TW201907008A - 用於調節htra1表現之反義寡核苷酸 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於與HTRA1互補之反義寡核苷酸(寡聚物)，其使得調節HTRA1之表現。調節HTRA1之表現有益於一系列醫學病症，諸如黃斑變性，例如年齡相關黃斑變性。

Description

用於調節HTRA1表現之反義寡核苷酸
本發明係關於與HTRA1互補之反義寡核苷酸(寡聚物)，其使得調節HTRA1之表現。調節HTRA1之表現有益於一系列醫學病症，諸如黃斑變性，例如年齡相關黃斑變性。
絲胺酸蛋白酶之人類高溫需求A (human high temperature requirement A；HTRA)家族為廣泛表現之PDZ-蛋白酶，其涉及藉由組合蛋白酶及伴隨蛋白之雙功能而維持胞外區室中蛋白質穩態。HTRA蛋白酶與胞外基質之組織、細胞增殖及衰老有關。調節HTRA活性與重度疾病相關聯，包括杜興氏肌肉萎縮症(Duchenne muscular dystrophy) (Bakay等人, 2002, Neuromuscul. Disord. 12: 125-141)、諸如骨關節炎之關節炎(Grau等人, 2006, JBC 281: 6124-6129)、癌症、家族性缺血性大腦小血管疾病及年齡相關黃斑變性，以及帕金森氏病(Parkinson's disease)及阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)。人類HTRA1含有類胰島素生長因子(insulin-like growth factor；IGF)結合域。已提出其調節IGF可用性及細胞生長(Zumbrunn及Trueb, 1996, FEES Letters 398:189-192)且呈現腫瘤抑制特性。HTRA1表現在轉移性黑素瘤中下調，且可因此指示黑素瘤發展程度。HTRA1在轉移性黑素瘤細胞株中之過度表現減少增殖及活體外侵襲，且減少異種移植小鼠模型中之腫瘤生長(Baldi等人, 2002, Oncogene 21:6684-6688)。HTRA1表現在卵巢癌中亦下調。在卵巢癌細胞株中，HTRA1過度表現誘發細胞死亡，而反義HTRA1表現促進非錨定依賴性生長(Chien等人, 2004, Oncogene 23:1636-1644)。
除HTRA1對IGF路徑上之影響以外，HTRA1亦抑制藉由生長因子之TGFβ家族的信號傳導(Oka等人, 2004, Development 131:1041-1053)。HTRA1可分解澱粉樣蛋白前驅蛋白(amyloid precursor protein；APP)，且HTRA1抑制劑造成經培養細胞中Aβ肽之累積。因此，HTRA1亦牽涉到阿茲海默氏病(Grau等人，2005, Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 102:6021-6026)。
此外，已觀測到HTRA1上調且似乎與杜興氏肌肉萎縮症(Bakay等人, 2002, Neuromuscul. Disord. 12: 125-141)及骨關節炎(Grau等人, 2006, JBC 281: 6124-6129)及AMD (Fritsche等人 Nat Gen 2013 45(4):433-9)相關聯。
HTRA1啟動子區中之單核苷酸多型性(single nucleotide polymorphism；SNP) (rs11200638)與10倍增加的患有年齡相關黃斑變性(age-related macular degeneration；AMD)之風險相關。此外，HTRA1 SNP與ARMS2 SNP (rs10490924)呈連接失平衡，與增加的患有年齡相關黃斑變性(AMD)的風險相關。風險對偶基因與2-3倍增加的HTRA1 mRNA及蛋白質表現相關，且HTRA1以脈絡膜小疣形式存在於患有AMD之患者中(Dewan等人，2006, Science 314:989-992； Yang等人，2006, Science 314:992-993)。HtrA1之過度表現誘發小鼠中之AMD樣表型。hHTRA轉殖基因小鼠(Veierkottn, PlosOne 2011)揭示布魯赫氏膜(Bruch's membrane)之彈性薄層之降解，確定脈絡膜血管異常(Jones, PNAS 2011)且增加息肉狀脈絡膜血管病變(Polypoidal choroidal vasculopathy；PCV) (Kumar, IOVS 2014)。另外，已報導在hHTRA1 Tg小鼠中布魯赫氏膜受損，其確定在暴露於香菸煙霧時3倍增加CNV (Nakayama, IOVS 2014)。
年齡相關黃斑變性(AMD)為65歲以上人群之視覺不可逆喪失的主要原因。隨著AMD之發病，眼睛後部之光敏性感光細胞、代謝上支持其之底層色素上皮細胞以及其所提供之敏銳的中央視覺逐漸喪失。年齡為AMD發病之主要風險因子：55歲之後患有AMD之可能性變為三倍。吸菸、光虹膜顏色、性別(女性存在較大風險)、肥胖及重複暴露於UV輻射亦增加AMD之風險。AMD進展可定義於三個階段中：1)早期，2)中期，及3)晚期AMD。存在兩種形式之晚期AMD：乾性AMD (亦稱為地圖狀萎縮(geographic atrophy)，GA)及濕性AMD (亦稱為滲出性AMD)。乾性AMD之特徵在於喪失感光器及視網膜色素上皮細胞，導致視覺喪失。濕性AMD與病理性脈絡膜(也稱為視網膜下)新血管生成相關。自此過程中形成之異常血管之滲漏損害黃斑且損害視覺，最終導致失明。在一些情況下，患者可存在與兩種類型之晚期AMD相關之病變。針對濕性AMD之治療策略需要頻繁注射至眼睛中且主要集中於延緩疾病進展。當前無可用於乾性AMD之治療。因此，存在提供治療黃斑變性病症(諸如濕性及乾性AMD)之有效藥物的未滿足醫學需求。WO 2008/013893主張用於治療患有年齡相關黃斑變性之個體之組合物，該組合物包含有包含反義序列之核酸分子，該反義序列雜交至HTRA1基因或mRNA：未揭示反義分子。WO2009/006460提供靶向HTRA1之siRNA及其在治療AMD中之用途。
本發明之目標 本發明提供活體內或活體外調節HTRA1之反義寡核苷酸。本發明鑑別出存在於人類HTRA1 mRNA (包括前體mRNA)中之隱藏標靶序列基元，反義寡核苷酸可靶向該等基元，以得到有效HTRA1抑制。本發明亦提供能夠抑制HTRA1之有效反義寡核苷酸序列及化合物，及其在治療指示HTRA1之疾病或病症中之用途。
本發明係關於靶向哺乳動物HTRA1核酸之寡核苷酸，亦即，能夠抑制HTRA1表現且治療或預防與HTRA1之機能相關之疾病的寡核苷酸。靶向HTRA1之寡核苷酸為反義寡核苷酸，亦即，與其HTRA1核酸標靶互補。
本發明之寡核苷酸可呈醫藥學上可接受之鹽的形式，諸如鈉鹽或鉀鹽。
因此，本發明提供反義寡核苷酸，其包含長度為10-30個核苷酸之連續核苷酸序列，該連續核苷酸序列與哺乳動物HTRA1核酸(諸如SEQ ID NO1、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4)至少90%互補，諸如完全互補。
在另一態樣中，本發明提供醫藥組合物，其包含本發明之寡核苷酸及醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑、鹽及/或佐劑。
本發明提供LNA反義寡核苷酸，諸如LNA間隔體寡核苷酸，其包含長度為10-30個核苷酸之連續核苷酸序列，該連續核苷酸序列與HTRA1核酸(諸如選自由SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4組成之群的序列)至少90%互補，諸如完全互補。
本發明提供包含10-30個(諸如12-22個)核苷酸之連續核苷酸區的反義寡核苷酸，其中連續核苷酸區與SEQ ID NO 113至少90% (諸如100%)互補。
本發明提供長度為10-30個核苷酸之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸包含與SEQ ID NO 113至少90% (諸如100%)互補的10-30個(諸如12-22個)核苷酸之連續核苷酸區： 。
SEQ ID NO 113之反向互補為SEQ ID NO 119： 。
本發明提供包含10-30個(諸如12-22個)核苷酸之連續核苷酸區的反義寡核苷酸，其中連續核苷酸區與SEQ ID NO 114至少90% (諸如100%)互補。
本發明提供長度為10-30個核苷酸之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸包含與SEQ ID NO 114至少90% (諸如100%)互補之10-30個(諸如12-22個)核苷酸的連續核苷酸區：5' 。
SEQ ID NO 114之反向互補為SEQ ID NO 120： 。
本發明提供包含10-30個(諸如12-22個)核苷酸之連續核苷酸區的反義寡核苷酸，其中連續核苷酸區與SEQ ID NO 115至少90% (諸如100%)互補。
本發明提供長度為10-30個核苷酸之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸包含與SEQ ID NO 115至少90% (諸如100%)互補之10-30個(諸如12-22個)核苷酸的連續核苷酸區：5' 。
SEQ ID NO 115之反向互補為SEQ ID NO 121： 。
本發明提供包含10-30個(諸如12-22個)核苷酸之連續核苷酸區的反義寡核苷酸，其中連續核苷酸區與SEQ ID NO 116至少90% (諸如100%)互補。
本發明提供長度為10-30個核苷酸之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸包含與SEQ ID NO 116至少90% (諸如100%)互補之10-30個(諸如12-22個)核苷酸的連續核苷酸區。5' 。
SEQ ID NO 116之反向互補為SEQ ID NO 122： 。
本發明提供包含10-30個(諸如12-22個)核苷酸之連續核苷酸區的反義寡核苷酸，其中連續核苷酸區與SEQ ID NO 117至少90% (諸如100%)互補。
本發明提供長度為10-30個核苷酸之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸包含與SEQ ID NO 117至少90% (諸如100%)互補之10-30個(諸如12-22個)核苷酸的連續核苷酸區：5' 。
SEQ ID NO 117之反向互補為SEQ ID NO 123： 。
在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸不屬於序列5' gcaatgtgtaagaagt 3' (SEQ ID NO 112)。在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸不包含序列5' gcaatgtgtaagaagt 3'或不由其組成。在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸不包含存在於序列5' gcaatgtgtaagaagt 3'中之10個或更多個連續核苷酸或不由其組成。在一些實施例中，本發明之寡核苷酸不為5' GCAatgtgtaagaAGT 3'，其中大寫字母表示LNA核苷(使用β-D-氧基LNA核苷)，所有LNA胞嘧啶為5-甲基胞嘧啶，小寫字母表示DNA核苷，前有上標m之DNA胞嘧啶表示5-甲基C-DNA核苷。所有核苷間鍵為硫代磷酸酯核苷間鍵。
本發明提供包含存在於SEQ ID NO 5-111中之任一者中的至少10個連續核苷酸之連續核苷酸區的反義寡核苷酸。本發明提供包含存在於SEQ ID NO 5-111中之任一者中的至少12個連續核苷酸之連續核苷酸區的反義寡核苷酸。本發明提供包含存在於SEQ ID NO 5-111中之任一者中的至少14個連續核苷酸之連續核苷酸區的反義寡核苷酸。本發明提供包含存在於SEQ ID NO 5-111中之任一者中的至少15個或16個連續核苷酸之連續核苷酸區的反義寡核苷酸。本發明提供反義寡核苷酸，其中寡核苷酸之連續核苷酸序列包含選自由SEQ ID NO 5-111中之任一者組成之群的核鹼基序列或由其組成。
本發明提供包含存在於SEQ ID NO 118：5' CTTCTTCTATCTACGCATTG 3'中之至少10個、或至少12個、至少13個、或至少14個、或至少15個、或至少16個連續核苷酸之連續核苷酸區的反義寡核苷酸。SEQ ID NO 118之反向互補為SEQ ID NO 231：CAATGCGTAGATAGAAGAAG。
本發明提供包含與SEQ ID NO 231互補之至少10個、或至少12個、至少13個、或至少14個、或至少15個、或至少16個連續核苷酸之連續核苷酸區的反義寡核苷酸。
本發明提供包含存在於SEQ ID NO 67中之至少10個、或至少12個、或至少13個、或至少14個、或至少15個或16個連續核苷酸之連續核苷酸區的反義寡核苷酸。
本發明提供包含存在於SEQ ID NO 86中之至少10個、或至少12個、或至少13個、或至少14個、或至少15個或16個連續核苷酸之連續核苷酸區的反義寡核苷酸。
本發明提供包含存在於SEQ ID NO 73中之至少10個、或至少12個、或至少13個、或至少14個、或至少15個、或至少16個、或至少17個或18個連續核苷酸之連續核苷酸區的反義寡核苷酸。
本發明提供包含與SEQ ID NO 186互補之至少10個、或至少12個、至少13個、或至少14個、或至少15個或16個連續核苷酸之連續核苷酸區的反義寡核苷酸。
本發明提供包含與SEQ ID NO 205互補之至少10個、或至少12個、至少13個、或至少14個、或至少15個或16個連續核苷酸之連續核苷酸區的反義寡核苷酸。
本發明提供包含與SEQ ID NO 192互補之至少10個、或至少12個、至少13個、或至少14個、或至少15個、或至少16個、或至少17個或18個連續核苷酸之連續核苷酸區的反義寡核苷酸。
本發明提供包含選自由以下組成之群的寡核苷酸或由其組成之寡核苷酸： Ts Ts m Cs ts as ts cs ts as m cs gs cs as Ts Ts G (SEQ ID NO 67,1)，m Cs Ts Ts m Cs ts ts cs ts as ts cs ts as m cs gs cs As T (SEQ ID NO 73,1)，及 Ts As m Cs Ts ts ts as as ts as gs cs Ts m Cs As A (SEQ ID NO 86,1)； 其中大寫字母表示β-D-氧基LNA核苷，小寫字母為DNA核苷，下標s表示硫代磷酸酯核苷間鍵，且m C表示5個甲基胞嘧啶β-D-氧基LNA核苷，且m c表示5個甲基胞嘧啶DNA核苷。
