JPWO2019009299A1 - α−シヌクレイン発現抑制するENAアンチセンスオリゴヌクレオチド - Google Patents

α−シヌクレイン発現抑制するENAアンチセンスオリゴヌクレオチド Download PDF

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Abstract

本発明は、α−シヌクレインの発現抑制について、より高い効果およびより長い持続性を有する核酸医薬を提供することを目的とする。本発明に係るオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩は、2’−O,4’−C−エチレンヌクレオシドを少なくとも1つ含み、α−シヌクレイン遺伝子と結合することができ、該α−シヌクレイン遺伝子の発現を抑制する活性を有し、そして該α−シヌクレイン遺伝子と相補的であり、そして、特定のヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを5’末端とし、配列番号1の少なくとも一部と相補的で、13〜15ヌクレオチド長である。

Description

本発明は、α−シヌクレイン発現抑制作用を示す新規オリゴヌクレオチドと、当該新規オリゴヌクレオチドを含むα−シヌクレイン発現抑制剤、より詳細には、新規な人工核酸を用いたα−シヌクレイン発現抑制剤に関する。
パーキンソン病(PD)は、孤発性パーキンソン病および遺伝性パーキンソン病に分類され得る。
孤発性パーキンソン病は、進行性の神経変性疾患で有病率は1000人に1人であり、進行すると認知症を合併する。このような認知症はレビー小体型認知症であり、その治療は対症療法のみである。これは、脳内のα−シヌクレインの凝集・蓄積が原因とされる。
遺伝性パーキンソン病は、パーキンソン病のうち5〜10%であり、病因遺伝子PARK1〜PARK20のうちPARK4遺伝子の関与が考えられている。PARK4遺伝子が関与する遺伝性パーキンソン病は常染色体優性遺伝を示し、そのような患者は日本には数十人存在する。PARK4遺伝子が関与する遺伝性パーキンソン病では正常α−シヌクレイン遺伝子が過剰となり、パーキンソン症状に認知症を合併することとなる。
α−シヌクレインは、140アミノ酸残基からなるタンパク質であり、特有の天然構造を持たないアミロイドタンパク質である。α−シヌクレインは、シナプス小胞蓄積・放出に関連する。α−シヌクレインノックアウト(KO)マウスは、病理学的にも異常なしであり、神経毒のMPTP(1−メチル−4−フェニル−1,2,3,6−テトラヒドロピリジン)に対する神経保護作用を示し得る。
α−シヌクレインは、パーキンソン病、レビー小体型認知症(DLB)などの疾患におけるレビー小体の主成分である。PD剖検脳解析ブラークのステージ分類のため、剖検脳のα−シヌクレイン染色を行い、病気の進展とα−シヌクレイン病変とを対比したところ、神経細胞内のα−シヌクレイン凝集が病変の主体であることが判明している。また、α−シヌクレイントランスジェニック(Tg)マウスにα−シヌクレインフィブリルを投与したところ、このフィブリルを核に病変が伸展し、細胞外にも異常α−シヌクレインがみられるようになった(プリオン様細胞外伝播)。
パーキンソン病の病態は次のとおりである。神経細胞内で異常α−シヌクレインが凝集することにより、中脳の黒質神経細胞が変性し、ドパミンの産生が低下し、そして運動機能障害または認知機能障害を引き起こす。従来の対症的治療法では、神経変性は徐々に進行し、ドパミン産生低下に対して、ドパミン補充のためL−ドパ製剤の投与またはドパミン分泌促進のためドパミンアゴニストの投与が行われていた。
神経細胞内の異常α−シヌクレインの凝集を標的にして、α−シヌクレインノックダウンのための核酸医薬を用いる試みがなされている。
過剰α−シヌクレインを抑制するための核酸医薬に関して、アデノ随伴ウイルス(AAV)リボザイムのラットでの使用(非特許文献1)、レンチウイルス−shRNAのラットでの使用(非特許文献2)、AAV−shRNAのラットでの使用(非特許文献3および4)、ネイキッドsiRNAのマウスでの使用(非特許文献5)、エキソソームsiRNAのマウスでの使用(非特許文献6)、siRNA(2−O−Me)のサルでの使用(非特許文献7)が報告されている。しかし、非特許文献1〜4ではウイルスを使用しており、非特許文献5および6のsiRNAの効果は早期に消失し、そして非特許文献7のsiRNAの効果は充分でないという問題点がある。
また、α−シヌクレイン遺伝子の発現抑制のために、人工核酸の使用が報告されている(特許文献1)。特許文献1では、2’−O−メトキシエチル(MOE)で修飾されたヌクレオシドが用いられている。また、特許文献1においては、オリゴヌクレオチドは、線条体内ボーラス注射を介して注射投与されている。
特表2014−501507号公報
