JP7281474B2 - Ｔｍｅｍ１０６ｂ発現を調節するためのオリゴヌクレオチド - Google Patents

Ｔｍｅｍ１０６ｂ発現を調節するためのオリゴヌクレオチド Download PDF

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Description

本発明は、ＴＭＥＭ１０６Ｂの発現を調節することができる、膜貫通タンパク質１０６Ｂ（ＴＭＥＭ１０６Ｂ）に相補的なオリゴヌクレオチドに関する。ＴＭＥＭ１０６Ｂ発現の調節は、神経学的障害、特に前頭側頭葉変性症のような神経変性障害のような一連の医学的障害に有益である。
膜貫通タンパク質１０６Ｂ（ＴＭＥＭ１０６Ｂ）は、エンドソームおよびリソソームの膜に主に位置する、シングルパスの２型内在性膜糖タンパク質である。これは、グリア細胞および内皮細胞と同様にニューロンにも発現している。これは、樹状突起の分枝などの樹状突起の形態形成、およびリソソームの機能に関与していると考えられている。ＴＭＥＭ１０６Ｂは、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）を含むいくつかの一般的な神経変性障害と関連付けられている（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ ａｎｄ Ｒａｄｅｍａｋｅｒｓ，Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．２０１６ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ；１３２（５）：６３９－６５１）。
Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｎｅｕｒｏｎ ９５，２８１－２９６は、ＴＭＥＭ１０６Ｂの欠損がプログラニュリン欠損マウスにおいてリソソームおよび前頭側頭型認知症関連表現型を改善することを報告している。
Ｒｏｓｔｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｇｉｎｇ ５９（２０１７）２２１．ｅ１ｅ２２１．ｅ７は、ＣＨＭＰ２Ｂを介した前頭側頭型認知症（ＦＴＤ－３）におけるＴＭＥＭ１０６ＢおよびＡｐｏＥ多型について報告している。
Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ３７７（２０１７）６５－７１は、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）および多系統萎縮症（ＭＳＡ）におけるＴＭＥＭ１０６Ｂ遺伝子の特定の多型の関連について報告している。
Ｇａｌｌａｇｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １０１，６４３－６６３，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２，２０１７は、クロマチン構造および遺伝子発現を変化させる認知症関連リスク変異体（ＴＭＥＭ１０６Ｂ付近）について報告している。
Ｓｉｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ ２０１７：１４０；３１０５－３１１１は、ＴＭＥＭ１０６Ｂにおける反復性ｄｅ ｎｏｖｏ突然変異が、低髄鞘性白質ジストロフィーを引き起こすことを報告する。
Ｈｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．ｅＮｅｕｒｏ．２０１７ Ｊｕｌ－Ａｕｇ；４（４）：ＥＮＥＵＲＯ．０１００－１７．２０１７は、例えば、アルカリ化剤またはＴＭＥＭ１０６Ｂの発現の増加によって誘導されるリソソーム機能障害が、プログラヌリン（ＰＧＲＮ）のグラニュリン（ＧＲＮ）へのプロセシングを阻害することを示している。それらはまた、ＦＴＤ－ＧＲＮ患者由来の初代線維芽細胞および皮質脳組織では、複数のＧＲＮがハプロ不全であることも示している。これは、プログラニュリン（ＰＧＲＮ）をコードするＧＲＮ遺伝子のホモ接合性またはヘテロ接合性突然変異として、神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）に適用され、各々、神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）または前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）を引き起こすことがある。
Ｇｏｔｚｌ ｅｔ ａｌ．Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．１２７（６）：８４５－６０は、ＮＣＬのモデルであるカテプシンＤノックアウトマウスにおけるＴＭＥＭ１０６ｂおよびＧＲＮタンパク質の上昇を報告している。
Ｓｃｈｗｅｎｋ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．２０１４ Ｍａｒ ３；３３（５）：４５０－６７は、ＦＴＬＤ－ＴＤＰ危険因子ＴＭＥＭ１０６Ｂおよびリソソームの樹状細胞輸送を制御するためのＭＡＰ６との機能的相互作用について報告している。ＴＭＥＭ１０６Ｂに対するｓｉＲＮＡをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトしたところ、ＴＭＥＭ１０６Ｂタンパク質の発現が減少し、核近傍にリソソームクラスターが形成された。さらに、海馬ニューロンにトランスフェクトしたｓｈＲＮＡを用いたＴＭＥＭ１０６Ｂノックダウンは、樹状突起の分枝を障害した。ＴＭＥＭ１０６Ｂノックダウンによって樹状突起の形態に生じた変化は、神経変性疾患の共通の属性であるシナプス強度および可塑性の障害を引き起こす可能性がある。このことは、ＴＭＥＭ１０６Ｂのノックダウンが神経変性疾患を引き起こす可能性があることを示唆している。
国際公開第２０１５／１２７０３７号は、ＴＭＥＭ１０６Ｂを含む一連の遺伝子の発現を調節するのに有効であると報告されている小分子化合物を含む、神経変性疾患の治療のための化合物および方法について報告している。開示された化合物によるＴＭＥＭ１０６Ｂ阻害を示すいかなるデータも存在しないようである。
神経変性障害は、大きな未充足の医学的ニーズを有し、ＴＭＥＭ１０６Ｂ発現と神経変性障害を伴う特異的ＴＭＥＭ１０６Ｂ対立遺伝子を示す明らかな遺伝的および実験的証拠がある。したがって、研究および治療用途に使用するためのＴＭＥＭ１０６Ｂの阻害剤が必要とされている。
発明の目的
本発明は、ＴＭＥＭ１０６Ｂの発現の下方調節、および神経学的障害における治療的介入のための、インビボおよびインビトロの両方で使用され得るＴＭＥＭ１０６Ｂの核酸阻害剤を提供する。
本発明は、ＴＭＥＭ１０６Ｂに相補的であり、ＴＭＥＭ１０６Ｂの発現を調節するオリゴヌクレオチドに関する。本発明はさらに、オリゴヌクレオチドのコンジュゲート、ならびにオリゴヌクレオチドを使用する神経学的障害の治療のための医薬組成物および方法に関する。
本発明は、細胞におけるＴＭＥＭ１０６Ｂの発現を減少させ、神経変性、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、パーキンソン病（またはパーキンソニズム）、低髄鞘性白質ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症および多系統萎縮症、アルツハイマー病、運動ニューロン疾患、低ミエリン化白質ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症、および多系統萎縮症、アルツハイマー病、運動ニューロン疾患、皮質基底核症候群、進行性核上性麻痺、および神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）などの神経学的障害の治療のために使用され得る、ＴＭＥＭ１０６Ｂのオリゴヌクレオチド阻害剤を提供する。
本発明は、細胞におけるＴＭＥＭ１０６Ｂの発現を減少させ、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）の治療のために使用され得る、ＴＭＥＭ１０６Ｂのオリゴヌクレオチド阻害剤を提供する。
本発明は、ＴＭＥＭ１０６Ｂの発現を阻害することができ、ＴＭＥＭ１０６Ｂの機能に関連した疾患を治療または予防するための、核酸を標的とするオリゴヌクレオチドを提供する。
本発明は、哺乳動物ＴＭＥＭ１０６Ｂ標的核酸に対して少なくとも９０％相補的な（例えば、完全に相補的な）１０～３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む、ＴＭＥＭ１０６Ｂを標的とするオリゴヌクレオチドを提供する。
本発明は、哺乳動物ＴＭＥＭ１０６Ｂ標的核酸に対して少なくとも９０％の相補的、例えば完全に相補的な１０～３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む、ＴＭＥＭ１０６Ｂを標的とする１０～４０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを提供する。
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、ＴＭＥＭ１０６Ｂを発現している細胞におけるＴＭＥＭ１０６Ｂの発現を阻害することができるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）であり得る。
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、ＴＭＥＭ１０６Ｂを発現している細胞におけるＴＭＥＭ１０６Ｂの発現を阻害することができるｓｉＲＮＡ（またはｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖）であり得る。
本発明は、哺乳動物ＴＭＥＭ１０６Ｂ標的核酸に対して少なくとも９０％の相補性を有する１０～３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドを提供し、このオリゴヌクレオチドは、ＴＭＥＭ１０６Ｂを発現している細胞におけるＴＭＥＭ１０６Ｂの発現を阻害することができる。
本発明は、哺乳動物ＴＭＥＭ１０６Ｂ標的核酸に対して少なくとも９０％の相補性を有する１０～３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＴＭＥＭ１０６Ｂを発現している細胞におけるＴＭＥＭ１０６Ｂの発現を阻害することができる。有利には、オリゴヌクレオチドは、ヒトＲＮａｓｅＨ１、例えばギャップマーオリゴヌクレオチドなどのＲＮａｓｅＨを動員することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドであってもよい。
本発明は、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡなどのオリゴヌクレオチドと、前記オリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも１つのコンジュゲート部分とを含むコンジュゲートを提供する。
本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはｓｉＲＮＡのような本発明のオリゴヌクレオチド、またはそのコンジュゲートの薬学的に許容され得る塩を提供する。
本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはｓｉＲＮＡのような本発明のオリゴヌクレオチド、またはそのコンジュゲート、ならびに薬学的に許容され得る希釈剤、溶媒、担体、塩および／または佐剤を含む医薬組成物を提供する。
本発明は、ＴＭＥＭ１０６Ｂを発現している標的細胞におけるＴＭＥＭ１０６Ｂ発現を調節するための方法を提供し、前記方法は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはｓｉＲＮＡのような本発明のオリゴヌクレオチド、もしくはそのコンジュゲート、もしくは薬学的塩、または医薬組成物を、有効量で前記細胞に投与することを含む。本発明は、例えば、インビトロ方法またはインビボ方法であり得る。
治療的または予防的に有効な量の本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはｓｉＲＮＡのような本発明のオリゴヌクレオチド、もしくはそのコンジュゲート、もしくは本発明の薬学的塩、または医薬組成物を、疾患に苦しむまたは罹り易い対象に投与することを含む、疾患の治療または予防方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、神経変性、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、パーキンソン病（またはパーキンソニズム）、低髄鞘性白質ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症および多系統萎縮症、アルツハイマー病、運動ニューロン疾患、皮質基底核症候群、進行性核上性麻痺、および神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）からなる群から選択される神経変性疾患などの神経変性疾患と診断された、またはそれに苦しむ対象における神経変性疾患の治療のためである。
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、前頭皮質の加齢に伴う変化の治療に使用される。
疾患の治療または予防方法は、例えば、神経変性、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、パーキンソン病（またはパーキンソニズム）、低髄鞘性白質ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症および多系統萎縮症、アルツハイマー病、運動ニューロン疾患、皮質基底核症候群、進行性核上性麻痺、および神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）からなる群から選択される疾患などの神経変性疾患の治療または予防のためであり得る。
本発明は、薬における使用のための、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはｓｉＲＮＡなどのオリゴヌクレオチド、もしくはそのコンジュゲート、または本発明の薬学的塩もしくは医薬組成物を提供する。
本発明は、神経変性、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、パーキンソン病（またはパーキンソニズム）、低髄鞘性白質ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症および多系統萎縮症、アルツハイマー病、運動ニューロン疾患、皮質基底核症候群、進行性核上性麻痺、および神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）から選択される疾患などの神経変性疾患の治療における使用のための、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはｓｉＲＮＡなどのオリゴヌクレオチド、もしくはそのコンジュゲート、または本発明の薬学的塩もしくは医薬組成物を提供する。
本発明は、神経変性、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、パーキンソン病（またはパーキンソニズム）、低髄鞘性白質ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症および多系統萎縮症、アルツハイマー病、運動ニューロン疾患、皮質基底核症候群、進行性核上性麻痺、および神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）から選択される疾患などの神経変性疾患の治療または予防のための医薬の製造のための、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはｓｉＲＮＡなどのオリゴヌクレオチド、もしくはそのコンジュゲート、または本発明の薬学的塩もしくは医薬組成物の使用を提供する。
ＰＢＳ処置対照と比較した、マウスＮｅｕｒｏ－２ａ細胞における５μＭ対２５μＭでの３日間のインキュベーション後の標的阻害（２つの生物学的複製の平均）。 ＰＢＳ処置対照と比較した、マウスＮｅｕｒｏ－２ａ細胞における５μＭ対２５μＭでの６日間のインキュベーション後の標的阻害（２つの生物学的反復の平均）。 ＰＢＳ処置対照と比較した、ギャップマーのトランスフェクションから２４時間後のカスパーゼ活性。 ヒトＳＫ－Ｎ－ＢＥ（２）細胞における５μＭ対２５μＭでの３日間のインキュベーション後の標的阻害（２つの生物学的複製の平均）。 ヒトＳＫ－Ｎ－ＢＥ（２）細胞における５μＭ対２５μＭでの６日間のインキュベーション後の標的阻害（２つの生物学的反復の平均）。 ヒトＳＫ－Ｎ－ＢＥ（２）細胞における図示される５μＭでの３日間のインキュベーション後の標的阻害、対、染色体７上の標的配列の位置。 増大する濃度の５つのヒトＡＳＯについての、ＡＳＯで１０日間連続処理した後のヒトｉＰＳＣニューロンおよび星状細胞混合培養物における標的阻害。 増大する濃度の５つのヒトＡＳＯについての、ＡＳＯで２４時間パルス処理で１０日後のヒトｉＰＳＣニューロンおよび星状細胞混合培養物における標的阻害。 ヒトｉＰＳＣニューロンおよび星状細胞混合培養物におけるＡＳＯで１０日間連続処理した後のＴＭＥＭ１０６Ｂタンパク質レベルの低下の自動ウェスタンブロット。 生理食塩水５μｌ中のＬＮＡオリゴヌクレオチド１００μｇを右側脳室に１回ＩＣＶ注入した後のインビボＴＭＥＭ１０６ｂ ｍＲＮＡ減少の時間経過（ＧＡＰＤＨに正規化）。 生理食塩水５μｌ中のＬＮＡオリゴヌクレオチド１００μｇを右側脳室に１回ＩＣＶ注入した後のインビボＴＭＥＭ１０６ｂタンパク質減少のインビボ時間経過（β－チューブリンに正規化）。 ＣＭＰ番号６５＿１の構造式。その薬学的塩は、一価または二価カチオン、例えばＮａ＋、Ｋ＋およびＣａ２＋、または化合物と関連したこれらの混合物を含む。 ＣＭＰ番号６６＿１の構造式。その薬学的塩は、一価または二価カチオン、例えばＮａ＋、Ｋ＋およびＣａ２＋、または化合物と関連したこれらの混合物を含む。 ＣＭＰ番号７１＿１の構造式。その薬学的塩は、一価または二価カチオン、例えばＮａ＋、Ｋ＋およびＣａ２＋、または化合物と関連したこれらの混合物を含む。 ＣＭＰ番号７４＿１の構造式。その薬学的塩は、一価または二価カチオン、例えばＮａ＋、Ｋ＋およびＣａ２＋、または化合物と関連したこれらの混合物を含む。 ＣＭＰ番号７５＿１の構造式。その薬学的塩は、一価または二価カチオン、例えばＮａ＋、Ｋ＋およびＣａ２＋、または化合物と関連したこれらの混合物を含む。
発明の詳細な説明
定義
本明細書において、用語「アルキル」は、単独または組み合わせで、１～８個の炭素原子を有する 直鎖または分岐鎖アルキル基、特に１～６個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖アルキル基、より特には１～４個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖アルキル基を意味する。直鎖および分岐鎖Ｃ１－Ｃ８アルキル基の例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ．－ブチル、異性体ペンチル、異性体ヘキシル、異性体ヘプチルおよび異性体オクチル、特にメチル、エチル、プロピル、ブチルおよびペンチルである。アルキルの特定の例は、メチル、エチルおよびプロピルである。
用語「シクロアルキル」は、単独または組み合わせで、３～８個の炭素原子を有するシクロアルキル環、特に３～６個の炭素原子を有するシクロアルキル環を意味する。シクロアルキルの例は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルおよびシクロオクチル、より特にはシクロプロピルおよびシクロブチルである。「シクロアルキル」の特定の例は、シクロプロピルである。
用語「アルコキシ」は、単独または組み合わせで、式アルキル－Ｏ－の基を意味し、用語「アルキル」は、以前付与した意味、例えばメトキシ、エトキシ、ｎ－プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ－ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ．ブトキシおよびｔｅｒｔ．ブトキシを意味する。特定の「アルコキシ」は、メトキシおよびエトキシである。メトキシエトキシは、「アルコキシアルコキシ」の特定の例である。
用語「オキシ」は、単独または組み合わせで、－Ｏ－基を意味する。
用語「アルケニル」は、単独または組み合わせで、オレフィン結合と、８個まで、好ましくは６個まで、特に好ましくは４個までの炭素原子を含む直鎖または分岐鎖炭化水素残基を意味する。アルケニル基の例は、エテニル、１－プロペニル、２－プロペニル、イソプロペニル、１－ブテニル、２－ブテニル、３－ブテニルおよびイソブテニルである。
用語「アルキニル」は、単独または組み合わせで、三重結合と、８個まで、好ましくは６個まで、特に好ましくは４個までの炭素原子を含む直鎖または分岐鎖炭化水素残基を意味する。
用語「ハロゲン」または「ハロ」は、単独または組み合わせで、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素、特にフッ素、塩素または臭素、より特にはフッ素を意味する。用語「ハロ」は、他の基と組み合わせて、少なくとも１つのハロゲン、特に１～５個のハロゲン、特に１～４個のハロゲン、即ち１個、２個、３個または４個のハロゲンで置換された前記基の置換を示す。
用語「ハロアルキル」は、単独または組み合わせで、少なくとも１つのハロゲンで置換された、特に１～５個のハロゲン、特に１～３個のハロゲンで置換されたアルキル基を意味する。ハロアルキルの例には、モノフルオロ－、ジフルオロ－またはトリフルオロ－メチル、－エチルまたは－プロピル、例えば３，３，３－トリフルオロプロピル、２－フルオロエチル、２，２，２－トリフルオロエチル、フルオロエチルまたはトリフルオロメチルが含まれる。フルオロメチル、ジフルオロメチルおよびトリフルオロメチルは、特定の「ハロアルキル」である。
用語「ハロシクロアルキル」は、単独または組み合わせで、少なくとも１つのハロゲンで置換された、特に１～５個のハロゲン、特に１～３個のハロゲンで置換された、上記に定義したシクロアルキル基を意味する。用語「ハロシクロアルキル」の特定の例は、ハロシクロプロピル、特にフルオロシクロプロピル、ジフルオロシクロプロピルおよびトリフルオロシクロプロピルである。
用語「ヒドロキシル」および「ヒドロキシ」は、単独または組み合わせで、－ＯＨ基を意味する。
用語「チオヒドロキシル」および「チオヒドロキシ」は、単独または組み合わせで、－ＳＨ基を意味する。
用語「カルボニル」は、単独または組み合わせで、－Ｃ（Ｏ）－基を意味する。
用語「カルボキシ」または「カルボキシル」は、単独または組み合わせで、－ＣＯＯＨ基を意味する。
用語「アミノ」は、単独または組み合わせで、第１級アミノ基（－ＮＨ２）、第２級アミノ基（－ＮＨ－）、または第３級アミノ基（－Ｎ－）を意味する。
用語「アルキルアミノ」は、単独または組み合わせで、１個または２個の上記に定義したアルキル基で置換された、上記に定義したアミノ基を意味する。
用語「スルホニル」は、単独または組み合わせで、－ＳＯ２基を意味する。
用語「スルフィニル」は、単独または組み合わせで、－ＳＯ－基を意味する。
用語「スルファニル」は、単独または組み合わせで、－Ｓ－基を意味する。
用語「シアノ」は、単独または組み合わせで、－ＣＮ基を意味する。
用語「アジド」は、単独または組み合わせで、－Ｎ３基を意味する。
用語「ニトロ」は、単独または組み合わせで、ＮＯ２基を意味する。
用語「ホルミル」は、単独または組み合わせで、－Ｃ（Ｏ）Ｈ基を意味する。
用語「カルバモイル」は、単独または組み合わせで、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ２基を意味する。
用語「カバミド」は、単独または組み合わせで、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ２基を意味する。
用語「アリール」は、単独または組み合わせで、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルおよびホルミルから独立して選択される１～３個の置換基で場合により置換された、６～１０個の炭素環原子を含む、一価芳香族炭素環式単環または二環式環系を示す。アリールの例には、フェニルおよびナフチル、特にフェニルが含まれる。
用語「ヘテロアリール」は、単独または組み合わせで、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１、２、３または４個のヘテロ原子を含み、残りの環原子は、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルおよびホルミルから独立して選択される１～３個の置換基で場合により置換された炭素である、５～１２個の環原子の一価芳香族複素環式単環または二環式環系を示す。ヘテロアリールの例には、ピロリル、フラニル、チエニル、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、トリアゾニル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、テトラゾリル、ピリジニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリミジニル、トリアジニル、アゼピニル、ジアゼピニル、イソオキサゾリル、ベンゾフラニル、イソチアゾリル、ベンゾチエニル、インドリル、イソインドリル、イソベンゾフラニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイソチアゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾトリアゾリル、プリニル、キノリニル、イソキノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、カルバゾリルまたはアクリジニルが含まれる。
用語「ヘテロシクリル」は、単独または組み合わせで、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１、２、３または４個の環ヘテロ原子を含み、残りの環原子は、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルおよびホルミルから独立して選択される１～３個の置換基で場合により置換された炭素である、４～１２、特に４～９個の環原子の一価飽和または部分不飽和単環または二環式環系を意味する。単環式飽和ヘテロシクリルの例には、アゼチジニル、ピロリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロ－チエニル、ピラゾリジニル、イミダゾリジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリル、チアゾリジニル、ピペリジニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、１，１－ジオキソ－チオモルホリン－４－イル、アゼパニル、ジアゼパニル、ホモピペラジニル、またはオキサゼパニルが含まれる。二環式飽和ヘテロシクロアルキルの例は、８－アザ－ビシクロ［３．２．１］オクチル、キヌクリジニル、８－オキサ－３－アザ－ビシクロ［３．２．１］オクチル、９－アザ－ビシクロ［３．３．１］ノニル、３－オキサ－９－アザ－ビシクロ［３．３．１］ノニル、または３－チア－９－アザ－ビシクロ［３．３．１］ノニルである。部分不飽和ヘテロシクロアルキルの例は、ジヒドロフリル、イミダゾリニル、ジヒドロ－オキサゾリル、テトラヒドロ－ピリジニルまたはジヒドロピラニルである。
用語「薬学的に許容され得る塩」は、生物学的にまたは別様に望ましくないものではない、遊離塩基または遊離酸の生物学的有効性および特性を保持する塩を指す。塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸、特に塩酸、および酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、サリチル酸、Ｎ－アセチルシステインなどの有機酸と共に形成される。加えて、これらの塩は、無機塩基または有機塩基を遊離酸に加えることにより調製され得る。無機塩基から誘導される塩には、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム塩が含まれるがこれらに限定されない。有機塩基から誘導される塩には、第１級、第２級、および第３級アミン、天然に存在する置換アミンを含む置換アミン、環式アミンおよび塩基性イオン交換樹脂、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、リシン、アルギニン、Ｎ－エチルピペリジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂の塩が含まれるがこれらに限定されない。式（Ｉ）の化合物は、双性イオンの形態で存在することもできる。特に好ましくは、式（Ｉ）の化合物の薬学的に許容され得る塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸およびメタンスルホン酸の塩である。
用語「保護基」は、単独または組み合わせで、化学反応が他の非保護の反応性部位で選択的に行われ得るように、多官能化合物の反応性部位を選択的に遮断する基を意味する。保護基は、除去することができる。例示的な保護基は、アミノ保護基、カルボキシ保護基またはヒドロキシ保護基である。
本発明の出発物質または化合物が、１つ以上の反応工程の反応条件下で安定でないかまたは反応性である１つ以上の官能基を含む場合、適切な保護基（例えば、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」ｂｙ Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，３ｒｄ Ｅｄ．，１９９９，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されているような）を、当技術分野で周知の重要な工程適用方法の前に導入することができる。そのような保護基は、文献に記載の標準的な方法を用いて、合成の後の段階で除去することができる。保護基の例は、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、９－フルオレニルメチルカルバメート（Ｆｍｏｃ）、２－トリメチルシリルエチルカルバメート（Ｔｅｏｃ）、カルボベンジルオキシ（Ｃｂｚ）およびｐ－メトキシベンジルオキシカルボニル（Ｍｏｚ）である。
本明細書に記載される化合物は、数個の不斉中心を含むことができ、光学的に純粋なエナンチオマー、例えばラセミ体などのエナンチオマーの混合物、ジアステレオ異性体の混合物、ジアステレオ異性体ラセミ体またはジアステレオ異性体ラセミ体の混合物として存在することができる。
用語「不斉炭素原子」は、４つの異なる置換基を有する炭素原子を意味する。Ｃａｈｎ－Ｉｎｇｏｌｄ－Ｐｒｅｌｏｇ則によれば、不斉炭素原子は、「Ｒ」または「Ｓ」立体配置のものであり得る。
核酸分子
本明細書で使用される用語「核酸分子」または「治療的核酸分子」は、それが当業者により、２つ以上の共有結合したヌクレオシド（即ち、ヌクレオチド配列）を含む分子として一般的に理解されているように定義される。本発明で言及される核酸分子は、一般に、１０～５０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであり、それらは一般に、１つまたは２つのオリコヌクレオチドから構成されている。核酸分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、もしくはそれを含み得、または例えばＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アプタマーもしくはリボザイムなどの他のオリゴマー核酸分子であり得る。治療的核酸分子は、通常、固相化学合成と、その後の精製および単離によって、研究室内で作製される。しかしながら、ｓｈＲＮＡは、多くの場合、レンチウイルスベクターを用いて細胞に送達され（例えばＳｏａｎ ａｎｄ Ｙａｎｇ ２０１０ Ｎ Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｓｃｉ ２（１２）：５９８を参照）、次いで転写されて単鎖ＲＮＡを生成し、これは、ＲＮＡ干渉機構（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体を含む）と相互作用することができるＲＮＡステムループ（ヘアピン）ＲＮＡ構造を形成するであろう。核酸分子の配列に言及する場合、共有結合したヌクレオチドまたはヌクレオシドの核酸塩基部分の配列もしくは順序、またはその修飾が参照される。本発明の核酸分子は、人工であり、化学的に合成され、典型的には精製または単離される。本発明の核酸分子は、１つ以上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチド、例えば２’－糖修飾ヌクレオシド、例えば高親和性修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでもよい。
いくつかの実施形態では、本発明の核酸分子は、８～７０ヌクレオチド長、１０～６０ヌクレオチド長、１２～５０ヌクレオチド長、例えば８～４０ヌクレオチド長、例えば９～３５、例えば１０～３０、例えば１１～２２、例えば１２～２０、例えば１３～１８または１４～１６連続ヌクレオチド長を含み、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、核酸分子またはその連続ヌクレオチド配列は、２４以下のヌクレオチド、例えば２２以下のヌクレオチド、例えば２０以下のヌクレオチド、例えば１８以下のヌクレオチド、例えば１４、１５、１６または１７ヌクレオチドを含み、またはそれからなる。本明細書で提供されるいずれの範囲も、範囲の終点を含むことを理解するべきである。したがって、核酸分子が１０～３０ヌクレオチドを含むと記される場合、１０ヌクレオチドおよび３０ヌクレオチドの両方が含まれる。
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０連続ヌクレオチド長を含み、またはそれからなる。
この核酸分子は、典型的には、哺乳動物における標的核酸の発現の調節用である。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの核酸分子は、典型的には、標的核酸の発現を阻害するためである。
本発明の一実施形態において、核酸分子は、ＲＮＡｉ剤、例えばｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡから選択される。