本發明提供下式之寡核苷酸： Ts Ts m Cs ts as ts cs ts as m cs gs cs as Ts Ts G (SEQ ID NO 67,1)， 其中大寫字母表示β-D-氧基LNA核苷，小寫字母為DNA核苷，下標s表示硫代磷酸酯核苷間鍵，且m C表示5個甲基胞嘧啶β-D-氧基LNA核苷，且m c表示5個甲基胞嘧啶DNA核苷。
本發明提供下式之寡核苷酸：m Cs Ts Ts m Cs ts ts cs ts as ts cs ts as m cs gs cs As T (SEQ ID NO 73,1) 其中大寫字母表示β-D-氧基LNA核苷，小寫字母為DNA核苷，下標s表示硫代磷酸酯核苷間鍵，且m C表示5個甲基胞嘧啶β-D-氧基LNA核苷，且m c表示5個甲基胞嘧啶DNA核苷。
本發明提供下式之寡核苷酸： Ts As m Cs Ts ts ts as as ts as gs cs Ts m Cs As A (SEQ ID NO 86,1) 其中大寫字母表示β-D-氧基LNA核苷，小寫字母為DNA核苷，下標s表示硫代磷酸酯核苷間鍵，且m C表示5個甲基胞嘧啶β-D-氧基LNA核苷，且m c表示5個甲基胞嘧啶DNA核苷。
本發明提供實例中所提供之寡核苷酸。
本發明提供共軛物，其包含根據本發明之寡核苷酸，及共價連接至該寡核苷酸之至少一個共軛部分。
本發明提供本發明之寡核苷酸或共軛物的醫藥學上可接受之鹽。
在另一態樣中，本發明提供藉由以有效量向表現HTRA1之細胞投與本發明之寡核苷酸、共軛物或組合物而用於調節該細胞中HTRA1表現之活體內或活體外方法的方法。
在另一態樣中，本發明提供用於治療或預防與HTRA1之活體內活性相關之疾病、病症或功能障礙的方法，其包含向患有疾病、病症或功能障礙，或對疾病、病症或功能障礙敏感之個體投與治療或預防有效量的本發明之寡核苷酸或其共軛物。
在另一態樣中，本發明之寡核苷酸或組合物用於治療或預防黃斑變性，及牽涉HTRA1之其他病症。
本發明提供本發明之寡核苷酸或共軛物用於治療選自包含以下之清單的疾病或病症：杜興氏肌肉萎縮症、諸如骨關節炎之關節炎、家族性缺血性大腦小血管疾病、阿茲海默氏病以及帕金森氏病。
本發明提供本發明之寡核苷酸或共軛物用於治療黃斑變性，諸如濕性或乾性年齡相關黃斑變性(例如，wAMD、dAMD、地圖狀萎縮、早期AMD、中期AMD)或糖尿病性視網膜病變。
本發明提供本發明之寡核苷酸、共軛物或組合物之用途，其用於製造用於治療諸如濕性或乾性年齡相關黃斑變性(例如，wAMD、dAMD、地圖狀萎縮、中期dAMD)或糖尿病性視網膜病變之黃斑變性的藥物。
本發明提供本發明之寡核苷酸、共軛物或組合物的用途，其用於製造用於治療選自由以下組成之群的疾病或病症的藥物：杜興氏肌肉萎縮症、諸如骨關節炎之關節炎、家族性缺血性大腦小血管疾病、阿茲海默氏病以及帕金森氏病。
本發明提供用於治療患有選自由以下組成之群的疾病或病症之個體的方法：杜興氏肌肉萎縮症、諸如骨關節炎之關節炎、家族性缺血性大腦小血管疾病、阿茲海默氏病以及帕金森氏病，該方法包含向個體投與有效量的本發明之寡核苷酸、共軛物或組合物的步驟。
本發明提供用於治療患有眼部疾病之個體的方法，該眼部疾病諸如黃斑變性，諸如濕性或乾性年齡相關黃斑變性(例如，wAMD、dAMD、地圖狀萎縮、中期dAMD)或糖尿病性視網膜病變，該方法包含向個體投與有效量的本發明之寡核苷酸、共軛物或組合物的步驟。
本發明提供用於治療患有眼部疾病之個體的方法，該眼部疾病諸如黃斑變性，諸如濕性或乾性年齡相關黃斑變性(例如，wAMD、dAMD、地圖狀萎縮、中間AMD)或糖尿病性視網膜病變，該方法包含以約10 µg-200 µg之劑量以眼內注射投與至少兩個劑量的本發明之寡核苷酸或其醫藥學上可接受之鹽，其中連續投與之間的給藥間隔為至少4週(亦即給藥間隔≥ 4週)，或至少每月(亦即給藥間隔≥ 1個月)。
定義 寡核苷酸 如本文中所使用之術語「寡核苷酸」定義為，熟習此項技術者一般將其理解為包含兩個或多於兩個共價鍵聯之核苷之分子。此類共價鍵結核苷亦可稱為核酸分子或寡聚物。寡核苷酸通常在實驗室中藉由固相化學合成隨後純化而製得。當提及寡核苷酸之序列時，提及共價鍵聯核苷酸或核苷之核鹼基部分或其修飾的序列或順序。本發明之寡核苷酸為人造的，且為化學合成的，且通常經純化或分離。本發明之寡核苷酸可包含一或多種經修飾之核苷或核苷酸。
反義寡核苷酸 如本文中所使用之術語「反義寡核苷酸」定義為能夠藉由雜交至標靶核酸、尤其雜交至標靶核酸上之連續序列而調節標靶基因表現的寡核苷酸。反義寡核苷酸基本上不為雙股，且因此不為siRNA。較佳地，本發明之反義寡核苷酸為單股。
連續核苷酸區 術語「連續核苷酸區」係指寡核苷酸中與標靶核酸互補之區。該術語可在本文中與術語「連續核苷酸序列」或「連續核鹼基序列」及術語「寡核苷酸基元序列」互換使用。在一些實施例中，寡核苷酸之所有核苷酸存在於連續核苷酸區中。在一些實施例中，寡核苷酸包含連續核苷酸區且可視情況包含其他核苷酸，例如可用以使官能基連接至連續核苷酸序列的核苷酸連接子區。核苷酸連接子區可與標靶核酸互補或可能不與其互補。在一些實施例中，存在於連續核苷酸區之核苷酸之間的核苷間鍵均為硫代磷酸酯核苷間鍵。在一些實施例中，連續核苷酸區包含一或多種糖經修飾之核苷。
核苷酸 核苷酸為寡核苷酸及聚核苷酸之構築嵌段，且出於本發明之目的包括天然存在及非天然存在之核苷酸兩者。在本質上，諸如DNA及RNA核苷酸之核苷酸包含核糖部分、核鹼基部分及一或多個磷酸酯基(其不存在於核苷中)。核苷及核苷酸亦可互換地稱作「單元」或「單體」。
經修飾之核苷 如本文中所使用之術語「經修飾之核苷」或「核苷修飾」係指與當量DNA或RNA核苷相比，藉由引入一或多個糖部分或(核)鹼基部分之修飾而經修飾的核苷。在一較佳實施例中，經修飾之核苷包含經修飾之糖部分。術語經修飾之核苷亦可在本文中與術語「核苷類似物」或經修飾之「單元」或經修飾的「單體」互換使用。
經修飾之核苷間鍵 術語「經修飾之核苷間鍵」定義為，熟習此項技術者一般理解為除磷酸二酯(PO)鍵以外之鍵，其將兩個核苷共價地偶合在一起。具有經修飾核苷間鍵之核苷酸亦稱為「經修飾之核苷酸」。在一些實施例中，與磷酸二酯鍵相比，經修飾核苷間鍵提高寡核苷酸對核酸酶之耐性。對於天然存在之寡核苷酸，核苷間鍵包括在相鄰核苷之間產生磷酸二酯鍵之磷酸酯基。對於活體內用途，經修飾核苷間鍵尤其適用於使寡核苷酸穩定，且可用以保護本發明之寡核苷酸中之DNA或RNA核苷區(例如在間隔體寡核苷酸之間隔區內，以及在經修飾核苷區中)免受核酸酶裂解。
在一實施例中，寡核苷酸包含自天然磷酸二酯至例如對核酸酶侵襲更具耐性之鍵的一或多種經修飾之核苷間鍵。核酸酶耐性可藉由在血清中培育寡核苷酸，或藉由使用核酸酶耐性分析(例如，蛇毒液磷酸二酯酶(SVPD))來測定，均為此項技術中所熟知。能夠增強寡核苷酸對核酸酶之耐性的核苷間鍵稱為耐核酸酶核苷間鍵。在一些實施例中，寡核苷酸或其連續核苷酸序列之所有核苷間鍵經修飾。將認識到，在一些實施例中，將本發明之寡核苷酸鍵聯至非核苷酸官能基(諸如共軛物)之核苷可為磷酸二酯。在一些實施例中，寡核苷酸或其連續核苷酸序列之所有核苷間鍵為耐核酸酶核苷間鍵。
在一些實施例中，經修飾核苷間鍵可為硫代磷酸酯核苷間鍵。在一些實施例中，經修飾核苷間鍵與本發明之寡核苷酸之RNase H募集(例如硫代磷酸酯)相容。
在一些實施例中，核苷間鍵包含硫(S)，諸如硫代磷酸酯核苷間鍵。
硫代磷酸酯核苷間鍵為尤其適用的，此係因為核酸酶耐性、有益之藥代動力學及製造簡易性。在一些實施例中，寡核苷酸或其連續核苷酸序列之所有核苷間鍵為硫代磷酸酯。
核鹼基 術語核鹼基包括存在於核苷及核苷酸中之嘌呤(例如，腺嘌呤及鳥嘌呤)及嘧啶(例如，尿嘧啶、胸腺嘧啶及胞嘧啶)部分，其在核酸雜交中形成氫鍵。在本發明之上下文中，術語核鹼基亦涵蓋經修飾核鹼基，其可不同於天然存在之核鹼基，但在核酸雜交期間具有功能性。在此上下文中，「核鹼基」係指天然存在之核鹼基(諸如腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸苷、尿嘧啶、黃嘌呤及次黃嘌呤)以及非天然存在之變體兩者。此類變體例如描述於Hirao等人(2012) Accounts of Chemical Research 第45卷第2055頁及Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1中。
在一些實施例中，核鹼基部分藉由將嘌呤或嘧啶改變成經修飾之嘌呤或嘧啶而經修飾，經修飾之嘌呤或嘧啶為諸如經取代的嘌呤或經取代之嘧啶，諸如選自以下之核鹼基：異胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑并-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、5-溴尿嘧啶5-噻唑并-尿嘧啶、2-硫基-尿嘧啶、2'硫基-胸腺嘧啶、肌苷、二胺基嘌呤、6-胺基嘌呤、2-胺基嘌呤、2,6-二胺基嘌呤及2-氯-6-胺基嘌呤。
核鹼基部分可藉由例如A、T、G、C或U之各對應核鹼基之字母代碼來指示，其中各字母可視情況包括當量功能之經修飾核鹼基。舉例而言，在例示性寡核苷酸中，核鹼基部分選自A、T、G、C及5-甲基胞嘧啶。視情況，對於LNA間隔體，可使用5-甲基胞嘧啶LNA核苷。在一些實施例中，5'cg3'基元中之胞嘧啶核鹼基為5-甲基胞嘧啶。
經修飾之寡核苷酸 術語經修飾寡核苷酸描述包含一或多個糖經修飾核苷及/或經修飾核苷間鍵之寡核苷酸。術語「嵌合」寡核苷酸為已在文獻中用以描述具有經修飾核苷之寡核苷酸的術語。
互補性 術語互補性描述核苷/核苷酸之沃森-克里克鹼基配對(Watson-Crick base-pairing)之能力。沃森-克里克鹼基對為鳥嘌呤(G)-胞嘧啶(C)及腺嘌呤(A)-胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)。將理解，寡核苷酸可包含具有經修飾核鹼基之核苷，例如通常使用5-甲基胞嘧啶替代胞嘧啶，且因而術語互補性涵蓋未經修飾及經修飾核鹼基之間的沃森-克里克鹼基配對(參見例如Hirao等人(2012) Accounts of Chemical Research第45卷第2055頁及Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1)。
如本文中所使用，術語「互補%」係指給定位置處之核酸分子(例如，寡核苷酸)中連續核苷酸區或序列與給定位置處之單獨核酸分子(例如，標靶核酸)之連續核苷酸序列互補(亦即，與連續核苷酸序列形成沃森克里克鹼基對)的核苷酸數目百分比。該百分比藉由以下計算：計數在兩個序列之間形成對之對準鹼基的數目，除以寡核苷酸中核苷酸之總數且乘以100。在此類比較中，未對準(形成鹼基對)之核鹼基/核苷酸稱為失配。
將理解，當提及兩個序列之間的互補性時，互補性之測定在兩個序列之較短序列的整個長度中量測，諸如連續核苷酸區或序列之長度。
術語「完全互補」係指100%互補。在不存在術語值%或不存在指示失配之情況下，互補意謂完全互補。
一致性 如本文中所使用，術語「一致性」係指給定位置處之核酸分子(例如，寡核苷酸)中連續核苷酸序列與給定位置處之單獨核酸分子(例如，標靶核酸)之連續核苷酸序列一致(亦即，其與互補核苷形成沃森克里克鹼基對的能力一致)的核苷酸數目百分比。該百分比藉由以下計算：計數在兩個序列之間一致的對準鹼基(包括間隔)之數目，除以寡核苷酸中核苷酸之總數目且乘以100。一致性百分比= (匹配× 100)/對準區(具有間隔)之長度。
當測定寡核苷酸之連續核苷酸區之一致性時，在連續核苷酸區的整個長度中計算一致性。在寡核苷酸之整個連續核苷酸序列為連續核苷酸區之實施例中，因此在寡核苷酸之核苷酸序列之整個長度中計算一致性。就此而言，連續核苷酸區可與參考核酸序列之區一致，或在一些實施例中可與整個參考核酸一致。除非另外指示，否則與參考序列具有100%一致性之序列稱為一致的。
舉例而言，參考序列可選自由SEQ ID NO 5-111中之任一者組成之群。
然而，若寡核苷酸包含側接連續核苷酸區(例如區D'或D")之額外核苷酸，則在測定一致性時可忽略此等額外側接核苷酸。在一些實施例中，可在整個寡核苷酸序列中計算一致性。
在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸包含與選自由SEQ ID NO 5-111組成之群之序列一致的至少10個連續核苷酸之連續核苷酸區。
在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸包含與選自由SEQ ID NO 5-111組成之群之序列一致的至少12個連續核苷酸之連續核苷酸區。
在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸包含與選自由SEQ ID NO 5-111組成之群之序列一致的至少13個連續核苷酸之連續核苷酸區。
在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸包含與選自由SEQ ID NO 5-111組成之群之序列一致的至少14個連續核苷酸之連續核苷酸區。
在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸包含與選自由SEQ ID NO 5-111組成之群之序列一致的至少15個連續核苷酸之連續核苷酸區。
在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸包含與選自由SEQ ID NO 5-111組成之群之序列一致的至少16個連續核苷酸之連續核苷酸區。
在一些實施例中，連續核苷酸區由至少10個連續核苷酸組成或包含該等連續核苷酸，諸如選自由SEQ ID NO 113-118或SEQ ID NO 5-111組成之群之序列的11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22個連續核苷酸，諸如12-22個，諸如14-18個連續核苷酸。
在一些實施例中，寡核苷酸之連續序列由至少10個連續核苷酸組成或包含該等連續核苷酸，諸如SEQ ID NO 119之11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22個連續核苷酸，諸如12-22個，諸如14-18個連續核苷酸。
在一些實施例中，寡核苷酸之連續序列由至少10個連續核苷酸組成或包含該等連續核苷酸，諸如SEQ ID NO 120之11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22個連續核苷酸，諸如12-22個，諸如14-18個連續核苷酸。
在一些實施例中，寡核苷酸之連續序列由至少10個連續核苷酸組成或包含該等連續核苷酸，諸如SEQ ID NO 121之11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22個連續核苷酸，諸如12-22個，諸如14-18個連續核苷酸。
在一些實施例中，寡核苷酸之連續序列由至少10個連續核苷酸組成或包含該等連續核苷酸，諸如SEQ ID NO 122之11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22個連續核苷酸，諸如12-22個，諸如14-18個連續核苷酸。