Kinoh et al. BBRC, 2006,vol. 341, pp.1088−95 Sapru et al. ExpNeurol, 2006,vol. 198, pp.382−90 Gorbatyuk et al. MolTher, 2010,vol. 18, pp.1450−7 Khodr et al. Brain Res, 2011,vol. 1395, pp.94−107 Lewis et al. MolNeurodegener, 2008,vol. 3, pp.19 Cooper et al. MovDisord, 2014,vol. 29, pp.1476−85 McCormack et al. PLoS One, 2010,vol. 5, pp.e12122
本発明は、上記課題を解決するものであり、その目的とするところは、α−シヌクレインの発現抑制について、より高い効果およびより長い持続性を有する核酸医薬を提供することにある。
本発明は、
2’−O,4’−C−エチレンヌクレオシドを少なくとも1つ含むオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩であって、
該オリゴヌクレオチドが、α−シヌクレイン遺伝子と結合することができ、該α−シヌクレイン遺伝子の発現を抑制する活性を有し、そして該α−シヌクレイン遺伝子と相補的であり、そして、
配列番号1の40〜43、74〜76、215、227〜230、234、254、255、263、266〜269、273〜275、277、278、284〜286、288、289、366〜368、及び、412〜415位からなる群から選ばれるいずれか1つのヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを5’末端とし、配列番号1の少なくとも一部と相補的で、13〜16ヌクレオチド長であるオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩を提供する。
1つの実施形態では、上記オリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩は、配列番号1の40〜42、74〜76、215、227〜230、234、254、255、263、266、267、269、273〜275、277、278、284〜286、288、289、366〜368、及び、412〜415位からなる群から選ばれるいずれか1つのヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを5’末端とし、配列番号1の少なくとも一部と相補的で、13〜16ヌクレオチド長である。
1つの実施形態では、上記オリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩は、配列番号1の41、42、215、227〜230、234、274、277、278、284〜286、288、366〜368、及び、412〜414位からなる群から選ばれるいずれか1つのヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを5’末端とし、配列番号1の少なくとも一部と相補的で、13〜16ヌクレオチド長である。
1つの実施形態では、上記オリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩は、配列番号1の42、227〜230、274、277、278、284〜286、413、及び、414位からなる群から選ばれるいずれか1つのヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを5’末端とし、配列番号1の少なくとも一部と相補的で、13〜16ヌクレオチド長である。
1つの実施形態では、上記オリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩は、配列番号1の42、227、229、274、277、278、285、及び、413位からなる群から選ばれるいずれか1つのヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを5’末端とし、配列番号1の少なくとも一部と相補的で、13〜16ヌクレオチド長である。
1つの実施形態では、上記オリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩は、配列番号1の227、229、278、285、及び、413位からなる群から選ばれるいずれか1つのヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを5’末端とし、配列番号1の少なくとも一部と相補的で、13〜16ヌクレオチド長である。
