JP2020521491A - Htra1発現を調節するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、HTRA1の発現の調節に導く、HTRA1に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチド(オリゴマー)に関する。HTRA1発現の調節は、広範な医学的障害、例えば黄斑変性症など(例、加齢性黄斑変性症)のために有益である。
セリンプロテアーゼのヒト高温要求A(HTRA)ファミリーは、プロテアーゼ及びシャペロンの二重機能を組み合わせることにより、細胞外コンパートメントにおけるタンパク質恒常性の維持に含まれる遍在的に発現するPDZプロテアーゼである。HTRAプロテアーゼは、細胞外マトリックスの組織化、細胞増殖、及び老化に関係している。HTRA活性の調節は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー(Bakay et al. 2002, Neuromuscul. Disord. 12: 125-141)、関節炎、例えば変形性関節症など(Grau et al. 2006, JBC 281: 6124-6129)、癌、家族性虚血性脳小血管疾患、及び加齢黄斑変性症、ならびにパーキンソン病及びアルツハイマー病を含む重度疾患に関連する。ヒトHTRA1はインスリン様成長因子(IGF)結合ドメインを含む。それは、IGFの可用性及び細胞成長を調節し(Zumbrunn and Trueb, 1996, FEES Letters 398:189-192)、腫瘍抑制特性を示すことが提唱されている。HTRA1発現は転移性メラノーマにおいて下方調節されており、このように、メラノーマの進行の程度を示しうる。転移性メラノーマ細胞株におけるHTRA1の過剰発現によって、インビトロでの増殖及び浸潤が低下し、異種移植マウスモデルにおいて腫瘍成長が低下した(Baldi et al., 2002, Oncogene 21:6684-6688)。HTRA1発現はまた、卵巣癌において下方調節される。卵巣癌細胞株では、HTRA1過剰発現によって細胞死が誘導され、アンチセンスHTRA1発現によって足場非依存性成長が促進された(Chien et al., 2004, Oncogene 23:1636-1644)。
本発明は、インビボ又はインビトロでHTRA1を調節するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。本発明では、効果的なHTRA1阻害を与えるためにアンチセンスオリゴヌクレオチドにより標的化されうるヒトHTRA1 mRNA(プレmRNAを含む)中に存在する潜在性の標的配列モチーフが同定された。本発明はまた、HTRA1を阻害することが可能である効果的なアンチセンスオリゴヌクレオチド配列及び化合物、ならびにHTRA1が適応される疾患又は障害の処置におけるそれらの使用を提供する。
本発明は、哺乳動物HTRA1核酸を標的とする(即ち、HTRA1の発現を阻害すること可能である)、HTRA1の機能に関連する疾患を処置又は防止するためのオリゴヌクレオチドに関する。HTRA1を標的とするオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドである、即ち、それらのHTRA1核酸標的に相補的である。
それにおいて大文字はベータ−D−オキシLNAヌクレオシドを表し、小文字はDNAヌクレオシドであり、下付き文字sはホスホロチオエートヌクレオシド間連結を表し、mCは5メチルシトシンベータ−D−オキシLNAヌクレオシドを表し、mcは5メチルシトシンDNAヌクレオシドを表す。
のオリゴヌクレオチドを提供し、
それにおいて大文字はベータ−D−オキシLNAヌクレオシドを表し、小文字はDNAヌクレオシドであり、下付き文字sはホスホロチオエートヌクレオシド間連結を表し、mCは5メチルシトシンベータ−D−オキシLNAヌクレオシドを表し、mcは5メチルシトシンDNAヌクレオシドを表す。
のオリゴヌクレオチドを提供し、
それにおいて大文字はベータ−D−オキシLNAヌクレオシドを表し、小文字はDNAヌクレオシドであり、下付き文字sはホスホロチオエートヌクレオシド間連結を表し、mCは5メチルシトシンベータ−D−オキシLNAヌクレオシドを表し、mcは5メチルシトシンDNAヌクレオシドを表す。
のオリゴヌクレオチドを提供し、
それにおいて大文字はベータ−D−オキシLNAヌクレオシドを表し、小文字はDNAヌクレオシドであり、下付き文字sはホスホロチオエートヌクレオシド間連結を表し、mCは5メチルシトシンベータ−D−オキシLNAヌクレオシドを表し、mcは5メチルシトシンDNAヌクレオシドを表す。
オリゴヌクレオチド
本明細書中で使用する用語「オリゴヌクレオチド」は、2つ又はそれ以上の共有結合的に連結されたヌクレオシドを含む分子として当業者により一般的に理解されるように定義する。そのような共有結合的に結合されたヌクレオシドはまた、核酸分子又はオリゴマーとして言及されうる。オリゴヌクレオチドは一般に、実験室において固相化学合成、それに続く精製により作製される。オリゴヌクレオチドの配列に言及する場合、共有結合的に連結されたヌクレオチド又はヌクレオシドの核酸塩基部分の配列もしくは順序、又はその修飾に言及する。本発明のオリゴヌクレオチドは人工であり、化学的に合成し、典型的には精製又は単離する。本発明のオリゴヌクレオチドは、1つ又は複数の修飾されたヌクレオシド又はヌクレオチドを含みうる。
本明細書中で使用する用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、標的核酸、特に標的核酸上の連続配列にハイブリダイズすることにより標的遺伝子の発現を調節することが可能であるオリゴヌクレオチドとして定義する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは本質的に二本鎖ではなく、従ってsiRNAではない。好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは一本鎖である。
用語「連続ヌクレオチド領域」は、標的核酸に相補的であるオリゴヌクレオチドの領域を指す。この用語は、本明細書中では、用語「連続ヌクレオチド配列」又は「連続核酸塩基配列」及び用語「オリゴヌクレオチドモチーフ配列」と互換的に使用してもよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチドが連続ヌクレオチド領域中に存在する。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは連続ヌクレオチド領域を含み、場合により、さらなるヌクレオチド、例えば、官能基を連続ヌクレオチド配列に付着させるために使用されうるヌクレオチドリンカー領域を含みうる。ヌクレオチドリンカー領域は、標的核酸に相補的であってもなくてもよい。一部の実施形態では、連続ヌクレオチド領域のヌクレオチド間に存在するヌクレオシド間連結は、全てのホスホロチオエートヌクレオシド間連結である。一部の実施形態では、連続ヌクレオチド領域は1つ又は複数の糖修飾ヌクレオシドを含む。
ヌクレオチドはオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの構成要素であり、本発明の目的のために、天然及び非天然ヌクレオチドの両方を含む。自然界では、ヌクレオチド(例えばDNAヌクレオチド及びRNAヌクレオチドなど)は、リボース糖部分、核酸塩基部分、及び1つ又は複数のリン酸基(ヌクレオシド中には存在しない)を含む。ヌクレオシド及びヌクレオチドはまた、「単位」又は「単量体」として互換的に言及してもよい。
本明細書中で使用する用語「修飾ヌクレオシド」又は「ヌクレオシド修飾」は、糖部分又は(核酸)塩基部分の1つ又は複数の修飾の導入により、等価のDNA又はRNAヌクレオシドと比較して修飾されたヌクレオシドを指す。好ましい実施形態では、修飾ヌクレオシドは修飾糖部分を含む。用語「修飾ヌクレオシド」はまた、本明細書中で、用語「ヌクレオシド類似体」又は修飾「単位」又は修飾「単量体」と互換的に使用してもよい。