在一些實施例中，寡核苷酸之連續序列由至少10個連續核苷酸組成或包含該等連續核苷酸，諸如SEQ ID NO 123之11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22個連續核苷酸，諸如12-22個，諸如14-18個連續核苷酸。
本發明提供包含存在於SEQ ID NO 118：5'CTTCTTCTATCTACGCATTG3'中之至少10個，或至少12個，或至少13個，或至少14個，或至少15個，或至少16個，或至少17個或至少18個連續核苷酸之連續核苷酸區的反義寡核苷酸。
在一些實施例中，連續核苷酸區包含與SEQ ID NO 67一致的10、11、12、13、14、15或16個連續核苷酸。
在一些實施例中，連續核苷酸區包含與SEQ ID NO 73一致的10、11、12、13、14、15、16、17或18個連續核苷酸。
在一些實施例中，連續核苷酸區包含與SEQ ID NO 86一致之10、11、12、13、14、15或16個連續核苷酸。
本發明提供長度為11-30個核苷酸(諸如長度為12-20個核苷酸)之反義寡核苷酸，其中寡核苷酸包含與選自由SEQ ID NO 5-111組成之群之序列一致的連續核苷酸序列。
本發明提供包含連續核苷酸序列或由其組成之反義寡核苷酸，其中連續核苷酸序列在該參考序列之至少10個連續核苷酸中與選自由SEQ ID NO 5-111組成之群的參考序列一致。
本發明提供包含連續核苷酸序列或由其組成之反義寡核苷酸，其中連續核苷酸序列在參考序列之至少12個連續核苷酸中與選自由SEQ ID NO 5-111組成之群的參考序列一致。
本發明提供包含連續核苷酸序列或由其組成之反義寡核苷酸，其中連續核苷酸序列在參考序列之至少14個連續核苷酸中與選自由SEQ ID NO 5-111組成之群的參考序列一致。
本發明提供包含連續核苷酸序列或由其組成之反義寡核苷酸，其中連續核苷酸序列在參考序列之長度中與選自由SEQ ID NO 5-111組成之群的參考序列一致。
雜交 如本文中所使用，將術語「雜交(hybridizing/hybridize)」理解為兩個核酸股(例如，寡核苷酸及標靶核酸)在對置股上之鹼基對之間形成氫鍵，由此形成雙螺旋體。兩個核酸股之間的結合親和力為雜交之強度。通常描述，就熔融溫度(Tm )而言定義為一半寡核苷酸與標靶核酸成雙螺旋時之溫度。在生理條件下，Tm 不與親和力嚴格成比例(Mergny及Lacroix, 2003,Oligonucleotides 13:515-537)。標準狀態吉布斯(Gibbs)自由能ΔG°為結合親和力之更精確表示，且經由ΔG° = -RTln(Kd )與反應之解離常數(Kd )相關，其中R為氣體常數且T為絕對溫度。因此，寡核苷酸與標靶核酸之間的反應之極低ΔG°反映寡核苷酸與標靶核酸之間的強雜交。ΔG°為與水性濃度為1 M、pH為7且溫度為37℃之反應相關之能量。寡核苷酸雜交至標靶核酸為自發反應，且對於自發反應，ΔG°小於零。ΔG°可以實驗方式量測，例如藉由使用等溫滴定量熱法(isothermal titration calorimetry；ITC)，如Hansen等人, 1965,Chem . Comm . 36-38及Holdgate等人, 2005,Drug Discov Today 中所描述。熟習此項技術者將知曉商業設備可供用於ΔG°量測。ΔG°亦可藉由使用如SantaLucia, 1998,Proc Natl Acad Sci USA . 95: 1460-1465所描述之最近鄰模型，使用由Sugimoto等人, 1995,Biochemistry 34:11211-11216及McTigue等人, 2004,Biochemistry 43:5388-5405描述之經恰當推導之熱力學參數進行數值上估計。為了具有藉由雜交調節本發明之寡核苷酸既定核酸標靶的可能性，本發明之寡核苷酸針對長度為10-30個核苷酸之寡核苷酸雜交至經估計ΔG°值低於-10千卡的標靶核酸。在一些實施例中，雜交度或雜交強度藉由標準狀態吉布斯自由能ΔG°量測。針對長度為8-30個核苷酸之寡核苷酸，寡核苷酸可雜交至經估計ΔG°值低於-10千卡範圍，諸如低於-15千卡，諸如低於-20千卡及諸如低於-25千卡的標靶核酸。在一些實施例中，寡核苷酸雜交至經估計ΔG°值為-10至-60千卡，諸如-12至-40千卡，諸如-15至-30千卡或-16至-27千卡，諸如-18至-25千卡的標靶核酸。
標靶序列 寡核苷酸包含連續核苷酸區，該區與標靶核酸分子之子序列互補或雜交。如本文中所使用，術語「標靶序列」係指存在於標靶核酸中之核苷酸之序列，其包含與本發明之寡核苷酸之連續核苷酸區或序列互補的核鹼基序列。在一些實施例中，標靶序列由標靶核酸上之區組成，該區與本發明之寡核苷酸之連續核苷酸區或序列互補。在一些實施例中，標靶序列長於單個寡核苷酸之互補序列，且可例如表示標靶核酸之較佳區，該區可經由本發明之若干寡核苷酸靶向。
本發明之寡核苷酸包含與標靶核酸(諸如標靶序列)互補之連續核苷酸區。
寡核苷酸包含具有至少10個核苷酸之連續核苷酸區，該區與存在於標靶核酸分子中之標靶序列互補或雜交。連續核苷酸區(及因此標靶序列)包含至少10個連續核苷酸、諸如11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22個連續核苷酸，諸如12-22個，諸如14-18個連續核苷酸。
在一些實施例中，標靶序列存在於選自由SEQ ID NO 113、114、115、116、117及118組成之群的序列內。
靶細胞 如本文中所使用之術語靶細胞係指表現標靶核酸之細胞。在一些實施例中，靶細胞可在活體內或活體外。在一些實施例中，靶細胞為哺乳動物細胞，諸如靈長類細胞，諸如猴細胞或人類細胞。在一些實施例中，靶細胞可為視網膜細胞，諸如視網膜色素上皮(PRE)細胞。在一些實施例中，細胞選自由以下組成之群：RPE細胞、雙極細胞、無軸突神經細胞、內皮細胞、神經節細胞以及微神經膠質細胞。對於活體外評定，靶細胞可為初級細胞或已確定細胞株，諸如U251、ARPE19。
標靶核酸 根據本發明，標靶核酸為編碼哺乳動物HTRA1之核酸，且可為例如基因、RNA、mRNA及前體mRNA、成熟mRNA或cDNA序列。標靶可因此稱作HTRA1標靶核酸。
適合地，標靶核酸編碼HTRA1蛋白質，尤其哺乳動物HTRA1，諸如人類HTRA1 (參見例如表1及表2，其提供人類及大鼠HTRA1之mRNA及前體mRNA序列)。
在一些實施例中，標靶核酸選自由以下組成之群：SEQ ID NO: 1、2、3及4或其天然存在之變體(例如，編碼哺乳動物HTRA1蛋白質的序列)。
靶細胞為表現HTRA1標靶核酸之細胞。在較佳實施例中，標靶核酸為HTRA1 mRNA，諸如HTRA1前體mRNA或HTRA1成熟mRNA。針對反義寡核苷酸靶向，通常忽略HTRA1 mRNA之聚A尾。
若在研究或診斷中採用本發明之寡核苷酸，則標靶核酸可為cDNA或衍生自DNA或RNA之合成核酸。
標靶序列可為標靶核酸之子序列。在一些實施例中，寡核苷酸或連續核苷酸區與諸如選自由SEQ ID NO 113、114、115、116、117或231組成之群的序列之HTRA1子序列完全互補，或僅包含一個或兩個失配。
標靶序列可為標靶核酸之子序列。在一些實施例中，寡核苷酸或連續核苷酸區與諸如選自由SEQ ID NO 124-230組成之群的序列之HTRA1子序列完全互補，或僅包含一個或兩個失配。在一些實施例中，寡核苷酸或連續核苷酸區與HTRA1子序列SEQ ID NO 231完全互補，或僅包含一個或兩個失配。
與標靶或其子序列之互補在寡核苷酸或其連續核苷酸區之長度中量測。
對於活體內或活體外應用，本發明之寡核苷酸通常能夠抑制HTRA1標靶核酸在表現HTRA1標靶核酸之細胞中之表現。本發明之寡核苷酸之核鹼基之連續序列通常與HTRA1標靶核酸互補，如在寡核苷酸的長度中所量測，視情況除一個或兩個失配之外，且視情況不包括可將寡核苷酸鍵聯至視情況選用之官能基(諸如共軛物)或其他非互補端核苷酸的基於核苷酸之連接子區(例如，區D)。在一些實施例中，標靶核酸可為RNA或DNA，諸如信使RNA，諸如成熟mRNA或前體mRNA。在一些實施例中，標靶核酸為編碼哺乳動物HTRA1蛋白質，諸如人類HTRA1，例如人類HTRA1 mRNA序列、諸如揭示為SEQ ID NO 1 (NM_002775.4，GI：190014575)之彼等的RNA或DNA。例示性標靶核酸之其他資訊提供於表1及表2中。表 1 .人類及獼猴HTRA1之基因組及總成資訊。 Fwd =正股。基因組座標提供前體mRNA序列(基因組序列)。NCBI參考提供mRNA序列(cDNA序列)。 *美國國家生物技術資訊中心(The National Center for Biotechnology Information)參考序列資料庫為包括基因組、轉錄物及蛋白質之參考序列之全面的、整合的、非冗餘的、充分註釋的集合。其在www . ncbi . nlm . nih . gov / refseq 託管。 **在參考序列中，位置126至位置227存在一連串100個核苷酸，其身分未知。在SEQ ID NO 3及4中，此串已由出現在此區中之人類及恆河猴HTRA1前體mRNA序列兩者中的核苷酸置換。表 2 . 人類及獼猴HTRA1之序列細節。
天然存在之變體 術語「天然存在之變體」係指HTRA1基因或轉錄物之變體，其源自與標靶核酸相同之基因座，但可例如藉助於基因密碼之簡併而不同，該簡併造成大量密碼子編碼相同胺基酸，或歸因於前體mRNA之替代性拼接，或存在多型性(諸如單核苷酸多型性)及對偶基因變體而不同。基於存在寡核苷酸之充足互補序列，本發明之寡核苷酸可因此靶向標靶核酸及其天然存在之變體。在一些實施例中，天然存在之變體與諸如選自由SEQ ID NO 1、2、3或4組成之群之標靶核酸的哺乳動物HTRA1標靶核酸具有至少95%，諸如至少98%或至少99%同源性。
表現之調節 如本文中所使用，術語「表現之調節」理解為總體術語：當與投與寡核苷酸之前的HTRA1之量相比時，寡核苷酸更改HTRA1之量的能力。替代地，表現之調節可藉由參考不投與本發明之寡核苷酸的對照實驗來測定。調節之一種類型為寡核苷酸例如藉由使mRNA降解或阻斷轉錄而抑制、下調、減少、遏制、移除、停止、阻斷、預防、減輕、降低、避免或終止HTRA1之表現的能力。本發明之反義寡核苷酸能夠抑制、下調、減少、遏制、移除、停止、阻斷、預防、減輕、降低、避免或終止HTRA1之表現。
高親和力經修飾核苷 高親和力經修飾核苷為經修飾之核苷酸，其在併入至寡核苷酸中時增強寡核苷酸對其互補標靶之親和力，例如如藉由熔融溫度(Tm )所量測。本發明之高親和力經修飾核苷較佳導致熔融溫度升高如下，每個經修飾核苷，在+ 0.5至+ 12℃之間、更佳在+ 1.5至+ 10℃之間且最佳在+ 3至+ 8℃之間。大量高親和力經修飾核苷在此項技術中已知，且包括例如許多2'經取代之核苷以及鎖核酸(locked nucleic acid；LNA) (參見例如Freier及Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443及Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213)。
糖修飾 本發明之寡聚物可包含具有經修飾糖部分(亦即當與在DNA及RNA中所發現之核糖部分相比時糖部分之修飾)的一或多個核苷。
已製備眾多具有核糖部分之修飾之核苷，其首要目的在於改良寡核苷酸之某些特性，諸如親和力及/或對核酸酶之耐性。
此類修飾包括例如藉由用以下替代來修飾核糖環結構之彼等：己醣環(HNA)；或雙環，其通常在核糖環(LNA)上之C2與C4碳原子之間具有雙基團橋；或非連鎖核糖環，其通常缺乏C2與C3碳原子之間的鍵(例如，UNA)。其他糖經修飾之核苷包括例如雙環己醣核酸(WO2011/017521)或三環核酸(WO2013/154798)。經修飾核苷亦包括糖部分經非糖部分替代之核苷，例如在肽核酸(PNA)或N-嗎啉基核酸之情形下。
糖修飾亦包括經由將核糖環上之取代基改變成除氫以外之基團，或DNA及RNA核苷中天然發現之2'-OH基團而得到的修飾。取代基可例如在2'、3'、4'或5'位置處引入。具有經修飾之糖部分之核苷亦包括2'經修飾核苷，諸如2'經取代核苷。實際上，在研發2'經取代核苷上已花費大量注意力，且已發現大量2'經取代核苷在併入至寡核苷酸中時具有有益特性，諸如增強的核苷耐性及增強的親和力。
2 ' 經修飾核苷。 2'糖經修飾核苷為在2'位置處具有除H或-OH以外之取代基的核苷(2'經取代核苷)，或包含2'鍵聯雙基團之核苷，且包括2'經取代核苷及LNA (2'至4'雙基團橋接)核苷。舉例而言，2'經修飾糖可向寡核苷酸提供增強的結合親和力及/或增加的核酸酶之耐性。2'經取代修飾之核苷的實例為2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA (MOE)、2'-胺基-DNA、2'-氟基-RNA以及2'-F-ANA核苷。對於其他實例，請參見例如Freier及Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443及Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213，以及Deleavey及Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937。下面為一些2'經取代修飾之核苷的圖示。
鎖核酸核苷 ( LNA ) 。 LNA核苷為在核苷酸之核糖環之C2'與C4'之間包含連接基團(稱為雙基團或橋)的經修飾核苷。此等核苷在文獻中亦稱為橋接核酸或雙環核酸(BNA)。
在一些實施例中，本發明之寡聚物之經修飾核苷或LNA核苷具有式I或式II之通式結構：其中W係選自-O-、-S-、-N(Ra )-、-C(Ra Rb )-，諸如，在一些實施例中，-O-； B指代核鹼基部分； Z指代與相鄰核苷之核苷間鍵，或5'-端基； Z*指代與相鄰核苷之核苷間鍵，或3'-端基； X指代選自由以下組成之清單的基團：-C(Ra Rb )-、-C(Ra )=C(Rb )-、-C(Ra )=N-、-O-、-Si(Ra )2 -、-S-、-SO2 -、-N(Ra )-及＞C=Z。
在一些實施例中，X選自由以下組成之群：-O-、-S-、NH-、NRa Rb 、-CH2 -、CRa Rb 、-C(=CH2 )-及-C(=CRa Rb )-。
在一些實施例中，X為-O- Y指代選自由以下組成之群的基團：-C(Ra Rb )-、-C(Ra )=C(Rb )-、-C(Ra )=N-、-O-、-Si(Ra )2 -、-S-、-SO2 -、-N(Ra )-及＞C=Z。
在一些實施例中，Y選自由以下組成之群：-CH2 -、-C(Ra Rb )-、-CH2 CH2 -、-C(Ra Rb )-C(Ra Rb )-、-CH2 CH2 CH2 -、-C(Ra Rb )C(Ra Rb )C(Ra Rb )-、-C(Ra )=C(Rb )-及-C(Ra )=N-。