1つの実施形態では、上記オリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩は、配列番号1の229、278、285、及び、413位からなる群から選ばれるいずれか1つのヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを5’末端とし、配列番号1の少なくとも一部と相補的で、15ヌクレオチド長、又は、配列番号1の227位のヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを5’末端とし、配列番号1の少なくとも一部と相補的で、13ヌクレオチド長である。
さらなる実施形態では、上記オリゴヌクレオチドが、5〜7塩基のギャップ領域、3〜5塩基の5’ウイング及び3〜5塩基の3’ウイングからなるギャップマーであり、該ギャップ領域が、該5’ウイングと該3’ウイングの間に位置づけられ、そして該5’ウイングおよび該3’ウイングが、少なくとも1つの2’−O,4’−C−エチレンヌクレオシドを含む。なお、本開示においては、2’−O,4’−C−エチレンヌクレオシドをENA(2’−O,4’−C−Ethylene−bridged Nucleic Acid)と表記する場合がある。
該5’ウイングおよび該3’ウイングには、2’−O−アルキル化ヌクレオシドで修飾されたヌクレオシド、文献(Yahara,A. et al. ChemBioChem (2012), 13, 2513-2516.)又はWO2014/109384記載のAmNA、又は、S−cEt(2’,4’−constrained ethyl)が含まれていてもよい。
2’−O−アルキル化ヌクレオシドとしては、D−リボフラノースの2’−O−アルキル化(例えば、2’−O−メチル化、2’−O−アミノエチル化、2’−O−プロピル化、2’−O−アリル化、2’−O−メトキシエチル化、2’−O−ブチル化、2’−O−ペンチル化、2’−O−プロパルギル化など)ヌクレオシドを用いてもよい。
本発明はまた、上記オリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩を有効成分として含有する、α−シヌクレイン発現抑制剤を提供する。
さらに、本発明は、上記オリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩を有効成分として含有する医薬組成物を提供する。
1つの実施形態では、上記医薬組成物は、α−シヌクレイン過剰症の治療または予防に用いられる。
1つの実施形態では、上記医薬組成物は、パーキンソン病またはレビー小体型認知症の治療または予防に用いられる。
さらに、本発明は、α−シヌクレイン発現抑制方法であって、上記オリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩を個体に投与する工程を含む、方法を提供する。
さらに、本発明は、α−シヌクレイン過剰症の治療または予防方法であって、上記オリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩を個体に投与する工程を含む、方法を提供する。
なおさらに、本発明は、パーキンソン病またはレビー小体型認知症の治療または予防方法であって、上記オリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩を個体に投与する工程を含む、方法を提供する。
本発明によれば、α−シヌクレインの発現抑制効果および持続性を有するオリゴヌクレオチドが提供される。本発明によれば、臨床応用時に通常用いられる投与経路である髄腔内投与においても、オリゴヌクレオチドのα−シヌクレイン抑制効果が発揮され得る。
試験例1におけるHEK293A細胞に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)のトランスフェクション後のα−シヌクレインmRNA量を示すグラフである。 試験例2におけるHEK293A細胞に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)のトランスフェクション後のα−シヌクレインmRNA量を示すグラフである。 試験例3におけるHEK293A細胞に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)のトランスフェクション後のα−シヌクレインmRNA量を示すグラフである。 試験例4におけるHEK293A細胞に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)のトランスフェクション後のα−シヌクレインmRNA量を示すグラフである。 試験例5におけるHEK293A細胞に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)のトランスフェクション後のα−シヌクレインmRNA量を示すグラフである。