別の実施形態では、核酸分子は、ＲＮａｓｅＨと相互作用するアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば単鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば高親和性修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、核酸分子は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、ホスホロチオエート結合を５’末端および３’末端に（例えば独立して１～３結合を各末端に）含む。いくつかの実施形態では、核酸分子内の全ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートからなる。
いくつかの実施形態では、核酸分子は、非ヌクレオシド部分（コンジュゲート部分）に結合され得る。
オリゴヌクレオチド
本明細書で使用される用語「オリゴヌクレオチド」または「治療的オリゴヌクレオチド」は、それが当業者により、２つ以上の共有結合したヌクレオシドを含む分子として一般的に理解されているように定義される。そのような共有結合ヌクレオシドは、核酸分子、オリゴヌクレオチドまたはオリゴマーとも称され得る。オリゴヌクレオチドは、通常、固相化学合成と、その後の精製によって研究室内で作製される。オリゴヌクレオチドの配列に言及する場合、共有結合したヌクレオチドまたはヌクレオシドの核酸塩基部分の配列もしくは順序、またはその修飾が参照される。本発明のオリゴヌクレオチドは、人工であり、化学的に合成され、典型的には精製または単離される。本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば２’糖修飾ヌクレオシドなどの１つ以上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含んでもよい。
本発明のオリゴヌクレオチドは、標的核酸または標的配列に相補的な連続ヌクレオチド配列を含み、いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列に加えて１つ以上の追加のヌクレオチド、例えば１～３０、例えば１～２０、例えば１～１０、例えば１、２、３、４または５のさらなるヌクレオチドをさらに含んでもよい。いくつかの実施形態では、追加のヌクレオチドは、連続ヌクレオチド配列に相補的であり、連続ヌクレオチド配列にハイブリダイズすることによりステムループ（ヘアピン）構造を形成することができる。いくつかの実施形態では、追加のヌクレオチドは、１～５ホスホジエステル結合ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの全ヌクレオチドは、連続ヌクレオチド配列を形成する。
アンチセンスオリゴヌクレオチド
本明細書で使用される用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、標的核酸、特に標的核酸上の連続配列にハイブリダイズすることによって標的遺伝子の発現を調節することができるオリゴヌクレオチドとして定義される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは本質的に二本鎖ではなく、したがってｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡではない。好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは単鎖である。本発明の単鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの全長にわたって内部（ｉｎｔｒａ）または相互（ｉｎｔｅｒ）の自己相補性の程度が５０％未満である限り、ヘアピンまたは分子間二重鎖構造（同じオリゴヌクレオチドの２分子間の二重鎖）を形成できることが理解される。
有利には、単鎖本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ耐性を低下させるためＲＮＡヌクレオシドを含まない。
有利には、本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば２’糖修飾ヌクレオシドなどの１つ以上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含む。さらに、修飾されていないヌクレオシドがＤＮＡヌクレオシドであることは有利である。
ＲＮＡｉまたはｓｉＲＮＡ
本明細書において、用語「ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子」は、細胞の原形質中でＲＮＡ発現またはＲＮＡ低下（ｒｅｄｕｃｉｎｇ）サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を介した翻訳を阻害する任意の分子を指し、ここでＲＮＡｉ分子は、触媒性ＲＩＳＣ構成要素アルゴノートと相互作用する。小型干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、典型的には、パッセンジャー（センス）およびガイド（アンチセンス）オリゴヌクレオチド（鎖）を含む二本鎖ＲＮＡ複合体であり、これは細胞に投与されると、ＲＩＳＣ複合体（ｓｉＲＩＳＣ）へのガイド（アンチセンス）鎖の組み込みがもたらされ、ＲＩＳＣ関連の細胞内の相補的なＲＮＡ標的核酸の翻訳阻害または分解がもたらされる。センス鎖はパッセンジャー鎖とも称され、アンチセンス鎖はガイド鎖とも称される。小型ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、ＲＩＳＣを介してｍＲＮＡを分解することができるステムループ（ヘアピン）構造を形成する単一の核酸分子である。ＲＮＡｉ核酸分子は、化学的に（ｓｉＲＮＡ複合体に典型的）もしくはインビトロ転写により合成され、またはベクターから発現され得る。
ｓｈＲＮＡ分子は、一般に４０～７０ヌクレオチド長、例えば４５～６５ヌクレオチド長、例えば５０～６０ヌクレオチド長であり、特徴的な２塩基３’オーバーハングを有する１９～２３塩基対の短干渉ＲＮＡにｄｓＲＮＡをプロセシングすると考えられるＤｉｃｅｒとして既知のエンドヌクレアーゼと相互作用し、これは次いでＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれる。
典型的には、ｓｉＲＮＡ（またはｓｈＲＮＡのアンチセンス領域）のガイド（アンチセンス）鎖は、１７～２５ヌクレオチド長、例えば１９～２３ヌクレオチド長であり、標的核酸または標的配列に相補的である。ｓｉＲＮＡ複合体において、ガイド（アンチセンス）鎖およびパッセンジャー（センス）鎖は、二本鎖デュプレックスを形成し、これは例えば１～３ヌクレオチドの３’末端オーバーハングを含んでもよく（Ｄｉｃｅｒにより生成される産物と類似）、または平滑末端（二重鎖の一方または両方の末端にオーバーハングがない）であってもよい。
ＲＮＡｉは、細胞内でｓｉＲＮＡにプロセシングされる（ｄｓＲＮＡエンドヌクレアーゼＤＩＣＥＲが関与すると考えられるプロセス）、より長いｄｓＲＮＡ基質により媒介され得ることが認識されるであろう。Ｄｉｃｅｒ基質の有効な拡張形態は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，３４９，８０９号および米国特許第８，５１３，２０７号に記載されている。
ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド間結合および高親和性ヌクレオシド、例えば２’糖修飾ヌクレオシド、例えば２’－４’二環式リボース修飾ヌクレオシド（ＬＮＡおよびｃＥＴまたは２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’－フルオロ－ＡＮＡのような２’置換修飾を含む）を用いて化学的に修飾されてもよい。例えば２’Ｏ－メチル修飾ｓｉＲＮＡを開示している国際公開第２００２／０４４３２１号、ｓｉＲＮＡ複合体中のＬＮＡヌクレオシドの使用（ｓｉＬＮＡとして既知）を開示している国際公開第２００４０８３４３０号、およびｓｉＲＮＡ中の不連続パッセンジャー鎖の使用（ｓｉＬＮＡ複合体など）を開示している国際公開第２００７１０７１６２号を参照されたい。国際公開第０３００６４７７号はＲＮＡｉのｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ（ｓｔＲＮＡとも称される）オリゴヌクレオチドメディエーターを開示している。Ｈａｒｂｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．２００３ Ａｐｒ；１３（２）：８３－１０５は、小型干渉ＲＮＡおよび短ヘアピンＲＮＡの配列、化学、構造変化、ならびに哺乳動物遺伝子サイレンシングに対する効果に言及している。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、１つ以上のホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。ＲＮＡｉ分子において、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合は、ＲＩＣＳにおけるヌクレアーゼ切断を低減し得るため、すべてのヌクレオシド間結合が修飾されるのではないことが有利である。ホスホロチオエートヌクレオシド間結合は、ＲＮＡｉ核酸分子の３’および／または５’末端、特に標的核酸に相補的ではない分子の部分（例えば、ｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖またはパッセンジャー鎖）に配置されることが有利であり得る。しかしながら、標的核酸に相補的なＲＮＡｉ分子の領域（例えば、ｓｉＲＮＡ分子中のアンチセンスまたはガイド鎖）も、３’および／または５’末端の最初の２～３ヌクレオシド間結合において修飾され得る。
連続ヌクレオチド配列
用語「連続ヌクレオチド配列」は、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドの領域を指す。この用語は、本明細書で用語「連続核酸塩基配列」および用語「オリゴヌクレオチドモチーフ配列」と互換的に使用される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの全ヌクレオチドは、連続ヌクレオチド配列を構成する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、連続ヌクレオチド配列、例えばギャップマーのフランク（ウイングとしても既知）およびギャップ領域、例えばＦ－Ｇ－Ｆ’－ギャップマー領域を含み、場合によりさらなるヌクレオチド、例えば、官能基を連続ヌクレオチド配列に結合するのに使用され得るヌクレオチドリンカー領域を含んでもよい。ヌクレオチドリンカー領域は、標的核酸に相補的であっても相補的でなくてもよい。
ヌクレオチド
ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの構成単位であり、本発明の目的のために、天然に存在するヌクレオチドおよび天然に存在しないヌクレオチドの両方を含む。本来、ＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチドなどのヌクレオチドは、リボース糖部分、核酸塩基部分および１つ以上のリン酸基（ヌクレオシドに存在しない）を含む。ヌクレオシドおよびヌクレオチドはまた、「単位」または「モノマー」と互換的に称されてもよい。
修飾ヌクレオシド
本明細書で使用される用語「修飾ヌクレオシド」または「ヌクレオシド修飾」は、等価なＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドと比較して、糖部分または（核酸）塩基部分の１つ以上の修飾の導入によって修飾されたヌクレオシドを指す。好ましい実施形態では、修飾ヌクレオシドは、修飾された糖部分を含む。用語修飾ヌクレオシドはまた、用語「ヌクレオシド類似体」または修飾「単位」または修飾「モノマー」と互換的に使用されてもよい。非修飾ＤＮＡまたはＲＮＡ糖部分を有するヌクレオシドは、本明細書でＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドと称される。ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドの塩基領域における修飾を有するヌクレオシドは、それらがＷａｔｓｏｎ Ｃｒｉｃｋ塩基対合が可能であれば、依然として一般にＤＮＡまたはＲＮＡと称される。
修飾ヌクレオシド間結合
用語「修飾ヌクレオシド間結合」は、２つのヌクレオシドを互いに共有結合する、ホスホジエステル（ＰＯ）結合以外の結合として当業者により理解されるように定義される。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシド間結合を含み得る。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合と比較して、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を増大させ、このことは治療的オリゴヌクレオチドにとって特に有利である。天然に存在するオリゴヌクレオチドの場合、ヌクレオシド間結合は、隣接するヌクレオシド間のホスホジエステル結合を形成するリン酸基を含む。修飾ヌクレオシド間結合は、インビボ使用のためのオリゴヌクレオチドの安定化に特に有用であり、本発明のオリゴヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドの領域、例えばギャップマーオリゴヌクレオチドのギャップ領域内、ならびに領域ＦおよびＦ’などの修飾ヌクレオシドの領域におけるヌクレアーゼ切断から保護する役割を果たし得る。
一実施形態では、オリゴヌクレオチド、例えば治療的アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡは、１つ以上の修飾ヌクレオシド間結合が、例えばヌクレアーゼ攻撃に対してより耐性であるように、天然のホスホジエステルから修飾された１つ以上のヌクレオシド間結合を含む。ヌクレアーゼ耐性は、オリゴヌクレオチドを血清中でインキュベートすることにより、またはヌクレアーゼ耐性アッセイ（例えばヘビ毒ホスホジエステラーゼ（ＳＶＰＤ））を用いることにより決定することができ、これらの両方は当技術分野で周知である。オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を向上させることができるヌクレオシド間結合は、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合と称される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列の少なくとも５０％のヌクレオシド間結合が修飾され、例えばオリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列の少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも８０または例えば少なくとも９０％のヌクレオシド間結合が、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の全部がヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合である。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドを非ヌクレオチド官能基、例えばコンジュゲートに結合するヌクレオシドは、ホスホジエステルであり得ることが認識されるであろう。
好ましい修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートである。
ホスホロチオエートヌクレオシド間結合は、そのヌクレアーゼ耐性、有益な薬物動態および製造の容易さのために特に有用である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列の少なくとも５０％のヌクレオシド間結合がホスホロチオエートであり、例えばオリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列の少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％または例えば少なくとも９０％のヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエートである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の全部がホスホロチオエートである。完全ホスホロチオエート修飾オリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列の使用は、多くの場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて使用されるが、ｓｉＲＮＡにおいては、特にガイド（アンチセンス）鎖中に使用される場合、完全ホスホロチオエート修飾はＲＮＡｉ活性を制限することが報告されているため、部分ホスホロチオエート修飾が好ましい可能性がある。ホスホロチオエート修飾は、ＲＮＡｉ活性を過度に制限することなく、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の５’および３’末端に組み込まれ得る。
ホスホロチオエート結合などのヌクレアーゼ耐性結合は、標的核酸と二重鎖を形成するときにヌクレアーゼを動員することができるオリゴヌクレオチド領域、例えばギャップマーの領域Ｇにおいて特に有用である。しかしながら、ホスホロチオエート結合は、非ヌクレアーゼ動員領域および／または親和性増強領域、例えばギャップマーの領域ＦおよびＦ’においても有用であり得る。ギャップマーオリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、領域ＦもしくはＦ’、または領域ＦおよびＦ’の両方に１つ以上のホスホジエステル結合を含んでもよく、領域Ｇのヌクレオシド間結合は、完全にホスホロチオエートであり得る。有利には、アンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列のすべてのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。
欧州特許第２７４２１３５号に開示されているように、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、他のヌクレオシド間結合（ホスホジエステルおよびホスホロチオエート以外の）、例えばアルキルホスホネート／メチルホスホネートヌクレオシド間結合（ｉｎｔｅｒｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ）を含んでもよいことが認識され、これは欧州特許第２７４２１３５号によれば、例えば別のＤＮＡホスホロチオエートのギャップ領域内で耐性であり得る。
核酸塩基
核酸塩基という用語は、ヌクレオシドおよびヌクレオチドに存在するプリン（例えばアデニンおよびグアニン）およびピリミジン（例えばウラシル、チミンおよびシトシン）部分を含み、これらは核酸ハイブリダイゼーションにおいて水素結合を形成する。本発明の文脈において、核酸塩基という用語は、天然に存在する核酸塩基とは異なり得るが、核酸ハイブリダイゼーション中に機能性である修飾核酸塩基も包含する。この文脈において、「核酸塩基」は、天然に存在する核酸塩基、例えばアデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチンおよびヒポキサンチンと、天然に存在しない変異体との両方を指す。そのような変異体は、例えばＨｉｒａｏ ｅｔ ａｌ（２０１２）Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｖｏｌ ４５ ｐａｇｅ ２０５５およびＢｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｕｐｐｌ．３７ １．４．１に記載されている。
いくつかの実施形態では、核酸塩基部分は、プリンまたはピリミジンを修飾プリンまたはピリミジン、例えば置換プリンまたは置換ピリミジン、例えばイソシトシン、シュードイソシトシン、５－メチルシトシン、５－チアゾロ－シトシン、５－プロピニル－シトシン、５－プロピニル－ウラシル、５－ブロモウラシル５－チアゾロ－ウラシル、２－チオ－ウラシル、２’チオ－チミン、イノシン、ジアミノプリン、６－アミノプリン、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリンおよび２－クロロ－６－アミノプリンから選択される核酸塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅｄ）に変えることにより修飾される。
核酸塩基部分は、各々の対応する核酸塩基の文字コード、例えばＡ、Ｔ、Ｇ、ＣまたはＵにより示され、各文字は、等価な機能の修飾核酸塩基を場合により含み得る。例えば、例示のオリゴヌクレオチドにおいて、核酸塩基部分は、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃおよび５－メチルシトシンから選択される。場合により、ＬＮＡギャップマーについて、５－メチルシトシンＬＮＡヌクレオシドが使用され得る。
修飾オリゴヌクレオチド
修飾オリゴヌクレオチドという用語は、１つ以上の糖－修飾ヌクレオシドおよび／または修飾ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを記述する。キメラ”オリゴヌクレオチドという用語は、修飾ヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドを記述するために文献で使用されている用語である。
相補性
用語「相補性」は、ヌクレオシド／ヌクレオチドのＷａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋの塩基対合の能力を記述する。Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対は、グアニン（Ｇ）－シトシン（Ｃ）およびアデニン（Ａ）－チミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）である。オリゴヌクレオチドは修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを含んでもよく、例えば５－メチルシトシンは度々シトシンの代わりに使用され、したがって相補性という用語は、非修飾および修飾核酸塩基の間のＷａｔｓｏｎ Ｃｒｉｃｋ塩基対合を包含することが理解されるであろう（例えばＨｉｒａｏ ｅｔ ａｌ（２０１２）Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｖｏｌ ４５ ｐａｇｅ ２０５５およびＢｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｕｐｐｌ．３７ １．４．１を参照されたい）。
本明細書で使用される用語「％相補的」は、所定に位置において、別個のオリゴヌクレオチド（例えば標的核酸）の所定の位置における連続ヌクレオチド配列に相補的な（即ちＷａｔｓｏｎ Ｃｒｉｃｋ塩基対を形成する）、オリゴヌクレオチド（例えばオリゴヌクレオチド）内の連続ヌクレオチド配列のパーセントにおけるオリゴヌクレオチドの数を指す。百分率は、２つの配列間で対を形成する（標的配列５’－３’とオリゴヌクレオチド配列３’－５’を整列させたとき）、整列された塩基の数を数え、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドの総数で割り、１００を掛けることにより計算される。このような比較において、整列（塩基対を形成）しない核酸塩基／ヌクレオチドは、ミスマッチと称される。好ましくは、挿入および欠失は、連続ヌクレオチド配列の％相補性の計算において許容されない。
「完全に相補的な」という用語は、１００％の相補性を指す。
以下は、標的核酸（配列番号３２５）に完全に相補的なオリゴヌクレオチドモチーフ（配列番号８６）の例である。
５’－ｇａａｔａａｔａｔｇｇａａａａａｃｇａａａａ－３’（配列番号３２５）
３’－ｔａｔｔａｔａｃｃｔｔｔｔｔｇｃｔ－５’（配列番号８６）
同一性
本明細書で使用される用語「同一性」は、連続ヌクレオチド配列にわたって参照配列（例えば配列モチーフ）に同一である、オリゴヌクレオチド（例えばオリゴヌクレオチド）の連続ヌクレオチド配列のヌクレオチドの割合（パーセントで表される）を指す。したがって、同一性の百分率は、２つの配列（本発明の化合物の連続ヌクレオチド配列および参照配列における）の間で同一の（一致する）整列された塩基の数を数え、その数をオリゴヌクレオチドのヌクレオチドの総数で割り、１００を掛けることにより計算される。したがって、同一性の百分率＝（一致×１００）／整列領域（例えば、連続ヌクレオチド配列）の長さ。挿入および欠失は、連続ヌクレオチド配列の同一性の百分率の計算において許容されない。同一性の決定において、核酸塩基の化学的修飾は、核酸塩基がＷａｔｓｏｎ Ｃｒｉｃｋ塩基対合を形成する機能的能力が保持される限り、無視されることが理解されるであろう（例えば、５－メチルシトシンは、％同一性の計算の目的のために、シトシンと同一であると見なされる）。
ハイブリダイゼーション
本明細書で使用される用語「ハイブリダイズしている」または「ハイブリダイズする」は、２つの核酸鎖（例えば、オリゴヌクレオチドおよび標的核酸）が対向する鎖上の塩基対の間で水素結合を形成することにより二重鎖を形成するとして理解するべきである。２つの核酸鎖の間の結合の親和性は、ハイブリダイゼーションの強度である。これは、度々、オリゴヌクレオチドの半分が標的核酸と二重鎖を形成する温度として定義される融解温度（Ｔｍ）によって記述される。生理学的条件では、Ｔｍは親和性に厳密に比例しない（Ｍｅｒｇｎｙ ａｎｄ Ｌａｃｒｏｉｘ，２００３，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １３：５１５－５３７）。標準状態ギブス自由エネルギーΔＧ°は、結合親和性をより正確に表し、ΔＧ°＝－ＲＴｌｎ（Ｋｄ）によって反応の解離定数（Ｋｄ）に関連付けられ、ここでＲは気体定数であり、Ｔは絶対温度である。したがって、オリゴヌクレオチドと標的核酸との反応の非常に低いΔＧ°は、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の強いハイブリダイゼーションを反映する。ΔＧ°は、水性濃度が１Ｍ、ｐＨが７、温度が３７℃の反応に関連したエネルギーである。標的核酸に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、自発的反応であり、自発的反応の場合、ΔＧ°はゼロ未満である。ΔＧ° は、Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９６５，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．３６－３８ ａｎｄ Ｈｏｌｄｇａｔｅ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙに記載されているように、例えば等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）により、実験的に測定することができる。当業者は、ΔＧ°測定のために市販の装置が入手可能であることを知るであろう。ΔＧ°は、ＳａｎｔａＬｕｃｉａ，１９９８，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９５：１４６０－１４６５に記載されているように、Ｓｕｇｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１１２１１－１１２１６およびＭｃＴｉｇｕｅ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３：５３８８－５４０５に記載されている適切に誘導した熱力学パラメータを使用して、最近接モデル（ｎｅａｒｅｓｔ ｎｅｉｇｈｂｏｒ ｍｏｄｅｌ）を用いることにより数値的に推定することもできる。ハイブリダイゼーションによってその意図された核酸標的を調節する可能性を有するために、本発明のオリゴヌクレオチドは、１０～３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドについて－１０ｋｃａｌ未満の推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションの程度または強度は、標準状態ギブス自由エネルギーΔＧ°により測定される。オリゴヌクレオチドは、８～３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドについて－１０ｋｃａｌの範囲未満、例えば－１５ｋｃａｌ未満、例えば－２０ｋｃａｌ未満、および例えば－２５ｋｃａｌ未満の推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズし得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、－１０～－６０ｋｃａｌ、例えば－１２～－４０、例えば－１５～－３０ｋｃａｌまたは－１６～－２７ｋｃａｌ、例えば－１８～－２５ｋｃａｌの推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズする。
標的核酸
本発明によれば、標的核酸は、哺乳動物ＴＭＥＭ１０６Ｂをコードする核酸であり、例えば遺伝子、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、およびプレｍＲＮＡ、成熟ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列であり得る。したがって、標的は、ＴＭＥＭ１０６Ｂ標的核酸と称され得る。本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、哺乳動物ＴＭＥＭ１０６Ｂ ＲＮＡの標的エキソン領域を標的とし得、または例えばＴＭＥＭ１０６ＢプレｍＲＮＡのイントロン領域を標的とし得る（表１参照）。
表１：本発明の化合物により標的とされ得るヒトＴＭＥＭ１０６Ｂエキソンおよびイントロン領域
Figure 0007281474000001
好適には、標的核酸は、ＴＭＥＭ１０６Ｂタンパク質、特に哺乳動物ＴＭＥＭ１０６Ｂ、例えばヒトＴＭＥＭ１０６Ｂをコードする（例えば、ヒト、サルおよびマウスＴＭＥＭ１０６ＢについてのｍＲＮＡおよびプレｍＲＮＡ配列を提供する表２および３を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、標的核酸は、配列番号１、２、３、４、５および６、またはその天然に存在する変異体（ＳＮＰ変異体を含む）からなる群から選択される。配列番号１の既知のヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の表は、表４に示される。本発明のオリゴヌクレオチドを研究または診断に使用する場合、標的核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡに由来するｃＤＮＡまたは合成核酸であり得る。
本発明のオリゴヌクレオチドは、典型的には、ＴＭＥＭ１０６Ｂ標的核酸を発現している細胞内のＴＭＥＭ１０６Ｂ標的核酸の発現を阻害することができる。本発明のオリゴヌクレオチドの核酸塩基の連続配列は、典型的には、オリゴヌクレオチドの長さにわたって測定して、場合により１つまたは２つのミスマッチを除いて、また場合により、オリゴヌクレオチドをコンジュゲートなどの任意の官能基に結合し得るヌクレオチドベースのリンカー領域、または他の非相補的末端ヌクレオチドを除いて、ＴＭＥＭ１０６Ｂ標的核酸に相補的である。標的核酸は、いくつかの実施形態では、成熟ｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡであり得る。
いくつかの実施形態では、標的核酸は、哺乳動物ＴＭＥＭ１０６Ｂタンパク質をコードするＲＮＡ、例えばヒトＴＭＥＭ１０６Ｂ、例えばヒトＴＭＥＭ１０６ＢプレｍＲＮＡ配列、例えば配列番号１として開示されているもの、またはヒト成熟ｍＲＮＡ、例えば配列番号２に開示されているものである。例示的な標的核酸に関するさらなる情報は、表２および３に提供される。
表２：種にわたるＴＭＥＭ１０６Ｂに関するゲノムおよびアセンブリー情報
Figure 0007281474000002
Ｆｗｄ＝フォワード鎖Ｒｖ＝リバース鎖ゲノム座標は、プレｍＲＮＡ配列（ゲノム配列）を提供する。ＮＣＢＩ参照は、ｍＲＮＡ配列（ｃＤＮＡ配列）を提供する。
＊アメリカ国立生物工学情報センター参照配列データベースは、ゲノム、転写物およびタンパク質を含む、包括的で統合された、冗長性のない、十分に注釈が付けられた参照配列のセットである。これはｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｆｓｅｑ．で主催されている。
表３：種にわたるＴＭＥＭ１０６Ｂについての配列の詳細
Figure 0007281474000003
標的配列
本明細書で使用される用語「標的配列」は、標的核酸に存在するヌクレオチドの配列を指し、これは本発明のオリコヌクレオチドに相補的な核酸塩基配列を含む。いくつかの実施形態では、標的配列は、本発明のオリコヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列に相補的な核酸塩基配列を有する標的核酸上の領域からなる。標的核酸のこの領域は、互換的に標的ヌクレオチド配列、標的配列または標的領域と称され得る。いくつかの実施形態では、標的配列は、単一オリゴヌクレオチドの相補的配列よりも長く、例えば本発明のいくつかのオリゴヌクレオチドの好ましい領域を表し得る。
いくつかの実施形態では、標的配列は、ＴＭＥＭ１０６Ｂ核酸、例えば配列番号１のイントロン領域内に存在する。
いくつかの実施形態では、標的配列は、エキソン９、例えばＴＭＥＭ１０６Ｂ核酸の３’ＵＴＲに存在する。
本発明者らは、ヒトおよびマウスＴＭＥＭ１０６Ｂの３’ＵＴＲは、有利な標的配列であることを特定した。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列は、哺乳動物ＴＭＥＭ１０６Ｂ ｍＲＮＡ、例えば本明細書に言及される標的核酸（例えば、配列番号１、３または５）の３’ＵＴＲに対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的である。一実施形態では、３’ＵＴＲは、配列番号１の位置２０７５５－３２１４６に位置する。実施例に示すように、本発明者らはさらに、ヒトＴＭＥＭ１０６Ｂ転写物の３’ＵＴＲ内に有利な標的配列を特定した。いくつかの実施形態では、標的配列は、配列番号１の位置２０７５５～位置２６４０３である。いくつかの実施形態では、標的配列は、配列番号１の位置２１０８４～位置２１２１３である。いくつかの実施形態では、標的配列は、配列番号１の位置２３０８６～位置２４０７７である。