用語「修飾ヌクレオシド間連結」は、2つのヌクレオシドを共有結合的に共役させるホスホジエステル(PO)連結以外の連結として当業者により一般的に理解されているように定義する。修飾ヌクレオシド間連結を伴うヌクレオチドはまた、「修飾ヌクレオチド」と呼ぶ。一部の実施形態では、修飾ヌクレオシド間連結によって、ホスホジエステル連結と比較して、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性が増加する。天然オリゴヌクレオチドについて、ヌクレオシド間連結は、隣接ヌクレオシド間にホスホジエステル結合を作製するリン酸基が含まれる。修飾ヌクレオシド間連結は、インビボでの使用のためにオリゴヌクレオチドを安定化する際に特に有用であり、本発明のオリゴヌクレオチド中のDNA又はRNAヌクレオシドの領域で、例えばギャップマーオリゴヌクレオチドのギャップ領域内の、ならびに修飾ヌクレオシドの領域中のヌクレアーゼ切断に対して保護するのに役立ちうる。
用語「核酸塩基」は、核酸ハイブリダイゼーションにおいて水素結合を形成するヌクレオシド及びヌクレオチド中に存在するプリン(例、アデニン及びグアニン)及びピリミジン(例、ウラシル、チミン、及びシトシン)部分を含む。本発明の文脈において、用語「核酸塩基」はまた、天然核酸塩基とは異なりうるが、しかし、核酸ハイブリダイゼーションの間に機能的である修飾核酸塩基を包含する。この文脈において、「核酸塩基」は、天然核酸塩基(例えばアデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチン、及びヒポキサンチンなど)、ならびに非天然バリアントの両方を指す。そのようなバリアントは、例えば、Hirao et al (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055及びBergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1において記載されている。
用語「修飾オリゴヌクレオチド」によって、1つ又は複数の糖修飾ヌクレオシド及び/又は修飾ヌクレオシド間連結を含むオリゴヌクレオチドを記載する。用語「キメラ」オリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシドを伴うオリゴヌクレオチドを記載するために文献において使用されてきた用語である。
用語「相補性」によって、ヌクレオシド/ヌクレオチドのワトソンクリック塩基対形成のための能力を記載する。ワトソン−クリック塩基対は、グアニン(G)−シトシン(C)及びアデニン(A)−チミン(T)/ウラシル(U)である。オリゴヌクレオチドは、修飾核酸塩基を伴うヌクレオシドを含みうるが、例えば、5−メチルシトシンがシトシンの代わりにしばしば使用され、そのようなものとして、用語「相補性」は、非修飾核酸塩基と修飾核酸塩基の間のワトソンクリック塩基対形成を包含することが理解されるであろう(例えば、Hirao et al (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055及びBergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1を参照のこと)。
本明細書中で使用する用語「同一性」は、所与の位置で、別々の核酸分子(例、標的核酸)の所与の位置で連続ヌクレオチド配列と(即ち、相補的ヌクレオシドとワトソンクリック塩基対を形成するそれらの能力において)同一である核酸分子(例、オリゴヌクレオチド)中の連続ヌクレオチド配列のパーセントでのヌクレオチド数を指す。パーセンテージは、2つの配列(ギャップを含む)間で同一である、整列された塩基の数をカウントし、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの総数により除し、100により乗じることにより算出する。同一性パーセント=(マッチ数×100)/整列領域の長さ(ギャップを伴う)。
本明細書中で使用する用語「ハイブリダイズしている」又は「ハイブリダイズする」は、2つの核酸鎖(例、オリゴヌクレオチド及び標的核酸)が反対鎖の塩基対間に水素結合を形成し、それにより二本鎖を形成すると理解すべきである。2つの核酸鎖間の結合の親和性は、ハイブリダイゼーションの強度である。それはしばしば、オリゴヌクレオチドの半分が標的核酸と二本鎖化される温度として定義される融解温度(Tm)の観点から記載される。生理学的条件Tmは親和性に厳密に比例しない(Mergny and Lacroix, 2003, Oligonucleotides 13:515-537)。標準状態のギブス自由エネルギーΔG°は、結合親和性のより正確な表現であり、ΔG°=−RTln(Kd)により反応の解離定数(Kd)に関連し、式中、Rは気体定数であり、Tは絶対温度である。従って、オリゴヌクレオチドと標的核酸間の反応の非常に低いΔG°は、オリゴヌクレオチドと標的核酸間の強いハイブリダイゼーションを反映している。ΔG°は、水溶液の濃度が1Mであり、pHが7であり、温度が37℃である反応に関連付けられるエネルギーである。標的核酸へのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは自発的な反応であり、自発的な反応について、ΔG°はゼロ未満である。ΔG°は、例えば、Hansen et al., 1965, Chem. Comm. 36-38及びHoldgate et al., 2005, Drug Discov Todayにおいて記載されている等温滴定熱量測定(ITC)方法の使用により実験的に測定することができる。当業者は、市販の機器をΔG°測定のために利用可能であることを知っているであろう。ΔG°はまた、Sugimoto et al., 1995, Biochemistry 34:11211-11216及びMcTigue et al., 2004, Biochemistry 43:5388-5405により記載されている適宜導出された熱力学的パラメーターを使用して、SantaLucia, 1998, Proc Natl Acad Sci USA. 95: 1460-1465により記載されているように、最近傍モデルを使用することにより数値的に推定することができる。 ハイブリダイゼーションによりその意図する核酸標的を調節する可能性を有するために、本発明のオリゴヌクレオチドは、長さ10〜30ヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドについて−10kcal未満の推定ΔG°値を伴い標的核酸にハイブリダイズする。一部の実施形態では、ハイブリダイゼーションの程度又は強度は、標準状態のギブス自由エネルギーΔG°により測定する。オリゴヌクレオチドは、長さ8〜30ヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドについて−10kcalの範囲未満、例えば−15kcal未満など、例えば−20kcal未満など、例えば−25kcal未満などの推定ΔG°値を伴い標的核酸にハイブリダイズしうる。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、−10〜−60kcal、例えば−12〜−40など、例えば−15〜−30kcal又は−16〜−27kcalなど、例えば−18〜−25kcalなどの推定ΔG°値を伴い標的核酸にハイブリダイズする。
オリゴヌクレオチドは、標的核酸分子の部分配列に相補的である又はハイブリダイズする連続ヌクレオチド領域を含む。本明細書中で使用する用語「標的配列」は、本発明のオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域又は配列に相補的である核酸塩基配列を含む標的核酸中に存在するヌクレオチドの配列を指す。一部の実施形態では、標的配列は、本発明のオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域又は配列に相補的である標的核酸上の領域からなる。一部の実施形態では、標的配列は単一のオリゴヌクレオチドの相補的配列よりも長く、例えば、本発明のいくつかのオリゴヌクレオチドにより標的化されうる標的核酸の好ましい領域を表す。