まず、本明細書中で用いられる用語を定義する。
本明細書において、用語「ヌクレオシド」は、プリンまたはピリミジン塩基と糖とが結合した「ヌクレオシド」をいう。天然型のヌクレオシドを「天然ヌクレオシド」ともいう。修飾された非天然型のヌクレオシドを「修飾ヌクレオシド」ともいい、特に糖部分が修飾されたヌクレオチドを「糖修飾ヌクレオシド」という。「ヌクレオチド」とは、ヌクレオシドの糖にリン酸基が結合した化合物を意味する。
本明細書において、用語「オリゴヌクレオチド」とは、同一または異なる「ヌクレオシド」がリン酸ジエステル結合または他の結合で2〜50個結合した「ヌクレオチド」のポリマーであり、天然型のものと非天然型のものを含む。非天然型の「オリゴヌクレオチド」としては、好適には、糖部分が修飾された糖誘導体;リン酸ジエステル結合の非架橋酸素原子が硫黄原子で置き換えられたホスホロチオエート誘導体;リン酸ジエステル結合がエステル化されたエステル体;プリン塩基上のアミノ基がアミド化されたアミド体が挙げられ、さらに好適には、糖部分が修飾された糖誘導体;リン酸ジエステル結合の非架橋酸素原子が硫黄原子で置き換えられたホスホロチオエート誘導体、または、「糖部分が修飾された糖誘導体」及び「リン酸ジエステル結合の非架橋酸素原子が硫黄原子で置き換えたホスホロチオエート誘導体」が共存した誘導体が挙げられる。
本明細書において、用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」(AON、または、ASOと表記される)とは、標的遺伝子のmRNA、mRNA前駆体またはncRNA(ノンコーディングRNA)に対して相補的なオリゴヌクレオチドをいい、1本鎖のDNA、RNAおよび/またはそれらの類似体から構成される。当該アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的とするmRNA、mRNA前駆体またはncRNAと二本鎖を形成することによりmRNA、mRNA前駆体またはncRNAの働きを抑制する。「アンチセンスオリゴヌクレオチド」には、標的となるmRNA、mRNA前駆体またはncRNAと完全に相補的であるものが含まれる。また、mRNA、mRNA前駆体またはncRNAと結合し、かつこれらの働きを抑制することができる限り、1もしくは数個のミスマッチが存在するものやゆらぎ塩基対を形成する塩基を含むものも含まれる。DNAまたはRNAの類似体とは、DNAまたはRNAに似た構造を持つ分子を意味する。例えば、ペプチド核酸(PNA)等が挙げられる。ncRNA(ノンコーディングRNA)とは、タンパク質へ翻訳されずに機能するRNAの総称である。例えば、リボソームRNA、転移RNA、miRNA等が挙げられる。
本明細書において、用語「その薬理学上許容される塩」とは、本発明のオリゴヌクレオチドの塩であって、本発明のオリゴヌクレオチドの生理学的におよび製薬上許容される塩、すなわち、当該オリゴヌクレオチドの所望される生物学的な活性を保持し、そこで望まれない毒物学的効果を与えない塩のことをいう。そのような塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩;カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩;アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩などの金属塩;アンモニウム塩のような無機塩;t−オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、N−メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、N,N’−ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、N−ベンジル−フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩のようなアミン塩;フッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩のようなハロゲン化水素酸塩;硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩;メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような低級アルカンスルホン酸塩;ベンゼンスルホン酸塩、p−トルエンスルホン酸塩のようなアリールスルホン酸塩;酢酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩等の有機酸塩;および、グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩が挙げられる。
