RNA濃度在整個樣品中標準化，且後續cDNA合成及qPCR在一步反應中使用qScript XLT一步RT-qPCR ToughMix Low ROX，95134-100 (Quanta Biosciences)進行。在雙螺旋體反應中使用以下TaqMan引子分析：Htra1，Rn00581870_m1及Rn00668987_m1及管家基因，HPRT，Rn01527840_m1及Tbp, Rn01455646_m1，來自Life Technologies。qPCR分析在ViiA7機器(Life Technologies)上執行。大鼠/組：5個，n = 10個眼。各眼視為單獨樣品。相對Htra1 mRNA表現水準展示為對照(PBS)之%。組織學
移除來自測試對象及PBS組之其餘2隻平行試驗動物(satellite animal)之兩個眼球，且固定於10%中性緩衝福馬林中24小時，修整且嵌入於石蠟中。ISH RNAscope如實例10中所描述進行。實例 12 ，大 鼠活體內功效動力研究 ， 3 、 7 及 14 天處理 ， 玻璃體內 ( IVT ) 注射 ， 單次劑量 .
針對2種所選擇之在位置33042-33064 (SEQ ID NO 147)之間靶向人類HTRA1前體mRNA中之「熱點」的HTRA1 LNA寡核苷酸，在視網膜中觀測mRNA水準下之阻斷基因表現(Knockdown；KD)。此在qPCR及ISH讀取兩者之情況下觀測(參看圖7A及/B及下表)。
阻斷基因表現之變化相對較大，參看表中所列之標準差。變化似乎在投與水準下，其可在針對寡核苷酸含量對比殘餘HTRA1 mRNA水準繪製劑量反應曲線時看出(參看圖7C)。動物
所有實驗皆對白化病史泊格多利大鼠執行。化合物及給藥程序
動物在異氟烷中麻醉。在研究第1天在麻醉動物兩個眼中均玻璃體內投與測試物件及陰性對照(PBS) (每次投與3 µL)。安樂死
在活體階段結束時(研究第4、8或15天)，將大鼠麻醉且藉由斷頭術處死。寡核苷酸含量量測及 Htra1 RNA 表現之量化
寡核苷酸含量量測及Htra1 mRNA表現之量化如實例10中所描述進行。 相對殘餘Htra1 mRNA表現水準展示為對照(PBS)之%。組織學
組織學如實例10中所描述進行。實例 13. 食蟹獼猴 ( 非人類靈長類 ， NHP ) 活體內藥代動力學及藥物效應動力學 ( PK / PD ) 研究 ， 21 天處理 ， 玻璃體內 ( IVT ) 注射 ， 單次劑量 .
針對1種所選擇之在位置33042-33064之間靶向人類HTRA1前體mRNA中之「熱點」的HTRA1 LNA寡核苷酸145.3，在視網膜中在mRNA下及在視網膜及玻璃體中在蛋白質水準下觀測阻斷基因表現(參看圖8)。動物
所有實驗皆對食蟹獼猴(Macaca fascicularis
)執行。化合物及給藥程序
丁基原啡因鎮痛在測試化合物注射之前及兩天之後投與。動物藉由肌肉內注射氯胺酮及甲苯噻嗪麻醉。在研究第1天在局部施用四卡因(tetracaine)麻醉劑之後在麻醉動物兩個眼中均玻璃體內投與測試物件及陰性對照(PBS) (每次投與50 µL)。安樂死
在活體階段結束時(第22天)所有猴藉由腹膜內注射過度劑量戊巴比妥安樂死。寡核苷酸含量量測及藉由 qPCR 之 Htra1 RNA 表現之量化
緊接在安樂死之後，在冰上快速且謹慎地解剖出眼組織且儲存於-80℃下直至運送為止。視網膜樣品溶解於700 µL MagNa純96 LC RNA分離組織緩衝劑中，且藉由每2 ml管添加1個不鏽鋼珠粒，使用precellys evolution均質機均質化2 × 1.5 min，隨後在RT下培育30 min。樣品以13000 rpm離心5 min。保留一半用於生物分析，且針對另一半直接繼續RNA提取。 對於生物分析，將樣品稀釋10-50倍用於藉由雜交ELISA方法之寡核苷酸含量量測。生物素標記之LNA擷取探針及地高辛(digoxigenin)-共軛LNA偵測探針(兩者均為35 nM於5×SSCT中，各者與待偵測之LNA寡核苷酸之一個末端互補)與經稀釋之勻漿或相關之標準物混合，在RT下培育30分鐘，且隨後添加至抗生蛋白鏈菌素塗佈之ELISA盤(Nunc目錄號436014)。 盤在RT下培育1小時，在2×SSCT (300 mM氯化鈉、30 mM檸檬酸鈉及0.05% v/v Tween-20，pH 7.0)中洗滌擷取之LNA雙螺旋使用與鹼性磷酸酶(Roche Applied Science目錄號11093274910)共軛之抗DIG抗體及鹼性磷酸酶基質系統(Blue Phos基質，KPL產品碼50-88-00)偵測。寡核苷酸錯合物之量在Biotek讀取器上量測為615 nm下之吸收度。 對於RNA提取，在MagNA純96系統中藉由程式：Tissue FF標準LV3.1根據製造商說明使用細胞RNA大容量套組(05467535001，Roche)，包括脫氧核糖核酸酶處理。RNA品質控制及濃度用Eon讀取器(Biotek)量測。RNA濃度在整個樣品中標準化，且後續cDNA合成及qPCR在一步反應中使用qScript XLT一步RT-qPCR ToughMix Low ROX，95134-100 (Quanta Biosciences)進行。在單股(singplex)反應中使用以下TaqMan引子分析：Htra1，Mf01016150_，Mf01016152_m1及Rh02799527_m1及管家基因，ARFGAP2，Mf01058488_g1及Rh01058485_m1，及ARL1，Mf02795431_m1，來自Life Technologies。qPCR分析在ViiA7機器(Life Technologies)上執行。眼/組：n = 3個眼。各眼視為單獨樣品。相對Htra1 mRNA表現水準展示為對照(PBS)之%。組織學