在一些實施例中，Y選自由以下組成之群：-CH2 -、-CHRa -、-CHCH3 -、CRa Rb - 或-X-Y-一起指代二價連接基團(亦稱為基團)，一起指代由選自由以下組成之群的1、2或3個基團/原子組成之二價連接基團：-C(Ra Rb )-、-C(Ra )=C(Rb )-、-C(Ra )=N-、-O-、-Si(Ra )2 -、-S-、-SO2 -、-N(Ra )-及＞C=Z。
在一些實施例中，-X-Y-指代選自由以下組成之群的雙基團：-X-CH2 -、-X-CRa Rb -、-X-CHRa - 、-X-C(HCH3 )- 、-O-Y-、-O-CH2 -、-S-CH2 -、-NH-CH2 -、-O-CHCH3 -、-CH2 -O-CH2 、-O-CH(CH3 CH3 )-、-O-CH2 -CH2 -、OCH2 -CH2 -CH2 -、-O-CH2 OCH2 -、-O-NCH2 -、-C(=CH2 )-CH2 -、-NRa -CH2 -、N-O-CH2 、-S-CRa Rb -及-S-CHRa -。
在一些實施例中，-X-Y-指代-O-CH2 -或-O-CH(CH3 )-。 其中Z係選自-O-、-S-及-N(Ra )-， 且Ra 及(當存在時) Rb 各自獨立地選自：氫、視情況經取代之C1 - 6 烷基、視情況經取代之C2 - 6 烯基、視情況經取代之C2 - 6 炔基、羥基、視情況經取代的C1 - 6 烷氧基、C2 - 6 烷氧基烷基、C2 - 6 烯基氧基、羧基、C1 - 6 烷氧羰基、C1 - 6 烷基羰基、甲醯基、芳基、芳氧基-羰基、芳氧基、芳基羰基、雜芳基、雜芳氧基-羰基、雜芳氧基、雜芳基羰基、胺基、單及二(C1 - 6 烷基)胺基、胺甲醯基、單及二(C1 - 6 烷基)-胺基-羰基、胺基-C1 - 6 烷基-胺基羰基、單及二(C1 - 6 烷基)胺基-C1 - 6 烷基-胺基羰基、C1 - 6 烷基-羰胺基、胺甲醯胺基、C1 - 6 烷醯基氧基、磺醯基(sulphono)、C1 - 6 烷基磺醯基氧基、硝基、疊氮基、硫基、C1 - 6 烷硫基、鹵素，其中芳基及雜芳基可視情況經取代，且其中兩個成對取代基Ra 及Rb 一起可指代視情況經取代之亞甲基(=CH2 )，其中對於所有對掌性中心，可在R 或S 定向中發現不對稱基團。 其中R1 、R2 、R3 、R5 及R5 * 獨立地選自由以下組成之群：氫、視情況經取代之C1 - 6 烷基、視情況經取代的C2 - 6 烯基、視情況經取代之C2 - 6 炔基、羥基、C1 - 6 烷氧基、C2 - 6 烷氧基烷基、C2 - 6 烯基氧基、羧基、C1 - 6 烷氧羰基、C1 - 6 烷基羰基、甲醯基、芳基、芳氧基-羰基、芳氧基、芳基羰基、雜芳基、雜芳氧基-羰基、雜芳氧基、雜芳基羰基、胺基、單及二(C1 - 6 烷基)胺基、胺甲醯基、單及二(C1 - 6 烷基)-胺基-羰基、胺基-C1 - 6 烷基-胺基羰基、單及二(C1 - 6 烷基)胺基-C1 - 6 烷基-胺基羰基、C1 - 6 烷基-羰胺基、胺甲醯胺基、C1 - 6 烷醯基氧基、磺醯基、C1 - 6 烷基磺醯基氧基、硝基、疊氮基、硫基、C1 - 6 烷硫基、鹵素，其中芳基及雜芳基可視情況經取代，且其中兩個成對取代基一起可指代酮基、硫酮基、亞胺基或視情況經取代之亞甲基。
在一些實施例中，R1 、R2 、R3 、R5 及R5 * 獨立地選自C1 - 6 烷基，諸如甲基，及氫。
在一些實施例中，R1 、R2 、R3 、R5 及R5 * 均為氫。
在一些實施例中，R1 、R2 、R3 均為氫，且R5 及R5 * 中之一者亦為氫且R5 及R5 * 中之另一者不為氫，諸如C1 - 6 烷基，諸如甲基。
在一些實施例中，Ra 為氫或甲基。在一些實施例中，(當存在時)Rb 為氫或甲基。
在一些實施例中，Ra 及Rb 中之一者或兩者為氫。
在一些實施例中，Ra 及Rb 中之一者為氫且另一者不為氫
在一些實施例中，Ra 及Rb 中之一者為甲基且另一者為氫
在一些實施例中，Ra 及Rb 兩者均為甲基。
在一些實施例中，雙基團-X-Y-為-O-CH2 -，W為O，且R1 、R2 、R3 、R5 及R5 * 中所有均為氫。此類LNA核苷揭示於WO99/014226、WO00/66604、WO98/039352及WO2004/046160中，其皆以引用之方式併入本文中，且包括通常稱為β-D-氧基LNA及α-L-氧基LNA核苷之該等LNA核苷。
在一些實施例中，雙基團-X-Y-為-S-CH2 -，W為O，且R1 、R2 、R3 、R5 及R5 * 中所有均為氫。此類硫基LNA核苷揭示於WO99/014226及WO2004/046160中，其以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，雙基團-X-Y-為-NH-CH2 -，W為O，且R1 、R2 、R3 、R5 及R5 * 中所有均為氫。此類胺基LNA核苷揭示於WO99/014226及WO2004/046160中，其以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，雙基團-X-Y-為-O-CH2 -CH2 -或-O-CH2 -CH2 -CH2 -，W為O，且R1 、R2 、R3 、R5 及R5 * 中所有者均為氫。此類LNA核苷揭示於WO00/047599及Morita等人, Bioorganic & Med.Chem. Lett. 12 73-76中，其以引用之方式併入本文中，且包括通常稱為2'-O-4'C-乙烯橋接核酸(ENA)之該等LNA核苷。
在一些實施例中，雙基團-X-Y-為-O-CH2 -，W為O，且R1 、R2 、R3 中所有及R5 及R5 * 中之一者為氫，且R5 及R5 * 中之另一者不為氫，諸如C1 - 6 烷基，諸如甲基。此類5'經取代LNA核苷揭示於WO2007/134181中，其以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，雙基團-X-Y-為-O-CRa Rb -，其中Ra 及Rb 中之一者或兩者不為氫，諸如甲基，W為O，且R1 、R2 、R3 中所有及R5 及R5 * 中之一者為氫，且R5 及R5 * 中之另一者不為氫，諸如C1 - 6 烷基，諸如甲基。此類雙修飾LNA核苷揭示於WO2010/077578中，其以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，雙基團-X-Y-指代二價連接基團-O-CH(CH2 OCH3 )-(2'O-甲氧基乙基雙環核酸-Seth等人, 2010, J. Org. Chem. 第75(5)卷, 第1569-81頁)。在一些實施例中，雙基團-X-Y-指代二價連接基團-O-CH(CH2 CH3 )-(2'O-乙基雙環核酸-Seth等人, 2010, J. Org. Chem. 第75(5)卷, 第1569-81頁)。在一些實施例中，雙基團-X-Y-為-O-CHRa -，W為O，且R1 、R2 、R3 、R5 及R5 * 中所有均為氫。此類6'經取代LNA核苷揭示於WO10036698及WO07090071中，其均以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，雙基團-X-Y-為-O-CH(CH2 OCH3 )-，W為O，且R1 、R2 、R3 、R5 及R5 * 中所有均為氫。此類LNA核苷在此項技術中亦稱為環狀MOE (cMOE)且揭示於WO07090071中。
在一些實施例中，雙基團-X-Y-指代二價連接基團-O-CH(CH3 )-，呈R或S組態。在一些實施例中，雙基團-X-Y-一起指代二價連接基團-O-CH2 -O-CH2 - (Seth等人, 2010, J. Org. Chem)。在一些實施例中，雙基團-X-Y-為-O-CH(CH3 )-，W為O，且R1 、R2 、R3 、R5 及R5 * 中所有均為氫。此類6'甲基LNA核苷在此項技術中亦稱為cET核苷，且可為(S)cET或(R)cET立體異構體，如揭示於WO07090071 (β-D)及WO2010/036698 (α-L)中，其均以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，雙基團-X-Y-為-O-CRa Rb -，其中在Ra 或Rb 中均不為氫，W為O，且R1 、R2 、R3 、R5 及R5 * 中所有均為氫。在一些實施例中，Ra 及Rb 均為甲基。此類6'經二取代之LNA核苷揭示於WO 2009006478中，其以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，雙基團-X-Y-為-S-CHRa -，W為O，且R1 、R2 、R3 、R5 及R5 * 中所有均為氫。此類6'經取代硫基LNA核苷揭示於WO11156202中，其以引用之方式併入本文中。在一些6'經取代硫基LNA實施例中，Ra 為甲基。
在一些實施例中，雙基團-X-Y-為-C(=CH2)-C(Ra Rb )-，諸如-C(=CH2 )-CH2 -或-C(=CH2 )-CH(CH3 )-，W為O，且R1 、R2 、R3 、R5 及R5 * 中所有均為氫。此類乙烯基碳LNA核苷揭示於WO08154401及WO09067647中，其均以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，雙基團-X-Y-為-N(-ORa )-，W為O，且R1 、R2 、R3 、R5 及R5 * 中所有均為氫。在一些實施例中，Ra 為C1 - 6 烷基，諸如甲基。此類LNA核苷亦稱為N經取代LNA，且揭示於WO2008/150729中，其以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，雙基團-X-Y-一起指代二價連接基團-O-NRa -CH3 (Seth等人, 2010, J. Org. Chem)。在一些實施例中，雙基團-X-Y-為-N(Ra )-，W為O，且R1 、R2 、R3 、R5 及R5 * 中所有均為氫。在一些實施例中，Ra 為C1 - 6 烷基，諸如甲基。
在一些實施例中，R5 及R5 * 中之一者或兩者為氫，且在經取代時，R5 及R5 * 中之另一者為C1 - 6 烷基，諸如甲基。在此實施例中，R1 、R2 、R3 可均為氫，且雙基團-X-Y-可選自-O-CH2-或-O-C(HCRa )-，諸如-O-C(HCH3)-。
在一些實施例中，雙基團為-CRa Rb -O-CRa Rb -，諸如CH2 -O-CH2 -，W為O，且R1 、R2 、R3 、R5 及R5 * 中所有均為氫。在一些實施例中，Ra 為C1 - 6 烷基，諸如甲基。此類LNA核苷亦稱為構形受限核苷酸(conformationally restricted nucleotide；CRN)且揭示於WO2013036868中，其以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，雙基團為-O-CRa Rb -O-CRa Rb -，諸如O-CH2 -O-CH2 -，W為O，且R1 、R2 、R3 、R5 及R5 * 中所有均為氫。在一些實施例中，Ra 為C1 - 6 烷基，諸如甲基。此類LNA核苷亦稱為COC核苷酸且揭示於Mitsuoka等人, Nucleic Acids Research 2009 37(4), 1225-1238中，其以引用之方式併入本文中。
將認識到，除非指定，否則LNA核苷可呈β-D或α-L立體異構形式。
LNA核苷之實例展現於方案1中。
方案1如實例中所說明，在本發明之一些實施例中，寡核苷酸中之LNA核苷係β-D-氧基-LNA核苷。
核酸酶介導之降解 核酸酶介導之降解係指當與互補核苷酸序列形成雙螺旋體時，能夠介導互補核苷酸序列之降解的寡核苷酸。
在一些實施例中，寡核苷酸可經由核酸酶介導之標靶核酸之降解起作用，其中本發明之寡核苷酸能夠募集核酸酶，特定言之核酸內切酶，較佳內切核糖核酸酶(RNase)，諸如RNase H。經由核酸酶介導之機制操作之寡核苷酸設計的實例為通常包含具有至少5或6個DNA核苷之區且在一側或兩側上由親和力增強核苷(例如間隔體、頭體(headmer)、尾體(tailmer))側接的寡核苷酸。
RNase H 活性及募集 反義寡核苷酸之RNase H活性係指當與互補RNA分子成雙螺旋體時，反義寡核苷酸募集RNase H之能力。WO01/23613提供用於測定RNase H活性之活體外方法，其可用於測定募集RNase H之能力。通常，若當寡核苷酸具備互補標靶核酸序列時，其初始速率(以pmol/l/min量測)為使用與經測試之經修飾寡核苷酸具有相同鹼基序列但僅含有DNA單體的寡核苷酸，其中寡核苷酸中之所有單體之間具有硫代磷酸酯鍵，且使用藉由WO01/23613 (以引用之方式併入本文中)之實例91至95所提供之方法時測定的初始速率的至少5%，諸如至少10%或超過20%，則將寡核苷酸視為能夠募集RNase H。
間隔體 如本文中所使用之術語間隔體係指反義寡核苷酸，其包含RNase H募集寡核苷酸之區(間隔)，該區藉由包含一或多個親和力增強經修飾核苷之區(側接(flank)或翼(wing))側接5'及3'。本文中描述多種間隔體設計。在側接中之一者缺失，亦即寡核苷酸之端部中之僅一者包含親和力增強經修飾核苷之情況下，頭體及尾體為能夠募集RNase H之寡核苷酸。對於頭體，3'側接缺失(亦即5'側接包含親和力增強經修飾核苷)，且對於尾體，5'側接缺失(亦即3'側接包含親和力增強經修飾核苷)。
LNA 間隔體 術語LNA間隔體為間隔體寡核苷酸，其中親和力增強經修飾核苷中之至少一者為LNA核苷。在一些實施例中，LNA間隔體中之LNA核苷為β-D-氧基LNA核苷及/或6'甲基β-D-氧基LNA核苷(諸如(S)cET核苷)。
混合翼間隔體 術語混合翼間隔體係指LNA間隔體，其中側接區包含至少一個LNA核苷及至少一個非LNA經修飾之核苷，諸如至少一個DNA核苷或至少一個2'經取代修飾之核苷，諸如2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA (MOE)、2'-胺基-DNA、2'-氟基-RNA及2'-F-ANA核苷。在一些實施例中，混合翼間隔體具有包含LNA核苷之一個側接(例如，5'或3')，且另一個側接(分別3'或5')包含2'經取代修飾之核苷。在一些實施例中，混合翼間隔體中之LNA核苷為β-D-氧基LNA核苷及/或6'甲基β-D-氧基LNA核苷(諸如(S)cET核苷)。
共軛物 如本文中所使用之術語共軛物係指共價鍵聯至非核苷酸部分(共軛部分或區C或第三區)之寡核苷酸。
在一些實施例中，非核苷酸部分選自由以下組成之群：蛋白質，諸如酶、抗體或抗體片段或肽；親脂部分，諸如脂質、磷脂、固醇；聚合物，諸如聚乙二醇或聚丙二醇；受體配位體；小分子；報導分子；以及非核苷碳水化合物。
連接子 鍵或連接子為兩個原子之間的連接，該連接經由一或多個共價鍵將相關之一個化學基團或片段鍵聯至相關之另一個化學基團或片段。共軛部分可直接或經由鍵聯部分(例如，連接子或繫栓)連接至寡核苷酸。連接子用於將第三區(例如，共軛部分)共價連接至寡核苷酸(例如，區A或C之末端)。