本明細書中で使用する用語「標的細胞」は、標的核酸を発現している細胞を指す。一部の実施形態では、標的細胞はインビボ又はインビトロでありうる。一部の実施形態では、標的細胞は、哺乳動物細胞、例えば霊長類細胞など、例えばサル細胞又はヒト細胞などである。一部の実施形態では、標的細胞は、網膜細胞、例えば網膜色素上皮(PRE)細胞などでありうる。一部の実施形態では、細胞は、RPE細胞、双極細胞、アマクリン細胞、内皮細胞、神経節細胞、及びミクログリア細胞からなる群より選択する。インビトロ評価について、標的細胞は初代細胞又は樹立細胞株、例えばU251、ARPE19・・・などである。
本発明に従い、標的核酸は、哺乳動物HTRA1をコードする核酸であり、例えば、遺伝子、RNA、mRNA、及びプレmRNA、成熟mRNA又はcDNA配列でありうる。標的は従って、HTRA1標的核酸として言及されうる。
用語「天然バリアント」は、標的核酸と同じ遺伝子座から由来するHTRA1遺伝子又は転写物のバリアントを指すが、しかし、例えば、同じアミノ酸をコードするコドンの多様性を起こす遺伝コードの縮重のため、又はプレmRNAの選択的スプライシング、又は多型(例えば一塩基多型など)、及び対立遺伝子変異体の存在に起因して異なりうる。オリゴヌクレオチドに完全に相補的な配列の存在に基づき、本発明のオリゴヌクレオチドは従って、標的核酸及びその天然バリアントを標的としうる。一部の実施形態では、天然バリアントは、哺乳動物HTRA1標的核酸(例えば配列番号1、2、3、又は4からなる群より選択され標的核酸など)への少なくとも95%、例えば少なくとも98%又は少なくとも99%などの相同性を有する。
本明細書中で使用する用語「発現の調節」は、オリゴヌクレオチドの投与前のHTRA1の量と比較した場合にHTRA1の量を変えるオリゴヌクレオチドの能力についての全体的な用語として理解される。あるいは、発現の調節は、本発明のオリゴヌクレオチドが投与されない対照実験の参照により決定されうる。調節の1つの型は、例えば、mRNAの分解又は転写の遮断によりHTRA1の発現を阻害、下方調節、低下、抑制、除去、停止、遮断、防止、軽減、低減、回避、又は終結させるオリゴヌクレオチドの能力である。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、HTRA1の発現を阻害、下方調節、低下、抑制、除去、停止、遮断、防止、軽減、低減、回避、又は終結させることが可能である。
高親和性修飾ヌクレオシドは、例えば融解温度(Tm)により測定されるように、オリゴヌクレオチド中に組み入れられた場合、その相補的標的についてのオリゴヌクレオチドの親和性を増強する修飾ヌクレオチドである。本発明の高親和性修飾ヌクレオシドは、好ましくは、修飾ヌクレオシド当たり+0.5〜+12℃、より好ましくは+1.5〜+10℃、最も好ましくは+3〜+8℃の間の融解温度における増加をもたらす。多数の高親和性修飾ヌクレオシドが当技術分野において公知であり、例えば、多くの2’置換ヌクレオシドならびにロックド核酸(LNA)を含む(例、Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443及びUhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213を参照のこと)。
本発明のオリゴマーは、修飾糖部分、即ち、DNA及びRNA中に見出されるリボース糖部分と比較した場合での糖部分の修飾を有する1つ又は複数のヌクレオシドを含んでもよい。
2’糖修飾ヌクレオシドは、2’位置にH又は−OH以外の置換基を有する(2’置換ヌクレオシド)、又は2’連結ビラジクルを含むヌクレオシドであり、2’置換ヌクレオシド及びLNA(2’−4’ビラジクル架橋)ヌクレオシドを含む。例えば、2’修飾糖は、オリゴヌクレオチドへの増強した結合親和性及び/又は増加したヌクレアーゼ耐性を提供しうる。2’置換修飾ヌクレオシドの例は、2’−O−アルキル−RNA、2’−O−メチル−RNA、2’−アルコキシ−RNA、2’−O−メトキシエチル−RNA(MOE)、2’−アミノ−DNA、2’−フルオロ−RNA、及び2’−F−ANAヌクレオシドである。さらなる例については、例えば Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443及びUhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213、ならびにDeleavey and Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937を是非参照のこと。以下は、2’置換修飾ヌクレオシドの例証である。
LNAヌクレオシドは、ヌクレオチドのリボース糖環のC2’とC4’の間にリンカー基(ビラジクル又は架橋として言及する)を含む修飾ヌクレオシドである。これらのヌクレオシドはまた、文献において架橋核酸又は二環式核酸(BNA)と呼ぶ。
式中、Wは−O−、−S−、−N(Ra)−、−C(RaRb)−より選択し、例えば一部の実施形態では−O−などである;
Bは核酸塩基部分を指定する;
Zは、隣接ヌクレオシド又は5’末端基へのヌクレオシド間連結を指定する;
Z*は、隣接ヌクレオシド又は3’末端基へのヌクレオシド間連結を指定する;
Xは、−C(RaRb)−、−C(Ra)=C(Rb)−、−C(Ra)=N−、−O−、−Si(Ra)2−、−S−、−SO2−、−N(Ra)−、及び>C=Zからなるリストより選択される群を指定する。
Yは、−C(RaRb)−、−C(Ra)=C(Rb)−、−C(Ra)=N−、−O−、−Si(Ra)2−、−S−、−SO2−、−N(Ra)−、及び>C=Zからなる群より選択された基を指定する。
又は−X−Y−は二価リンカー基(ラジクルとしても言及する)を一緒に指定し、−C(RaRb)−、−C(Ra)=C(Rb)−、−C(Ra)=N−、−O−、−Si(Ra)2−、 −S−、−SO2−、−N(Ra)−、及び>C=Zからなる群より選択される1、2、又は3の基/原子からなる二価リンカー基を一緒に指定する。
式中、Zは−O−、−S−、及び−N(Ra)−より選択し、
Ra、及び存在する場合にはRbは、各々が、水素、場合により置換C1−6−アルキル、場合により置換C2−6−アルケニル、場合により置換C2−6−アルキニル、ヒドロキシ、場合により置換C1−6−アルコキシ、C2−6−アルコキシアルキル、C2−6−アルケニルオキシ、カルボキシ、C1−6−アルコキシカルボニル、C1−6−アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ−カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ−カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ及びジ(C1−6−アルキル)アミノ、カルバモイル、モノ及びジ(C1−6−アルキル)−アミノ−カルボニル、アミノ−C1−6−アルキル−アミノカルボニル、モノ及びジ(C1−6−アルキル)アミノ−C1−6−アルキル−アミノカルボニル、C1−6−アルキル−カルボニルアミノ、カルバミド、C1−6−アルカノイルオキシ、スルホノ、C1−6−アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C1−6−アルキルチオ、ハロゲンより独立して選択され、ここでアリール及びヘテロアリールを場合により置換してもよく、ここで2つのジェミナル置換基Ra及びRbは一緒に、場合により置換メチレン(=CH2)を指定しうるが、それにおいて全てのキラル中心について、不斉基はR又はSのいずれかの方向において見出されうる。