いくつかの実施形態では、標的配列は、ヒトＴＭＥＭ１０６Ｂ ｍＲＮＡエキソン、例えばｅ１、ｅ２、ｅ３、ｅ４、ｅ５、ｅ６、ｅ７、ｅ８およびｅ９からなる群から選択されるＴＭＥＭ１０６ＢヒトｍＲＮＡエキソンからなる群から選択される配列である（上記の表１参照）。いくつかの実施形態では、標的配列は、エキソンｅ２である。
いくつかの実施形態では、標的配列は、ヒトＴＭＥＭ１０６Ｂ ｍＲＮＡイントロン、例えば、ｉ１、ｉ２、ｉ３、ｉ４、ｉ５、ｉ６、ｉ７およびｉ８からなる群から選択されるＴＭＥＭ１０６ＢヒトｍＲＮＡイントロンからなる群から選択される配列である（上記の表１参照）。いくつかの実施形態では、標的配列は、イントロンｉ８または３’ＵＴＲ領域である。
いくつかの実施形態では、標的配列は、ｉ１、ｉ２、ｉ３、ｉ４、ｉ５、ｉ６、ｉ７およびｉ８からなる群から選択されＴＭＥＭ１０６ＢヒトｍＲＮＡイントロン、ならびにＴＭＥＭ１０６ＢヒトｍＲＮＡ ３’ＵＴＲからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、標的配列は、ＴＭＥＭ１０６ＢヒトｍＲＮＡイントロンｉ８または３’ＵＴＲの配列である（上記の表１参照）。
いくつかの実施形態では、標的配列は、配列番号１の位置２０２２７～位置２０２４３のヌクレオチド配列であり、またはそれを含む。
いくつかの実施形態では、標的配列は、配列番号１の位置２０２２７～位置２６４０３のヌクレオチド配列であり、またはそれを含む。
いくつかの実施形態では、標的配列は、配列番号１の位置２０２２７～位置２１２１３のヌクレオチド配列であり、またはそれを含む。
いくつかの実施形態では、標的配列は、配列番号１の位置２０２２７～位置２４０７７のヌクレオチド配列であり、またはそれを含む。
本発明のオリゴヌクレオチドは、標的核酸、例えば本明細書に記載される標的配列に相補的またはハイブリダイズする連続ヌクレオチド配列を含む。
オリゴヌクレオチドが相補的またはハイブリダイズする標的配列は、一般に、少なくとも１０ヌクレオチドの連続核酸塩基配列を含む。いくつかの実施形態では、そのような本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、連続ヌクレオチド配列は、１０～５０ヌクレオチド、例えば１０～３０ヌクレオチド、例えば１４～２０、例えば１５～１８連続ヌクレオチドである。
ｓｉＲＮＡの場合、アンチセンス鎖オリゴヌクレオチドが相補的またはハイブリダイズする標的配列は、少なくとも１６または１７ヌクレオチドの連続核酸塩基配列を含み得る。いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、１７～２５ヌクレオチド、例えば１９～２３連続ヌクレオチドである。
標的細胞
本明細書で使用される用語「標的細胞」は、標的核酸を発現している細胞を指す。いくつかの実施形態では、標的細胞は、インビボまたはインビトロであり得る。いくつかの実施形態では、標的細胞は、哺乳動物細胞、例えばげっ歯類細胞、例えばマウス細胞もしくはラット細胞、または霊長類細胞、例えばサル細胞もしくはヒト細胞である。
いくつかの実施形態では、標的細胞は、神経細胞である。いくつかの実施形態では、ＴＭＥＭ１０６Ｂを発現している細胞は、神経細胞であり得る。
いくつかの実施形態では、標的細胞は、ＴＭＥＭ１０６ＢプレｍＲＮＡまたはＴＭＥＭ１０６Ｂ成熟ｍＲＮＡなどのＴＭＥＭ１０６Ｂ ｍＲＮＡを発現する。ＴＭＥＭ１０６Ｂ ｍＲＮＡのポリＡテールは、典型的には、アンチセンスオリゴヌクレオチド標的化では無視される。
いくつかの実施形態では、ＡＴＣＣ（ＣＲＬ－２２７１）から獲得したヒトＳＫ－Ｎ－ＢＥ（２）神経芽腫細胞、またはＡＴＣＣ（ＣＣＬ－１３１）から獲得したマウスＮｅｕｒｏ－２ａ神経芽腫細胞は、オリゴヌクレオチドが標的核酸をダウンレギュレートできるか否かを決定するのに使用され得る（実施例参照）。
天然に存在する変異体
用語「天然に存在する変異体」は、標的核酸と同じ遺伝子座に由来するが、例えば、同じアミノ酸をコードする多数のコドンを引き起こす遺伝コードの縮重のために、またはプレｍＲＮＡの選択的スプライシング、または多型、例えば単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の存在に起因して異なり得るＴＭＥＭ１０６Ｂ遺伝子または転写産物の変異体、および対立遺伝子変異体を指す。オリゴヌクレオチドに対する十分な相補的な配列の存在に基づいて、本発明のオリゴヌクレオチドは、したがって、標的核酸およびその天然に存在する変異体を標的とし得る。
いくつかの実施形態では、天然に存在する変異体は、哺乳動物ＴＭＥＭ１０６Ｂ標的核酸、例えば配列番号１～６からなる群から選択される標的核酸に対して少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％または少なくとも９９％相同性を有する。いくつかの実施形態では、天然に存在する変異体は、配列番号１または配列番号２のヒトＴＭＥＭ１０６Ｂ標的核酸に対して少なくとも９９％相同性を有する。いくつかの実施形態では、天然に存在する変異体は、表４に列挙する多型である。
表４：ヒトＴＭＥＭ１０６Ｂ遺伝子における既知の単一ヌクレオチド多型の例（ヒトプレｍＲＮＡ開始／参照配列は、配列番号１である）。
Figure 0007281474000004
Figure 0007281474000005
Figure 0007281474000006
Figure 0007281474000007
Figure 0007281474000008
Figure 0007281474000009
Figure 0007281474000010
発現の調節
本明細書で使用される用語「発現の調節」は、オリゴヌクレオチドの投与前のＴＭＥＭ１０６Ｂの量と比較したときに、ＴＭＥＭ１０６Ｂの量を変更するオリゴヌクレオチドの能力の総称として理解されるべきである。あるいは、発現の調節は、対照実験を参照することによって決定され得る。対照は、生理食塩水組成物で処理された個体もしくは標的細胞、または非標的化オリゴヌクレオチド（モック）で処理された個体もしくは標的細胞であると一般的に理解されている。
調節の１つのタイプは、例えばｍＲＮＡの分解または転写の遮断による、ＴＭＥＭ１０６Ｂの発現を阻害、ダウンレギュレート、低減、抑制、除去、停止、遮断、防止、減少、低下、回避または終了するオリゴヌクレオチドの能力である。別のタイプの調節は、例えばスプライス部位の修復またはスプライシングの防止、またはマイクロＲＮＡ抑制などの阻害メカニズムの除去もしくは遮断による、ＴＭＥＭ１０６Ｂの発現を回復、増加または増強するオリゴヌクレオチドの能力である。
高親和性修飾ヌクレオシド
高親和性修飾ヌクレオシドは、修飾されたヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチドに組み込まれると、例えば、融解温度（Ｔｍ）によって測定されるように、その相補的標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性を高める。本発明の高親和性修飾ヌクレオシドは、好ましくは、修飾ヌクレオシドあたり＋０．５～＋１２℃、より好ましくは＋１．５～＋１０℃、最も好ましくは＋３～＋８℃の融解温度の上昇をもたらす。多数の高親和性修飾ヌクレオシドが当技術分野にて既知であり、例えば、多くの２’置換ヌクレオシドおよびロックド核酸（ＬＮＡ）が含まれる（例えば、Ｆｒｅｉｅｒ＆Ａｌｔｍａｎｎ；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９９７，２５，４４２９－４４４３ ａｎｄ Ｕｈｌｍａｎｎ；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０００，３（２），２９３－２１３を参照されたい）。
糖修飾
本発明のオリゴマーは、修飾された糖部分、即ち、ＤＮＡおよびＲＮＡに見られるリボース糖部分と比較した場合の糖部分の修飾を有する１つ以上のヌクレオシドを含み得る。
リボース糖部分の修飾を有する多数のヌクレオシドが、親和性および／またはヌクレアーゼ耐性などのオリゴヌクレオチドの特定の特性を改善することを主な目的として作製されている。
そのような修飾には、例えばヘキソース環（ＨＮＡ）または二環式環（典型的には、リボース環（ＬＮＡ）のＣ２とＣ４炭素の間にバイラジカル架橋を有する）、または典型的にはＣ２とＣ３炭素の間の結合を欠く非結合リボース環（例えば、ＵＮＡ）で置き換えることにより、リボース環構造が修飾されているものが含まれる。他の糖修飾ヌクレオシドには、例えばビシクロヘキソース核酸（国際公開第２０１１／０１７５２１号）または三環式核酸（国際公開第２０１３／１５４７９８号）が含まれる。修飾ヌクレオシドには、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）の場合には、糖部分が非糖部分で置き換えられているヌクレオシド、またはモルホリノ核酸も含まれる。
糖修飾には、リボース環上の置換基を水素以外の基、またはＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオシドに天然に存在する２’－ＯＨ基に変更することによる修飾も含まれる。置換基は、例えば２’、３’、４’または５’位で導入され得る。
２’糖修飾ヌクレオシド
２’糖修飾ヌクレオシドは、２’位にＨまたは－ＯＨ以外の置換基を有し（２’置換ヌクレオシド）、または２’炭素とリボース環の第２の炭素との間に架橋を形成できる２’結合バイラジカルを含むヌクレオシド、例えばＬＮＡ（２’－４’バイラジカル架橋）である。
実際、２’置換ヌクレオシドの開発には多くの注目が集まっており、多くの２’置換ヌクレオシドが、オリゴヌクレオチドに組み込まれた際に有益な特性を有することが見出されている。例えば、２’修飾ヌクレオシドは、向上された結合親和性、および／または増大されたヌクレアーゼ耐性をオリゴヌクレオチドに提供することができる。２’置換修飾ヌクレオシドの例は、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＲＮＡおよび２’－Ｆ－ＡＮＡヌクレオシドである。さらなる例については、例えばＦｒｅｉｅｒ＆Ａｌｔｍａｎｎ；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９９７，２５，４４２９－４４４３およびＵｈｌｍａｎｎ；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０００，３（２），２９３－２１３、およびＤｅｌｅａｖｅｙ ａｎｄ Ｄａｍｈａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１２，１９，９３７を参照。以下は、いくつかの２’置換修飾ヌクレオシドの説明である。
Figure 0007281474000011
本発明に関連して、２’置換は、ＬＮＡのような２’架橋分子を含まない。
ロックド核酸（ＬＮＡ）
「ＬＮＡヌクレオシド」は、前記ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’を結合するバイラジカル（「２’－４’架橋」とも称される）を含む２’修飾ヌクレオシドであり、これはリボース環の立体配座を制限または固定する。これらのヌクレオシドは、文献にて架橋核酸または二環式核酸（ＢＮＡ）とも称されている。リボースのコンフォメーションの固定は、ＬＮＡが相補的ＲＮＡまたはＤＮＡ分子のオリゴヌクレオチドに組み込まれる場合、ハイブリダイゼーションの親和性の向上（二重鎖安定化）に関連している。これはオリゴヌクレオチド／補完二重鎖の融解温度を測定することにより日常的に決定され得る。
非限定的な、例示的なＬＮＡヌクレオシドは、国際公開第９９／０１４２２６号、国際公開第００／６６６０４号、国際公開第９８／０３９３５２号、国際公開第２００４／０４６１６０号、国際公開第００／０４７５９９号、国際公開第２００７／１３４１８１号、国際公開第２０１０／０７７５７８号、国際公開第２０１０／０３６６９８号、国際公開第２００７／０９００７１号、国際公開第２００９／００６４７８号、国際公開第２０１１／１５６２０２号、国際公開第２００８／１５４４０１号、国際公開第２００９／０６７６４７号、国際公開第２００８／１５０７２９号、Ｍｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１２，７３－７６，Ｓｅｔｈ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１０，Ｖｏｌ ７５（５）ｐｐ．１５６９－８１，ａｎｄ Ｍｉｔｓｕｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００９，３７（４），１２２５－１２３８，ａｎｄ Ｗａｎ ａｎｄ Ｓｅｔｈ，Ｊ．Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１６，５９，９６４５－９６６７に開示されている。
さらなる非限定的な、例示的なＬＮＡヌクレオシドは、スキーム１に開示されている。
スキーム１：
Figure 0007281474000012
特定のＬＮＡヌクレオシドは、β－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ、６’－メチル－β－Ｄ－オキシＬＮＡ、例えば（Ｓ）－６’－メチル－β－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ（ＳｃＥＴ）およびＥＮＡである。
特定の有利なＬＮＡは、β－Ｄ－オキシ－ＬＮＡである。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのβ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡまたは６’－メチル－β－Ｄ－オキシ－ＬＮＡヌクレオシドを含む。
ヌクレアーゼ媒介分解
ヌクレアーゼ媒介分解は、相補的なヌクレオチド配列と二重鎖を形成するときに、そのような配列の分解を媒介することができるオリゴヌクレオチドを指す。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、標的核酸のヌクレアーゼ媒介分解を介して機能し得、本発明のオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ、特にエンドヌクレアーゼ、好ましくはＲＮａｓｅ Ｈなどのエンドリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）を動員することができる。ヌクレアーゼ媒介機構を介して機能するオリゴヌクレオチド設計の例は、少なくとも５または６の連続ＤＮＡヌクレオシドの領域を通常含み、親和性増強ヌクレオシド、例えばギャップマー、ヘッドマーおよびテイルマーが片側または両側に隣接するオリゴヌクレオチドである。
ＲＮａｓｅ Ｈ活性および動員
アンチセンスアンチセンスオリゴヌクレオチドのＲＮａｓｅ Ｈ活性は、相補的ＲＮＡ分子と二重鎖を形成するときにＲＮａｓｅ Ｈを動員するその能力を指す。国際公開第０１／２３６１３号は、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を決定するインビトロ方法を提供し、これはＲＮａｓｅＨを動員する能力の決定に使用され得る。典型的には、オリゴヌクレオチドは、相補的な標的核酸が提供された場合、ｐｍｏｌ／ｌ／分で測定して、試験されている修飾オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するが、ＤＮＡモノマーのみを含み、オリゴヌクレオチドの全モノマー間にホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドを使用し、また国際公開第０１／２３６１３号（参照により本明細書に組み込まれる）の実施例９１～９５により提供される方法論を使用したときに決定された初期率の少なくとも５％、例えば少なくとも１０％または２０％超を有する場合に、ＲＮａｓｅ Ｈを動員することができると見なされる。ＲＨａｓｅ Ｈ活性の測定に使用するために、組換えヒトＲＮａｓｅ Ｈ１がＬｕｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＧｍｂＨ，Ｌｕｃｅｒｎｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから入手可能である。
ギャップマー
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列は、ギャップマーであってもよい。アンチセンスギャップマーは、通常、ＲＮａｓｅ媒介分解を介して標的核酸を阻害するのに使用される。ギャップマーオリゴヌクレオチドは、少なくとも３つの区別される構造領域、５’－フランク、ギャップおよび３’－フランク、Ｆ－Ｇ－Ｆ’を５’－＞３’配向で含む。「ギャップ」領域（Ｇ）は、オリゴヌクレオチドがＲＮａｓｅ Ｈを動員することを可能にする連続ＤＮＡヌクレオチドのストレッチを含む。ギャップ領域は、１つ以上の糖修飾ヌクレオシド、有利には高親和性糖修飾ヌクレオシドを含む５’隣接領域（Ｆ）と、１つ以上の糖修飾ヌクレオシド、有利には高親和性糖修飾ヌクレオシドを含む３’隣接領域（Ｆ’）が隣接する。領域ＦおよびＦ’の１つ以上の糖修飾ヌクレオシドは、標的核酸に対するオリゴヌクレオチドの親和性を増強する（即ち、これは親和性増強糖修飾ヌクレオシドである）。いくつかの実施形態では、領域ＦおよびＦ’の１つ以上の糖修飾ヌクレオシドは、２’糖修飾ヌクレオシド、例えばＬＮＡおよび２’－ＭＯＥから独立して選択される、例えば高親和性２’糖修飾である。
ギャップマー設計において、ギャップ領域の最も５’および３’のヌクレオシドはＤＮＡヌクレオシドであり、各々、５’（Ｆ）または３’（Ｆ’）の糖修飾ヌクレオシドに隣接して配置されている。フランクはさらに、ギャップ領域から最も遠い端、即ち５’フランクの５’末端および３’フランクの３’末端に少なくとも１つの糖修飾ヌクレオシドを有することによって定義されてもよい。
領域Ｆ－Ｇ－Ｆ’は、連続ヌクレオチド配列を形成する。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列は、式Ｆ－Ｇ－Ｆ’のギャップマー領域を含んでもよい。
ギャップマー設計Ｆ－Ｇ－Ｆ’の全長は、例えば１２～３２ヌクレオシド、例えば１３～２４、例えば１４～２２ヌクレオシド、例えば１４～１７、例えば１６～１８ヌクレオシドであってもよい。
例として、本発明のギャップマーオリゴヌクレオチドは、以下の式により表すことができる：
Ｆ１－８－Ｇ５－１６－Ｆ’１－８、例えば
Ｆ１－８－Ｇ７－１６－Ｆ’２－８
ただし、ギャップマー領域の全長は、少なくとも１２、例えば少なくとも１４ヌクレオチド長であることを条件とする。
領域Ｆ、ＧおよびＦ’は、さらに以下に定義され、Ｆ－Ｇ－Ｆ’式に組み込まれることができる。
ギャップマー－領域Ｇ
ギャップマーの領域Ｇ（ギャップ領域）は、オリゴヌクレオチドがＲＮａｓｅＨ、例えばヒトＲＮａｓｅ Ｈ１を動員することを可能にするヌクレオシド、典型的にはＤＮＡヌクレオシドの領域である。ＲＮａｓｅＨは、ＤＮＡとＲＮＡの間の二重鎖を認識し、ＲＮＡ分子を酵素的に切断する細胞酵素である。好適には、ギャップマーは、少なくとも５または６連続ＤＮＡヌクレオシド、例えば５～１６連続ＤＮＡヌクレオシド、例えば６～１５連続ＤＮＡヌクレオシド、例えば７～１４連続ＤＮＡヌクレオシド、例えば８～１２連続ＤＮＡヌクレオチド、例えば８～１２連続ＤＮＡヌクレオチド長のギャップ領域（Ｇ）を有してもよい。ギャップ領域Ｇは、いくつかの実施形態では、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６連続ＤＮＡヌクレオシドからなっていてもよい。ギャップ領域内の１つ以上のシトシン（Ｃ）ＤＮＡは、いくつかの場合、メチル化（例えば、ＤＮＡ ｃにＤＮＡ ｇが続く場合）されてもよく、そのような残基は、５－メチル－シトシン（ｍｅＣ）と注釈が付けられる。いくつかの実施形態では、ギャップ領域Ｇは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６連続ホスホロチオエート結合ＤＮＡヌクレオシドからなっていてもよい。いくつかの実施形態では、ギャップ内の全ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。
従来のギャップマーはＤＮＡギャップ領域を有するが、ギャップ領域内で使用される場合にＲＮａｓｅＨ動員を可能にする修飾ヌクレオシドの多数の例が存在する。ギャップ領域内に含まれる場合にＲＮａｓｅＨの動員が可能であるとして報告されている修飾ヌクレオシドには、例えば、α－Ｌ－ＬＮＡ、Ｃ４’－アルキル化ＤＮＡ（ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５０３４９およびＶｅｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１８（２００８）２２９６－２３００に記載されているような、両方とも参照により本明細書に組み込まれる）、ＡＮＡおよび２’Ｆ－ＡＮＡのようなアラビノース由来ヌクレオシド（Ｍａｎｇｏｓ ｅｔ ａｌ．２００３ Ｊ．ＡＭ．ＣＨＥＭ．ＳＯＣ．１２５，６５４－６６１）、ＵＮＡ（アンロックド核酸）（参照により本明細書に組み込まれるＦｌｕｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｓｙｓｔ．，２００９，１０，１０３９に記載されているような）が含まれる。ＵＮＡは、典型的には、リボースのＣ２とＣ３の間の結合が除去され、アンロックド「糖」残基を形成しているアンロックド核酸である。そのようなギャップマーに使用されている修飾ヌクレオシドは、ギャップ領域内に導入された際に２’エンド（ｅｎｄｏ）（ＤＮＡ様）構造を採択する（即ち、ＲＮａｓｅＨ動員を可能にする修飾）ヌクレオシドであり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＤＮＡギャップ領域（Ｇ）は、場合により、ギャップ領域内に導入された際に２’エンド（ｅｎｄｏ）（ＤＮＡ様）構造を採択する１～３糖修飾ヌクレオシドを含んでもよい。
領域Ｇ－「ギャップブレーカー」
あるいは、いくつかのＲＮａｓｅＨ活性を保持しながら、ギャップマーのギャップ領域に３’エンドコンフォメーションを付与する修飾ヌクレオシドの挿入についての多くの報告が存在する。１つ以上の３’エンド修飾ヌクレオシドを含むギャップ領域を有するそのようなギャップマーは、「ギャップブレーカー」または「ギャップ破壊」ギャップマーと称される。例えば、国際公開第２０１３／０２２９８４号を参照されたい。ギャップブレーカーオリゴヌクレオチドは、ＲＮａｓｅＨ動員を可能にするために、ギャップ領域内にＤＮＡヌクレオシドの十分な領域を保持する。ギャップブレーカーオリゴヌクレオチド設計がＲＮａｓｅＨを動員する能力は、典型的には、配列または化合物固有である－Ｒｕｋｏｖ ｅｔ ａｌ．２０１５ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｖｏｌ．４３ ｐｐ．８４７６－８４８７を参照されたい。これは、いくつかの場合、標的ＲＮＡのより特異的な切断を提供するＲＮａｓｅＨを動員する「ギャップブレーカー」オリゴヌクレオチドを開示している。ギャップブレーカーオリゴヌクレオチドのギャップ領域内で使用される修飾ヌクレオシドは、例えば、３’エンドコンフォメーションを付与する修飾ヌクレオシド、例えば２’－Ｏ－メチル（ＯＭｅ）または２’－Ｏ－ＭＯＥ（ＭＯＥ）ヌクレオシド、またはβ－Ｄ ＬＮＡヌクレオシド（ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’の間の架橋が、βコンフォメーションである）、例えばβ－Ｄ－オキシＬＮＡまたはＳｃＥＴヌクレオシドであってもよい。
上述した領域Ｇを含むギャップマーと同様に、ギャップブレーカーまたはギャップ破壊ギャップマーは、ギャップの５’末端に（領域Ｆの３’ヌクレオシドに隣接して）ＤＮＡヌクレオシドを有し、ギャップの３’末端に（領域Ｆの５’ヌクレオシドに隣接して）ＤＮＡヌクレオシドを有する。破壊ギャップを含むギャップマーは、典型的には、ギャップ領域の５’末端または３’末端のいずれかに少なくとも３または４連続ＤＮＡヌクレオシドの領域を保持する。
ギャップブレーカーオリゴヌクレオチドの例示的な設計は、
Ｆ１－８－［Ｄ３－４－Ｅ１－Ｄ３－４］－Ｆ’１－８
Ｆ１－８－［Ｄ１－４－Ｅ１－Ｄ３－４］－Ｆ’１－８
Ｆ１－８－［Ｄ３－４－Ｅ１－Ｄ１－４］－Ｆ’１－８
を含み、領域Ｇは、［Ｄｎ－Ｅｒ－Ｄｍ］内であり、Ｄは、ＤＮＡヌクレオシドの連続配列であり、Ｅは、修飾ヌクレオシド（ギャップブレーカーまたはギャップ破壊ヌクレオシド）であり、ＦおよびＦ’は、本明細書に定義した隣接領域であるが、ただし、ギャップマー領域Ｆ－Ｇ－Ｆ’の全長は、少なくとも１２、例えば１４ヌクレオチド長であることを条件とする。
いくつかの実施形態では、ギャップ破壊ギャップマーの領域Ｇは、少なくとも６ＤＮＡヌクレオシド、例えば６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６ＤＮＡを含む。上述したように、ＤＮＡヌクレオシドは連続であってもよく、場合により１つ以上の修飾ヌクレオシドが散在してもよいが、ただしギャップ領域Ｇは、ＲＮａｓｅＨ動員を媒介できることを条件とする。
ギャップマー－隣接領域、ＦおよびＦ’
領域Ｆは、領域Ｇの５’ＤＮＡヌクレオシドのすぐ隣に配置されている。領域Ｆの最も３’のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシド、例えば高親和性糖修飾ヌクレオシド、例えば２’置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシド、またはＬＮＡヌクレオシドである。
領域Ｆ’は、領域Ｇの３’ＤＮＡヌクレオシドのすぐ隣に配置されている。領域Ｆの最も５’のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシド、例えば高親和性糖修飾ヌクレオシド、例えば２’置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシド、またはＬＮＡヌクレオシドである。
領域Ｆは、１～８連続ヌクレオチド長、例えば２～６、例えば３～４連続ヌクレオチド長である。有利には、領域Ｆの最も５’のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆの２つの最も５’のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆの最も５’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆの２つの最も５’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆの２つの最も５’のヌクレオシドは、２’置換ヌクレオシドヌクレオシド、例えば２つの３’ＭＯＥヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆの最も５’のヌクレオシドは、２’置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシドである。
領域Ｆ’は、２～８連続ヌクレオチド長、例えば３～６、例えば４～５連続ヌクレオチド長である。有利には、領域Ｆの最も３’の実施形態は、糖修飾ヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’の２つの最も３’のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’の２つの最も３’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’の最も３’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’の２つの最も３’のヌクレオシドは、２’置換ヌクレオシドヌクレオシド、例えば２つの３’ＭＯＥヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’の最も３’のヌクレオシドは、２’置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシドである。
領域Ｆまたは領域Ｆ’の長さが１である場合、それはＬＮＡヌクレオシドであることに留意するべきである。
いくつかの実施形態では、領域Ｆおよび領域Ｆ’は、独立して、糖修飾ヌクレオシドの連続配列からなり、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、領域Ｆの糖修飾ヌクレオシドは、独立して、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ単位、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ単位、２’－フルオロ－ＤＮＡ単位、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、ＭＯＥ単位、ＬＮＡ単位、アラビノ核酸（ＡＮＡ）単位および２’－フルオロ－ＡＮＡ単位から選択されてもよい。
いくつかの実施形態では、領域Ｆおよび領域Ｆ’は、独立して、ＬＮＡおよび２’置換修飾ヌクレオシドの両方を含む（混合ウイング設計）。
いくつかの実施形態では、領域Ｆおよび領域Ｆ’は、１タイプのみの糖修飾ヌクレオシド、例えばＭＯＥのみ、またはβ－Ｄ－オキシＬＮＡのみ、またはＳｃＥＴのみからなる。このような設計は、均一フランクまたは均一ギャップマー設計とも称される。
いくつかの実施形態では、領域ＦもしくはＦ’の全ヌクレオシド、またはＦおよびＦ’は、例えばβ－Ｄ－オキシＬＮＡ、ＥＮＡまたはＳｃＥＴヌクレオシドから独立して選択される、ＬＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、領域Ｆは、１～５、例えば２～４、例えば３～４、例えば１、２、３、４または５連続ＬＮＡヌクレオシドからなる。いくつかの実施形態では、領域ＦおよびＦ’の全ヌクレシドは、β－Ｄ－オキシＬＮＡである。
いくつかの実施形態では、領域ＦもしくはＦ’の全ヌクレシド、またはＦおよびＦ’は、２’置換ヌクレオシド、例えばＯＭｅまたはＭＯＥである。いくつかの実施形態では、領域Ｆは、１、２、３、４、５、６、７または８連続ＯＭｅまたはＭＯＥからなる。いくつかの実施形態では、隣接領域の１つのみが、２’置換ヌクレオシド、例えばＯＭｅまたはＭＯＥからなり得る。いくつかの実施形態では、２’置換ヌクレオシド、例えばＯＭｅまたはＭＯＥからなるのは５’（Ｆ）隣接領域であり、一方、３’（Ｆ’）隣接領域は、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシド、例えばβ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドまたはｃＥＴヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、２’置換ヌクレオシド、例えばＯＭｅまたはＭＯＥからなるのは３’（Ｆ’）隣接領域であり、一方、５’（Ｆ）隣接領域は、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシド、例えばβ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドまたはｃＥＴヌクレオシドを含む。
いくつかの実施形態では、領域ＦおよびＦ’の全修飾ヌクレオシドが、ＬＮＡヌクレオシド、例えばβ－Ｄ－オキシＬＮＡ、ＥＮＡまたはＳｃＥＴヌクレオシドから独立して選択される、ＬＮＡヌクレオシドであり、領域ＦもしくはＦ’、またはＦおよびＦ’は、場合によりＤＮＡヌクレオシドを含んでもよい（交互フランク、詳細にはこれらの定義を参照されたい）。いくつかの実施形態では、領域ＦおよびＦ’の全修飾ヌクレオシドがβ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドであり、領域ＦもしくはＦ’、またはＦおよびＦ’は、場合によりＤＮＡヌクレオシドを含んでもよい（交互フランク、詳細にはこれらの定義を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、領域ＦおよびＦ’の最も５’および最も３’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシド、例えばβ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドまたはＳｃＥＴヌクレオシドである。
いくつかの実施形態では、領域Ｆと領域Ｇの間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’と領域Ｇの間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。いくつかの実施形態では、領域ＦまたはＦ’、ＦおよびＦ’の間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
ＬＮＡギャップマー
ＬＮＡギャップマーは、領域ＦおよびＦ’の一方または両方のいずれかが、ＬＮＡヌクレオシドを含み、またはそれからなるギャップマーである。β－Ｄ－オキシギャップマーは、領域ＦおよびＦ’の一方または両方のいずれかが、β－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドを含み、またはそれからなるギャップマーである。
いくつかの実施形態では、ＬＮＡギャップマーは、式：［ＬＮＡ］１－５－［領域Ｇ］－［ＬＮＡ］１－５のものであり、領域Ｇはギャップマー領域Ｇの定義に定義した通りである。
ＭＯＥギャップマー
ＭＯＥギャップマーは、領域ＦおよびＦ’がＭＯＥヌクレオシドからなるギャップマーである。いくつかの実施形態では、ＭＯＥギャップマーは、設計［ＭＯＥ］１－８－［領域Ｇ］－［ＭＯＥ］１－８、例えば［ＭＯＥ］２－７－［領域Ｇ］５－１６－［ＭＯＥ］２－７、例えば［ＭＯＥ］３－６－［領域Ｇ］－［ＭＯＥ］３－６のものであり領域Ｇはギャップマーの定義に定義した通りである。５－１０－５設計（ＭＯＥ－ＤＮＡ－ＭＯＥ）を有するＭＯＥギャップマーは、当技術分野で広く使用されている。
混合ウイングギャップマー
混合ウイングギャップマーは、領域ＦおよびＦ’の一方または両方が、２’置換ヌクレオシド、例えば２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ単位、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ単位、２’－フルオロ－ＤＮＡ単位、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、ＭＯＥ単位、アラビノ核酸（ＡＮＡ）単位および２’－フルオロ－ＡＮＡ単位から独立して選択される２’置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシドを含むＬＮＡギャップマーである。領域ＦおよびＦ’の少なくとも一方、または領域ＦおよびＦ’の両方が少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシドを含むいくつかの実施形態では、領域ＦおよびＦ’の残りのヌクレオシドは、ＭＯＥおよびＬＮＡからなる群から独立して選択される。領域ＦおよびＦ’の少なくとも一方、または領域ＦおよびＦ’の両方が少なくとも２つのＬＮＡヌクレオシドを含むいくつかの実施形態では、領域ＦおよびＦ’の残りのヌクレオシドは、ＭＯＥおよびＬＮＡからなる群から独立して選択される。いくつかの混合ウイング実施形態では、領域ＦおよびＦ’の一方または両方が、１つ以上のＤＮＡヌクレオシドをさらに含んでもよい。