在本發明之一些實施例中，本發明之共軛物或寡核苷酸共軛物可視情況包含安置於寡核苷酸與共軛部分之間的連接子區。在一些實施例中，共軛物與寡核苷酸之間的連接子為生物可裂解的。
包含生理上不穩定鍵或由該鍵組成之生物可裂解連接子在哺乳動物身體內通常遭遇之條件或類似於哺乳動物身體內遭遇之條件下可裂解。生理上不穩定連接子經歷化學轉化(例如，裂解)之條件包括化學條件，諸如pH、溫度、氧化或還原條件或試劑，及哺乳動物細胞中所發現之鹽濃度或類似於哺乳動物細胞中所碰到之彼等鹽濃度。哺乳動物細胞內條件亦包括通常存在於哺乳動物細胞中(諸如來自蛋白水解酶或水解酶或核酸酶)之酶活性之現狀。在一個實施例中，生物可裂解連接子對S1核酸酶裂解敏感。在一較佳實施例中，對核酸酶敏感之連接子包含1與10個之間核苷，諸如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷，更佳2與6個之間核苷且最佳2與4個之間鍵聯核苷，該等核苷包含至少兩個連續磷酸二酯鍵，諸如至少3或4或5個連續磷酸二酯鍵。較佳地，核苷為DNA或RNA。含有生物可裂解連接子之磷酸二酯更詳細地描述於WO 2014/076195中(其以引用之方式併入本文中)，且在本文可指區D。
共軛物亦可經由生物不可裂解連接子鍵聯至寡核苷酸，或在一些實施例中，共軛物可包含共價連接至生物可裂解連接子的不可裂解連接子。連接子未必為生物可裂解的，但主要用於將共軛部分共價連接至寡核苷酸或生物可裂解連接子。此類連接子可包含鏈結構或重複單元之寡聚物，重複單元為諸如乙二醇、胺基酸單元或胺基烷基。在一些實施例中，連接子(區Y)為胺基烷基，諸如C2 -C36 胺基烷基，包括例如C6 至C12 胺基烷基。在一些實施例中，連接子(區Y)為C6 胺基烷基。共軛物連接基團可通常經由使用胺基經修飾寡核苷酸及共軛基團上之活化酯基連接至寡核苷酸。
治療 如本文中所使用之術語『治療』係指治療現有疾病(例如，如本文中提及之疾病或病症)或預防疾病(亦即防治)兩者。因而，將認識到，如本文中所提及之治療在一些實施例中可為預防性的。
本發明之寡核苷酸 本發明係關於能夠抑制HTRA1之表現的寡核苷酸。調節可藉由雜交至編碼HTRA1之標靶核酸或涉及調控HTRA1之標靶核酸來實現。標靶核酸可為哺乳動物HTRA 1序列，諸如選自由SEQ ID 1、2、3或4組成之群的序列。
本發明之寡核苷酸係靶向HTRA1 (諸如哺乳動物HTRA1)之反義寡核苷酸。
在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸能夠經由抑制或下調標靶之表現而調節標靶表現。較佳地，此類調節產生與標靶之正常表現量相比表現之至少20%抑制，諸如與標靶之正常表現量相比至少30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%抑制。在一些實施例中，在活體外使用ARPE-19細胞，本發明之化合物可能夠抑制HTRA1 mRNA之表現量至少60%或70%。在一些實施例中，在活體外使用ARPE-19細胞，本發明之化合物可能夠抑制HTRA1蛋白質之表現量至少50%。適合地，實例提供可用於量測HTRA1 RNA或蛋白質抑制之分析。標靶調節藉由寡核苷酸之連續核苷酸序列與標靶核酸之間的雜交來觸發。在一些實施例中，本發明之寡核苷酸在寡核苷酸與標靶核酸之間包含失配。儘管存在失配，但與標靶核酸之雜交仍可足以展示HTRA1表現之所需調節。由失配產生之減少的結合親和力宜可藉由寡核苷酸中增加的核苷酸數目及/或增加的能夠提高與標靶之結合親和力的經修飾核苷(諸如2'經修飾核苷，包括存在於寡核苷酸序列內之LNA)數目來補償。
本發明之一態樣係關於反義寡核苷酸，其包含長度為10至30個核苷酸之連續核苷酸區，該連續核苷酸區與HTRA1標靶序列具有至少90%互補性，諸如與HTRA1標靶序列(例如選自由SEQ ID NO 1、2、3及4組成之群的核酸)完全互補。
在一些實施例中，寡核苷酸包含連續序列，該連續序列與標靶核酸之區至少90%互補，諸如至少91%、諸如至少92%、諸如至少93%、諸如至少94%、諸如至少95%、諸如至少96%、諸如至少97%、諸如至少98%或100%互補。
在一些實施例中，本發明之寡核苷酸或其連續核苷酸序列與標靶核酸之區完全互補(100%互補)，或在一些實施例中在寡核苷酸與標靶核酸之間可包含一個或兩個失配。
在一些實施例中，寡核苷酸或其至少12個核苷酸之連續核苷酸序列與選自由SEQ ID NO 119、120、121、122或123組成之群的序列之區至少90%互補，諸如完全(或100%)互補。
在一些實施例中，寡核苷酸或其至少12個核苷酸之連續核苷酸序列與選自由SEQ ID NO 124-230組成之群的序列之區至少90%互補，諸如完全(或100%)互補。
在一些實施例中，寡核苷酸或其至少12個核苷酸之連續核苷酸序列與SEQ ID NO 186之區至少90%互補，諸如完全(或100%)互補。
在一些實施例中，寡核苷酸或其至少12個核苷酸之連續核苷酸序列與SEQ ID NO 192之區至少90%互補，諸如完全(或100%)互補。
在一些實施例中，寡核苷酸或其至少12個核苷酸之連續核苷酸序列與SEQ ID NO 205之區至少90%互補，諸如完全(或100%)互補。
在一些實施例中，寡核苷酸或其至少13個核苷酸之連續核苷酸序列與SEQ ID NO 186之區至少90%互補，諸如完全(或100%)互補。
在一些實施例中，寡核苷酸或其至少13個核苷酸之連續核苷酸序列與SEQ ID NO 192之區至少90%互補，諸如完全(或100%)互補。
在一些實施例中，寡核苷酸或其至少13個核苷酸之連續核苷酸序列與SEQ ID NO 205之區至少90%互補，諸如完全(或100%)互補。
在一些實施例中，寡核苷酸或其至少14個核苷酸之連續核苷酸序列與選自由SEQ ID NO 113、114、115、116、117及231組成之群的序列完全(或100%)互補。
在一些實施例中，寡核苷酸或其至少14個核苷酸之連續核苷酸序列與SEQ ID NO 186之區至少90%互補，諸如完全(或100%)互補。
在一些實施例中，寡核苷酸或其至少14個核苷酸之連續核苷酸序列與SEQ ID NO 192之區至少90%互補，諸如完全(或100%)互補。
在一些實施例中，寡核苷酸或其至少14個核苷酸之連續核苷酸序列與SEQ ID NO 205之區至少90%互補，諸如完全(或100%)互補。
在一些實施例中，寡核苷酸或其至少15個核苷酸之連續核苷酸序列與SEQ ID NO 186之區至少90%互補，諸如完全(或100%)互補。
在一些實施例中，寡核苷酸或其至少15個核苷酸之連續核苷酸序列與SEQ ID NO 192之區至少90%互補，諸如完全(或100%)互補。
在一些實施例中，寡核苷酸或其至少15個核苷酸之連續核苷酸序列與SEQ ID NO 205之區至少90%互補，諸如完全(或100%)互補。
在一些實施例中，寡核苷酸或其至少16個核苷酸之連續核苷酸序列與選自由SEQ ID NO 113、114、115、116、117及231組成之群的序列完全(或100%)互補。
在一些實施例中，寡核苷酸或其至少16個核苷酸之連續核苷酸序列與SEQ ID NO 186之區至少90%互補，諸如完全(或100%)互補。
在一些實施例中，寡核苷酸或其至少16，諸如16、17或18個核苷酸之連續核苷酸序列與SEQ ID NO 192之區至少90%互補，諸如完全(或100%)互補。
在一些實施例中，寡核苷酸或其至少16個核苷酸之連續核苷酸序列與SEQ ID NO 205之區至少90%互補，諸如完全(或100%)互補。
在一些實施例中，寡核苷酸或其連續核苷酸區與選自由SEQ ID NO 113、114、115、116、117及231組成之群的序列完全(或100%)互補。
在一些實施例中，寡核苷酸或其連續核苷酸區與選自由SEQ ID NO 124-230組成之群的序列完全(或100%)互補。
在一些實施例中，寡核苷酸或其連續核苷酸區與SEQ ID NO 186完全(或100%)互補。
在一些實施例中，寡核苷酸或其連續核苷酸區與SEQ ID NO 192完全(或100%)互補。
在一些實施例中，寡核苷酸或其連續核苷酸區與SEQ ID NO 205完全(或100%)互補。
應理解，寡核苷酸基元序列可經修飾以例如提高對核酸酶之耐性及/或與標靶核酸之結合親和力。修飾描述於定義及「寡核苷酸設計」章節中。
在一些實施例中，本發明之寡核苷酸或其連續核苷酸區與標靶核酸之區完全互補(100%互補)，或在一些實施例中在寡核苷酸與標靶核酸之間可包含一個或兩個失配。在一些實施例中，寡核苷酸或其至少12個核苷酸之連續核苷酸序列與標靶核酸序列至少90%互補，諸如完全(或100%)互補。
在一些實施例中，寡核苷酸或其至少12個核苷酸之連續核苷酸序列與選自由SEQ ID NO 5-111組成之群的序列具有100%一致性。
在一些實施例中，寡核苷酸或其至少14個核苷酸之連續核苷酸序列與選自由SEQ ID NO 5-111組成之群的序列具有100%一致性。
在一些實施例中，寡核苷酸或其至少16個核苷酸之連續核苷酸序列與選自由SEQ ID NO 5-111組成之群的序列具有100%一致性。
在一些實施例中，寡核苷酸或其連續核苷酸區包含選自SEQ ID NO 5-111之序列或由其組成。
在一些實施例中，本發明之寡核苷酸係選自以下群組(注意，標靶子序列為寡核苷酸基元之反向補充)： 或其共軛物；其中對於標題為化合物設計之欄，大寫字母為LNA核苷，小寫字母為DNA核苷，胞嘧啶核苷視情況為5甲基胞嘧啶，且核苷間鍵為至少80%，諸如至少90%或100%經修飾核苷間鍵，諸如硫代磷酸酯核苷間鍵。在一些實施例中，上表中之化合物設計欄中之化合物的所有核苷間鍵為硫代磷酸酯核苷間鍵。基元及標靶子序列序列為核鹼基序列。
本發明提供以下寡核苷酸： 或其共軛物；其中在上表之化合物中，大寫字母表示β-D-氧基LNA核苷，所有LNA胞嘧啶均為5-甲基胞嘧啶(如由上標m 所指示)，小寫字母表示DNA核苷，小寫字母c前之上標m表示5甲基胞嘧啶DNA核苷。所有核苷間鍵為硫代磷酸酯核苷間鍵。
寡核苷酸設計 寡核苷酸設計係指寡核苷酸序列中核苷糖修飾之樣式。本發明之寡核苷酸包含糖經修飾核苷且亦可包含DNA或RNA核苷。在一些實施例中，寡核苷酸包含糖經修飾核苷及DNA核苷。將經修飾核苷併入至本發明之寡核苷酸中可增強寡核苷酸對標靶核酸之親和力。在彼情況下，經修飾核苷可稱作親和力增強經修飾核苷酸。
在一實施例中，寡核苷酸包含至少1個經修飾核苷，諸如至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15或至少16個經修飾核苷。在一實施例中，寡核苷酸包含1至10個經修飾核苷，諸如2至9個經修飾核苷，諸如3至8個經修飾核苷，諸如4至7個經修飾核苷，諸如6或7個經修飾核苷。在一實施例中，本發明之寡核苷酸可包含修飾，該等修飾獨立地選自此等三種類型之修飾(經修飾糖、經修飾核鹼基及經修飾核苷間鍵)或其組合。較佳地，寡核苷酸包含一或多個糖經修飾核苷，諸如2'糖經修飾核苷。較佳地，本發明之寡核苷酸包含一或多個2'糖經修飾核苷，獨立地選自由以下組成之群：2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA、2'-胺基-DNA、2'-氟基-DNA、阿拉伯糖核酸(arabino nucleic acid；ANA)、2'-氟基-ANA及LNA核苷。甚至更佳地，一或多個經修飾核苷為LNA。
在一些實施例中，至少1個經修飾核苷為鎖核酸(LNA)，諸如至少2、諸如至少3、至少4、至少5、至少6、至少7或至少8個經修飾核苷為LNA。在又另一實施例中，所有經修飾核苷為LNA。
在另一實施例中，寡核苷酸包含至少一個經修飾核苷間鍵。在一較佳實施例中，連續核苷酸序列內之核苷間鍵為硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯核苷間鍵。在一些實施例中，寡核苷酸之連續序列中之所有核苷酸間鍵為硫代磷酸酯鍵。
在一些實施例中，本發明之寡核苷酸包含至少一個經修飾核苷，其為2'-MOE-RNA，諸如2、3、4、5、6、7、8、9或10個2'-MOE-RNA核苷單元。在一些實施例中，該等經修飾核苷中之至少一者為2'-氟基DNA，諸如2、3、4、5、6、7、8、9或10個2'-氟基-DNA核苷單元。
在一些實施例中，本發明之寡核苷酸包含至少一個LNA單元，諸如1、2、3、4、5、6、7或8個LNA單元，諸如2至6個LNA單元，諸如3至7個LNA單元，4至8個LNA單元或3、4、5、6或7個LNA單元。在一些實施例中，所有經修飾核苷為LNA核苷。在一些實施例中，所有LNA胞嘧啶單元為5-甲基-胞嘧啶。在一些實施例中，寡核苷酸或其連續核苷酸區在核苷酸序列之5'端具有至少1個LNA單元，且在3'端具有至少2個LNA單元。在一些實施例中，存在於本發明之寡核苷酸中之所有胞嘧啶核鹼基為5-甲基-胞嘧啶。
在一些實施例中，本發明之寡核苷酸包含至少一個LNA單元及至少一個2'經取代修飾之核苷。
在本發明之一些實施例中，寡核苷酸包含2'糖經修飾核苷及DNA單元兩者。
在本發明之一實施例中，本發明之寡核苷酸能夠募集RNase H。
在一些實施例中，本發明之寡核苷酸或其連續核苷酸區為間隔體寡核苷酸。
間隔體設計 在一些實施例中，本發明之寡核苷酸或其連續核苷酸區具有間隔體設計或在本文中亦僅稱為「間隔體」之結構。在間隔體結構中，寡核苷酸包含至少三個相異結構區，5'-側接、間隔及3'-側接，F-G-F'，呈『5→3』定向。在此設計中，側接區F及F' (亦稱為翼區)包含至少一個糖經修飾核苷，該核苷鄰近於區G，且在一些實施例中可包含2-7個糖經修飾核苷之連續延伸，或糖經修飾及DNA核苷之連續延伸(包含糖經修飾及DNA核苷兩者之混合翼)。因此，5'側接區及3'側接區之鄰近間隔區之核苷為糖經修飾核苷，諸如2'經修飾核苷。間隔區G包含在寡核苷酸與HTRA1標靶核酸成雙螺旋體時能夠募集RNase H之核苷酸之連續延伸。在一些實施例中，區G包含5-16個DNA核苷之連續延伸。間隔體區F-G-F'與HTRA1標靶核酸互補，且可因此為寡核苷酸之連續核苷酸區。
側接區G之5'及3'端之區F及F'可包含一或多個親和力增強經修飾核苷。在一些實施例中，3'側接包含至少一個LNA核苷，較佳至少2個LNA核苷。在一些實施例中，5'側接包含至少一個LNA核苷。在一些實施例中，5'及3'側接區均包含LNA核苷。在一些實施例中，側接區中之所有核苷為LNA核苷。在其他實施例中，側接區可包含LNA核苷及其他核苷兩者(混合側接)，諸如DNA核苷及/或非LNA經修飾核苷，諸如2'經取代核苷。在此情形下，間隔定義為具有至少5個RNase H募集核苷(諸如5-16個DNA核苷)，藉由親和力增強經修飾核苷(諸如LNA,諸如β-D-氧基-LNA)側接於5'及3'端之連續序列。