式中、R1、R2、R3、R5、及びR5*は、水素、場合により置換C1−6−アルキル、場合により置換C2−6−アルケニル、場合により置換C2−6−アルキニル、ヒドロキシ、C1−6−アルコキシ、C2−6−アルコキシアルキル、C2−6−アルケニルオキシ、カルボキシ、C1−6−アルコキシカルボニル、C1−6−アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ−カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ−カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、 アミノ、モノ及びジ(C1−6−アルキル)アミノ、カルバモイル、モノ及びジ(C1−6−アルキル)−アミノ−カルボニル、アミノ−C1−6−アルキル−アミノカルボニル、モノ及びジ(C1−6−アルキル)アミノ−C1−6−アルキル−アミノカルボニル、C1−6−アルキル−カルボニルアミノ、カルバミド、C1−6−アルカノイルオキシ、スルホノ、C1−6−アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C1−6−アルキルチオ、ハロゲンからなる群より独立して選択し、ここでアリール及びヘテロアリールは場合により置換されてもよく、ここで2つのジェミナル置換基は一緒にオキソ、チオキソ、イミノ、又は場合により置換メチレンを指定しうる。
ヌクレアーゼ媒介性分解は、相補的ヌクレオチド配列の分解を、そのような配列と二本鎖を形成する場合に媒介することが可能であるオリゴヌクレオチドを指す。
アンチセンスオリゴヌクレオチドのRNase H活性は、相補的RNA分子との二本鎖における場合、RNase Hを動員するためのその能力を指す。WO01/23613には、RNaseH活性を決定するためのインビトロ方法が提供されており、それは、RNaseHを動員する能力を決定するために使用されうる。典型的には、オリゴヌクレオチドは、相補的な標的核酸配列を伴い提供された場合、テスト中の修飾オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するが、しかし、DNA単量体だけを含み、オリゴヌクレオチド中の全ての単量体間のホスホロチオエート連結を伴うオリゴヌクレオチドを使用し、WO01/23613の実施例91〜95(参照により本明細書により組み入れる)により提供される方法論を使用した場合に決定された初期速度(pmol/l/分で測定される)の少なくとも5%、例えば少なくとも10%又は20%超などを有する場合、RNase Hを動員することが可能であると見なす。
本明細書中で使用する用語「ギャップマー」は、1つ又は複数の親和性増強修飾ヌクレオシド(隣接又はウィング)を含む領域により5’及び3’が隣接されたRNase H動員オリゴヌクレオチド(ギャップ)の領域を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを指す。種々のギャップマー設計を本明細書中に記載する。ヘッドマー及びテールマーは、隣接部の1つが欠落している、即ち、オリゴヌクレオチドの末端の1つだけが親和性増強修飾ヌクレオシドを含むRNase Hを動員することが可能なオリゴヌクレオチドである。ヘッドマーについて、3’隣接部が欠落している(即ち、5’隣接部は親和性増強修飾ヌクレオシドを含む)。
用語「LNAギャップマー」は、親和性増強修飾ヌクレオシドの少なくとも1つがLNAヌクレオシドであるギャップマーオリゴヌクレオチドである。一部の実施形態では、LNAギャップマー中のLNAヌクレオシドは、ベータ−D−オキシLNAヌクレオシド及び/又は6’メチルベータ−D−オキシLNAヌクレオシド(例えば(S)cETヌクレオシドなど)である。
用語「混合ウィングギャップマー」は、隣接領域が少なくとも1つのLNAヌクレオシド及び少なくとも1つの非ヌクレオシド修飾ヌクレオシド、例えば少なくとも1つのDNAヌクレオシド又は少なくとも1つの2’置換修飾ヌクレオシド、例えば2’−O−アルキル−RNA、2’−O−メチル−RNA、2’−アルコキシ−RNA、2’−O−メトキシエチル−RNA(MOE)、2’−アミノ−DNA、2’−フルオロRNA、及び2’−F−ANAヌクレオシドなどを含むLNAギャップマーを指す。一部の実施形態では、混合ウィングギャップマーは、LNAヌクレオシドを含む1つの隣接部(例、5’又は3’)を有し、他の隣接部(それぞれ3’又は5’)は2’置換修飾ヌクレオシドを含む。一部の実施形態では、混合ウィングギャップマー中のLNAヌクレオシドは、ベータ−D−オキシLNAヌクレオシド及び/又は6’メチルベータ−D−オキシLNAヌクレオシド(例えば(S)cETヌクレオシドなど)である。
本明細書中で使用する用語「コンジュゲート」は、非ヌクレオチド部分(コンジュゲート部分又は領域Cもしくは第3の領域)に共有結合的に連結されたオリゴヌクレオチドを指す。
連結又はリンカーは、1つの化学基又は目的のセグメントを、1つ又は複数の共有結合を介して別の化学基又は目的のセグメントに連結する2つの原子間の接続である。コンジュゲート部分は、オリゴヌクレオチドに直接的に又は連結部分(例、リンカー又はテザー)を通じて付着させることができる。リンカーは、3番目の領域を共有的に接続するのに役立つ(例、オリゴヌクレオチドへのコンジュゲート部分(例、領域A又はCの末端))。
本明細書中で使用する用語「処置」は、既存の疾患(例、本明細書中で言及する疾患又は障害)の処置、又は疾患の防止(即ち、予防)の両方を指す。従って、本明細書中で言及する処置は、一部の実施形態では予防的でありうることが認識されるであろう。
本発明のオリゴヌクレオチド
本発明は、HTRA1の発現を阻害することが可能なオリゴヌクレオチドに関する。調節は、HTRA1をコードする、又はHTRA1の調節において含まれる標的核酸にハイブリダイズすることにより達成されうる。標的核酸は、哺乳動物HTRA 1配列、例えば配列番号1、2、3、又は4からなる群より選択される配列などでありうる。
又はそのコンジュゲート;化合物の設計と題された欄について、大文字はLNAヌクレオシドであり、小文字はDNAヌクレオシドであり、シトシンヌクレオシドは場合により5メチルシトシンであり、ヌクレオシド間連結は少なくとも80%、例えば少なくとも90%又は100%修飾ヌクレオシド間連結など、例えばホスホロチオエートヌクレオシド間連結などである。一部の実施形態では、上の表中の化合物設計欄中の化合物の全てのヌクレオシド間連結が、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結である。モチーフ及び標的部分配列は核酸塩基配列である。
又はそのコンジュゲート;それにおいて上の表の化合物において、大文字はベータ−D−オキシLNAヌクレオシドを表し、全てのLNAシトシンは5−メチルシトシン(上付き文字mにより示す)であり、小文字はDNAヌクレオシドを表し、小文字cの前の上付き文字mは5メチルシトシンDNAヌクレオシドを表す。全てのヌクレオシド間連結がホスホロチオエートヌクレオシド間連結である。
オリゴヌクレオチド設計は、オリゴヌクレオチド配列におけるヌクレオシド糖修飾のパターンを指す。本発明のオリゴヌクレオチドは糖修飾ヌクレオシドを含み、DNA又はRNAヌクレオシドも含みうる。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは糖修飾ヌクレオシド及びDNAヌクレオシドを含む。本発明のオリゴヌクレオチド中への修飾ヌクレオシドの組み入れによって、標的核酸についてのオリゴヌクレオチドの親和性が増強しうる。その場合において、修飾ヌクレオシドは、親和性増強修飾ヌクレオチドとして言及することができる。