混合ウイングギャップマー設計は、国際公開第２００８／０４９０８５号および国際公開第２０１２／１０９３９５号（これらの両方は参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
交互フランクギャップマー
交互フランクを有するオリゴヌクレオチドは、ＬＮＡギャップマーオリコヌクレオチドであり、フランクの少なくとも一方（ＦまたはＦ’）が、ＬＮＡヌクレオシドに加えてＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、領域ＦもしくはＦ’、または両領域ＦおよびＦ’は、ＬＮＡヌクレオシドおよびＤＮＡヌクレオシドの両方を含む。そのような実施形態では、隣接領域ＦもしくはＦ’、またはＦおよびＦ’の両方は、少なくとも３つのヌクレオシドを含み、Ｆおよび／またはＦ’領域の最も５’および３’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。
いくつかの実施形態では、領域ＦもしくはＦ’、または両領域ＦおよびＦ’は、ＬＮＡヌクレオシドおよびＤＮＡヌクレオシドの両方を含む。そのような実施形態では、隣接領域ＦもしくはＦ’、またはＦおよびＦ’の両方は、少なくとも３つのヌクレオシドを含み、ＦまたはＦ’領域の最も５’および３’のヌクレオシドはＬＮＡヌクレオシドであり、領域ＦまたはＦ’（または領域ＦまたはＦ’の両方）の最も５’および３’のヌクレオシド間に位置する少なくとも１つのＤＮＡヌクレオシドが存在する。
オリゴヌクレオチドにおける領域Ｄ’またはＤ”
本発明のオリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列、例えばギャップマーＦ－Ｇ－Ｆ’、ならびにさらに５’および／または３’ヌクレオシドを含み、またはそれからなり得る。さらなる５’および／または３’ヌクレオシドは、標的核酸に完全に相補的であってもよく、または完全に相補的でなくてもよい。このようなさらなる５’および／または３’ヌクレオシドは、本明細書で領域Ｄ’およびＤ”と称され得る。
領域Ｄ’またはＤ”の追加は、連続ヌクレオチド配列、例えばギャップマーをコンジュゲート部分または他の官能基に連結することを目的として用いられ得る。連続ヌクレオチド配列をコンジュゲート部分に連結するのに使用される場合、生体切断可能なリンカーとしての役割を果たし得る。あるいは、それはエキソヌクレアーゼ保護を提供するために、または合成もしくは製造を容易にするために使用され得る。
領域Ｄ’およびＤ”は、各々、領域Ｆの５’末端または領域Ｆ’の３’末端に結合されて、以下の式Ｄ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’、Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ”またはＤ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ”の設計を生成することができる。この場合、Ｆ－Ｇ－Ｆ’はオリゴヌクレオチドのギャップマー部分であり、領域Ｄ’またはＤ”は、オリゴヌクレオチドの別個の部分を構成する。
領域Ｄ’またはＤ”は、独立して、１、２、３、４または５個の追加のヌクレオチドを含み、またはそれからなり、標的核酸に相補的であっても、または相補的でなくてもよい。ＦまたはＦ’領域に隣接するヌクレオチドは、糖修飾ヌクレオチドではなく、例えばＤＮＡまたはＲＮＡまたはこれらの塩基修飾バージョンである。Ｄ’およびＤ”領域は、ヌクレアーゼ感受性の生体切断可能なリンカーとしての役割を果たし得る（リンカーの定義を参照されたい）。いくつかの実施形態では、追加の５’および／または３’末端ヌクレオチドは、ホスホジエステル結合で連結され、ＤＮＡまたはＲＮＡである。領域Ｄ’およびＤ”としての使用に好適なヌクレオチドベースの生体切断可能なリンカーは、国際公開第２０１４／０７６１９５号に開示されており、これは例としてホスホジエステル結合ＤＮＡジヌクレオチドを含む。ポリオリゴヌクレオチド構築物における生体切断可能なリンカーの使用は、国際公開第２０１５／１１３９２２号に開示されており、それらは複数のアンチセンス構築物（例えば、ギャップマー領域）を単一のオリゴヌクレオチド内で結合するのに使用されている。
一実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、ギャップマーを構成する連続ヌクレオチド配列に加えて、領域Ｄ’および／またはＤ”を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、以下の式により表すことができる：
Ｆ－Ｇ－Ｆ’；特にＦ１－８－Ｇ５－１６－Ｆ’２－８
Ｄ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’、特にＤ’１－３－Ｆ１－８－Ｇ５－１６－Ｆ’２－８
Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ’’、特にＦ１－８－Ｇ５－１６－Ｆ’２－８－Ｄ’’１－３
Ｄ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ’’、特にＤ’１－３－Ｆ１－８－Ｇ５－１６－Ｆ’２－８－Ｄ’’１－３
いくつかの実施形態では、領域Ｄ’と領域Ｆの間に位置するヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合である。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’と領域Ｄ”の間に位置するヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合である。
コンジュゲート
本明細書で使用されるコンジュゲートという用語は、非ヌクレオチド部分に共有結合したオリゴヌクレオチドを指す（コンジュゲート部分または領域Ｃまたは第３の領域）。
１つ以上の非ヌクレオチド部分に対する本発明のオリゴヌクレオチドのコンジュゲーションは、例えば、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、細胞取り込み、または安定性に影響を及ぼすことにより、オリゴヌクレオチドの薬理学を改善することができる。いくつかの実施形態では、コンジュゲート部分は、オリゴヌクレオチドの細胞分布、バイオアベイラビリティ、代謝、排泄、浸透性、および／または細胞取り込みを改善することにより、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を調節または向上させる。特に、コンジュゲートは、オリゴヌクレオチドを特定の器官、組織または細胞型に標的化し、それにより、その器官、組織または細胞型におけるオリゴヌクレオチドの有効性を増強し得る。同時に、コンジュゲートは、非標的細胞型、組織または器官内のオリゴヌクレオチドの活性を低下させるのに役立ち得る（例えば、非標的細胞型、組織または器官内のオフ標的活性または活性）。
一実施形態では、非ヌクレオチド部分（コンジュゲート部分）は、炭水化物、細胞表面受容体リガンド、原薬、ホルモン、親油性物質、ポリマー、タンパク質、ペプチド、毒素（例えば、細菌毒素）、ビタミン、ウイルスタンパク質（例えば、キャプシド）またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１２／１４３３７９号に開示されているような、トランスフェリン受容体に対して特異的親和性を有する抗体または抗体断片である。いくつかの実施形態では、非ヌクレオチド部分は、抗体または抗体断片、例えば脳血液関門を通過する送達を促進する抗体または抗体断片、特にトランスフェリン受容体を標的とする抗体または抗体断片である。
リンカー
リンケージまたはリンカーは、１つ以上の共有結合を介して、対象の化学基またはセグメントを別の化学基またはセグメントに連結する２つの原子間の接続である。コンジュゲート部分は、直接または連結部分（例えば、リンカーまたはテザー）を介してオリゴヌクレオチドに付着させることができる。リンカーは、第３の領域、例えばコンジュゲート部分（領域Ｃ）を、第１の領域、例えばオリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列またはギャップマー領域Ｆ－Ｇ－Ｆ’（領域Ａ）に共有結合する役割を果たす。
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のコンジュゲートまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、場合により、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列（領域Ａまたは第１の領域）の間に位置するリンカー領域（第２の領域または領域Ｂおよび／または領域Ｙ）と、コンジュゲート部分（領域Ｃまたは第３の領域）とを含み得る。
領域Ｂは、哺乳動物の体内で通常遭遇するまたは遭遇するものに類似した条件下で切断可能である生理学的に不安定な結合を含み、またはそれからなる生体切断可能なリンカーを指す。生理学的に不安定なリンカーが化学的変換（例えば、切断）を受ける条件には、ｐＨ、温度、酸化のしくは還元条件または薬剤などの化学条件、および哺乳動物細胞で見られるまたは遭遇するものに類似した塩濃度が含まれる。哺乳動物の細胞内条件には、タンパク質分解酵素または加水分解酵素またはヌクレアーゼなどの哺乳動物細胞に通常存在する酵素活性の存在も含まれる。一実施形態では、生体切断可能なリンカーは、Ｓ１ヌクレアーゼ切断の影響を受けやすい。ＤＮＡホスホジエステルを含む生体切断可能なリンカーは、国際公開第２０１４／０７６１９５号（参照により本明細書に組み込まれる）により詳細に記載されている－本明細書の領域Ｄ’またはＤ”’も参照されたい。
領域Ｙは、必ずしも生体切断可能ではないが、主にコンジュゲート部分（領域Ｃまたは第３の領域）をオリゴヌクレオチド（領域Ａまたは第１の領域）に共有結合させるのに役立つリンカーを指す。領域Ｙリンカーは、エチレングリコール、アミノ酸単位またはアミノアルキル基などの反復単位の鎖構造またはオリゴマーを含み得る。本発明のオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、以下の局所要素Ａ－Ｃ、Ａ－Ｂ－Ｃ、Ａ－Ｂ－Ｙ－Ｃ、Ａ－Ｙ－Ｂ－ＣまたはＡ－Ｙ－Ｃから構築することができる。いくつかの実施形態では、リンカー（領域Ｙ）は、例えばＣ６～Ｃ１２アミノアルキル基を含むＣ２～Ｃ３６アミノアルキル基などのアミノアルキルである。好ましい実施形態では、リンカー（領域Ｙ）は、Ｃ６アミノアルキル基である。
治療
本明細書で使用される用語「治療」は、既存の疾患（例えば、本明細書で言及される疾患または障害）の治療、または疾患の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）、即ち予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）の両方を指す。したがって、本明細書で言及される治療は、いくつかの実施形態では、予防的であり得ることが認識されるであろう。いくつかの実施形態では、治療は、本発明は、神経変性、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、パーキンソン病（またはパーキンソニズム）、低髄鞘性白質ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症および多系統萎縮症、アルツハイマー病、運動ニューロン疾患、皮質基底核症候群、進行性核上性麻痺、および神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）からなる群から選択される神経学的障害などの神経学的障害と診断された患者に行われる。
いくつかの実施形態では、本発明の化合物は、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）の治療に使用するためのものである。
治療の望ましい効果は、治療を受ける対象の前頭皮質のＴＭＥＭ１０６Ｂ ｍＲＮＡを、認知症でない個人の平均ＴＭＥＭ１０６Ｂ ｍＲＮＡレベルに対応する正常レベルに低下させることである。ＴＭＥＭ１０６Ｂ ｍＲＮＡの減少は、正常レベルの４０％未満、例えば正常レベルの３０％未満、例えば正常レベルの２０％未満、例えば正常レベルの４０％未満の範囲内であり、かつ正常レベルより２０％高く、例えば正常レベルの３０％未満であり、かつ正常レベルより１５％高く、例えば正常レベルの２０％未満であり、かつ正常レベルより１０％高く、減少しないことが有利である。
薬学的に許容され得る塩
用語「薬学的に許容され得る塩」は、生物学的にまたは別様に望ましくないものではない、遊離塩基または遊離酸の生物学的有効性および特性を保持する塩を指す。塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸、特に塩酸、および酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、サリチル酸、Ｎ－アセチルシステインなどの有機酸と共に形成される。加えて、これらの塩は、無機塩基または有機塩基を遊離酸に加えることにより調製され得る。無機塩基から誘導される塩には、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム塩が含まれるがこれらに限定されない。有機塩基から誘導される塩には、第１級、第２級、および第３級アミン、天然に存在する置換アミンを含む置換アミン、環式アミンおよび塩基性イオン交換樹脂、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、リシン、アルギニン、Ｎ－エチルピペリジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂の塩が含まれるがこれらに限定されない。式（Ｉ）の化合物は、双性イオンの形態で存在することもできる。特に好ましくは、式（Ｉ）の化合物の薬学的に許容され得る塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸およびメタンスルホン酸の塩である。
保護基
用語「保護基」は、単独または組み合わせで、化学反応が他の非保護の反応性部位で選択的に行われ得るように、多官能化合物の反応性部位を選択的に遮断する基を意味する。保護基は、除去することができる。例示的な保護基は、アミノ保護基、カルボキシ保護基またはヒドロキシ保護基である。
発明の詳細な説明
本発明のオリゴヌクレオチド
本発明は、ＴＭＥＭ１０６Ｂの発現を調節する、例えばＴＭＥＭ１０６Ｂを阻害（ダウンレギュレート）することができるオリゴヌクレオチドに関する。調節は、ＴＭＥＭ１０６Ｂをコードする、またはＴＭＥＭ１０６Ｂの調節に関与する標的核酸にハイブリダイズすることにより達成される。標的核酸は、配列番号１～６からなる群から選択される配列などの哺乳動物のＴＭＥＭ１０６Ｂ配列であり得る。
有利には、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＴＭＥＭ１０６Ｂを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡから選択することができる。
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、標的の発現を阻害またはダウンレギュレートすることにより、それを調節することができる。好ましくは、そのような調節は、標的の正常な発現レベルと比較して少なくとも２０％、より好ましくは、標的の正常な発現レベルと比較して少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の阻害をもたらす。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＡＴＣＣ（ＣＲＬ－２２７１から獲得され得るヒトＳＫ－Ｎ－ＢＥ（２）神経芽細胞腫細胞を使用して、インビトロでＴＭＥＭ１０６Ｂ ｍＲＮＡの発現レベルを少なくとも６０％または７０％阻害することが可能であり得る。いくつかの実施形態では、本発明の化合物は、ヒトＳＫ－Ｎ－ＢＥ（２）神経芽細胞腫細胞を使用して、インビトロでＴＭＥＭ１０６Ｂタンパク質の発現レベルを少なくとも５０％阻害することが可能であり得る。好適には、実施例は、ＴＭＥＭ１０６Ｂ ＲＮＡまたはタンパク質阻害を測定するために用いられ得るアッセイを提供する。標的調節は、オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列と標的核酸との間のハイブリダイゼーションによって引き起こされる。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間のミスマッチを含む。ミスマッチにもかかわらず、標的核酸へのハイブリダイゼーションは、ＴＭＥＭ１０６Ｂ発現の所望の調節を示すのに尚十分であり得る。ミスマッチから生じる結合親和性の低下は、オリゴヌクレオチド内のヌクレオチド数の増加、および／または、標的への結合親和性を増加させることができる修飾ヌクレオシド、例えばオリゴヌクレオチド配列内に存在する、ＬＮＡを含む２’糖修飾ヌクレオシドの数の増加により有利に補償され得る。
本発明の一態様は、哺乳動物ＴＭＥＭ１０６Ｂ核酸、例えば配列番号１～６、例えば配列番号１、２、３、４、５または６に対して少なくとも９０％の相補性を有する１０～３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１０～３０ヌクレオチド長の連続配列を含み、これは標的核酸または標的配列の領域と少なくとも９０％相補的、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、または１００％相補的である。
好ましい実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列は、標的核酸の領域に完全に相補的（１００％相補的）であり、またはいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間に１つまたは２つのミスマッチを含み得る。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１および／または２に存在する領域標的核酸領域に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に（または１００％）相補的であり、１０～３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド配列は、配列番号１および配列番号３または配列番号５（または配列番号３および５の両方）に存在する対応する標的核酸領域に対して１００％相補的である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド配列は、配列番号１、３および５に存在する対応する標的核酸領域に対して１００％相補的である。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド配列は、配列番号２および配列番号４または配列番号６（または配列番号４および６の両方）に存在する対応する標的核酸領域に対して１００％相補的である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド配列は、配列番号２、４および６に存在する対応する標的核酸領域に対して１００％相補的である。
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号１のエキソン９に対して少なくとも９０％相補的、例えば１００％相補的である。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１に存在する対応する標的核酸領域に対して少なくとも９０％相補的であり、例えば１００％の相補性を有する１０～３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含み、標的核酸領域は、表５の領域Ａ１～Ａ８０からなる群から選択される。
表５：本発明のオリゴヌクレオチドを使用して標的化され得る配列番号１の選択された領域
Figure 0007281474000013
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１に存在する対応する標的核酸領域に対して少なくとも９０％相補的であり、例えば１００％の相補性を有する１０～３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含み、標的核酸領域は、表６の領域Ｂ１～Ｂ２９からなる群から選択される。
表６：本発明のオリゴヌクレオチドを使用して標的化され得る配列番号２の選択された領域
Figure 0007281474000014
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、８～７０ヌクレオチド長、例えば１０～６０ヌクレオチド長、例えば１０～５０ヌクレオチド長、例えば１２～５０ヌクレオチド長、例えば８～４０ヌクレオチド長、例えば９～３５、例えば１０～３０、例えば１１～２２、例えば１２～２０、例えば１３～１８または１４～１６ヌクレオチド長を含み、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列は、１０～３５ヌクレオチド長、例えば１０～３０、例えば１１～２２、例えば１２～２０、例えば１４～１８または１４～１６連続ヌクレオチド長を含み、またはそれからなる。有利には、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列は、１４、１５、１６、１７または１８オリゴヌクレオチド長を含み、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列は、２２以下のヌクレオチド、例えば２０以下のヌクレオチド、例えば１８以下のヌクレオチド、例えば１４、１５、１６または１７ヌクレオチドを含み、またはそれからなる。本明細書で提供されるいずれの範囲も、範囲の終点を含むことを理解するべきである。したがって、オリゴヌクレオチドが１０～３０ヌクレオチドを含むと記される場合、１０ヌクレオチドおよび３０ヌクレオチドの両方が含まれる。
いくつかの実施形態では、その連続ヌクレオチド配列は、１０～３５ヌクレオチド長、例えば１０～３０、例えば１１～２２、例えば１２～２０、例えば１４～１８または１４～１６連続ヌクレオチド長を含み、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０連続ヌクレオチド長を含み、またはそれからなる。一般に、オリゴヌクレオチドは、連続ヌクレオチド配列よりも短くなり得ないことが理解される。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列は、各々表５および６に提供される標的配列領域Ａ１～Ａ８０または領域Ｂ１～Ｂ２９に対して完全に相補的である配列を含み、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列は、配列番号７～１６４、例えば配列番号７～８６、例えば配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５および８６（表７および８のモチーフ配列を参照）からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％同一、例えば１００％同一の少なくとも１０連続ヌクレオチドを含む。配列が、ヒトおよびカニクイザル（ｃｙｎｏ）の両方、例えば配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４６、４８、４９、５０、５１、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６９、７０、７１、７２、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８３、８４および８５からなる群から選択される配列に相補的である場合、有利である。
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列は、配列番号７～１６４、例えば配列番号７～８６、例えば配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５および８６（表７および８のモチーフ配列を参照）からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％同一、例えば１００％同一の少なくとも１２連続ヌクレオチドを含む。配列が、ヒトおよびカニクイザル（ｃｙｎｏ）の両方、例えば配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４６、４８、４９、５０、５１、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６９、７０、７１、７２、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８３、８４および８５からなる群から選択される配列に相補的である場合、有利である。
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列は、配列番号７～１６４、例えば配列番号７～８６、例えば配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５および８６（表７および８のモチーフ配列を参照）からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％同一、例えば１００％同一の少なくとも１３連続ヌクレオチドを含む。配列が、ヒトおよびカニクイザル（ｃｙｎｏ）の両方、例えば配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４６、４８、４９、５０、５１、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６９、７０、７１、７２、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８３、８４および８５からなる群から選択される配列に相補的である場合、有利である。
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列は、配列番号７～１６４、例えば配列番号７～８６、例えば配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５および８６（表７および８のモチーフ配列を参照）からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％同一、例えば１００％同一の少なくとも１４連続ヌクレオチドを含む。配列が、ヒトおよびカニクイザル（ｃｙｎｏ）の両方、例えば配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４６、４８、４９、５０、５１、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６９、７０、７１、７２、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８３、８４および８５からなる群から選択される配列に相補的である場合、有利である。
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列は、配列番号７～１６４、例えば配列番号７～８６、例えば配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５および８６からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％同一、例えば１００％同一の少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む。配列が、ヒトおよびカニクイザルの両方、例えば配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４６、４８、４９、５０、５１、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６９、７０、７１、７２、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８３、８４および８５からなる群から選択される配列に相補的である場合、有利である。
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列は、配列番号７～１６４、例えば配列番号７～８６、例えば配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５および８６（表７および８のモチーフ配列を参照）からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％同一、例えば１００％同一の少なくとも１６連続ヌクレオチドを含む。配列が、ヒトおよびカニクイザル（ｃｙｎｏ）の両方、例えば配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４６、４８、４９、５０、５１、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６９、７０、７１、７２、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８３、８４および８５からなる群から選択される配列に相補的である場合、有利である。
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列は、配列番号６５、６６、７１、７４および７５（表７および８に列挙されるモチーフ配列を参照）からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％同一、例えば１００％同一の少なくとも１７連続ヌクレオチドを含む。配列が、ヒトおよびカニクイザルの両方、例えば配列番号６５、６６および７１からなる群から選択される配列に相補的である場合、有利である。
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列は、配列番号１６７～２４６、例えば配列番号１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５および２４６からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的な少なくとも１０連続ヌクレオチドを含む。ヒトおよびカニクイザル（ｃｙｎｏ）の両方に存在する配列、例えば配列番号１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０６、２０８、２０９、２１０、２１１、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２９、２３０、２３１、２３２、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４および２４５からなる群から選択される配列を標的とすることが有利である。
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列は、配列番号２４７～３２６、例えば配列番号２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０および３２１からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的な少なくとも１０連続ヌクレオチドを含む。
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列は、配列番号１６７～２４６、例えば配列番号１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５および２４６からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的な少なくとも１２連続ヌクレオチドを含む。ヒトおよびカニクイザル（ｃｙｎｏ）の両方に存在する配列、例えば配列番号１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０６、２０８、２０９、２１０、２１１、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２９、２３０、２３１、２３２、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４および２４５からなる群から選択される配列を標的とすることが有利である。
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列は、配列番号２４７～３２６、例えば配列番号２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０および３２１からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的な少なくとも１２連続ヌクレオチドを含む。
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列は、配列番号１６７～２４６、例えば配列番号１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５および２４６からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的な少なくとも１３連続ヌクレオチドを含む。ヒトおよびカニクイザルの両方に存在する配列、例えば配列番号１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０６、２０８、２０９、２１０、２１１、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２９、２３０、２３１、２３２、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４および２４５からなる群から選択される配列を標的とすることが有利である。
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列は、配列番号２４７～３２６、例えば配列番号２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０および３２１からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的な少なくとも１３連続ヌクレオチドを含む。