區F 連接至區G之'5端之區F (5'側接或5'翼)包含、含有至少一個糖經修飾核苷或由其組成，諸如至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7個經修飾核苷。在一些實施例中，區F包含1-7個經修飾核苷或由其組成，諸如2至6個經修飾核苷，諸如2至5個經修飾核苷，諸如2至4個經修飾核苷，諸如1至3個經修飾核苷，諸如1、2、3或4個經修飾核苷。
在一實施例中，區F中之一或多個或所有經修飾核苷為2'經修飾核苷。
在另一實施例中，區F中之2'經修飾核苷中之一或多者選自2'-O-烷基-RNA單元、2'-O-甲基-RNA、2'-胺基-DNA單元、2'-氟基-DNA單元、2'-烷氧基-RNA、MOE單元、LNA單元、阿拉伯糖核酸(ANA)單元及2'-氟基-ANA單元。
在本發明之一個實施例中，區F中之所有經修飾核苷為LNA核苷。在另一實施例中，區F中之LNA核苷獨立地選自由以下組成之群：氧基-LNA、硫基-LNA、胺基-LNA、cET及/或ENA，呈β-D或α-L組態或其組合。在一較佳實施例中，區F在連續序列之5'端具有至少1個β-D-氧基LNA單元。
區G 區G (間隔區)可包含、含有5-16個能夠募集RNase H之連續DNA核苷或由該等核苷組成。在另一實施例中，區G包含、含有5至12個、或6至10個或7至9個、諸如8個能夠募集RNase H之連續核苷酸單元或由該等單元組成。
在另一實施例中，區G中之至少一個核苷單元為DNA核苷單元，諸如4至20個或6至18個DNA單元，諸如5至16個。在一些實施例中，區G中之所有核苷為DNA單元。
在其他實施例中，區G可由DNA與能夠介導RNase H裂解之其他核苷之混合物組成。在一些實施例中，區G之至少50%核苷為DNA，諸如至少60%，至少70%或至少80%，或至少90% DNA。
區F' 連接至區G之'3端之區F' (3'側接或3'翼)包含、含有至少一個糖經修飾核苷或由其組成，諸如至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7個經修飾核苷。在一些實施例中，區F'包含1至7個經修飾核苷或由其組成，諸如2至6個經修飾核苷，諸如2至5個經修飾核苷，諸如2至4個經修飾核苷，諸如1至3個經修飾核苷，諸如1、2、3或4個經修飾核苷。
在一實施例中，區F'中之一或多個或所有經修飾核苷為2'經修飾核苷。
在另一實施例中，區F'中之2'經修飾核苷中之一或多者選自2'-O-烷基-RNA單元、2'-O-甲基-RNA、2'-胺基-DNA單元、2'-氟基-DNA單元、2'-烷氧基-RNA、MOE單元、LNA單元、阿拉伯糖核酸(ANA)單元及2'-氟基-ANA單元。
在本發明之一個實施例中，區F'中之所有經修飾核苷為LNA核苷。在另一實施例中，區F'中之LNA核苷獨立地選自由以下組成之群：氧基-LNA、硫基-LNA、胺基-LNA、cET及/或ENA，呈β-D或α-L組態或其組合。在一較佳實施例中，區F'在連續序列之5'端具有至少1個β-D-氧基LNA單元。
區D、D'及D'' 本發明之寡核苷酸包含與標靶核酸互補之連續核苷酸區。在一些實施例中，寡核苷酸可進一步包含相對於連續核苷酸區定位於5'及/或3'之其他核苷酸，其在本文稱為區D。區D'及D"可分別連接至區F之5'端或區F'之3'端。在一些實施例中，D區(區D'或D")可形成與標靶核酸互補之連續核苷酸序列之部分，或在其他實施例中D區可與標靶核酸不互補。
在一些實施例中，本發明之寡核苷酸由連續核苷酸區及視情況存在之1-5個額外5'核苷酸(區D')組成或包含該連續核苷酸區及該等核苷酸。
在一些實施例中，本發明之寡核苷酸由連續核苷酸區及視情況存在之1-5個額外3'核苷酸(區D")組成或包含該連續核苷酸區及該等核苷酸。
區D'或D"可獨立地包含1、2、3、4或5個額外核苷酸，該等核苷酸可與標靶核酸互補或不互補。就此而言，在一些實施例中，本發明之寡核苷酸可包含能夠調節藉由額外核苷酸側接於5'及/或3'端之標靶的連續核苷酸序列。此類額外核苷酸可充當對核酸酶敏感之生物可裂解連接子，且可因而用以將官能基(諸如共軛部分)連接至本發明之寡核苷酸。在一些實施例中，額外5'及/或3'端核苷酸與磷酸二酯鍵鍵聯，且可為DNA或RNA。在另一實施例中，額外5'及/或3'端核苷酸為經修飾之核苷酸，其可例如經包括以增強核酸酶穩定性或用於合成之簡易性。在一些實施例中，本發明之寡核苷酸包含區D'及/或D"以及連續核苷酸區。
在一些實施例中，本發明之間隔體寡核苷酸可由下式表示： F-G-F'；尤其F1-7 -G4-12 -F'1-7 D'-F-G-F'，尤其D'1-3 -F1-7 -G4-12 -F'1-7 F-G-F'-D''，尤其F1-7 -G4-12 -F'1-7 -D''1-3 D'-F-G-F'-D''，尤其D'1-3 -F1-7 -G4-12 -F'1-7 -D''1-3
製造方法 在另一態樣中，本發明提供用於製造本發明之寡核苷酸的方法，其包含使核苷酸單元反應且由此形成包含於寡核苷酸中之共價鍵聯連續核苷酸單元。較佳地，方法使用亞磷醯胺化學方法(參見例如Caruthers等人, 1987, Methods in Enzymology, 第154卷, 第287-313頁)。在另一實施例中，方法進一步包含使連續核苷酸序列與共軛部分(配位體)反應。在另一態樣中，提供用於製造本發明之組合物的方法，其包含將本發明之寡核苷酸或共軛寡核苷酸與醫藥學上可接受之稀釋劑、溶劑、載劑、鹽及/或佐劑混合。
醫藥鹽 對於作為治療性之用途，本發明之寡核苷酸可以適合醫藥鹽之形式提供，諸如鈉鹽或鉀鹽。在一些實施例中，本發明之寡核苷酸為鈉鹽。
醫藥組合物 在另一態樣中，本發明提供醫藥組合物，其包含前述寡核苷酸及/或寡核苷酸共軛物中之任一者及醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑、鹽及/或佐劑。醫藥學上可接受之稀釋劑包括磷酸鹽-緩衝鹽水(PBS)及醫藥學上可接受之鹽，包括但不限於鈉鹽及鉀鹽。在一些實施例中，醫藥學上可接受之稀釋劑為無菌磷酸鹽緩衝鹽水。在一些實施例中，寡核苷酸用於濃度為50-300 µM溶液之醫藥學上可接受之稀釋劑中。在一些實施例中，本發明之寡核苷酸以10-1000 µg之劑量投與。
WO 2007/031091提供醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑及佐劑之適合及較佳實例(以引用之方式併入本文中)。WO2007/031091中亦提供適合之劑量、調配物、投與途徑、組合物、劑型、與其他治療劑之組合、前藥調配物。
本發明之寡核苷酸或寡核苷酸共軛物可與醫藥學上可接受之活性或惰性物質混合以用於製備醫藥組合物或調配物。用於調配醫藥組合物之組合物及方法視多個指標而定，包括但不限於投與途徑、疾病程度或待投與之劑量。
在一些實施例中，本發明之寡核苷酸或寡核苷酸共軛物為前藥。特定言之，關於寡核苷酸共軛物，一旦前藥傳遞至作用部位(例如靶細胞)，共軛部分自寡核苷酸裂解。
應用 本發明之寡核苷酸可用作例如診斷、治療及防治之研究試劑。
在研究中，此類寡核苷酸可用以特異性調節細胞(例如，活體外細胞培養物)及實驗動物中HTRA1蛋白質之合成，由此有助於對標靶之功能分析或評估其作為治療性干預之標靶的有效性。通常，標靶調節藉由降低或抑制mRNA生成蛋白質，由此防止蛋白質形成來實現，或藉由降低或抑制基因或mRNA生成蛋白質的調節劑來實現。
在診斷中，寡核苷酸可用以藉由北方墨點法(northern blotting)、原位雜交或類似技術偵測及定量細胞及組織中之HTRA1表現。
對於治療，疑似患有疾病或病症之動物或人類可藉由調節HTRA1表現來治療。
本發明提供用於治療或預防疾病之方法，其包含向患有疾病或對疾病敏感之個體投與治療或預防有效量的本發明之寡核苷酸、寡核苷酸共軛物或醫藥組合物。
本發明亦係關於如本文所定義用作藥物之寡核苷酸、組合物或共軛物。
根據本發明之寡核苷酸、寡核苷酸共軛物或醫藥組合物通常以有效量投與。
本發明亦提供本發明之寡核苷酸或寡核苷酸共軛物之用途，如所描述用於製造供用於治療如本文中所提及之病症的藥物，或提供用於治療如本文中所提及的如病症的方法。
如本文中所提及之疾病或病症與HTRA1之表現相關。在一些實施例中，疾病或病症可與HTRA1基因中或蛋白質產物與HTRA1相關或相互作用的基因中之突變相關。因此，在一些實施例中，標靶核酸為HTRA1序列之突變形式，且在其他實施例中，標靶核酸為HTRA1序列之調控因子。
本發明之方法較佳用於治療或防治由HTRA1之異常水準及/或活性導致的疾病。
本發明進一步係關於如本文所定義之寡核苷酸、寡核苷酸共軛物或醫藥組合物之用途，其用於製造用於治療HTRA1之異常水準及/或活性的藥物。
在一個實施例中，本發明係關於寡核苷酸、寡核苷酸共軛物或醫藥組合物，其用於治療選自以下之疾病或病症：眼部病症，諸如黃斑變性，包括年齡相關黃斑變性(AMD)，諸如乾性AMD或濕性AMD，及糖尿病性視網膜病變。在一些實施例中，本發明之寡核苷酸共軛物或醫藥組合物可用於治療地圖狀萎縮或中期dAMD。在阿茲海默氏病及帕金森氏病中亦已指示HTRA1，且因此在一些實施例中，本發明之寡核苷酸共軛物或醫藥組合物可用於治療阿茲海默氏病或帕金森氏病。在杜興氏肌肉萎縮症、諸如骨關節炎之關節炎、家族性缺血性大腦小血管疾病中亦已指示HTRA1，且因此在一些實施例中，本發明之寡核苷酸共軛物或醫藥組合物可用於治療杜興氏肌肉萎縮症、諸如骨關節炎之關節炎或家族性缺血性大腦小血管疾病。
投藥 本發明之寡核苷酸或醫藥組合物可局部(諸如，至皮膚、吸入、經眼或經耳)、或經腸(諸如，經口或藉由胃腸道)或非經腸(諸如，靜脈內、皮下、肌肉內、腦內、腦室內或鞘內)投與。
在一些實施例中，本發明之寡核苷酸、共軛物或醫藥組合物藉由非經腸途徑投與，包括靜脈內、動脈內、皮下、腹膜內或肌肉內注射或輸注、鞘內或顱內、例如腦內或室內投與。在一些實施例中，活性寡核苷酸或寡核苷酸共軛物經靜脈內投與。在另一實施例中，活性寡核苷酸或寡核苷酸共軛物經皮下投與。
對於用於治療眼部病症，諸如黃斑變性，例如AMD (濕性或乾性)，可使用眼內注射。
在一些實施例中，本發明之化合物或其醫藥學上可接受之鹽經由眼內注射，以每眼約10 µg至約200 µg，諸如每眼約50 µg至約150 µg，諸如每眼約100 µg之劑量投與。在一些實施例中，劑量區間，亦即連續給藥之間的時間段為至少每月一次，諸如至少每兩月一次，或至少每三月一次。
組合療法 在一些實施例中，本發明之寡核苷酸、寡核苷酸共軛物或醫藥組合物用於與另一種治療劑組合治療。治療劑可例如為用於上文所描述之疾病或病症之護理的標準物。
實例 材料及方法寡核苷酸合成 寡核苷酸合成在此項技術中總體上已知。下方為可應用之方案。本發明之寡核苷酸已藉由在所用設備、載體及濃度方面略微改變方法而製備。
寡核苷酸使用亞磷醯胺方法在Oligomaker 48上在尿苷通用載體上以1 μmol等級合成。在合成結束時，在60℃下使用氨水持續5-16小時使寡核苷酸自固體載體裂解。寡核苷酸藉由逆相HPLC (RP-HPLC)或固相提取純化，且藉由UPLC特徵化，且分子量藉由ESI-MS進一步確認。
寡核苷酸之延長 ： β-氰基乙基-亞磷醯胺之偶合(DNA-A(Bz)、DNA-G(ibu)、DNA-C(Bz)、DNA-T、LNA-5-甲基-C(Bz)、LNA-A(Bz)、LNA-G(dmf)、LNA-T)藉由使用0.1 M之5'-O-DMT-受保護亞醯胺於乙腈中之溶液及含DCI (4,5-二氰基咪唑)之乙腈(0.25 M)作為活化劑來進行。對於最終循環，可使用具有所需修飾之亞磷醯胺，例如用於連接共軛基團或共軛基團本身之C6連接子。用於引入硫代磷酸酯鍵之硫醇化藉由使用氫化黃原素(xanthane hydride) (0.01 M於9:1之乙腈/吡啶中)進行。磷酸二酯鍵可使用含0.02 M碘之7:2:1之THF/吡啶/水引入。剩餘試劑為通常用於寡核苷酸合成之試劑。
對於後固相合成共軛，在固相合成之最終循環中可使用市售C6胺基連接子亞磷醯胺，且在去除保護基及自固體載體裂解之後，胺基鍵聯之去保護寡核苷酸經分離。共軛物經由使用標準合成方法活化官能基來引入。
藉由 RP - HPLC 純化 ： 粗製化合物藉由製備型RP-HPLC在Phenomenex Jupiter C18 10 µ 150 × 10 mm管柱上純化。0.1 M pH 8之乙酸銨及乙腈以5 mL/min之流動速率用作緩衝液。將所收集之部分凍乾，得到通常呈白色固體狀之經純化化合物。
縮寫： DCI: 4,5-二氰基咪唑 DCM: 二氯甲烷 DMF: 二甲基甲醯胺 DMT: 4,4'-二甲氧基三苯甲基 THF: 四氫呋喃 Bz: 苯甲醯基 Ibu: 異丁醯基 RP-HPLC: 反相高效液相層析
Tm 分析 ： 寡核苷酸及RNA標靶(磷酸酯鍵聯，PO)雙螺旋體在500 ml無RNase之水中稀釋至3 mM，且與500 ml 2 × Tm -緩衝液(200 mM NaCl、0.2 mM EDTA、20 mM磷酸鈉，pH 7.0)混合。溶液加熱至95℃ 3 min且隨後使其在室溫下退火30 min。雙螺旋體熔融溫度(Tm )在配備有帕爾貼(Peltier)溫度程式設計器PTP6之Lambda 40 UV/VIS分光光度計上使用PE Templab軟體(Perkin Elmer)量測。溫度自20℃斜升至95℃且隨後降至25℃，記錄260 nm處之吸光值。熔融及退火兩者之一階導數及局部最大值用以分析雙螺旋體Tm 。
所使用之寡核苷酸： 對於化合物：大寫字母表示LNA核苷(使用β-D-氧基LNA核苷)，所有LNA胞嘧啶均為5-甲基胞嘧啶，小寫字母表示DNA核苷，前有上標m 之DNA胞嘧啶表示5-甲基C-DNA核苷。所有核苷間鍵為硫代磷酸酯核苷間鍵。在EP16177508.5及EP17170129.5中將化合物A揭示為化合物143,1且將化合物B揭示為化合物145,1，且用作陽性對照化合物。
實例 1 . 在 單一濃度下測試 LNA 寡核苷酸在 U251 細胞株中之活體外功效。 針對HTRA1鑑別有前景之「熱點」區。在U251細胞株中以5µM篩選治療6天之n = 231個HTRA1 LNA寡核苷酸庫。自此庫，吾等鑑別如圖1中所展示之位置53113-53384之間的靶向人類HTRA1 前體mRNA之一系列活性寡核苷酸(SEQ ID NO 116或117)。
人類神經膠母細胞瘤U251細胞株購自ECACC且如由供應商所推薦在37℃下維持於具有5% CO2 的含濕氣培育箱中。針對分析，在饑餓培養基(由供應商推薦之培養基，除1% FBS而非10%以外)中在96多孔盤中接種15000個U251細胞/孔。在添加溶解於PBS中之寡核苷酸之前，培育細胞24小時。寡核苷酸濃度：5 µM。在添加寡核苷酸3-4天之後，移除培養基且添加新培養基(無寡核苷酸)。在添加寡核苷酸6天之後，收集細胞。RNA使用PureLink Pro 96 RNA純化套組(Ambion，根據製造商說明)提取。cDNA隨後使用M-MLT逆轉錄酶、無規十聚體(decamer) RETROscript、RNase抑制劑(Ambion，根據製造商說明)及100mM dNTP組PCR級(Invitrogen)以及無DNase/RNase之水(Gibco)來合成。對於基因表現分析，qPCR使用TagMan Fast Advanced Master Mix (2X) (Ambion)在doublex設置中進行。針對qPCR使用以下TaqMan引子分析：HTRA1，Hs01016151_m1 (FAM-MGB)及管家基因，TBP， Hs4326322E (VIC-MGB)，來自Life Technologies。n = 2次獨立的生物重複。將表中之剩餘HTRA1 mRNA表現量展示為對照(經PBS處理之細胞)之%。