一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド領域は、本明細書中で単に「ギャップマー」としても言及されるギャップマー設計又は構造を有する。ギャップマー構造では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも3つの異なる構造領域、5’−隣接部、ギャップ、及び3’−隣接部、F−G−F’を「5−>3」方向に含む。この設計において、隣接領域F及びF’(ウィング領域とも呼ぶ)は、領域Gに隣接する少なくとも1つの糖修飾ヌクレオシドを含み、一部の実施形態では、2〜7の糖修飾ヌクレオシドの連続ストレッチ、又は糖修飾及びDNAヌクレオシドの連続ストレッチ(糖修飾及びDNAヌクレオシドの両方を含む混合ウィング)を含みうる。結果的に、ギャップ領域に隣接する5’隣接領域及び3’隣接領域のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシド(例えば2’修飾ヌクレオシドなど)である。ギャップ領域Gは、オリゴヌクレオチドがHTRA1標的核酸との二本鎖中にある場合、RNase Hを動員することが可能である連続ヌクレオチドのストレッチを含む。一部の実施形態では、領域Gは、5〜16のDNAヌクレオシドの連続ストレッチを含む。ギャップマー領域F−G−F’はHTRA1標的核酸に相補的であり、従って、オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域でありうる。
領域Gの’5末端に付着した領域F(5’隣接部又は5’ウィング)は、少なくとも1つの糖修飾ヌクレオシド、例えば少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7の修飾ヌクレオシドなどを含む、含有する、又はそれからなる。一部の実施形態では、領域Fは、1〜7の修飾ヌクレオシド、例えば2〜6の修飾ヌクレオシドなど、例えば2〜5の修飾ヌクレオシドなど、例えば2〜4の修飾ヌクレオシドなど、例えば1〜3の修飾ヌクレオシドなど、例えば1、2、3、又は4の修飾ヌクレオシドなどを含む、又はそれらからなる。
領域G(ギャップ領域)は、RNaseHを動員することが可能な5〜16の連続DNAヌクレオシドを含む、含有する、又はそれからなる。さらなる実施形態では、領域Gは、RNaseHを動員することが可能である5〜12、又は6〜10、又は7〜9、例えば8つなどの連続ヌクレオチド単位を含む、含有する、又はそれらからなる。
領域Gの’3末端に付着した領域F’(3’隣接部又は3’ウィング)は、少なくとも1つの糖修飾ヌクレオシド、例えば少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7の修飾ヌクレオシドなどを含む、含有する、又はそれからなる。一部の実施形態では、領域F’は、1〜7の修飾ヌクレオシド、例えば2〜6の修飾ヌクレオシドなど、例えば2〜5の修飾ヌクレオシドなど、例えば2〜4の修飾ヌクレオシドなど、例えば1〜3の修飾ヌクレオシドなど、例えば1、2、3、又は4の修飾ヌクレオシドなどを含む、又はそれらからなる。
本発明のオリゴヌクレオチドは、標的核酸に相補的である連続ヌクレオチド領域を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、本明細書において領域Dとして言及する連続ヌクレオチド領域の5’及び/又は3’に位置付けられる追加のヌクレオチドをさらに含みうる。領域D’及びD’’は、それぞれ領域Fの5’末端又は領域F’の3’末端に付着させることができる。D領域(領域D’又はD’’)は、一部の実施形態では、標的核酸に相補的である連続ヌクレオチド配列の部分を形成しうる、又は他の実施形態では、D領域は標的核酸に非相補的でありうる。
F−G−F’;特にF1−7−G4−12−F’1−7
D’−F−G−F’、特にD’1−3−F1−7−G4−12−F’1−7
F−G−F’−D’’、特にF1−7−G4−12−F’1−7−D’’1−3
D’−F−G−F’−D’’、特にD’1−3−F1−7−G4−12−F’1−7−D’’1−3
さらなる態様では、本発明は、ヌクレオチド単位を反応させ、それによりオリゴヌクレオチド中に含まれる共有結合的に連結された連続ヌクレオチド単位を形成することを含む、本発明のオリゴヌクレオチドの製造のための方法を提供する。好ましくは、この方法ではホスホラミダイト化学を使用する(例えば、Caruthers et al, 1987, Methods in Enzymology vol. 154, pages 287-313を参照のこと)。さらなる実施形態では、この方法は、連続ヌクレオチド配列をコンジュゲート部分(リガンド)と反応させることをさらに含む。さらなる態様では、本発明のオリゴヌクレオチド又はコンジュゲートオリゴヌクレオチドを医薬的に許容可能な希釈剤、溶媒、担体、塩及び/又はアジュバントと混合することを含む、本発明の組成物を製造するための方法を提供する。
治療薬としての使用のために、本発明のオリゴヌクレオチドは、適切な医薬的塩(例えばナトリウム又はカリウム塩など)として提供してもよい。一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドはナトリウム塩である。
さらなる態様では、本発明は、上記のオリゴヌクレオチド及び/又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートのいずれか、ならびに医薬的に許容可能な希釈剤、担体、塩及び/又はアジュバントを含む医薬的組成物を提供する。医薬的に許容可能な希釈剤は、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含み、医薬的に許容可能な塩は、ナトリウム塩及びカリウム塩を含むが、これらに限定しない。一部の実施形態では、医薬的に許容可能な希釈剤は、滅菌リン酸緩衝生理食塩水である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、50〜300μM溶液の濃度で医薬的に許容可能な希釈剤中で使用する。一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、10〜1000μgの用量で投与する。
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、診断、治療、及び予防のための研究試薬として利用されうる。
本発明のオリゴヌクレオチド又は医薬的組成物は、局所(例えば皮膚、吸入、眼、又は耳など)又は経腸(例えば経口又は胃腸管を通じてなど)又は非経口(例えば静脈内、皮下、筋肉内、脳内、脳室内、又は髄腔内など)投与しうる。
一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート、又は医薬的組成物は、別の治療薬剤との併用処置における使用のためである。治療薬剤は、例えば、上に記載する疾患又は障害のための標準治療でありうる。
材料及び方法
オリゴヌクレオチド合成
オリゴヌクレオチド合成は、当技術分野において一般的に公知である。以下は適用されうるプロトコールである。本発明のオリゴヌクレオチドは、使用される装置、支持体、及び濃度に関してわずかに変動する方法により製造されていたであろう。
β−シアノエチル−ホスホラミダイト(DNA−A(Bz)、DNA−G(ibu)、DNA−C(Bz)、DNA−T、LNA−5−メチル−C(Bz)、LNA−A(Bz)、LNA−G(dmf)、LNA−T)の共役を、アセトニトリル中の0.1Mの5’−O−DMT保護アミダイト及びアセトニトリル(0.25M)中のDCI(4,5−ジシアノイミダゾール)(アクティベーターとして)の溶液を使用して実施する。最終サイクルについては、所望の修飾を伴うホスホルアミダイトを使用することができる(例、コンジュゲート基又はコンジュゲート基自体を付着させるいためのC6リンカー)。ホスホロチオエート連結の導入のためのチオール化は、キサンタン水素化物(アセトニトリル/ピリジン9:1中0.01M)を使用して行う。ホスホジエステル(phosphordiester)連結を、THF/ピリジン/水7:2:1中の0.02Mヨウ素を使用して導入することができる。試薬の残りは、オリゴヌクレオチド合成のために典型的に使用されるものである。
粗化合物を、Phenomenex Jupiter C18 10μ 150×10mmカラムでの分取RP−HPLCにより精製する。0.1M酢酸アンモニウム(pH 8)及びアセトニトリルを、5mL/分の流速で緩衝液として使用する。収集した画分を凍結乾燥し、典型的には白色固体として精製化合物を与える。
DCI:4,5−ジシアノイミダゾール
DCM:ジクロロメタン