以下、本発明について詳述する。
本発明のオリゴヌクレオチドは、天然に存在するDNAまたはRNAが化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドを含む。このような修飾は、オリゴヌクレオチドの活性に影響を与える。例えば、標的遺伝子に対する親和性を高め、核酸分解酵素(ヌクレアーゼ)に対する耐性を高め、オリゴヌクレオチドの薬物動態または組織分布に影響を与える。その標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性を高めることにより、より短いオリゴヌクレオチドの使用を可能にし得る。
本発明は、下述するようなオリゴヌクレオチドおよびその薬理学上許容される塩を包含する。
本発明のオリゴヌクレオチドは、2’−O,4’−C−エチレンヌクレオシドを任意の位置に少なくとも1つ含む。この2’−O,4’−C−エチレンヌクレオシドは、その糖環の2位と4位との間でエチレン架橋を有する。
オリゴヌクレオチドの塩基部分は、以下の構造式:
Figure 2019009299
でそれぞれ表される基(すなわち、チミニル基、シトシニル基、アデニニル基、グアニニル基、5−メチルシトシニル基、およびウラシリル基)、ならびに2−オキソ−4−ヒドロキシ−5−メチル−1,2−ジヒドロピリミジン−1−イル基、2−オキソ−4−アミノ−1,2−ジヒドロピリミジン−1−イル基、6−アミノプリン−9−イル基、2−アミノ−6−ヒドロキシプリン−9−イル基、4−アミノ−5−メチル−2−オキソ−1,2−ジヒドロピリミジン−1−イル基、および2−オキソ−4−ヒドロキシ−1,2−ジヒドロピリミジン−1−イル基が好適であり、特に、チミニル基、シトシニル基、アデニニル基、グアニニル基、5−メチルシトシニル基、およびウラシリル基が好適である。また、オリゴヌクレオチドの合成の際には、水酸基およびアミノ基が保護基により保護されていることが好ましい。核酸塩基のうち、ウラシル(U)とチミン(T)は、互換性がある。ウラシル(U)とチミン(T)のどちらも、相補鎖のアデニン(A)との塩基対形成に使うことができる。
上記のような2’−O,4’−C−エチレンヌクレオシドを少なくとも1つ含むオリゴヌクレオチドは、例えば、2’−O,4’−C−エチレンヌクレオシド ホスホロアミダイトを用いて、例えば、国際公開第2000/47599号に記載されるような方法を用いて合成することができる。
本発明のオリゴヌクレオチドは、α−シヌクレイン遺伝子と結合することができる。本明細書において、本発明のオリゴヌクレオチドの「α−シヌクレイン遺伝子との結合」は、本発明のオリゴヌクレオチドのα−シヌクレイン遺伝子への直接結合、本発明のオリゴヌクレオチドのα−シヌクレイン遺伝子のmRNAへの結合、および本発明のオリゴヌクレオチドのα−シヌクレイン遺伝子のmRNA前駆体への結合を包含する。
「結合することができる」とは、1本鎖オリゴヌクレオチドが、標的遺伝子と核酸塩基の相補性により2本鎖核酸の構造を形成できることをいう。結合の熱安定性の指標は、2本鎖核酸の融解温度(Tm)に限定されない。2本鎖核酸の融解温度(Tm)は、例えば、下記のように決定され得る:緩衝液(8.1mM Na2HPO4,2.68mM KCl,1.47mM KH2PO4,pH7.2)中で、オリゴヌクレオチドと標的RNAとを等モル混合し、95℃にて5分間加熱後、室温まで徐冷してアニーリングさせ、2本鎖核酸を形成させる。2本鎖核酸の温度を20℃から95℃まで0.5℃/分の速度で加温していき、260nmにおける吸光度(A)の温度(T)による変化を測定し、この測定結果よりdA/dT vs Tのグラフを描き、dA/dTの値が最も大きくなる温度、つまりAのTによる変化が最も大きくなる温度を、2本鎖核酸のTmとする。融解温度(Tm)は、例えば、40℃〜90℃であり、好ましくは50℃〜75℃である。
本発明のオリゴヌクレオチドは、α−シヌクレイン遺伝子と相補的であるが、完全な相補性を有する必要はなく、ミスマッチを有していてもよい。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドとα−シヌクレイン遺伝子は、2本鎖を形成する領域の塩基配列が完全に相補性を有する必要はなく、2本鎖核酸を形成し得、発現抑制作用を有する限り、1もしくは数個のミスマッチを有し得る。1もしくは数個のミスマッチとは、オリゴヌクレオチドの長さに依存し得るが、1〜4個、好ましくは1〜3個、さらに好ましくは1または2個のミスマッチを意味している。本発明のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、2本鎖を形成する領域の塩基配列に対して完全に(100%)相補性を有するものである。
本発明のオリゴヌクレオチドの標的遺伝子であるα−シヌクレイン(SNCA)遺伝子としては、例えば、ヒトSNCA(「hSNCA」)遺伝子、マウスSNCA(「mSNCA」)遺伝子などが挙げられるが、これらに限定されない。