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列は、配列番号１６７～２４６、例えば配列番号１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５および２４６からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的な少なくとも１４連続ヌクレオチドを含む。ヒトおよびカニクイザル（ｃｙｎｏ）の両方に存在する配列、例えば配列番号１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０６、２０８、２０９、２１０、２１１、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２９、２３０、２３１、２３２、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４および２４５からなる群から選択される配列を標的とすることが有利である。
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列は、配列番号２４７～３２６、例えば配列番号２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０および３２１からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的な少なくとも１４連続ヌクレオチドを含む。
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列は、配列番号１６７～２４６、例えば配列番号１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５および２４６からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的な少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む。ヒトおよびカニクイザル（ｃｙｎｏ）の両方に存在する配列、例えば配列番号１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０６、２０８、２０９、２１０、２１１、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２９、２３０、２３１、２３２、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４および２４５からなる群から選択される配列を標的とすることが有利である。
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列は、配列番号２４７～３２６、例えば配列番号２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０および３２１からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的な少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む。
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列は、配列番号１６７～２４６、例えば配列番号１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５および２４６からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的な少なくとも１６連続ヌクレオチドを含む。ヒトおよびカニクイザル（ｃｙｎｏ）の両方に存在する配列、例えば配列番号１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０６、２０８、２０９、２１０、２１１、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２９、２３０、２３１、２３２、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４および２４５からなる群から選択される配列を標的とすることが有利である。
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列は、配列番号２４７～３２６、例えば配列番号２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０および３２１からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的な少なくとも１６連続ヌクレオチドを含む。
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列は、配列番号１６７～２４６、例えば配列番号１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５および２４６からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的である。ヒトおよびカニクイザル（ｃｙｎｏ）の両方に存在する配列、例えば配列番号１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０６、２０８、２０９、２１０、２１１、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２９、２３０、２３１、２３２、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４および２４５からなる群から選択される配列を標的とすることが有利である。
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列は、配列番号２４７～３２６、例えば配列番号２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０および３２１からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的である。
本発明のいくつかの実施形態では、標的配列は、配列番号１６７～２４６、例えば配列番号１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５および２４６からなる群から選択される。ヒトおよびカニクイザル（ｃｙｎｏ）の両方に存在する配列、例えば配列番号１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０６、２０８、２０９、２１０、２１１、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２９、２３０、２３１、２３２、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４および２４５からなる群から選択される配列を標的とすることが有利である。
本発明のいくつかの実施形態では、標的配列は、配列番号２４７～３２６、例えば配列番号２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０および３２１からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列は、標的核酸の領域、例えば配列番号２２２、２２５、２２６、２３１、２３４および２３５からなる群から選択される標的配列に対して完全に相補的な少なくとも１０連続ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列は、標的核酸の領域、例えば配列番号２２２、２２５、２２６、２３１、２３４および２３５からなる群から選択される標的配列に対して完全に相補的な少なくとも１２連続ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列は、標的核酸の領域、例えば配列番号２２２、２２５、２２６、２３１、２３４および２３５からなる群から選択される標的配列に対して完全に相補的な少なくとも１３連続ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列は、標的核酸の領域、例えば配列番号２２２、２２５、２２６、２３１、２３４および２３５からなる群から選択される標的配列に対して完全に相補的な少なくとも１４連続ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列は、標的核酸の領域、例えば配列番号２２２、２２５、２２６、２３１、２３４および２３５からなる群から選択される標的配列に対して完全に相補的な少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列は、標的核酸の領域、例えば配列番号２２２、２２５、２２６、２３１、２３４および２３５からなる群から選択される標的配列に対して完全に相補的な少なくとも１６、例えば少なくとも１７の連続ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列は、配列番号１の位置２１０８４～２１１０１（領域Ａ５９、表５）、位置２１２１４～２１２３１（領域Ａ６０、表５）、位置２３８０６～２３８２２（領域Ａ７０表５）、位置２４０６０～２４０７７（領域Ａ６８、表５）または位置２４０４５～２４０９８（領域Ａ６７～Ａ７０、表５）からの標的核酸の領域に対して完全に相補的な、少なくとも１６、例えば少なくとも１７の連続ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号７～８６、例えば配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５および８６からなる群から選択される配列に対して１００％同一の連続ヌクレオチド配列、またはその少なくとも１２連続ヌクレオチドを含み、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号７～８６、例えば配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５および８６からなる群から選択される連続ヌクレオチド配列、またはその少なくとも１２連続ヌクレオチドを含み、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号７～８６、例えば配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５および８６からなる群から選択される配列に対して少なくとも１００％同一である連続ヌクレオチド配列、またはその少なくとも１２連続ヌクレオチドを含み、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号７～８６、例えば配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５および８６からなる群から選択される連続ヌクレオチド配列、またはその少なくとも１２連続ヌクレオチドを含み、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号６５、６６、７１、７４および７５からなる群から選択される配列に対して１００％同一の連続ヌクレオチド配列、またはその少なくとも１６連続ヌクレオチドを含み、またはそれからなる。
連続核酸塩基配列（モチーフ配列）は、例えばヌクレアーゼ耐性および／または標的核酸に対する親和性を増大させるために修飾され得ることが理解される。
修飾ヌクレオシド（高親和性修飾ヌクレオシドなど）がオリゴヌクレオチド配列に組み込まれるパターンは、一般にオリゴヌクレオチド設計と称される。
本発明のオリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシドおよびＤＮＡヌクレオシドを用いて設計される。高親和性修飾ヌクレオシドを用いることが有利である。
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド、例えば少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５または少なくとも１６個の修飾ヌクレオシドを含む。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１～１０個の修飾ヌクレオシド、例えば２～９個の修飾ヌクレオシド、例えば３～８個の修飾ヌクレオシド、例えば４～７個の修飾ヌクレオシド、例えば６または７個の修飾ヌクレオシドを含む。適切な修飾は、「修飾ヌクレオシド」、「高親和性修飾ヌクレオシド」、「糖修飾」、「２’糖修飾」およびロックド核酸（ＬＮＡ）の「定義」セクションに記載されている。
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つ以上の糖修飾ヌクレオシド、例えば２’糖修飾ヌクレオシドを含む。好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’－フルオロ－ＡＮＡおよびＬＮＡヌクレオシドからなる群から独立して選択される１つ以上の２’糖修飾ヌクレオシドを含む。修飾ヌクレオシドの１つ以上がロックド核酸（ＬＮＡ）である場合、有利である。
さらなる実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合を含む。適切なヌクレオシド間結合は、「修飾ヌクレオシド間結合」の「定義」セクションに記載されている。連続ヌクレオチド配列内の少なくとも７５％、例えばすべてのヌクレオシド間結合がホスホロチオエートまたはボラノホスフェート結合であれば有利である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの連続配列中の全ヌクレオチド間結合がホスホロチオエート結合である。
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシド、例えば１、２、３、４、５、６、７または８個のＬＮＡヌクレオシド、例えば２～６個のＬＮＡヌクレオシド、例えば３～７個のＬＮＡヌクレオシド、４～８個のＬＮＡヌクレオシド、または３、４、５、６、７もしくは８個のＬＮＡヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの修飾ヌクレオシドの少なくとも７５％、例えば修飾ヌクレオシドの８０％、例えば８５％、例えば９０％がＬＮＡヌクレオシドである。尚さらなる実施形態では、オリゴヌクレオチドの全修飾ヌクレオシドがＬＮＡヌクレオシドである。さらなる実施形態では、オリゴヌクレオチドは、β－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ、および以下のＬＮＡヌクレオシドの１つ以上：β－Ｄまたはα－Ｌ立体構造のいずれかのチオ－ＬＮＡ、アミノ－ＬＮＡ、ｏｘｙ－ＬＮＡ、ＳｃＥＴおよび／またはＥＮＡ、またはそれらの組み合わせの両方を含んでもよい。さらなる実施形態では、全ＬＮＡシトシン単位は、５－メチル－シトシンである。オリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列のヌクレアーゼ安定性にとって、ヌクレオチド配列の５’末端に少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシドと３’末端に少なくとも２つのＬＮＡヌクレオシドがあることが有利である。
本発明の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＲＮａｓｅ Ｈを動員することが可能である。
本発明において、有利な構造設計は、例えば、「ギャップマー」、「ＬＮＡギャップマー」、「ＭＯＥギャップマー」および「混合ウイングギャップマー」「交互フランクギャップマー」の「定義」セクションに記載されているギャップマー設計である。ギャップマー設計には、均一フランク、混合ウイングフランク、交互フランク、およびギャップブレーカー設計のギャップマーが含まれる。本発明では、本発明のオリゴヌクレオチドがＦ－Ｇ－Ｆ ’設計のギャップマーである場合が有利である。いくつかの実施形態では、ギャップマーは、領域ＦおよびＦ’の少なくとも一方または両方が少なくとも１つのＬＮＡ単位を含むＬＮＡギャップマーである。
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、６’－メチル－β－Ｄ－オキシ－ＬＮＡヌクレオシドを含まない。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－メトキシエチルヌクレオシドを含まない。
いくつかの実施形態では、ＬＮＡギャップマーは、配列番号７～８６、例えば配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５および８６からなる群から選択される配列に対して１００％同一の連続ヌクレオチド配列、またはその少なくとも１２連続ヌクレオチドを含み、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、ＬＮＡギャップマーは、配列番号７～８６、例えば配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５および８６からなる群から選択される連続ヌクレオチド配列、またはその少なくとも１２連続ヌクレオチドを含み、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、ＬＮＡギャップマーは、配列番号７～８６、例えば配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５および８６からなる群から選択される連続ヌクレオチド配列、またはその少なくとも１３連続ヌクレオチドを含み、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、ＬＮＡギャップマーは、配列番号７～８６、例えば配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５および８６からなる群から選択される連続ヌクレオチド配列、またはその少なくとも１４連続ヌクレオチドを含み、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、ＬＮＡギャップマーは、配列番号７～８６、例えば配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５および８６からなる群から選択される連続ヌクレオチド配列、またはその少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、ＬＮＡギャップマーは、配列番号７～８６、例えば配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５および８６からなる群から選択される連続ヌクレオチド配列、またはその少なくとも１６連続ヌクレオチドを含み、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、ＬＮＡギャップマーは、配列番号６５、６６、７１、７４および７５からなる群から選択される連続ヌクレオチド配列、またはその少なくとも１６連続ヌクレオチドを含み、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、本発明の化合物は、配列番号７～８６、例えば配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５および８６からなる群から選択される連続ヌクレオチド配列を含み、またはそれからなり、配列の設計は、表７に列挙されているものに対応する。特に、フランク（ＦおよびＦ’）は、ＬＮＡ、ｃＥＴ、ＭＯＥなどの２’－糖修飾ヌクレオシド（Ｍ）から選択され、ギャップはＤＮＡのストレッチ（Ｄ）を構成する。交互フランク設計のギャップマーでは、オリゴヌクレオチドのフランクは一連の整数として注釈が付けられ、２’糖修飾ヌクレオシド（Ｍ）の後にいくつかのＤＮＡヌクレオシド（Ｄ）が続く。例えば、２－２－１モチーフのフランクは５’［Ｍ］２－［Ｄ］２－［Ｍ］３’を表し、１－１－１－１－１モチーフは５’［Ｍ］－［Ｄ］－［Ｍ］－［Ｄ］－［Ｍ］３’を表す。両方のフランクは、５’’および３’末端に２’糖修飾ヌクレオシドを有する。ギャップ領域（Ｇ）は、フランクの間に位置するいくつかのＤＮＡヌクレオシド（通常は５～１６個）で構成されている。
いくつかの実施形態では、本発明の化合物は、ＣＭＰ番号７＿１～８６＿１、例えば７＿１、８＿１、９＿１、１０＿１、１１＿１、１２＿１、１３＿１、１４＿１、１５＿１、１６＿１、１７＿１、１８＿１、１９＿１、２０＿１、２１＿１、２２＿１、２３＿１、２４＿１、２５＿１、２６＿１、２７＿１、２８＿１、２９＿１、３０＿１、３１＿１、３２＿１、３３＿１、３４＿１、３５＿１、３６＿１、３７＿１、３８＿１、３９＿１、４０＿１、４１＿１、４２＿１、４３＿１、４４＿１、４５＿１、４６＿１、４７＿１、４８＿１、４９＿１、５０＿１、５１＿１、５２＿１、５３＿１、５４＿１、５５＿１、５６＿１、５７＿１、５８＿１、５９＿１、６０＿１、６１＿１、６２＿１、６３＿１、６４＿１、６５＿１、６６＿１、６７＿１、６８＿１、６９＿１、７０＿１、７１＿１、７２＿１、７３＿１、７４＿１、７５＿１、７６＿１、７７＿１、７８＿１、７９＿１、８０＿１、８１＿１、８２＿１、８３＿１、８４＿１、８５＿１および８６＿１からなる群から選択される連続ヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなり、大文字はＬＮＡヌクレオシドであり、小文字はＤＮＡヌクレオシドであり、ＬＮＡシトシンヌクレオシドは場合により５メチルシトシンＬＮＡであり、ＤＮＡシトシンは場合により５－メチルシトシンＤＮＡである。
いくつかの実施形態では、本発明の化合物は、ＣＭＰ番号７＿１～８６＿１、例えば７＿１、８＿１、９＿１、１０＿１、１１＿１、１２＿１、１３＿１、１４＿１、１５＿１、１６＿１、１７＿１、１８＿１、１９＿１、２０＿１、２１＿１、２２＿１、２３＿１、２４＿１、２５＿１、２６＿１、２７＿１、２８＿１、２９＿１、３０＿１、３１＿１、３２＿１、３３＿１、３４＿１、３５＿１、３６＿１、３７＿１、３８＿１、３９＿１、４０＿１、４１＿１、４２＿１、４３＿１、４４＿１、４５＿１、４６＿１、４７＿１、４８＿１、４９＿１、５０＿１、５１＿１、５２＿１、５３＿１、５４＿１、５５＿１、５６＿１、５７＿１、５８＿１、５９＿１、６０＿１、６１＿１、６２＿１、６３＿１、６４＿１、６５＿１、６６＿１、６７＿１、６８＿１、６９＿１、７０＿１、７１＿１、７２＿１、７３＿１、７４＿１、７５＿１、７６＿１、７７＿１、７８＿１、７９＿１、８０＿１、８１＿１、８２＿１、８３＿１、８４＿１、８５＿１および８６＿１からなる群から選択される連続ヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなり、大文字はＬＮＡヌクレオシドであり、小文字はＤＮＡヌクレオシドであり、ＬＮＡシトシンヌクレオシドは場合により５メチルシトシンＬＮＡであり、ＤＮＡシトシンは場合により５－メチルシトシンＤＮＡであり、連続ヌクレオチド配列内の全ヌクレオシド間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
いくつかの実施形態では、本発明の化合物は、ＣＭＰ番号７＿１～８６＿１、例えば７＿１、８＿１、９＿１、１０＿１、１１＿１、１２＿１、１３＿１、１４＿１、１５＿１、１６＿１、１７＿１、１８＿１、１９＿１、２０＿１、２１＿１、２２＿１、２３＿１、２４＿１、２５＿１、２６＿１、２７＿１、２８＿１、２９＿１、３０＿１、３１＿１、３２＿１、３３＿１、３４＿１、３５＿１、３６＿１、３７＿１、３８＿１、３９＿１、４０＿１、４１＿１、４２＿１、４３＿１、４４＿１、４５＿１、４６＿１、４７＿１、４８＿１、４９＿１、５０＿１、５１＿１、５２＿１、５３＿１、５４＿１、５５＿１、５６＿１、５７＿１、５８＿１、５９＿１、６０＿１、６１＿１、６２＿１、６３＿１、６４＿１、６５＿１、６６＿１、６７＿１、６８＿１、６９＿１、７０＿１、７１＿１、７２＿１、７３＿１、７４＿１、７５＿１、７６＿１、７７＿１、７８＿１、７９＿１、８０＿１、８１＿１、８２＿１、８３＿１、８４＿１、８５＿１および８６＿１からなる群から選択される連続ヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなり、表７に示すように、大文字はβ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドであり、小文字はＤＮＡヌクレオシドであり、ＬＮＡシトシンヌクレオシドは５メチルシトシンＬＮＡであり、連続ヌクレオチド配列内の全ヌクレオシド間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
いくつかの実施形態では、本発明の化合物は、ＣＭＰ番号７＿１～８６＿１、例えば７＿１、８＿１、９＿１、１０＿１、１１＿１、１２＿１、１３＿１、１４＿１、１５＿１、１６＿１、１７＿１、１８＿１、１９＿１、２０＿１、２１＿１、２２＿１、２３＿１、２４＿１、２５＿１、２６＿１、２７＿１、２８＿１、２９＿１、３０＿１、３１＿１、３２＿１、３３＿１、３４＿１、３５＿１、３６＿１、３７＿１、３８＿１、３９＿１、４０＿１、４１＿１、４２＿１、４３＿１、４４＿１、４５＿１、４６＿１、４７＿１、４８＿１、４９＿１、５０＿１、５１＿１、５２＿１、５３＿１、５４＿１、５５＿１、５６＿１、５７＿１、５８＿１、５９＿１、６０＿１、６１＿１、６２＿１、６３＿１、６４＿１、６５＿１、６６＿１、６７＿１、６８＿１、６９＿１、７０＿１、７１＿１、７２＿１、７３＿１、７４＿１、７５＿１、７６＿１、７７＿１、７８＿１、７９＿１、８０＿１、８１＿１、８２＿１、８３＿１、８４＿１、８５＿１および８６＿１からなる群から選択され、大文字はＬＮＡヌクレオシドであり、小文字はＤＮＡヌクレオシドであり、ＬＮＡシトシンヌクレオシドは場合により５メチルシトシンＬＮＡであり、ＤＮＡシトシンは場合により５－メチルシトシンＤＮＡであり、ＤＮＡヌクレオシド間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
いくつかの実施形態では、本発明の化合物は、化合物の群から選択され、
ＡＴＧＴｔｔａｔｃａｃｃａａＡＡＴＴ（配列番号６５、ＣＭＰ番号６５＿１）
ＣＴＧＡａａｔａｃｔａｃｃａＴＡＴＡ（配列番号６６、ＣＭＰ番号６６＿１）
ＴＴＴＡａｔｃａｔａｃｃａＡＴＣＴ（配列番号７１、ＣＭＰ番号７１＿１）
ＴＴＣＴｔａｔｔｔｃａａａｔＣＴＣＡ（配列番号７４、ＣＭＰ番号７４＿１）
ＴＣＴＴａｔｔｔｃａａａｔＣＴＣＡ（配列番号７５、ＣＭＰ番号＿１）
ここで、大文字はβ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡなどのＬＮＡヌクレオシドであり、小文字はＬＮＡヌクレオシドであり、ＬＮＡシトシンヌクレオシドは場合により５メチルシトシンＬＮＡであり、ＤＮＡシトシンヌクレオシドは場合により５－メチルシトシンＤＮＡであり、ＤＮＡヌクレオシド間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
いくつかの実施形態では、本発明の化合物は、ＣＭＰ番号７＿１～８６＿１の化合物の群から選択され、大文字はＬＮＡヌクレオシドであり、小文字はＤＮＡヌクレオシドであり、ＬＮＡシトシンヌクレオシドは場合により５メチルシトシンＬＮＡであり、ＤＮＡシトシンは場合により５－メチルシトシンＤＮＡであり、全ヌクレオシド間結合ヌクレオシドは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
有利には、本発明の化合物は、薬学的に許容される塩の形態である。
本発明のさらなる実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの立体的に規定されたヌクレオシド間結合、例えば立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含み得る。立体的に規定されたオリゴヌクレオチド変異体を生成する利点は、配列モチーフ全体の多様性を高め、立体的に規定されていないオリゴヌクレオチドと比較して改善された医薬化学的性質を有する、立体的に規定されたオリゴヌクレオチドのサブライブラリを含む立体的に規定されたオリゴヌクレオチドを選択できることである。
本発明は、本発明によるオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドと、前記オリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも１つのコンジュゲート部分とを含むコンジュゲートを提供する。いくつかの実施形態では、コンジュゲート部分は、トランスフェリン受容体を標的とする抗体または抗体断片など、血液脳関門を通過する送達を促進するコンジュゲートである。
本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドの薬学的に許容され得る塩、またはコンジュゲートを提供する。
いくつかの実施形態では、本発明の連続ヌクレオチド配列は、配列ＧＡＴＣＡＧＡＧＡＴＴＡＡＧＧＣＣＡＡ（配列番号３２２）に存在する１０個以上の連続ヌクレオチドを含まない。いくつかの実施形態では、本発明の連続ヌクレオチド配列は、配列ＧＣＡＧＡＴＴＧＡＴＴＡＴＡＣＧＧＴＡ（配列番号３２３）またはＧＴＧＧＡＡＧＧＡＡＣＡＣＧＡＣＴＴＡ（配列番号３２４）に存在する１０個以上の連続ヌクレオチドを含まない。
製造方法
さらなる態様では、本発明は、ヌクレオチド単位を反応させ、それによってオリゴヌクレオチドからなる共有結合された連続ヌクレオチド単位を形成することを含む、本発明のオリゴヌクレオチドを製造する方法を提供する。好ましくは、この方法は、ホスホラミダイト化学を使用する（例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ｅｔ ａｌ，１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１５４，ｐａｇｅｓ ２８７－３１３を参照のこと）。さらなる実施形態では、この方法は、連続ヌクレオチド配列を結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ）部分（リガンド）と反応させて、コンジュゲート部分をオリゴヌクレオチドに共有結合させることをさらに含む。さらなる態様では、本発明のオリゴヌクレオチドまたは結合オリゴヌクレオチドを薬学的に許容され得る希釈剤、溶媒、担体、塩および／または佐剤と混合することを含む、本発明の組成物を製造する方法が提供される。
薬学的塩
本発明による化合物は、それらの薬学的に許容され得る塩の形態で存在し得る。「薬学的に許容され得る塩」という用語は、本発明の化合物の生物学的有効性および特性を保持し、適切な非毒性の有機もしくは無機酸または有機もしくは無機塩基から形成される従来の酸付加塩または塩基付加塩を指す。酸付加塩には、例えば、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸および硝酸などの無機酸に由来するもの、ならびにｐ－トルエンスルホン酸、サリチル酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸などの有機酸に由来するものが含まれる。塩基付加塩には、アンモニウム、カリウム、ナトリウム、および第四級アンモニウム水酸化物、例えばテトラメチルアンモニウム水酸化物から誘導されるものが含まれる。医薬化合物の塩への化学修飾は、化合物の物理的および化学的安定性、吸湿性、流動性、および溶解性を向上させるために、薬剤師によく知られている手法である。これは例えば、Ｂａｓｔｉｎ，Ｏｒｇａｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２０００，４，４２７－４３５ ｏｒ ｉｎ Ａｎｓｅｌ，Ｉｎ：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，６ｔｈ ｅｄ．（１９９５），ｐｐ．１９６ ａｎｄ １４５６－１４５７に記載されている。例えば、本明細書で提供される化合物の薬学的に許容され得る塩は、ナトリウム塩であり得る。
さらなる態様では、本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲートの薬学的に許容され得る塩を提供する。好ましい実施形態では、薬学的に許容され得る塩は、ナトリウムまたはカリウム塩である。
医薬組成物
さらなる態様では、本発明は、前述のオリゴヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその塩のいずれかと、薬学的に許容される希釈剤、担体、塩および／または佐剤とを含む医薬組成物を提供する。薬学的に許容される希釈剤には、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれ、薬学的に許容される塩には、ナトリウム塩およびカリウム塩が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される希釈剤は、無菌リン酸緩衝生理食塩水である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５０～３００μＭ溶液の濃度で薬学的に許容される希釈剤中で使用される。
本発明での使用に適した製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，１７ｔｈ ｅｄ．，１９８５に見られる。薬物送達の方法の簡単なレビューについては、例えば、Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３，１９９０）を参照のこと。国際公開第２００７／０３１０９１号は、薬学的に許容される希釈剤、担体および佐剤のさらに適切で好ましい例を提供する（参照により本明細書に組み込まれる）。適切な用量、製剤、投与経路、組成物、剤形、他の治療薬との組み合わせ、プロドラッグ製剤もまた、国際公開第２００７／０３１０９１号に提供されている。
本発明のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、医薬組成物または製剤の調製のために、薬学的に許容され得る活性または不活性物質と混合されてもよい。医薬組成物の調製のための組成物および方法は、限定されるものではないが、投与経路、疾患の程度、または投与される用量を含む多くの基準に依存する。
これらの組成物は、従来の滅菌技術によって滅菌され得るか、または滅菌濾過され得る。得られた水溶液は、そのまま使用するために包装するか、または凍結乾燥することができ、凍結乾燥された調製物は、投与前に滅菌水性担体と組み合わされる。調製物のｐＨは、典型的には３～１１、より好ましくは５～９または６～８、最も好ましくは７～８、例えば７～７．５であろう。得られた固体形態の組成物は、錠剤またはカプセルの密封パッケージなどのように、各々が上記の薬剤または薬剤群の固定量を含む複数の単回用量単位で包装することができる。固体形態の組成物はまた、局所適用可能なクリームまたは軟膏用に設計された絞り出し可能なチューブなどの柔軟な量の容器に包装することもできる。