DMF:ジメチルホルムアミド
DMT:4,4’−ジメトキシトリチル
THF:テトラヒドロフラン
Bz:ベンゾイル
イブ:イソブチリル
RP−HPLC:逆相高速液体クロマトグラフィー
オリゴヌクレオチド及びRNA標的(リン酸連結、PO)二本鎖を500mlのRNaseフリー水中で3mMに希釈し、500mlの2×Tm緩衝液(200mM NaCl、0.2mM EDTA、20mM Naリン酸、pH 7.0)と混合する。溶液を3分間にわたり95℃に加熱し、次に室温で30分間にわたりアニールする。二重融解温度(Tm)を、PE Templabソフトウェア(Perkin Elmer)を使用し、ペルチェ温度プログラマーPTP6を備えたLambda 40 UV/VIS分光光度計で測定する。温度を20℃から95℃に上昇させ、次に25℃に下落させ、260nmでの吸収を記録する。融解及びアニーリングの両方の1次導関数及び局所最大値を使用して二本鎖Tmを評価する。
HTRA1についての有望な「ホットスポット」領域の同定。n=231のHTRA1 LNAオリゴヌクレオチドのライブラリーをU251細胞株において5μM、6日間の処理でスクリーニングした。このライブラリーから、本発明者らは、図1(配列番号116又は117)に示すように、位置53113〜53384の間のヒトHTRA1プレmRNAを標的とする一連の活性オリゴヌクレオチドを同定した。
実施例1において記載する「ホットスポット」領域53113〜53384を、5μMでU251細胞株においてスクリーニングされたn=210のHTRA1 LNAオリゴヌクレオチドの新たなライブラリー中でさらに検証した。n=33のLNAオリゴヌクレオチドは、位置53113〜53384の間でヒトHTRA1プレmRNAを標的としたが、これらのオリゴは、図2に示すように、残りとの比較において、比較的活性であった。
実施例1及び2に記載する「ホットスポット」領域53113〜53384を、それぞれ5μM及び25μMでU251及びARPE19細胞株でスクリーニングされたn=305のHTRA1 LNAオリゴヌクレオチドの新たなライブラリーにおいてさらに検証した。n=95のLNAオリゴヌクレオチドは、位置53113〜53384の間でヒトHTRA1プレmRNAを標的としたが、これらのオリゴは、図3に示すように、残りとの比較において、比較的活性であった。
U251及びARPE19細胞株をそれぞれ実施例1及び3に記載した。U251アッセイを、実施例1に記載するとおりに実施した。ARPE19アッセイを以下のように実施した:5000個のARPE19細胞/ウェルを、96マルチウェルプレートにおいて、供給者により推奨される培地(10%の代わりの1%FBSを除く)中に播種した。細胞を、PBS中に溶解したオリゴヌクレオチドの添加前に、2時間にわたりインキュベートした。オリゴヌクレオチドの濃度:50μMから、半対数希釈、8ポイント。オリゴヌクレオチドの添加後4日に細胞を回収した。RNA抽出、cDNA合成、及びqPCRを、実施例1に記載するように実施した。n=2の非依存的な生物学的複製物。50μMでのEC50値及び残留HTRA1 mRNAレベルを、対照の%(PBS)として表中に示す。
アッセイを、実施例3に記載するように実施した。オリゴヌクレオチドの濃度:50μMから、半対数希釈、8ポイント。それぞれU251及びARPE19についてのn=2及びn=1の非依存的な生物学的複製物。50μMでのEC50値及び残留HTRA1 mRNAレベルを、対照の%(PBS)として表中に示す。
アッセイを、実施例3に記載するように実施した。オリゴヌクレオチドの濃度:50μMから、半対数希釈、8ポイント。n=2の非依存的な生物学的複製物。50μMでのEC50値及び残留HTRA1 mRNAレベルを、対照の%(PBS)として表中に示す。
ARPE19細胞株を実施例3において記載した。アッセイのために、ARPE19細胞、24000個細胞/ウェルを、96マルチウェルプレートにおいて、100μLの飢餓培地(10%の代わりの1%FBSを除く、供給者により推奨される培養培地)中に播種した。細胞を、PBS中に溶解したオリゴヌクレオチドの添加前に、2時間にわたりインキュベートした。オリゴヌクレオチドの濃度:50μMから、半対数希釈、8ポイント。オリゴヌクレオチド化合物の添加後4及び7日目に、オリゴヌクレオチドを伴わない75μLの新鮮な飢餓培地を細胞に加えた(古い培地の除去を伴わない)。RNA抽出、cDNA合成、及びqPCRを、実施例3に記載するように実施した。n=2の非依存的な生物学的複製物。50μMでのEC50値及び残留HTRA1 mRNAレベルを、対照の%(PBS)として表中に示す。
ヒト初代RPE細胞中でのインビトロ有効性の試験。
ヒト初代網膜色素上皮(hpRPE)細胞をSciencell(カタログ番号6540)から購入した。アッセイのために、5000個のhpRPE細胞/ウェルを、ラミニン(ラミニン521、BioLamina カタログ番号LN521−03)でコーティングした96マルチウェルプレートにおいて培養培地(EpiCM、Sciencell カタログ番号4101)中に播種した。それらをこの培地で1週間にわたり増殖させ、以下の培地を2週間にわたり使用して分化させた:N1サプリメント(Sigma カタログ番号N−6530)、グルタミン−ペニシリン−ストレプトマイシン(Sigma カタログ番号G−1146)、非必須アミノ酸(NEAA、Sigma カタログ番号M−7145)、タウリン(Sigma カタログ番号T−0625)、ヒドロコルチゾン(Sigma カタログ番号H−03966)、トリヨードサイロニン(Sigma カタログ番号T−5516)、及びウシ血清アルブミン(BSA、Sigma カタログ番号A−9647)を添加したMEアルファ培地(Sigma カタログ番号M−4526)。細胞を加湿したインキュベーター中で37℃、5%CO2で培養した。
ノックダウンを、網膜中のmRNAならびに網膜中及び硝子体中のタンパク質レベルの両方で、位置53113〜53384の間のヒトHTRA1プレmRNAにおいて「ホットスポット」を標的とする3つのHTRA1 LNAオリゴヌクレオチドについて観察した(図5を参照のこと)。
全ての実験をカニクイザル(Macaca fascicularis)において実施した。
ブプレノルフィン鎮痛剤を、試験化合物注射の前及び2日後に投与した。動物を、ケタミン及びキシラジンの筋肉内注射を用いて麻酔した。試験項目及び陰性対照(PBS)を、テトラカイン麻酔薬の局所適用後の試験1日目に、麻酔動物の両眼において硝子体内投与(投与当たり50μL)した。
生存期の終了時(22日目)に、全てのサルを、ペントバルビタールの腹腔内及び過剰投与注射により安楽死させた。
安楽死の直後に、眼組織を氷上で素早く慎重に切開し、出荷まで−80℃で保存した。網膜サンプルを700μLのMagNa Pure 96 LC RNA Isolation Tissue緩衝液中で溶解し、Precellys Evolutionホモジナイザーを使用して2mlチューブ2×1.5分当たり1つのステンレススチールビーズを加え、それに続く室温での30分間のインキュベートによりホモジナイズした。サンプルを13000rpm、5分間遠心分離した。半分を生物分析用に取っておき、残りの半分については、RNA抽出を直接続けた。
眼球を取り出し、10%中性緩衝ホルマリン中で24時間にわたり固定し、トリミングしてパラフィン中に包埋した。
サンプル調製、網膜
硝子体液(300μl)を、プロテアーゼ阻害剤(Complete EDTA-free、Roche)を伴う5×RIPA緩衝液(最終濃度:50mM Tris−HCl、pH 7.4、150mM NaCl、0.25%デオキシコール酸、1%NP−40、1mM EDTA)を用いて希釈し、Precellys 24(5500、15秒、2サイクル)を使用して均質化した。ホモジネートを遠心分離し(13,000rpm、3分)、上清のタンパク質含量を測定した(Pierce BCAタンパク質アッセイ)。