α−シヌクレイン(「SNCA」)は、140アミノ酸残基からなるタンパク質であり、特有の天然構造を持たないアミロイドタンパク質である。α−シヌクレインは、シナプス小胞蓄積・放出に関連する。ヒトSNCA(hSNCA)のコーディング領域(GenBankアクセッション番号:NM_000345)のDNA配列(塩基配列)を配列表の配列番号1に記載する。本発明における「SNCA」は、配列番号1の配列に限定されるものではなく、SNCAタンパク質の機能が保持される限り、アミノ酸やDNAの変異数や変異部位に制限はないものとする。
本発明のオリゴヌクレオチドは、α−シヌクレイン遺伝子の発現を抑制する活性を有する。SNCA発現抑制活性(ノックダウン活性)は、公知の方法により測定することが可能である。例えば、後述するHEK293A細胞に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)のトランスフェクションまたはα−シヌクレイントランスジェニックマウス(SNCA Tgマウス)の脳室内投与の方法により測定することができる。
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば13〜16ヌクレオチド長、好ましくは13〜15ヌクレオチド長、より好ましくは14または15ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドが挙げられる。オリゴヌクレオチドが上記のような長さであることにより、SNCA標的遺伝子への結合、SNCA標的遺伝子のmRNAもしくはmRNA前駆体への結合およびSNCA発現抑制(ノックダウン)をより効果的に行い得る。
1つの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、以下の表1−1、及び表1−2記載の塩基配列からなり、表1−1、及び表1−2記載のα−シヌクレイン遺伝子の標的領域と結合することができる。但し、配列中、少なくとも1つのヌクレオシドは、2’−O,4’−C−エチレンヌクレオシドである。表1−1および表1−2では、2’−O,4’−C−エチレンヌクレオシドの位置は示しておらず、塩基配列のみを示している。上記標的領域は、ヒトSNCA遺伝子において、特に、α−シヌクレイン遺伝子の発現を抑制する活性またはノックダウン活性に関連する領域である。
Figure 2019009299
Figure 2019009299
本発明において「標的領域」は、標的となるSNCA遺伝子上の領域(例えば、示された塩基配列(例えば、配列番号1の28位〜40位の塩基配列)からなる標的領域)、および、該遺伝子上の領域に対応するSNCA遺伝子のmRNAもしくはmRNA前駆体上の領域を含む。また、「標的領域と結合」とは、標的領域全体と必ずしも2本以上の鎖(好ましくは2本鎖)を形成する必要はなく、その領域の一部である領域と2本以上の鎖(好ましくは2本鎖)を形成するものであってもよい。本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、この標的領域の少なくとも一部と相補的であり、好ましくは完全な相補性を有する。ここで「一部」とは、当該標的領域のうち13〜15ヌクレオチド長の領域である。好ましくは、この標的領域の3’末端が、配列番号1の塩基配列の40位であるような「一部」の領域が、標的領域として選択され得る。「標的領域の少なくとも一部と相補的である」とは、SNCA遺伝子上の標的領域(例えば、配列番号1の28位〜40位の塩基配列からなる)の少なくとも一部の領域の塩基と相補的であること、および、当該少なくとも一部の領域に対応するmRNAもしくはmRNA前駆体上の領域の塩基と相補的であることを含む。
本発明のオリゴヌクレオチドの好ましい塩基配列としては、表1−1および表1−2に記載された標的領域に対応するmRNA上の領域に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド)に示される塩基配列の一部からなる塩基配列が挙げられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列は、当該アンチセンスオリゴヌクレオチドを構成する塩基数(オリゴヌクレオチドのヌクレオチド長に対応する)分、3’から5’の方向(3’→5’)に、配列番号1に示される標的領域の塩基に対して相補的な塩基を並べるように設計され得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列を5’から3’の方向(5’→3’)で表す場合、配列番号1に示される標的領域の塩基配列に対して逆相補(reverse complementary)配列となり得る。本発明のオリゴヌクレオチドは、これらの配列において、SNCA発現抑制活性を有する限り、1もしくは数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入されたものであってもよい。好ましくは、1〜3個、より好ましくは1〜2個、さらに好ましくは1個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入されたものであってもよい。