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートはプロドラッグである。特にオリゴヌクレオチドコンジュゲートに関して、プロドラッグが作用部位、例えば標的細胞に送達されると、コンジュゲート部分はオリゴヌクレオチドから切断される。
用途
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、診断、治療および予防のための研究試薬として利用され得る。
研究では、そのようなオリゴヌクレオチドを使用して、細胞（例えば、インビトロ細胞培養物）および実験動物におけるＴＭＥＭ１０６Ｂタンパク質の合成を特異的に調節し、それによって標的の機能分析または治療的介入の標的としてのその有用性の評価を促進することができる。典型的には、標的調節は、タンパク質を生成するｍＲＮＡを分解または阻害し、それによりタンパク質形成を防止することによって、またはタンパク質を生成する遺伝子もしくはｍＲＮＡのモジュレーターを分解もしくは阻害することによって達成される。
本発明のオリゴヌクレオチドを研究または診断に使用する場合、標的核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡに由来するｃＤＮＡまたは合成核酸であり得る。
本発明は、ＴＭＥＭ１０６Ｂを発現している標的細胞におけるＴＭＥＭ１０６Ｂ発現を調節するためのインビボまたはインビトロ方法を提供し、前記方法は、本発明のオリゴヌクレオチドを前記細胞に有効量で投与することを含む。
いくつかの実施形態では、標的細胞は、神経細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、小膠細胞である。
いくつかの実施形態では、標的細胞は、哺乳動物細胞、特にヒト細胞である。標的細胞は、哺乳動物の組織の一部を形成するインビトロ細胞培養物またはインビボ細胞であってよい。好ましい実施形態では、標的細胞は、前頭側頭葉などの脳などのＣＮＳに存在する。
いくつかの実施形態では、標的細胞は、ＣＮＳ細胞、脳細胞、前頭皮質細胞または前頭側頭葉細胞である。
いくつかの実施形態では、標的細胞は、視床、海馬、線条体、網膜、または脊髄に存在する細胞である。
いくつかの実施形態では、標的細胞は、視床細胞、海馬細胞、線条体細胞、網膜細胞、または脊髄細胞である。
標的細胞などの細胞における、ＴＭＥＭ１０６Ｂ発現またはその阻害の評価、または標的化などのインビトロでの使用のために、細胞は組織、例えばＣＮＳ組織、脳組織、前頭皮質、前頭側頭葉組織、視床組織、海馬組織、線条体組織、網膜組織、または脊髄組織から単離され得るか、または組織に由来し得る（例えば、樹立されたまたは不死化細胞株）ことが理解されるであろう。標的組織から分離された細胞は、初代細胞と称される。
診断では、オリゴヌクレオチドを使用して、ノーザンブロッティング、ｉｎ－ｓｉｔｕハイブリダイゼーションまたは同様の技術により、細胞および組織におけるＴＭＥＭ１０６Ｂ発現を検出および定量することができる。
治療のために、オリゴヌクレオチドは、ＴＭＥＭ１０６Ｂの発現を調節することによって治療することができる疾患または障害を有することが疑われる動物またはヒトに投与することができる。
本発明は、治療的または予防的に有効な量の本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または医薬組成物を、疾患に苦しむまたは罹り易い対象に投与することを含む、疾患の治療または予防方法を提供する。
本発明はまた、医薬として使用するための、本明細書で定義されるオリゴヌクレオチド、組成物またはコンジュゲートに関する。
本発明によるオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは医薬組成物は、典型的には有効量で投与される。
本発明はまた、本明細書で言及される障害の治療のための医薬の製造のため、または本明細書で言及される障害の治療の方法のために記載される本発明のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートの使用を提供する。
本明細書で言及される疾患または障害は、ＴＭＥＭ１０６Ｂの発現に関連している。いくつかの実施形態では、疾患または障害は、ＴＭＥＭ１０６Ｂ遺伝子またはそのタンパク質産物がＴＭＥＭ１０６Ｂと関連するかまたは相互作用する遺伝子における突然変異と関連し得る。したがって、いくつかの実施形態では、標的核酸は、ＴＭＥＭ１０６Ｂ配列の変異形態であり、他の実施形態では、標的核酸は、ＴＭＥＭ１０６Ｂ配列の調節因子である。
本発明の方法は、好ましくは、ＴＭＥＭ１０６Ｂの異常なレベルおよび／または活性によって引き起こされる疾患の治療または予防のために使用される。
本発明はさらに、ＴＭＥＭ１０６Ｂの異常なレベルおよび／または活性を治療するための医薬を製造するための、本明細書で定義されるオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは医薬組成物の使用に関する。
いくつかの態様では、本発明は、神経変性、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、パーキンソン病（またはパーキンソニズム）、低髄鞘性白質ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症および多系統萎縮症、アルツハイマー病、運動ニューロン疾患、皮質基底核症候群、進行性核上性麻痺、および神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）からなる群から選択される疾患または障害の治療に使用するための、本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは医薬組成物に関する。
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、前頭皮質の加齢に伴う変化の治療に使用される。
一態様では、本発明は、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）の治療に使用するための、本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは医薬組成物に関する。オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは医薬組成物は、ユビキチン化タンパク質（ＦＴＬＤ－Ｕ）の核内および／または細胞質蓄積を特徴とするＦＴＬＤ、特に前頭葉および側頭脳領域内のユビキチン化ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ－４３）蓄積の存在を特徴とするＦＴＤＬ－ＴＤＰ、および他のＴＤＰ－４３タンパク質症の治療において有利であり得る。
投与
本発明のオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物は、非経口（静脈内、皮下、筋肉内、脳内、脳室内、眼内、または髄腔内投与など）を介して投与することができる。
いくつかの実施形態では、投与は、髄腔内投与を介する。
有利には、例えば神経学的障害の治療のために、本発明のオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物は、髄腔内または頭蓋内に、例えば脳内または脳室内投与を介して投与される。
本発明はまた、皮下投与用の剤形である医薬の製造のための、本発明の薬学的塩または組成物などのオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲートの使用を提供する。
本発明はまた、髄腔内投与用の剤形である医薬の製造のための、本発明の薬学的塩または組成物などの、本発明のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲートの使用を提供する。
併用療法
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは医薬組成物は、別の治療剤との併用治療で使用するためのものである。治療剤は、例えば、上記の疾患または障害の標準的な治療であり得る。
実施形態
１．哺乳動物ＴＭＥＭ１０６Ｂ標的核酸に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的な１０～３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む、ＴＭＥＭ１０６Ｂを標的とするオリゴヌクレオチド。
２．前記オリゴヌクレオチドが、細胞における哺乳動物ＴＭＥＭ１０６Ｂ標的核酸の発現を低下させることができる、実施形態１に記載のオリゴヌクレオチド。
３．前記オリゴヌクレオチドが治療用オリゴヌクレオチドである、実施形態１～１０のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド。
４．前記哺乳動物ＴＭＥＭ１０６Ｂ標的核酸が、配列番号１、２、３、４、５および６、またはその天然に存在する変異体から選択される、実施形態１～３のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド。
５．前記天然に存在する変異体が表４に列挙された多型から選択される、実施形態４に記載のオリゴヌクレオチド。
６．前記標的核酸がＲＮＡである、実施形態１～５のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド。
７．ＲＮＡがｍＲＮＡである、実施形態６に記載のオリゴヌクレオチド。
８．ｍＲＮＡがプレＲＮＡまたは成熟ＲＮＡである、実施形態７に記載のオリゴヌクレオチド。
９．連続ヌクレオチド配列が、配列番号１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５および２４６、または配列番号２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０および３２１からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的な少なくとも１０連続ヌクレオチドを含む、実施形態１～８のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド。
１０．オリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列が、配列番号１および／または２、またはその天然に存在する変異体に対して完全に相補的である、実施形態１～９のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド。
１１．前記連続ヌクレオチド配列が、配列番号１の領域に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的な少なくとも１０連続ヌクレオチドを含み、前記領域が配列番号１の位置５４６－５６３；２１２２－２１４０；２１４３－２１６０；２１６５－２１８３；２３００－２３１７；２３９２－２４１０；２５４８－２５６５；３５０７－３５２４；３６７８－３６９４；３７３６－３７５３；３７５２－３７６７；３８０２－３８１９；３９０８－３９２５；３９０８－６４１７；４３２１－４３３７；４７０１－４７２０；４９４８－４９６５；５０６３－５０８０；５０６９－５０８６；５１７２－５１９０；５５１２－５５３０；５５８３－５５９９；６０１５－６０４７；６０１５－６０３２；６０３２－６０４７；６１２５－６１５４；６１２５－６１４０；６１３６－６１５４；６１７２－６１８９；６２００－６２３１；６２００－６２１６；６２１４－６２３１；６４０１－６４１７；６４５８－６４７６；６８３７－６８５３；８４５３－８４７２；８９８３－９００１；９５３３－９５４９；９６２８－９６４４；１１０６５－１１０８３；１１１１７－１１１３４；１１２６４－１１２８１；１２３１０－１２３２５；１２８７０－１２８８７；１３０５０－１３０６５；１３３９７－１３４１４；１５０６１－１５０７９；１５２４９－１５２６６；１５３１８－１５３３６；１５３６８－１５３８５；１５４４０－１５４５７；１５６３２－１５６４９；１５８２３－１５８４２；１６４９６－１６５１３；１９０９０－１９１０９；１９１９８－１９２１７；１９２１１－１９２２８；１９６９９－１９７１８；２０２１７－２０２４３；２０２１７－２０２３６；２０２２７－２０２４３；２０７５５－２６４０３；２０７６７－２０７８６；２０８８０－２０８９６；２１０８４－２１１０１；２１２１４－２１２３１；２１４２５－２１４４２；２２１１０－２５４０６；２２１１０－２２１２８；２３３７４－２３３９３；２３４３５－２３４５２；２３８０６－２３８２２；２３８７４－２３８９０；２４０４５－２４０９８；２４０４５－２４０６３；２４０６０－２４０７７；２４０６０－２４０７６；２４０６４－２４０８３；２４０８１－２４０９８；２４０４５－２４０９８；２４８０１－２４８２８；２４８０１－２４８１９；２４８１２－２４８２８；２５０５０－２５０６７；２５３７２－２５３８７；２５３９２－２５４０６；２５７７３－２５７９０；２５７９６－２５８１４；２５９６９－２５９８５；および２９３５１－２９３６７からなる群から選択される、実施形態１～１０のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド。
１２．前記連続ヌクレオチド配列が、配列番号１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５および２４６からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的な少なくとも１０連続ヌクレオチドを含む、実施形態１～１１のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド。
１３．連続ヌクレオチド配列が、配列番号１および配列番号３、またはその天然に存在する変異体に対して相補的、例えば完全に相補的である、実施形態１～１２のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド。
１４．連続ヌクレオチド配列が、配列番号１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０６、２０８、２０９、２１０、２１１、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２９、２３０、２３１、２３２、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４および２４５からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的な少なくとも１０連続ヌクレオチドを含む、実施形態１３に記載のオリゴヌクレオチド。
１５．哺乳動物ＴＭＥＭ１０６Ｂ標的核酸の３’ＵＴＲに対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的な１０～３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む、実施形態１～１４のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド。
１６．少なくとも１０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列が、配列番号１の位置２０２２７～２６４０３、または位置２０２２７～２４０７７の配列に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的である、実施形態１～１５のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド。
１７．前記連続ヌクレオチド配列が、配列番号１の位置２０７５５～位置２６４０３に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的である、実施形態１～１６のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド。
１８．少なくとも１０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列が、配列番号１の位置２１０８４～２１２３１、例えば位置２１０８４～２１２１３の配列に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的である、実施形態１～１７のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド。
１９．少なくとも１０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列が、配列番号１の位置２２１１０～２５４０６に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的である、実施形態１～１７のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド。
２０．少なくとも１０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列が、配列番号１の位置２３０８６～２４０７７の配列に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的である、実施形態１～１７のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド。
２１．少なくとも１０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列が、配列番号１の位置２０２２７～２０２４３の配列に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的である、実施形態１～１７のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド。
２２．少なくとも１０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列が、配列番号１の位置２０２２７～２６４０３の配列に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的である、実施形態１～１７のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド。
２３．本発明は、配列番号１の位置２４０４５～２４０９８の配列に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的である少なくとも１０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む、ＴＭＥＭ１０６Ｂを標的とするオリゴヌクレオチドを提供する。
２４．少なくとも１０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列が、配列番号１の位置２２１１０－２２１２８、２４０４５－２４０６３、２４０６０－２４０７７、２４８１２－２４８２８および２５３９２－２５４０６の配列に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的である、実施形態１～１７のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド。
２５．少なくとも１０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列が、配列番号１の位置３９０８～６４１７に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的である、実施形態１～１４のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド。
２６．少なくとも１０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列が、配列番号１の位置３９０８－３９２５、６１３６－６１５４、５１７２－５１９０、６２００－６２１６および６４０１－６４１７からなる群から選択される領域に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的である、実施形態２５に記載のオリゴヌクレオチド。
２７．前記連続ヌクレオチド配列が、配列番号１または実施形態１２または１４に列挙された配列番号の１つに対して完全に相補的である、実施形態１～２６のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド。
２８．前記オリゴヌクレオチドが、－１０ｋｃａｌ未満のΔＧ°で、配列番号１の標的核酸、または配列番号１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５および２４６からなる群から選択される標的配列とハイブリダイズすることが可能である、実施形態１～２７のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド。
２９．前記連続ヌクレオチド配列が、配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６からなる群から選択される配列に存在する少なくとも１０連続、例えば少なくとも１２連続または少なくとも１４連続ヌクレオチドを含む、実施形態１～２８のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド。
３０．前記連続ヌクレオチド配列が、配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４６、４８、４９、５０、５１、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６９、７０、７１、７２、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８３、８４および８５からなる群から選択される少なくとも１０連続ヌクレオチドを含む、実施形態１～２９のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド。
３１．前記連続ヌクレオチド配列が、配列番号８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０および１６１からなる群から選択される少なくとも１０連続ヌクレオチドを含む、実施形態１～９のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド。
３２．前記オリゴヌクレオチドが、６０ヌクレオチド長よりも短く、例えば５０ヌクレオチド長よりも短く、例えば１０～６０または１０～５０ヌクレオチド長である、実施形態１～３１のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド。
３３．前記連続ヌクレオチド配列が、少なくとも１０連続ヌクレオチド、特に１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９連続ヌクレオチドを含み、またはそれからなる、実施形態１～３２のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド。
３４．前記連続ヌクレオチド配列が、配列番号１または実施形態１２または１４に列挙された配列番号の１つに対して完全に相補的な、少なくとも１２ヌクレオチド長、例えば少なくとも１４ヌクレオチド長である、実施形態３３に記載のオリゴヌクレオチド。
３５．前記連続ヌクレオチド配列が、１２～２２個のヌクレオチドを含み、またはそれからなる、実施形態１～３２のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド。
３６．前記連続ヌクレオチド配列が、１４～２０個のヌクレオチドを含み、またはそれからなる、実施形態３５に記載のオリゴヌクレオチド。
３７．前記連続ヌクレオチド配列が、それが相補的である標的核酸と比較して、０～３個のミスマッチを有する、実施形態１～３６のいずれか１つに記載のオリコヌクレオチド。
３８．前記連続ヌクレオチド配列が、標的核酸と比較して１つのミスマッチを有する、実施形態３７に記載のオリゴヌクレオチド。
３９．前記連続ヌクレオチド配列が、標的核酸と比較して２つのミスマッチを有する、実施形態３７に記載のオリゴヌクレオチド。
４０．前記連続ヌクレオチド配列が、標的核酸配列に対して完全に相補的である、実施形態３７に記載のオリゴヌクレオチド。
４１．前記オリゴヌクレオチドが、１つ以上の２’糖修飾ヌクレオシドを含む、実施形態１～４０のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド。
４２．前記１つ以上の２’－糖修飾ヌクレオシドが、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’－フルオロ－ＡＮＡおよびＬＮＡヌクレオシドからなる群から独立して選択される、実施形態４１に記載のオリゴヌクレオチド。
４３．前記１つ以上の２’－糖修飾ヌクレオシドの少なくとも１つが、ＬＮＡヌクレオシドである、実施形態４２に記載のオリゴヌクレオチド。
４４．前記修飾ＬＮＡヌクレオシドが、オキシ－ＬＮＡ、アミノ－ＬＮＡ、チオ－ＬＮＡおよびＥＮＡから選択される、実施形態４３に記載のオリゴヌクレオチド。
４５．前記修飾ＬＮＡヌクレオシドが、以下の２’－４’架橋－Ｏ－ＣＨ２－を有するオキシ－ＬＮＡである、実施形態４３または４４に記載のオリゴヌクレオチド。
４６．前記オキシ－ＬＮＡがβ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡである、実施形態４５に記載のオリゴヌクレオチド。
４７．前記修飾ＬＮＡヌクレオシドが、以下の２’－４’架橋－Ｏ－ＣＨ（ＣＨ３）－を有するｃＥＴである、実施形態４３または４４に記載のオリゴヌクレオチド。
４８．ｃＥＴが（Ｓ）ＣＥＴ、即ち６’（Ｓ）メチル－β－Ｄ－オキシ－ＬＮＡである、実施形態４７に記載のオリゴヌクレオチド。
４９．ＬＮＡがＥＮＡであり、２’－４’架橋－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－がそれに続く、実施形態４３または４４に記載のオリゴヌクレオチド。
５０．前記連続ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合を含む、実施形態１～４９のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド。
５１．前記連続ヌクレオチド配列が、少なくとも１つのホスホロチオエート修飾ヌクレオシド間結合を含む、実施形態１～５０のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド。
５２．前記オリゴヌクレオチドが、ｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡであり、またはｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡのガイド鎖を形成する、実施形態１～５１のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド。
５３．前記オリゴヌクレオチドが、ＲＩＳＣ複合体と相互作用することができる二本鎖ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドまたはｓｈＲＮＡオリゴヌクレオチドである、実施形態５２に記載のオリゴヌクレオチド。
５４．前記オリゴヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチドである、実施形態１～５１のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド。
５５．前記オリゴヌクレオチドが単鎖である、実施形態５４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
５６．前記連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間のヌクレオシド間結合の少なくとも７５％または全部が、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、実施形態５４または５５に記載のオリゴヌクレオチド。
５７．前記オリゴヌクレオチドが、ＲＮａｓｅ Ｈ１を動員することが可能である、実施形態５４～５６のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド。
５８．前記オリゴヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチドギャップマーである、実施形態５７に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
５９．前記アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列が、式５’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－３’のギャップマーからなり、またはそれを含み、領域ＦおよびＦ’が独立して１～８個のヌクレオシドを含み、そのうち１～５個が独立して２’糖修飾され、ＦおよびＦ’領域の５’および３’末端を規定し、ＧがＲＮａｓｅＨを動員することが可能な５～１８個のヌクレオシドの領域、例えば５～１８個のＤＮＡヌクレオシドを含む領域である、実施形態５７または５８に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
６０．前記２’糖修飾ヌクレオシドが、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’－フルオロ－ＡＮＡおよびＬＮＡヌクレオシドからなる群から独立して選択される、実施形態５９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
６１．領域ＦおよびＦ’内の１つ以上の２’糖修飾ヌクレオシドが、ＬＮＡヌクレオシドである、実施形態５９または６０に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
６２．前記ＬＮＡヌクレオシドが、β－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ、α－Ｌ－オキシ－ＬＮＡ、β－Ｄ－アミノ－ＬＮＡ、α－Ｌ－アミノ－ＬＮＡ、β－Ｄ－チオ－ＬＮＡ、α－Ｌ－チオ－ＬＮＡ、（Ｓ）ｃＥＴ、（Ｒ）ｃＥＴ β－Ｄ－ＥＮＡおよびα－Ｌ－ＥＮＡから選択される、実施形態６０または６１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
６３．前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＬＮＡギャップマー、混合ウイングギャップマー、および交互フランクギャップマーからなる群から選択される、実施形態５４～６２のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
６４．実施形態５９～６３のいずれか１つに記載のオリコヌクレオチドであって、
ａ．Ｆ領域が１～５ヌクレオチド長であり、１～４個の同一ＬＮＡヌクレオシドおよび０～２個のＤＮＡヌクレオシドからなり、
ｂ．Ｆ’領域が２～５ヌクレオチド長であり、２～４個の同一ＬＮＡヌクレオシドおよび０～２個のＤＮＡヌクレオシドからなり、
ｃ．領域Ｇが８～１６ＤＮＡヌクレオチドである、オリコヌクレオチド。
６５．領域ＦおよびＦ’が、同一ＬＮＡヌクレオシドからなる、実施形態５９～６２のいずれか１つに記載のアンチセンスオリコヌクレオチド。
６６．領域ＦおよびＦ’内の全部の２’糖修飾ヌクレオシドが、オキシ－ＬＮＡヌクレオシドである、実施形態５９～６２のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
６７．前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが２’－ＭＯＥギャップマーである、実施形態５４～６０のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
６８．領域Ｇ内のヌクレオシドが、ＤＮＡおよび／またはα－Ｌ－ＬＮＡヌクレオシドである、実施形態５４～６７のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
６９．領域Ｇが、少なくとも７５％のＤＮＡヌクレオシドからなる、実施形態６８に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
７０．領域Ｇ内の全部のヌクレオシドが、ＤＮＡヌクレオシドである、実施形態６９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
７１．前記オリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列が、モチーフ配列と、表７に列挙された示された設計との組み合わせから選択される、実施形態１～５１または５４～７０のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド。
７２．前記オリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列が、表７に列挙されるＣＭＰ番号７＿１、８＿１、９＿１、１０＿１、１１＿１、１２＿１、１３＿１、１４＿１、１５＿１、１６＿１、１７＿１、１８＿１、１９＿１、２０＿１、２１＿１、２２＿１、２３＿１、２４＿１、２５＿１、２６＿１、２７＿１、２８＿１、２９＿１、３０＿１、３１＿１、３２＿１、３３＿１、３４＿１、３５＿１、３６＿１、３７＿１、３８＿１、３９＿１、４０＿１、４１＿１、４２＿１、４３＿１、４４＿１、４５＿１、４６＿１、４７＿１、４８＿１、４９＿１、５０＿１、５１＿１、５２＿１、５３＿１、５４＿１、５５＿１、５６＿１、５７＿１、５８＿１、５９＿１、６０＿１、６１＿１、６２＿１、６３＿１、６４＿１、６５＿１、６６＿１、６７＿１、６８＿１、６９＿１、７０＿１、７１＿１、７２＿１、７３＿１、７４＿１、７５＿１、７６＿１、７７＿１、７８＿１、７９＿１、８０＿１、８１＿１、８２＿１、８３＿１、８４＿１、８５＿１、８６＿１、８７＿１、８８＿１、８９＿１、９０＿１、９１＿１、９２＿１、９３＿１、９４＿１、９５＿１、９６＿１、９７＿１、９８＿１、９９＿１、１００＿１、１０１＿１、１０２＿１、１０３＿１、１０４＿１、１０５＿１、１０６＿１、１０７＿１、１０８＿１、１０９＿１、１１０＿１、１１１＿１、１１２＿１、１１３＿１、１１４＿１、１１５＿１、１１６＿１、１１７＿１、１１８＿１、１１９＿１、１２０＿１、１２１＿１、１２２＿１、１２３＿１、１２４＿１、１２５＿１、１２６＿１、１２７＿１、１２８＿１、１２９＿１、１３０＿１、１３１＿１、１３２＿１、１３３＿１、１３４＿１、１３５＿１、１３６＿１、１３７＿１、１３８＿１、１３９＿１、１４０＿１、１４１＿１、１４２＿１、１４３＿１、１４４＿１、１４５＿１、１４６＿１、１４７＿１、１４８＿１、１４９＿１、１５０＿１、１５１＿１、１５２＿１、１５３＿１、１５４＿１、１５５＿１、１５６＿１、１５７＿１、１５８＿１、１５９＿１、１６０＿１および１６１＿１からなる群から選択される、実施形態１～５１または５４～７１のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド。