96ウェルプレート(Nunc MaxiSorp)を抗HTRA1マウスモノクローナル抗体(R&D MAB2916、500μg/ウェル、PBS 50μl)でコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。プレートをPBS(200μl)で2回洗浄し、20℃で30分間にわたり、PBS中の3%(w/v)BSAでブロックし、続いてPBSで2回洗浄した。サンプル(75μg網膜、50μlPBS中の100μg硝子体)を無作為化し、プレートに加え、続いてシェーカー(150rpm)で4℃で一晩インキュベートした。プレートを次に、PBSで2回、水で1回洗浄した。50mM TEAB中の10mM DTT(30μl)を次に各々のウェルに加え、続いて20℃で1時間にわたりインキュベートしてシステインスルフヒドリルを還元した。50mM TEAB(5μl)中の150mMヨードアセトアミドを次に各々のウェルに加え、システインスルフヒドリルをブロックするために、暗所で20℃で30分間にわたりインキュベートした。10μlの消化液を各々のウェルに加え(最終濃度:1.24ng/μlトリプシン、20fmol/μlBSAペプチド、26fmol/μl同位体標識HTRA1ペプチド、1fmol/μliRTペプチド、Biognosys)、続いて20℃で一晩インキュベートした。
0.5 Precellysesチューブ(CK14_0.5ml、Bertin Technologies)中の切開した網膜サンプルを、プロテアーゼ阻害剤(Complete EDTA-free Proteases-Inhibitor Mini、11 836 170 001、Roche)を伴うRIPA溶解緩衝液(20−188、Milipore)中で溶解及びホモジナイズした。
実験方法:上の実施例を参照のこと。実施例9の硝子体液サンプルに従って、房水サンプルを採取し、サンプルを調製した。カニクイザルの房水サンプル(AH)を分析方法論:キャピラリー電気泳動システム(Peggy Sue(商標)、Proteinsimple)のサイズベースアッセイで分析した。
一次ウサギ抗ヒトHTRA抗体SF1は、Sascha Fauser教授により提供され、1:300希釈で使用した。全ての他の試薬はProteinsimpleからであった。
Claims (23)
- アンチセンスオリゴヌクレオチドがHTRA1核酸を標的とし、配列番号113に少なくとも90%、例えば100%相補性である10〜22ヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域を含む、長さ10〜30ヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
- 連続ヌクレオチド領域が、配列番号231、186、192、及び205からなる群より選択される配列に完全に相補的である、請求項1記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
- 連続ヌクレオチド領域が、配列番号124〜230からなる群より選択される配列に完全に相補的な少なくとも12の連続ヌクレオチドを含む、請求項1又は2記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
- 連続ヌクレオチド領域が、配列番号113に完全に相補的である少なくとも12の連続ヌクレオチドを含む、請求項1〜3のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
- 連続ヌクレオチド領域が、配列番号113に完全に相補的である少なくとも14の連続ヌクレオチドを含む、請求項1〜4のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
- オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域が、配列番号67、73、及び86のいずれか1つより選択される配列、又はその少なくとも12の連続ヌクレオチドからなる、又はそれを含む、請求項1〜5のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
- オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域が、1つ又は複数の2’糖修飾ヌクレオシド、例えば2’−O−アルキル−RNA、2’−O−メチル−RNA、2’−アルコキシ−RNA、2’−O−メトキシエチル−RNA、2’−アミノ−DNA、2’−フルオロ−DNA、アラビノ核酸(ANA)、2’−フルオロ−ANA及びLNAヌクレオシドからなる群より独立して選択される1つ又は複数の2’糖修飾ヌクレオシドを含む、請求項1〜6のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
- オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域が、少なくとも1つの修飾ヌクレオシド間連結、例えば1つ又は複数のホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含む、又は、例えば連続ヌクレオチド領域内の全てのヌクレオシド間連結がホスホロチオエートヌクレオシド間連結である、請求項1〜7のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
- オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列が、ギャップマー、例えば式5’−FG−F’−3’のギャップマーなどである、又はそれを含み、式中、領域F及びF’が独立して1〜7の糖修飾ヌクレオシドを含み、Gが、RNaseHを動員することが可能である領域6〜16のヌクレオシドであり、それにおいて領域Gに隣接する領域F及びF’のヌクレオシドが糖修飾ヌクレオシドである、請求項1〜8のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
- 領域F及びF’の少なくとも一方又は両方が少なくとも1つのLNAヌクレオシドを各々含む、請求項9記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
- 連続ヌクレオチド領域を以下より選択される群より選択する、請求項1〜10のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド:
それにおいて大文字はLNAヌクレオチドであり、小文字はDNAヌクレオシドであり、シトシン残基は場合により5−メチルシトシンである。 - LNAヌクレオシドがベータ−D−オキシLNAヌクレオシドである、請求項10又は11記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
- 連続ヌクレオチド領域のヌクレオチド間のヌクレオシド間連結が全てホスホロチオエートヌクレオチド間連結である、請求項1〜12のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
- 以下からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを含む、又はそれからなるオリゴヌクレオチド:
それにおいて大文字はベータ−D−オキシLNAヌクレオシドを表し、小文字はDNAヌクレオシドであり、下付き文字sはホスホロチオエートヌクレオシド間連結を表し、mCは5メチルシトシンベータ−D−オキシLNAヌクレオシドを表し、mcは5メチルシトシンDNAヌクレオシドを表す。 - 請求項1〜14記載のオリゴヌクレオチドのいずれか1つの医薬的に許容可能な塩。
- 請求項1〜15のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド、及び該オリゴヌクレオチドに共有結合的に付着した少なくとも1つのコンジュゲート部分を含む、コンジュゲート。
- 請求項1〜15記載のオリゴヌクレオチド又は請求項16記載のコンジュゲートならびに医薬的に許容可能な希釈剤、溶媒、担体、塩及び/又はアジュバントを含む、医薬的組成物。