實例 2 . 在 單一濃度下測試 LNA 寡核苷酸在 U251 細胞株中之活體外功效。 在呈5 µM之U251細胞株中篩選之新的n = 210個HTRA1 LNA寡核苷酸庫中進一步驗證描述於實例1中之「熱點」區53113-53384。n = 33個LNA寡核苷酸靶向位置53113-53384之間的人類HTRA1 前體mRNA，且此等寡核苷酸與如圖2中所展示之其餘寡核苷酸相比為相對活性的。
如實例1中所描述進行分析。n = 2次獨立的生物重複。在表中將剩餘HTRA1 mRNA表現量展示為對照(經PBS處理之細胞)之%。
實例 3 . 在 單一濃度下測試 LNA 寡核苷酸在 U251 及 ARPE19 細胞株中之活體外功效。 在分別呈5 µM及25 µM之U251及ARPE19細胞株中篩選之新的n = 305個HTRA1 LNA寡核苷酸庫中進一步驗證描述於實例1及2中之「熱點」區53113-53384。n = 95個LNA寡核苷酸靶向位置53113-53384之間的人類HTRA1 前體mRNA，且此等寡核苷酸與如圖3中所展示之其餘寡核苷酸相比為相對活性的。
人類視網膜色素上皮ARPE19細胞株購自ATCC且在37℃下維持於含DMEM-F12 (Sigma，D8437)、10% FBS、1%青黴素/鏈黴素(pen/strep)之具有5% CO2 的含濕氣培育箱中。U251細胞株描述於實例1中。針對分析，在供應商推薦之培養基中在96多孔盤中接種2000個U251或ARPE19細胞/孔。在添加溶解於PBS中之寡核苷酸之前，培育細胞2小時。寡核苷酸之濃度在U251及ARPE19細胞中分別為5及25 µM。在添加寡核苷酸4天之後，收集細胞。RNA提取如實例1中所描述進行，cDNA合成及qPCR使用qScript XLT一步RT-qPCR ToughMix Low ROX，95134-100 (Quanta Biosciences)進行。針對U251及ARPE19細胞在douplex設置中使用以下TaqMan引子分析：HTRA1，Hs01016151_m1 (FAM-MGB)及管家基因，GAPDH，Hs4310884E (VIC-MGB)。所有引子組皆購自Life Technologies。n = 1次生物重複。將表中之相對HTRA1 mRNA表現量展示為對照(經PBS處理之細胞)之%。
實例 4 . 在劑量反應曲線中測試所選擇化合物 在 U251 及 ARPE19 細胞株中之活體外效力及功效。 U251及ARPE19細胞株分別描述於實例1及3中。如實例1中所描述進行U251分析。ARPE19分析如下進行：在由供應商所推薦之培養基(除5% FBS而非10%以外)中在96多孔盤中接種5000個ARPE19細胞/孔。在添加溶解於PBS中之寡核苷酸之前，培育細胞2小時。寡核苷酸濃度：自50 µM，半對數稀釋，8個點。在添加寡核苷酸4天之後，收集細胞。實例1中所描述進行RNA提取、cDNA合成及qPCR如。n = 2次獨立的生物重複。將表中之50 µM下之EC50值及剩餘HTRA1 mRNA水準展示為對照(PBS)之%。
實例 5 . 在劑量反應曲線中測試所選擇化合物 在 U251 及 ARPE19 細胞株中之活體外效力及功效。 如實例3中所描述進行分析。寡核苷酸濃度：自50 µM，半對數稀釋，8個點。分別針對U251及ARPE19，n = 2個及n = 1次獨立的生物重複。將表中之50 µM下之EC50值及剩餘HTRA1 mRNA水準展示為對照(PBS)之%。
實例 6 . 在劑量反應曲線中測試所選擇化合物 在 U251 細胞株中之活體外效力及功效。 如實例3中所描述進行分析。寡核苷酸濃度：自50 µM，半對數稀釋，8個點。n = 2次獨立的生物重複。將表中之50 µM下之EC50值及剩餘HTRA1 mRNA水準展示為對照(PBS)之%。
實例 7 . 在劑量反應曲線中測試所選擇化合物在 U251 細胞株中之活體外效力及功效。 ARPE19細胞株描述於實例3中。針對分析，在饑餓培養基(如由供應商推薦之培養基，除1%FBS而非10%以外)中在96多孔盤中以100 µL接種ARPE19細胞，24000個細胞/孔。在添加溶解於PBS中之寡核苷酸之前，培育細胞2小時。寡核苷酸濃度：自50 µM，半對數稀釋，8個點。在添加寡核苷酸化合物第4天及個7天之後，將無寡核苷酸之75 µL新鮮饑餓培養基添加至細胞(無需移除舊培養基)。如實例3中所描述進行RNA提取、cDNA合成及qPCR。n = 2次獨立的生物重複。將表中之50 µM下之EC50值及剩餘HTRA1 mRNA水準展示為對照(PBS)之%。
實例 8. 測試在人類初級 RPE 細胞中之活體外功效。 人類初級視網膜色素上皮(hpRPE)細胞購自Sciencell (目錄號6540)。針對分析，在培養基(EpiCM，Sciencell目錄號4101)中在經層黏連蛋白(層黏連蛋白521，BioLamina目錄號LN521-03)塗佈之96多孔盤中接種5000個hpRPE細胞/孔。其藉由此培養基擴增一週，且使用以下培養基分化2週：補充有N1補充劑(Sigma目錄號N-6530)、麩醯胺酸-青黴素-鏈黴素(Sigma目錄號G-1146)、非必需胺基酸(NEAA，Sigma目錄號M-7145)、牛磺酸(Sigma目錄號T-0625)、氫皮質酮(Sigma目錄號H-03966)、三碘-甲狀腺胺酸(Sigma目錄號T-5516)及牛血清白蛋白(BSA，Sigma目錄號A-9647)之MEM α培養基(Sigma目錄號M-4526)。在37℃下在具有5% CO2 之含濕氣培育箱中培養細胞。
在實驗當天，細胞用新鮮分化培養基培育1小時，隨後添加寡核苷酸。此等寡核苷酸溶解於PBS中且在第0天及第4天塗覆於細胞上。在第7天，改變培養基，且在第10天，用具有β-氫硫基-乙醇(Qiagen目錄號79216)之50 µl RLT緩衝液收集細胞。RNA之提取根據Qiagen RNeasy微型套組(目錄號74104；批號151048073)之使用者手冊進行，該微型套組包括DNase I處理(目錄號79254；批號151042674)。RNA品質控制藉由Agilent生物分析儀奈米套組(Agilent；目錄號5067-1511；批號1446)進行。總RNA逆轉錄成cDNA (cDNA合成)使用基於無規六聚體寡核苷酸之高容量cDNA逆轉錄套組，根據製造商說明(Thermo Fisher Scientific，目錄號4368814，批號00314158)進行。cDNA樣品之量測以一式三份在7900HT即時PCR儀器(Thermo Fisher Scientific)上在384孔盤形式中進行。針對qPCR使用以下TaqMan引子分析：HTRA1，Hs01016151_m1及Hs00170197_m1，管家基因，GAPDH，Hs99999905_m1及PPIA，Hs99999904_m1，來自Life Technologies。n = 3次生物重複。將圖4及下表中之剩餘HTRA1 mRNA表現量展示為對照(PBS)之%。
實例 9 . 食蟹獼猴活體內藥代動力學及藥力學研究， 21 天治療，玻璃體內 ( IVT ) 注射，單次劑量。 針對在位置53113-53384之間靶向人類HTRA1前體mRNA中之「熱點」的3種HTRA1 LNA寡核苷酸，在視網膜中之mRNA水準下及在視網膜及玻璃體中之蛋白質水準下觀測到阻斷基因表現(參見圖5)。
動物 所有實驗皆對食蟹獼猴(Cynomolgus monkey/Macaca fascicularis ) 執行。
四隻動物包括於研究之各組中，總共20隻動物。
化合物及給藥程序 丁基原啡因鎮痛在測試化合物注射之前及兩天之後投與。動物藉由肌肉內注射氯胺酮及甲苯噻嗪麻醉。在研究第1天在局部施用四卡因(tetracaine)麻醉劑之後在麻醉動物兩個眼中玻璃體內投與測試物件及陰性對照(PBS) (每次投與50 µL)。
安樂死 在活體階段結束時(第22天)，所有猴藉由腹膜內注射過度劑量戊巴比妥安樂死。
寡核苷酸含量量測及藉由 qPCR 之 Htra1 RNA 表現之量化 緊接在安樂死之後，在冰上快速且謹慎地解剖出眼組織且儲存於-80℃下直至運送為止。視網膜樣品溶解於700 µL MagNa純96 LC RNA分離組織緩衝劑中，且藉由每2 ml管添加1個不鏽鋼珠粒，使用precellys evolution均質機均質化2 × 1,5 min，隨後在RT下培育30 min。樣品以13000 rpm離心5 min。保留一半用於生物分析，且針對另一半直接繼續RNA提取。
對於生物分析，將樣品稀釋10-50倍用於藉由雜交ELISA方法之寡核苷酸含量量測。生物素標記之LNA擷取探針及地高辛(digoxigenin)-共軛LNA偵測探針(兩者均為35 nM於5×SSCT中，各者與待偵測之LNA寡核苷酸的一個末端互補)與經稀釋之勻漿或相關之標準物混合，在室溫下培育30分鐘，且隨後添加至經抗生蛋白鏈菌素(streptavidine)塗佈之ELISA盤(Nunc目錄號436014)。
盤在室溫下培育1小時，在2×SSCT (300 mM氯化鈉、30 mM檸檬酸鈉及0.05% v/v Tween-20，pH 7.0)中洗滌。擷取之LNA雙螺旋使用與鹼性磷酸酶(Roche Applied Science目錄號11093274910)共軛之抗DIG抗體及鹼性磷酸酶基質系統(Blue Phos基質，KPL產品碼50-88-00)偵測。寡核苷酸錯合物之量在Biotek讀取器上量測為615 nm下之吸收度。
對於RNA提取，在MagNA純96系統中藉由程式：Tissue FF標準LV3.1根據製造商說明使用細胞RNA大容量套組(05467535001，Roche)，包括DNAse處理。RNA品質控制及濃度用Eon讀取器(Biotek)量測。RNA濃度在整個樣品中標準化，且後續cDNA合成及qPCR在一步反應中使用qScript XLT一步RT-qPCR ToughMix Low ROX，95134-100 (Quanta Biosciences)進行。在singplex反應中使用以下TaqMan引子分析：Htra1，Mf01016150_，Mf01016152_m1及Rh02799527_m1及管家基因，ARFGAP2，Mf01058488_g1及Rh01058485_m1，及ARL1，Mf02795431_m1，來自Life Technologies。qPCR分析在ViiA7機器(Life Technologies)上執行。眼/組：n = 3隻眼。各眼視為單獨樣品。將相對Htra1 mRNA表現量展示為對照(PBS)之%。
組織結構 移除眼球且固定於10%中性緩衝福馬林中24小時，修整且嵌入於石蠟中。
針對ISH分析，福馬林固定、嵌入石蠟之視網膜組織4 μm厚截面使用完全自動化Ventana Dicovery ULTRA染色模組(程序：mRNA Discovery Ultra Red 4.0 - v0.00.0152)使用RNAscope 2.5 VS 探針-Mmu-HTRA1，REF 486979，Advanced Cell Diagnostics, Inc.處理。所使用色原體為堅牢紅(Fastred)，蘇木精II對比染色。
使用盤基免疫沈澱質譜分析 ( IP - MS ) 方法之 HTRA1 蛋白質量化 樣品製備 ， 視網膜 視網膜在具有蛋白酶抑制劑(完全無EDTA，Roche)之4個體積(w/v)之RIPA緩衝液(50 mM Tris-HCl，pH 7.4，150 mM NaCl，0.25%去氧膽酸，1% NP-40，1 mM EDTA，Millipore)中使用Precellys 24 (5500，15 s，2次循環)均質化。將勻漿離心(13,000 rpm，3 min)且測定上清液之蛋白質含量(Pierce BCA蛋白質分析)。
樣品製備，玻璃體 玻璃體液(300 μl)用具有蛋白酶抑制劑(完全無EDTA，Roche)之5 × RIPA緩衝液(最終濃度：50 mM Tris-HCl，pH 7.4，150 mM NaCl，0.25%去氧膽酸，1% NP-40，1 mM EDTA)稀釋，且使用Precellys 24 (5500，15 s，2次循環)均質化。將勻漿離心(13,000 rpm，3 min)且測定上清液之蛋白質含量(Pierce BCA蛋白質分析)。
盤基 HTRA1 免疫沈澱及胰蛋白酶分解 96孔盤(Nunc MaxiSorp)塗佈有抗HTRA1小鼠單株抗體(R&D MAB2916，於50 μl PBS中500奈克/孔)且在4℃下培育隔夜。盤用PBS (200 μl)洗滌兩次，且在20℃下藉由於PBS中之3% (w/v) BSA阻斷30 min，隨後兩次PBS洗滌。使樣品(於50 μl PBS中75 μg視網膜、100 μg玻璃體)隨機化且添加至盤，隨後在振盪器(150 rpm)上在4℃下隔夜培育。盤隨後用PBS洗滌兩次且用水洗滌一次。隨後將於50 mM TEAB (30 μl)中之10 mM DTT添加至各孔，隨後在20℃下培育1 h，以減少半胱胺酸硫氫基。隨後將於50 mM TEAB (5 μl)中之150 mM碘乙醯胺添加至各孔，隨後在20℃下在暗處培育30 min，以便阻斷半胱胺酸硫氫基。將10 μl分解溶液添加至各孔(最終濃度：1.24 ng/μl胰蛋白酶，20 fmol/μl BSA肽，26 fmol/μl同位素標記之HTRA1肽，1 fmol/μl iRT肽，Biognosys)，隨後在20℃下培育隔夜。
藉由 靶向質譜分析 ( 所選擇反應監測， SRM ) 之 HTRA1 肽量化 質譜分析在耦接至TSQ Quantiva三重四極質譜儀(Thermo Scientific)之Ultimate RSLCnano LC上進行。樣品(20 μL)直接自96孔盤注射用於IP，且在加樣緩衝液(0.5% v/v甲酸，2% v/v ACN)中以5 μL/min持續6 min裝載於Acclaim Pepmap 100阱管柱(100 μm × 2 cm，C18，5 μm，100 Å，Thermo Scientific)上。肽隨後在PepMap Easy-SPRAY分析型管柱(75 μm × 15 cm，3 μm，100 Å，Thermo Scientific)上分解，其中積體電噴射發射器使用以下梯度以250 nL/min之速率加熱至40℃：6 min，98%緩衝液A (2% ACN，0.1%甲酸)，2%緩衝液B (ACN + 0.1%甲酸)；36 min，30%緩衝液B；41 min，60%緩衝液B；43 min，80%緩衝液B；49 min，80%緩衝液B；50 min，2%緩衝液B。TSQ Quantiva在SRM模式下用以下參數操作：循環時間，1.5 s；噴射電壓，1800 V；碰撞氣體壓力，2毫托(mTorr)；Q1及Q3解析度，0.7 FWHM；離子轉移管溫度300℃。針對HTRA1肽「LHRPPVIVLQR」及同位素標記(L-[U-13C, U-15N]R)合成型式(其使用內標)獲取SRM躍遷。