７３．前記オリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列が、以下からなる群から選択され、
ＡＴＧＴｔｔａｔｃａｃｃａａＡＡＴＴ（配列番号６５、ＣＭＰ番号６５＿１）
ＣＴＧＡａａｔａｃｔａｃｃａＴＡＴＡ（配列番号６６、ＣＭＰ番号６６＿１）
ＴＴＴＡａｔｃａｔａｃｃａＡＴＣＴ（配列番号７１、ＣＭＰ番号７１＿１）
ＴＴＣＴｔａｔｔｔｃａａａｔＣＴＣＡ（配列番号７４、ＣＭＰ番号７４＿１）
ＴＣＴＴａｔｔｔｃａａａｔＣＴＣＡ（配列番号７５、ＣＭＰ番号＿１）
ここで、大文字はβ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡなどのＬＮＡヌクレオシドであり、小文字はＬＮＡヌクレオシドであり、ＬＮＡシトシンヌクレオシドは場合により５メチルシトシンＬＮＡであり、ＤＮＡシトシンヌクレオシドは場合により５－メチルシトシンＤＮＡであり、ＤＮＡヌクレオシド間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、実施形態１～５１または５４～７１のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド。
７４．実施形態１～７３のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドと、前記オリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも１つのコンジュゲート部分とを含むコンジュゲート。
７５．前記コンジュゲート部分が、炭水化物、細胞表面受容体リガンド、原薬、ホルモン、親油性物質、ポリマー、タンパク質、ペプチド、毒素、ビタミン、ウイルスタンパク質またはそれらの組み合わせから選択される、実施形態７４に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
７６．前記コンジュゲートが、脳血液関門を通過する送達を促進する、実施形態７４または７５に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
７７．前記コンジュゲートが、トランスフェリン受容体を標的とする抗体または抗体断片である、実施形態７６に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
７８．実施形態１～７２のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチドもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチド、または実施形態７４～７７のいずれか１つに記載のコンジュゲートの薬学的に許容され得る塩。
７９．実施形態１～７２のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチドもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチド、または実施形態７４～７７のいずれか１つに記載のコンジュゲートと、薬学的に許容され得る希釈剤、溶媒、担体、塩および／または佐剤とを含む医薬組成物。
８０．ＴＭＥＭ１０６Ｂを発現している標的細胞におけるＴＭＥＭ１０６Ｂ発現を調節するためのインビトロまたはインビボ方法であって、実施形態１～７２のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチドもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチド、または実施形態７４～７７のいずれか１つに記載のコンジュゲート、または実施形態７８に記載の薬学的塩、または実施形態７９に記載の医薬組成物を有効量で前記細胞に投与することを含む、方法。
８１．疾患の治療または予防方法であって、治療的または予防的に有効な量の、実施形態１～７２のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド、実施形態７４～７７のいずれか１つに記載のコンジュゲート、または実施形態７８に記載の薬学的塩、または実施形態７９に記載の医薬組成物を、前記疾患に苦しむまたは罹り易い対象に投与することを含む、方法。
８２．対象における疾患を治療または予防するための薬における使用のための、実施形態１～７２のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド、実施形態７４～７７のいずれか１つに記載のコンジュゲート、または実施形態７８に記載の薬学的塩、または実施形態７９に記載の医薬組成物。
８３．神経変性、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、パーキンソン病（またはパーキンソニズム）、低髄鞘性白質ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症および多系統萎縮症、アルツハイマー病、運動ニューロン疾患、皮質基底核症候群、進行性核上性麻痺、および神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）からなる群から選択される疾患の治療または予防における使用のための、実施形態１～７２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド、実施形態７４～７７のいずれか１つに記載のコンジュゲート、または実施形態７８に記載の薬学的塩、または実施形態７９に記載の医薬組成物。
８４．疾患の治療または予防のための医薬の製造のための、実施形態１～７２のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド、実施形態７４～７７のいずれか１つに記載のコンジュゲート、または実施形態７８に記載の薬学的塩、または実施形態７９に記載の医薬組成物の使用。
８５．前記疾患が、ＴＭＥＭ１０６Ｂの過剰発現、および／またはＴＭＥＭ１０６Ｂの異常なレベルに関連する、実施形態８１～８４のいずれか１つに記載の使用のためのオリゴヌクレオチド、または使用または方法。
８６．前記治療が、前頭皮質のＴＭＥＭ１０６Ｂ ｍＲＮＡレベルを正常レベルに低下させる、実施形態８１～８４のいずれか１つに記載の使用のためのオリゴヌクレオチド、または使用または方法。
８７．前記疾患が、神経変性、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、パーキンソン病（またはパーキンソニズム）、低髄鞘性白質ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症および多系統萎縮症、アルツハイマー病、運動ニューロン疾患、皮質基底核症候群、進行性核上性麻痺、および神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）からなる群から選択される、実施形態８１～８４のいずれか１つに記載の使用のためのオリゴヌクレオチド、または使用または方法。
８８．前記疾患が前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）である、実施形態８１～８７のいずれか１つに記載の使用のためのオリゴヌクレオチド、または使用または方法。
８９．前記対象が哺乳動物である、実施形態８１～８４～８８のいずれか１つに記載の使用のためのオリゴヌクレオチド、または使用または方法。
９０．前記哺乳動物がヒトである、実施形態８９に記載の使用のためのオリゴヌクレオチド、または使用または方法。
材料および方法
オリゴヌクレオチド化合物およびモチーフ配列
表７－化合物リスト
オリゴヌクレオチドモチーフ配列（配列番号で示される）、これらの設計、およびモチーフ配列に基づいて設計された特定のオリゴヌクレオチド化合物（ＣＭＰ番号で示される）のリスト。
実施例では、使用されている化合物は次の構造を有する。大文字はβ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、すべてのＬＮＡシトシンは５－メチルシトシンであり、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表し、すべてのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
Figure 0007281474000015
Figure 0007281474000016
Figure 0007281474000017
Figure 0007281474000018
モチーフ配列は、オリゴヌクレオチドに存在する核酸塩基の連続配列を表す。
設計は、オリゴヌクレオチド設計、例えばギャップマー設計、Ｆ－Ｇ－Ｆ’を指す。古典的なギャップマー設計、例えば３－１０－３では、フランク内の全ヌクレオチド（ＦおよびＦ’）は、同じ２’－糖修飾ヌクレオシド、例えばＬＮＡ、ｃＥＴまたはＭＯＥと、ギャップを形成する中央のＤＮＡストレッチ（Ｇ）で構成される。交互フランク設計のギャップマーでは、オリゴヌクレオチドのフランクは一連の整数として注釈が付けられ、２’糖修飾ヌクレオシド（Ｍ）の後にいくつかのＤＮＡヌクレオシド（Ｄ）が続く。例えば、２－２－１モチーフのフランクは５’［Ｍ］２－［Ｄ］２－［Ｍ］３’を表し、１－１－１－１－１モチーフは５’［Ｍ］－［Ｄ］－［Ｍ］－［Ｄ］－［Ｍ］３’を表す。両方のフランクは、５’’および３’末端に２’糖修飾ヌクレオシドを有する。ギャップ領域（Ｇ）は、フランクの間に位置するいくつかのＤＮＡヌクレオシド（通常は５～１６個）で構成されている。
オリゴヌクレオチド化合物は、モチーフ配列の特定の設計を表す。大文字はβ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表し、すべてのＬＮＡ Ｃは５－メチルシトシンであり、すべてのヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
表８：モチーフリスト
実施例で使用される化合物のオリゴヌクレオチドモチーフ配列（配列番号で示される）のリスト、ならびに示されるように、それらの標的配列およびそれらの核酸標的／標的配列（配列番号１～６）上の位置。モチーフ配列は、オリゴヌクレオチドに存在する核酸塩基の連続配列を５’から３’の方向で表す。ＲＮＡ標的配列は、モチーフ配列の相補的な配列であり、同様に５’から３’の方向である。
Figure 0007281474000019
Figure 0007281474000020
Figure 0007281474000021
Figure 0007281474000022
Figure 0007281474000023
Figure 0007281474000024
Figure 0007281474000025
Figure 0007281474000026
オリゴヌクレオチド合成
オリゴヌクレオチド合成は、当技術分野で一般に知られている。以下は、適用できるプロトコルである。本発明のオリゴヌクレオチドは、使用する装置、支持体および濃度に関してわずかに異なる方法によって生成されている場合がある。
オリゴヌクレオチドは、Ｏｌｉｇｏｍａｋｅｒ ４８のホスホラミダイトアプローチを１μｍｏｌスケールで使用して、ウリジンユニバーサル支持体上で合成される。合成の最後に、水性アンモニアを使用して６０℃で５～１６時間、オリゴヌクレオチドを固相支持体から切断する。オリゴヌクレオチドは逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）または固相抽出によって精製され、ＵＰＬＣによって特徴付けられ、分子量はさらにＥＳＩ－ＭＳによって確認される。
オリゴヌクレオチドの伸長：
β－シアノエチル－ホスホルアミダイトのカップリング（ＤＮＡ－Ａ（Ｂｚ）、ＤＮＡ－Ｇ（ｉｂｕ）、ＤＮＡ－Ｃ（Ｂｚ）、ＤＮＡ－Ｔ、ＬＮＡ－５－メチル－Ｃ（Ｂｚ）、ＬＮＡ－Ａ（Ｂｚ）、ＬＮＡ－Ｇ（ｄｍｆ）、またはＬＮＡ－Ｔ）は、アセトニトリル中の０．１Ｍの５’－Ｏ－ＤＭＴ保護アミダイトおよびアセトニトリル（０．２５Ｍ）中のＤＣＩ（４，５－ジシアノイミダゾール）の溶液を使用して行われる。最終サイクルでは、所望の修飾を有するホスホラミダイト、例えばコンジュゲート基を結合するためのＣ６リンカー、またはそのようなコンジュゲート基を使用できる。ホスホルチオエート結合を導入するためのチオール化は、水素化キサンタン（アセトニトリル／ピリジン９：１中０．０１Ｍ）を使用することにより行われる。ホスホジエステル結合は、ＴＨＦ／ピリジン／水７：２：１中の０．０２Ｍヨウ素を使用して導入できる。残りの試薬は、オリゴヌクレオチド合成に通常使用される試薬である。
固相合成後のコンジュゲーションでは、固相合成の最後のサイクルで市販のＣ６アミノリンカーホルフォラミダイトを使用でき、脱保護および固相支持体からの切断後、アミノ結合脱保護オリゴヌクレオチドが分離される。コンジュゲートは、標準的な合成方法を使用した官能基の活性化によって導入される。
ＲＰ－ＨＰＬＣによる精製：
粗化合物は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ１８ １０μ １５０ｘ１０ｍｍカラムでの取ＲＰ－ＨＰＬＣにより精製される。０．１Ｍ酢酸アンモニウムｐＨ８およびアセトニトリルを５ｍＬ／分の流速でバッファーとして使用する。収集された画分は凍結乾燥されて、精製された化合物が典型的には白色固体として得られる。
略記：
ＤＣＩ ４，５－ジシアノイミダゾール
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＤＭＴ：４，４’－ジメトキシトリチル
ＴＨＦ テトラヒドロフラン
Ｂｚ：ベンゾイル
Ｉｂｕ：イソブチリル
ＲＰ－ＨＰＬＣ：逆相高速液体クロマトグラフィー
Ｔｍアッセイ
オリゴヌクレオチドとＲＮＡ標的（リン酸結合、ＰＯ）二重鎖は、５００ｍｌのＲＮａｓｅフリー水で３ｍＭに希釈され、５００ｍｌの２ｘＴｍバッファー（２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭリン酸、ｐＨ７．０）と混合される。この溶液を９５℃で３分間加熱した後、室温で３０分間アニールする。二重鎖の融解温度（Ｔｍ）は、ＰＥ Ｔｅｍｐｌａｂソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、ペルチェ温度プログラマーＰＴＰ６を備えたＬａｍｂｄａ ４０ ＵＶ／ＶＩＳ分光光度計で測定される。温度を２０℃から９５℃に上昇させ、次いで２５℃に低下させ、２６０ｎｍで吸収を記録する。一次導関数と、融解およびアニーリングの両方の極大値を使用して、二重鎖Ｔｍを評価する。
実施例１：オリゴヌクレオチドを使用したＮｅｕｒｏ２ａマウス細胞株におけるＴＭＥＭ１０６ｂのインビトロ低下
マウスＴｍｅｍ１０６ｂを標的とするＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドを、ＡＴＣＣ（ＣＣＬ－１３１）から取得したマウスＮｅｕｒｏ－２ａ神経芽細胞腫細胞におけるＴｍｅｍ１０６ｂ ｍＲＮＡ発現を低下させる能力について試験した。
Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞は、細胞培養培地（１０％ウシ胎児血清［Ｓｉｇｍａ、ｃａｔ．ｎｏ Ｆ７５２４］、１ｘＧｌｕｔａｍａｘ（商標）［Ｓｉｇｍａ、ｃａｔ．ｎｏ ３０５０－０３８］を補充したＤＭＥＭ ＡＱ培地［Ｓｉｇｍａ、ｃａｔ．Ｄ０８１９］、１ｍＭ Ｎａ－ピルビン酸および２５μｇ／ｍｌゲンタマイシン）中、５％ＣＯ２雰囲気の３７℃の細胞インキュベーター内で増殖させた。細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）［Ｓｉｇｍａ ｃａｔ．ｎｏ １４１９０－０９４］で洗浄し、次に０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ溶液（Ｓｉｇｍａ、Ｔ３９２４）を添加して、８０％コンフルエンシーに達したらトリプシン処理し、３７℃で２～３分インキュベートし、細胞播種前に粉砕した。細胞は最大１５継代まで培養で維持された。
実験使用のために、１ウェルあたり２４００個の細胞を９５μＬの増殖培地の９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ ｃａｔ．ｎｏ １６７００８）に播種した。オリゴヌクレオチドは５００μＭストックから調製した。ＰＢＳに溶解した５μｌのＡＳＯを、細胞を細胞培地に５μＭまたは２５μＭの最終濃度で播種した約２４時間後に加えた。培地を交換せずに細胞を３または６日間インキュベートした。ＡＳＯとの３日間および６日間のインキュベーションに使用された細胞は、異なる凍結ストックに由来し、実験中は異なる継代数であった。
インキュベーション後、培地を除去して細胞を回収した後細胞溶解し、メーカーのプロトコルに従って、ＱＩＡＧＥＮ ＲＮｅａｓｙ ９６ Ｋｉｔ（ｃａｔ ７４１８１）を使用してＲＮＡ精製を行った。ワンステップｑＰＣＲ反応の前に、ＲＮＡを水で１０倍に希釈した。ワンステップｑＰＣＲ反応では、ｑＰＣＲミックス（ＱｕａｎｔａＢｉｏのｑＳｃｒｉｐｔ（商標）ＸＬＴ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲ ＴｏｕｇｈＭｉｘ（登録商標）Ｌｏｗ ＲＯＸ、ｃａｔ．ｎｏ ９５１３４－５００）を２つのＴａｑｍａｎプローブと１０：１：１の比率で混合して（ｑＰＣＲミックス：プローブ１：プローブ２）マスターミックスを生成した。Ｔａｑｍａｎプローブは、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから獲得した：Ｍｍ００５１０９５２＿ｍ１、Ｍｍ００５１０９５４＿ｍ１、Ｍｍ０１１３４６６６＿ｍ１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ｃａｔ．各々、４３５１３６８、４３５１３６８および４３５１３７０）；ＧＡＰＤＨ（ｃａｔ．４３５２３３９Ｅ）およびＡＣＴＢ（ｃａｔ．４３５２３４１Ｅ）。Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞を使用した各実験には、ＧＡＰＤＨとＡＣＴＢの両方と、１つの（Ｍｍ００５１０９５２＿ｍ１）または３つ全部のＴｍｅｍ１０６ｂ固有プローブの測定が含まれ、特定のウェルに１つのＴｍｅｍ１０６ｂと１つの対照プローブセットが含まれていた。次に、Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（６μＬ）とＲＮＡ（４μＬ）をｑＰＣＲプレート（ＭＩＣＲＯＡＭＰ（登録商標）ｏｐｔｉｃａｌ３８４ウェル、４３０９８４９）内で混合した。播種後、プレートにＲＴで１分間の１０００ｇのクイックスピンを与え、ＶｉｉａＴＭ ７システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｈｅｒｍｏ）に移し、以下のＰＣＲ条件を使用した：５０℃で１５分間；９５℃で３分間；以下の４０サイクル：９５℃で５秒間、その後１．６℃／秒の温度低下、続いて６０℃で４５秒間。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）Ｒｅａｌ＿ｔｉｍｅ ＰＣＲソフトウェアを使用してデータを分析した。提示された結果は、さまざまなハウスキーピング遺伝子に対して正規化されている。結果を以下の表９に、対照サンプル（ＰＢＳ処理細胞）として示す。即ち、値が低いほど阻害が大きい。結果は、図１および図２にもプロットされる。試験した化合物（黒い点）のほとんどすべては、負の対照のギャップマー（白い点）と比較して、５μＭと２５μＭで標的発現を阻害することがわかり、ＴＭＥＭ１０６Ｂがオリゴヌクレオチドによる阻害に驚くほど敏感であることがわかる。
表９：Ｎｅｕｒｏ２ａマウス細胞におけるＴＭＥＭ１０６Ｂ ｍＲＮＡを標的とするオリゴヌクレオチドのインビトロ有効性。実験は３日目（複製ＡとＢ）に二重に、６日目に単一の実験として行われた。
Figure 0007281474000027
Figure 0007281474000028
実施例２：オリゴヌクレオチドを使用したヒトＳＫ－Ｎ－ＢＥ（２）細胞におけるＴＭＥＭ１０６Ｂのインビトロ低下
ＴＭＥＭ１０６Ｂを標的とするオリゴヌクレオチドを、ＡＴＣＣ（ＣＲＬ－２２７１）から取得したヒトＳＫ－Ｎ－ＢＥ（２）神経芽細胞腫細胞におけるＴＭＥＭ１０６Ｂ ｍＲＮＡ発現を低下させる能力について試験した。
ＳＫ－Ｎ－ＢＥ（２）細胞を、１０％ウシ胎児血清［Ｓｉｇｍａ、ｃａｔ．ｎｏ Ｆ７５２４］、１ｘ Ｇｌｕｔａｍａｘ（商標）［Ｓｉｇｍａ、ｃａｔ．ｎｏ ３０５０－０３８］１ｘ ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液［Ｓｉｇｍａ、ｃａｔ．ｎｏ Ｍ７１４５］および０．０２５ｍｇ／ｍｌゲンタマイシン［Ｓｉｇｍａ、ｃａｔ．ｎｏ Ｇ１３９７］）を補充した細胞培養培地（ＭＥＭ［Ｓｉｇｍａ、ｃａｔ．ｎｏ Ｍ２２７９］）中で増殖させた。細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）［Ｓｉｇｍａ ｃａｔ．ｎｏ １４１９０－０９４］で洗浄し、次に０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ溶液（Ｓｉｇｍａ、Ｔ３９２４）を添加して、５日毎にトリプシン処理し、３７℃で２～３分インキュベートし、細胞播種前に粉砕した。細胞は最大１５継代まで培養で維持された。
実験使用のために、１ウェルあたり１５，０００（３日目）または２５，０００（６日目）個の細胞を１００μＬの増殖培地の９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ ｃａｔ．ｎｏ １６７００８）に播種した。オリゴヌクレオチドは７５０μＭストックから調製した。ＰＢＳに溶解したオリゴヌクレオチドを、細胞を５μＭまたは２５μＭの最終濃度で播種した約２４時間後に加えた。培地を交換せずに細胞を３または６日間インキュベートした。
インキュベート後、培地を除去して細胞を回収し、その後、１２５μＬ ＰｕｒｅＬｉｎｋ（Ｃ）Ｐｒｏ ９６ Ｌｙｓｉｓバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １２１７３．００１Ａ）および１２５μＬ ７０％エタノールを加えた。製造者の指示書に従ってＲＮＡを精製し、最終容積５０μＬの水で溶出した結果、ＲＮＡ濃度は１０～２０ｎｇ／μｌであった。ワンステップｑＰＣＲ反応の前に、ＲＮＡを水で１０倍に希釈した。ワンステップｑＰＣＲ反応では、ｑＰＣＲミックス（ＱｕａｎｔａＢｉｏのｑＳｃｒｉｐｔ（商標）ＸＬＴ １－ステップＲＴ－ｑＰＣＲ ＴＯＵＧＨＭＩＸ（登録商標）Ｌｏｗ ＲＯＸ、ｃａｔ．ｎｏ ９５１３４－５００）を２つのＴａｑｍａｎプローブと１０：１：１の比率で混合して（ｑＰＣＲミックス：プローブ１：プローブ２）マスターミックスを生成した。Ｔａｑｍａｎプローブは、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから獲得した：ＴＭＥＭ＿Ｈｓ００９９８８４９＿ｍ１；ＧＡＰＤＨ ４３２５７９２。次に、Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（６μＬ）とＲＮＡ（４μＬ、１～２ｎｇ／μＬ）をｑＰＣＲプレート（ＭＩＣＲＯＡＭＰ（登録商標）ｏｐｔｉｃａｌ３８４ウェル、４３０９８４９）内で混合した。播種後、プレートにＲＴで１分間の１０００ｇのクイックスピンを与え、ＶｉｉａＴＭ ７システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｈｅｒｍｏ）に移し、以下のＰＣＲ条件を使用した：５０℃で１５分間；９５℃で３分間；以下の４０サイクル：９５℃で５秒間、その後１．６℃／秒の温度低下、続いて６０℃で４５秒間。
ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）Ｒｅａｌ＿ｔｉｍｅ ＰＣＲソフトウェアを使用してデータを分析した。提示した結果は、ＧＡＰＤＨに対して正規化されている。結果を以下の表１０に、対照サンプル（ＰＢＳ処理細胞）の％として示す。即ち、値が低いほど阻害が大きい。結果は、図４および図５にもプロットされる。試験した化合物（黒い点）のほとんどすべては、負の対照のギャップマー（白い点）と比較して、５μＭと２５μＭで標的発現を阻害することがわかり、ＴＭＥＭ１０６Ｂがオリゴヌクレオチドによる阻害に驚くほど敏感であることがわかる。特に、３’ＵＴＲを標的とする化合物、例えば化合物６８＿１、７３＿１、７４＿１、７９＿１、８２＿１が特に効果的であることがわかった。
表１０：ＳＫ－Ｎ－ＢＥ（２）ヒト細胞におけるＴＭＥＭ１０６Ｂ ｍＲＮＡを標的とするオリゴヌクレオチドのインビトロ有効性。実験は、二重（サンプルＡおよびＢ）で行われた。
Figure 0007281474000029
Figure 0007281474000030
実施例３：オリゴヌクレオチドの細胞毒性
ＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドが細胞のアポトーシスを誘導するかどうかを測定するために、本明細書に記載するようにカスパーゼアッセイを適用した。ＮＩＨ ３Ｔ３細胞（ＥＣＡＣＣ ｃａｔ．９３０６１５２４）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００を使用して１００ｎＭまたは３０ｎＭ ＬＮＡオリゴヌクレオチドでトランスフェクトし、カスパーゼ３およびカスパーゼ７の活性化を、Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｖｏｌ．１０ Ｍａｒｃｈ ２０１８）
から適合させたプロトコルに従って２４時間後に測定した。実験は、わずかに異なるプロトコルを使用して２つの複製で行った。各複製は２つの９６ウェルプレートで行った。所定のトランスフェクション濃度での各ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、各複製で合計４回測定された。
最初の複製では、マウス胚線維芽細胞株ＮＩＨ ３Ｔ３を、ｍ３Ｔ３培地（１０％ＦＢＳおよび２５μ／ｍｌゲンタマイシンで補充したＤＭＥＭ ＡＱ（Ｓｉｇｍａ：Ｄ０８１９）を３７℃、５％ＣＯ２で増殖させた。細胞をトリプシン処理し、９６ウェルプレート（ＶｉｅｗＰｌａｔｅ－９６、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ｃａｔ ６００５１８１）に、１００μｌのｍ３Ｔ３培地中でウェルあたり４０００細胞の密度で播種し、２４時間増殖させた。ＬＮＡオリゴヌクレオチドをＤＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ．１４１９０２５０）で最終濃度５μＭまたは１．５μＭに希釈した（０μＭのオリゴヌクレオチドの負の対照も含まれる）。希釈した各ＬＮＡオリゴヌクレオチドをＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｃａｔ．３１９８５０４７）と１～２４（体積）の比で混合し、３０μｌのそのような混合物に、３０μｌのＬＯＭ溶液（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｃａｔ．３１９８５０４７）と１～９９（体積）の比で混合したＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｃａｔ．１１６６８０１９）、調製直後に使用）を加え、２０分間インキュベートした。ＮＩＨ ３Ｔ３細胞培養物から培地を除去し、ＬＯＭ溶液中の５０μｌのＬＮＡオリゴヌクレオチドを加えた。４時間後、５０μｌのｍ２０Ｆ培地（ミックス８００ｍｌ ＤＭＥＭ ＡＱ（Ｓｉｇｍａ：Ｄ０８１９）と２００ｍｌ ＦＢＳおよび１０ｍｌ ２００ｍＭ Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミンおよび５００μｌ ５０ｍｇ／ｍｌゲンタマイシン）を各ウェルに加えた。ＬＮＡオリゴヌクレオチドを細胞に添加してから２４時間後、１００μｌのＣａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ（登録商標）３／７試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、ｃａｔ．Ｇ８０９３、製造者の指示書に従って調製）を細胞に添加し、プレートを５００ｒｐｍで３０秒間振とうし、室温で１時間インキュベートした後、ＢａｃｋＳｅａｌ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ｃａｔ．６００５１９９）でプレートの裏をふさぎ、ＥｎＳｉｇｈｔマルチモードプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ｃａｔ．ＨＨ３４００００００）で発光を測定した。
２番目の複製については、同様のプロトコルに以下の変更を加えた。（１）希釈ＬＮＡオリゴヌクレオチドをＯｐｔｉ－ＭＥＭと１：２４ではなく２：２３の比で混合した。（２）５０μｌのＬＮＡオリゴヌクレオチドとｏｐｔｉ－ＭＥＭおよびＬＯＭ溶液の混合物を細胞に加える直前に、５０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭを細胞に加えた。（３）ｍ２０Ｆの代わりに、５０μｌのｍ３０Ｆ（ミックス７００ｍｌ ＤＭＥＭ ＡＱ（Ｓｉｇｍａ：Ｄ０８１９）と３００ｍｌ ＦＢＳおよび１０ｍｌ ２００ｍＭ Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミンおよび５００μｌ ５０ｍｇ／ｍｌゲンタマイシン）を加えた。（４）Ｃａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ（登録商標）３／７試薬を添加する直前に、細胞から５０μｌの培地を除去した。
ＥｎＳｉｇｈｔリーダーで測定した発光シグナルを、所定の９６ウェルプレート内の負の対照のウェルの平均発光シグナルで割った。特定の濃度での異なる化合物のシグナルは、プレート間および複製全体で平均化された（複製内の平均信号から１．５四分位範囲以上または以下のデータポイントとして定義された外れ値は削除された）。結果を、表１１に示し、図３に図示する。
表１１：オリゴヌクレオチドで処理されたＮＩＨ ３Ｔ３細胞におけるカスパーゼ活性化（４の複製）
Figure 0007281474000031
実施例４：マウスにおけるＴＭＥＭ１０６Ｂのインビボ低下
本実施例は、実施例１から選択されたオリゴヌクレオチドがマウス脳内のインビボでＴＭＥＭ１０６Ｂを低下させる能力、ならびにオリゴヌクレオチドの急性および非急性毒性の可能性を試験する。
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊオスマウス（２３～３２ｇ）の右側脳室に（０．３ＡＰ、１．０ＭＬ、３．０ＤＶ；ＴＭＥＭ１０６Ｂ反応性化合物のグループごとに６匹の動物；生理食塩水で処理された動物１５匹の動物；ＭＡＰＴ反応性化合物で処理された１５匹の動物および負の対照のオリゴで処理された６匹の動物）、５μｇの２０ｍｇ／ｍｌ生理食塩水配合ＬＮＡオリゴヌクレオチドをイソフルラン麻酔下でフリーハンド注射した。
投与後、急性反応は４つのレベルで記録された：（１）正常な動作、（２）軽度の反応（３０分～１時間の活動／姿勢／歩行のわずかな変化）、（３）中程度の反応（２～４時間の活動／姿勢の長期の顕著な変化）、（４）重度（活動なし、浅い呼吸、瀕死）。マウスの体重は、オリゴヌクレオチドの投与直前および投与の６日後に測定した。体重の大幅な減少は、潜在的な非急性毒性の指標である。結果を、以下の表１３に示す。
注射の７日後、イソフルランの過剰摂取でマウスを犠牲にし、その後急速に断頭し、脳を氷冷マウス脳スライサーマトリックス（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ）に入れ、重量約３０～４０ｍｇの２つの（２ｍｍ）冠状切片（Ｂｒｅｇｍａから０．２６ｍｍから始まる）に切片化した。組織をＲＮＡＬａｔｅｒ溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ．ＡＭ７０２１）に浸漬し、４℃で保管した。ＲＮＡはＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、ｃａｔ．７４１１６）を使用して、ＱＩＡｃｕｂｅロボットワークステーション（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離した。手短に言えば、脳の断片を、ＲＮＡＬａｔｅｒ溶液から、３ｍｍのタングステンカーバイドビーズ（Ｑｉａｇｅｎ、ｃａｔ ６９９９７）を含む１．５ｍＬエッペンドルフチューブ内の１ｍＬ ＲＬＴバッファーに移した。ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ ＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して組織を溶解し（３０Ｈｚで３分間）、２００００ｇで３分間遠心分離した。５５０μｌの溶解物（泡なし、沈殿物なし）を２ｍＬエッペンドルフチューブに移し、必要なすべての試薬をあらかじめ充填したＱＩＡｃｕｂｅに入れた。５０μｌのＨ２Ｏで溶出するプログラム「ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ－動物組織および細胞－大量サンプル（バージョン２）」に従ってＲＮＡを精製した。ＮａｎｏＤｒｏｐ ８０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）分光光度計を使用してＲＮＡ濃度を測定し、Ｈ２Ｏで濃度を２ｎｇ／μｌに調整した。
右半球からの切片の発現レベルは、プローブとしてとしてのＴＭＥＭ１０６Ｂ Ｍｍ００５１０９５２＿ｍ１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ．４３５１３７０）、および正規化のためのＧＡＰＤＨプローブ（ｃａｔ．４３５２３３９Ｅ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、基本的に実施例１に記載したように測定した。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）Ｒｅａｌ＿ｔｉｍｅ ＰＣＲソフトウェアを使用してデータを分析し、技術的な複製の読み取り値を平均した。結果を表１２に、平均対照サンプル（ＰＢＳ処理マウス）の％として示す。即ち、値が低いほど阻害が大きい。
表１２：ＴＭＥＭ１０６Ｂを標的とするオリゴヌクレオチドのインビボ効力。
Figure 0007281474000032
表１３：ＴＭＥＭ１０６Ｂを標的とするオリゴヌクレオチドを注入したマウスで観察された急性応答と体重変化
Figure 0007281474000033