- 請求項1〜15のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド又は請求項16記載のコンジュゲート又は請求項17記載の医薬的組成物を有効量で細胞に投与することを含む、HTRA1を発現している標的細胞においてHTRA1発現を調節するためのインビボ又はインビトロの方法。
- 請求項1〜15のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド又は請求項16記載のコンジュゲート又は請求項17記載の医薬的組成物の治療的又は予防的有効量を、疾患に罹患している又は感受性である被験者に投与することを含む、疾患を処置又は防止するための方法。
- 医薬における使用のための、請求項1〜15のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド又は請求項16記載のコンジュゲート又は請求項17記載の医薬的組成物。
- 黄斑変性症(例えば湿潤型AMD、乾燥型AMD、地図状萎縮、中間dAMD、糖尿病性網膜症など)、パーキンソン病、アルツハイマー病、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、関節炎、例えば変形性関節症など、及び家族性虚血性脳小血管疾患からなる群より選択される疾患の処置又は防止における使用のための請求項1〜15のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド又は請求項16記載のコンジュゲート又は請求項17記載の医薬的組成物。
- 黄斑変性症(例えば湿潤型AMD、乾燥型AMD、地図状萎縮、中間dAMD、糖尿病性網膜症など)、パーキンソン病、アルツハイマー病、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、関節炎、例えば変形性関節症など、及び家族性虚血性脳小血管疾患からなる群より選択される疾患の処置又は防止のための医薬の調製のための、請求項1〜15記載のオリゴヌクレオチド又は請求項16記載のコンジュゲート又は請求項17記載の医薬的組成物の使用。
- 方法又は使用が黄斑変性症の処置のためである、請求項19〜22のいずれか一項記載の使用又は方法。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2022092326A1 (ja) * | 2020-10-30 | 2022-05-05 | 英彰 原 | 眼組織線維化の阻害に使用するためのgdf15調節物質 |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CR20180606A (es) | 2016-07-01 | 2019-02-14 | Hoffmann La Roche | Oligonucleótidos antisentido para modular la expresión de htra1 |
JP7317029B2 (ja) | 2018-02-12 | 2023-07-28 | アイオーニス ファーマシューティカルズ, インコーポレーテッド | 修飾化合物及びその使用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009006460A1 (en) * | 2007-07-02 | 2009-01-08 | Alcon Research, Ltd. | Rnai-mediated inhibition of htra1 for treatment of macular degeneration |
WO2012038668A1 (fr) * | 2010-09-23 | 2012-03-29 | Universite De Caen Basse Normandie | Procédé d'obtention in vitro ou ex vivo de chondrocytes articulaires différenciés et leurs utilisations |
Family Cites Families (27)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP3756313B2 (ja) | 1997-03-07 | 2006-03-15 | 武 今西 | 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体 |
IL135000A0 (en) | 1997-09-12 | 2001-05-20 | Exiqon As | Bi- and tri-cyclic nucleoside, nucleotide and oligonucleotide analogues |
AU5290499A (en) * | 1998-08-03 | 2000-02-28 | Novartis Ag | Human htra serine protease |
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DK3222722T3 (da) | 2002-11-18 | 2019-06-17 | Roche Innovation Ct Copenhagen As | Antisense-design |
EP1888083B1 (en) * | 2005-05-24 | 2011-12-28 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and their uses directed to lmw-ptpase |
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WO2008067040A2 (en) * | 2006-10-06 | 2008-06-05 | University Of Utah Research Foundation | Method of detecting ocular diseases and pathologic conditions and treatment of same |
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Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009006460A1 (en) * | 2007-07-02 | 2009-01-08 | Alcon Research, Ltd. | Rnai-mediated inhibition of htra1 for treatment of macular degeneration |
WO2012038668A1 (fr) * | 2010-09-23 | 2012-03-29 | Universite De Caen Basse Normandie | Procédé d'obtention in vitro ou ex vivo de chondrocytes articulaires différenciés et leurs utilisations |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
KURRECK J. ET AL., NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 30, no. 9, JPN6022010168, 2002, pages 1911 - 1918, ISSN: 0004727366 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2022092326A1 (ja) * | 2020-10-30 | 2022-05-05 | 英彰 原 | 眼組織線維化の阻害に使用するためのgdf15調節物質 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CR20190543A (es) | 2020-02-10 |
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