使用Skyline 3.6版進行資料分析。
西方墨點法 0.5 Precellyses管(CK14_0.5ml，Bertin Technologies)中之解剖視網膜樣品經裂解且在具有蛋白酶抑制劑(完全無EDTA蛋白酶-抑制劑微型，11 836 170 001，Roche)之RIPA溶胞緩衝液(20-188，Milipore)中均質化。
添加至0.5 Precellyses管(CK14_0.5ml，Bertin Technologies)中之玻璃體樣品經裂解且在具有蛋白酶抑制劑(完全無EDTA蛋白酶-抑制劑微型，11 836 170 001，Roche)之1/4 × RIPA溶胞緩衝液(20-188，Milipore)中均質化。
樣品(視網膜20 µg蛋白質，玻璃體40 µg蛋白質)在還原條件下在4-15%梯度凝膠(#567-8084 Bio-Rad)分析且使用來自Bio-Rad之Trans-Blot Turbo裝置轉移至硝化纖維素(#170-4159 Bio-Rad)。
初級抗體：家兔抗人類HTRA1 (SF1)為Sascha Fauser (University of Cologne)所贈，小鼠抗人類Gapdh (#98795 Sigma-Aldrich)。二級抗體：山羊抗家兔800CW及山羊抗小鼠680RD來自Li-Cor。
墨點經成像且在來自Li-Cor之Odyssee CLX上分析。
實例 10 - 食蟹獼猴活體內評定 ： 水樣液中之 HTRA1 蛋白質測定及與視網膜中之 HTRA1 mRNA 及蛋白質抑制的比較 實驗方法：參見上文實例。採用水樣液樣品，且樣品根據實例9製備為玻璃體液樣品。食蟹獼猴水樣液樣品(AH)以分析方法學上之基於大小分析法進行分析：毛細電泳法系統(Peggy SueTM ，Proteinsimple)。
樣品在冰上解凍且未經稀釋使用。對於量化，重組型HTRA1-S328A突變體(Origene #TP700208)。如由提供者所描述製備。
初級家兔抗人類HTRA抗體SF1由教授Dr.Sascha Fauser提供且稀釋1:300使用。所有其他試劑均來自Proteinsimple。
樣品以技術一式三份處理，校準曲線一式兩份地使用12-230 kDa分離模組。使用Xlfit (IDBS軟體)計算且分析峰下之面積。
結果
注意-圖12至圖14中所展示之化合物ID利用不同編號系統作為實例之其餘部分。與用於先前實例及本文中其他處之圖號相比，上表提供編號使用之圖12至圖14的關鍵。
圖12A展示用化合物B及#73,1投藥之猴的水樣液中之HTRA1蛋白質水準之視覺顯示，其中樣品在注射後第3天、第8天、第15天及第22天取得。圖12B提供用於計算HTRA1蛋白質水準之校準曲線。圖12C提供在注射後針對時間描繪之個別動物之水樣液的經計算HTRA1水準。
圖13說明水樣液中之HTRA1蛋白質的水準與視網膜中之HTRA1 mRNA的水準之間的直接相關性。水樣液HTRA1蛋白質水準可因此用作HTRA1視網膜mRNA水準或HTRA1視網膜mRNA抑制之生物標記。
圖14說明視網膜中之HTRA1蛋白質水準與水樣液中的HTRA1蛋白質水準之間亦存在相關性，儘管在此實驗中，相關性並不如視網膜中之HTRA1 mRNA抑制與水樣液中的HTRA1蛋白質水準之間的相關性一樣強，從而指示水樣液HTRA1蛋白質水準尤其適合作為HTRA1 mRNA拮抗劑之生物標記。
圖 1 . 在呈5 µM 之U251細胞株中篩選n = 231個HTRA1 LNA寡核苷酸庫。剩餘HTRA1 mRNA表現量藉由qPCR來量測且展示為對照百分比(經PBS處理之細胞)。位於位置53113-53384之間的n = 10個寡核苷酸為相對活性的。圖 2 . 在呈5 µM 之U251細胞株中篩選n = 210個HTRA1 LNA寡核苷酸庫。剩餘HTRA1 mRNA表現量藉由qPCR來量測且展示為對照百分比(經PBS處理之細胞)。位於位置53113-53384之間的n = 33個寡核苷酸為相對活性的。圖 3 .在分別呈5及25 µM之U251及ARPE19細胞株中篩選n = 305個HTRA1 LNA寡核苷酸庫。剩餘HTRA1 mRNA表現量藉由qPCR來量測且展示為對照百分比(經PBS處理之細胞)。位於位置53113-53384之間的n = 95個寡核苷酸與其餘部分相比為相對活性的。圖 4 . 在用LNA寡核苷酸處理人類初級RPE細胞(處理10天)後HTRA1 mRNA水準之劑量反應。亂序的為具有不與Htra1標靶序列相關之亂序序列的對照寡核苷酸。圖 5 . NHP PK/PD研究，IVT投與，25微克/眼睛。A)藉由qPCR在視網膜中量測之HTRA1 mRNA水準。B)藉由寡核苷酸ELISA量測之視網膜中之寡核苷酸含量。C)藉由ISH說明之HTRA1 mRNA水準。D-E)藉由IP-MS量化分別在視網膜及玻璃體中之HTRA1蛋白質水準。點展示個別動物之資料。誤差條展示技術複本(n = 3)之標準差。F-G)藉由西方墨點說明之分別在視網膜及玻璃體中之HTRA1蛋白質水準的減少。圖 6 . 本發明之化合物(化合物ID NO 67,1)。化合物可呈醫藥鹽之形式，諸如鈉鹽或鉀鹽。圖 7 . 本發明之化合物(化合物ID NO 86,1)。化合物可呈醫藥鹽之形式，諸如鈉鹽或鉀鹽。圖 8 . 本發明之化合物(化合物ID NO73,1)。化合物可呈醫藥鹽之形式，諸如鈉鹽或鉀鹽。圖 9 . 化合物67,1之醫藥鹽之實例：M+為適合陽離子，通常為正金屬離子，諸如鈉或鉀離子。陽離子與寡核苷酸陰離子之化學計量比將視所用陽離子之電荷而定。適合地，陽離子具有一個、兩個或三個正電荷(可使用M+ 、M++ 或M+++ )。出於說明性目的，與諸如Ca2 + 之二價陽離子相比，需要兩倍的單+電荷陽離子(單價)，諸如Na+ 或K+ 。圖 10 . 化合物86,1之醫藥鹽之實例：參見用於描述陽離子M+ 之圖9的圖例。圖 11 . 化合物73,1之醫藥鹽之實例：參見用於描述陽離子M+ 之圖9的圖例。圖 12A . 將化合物#15,3及#17玻璃體內投與於食蟹獼猴(cynomolgus monkey)中，且在注射後第3、8、15及22天時收集水樣液樣品。藉由毛細電泳法使用Peggy Sue裝置(Protein Simple)分析來自未經稀釋樣品之蛋白質。使用訂製多株家兔抗血清檢測HTRA1。呈現來自動物#J60154 (媒劑)、J60158 (C.Id#15,3)、J60162 (C.Id#17)之資料。圖 12B . 藉由與經純化重組型(S328A突變) HTRA1蛋白質(Origene, #TP700208)比較來量化信號強度。此處展示校準曲線。圖 12C . 上部圖：針對注射後時間繪製來自個別動物之經計算HTRA1水樣液濃度。下部圖：測定在各時間點處媒劑組之平均HTRA1濃度及經計算之經治療動物中之對應相對濃度。空心圓：個別值，實心圓：組平均值。指示第22天HTRA1減少百分比。圖 13 . 針對用靶向HTRA1轉錄物之各種LNA分子治療的食蟹獼猴中之水樣液(藍色菱形)或視網膜(紅光方形)中之HTRA1蛋白質水準繪製HTRA1 mRNA。值表述為經PBS對照組標準化之百分比。圖 14 . 水樣液中之HTRA1蛋白質與(A)視網膜中之HTRA1蛋白質及(B)用靶向HTRA1轉錄物的各種LNA分子治療之食蟹獼猴中之視網膜中之HTRA1 mRNA的相關性。值表述為經PBS對照組標準化之百分比。

Claims (30)

  1. 一種長度為10-30個核苷酸之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸靶向HTRA1核酸且包含與SEQ ID NO 113至少90% (諸如100%)互補之10-22個核苷酸的連續核苷酸區。
  2. 如請求項1之反義寡核苷酸，其中該連續核苷酸區與選自由SEQ ID NO 231、186、192及205組成之群的序列完全互補。
  3. 如請求項1或2之反義寡核苷酸，其中該連續核苷酸區包含與選自由SEQ ID NO 124-230組成之群的序列完全互補之至少12個連續核苷酸。
  4. 如請求項1或2之反義寡核苷酸，其中該連續核苷酸區包含與SEQ ID NO 113完全互補之至少12個連續核苷酸。
  5. 如請求項1或2之反義寡核苷酸，其中該連續核苷酸區包含與SEQ ID NO 113完全互補之至少14個連續核苷酸。
  6. 如請求項1或2之反義寡核苷酸，其中該寡核苷酸之該連續核苷酸區由選自SEQ ID NO 67、73及86中之任一者的序列或其至少12個連續核苷酸組成或包含該序列或該等連續核苷酸。
  7. 如請求項1或2之反義寡核苷酸，其中該寡核苷酸之該連續核苷酸區包含一或多個2'糖經修飾之核苷，諸如獨立地選自由以下組成之群的一或多個2'糖經修飾之核苷：2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA、2'-胺基-DNA、2'-氟基-DNA、阿拉伯糖核酸(arabino nucleic acid；ANA)、2'-氟基-ANA及LNA核苷。
  8. 如請求項1或2之反義寡核苷酸，其中該寡核苷酸之該連續核苷酸區包含至少一個經修飾之核苷間鍵，諸如一或多個硫代磷酸酯核苷間鍵，或諸如該連續核苷酸區內之所有該等核苷間鍵為硫代磷酸酯核苷間鍵。
  9. 如請求項1或2之反義寡核苷酸，其中該寡核苷酸或其連續核苷酸序列為或包含間隔體，諸如式5'-F-G-F'-3'之間隔體，其中區F及F'獨立地包含1-7個糖經修飾之核苷且G為6-16個核苷之區，該區能夠募集RNaseH，其中區F及F'之鄰近於區G的核苷為糖經修飾之核苷。
  10. 如請求項9之反義寡核苷酸，其中區F及F'中之至少一者或兩者各自包含至少一個LNA核苷。
  11. 如請求項1或2之反義寡核苷酸，其中該連續核苷酸區係選自選自以下之群組： TTCtatctacgcaTTG (SEQ ID NO 67)， CTTCttctatctacgcAT (SEQ ID NO 73)，及 TACTttaatagcTCAA (SEQ ID NO 86)； 其中大寫字母為LNA核苷酸，且小寫字母為DNA核苷，且胞嘧啶殘基視情況為5-甲基胞嘧啶。
  12. 如請求項10之反義寡核苷酸，其中該等LNA核苷均為β-D-氧基LNA核苷。
  13. 如請求項1或2之反義寡核苷酸，其中該連續核苷酸區之該等核苷酸之間的該等核苷間鍵皆為硫代磷酸酯核苷間鍵。
  14. 一種寡核苷酸，其包含選自由以下組成之群的寡核苷酸或由其組成： Ts Ts m Cs ts as ts cs ts as m cs gs cs as Ts Ts G (SEQ ID NO 67,1)，m Cs Ts Ts m Cs ts ts cs ts as ts cs ts as m cs gs cs As T (SEQ ID NO 73,1)，及 Ts As m Cs Ts ts ts as as ts as gs cs Ts m Cs As A (SEQ ID NO 86,1)； 其中大寫字母表示β-D-氧基LNA核苷，小寫字母為DNA核苷，下標s表示硫代磷酸酯核苷間鍵，且m C表示5個甲基胞嘧啶β-D-氧基LNA核苷，且m c表示5個甲基胞嘧啶DNA核苷。
  15. 一種如請求項1至14中任一項之寡核苷酸的醫藥學上可接受之鹽。
  16. 一種共軛物，其包含如請求項1至14中任一項之寡核苷酸，或如請求項15之醫藥學上可接受之鹽，以及共價連接至該寡核苷酸之至少一個共軛部分。
  17. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至14中任一項之寡核苷酸、如請求項15之醫藥學上可接受之鹽或如請求項16之共軛物，以及醫藥學上可接受之稀釋劑、溶劑、載劑、鹽及/或佐劑。
  18. 一種用於調節表現HTRA1之靶細胞中之HTRA1表現的活體外方法，該方法包含以有效量向該細胞投與如請求項1至14中任一項之寡核苷酸，或如請求項15之醫藥學上可接受之鹽，或如請求項16之共軛物或如請求項17之醫藥組合物。
  19. 一種如請求項1至14中任一項之寡核苷酸，或如請求項15之醫藥學上可接受之鹽，或如請求項16之共軛物或如請求項17之醫藥組合物的用途，其用於製備用於調節表現HTRA1之靶細胞中之HTRA1表現的藥物。
  20. 一種如請求項1至14中任一項之寡核苷酸，或如請求項15之醫藥學上可接受之鹽，或如請求項16之共軛物或如請求項17之醫藥組合物的用途，其用於製備用於治療或預防患有或易患有疾病之個體的藥物。
  21. 2及14中任一項之寡核苷酸，其用於醫學。
  22. 如請求項15之醫藥學上可接受之鹽，其用於醫學。
  23. 如請求項16之共軛物，其用於醫學。
  24. 如請求項17之醫藥組合物，其用於醫學。
  25. 2及14中任一項之寡核苷酸，其用於治療或預防選自由以下組成之群的疾病：黃斑變性(諸如濕性AMD、乾性AMD、地圖狀萎縮(geographic atrophy)、中期dAMD、糖尿病性視網膜病變)、帕金森氏病(Parkinson's disease)、阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)、杜興氏肌肉萎縮症(Duchenne muscular dystrophy)、諸如骨關節炎之關節炎以及家族性缺血性大腦小血管疾病。
  26. 如請求項15之醫藥學上可接受之鹽，其用於治療或預防選自由以下組成之群的疾病：黃斑變性(諸如濕性AMD、乾性AMD、地圖狀萎縮、中期dAMD、糖尿病性視網膜病變)、帕金森氏病、阿茲海默氏病、杜興氏肌肉萎縮症、諸如骨關節炎之關節炎以及家族性缺血性大腦小血管疾病。
  27. 如請求項16之共軛物，其用於治療或預防選自由以下組成之群的疾病：黃斑變性(諸如濕性AMD、乾性AMD、地圖狀萎縮、中期dAMD、糖尿病性視網膜病變)、帕金森氏病、阿茲海默氏病、杜興氏肌肉萎縮症、諸如骨關節炎之關節炎以及家族性缺血性大腦小血管疾病。
  28. 如請求項17之醫藥組合物，其用於治療或預防選自由以下組成之群的疾病：黃斑變性(諸如濕性AMD、乾性AMD、地圖狀萎縮、中期dAMD、糖尿病性視網膜病變)、帕金森氏病、阿茲海默氏病、杜興氏肌肉萎縮症、諸如骨關節炎之關節炎以及家族性缺血性大腦小血管疾病。
  29. 一種如請求項1、2及14中任一項之寡核苷酸，或如請求項15之醫藥學上可接受之鹽，或如請求項16之共軛物或如請求項17之醫藥組合物的用途，其用於製備供用於治療或預防選自由以下組成之群的疾病之藥物：黃斑變性(諸如濕性AMD、乾性AMD、地圖狀萎縮、中期dAMD、糖尿病性視網膜病變)、帕金森氏病、阿茲海默氏病、杜興氏肌肉萎縮症、諸如骨關節炎之關節炎及家族性缺血性大腦小血管疾病。
  30. 如請求項20或29之用途，其中該藥物用於治療黃斑變性。
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