移除眼球且固定於10%中性緩衝福馬林中24小時，修整且嵌入於石蠟中。 針對ISH分析，福馬林固定、嵌入石蠟之視網膜組織4 μm厚截面使用完全自動化Ventana Dicovery ULTRA染色模組(程序：mRNA Discovery Ultra Red 4.0 - v0.00.0152)使用RNAscope 2.5 VS 探針-Mmu-HTRA1，REF 486979，Advanced Cell Diagnostics, Inc.處理。所用色原體係堅牢紅，蘇木精II對比染色。使用盤基免疫沈澱質譜 ( IP - MS ) 方法之 HTRA1 蛋白質量化 樣品製備 ， 視網膜
視網膜在具有蛋白酶抑制劑(完全無EDTA，Roche)之4個體積(w/v)之RIPA緩衝液(50 mM Tris-HCl，pH 7.4，150 mM NaCl，0.25%去氧膽酸，1% NP-40，1mM EDTA，Millipore)中使用Precellys 24 (5500，15 s，2次循環)均質化。將勻漿離心(13,000 rpm，3 min)且測定上清液之蛋白質含量(Pierce BCA蛋白質分析)。樣品製備 ， 玻璃體
玻璃體液(300 μl)用具有蛋白酶抑制劑(完全無EDTA，Roche)之5 × RIPA緩衝液(最終濃度：50 mM Tris-HCl，pH 7.4，150 mM NaCl，0.25%去氧膽酸，1% NP-40，1mM EDTA)稀釋，且使用Precellys 24 (5500，15 s，2次循環)均質化。將勻漿離心(13,000 rpm，3 min)且測定上清液之蛋白質含量(Pierce BCA蛋白質分析)。盤基 HTRA1 免疫沈澱及胰蛋白酶分解
96孔盤(Nunc MaxiSorp)塗佈有抗HTRA1小鼠單株抗體(R&D MAB2916，於50 μl PBS中500 ng/孔)且在4℃下培育隔夜。盤用PBS (200 μl)洗滌兩次，且在20℃下藉由於PBS中之3% (w/v)BSA阻斷30 min，隨後兩次PBS洗滌。使樣品(於50 μl PBS中75 μg視網膜、100 μg玻璃體)隨機化且添加至盤，隨後在振盪器(150 rpm)上在4℃下隔夜培育。盤隨後用PBS洗滌兩次且用水洗滌一次。隨後將於50 mM TEAB (30 μl)中之10 mM DTT添加至各孔，隨後在20℃下培育1 h，以減少半胱胺酸硫氫基。隨後將於50 mM TEAB (5 μl)中之150 mM碘乙醯胺添加至各孔，隨後在20℃下在暗處培育30 min，以便阻斷半胱胺酸硫氫基。將10 μl 分解溶液添加至各孔(最終濃度：1.24 ng/μl胰蛋白酶，20 fmol/μl BSA肽，26 fmol/μl同位素標記之HTRA1肽，1 fmol/μl iRT肽，Biognosys)，隨後在20℃下培育隔夜。藉由定向 質譜 ( 選擇反應監測， SRM ) 之 HTRA1 肽量化
質譜分析在連接至TSQ Quantiva三重四極質譜儀(Thermo Scientific)之Ultimate RSLCnano LC上進行。樣品(20 μL)直接自96孔盤注射用於IP，且在加樣緩衝液(0.5% v/v甲酸，2% v/v ACN)中以5 μL/min持續6 min裝載於Acclaim Pepmap 100阱管柱(100 μm × 2 cm，C18，5 μm，100 Å，Thermo Scientific)上。肽隨後在PepMap Easy-SPRAY分析型管柱(75 μm × 15 cm，3 μm，100 Å，Thermo Scientific)上分解，其中積體電噴射發射器使用以下梯度以250 nL/min之速率加熱至40℃：6 min，98%緩衝液A (2% ACN，0.1%甲酸)，2%緩衝液B (ACN + 0.1%甲酸)；36 min，30%緩衝液B；41 min，60%緩衝液B；43 min，80%緩衝液B；49 min，80%緩衝液B；50 min，2%緩衝液B。TSQ Quantiva在SRM模式下用以下參數操作：循環時間，1.5 s；噴射電壓，1800 V；碰撞氣體壓力，2毫托(mTorr)；Q1及Q3解析度，0.7 FWHM；離子轉移管溫度300℃。針對HTRA1肽「LHRPPVIVLQR」及同位素標記(L-[U-13C, U-15N]R)合成型式(其使用內標)獲取SRM躍遷。使用Skyline 3.6版進行資料分析。