表１２および１３から、すべてのＴＭＥＭ１０６Ｂ標的化オリゴヌクレオチドが、単回注射後にＴＭＥＭ１０６Ｂ ｍＲＮＡを減少させることができたことが分かる。試験した１０のオリゴヌクレオチドのうちの１つは、重篤な急性毒性を引き起こすことがわかった。化合物番号１６１を３匹の動物にのみ投与し、重篤な反応が観察された直後に安楽死させたため、この化合物で測定されたＴＭＴＭ１０６Ｂの減少はない。化合物１４４＿１を投与した一部の動物は、この化合物の非急性毒性が原因である可能性のある、有意な体重減少の徴候を示した。残りのすべてのオリゴヌクレオチド化合物は、治療の７日後に十分に許容されるようであった。
実施例５：ヒトｉＰＳＣニューロンおよび星状細胞の混合培養の処理
実施例２において、ヒトＴＭＥＭ１０６ｂは、最初に、ヒト神経芽細胞腫細胞株においてスクリーニングされた。これらのＡＳＯがヒトニューロンの標的を低下させる能力を評価するために、５つのヒトＴＭＥＭ１０６ｂ ＡＳＯの効果：ＣＭＰ番号７４＿１、６５＿１、７５＿１、７１＿１、６６＿１を、ヒトｉＰＳＣニューロンおよび星状細胞の細胞培養混合物で評価した。
ヒトｉＰＳＣ由来の神経幹細胞（ＭＴＩ－ＧｌｏｂａｌＳｔｅｍ、ＧＳＣ－４３１１）をＮＳＣ維持培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）／Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２１１０３０４９）、１Ｘ ＧＳ２２（ＭＴＩ－Ｇｌｏｂａｌ ＳＴＥＭ、ＧＳＭ－３２００）、２０ｎｇ／ｍｌ ＢＤＮＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、４５０－０２）、２０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ－ｂａｓｉｃ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、１００－１８ｂ）、２０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ＡＦ－１００－１５）、０．５ｍＭ Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ、３５０５００６１）、０．１１ｍＭ β－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ＣＨＥＣＫＣＡＴ）、１Ｘ Ｎｏｒｍｏｃｉｎ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、ａｎｔ－ｎｒ－１）、５０Ｕ／ｍｌペニシリン－ストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ １５１６０１２２））中で、３７℃ ＣＯ２細胞培養インキュベーター内で維持し、細胞がコンフルエントになるまで、ＮＳＣ維持培地を３～４日毎に交換した。ニューロンの分化のために、細胞を５０μｇ／ｍｌ ＰＤＬ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐ６４０７）および１０μｇ／ｍｌ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｌａｍｉｎｉｎ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）のＴ－６５０細胞培養フラスコにおおよその濃度０．７ｘ１０６ ～１．０ｘ１０６ 細胞／ｍｌで蒔いた。細胞をＹ２７６３２（Ｔｏｃｒｉｓ、１２５４）、ＳＵ９５１６（Ｔｏｃｒｉｓ、２９０７）およびＣｕｍａｔｅ（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＭ１００Ａ－１）で補充したニューロン分化培地（（ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）／Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ２１１０３０４９）、１Ｘ ＧＳ２１（ＭＴＩ－Ｇｌｏｂａｌ ＳＴＥＭ ＧＳＭ－３１００）、１Ｘ Ｎ２（ＭＴＩ－ＧｌｏｂａｌＳｔｅｍ ＧＳＭ３３００）、５μｇ／ｍｌコレステロール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃ３０４５）、１ｍＭクレアチン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃ０７８０）、１００μＭアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ａ８９６０）、０．５ｍＭ ｃＡＭＰ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｄ０６２７）、２０ｎｇ／ｍｌ ＢＤＮＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、４５０－０２）、２０ｎｇ／ｍｌ ＧＤＮＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、４５０－１０）、１μｇ／ｍｌマウスラミニン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、２３０１７－０１５）、０．５ｍＭ Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ、３５０５００６１）、１Ｘ Ｎｏｒｍｏｃｉｎ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、ａｎｔ－ｎｒ－１）、５０Ｕ／ｍｌペニシリン－ストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、１５１６０１２２））に置いた。蒔いた細胞を１週間分化させた。半量の分化培地を３～４日毎に交換した。分化後、細胞を、Ｙ２７６３２ Ｒｏｃｋ阻害剤（Ｔｏｃｒｉｓ、１２５４）および１Ｘ ＲｅｖｉｔａＣｅｌｌ（Ｇｉｂｃｏ、Ａ２６４４５０１）で補充した、予熱した分化培地中、３８４ウェルまたは９６ウェルのＰＤＬ－ラミニンコーティングプレート上に、およその濃度２．５ｘ１０５～５．５ｘ１０５で蒔き、１週間維持し、半量の分化培地を３～４日毎に交換した。
初代ヒト星状細胞（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｎ７８０５１００）を、星状細胞培地（ＤＭＥＭ Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、１０％ＦＢＳ（ＶＷＲ、８９５１０－１９８）、１Ｘ Ｎ２（ＭＴＩ－ＧｌｏｂａｌＳｔｅｍ ＧＳＭ３３００）、１Ｘ Ｎｏｒｍｏｃｉｎ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、ａｎｔ－ｎｒ－１）、５０Ｕ／ｍｌペニシリン－ストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、１５１６０１２２））中で３７℃ ＣＯ２細胞培養インキュベーター内で維持し、細胞がコンフルエントになるまで３～４日毎に培地を交換した。続いて、星状細胞を３８４ウェルまたは９６ウェルプレート内でヒトｉＰＳＣニューロン（前の段落で説明）に、およその濃度３．０ｘ１０４～８．０ｘ１０４で、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ維持培地（ＢｒａｉｎＰｈｙｓ Ｂａｓａｌ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、０５７９０）、１Ｘ ＧＳ２１（ＭＴＩ－Ｇｌｏｂａｌ ＳＴＥＭ ＧＳＭ－３１００）、１Ｘ Ｎ２（ＭＴＩ－ＧｌｏｂａｌＳｔｅｍ ＧＳＭ３３００）、５μｇ／ｍｌコレステロール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃ３０４５）、１ｍＭクレアチン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃ０７８０）、１０ｎＭ β－エストラジオール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｅ２７５８）、２００ｎＭアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ａ８９６０）、１ｍＭ ｃＡＭＰ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｄ０６２７）、２０ｎｇ／ｍｌ ＢＤＮＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、４５０－０２）、２０ｎｇ／ｍｌ ＧＤＮＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、４５０－１０）、１μｇ／ｍｌマウスラミニン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、２３０１７－０１５）、０．５ｍＭ Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ、３５０５００６１）、１Ｘ Ｎｏｒｍｏｃｉｎ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、ａｎｔ－ｎｒ－１）、５０Ｕ／ｍｌペニシリン－ストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、１５１６０１２２）、１ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦβ１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、１００－２１）中に加え、半量のＢｒａｉｎＰｈｕｓ維持培地を３～４日毎に６～８週間交換した。
ヒトｉＰＳＣニューロンのＡＳＯ処理では、ＣＭＰ番号７４＿１、６５＿１、７５＿１、７１＿１、６６＿１を中間の９６ウェルプレートのストックから９ポイント３倍連続希釈（１０μＭ、３．３μＭ、１．１μＭ、０．３７μＭ、０．１２μＭ、０．０４μＭ、０．０１３７μＭ、０．００４５μＭ、０．００１５μＭ）または５ポイントの１０倍連続希釈（１０μＭ、１μＭ、０．１μＭ、０．０１μＭ、０．００１μＭ）で希釈した。
連続１０日間のインキュベーション実験では、上記のＡＳＯ濃度（５ポイント１０倍）で２か月培養した後、ＡＳＯにヒトｉＰＳＣニューロンおよび星状細胞混合物を加えた。３日目と７日目に、最適な細胞の健康を維持するために培地の５０％を交換した（追加のＡＳＯは加えなかった）。ＡＳＯ処理を開始してから１０日後、ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｅｌｌｓ－ｔｏ－Ｃｔキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＡＭ１７２８）の製造者の指示書に従って、Ｔａｑｍａｎアッセイのために細胞を回収した。製造者の指示書に従って、ヒトニューロンＴＭＥＭ１０６ｂ Ｔａｑｍａｎアッセイを、ハウスキーピング遺伝子ノーマライザとしてのヒトＴＭＥＭ１０６ｂおよびＰＯＬ２ＲＢの特定の遺伝子発現アッセイプローブを使用して行った（各々、アッセイＩＤ Ｈｓ００９９８８４９＿ｍ１およびＨｓ００９４６２９３＿ｍ１）。ＴＭＥＭ１０６ｂの発現レベルはＰＯＬ２ＲＢハウスキーピング遺伝子に対して正規化され、培地対照（１００％）に対する相対的な発現が計算された（即ち、数値が小さいほどＴＭＥＭ１０６ｂの減少が大きいことを示す）。Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、ソフトウェアカーブフィットオプションを使用したＩＣ５０分析を行った。結果を表１４および１５、ならびに図７Ａおよび７Ｂに示す。ＣＭＰ番号７４＿１、６５＿１、７５＿１、７１＿１、６６＿１の構造式を図９～１３に示す。
表１４：ＡＳＯの連続希釈による１０日間の連続処理後のヒトｉＰＳＣニューロンおよび星状細胞混合培養物の生理食塩水に対するＴＭＥＭ１０６ｂ ｍＲＮＡの減少（％）（ｎ＝３）。
Figure 0007281474000034
データから、ＡＳＯが７．６ｎＭ～１２８．７ｎＭの範囲で高い効力を示すことがわかる（表１４、図７Ａ）。さらに、ヒト神経細胞ＴＭＥＭ１０６ｂ ｍＲＮＡのほぼ完全な排除が見られる。
さらに、２４時間パルス実験でＡＳＯを評価して、短期のＡＳＯ治療が長期的な効果をもたらすかどうかを評価した。５つのヒトＴＭＥＭ１０６ｂ ＡＳＯ ＣＭＰ番号７４＿１、６５＿１、７５＿１、７１＿１、６６＿１を、上記のＡＳＯ濃度（９ポイント３倍希釈）で２か月培養した後、ヒトｉＰＳＣニューロンおよび星状細胞混合物に加えた。ＡＳＯ処理は２４時間のみであり、その後細胞をニューロン培養培地で３回洗浄した。３日目と７日目に、最適な細胞の健康を維持するために培地の５０％が交換された。ＡＳＯ処理の１０日後、細胞を回収し、上記のＴａｑｍａｎアッセイでＴＭＥＭ１０６Ｂ ｍＲＮＡを評価（ａｃｃｅｓｓｅｄ）した。結果を表１５および図７Ｂに示す。
表１５：ＡＳＯの連続希釈による２４時間パルス処理後のヒトｉＰＳＣニューロンおよび星状細胞混合培養物の生理食塩水に対するＴＭＥＭ１０６Ｂ ｍＲＮＡの減少（％）（ｎ＝３）。
Figure 0007281474000035
これらの結果は、ＩＣ５０が６２．５ｎＭ～１μＭの範囲であることを示し（表１５、図７Ｂ）、２４時間のみのインキュベーションで、１０μＭの５つのヒトＴＭＥＭ１０６ｂ ＡＳＯすべてが効果的かつほぼ完全にヒトＴＭＥＭ１０６ｂ ｍＲＮＡを除去し、長期インキュベーションと同様に少なくとも１０日間持続する、長続きする効果を有することができる（表１４、図７Ａ）。
ヒトｉＰＳＣニューロンおよび星状細胞のＡＳＯ処理によりＴＭＥＭ１０６ｂタンパク質レベルが低下するかどうかをさらに調査した。連続１０日間のインキュベーション実験では、最終ＡＳＯ濃度１０μＭで２か月培養した後、ＡＳＯにヒトｉＰＳＣニューロンおよび星状細胞混合物を加えた。３日目と７日目に、最適な細胞の健康を維持するために培地の５０％を交換した（追加のＡＳＯは加えなかった）。ＡＳＯ処理を開始してから１０日後、タンパク質分析のために、プロテイナーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ １１８３６１５３００１）を含むＲＩＰＡバッファー（Ｐｉｅｒｃｅ ８９９００）で細胞を回収した。ＢＣＡマイクロタンパク質濃度分析は、総タンパク質濃度を測定するために、すべての溶解物について製造者の指示書に従って行われた（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２３２３５）。タンパク質分析は、Ｐｅｇｇｙ Ｓｕｅキット（ＳＭ－Ｓ００１）を使用して製造者の指示書に従ってＰｅｇｇｙ Ｓｕｅ自動ウェスタン機器（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ）で行った。等量の総タンパク質がロードされた。ＴＭＥＭ１０６ｂの抗体はＢｅｔｈｙｌ（Ａ３０３－４３９Ａ）からであり、ハウスキーピング遺伝子の正規化のためのＧＡＰＤＨはＮｏｒｖｕｓ（ＮＢ１００－５６８７５）からである。
図７Ｃは、自動化ウェスタンブロットの結果を示す。左側のパネルでは、対照とＣＭＰ番または６５＿１ ＡＳＯ １０μＭで１０日間処理した後のニューロン溶解物を、表示されたレーンにロードした。次いで、レーンを抗ＴＭＥＭ１０６ｂ抗体でプローブした。右のパネルは、抗ＧＡＰＤＨ抗体でプローブされた同じサンプルレーンを示す。ＣＭＰ番号６５＿１は、１０日間の処理後にヒトＴＭＥＭ１０６ｂタンパク質レベルを低下させることができることがわかる。
実施例６：ＴＭＥＭ１０６ｂ ｍＲＮＡおよびタンパク質のマウスにおけるインビボ減少の時間経過
本実施例は、単一ＩＣＶ注射の１、２、４、８、および１２週間後のｍＲＮＡおよびタンパク質の長期間の減少について、上記の実施例４でも使用された、選択されたマウスＡＳＯの能力を試験した。
本実施例では、単一ＩＣＶ注射の１週間後のｍＲＮＡの減少に関連して実施例４で生成されたデータを引き継いだ。追加のデータは、単一ＩＣＶ注射の１、２、４、８および１２週間後のｍＲＮＡおよびタンパク質の減少について生成された。
これらの実験では、Ｊａｃｋｓｏｎ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙからのＣ５７ＢＬ／６Ｊオス（３～６か月齢）を使用した。マウスは規則的な明／暗サイクル（１４：１０時間）で飼育し、食物（ＬａｂＤｉｅｔ ５０１０）と水を自由に摂取させた。すべての注射および組織採取は、明期中に行われた。マウス実験のすべてのプロトコルは、施設内動物管理および使用委員会によって承認され、実験動物の管理および使用に関するＮＩＨガイドに従って実施された。
動物をイソフルランで麻酔し、頭蓋骨の頭頂領域の上の毛を剃毛により除去し、抗菌ベタジン溶液と７０％エタノールまたはＣｌｏｒａｐｒｅｐ溶液のいずれかで皮膚を洗浄した。ブレグマを特定するために、後頭部と額の間で皮膚を正中切開した。２６ゲージの１０μｌハミルトンシリンジを使用して、容積５μｌ（生理食塩水）のＡＳＯ １００μｇを右心室（－０．５ＡＰ、１．０ＭＬ、３．０ＤＶ）に１μｌ／秒の速度で注射した。注射の１分後、針をゆっくりと引き抜いた。切開部を組織接着剤で閉じ、手順に起因する痛みを軽減するために、最大３日間ブプレノルフィンを投与した。
注射後１（実施例４のｍＲＮＡオリジナルデータ）、２、４、８、および１２週間で、マウスを吸入麻酔薬（イソフルラン）の一定の流れの下で断頭して安楽死させた。脳を氷冷した脳基質上に置き、右半脳を２つの２ｍｍ切片に切断した。１つの切片をすぐにＲＮＡＬａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ）に入れ、ｑＰＣＲのために４℃で保管した。２番目の２ｍｍスライスの重さを量り、すぐに液体窒素で瞬間凍結し、タンパク質分析のために－８０℃で保管した。
ｑＰＣＲでは、組織を次いでＲＬＴバッファー（Ｑｉａｇｅｎ）溶解試薬に移し、ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して溶解した。ＲＮＡは、ＱＩＡＣＵＢＥワークステーションを有するＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ＱＩＡｃｕｂｅ Ｋｉｔ（ｃａｔ．７４１１６）を使用して抽出した。ＲＮＡ濃度をＮａｎｏｄｒｏｐでチェックし（ＲＮＡ－４０、ブランクＨ２０として）、次いで各サンプルを水で希釈して、２ｎｇ／μｌの溶液を得た。ＲＮＡを９０℃で４０秒間熱変性させた。ｑＰＣＲアッセイは、ｑＳｃｒｉｐｔ（商標）ＸＬＴ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲ ＴｏｕｇｈＭｉｘ（登録商標）Ｌｏｗ ＲＯＸ（ＱｕａｎｔａＢｉｏ、ｃａｔ．９５１３４－０２Ｋ）を使用して、ＴＭＥＭ１０６ｂ（ｃａｔ．４３５１３６８、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をプローブとして、ＧＡＰＤＨ（ｃａｔ．４３５２３３９Ｅ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を正規化用プローブとして使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＶｉｉＡ７サーマルサイクラーで行った。結果を表１６および図８Ａに示す。
表１６：ＴＭＥＭ１０６ｂ ｍＲＮＡのインビボでの長期的な減少
Figure 0007281474000036
表１６および図８Ａからわかるように、ＣＭＰ番号１５２＿１と１５５＿１の両方のＴＭＥＭ１０６ｂ ｍＲＮＡの減少は、注射後１～４週間で最大であった。生理食塩水対照（ｎ＝３～６／グループ）と比較して、ＡＳＯ処理された動物のＴＭＥＭ１０６ｂ ｍＲＮＡは、注射後１２週間でベースライン（生理食塩水対照動物）に戻らず、１２週間後に両方のＣＭＰ番号１５２＿１および１５５＿１（ｎ＝６～７／グループ）で３０～３５％のｍＲＮＡ減少が検出された。
ウェスタンブロットの場合、２番目の瞬間凍結スライスを、ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ、３０サイクル／ｓで３分間）を使用して、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｒｏｃｈｅプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）およびＰｈｏｓＳｔｏｐ（Ｒｏｃｈｅ）を含む１０容積のＲＩＰＡバッファーでホモジナイズした。次いで、サンプルを４℃で２０分間回転させた後、４℃で１４，０００ｒｐｍ（Ｇｓ）で２０分間遠心分離した。上清を収集し、－８０℃で保管した。タンパク質サンプルを、還元剤（１０ｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＬＤＳローディングバッファー（４ｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で１／５に希釈し、９５℃で５分間熱変性させた。次いで、サンプルを氷上に置き、－２０℃で保管した。等量のサンプルを、１ｘ ＭＯＰＳランニングバッファーを含む１０％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲルで分離し、ニトロセルロースメンブレン（ｉＢｌｏｔ２、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に移し、ＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ中の５％脱脂粉乳で室温でブロックした。ブロットは、ウサギ抗ＴＭＥＭ１０６ｂ（Ａ３０３－４３９；Ｂｅｔｈｙｌ、１：５００）または５％ＢＳＡ中のβ－チューブリンで４℃で一晩プローブした。ブロットをＴＢＳＴで洗浄し、ＨＲＰ結合二次抗体と室温で２時間インキュベートした後、ＣｈｅｍｉＤｏｃ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）でＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ ＥＣＬ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して展開した。Ｉｍａｇｅ Ｌａｂ ５．２（ＢｉｏＲａｄ）を使用してブロットを定量し、各レーンをβ－チューブリン、次いで対照サンプルに正規化した。結果を、表１７および図８Ｂに示す。結果を、表１７および図８Ｂに示す。
表１７：ＴＭＥＭ１０６ｂタンパク質のインビボでの長期的な減少
Figure 0007281474000037
同様に、表１７および図８Ｂからわかるように、ＴＭＥＭ１０６ｂタンパク質は注射後２～４週間で最大４０～５０％減少した。生理食塩水対照と比較して（ｎ＝２～６／グループ）、ＴＭＥＭ１０６ｂタンパク質は注射後１２週間でベースラインに戻らず、ＣＭＰ番号１５２＿１で処理された動物（ｎ＝６～７／グループ）は３９％減少し、ＣＭＰ番号１５５＿１で処理された（ｎ＝５～７／グループ）動物は１４％減少した。

Claims (28)

  1. １０～３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む、１０～５０ヌクレオチド長の治療的単鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドであって、前記連続ヌクレオチド配列が、配列番号６５、６６、６８、７１、７３、７４、７５、７９、および８２からなる群から選択される配列を含み、前記単鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが、１つ以上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含む、単鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
  2. 前記連続ヌクレオチド配列が、１２～２２ヌクレオチドを含む、または１２～２２ヌクレオチドからなる、請求項１に記載の単鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
  3. 前記単鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが、１つ以上の２’－糖修飾ヌクレオシドを含む、請求項１又は２に記載の単鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
  4. 前記１つ以上の２’－糖修飾ヌクレオシドが、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’－フルオロ－ＡＮＡおよびＬＮＡヌクレオシドからなる群から独立して選択される、請求項３に記載の単鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
  5. 前記１つ以上の２’－糖修飾ヌクレオシドの少なくとも１つが、ＬＮＡヌクレオシドである、請求項４に記載の単鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
  6. 前記連続ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の単鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
  7. 前記連続ヌクレオチド配列が、少なくとも１つのホスホロチオエート修飾ヌクレオシド間結合を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の単鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
  8. 前記連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の少なくとも７５％または全部が、ホスホロチオエート－ヌクレオシド間結合である、請求項７に記載の単鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
  9. 前記単鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＲＮａｓｅ Ｈ１を動員することが可能である、請求項１～８のいずれか一項に記載の単鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
  10. 前記単鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその前記連続ヌクレオチド配列が、式５’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－３’のギャップマーからなり、またはそれを含み、ＦおよびＦ’が独立して１～８個のヌクレオシドを含み、そのうち１～５個のヌクレオシドが独立して２’糖修飾され、かつＦおよびＦ’の５’および３’末端を規定し、ＧがＲＮａｓｅＨを動員することが可能な５～１８個のヌクレオシドである、請求項１～９のいずれか一項に記載の単鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
  11. 前記単鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが、２’－ＭＯＥギャップマー、ＬＮＡギャップマー、混合ウイングギャップマー、および交互フランクギャップマーからなる群から選択される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の単鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
  12. 前記単鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその前記連続ヌクレオチド配列が、ＡＴＧＴｔｔａｔｃａｃｃａａＡＡＴＴ（配列番号６５）、ＣＴＧＡａａｔａｃｔａｃｃａＴＡＴＡ（配列番号６６）、ＣｇａａａｔｔａａｔｃｔｃａａＣＣＣＡ（配列番号６８）、ＴＴＴＡａｔｃａｔａｃｃａＡＴＣＴ（配列番号７１）、ＣＴＣＡａａｔａａａｔｔａａｔＣＴＣＴ（配列番号７３）、ＴＴＣＴｔａｔｔｔｃａａａｔＣＴＣＡ（配列番号７４）、ＴＣＴＴａｔｔｔｃａａａｔＣＴＣＡ（配列番号７５）、ＴＡＡＣａｇｔｃｔｔｔｔｔＡＣＴＣ（配列番号７９）、及びＡＣＴＡｔａａｃａｇｔＣＴＡＣ（配列番号８２）からなる群から選択され、ここで大文字のアルファベットはベータ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドであり、小文字のアルファベットはＤＮＡヌクレオシドであり、全てのＬＮＡのＣは、５－メチルシトシンであり、ヌクレオシド間結合はホスホロチオエート－ヌクレオシド間結合である、
    請求項１に記載の単鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
  13. 前記単鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその前記連続ヌクレオチド配列が、ＣＭＰ番号６５＿１（配列番号６５）である、請求項１２に記載の単鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
  14. 前記単鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその前記連続ヌクレオチド配列が、ＣＭＰ番号６６＿１（配列番号６６）である、請求項１２に記載の単鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
  15. 前記単鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその前記連続ヌクレオチド配列が、ＣＭＰ番号６８＿１（配列番号６８）である、請求項１２に記載の単鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
  16. 前記単鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその前記連続ヌクレオチド配列が、ＣＭＰ番号７１＿１（配列番号７１）である、請求項１２に記載の単鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
  17. 前記単鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその前記連続ヌクレオチド配列が、ＣＭＰ番号７３＿１（配列番号７３）である、請求項１２に記載の単鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
  18. 前記単鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその前記連続ヌクレオチド配列が、ＣＭＰ番号７４＿１（配列番号７４）である、請求項１２に記載の単鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
  19. 前記単鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその前記連続ヌクレオチド配列が、ＣＭＰ番号７５＿１（配列番号７５）である、請求項１２に記載の単鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
  20. 前記単鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその前記連続ヌクレオチド配列が、ＣＭＰ番号７９＿１（配列番号７９）である、請求項１２に記載の単鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
  21. 前記単鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその前記連続ヌクレオチド配列が、ＣＭＰ番号８２＿１（配列番号８２）である、請求項１２に記載の単鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
  22. 請求項１～２１のいずれか一項に記載の単鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドと、前記単鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも１つのコンジュゲート部分とを含むコンジュゲート。
  23. 請求項１～２１のいずれか一項に記載の単鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは請求項２２に記載のコンジュゲートの、薬学的に許容される塩。
  24. 請求項１～２１のいずれか一項に記載の単鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項２２に記載のコンジュゲート、または請求項２３に記載の薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される希釈剤、溶媒、担体、塩、および／または佐剤とを含む医薬組成物。
  25. ＴＭＥＭ１０６Ｂを発現している標的細胞におけるＴＭＥＭ１０６Ｂ発現を調節するためのインビトロ方法であって、請求項１～２１のいずれか一項に記載の単鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項２２に記載のコンジュゲート、請求項２３に記載の薬学的に許容される塩、または請求項２４に記載の医薬組成物を前記細胞に投与することを含む、方法。
  26. 請求項１～２１のいずれか一項に記載の単鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項２２に記載のコンジュゲート、請求項２３に記載の薬学的に許容される塩、または請求項２４に記載の医薬組成物を含む、医薬。
  27. 請求項１～２１のいずれか一項に記載の単鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項２２に記載のコンジュゲート、請求項２３に記載の薬学的に許容される塩、または請求項２４に記載の医薬組成物を含む、神経変性、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、パーキンソン病（またはパーキンソニズム）、低髄鞘性白質ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症および多系統萎縮症、アルツハイマー病、運動ニューロン疾患、皮質基底核症候群、進行性核上性麻痺、ならびに神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）からなる群から選択される疾患の治療または予防のための医薬。
  28. 前記疾患が前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）である、請求項２７に記載の医薬。

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