上記糖修飾以外の当該分野で公知のヌクレオチドの修飾は、いずれも本発明のオリゴヌクレオチドに利用可能である。ヌクレオチドの修飾としては、リン酸修飾、核酸塩基修飾が知られている。このような核酸修飾は、当該分野で公知の方法に基づいて行うことができる。
リン酸修飾としては、例えば、天然の核酸が有するリン酸ジエステル結合、S−オリゴ(ホスホロチオエート)、D−オリゴ(ホスホジエステル)、M−オリゴ(メチルフォスフォネイト)、ボラノホスフェート等が挙げられる。これらの修飾は公知の方法に従って、オリゴヌクレオチドに取り込まれる。S−オリゴ(ホスホロチオエート)は、ヌクレオシド間のリン酸ジエステル結合のリン酸基部の非架橋酸素原子を硫黄原子で置換された骨格である。ホスホロチオエートの修飾は、オリゴヌクレオチド中の1つもしくは複数、或いは、すべてのリン酸ジエステル結合を変換してもよい。
核酸塩基修飾としては、例えば、5−メチルシトシン、5−ヒドロキシメチルシトシン、5−プロピニルシトシン等が挙げられる。
本発明のオリゴヌクレオチドは、ギャップマーであることが好ましい。ギャップマーとは、中心領域となる「ギャップ」と該ギャップの両側の領域、2つのウイング、すなわち、5’側の「5’ウイング」および3’側の「3’ウイング」を含むオリゴヌクレオチドを意味する。
本発明におけるギャップマーのギャップ領域は5〜7ヌクレオチド長、好ましくは6〜7ヌクレオチド長、より好ましくは7ヌクレオチド長であり得る。ギャップは、DNAからなる天然ヌクレオシドから構成されている。
本発明におけるギャップマーのウイング領域は3〜5ヌクレオチド長、好ましくは3〜4ヌクレオチド長、さらに好ましくは3ヌクレオチド長であり得る。本発明のオリゴヌクレオチドは、「5’ウイング」および/または「3’ウイング」に、2’−O,4’−C−エチレンヌクレオシドを少なくとも1つ含む。好ましくは、「5’ウイング」に、2’−O,4’−C−エチレンヌクレオシドを少なくとも1つ、好ましくは1〜4、より好ましくは2〜4、さらに好ましくは2〜3、特に好ましくは2含む。好ましくは、「3’ウイング」に、2’−O,4’−C−エチレンヌクレオシドを少なくとも1つ、好ましくは1〜4、より好ましくは2〜4、さらに好ましくは2〜3、特に好ましくは2含む。
1つの実施形態では、5〜7ヌクレオチドのギャップ領域、3〜5ヌクレオチドの5’ウイングおよび3〜5ヌクレオチドの3’ウイングからなり、ギャップ領域が5’ウイングと3’ウイングの間に位置づけられ、5’ウイングおよび3’ウイングは、少なくとも1つの2’−O,4’−C−エチレンヌクレオシドを含み得る。さらに、リン酸修飾、塩基修飾などを含んでいてもよい。一方のウイング内の修飾の種類、数、位置は、他方のウイングにおける修飾の種類、数、位置と同じであってもまたは異なっていてもよい。
1つの好ましい実施形態では、5〜7ヌクレオチドのギャップ領域、3ヌクレオチドの5’ウイングおよび3ヌクレオチドの3’ウイングからなり、5’ウイングおよび3’ウイングは、各々少なくとも1つ2’−O,4’−C−エチレンヌクレオシドを含み得る。
より好ましい実施形態では、6〜7ヌクレオチドのギャップ領域、3ヌクレオチドの5’ウイングおよび3ヌクレオチドの3’ウイングからなり、5’ウイングの3つのうち2つが2’−O,4’−C−エチレンヌクレオシドであり、3’ウイングの3つのうち2つが2’−O,4’−C−エチレンヌクレオシドを含み得る。
このようなギャップマーとしては、例えば、3−7−3、4−6−3、3−6−4、4−5−4、4−7−3、3−7−4、4−6−4、5−6−3、3−6−5、3−7−5、5−7−3、4−7−4、4−6−5、5−6−4、5−5−5、5−6−5などが挙げられる。ここで、「A−B−C」または「A−B−C−D」の表記において、「A」は5’ウイングの塩基数を示し、「B」はギャップの塩基数を示し、「C」は3’ウイングを形成する塩基のうち糖修飾ヌクレオシドの数を示し、「D」は3’ウイングを形成する塩基のうち天然ヌクレオシドの数を示す。例えば、3−7−3の表記の場合、ギャップの7ヌクレオチドが天然ヌクレオシド(DNA)であり、5’ウイング(5’末端から3ヌクレオチド)、3’ウイング(3’末端から3塩ヌクレオチド)からなり、5’ウイングおよび3’ウイングは、各々少なくとも1つ2’−O,4’−C−エチレンヌクレオシドを含み得る。
該5’ウイングおよび該3’ウイングには、2’−O−アルキル化ヌクレオシドで修飾されたヌクレオシド、文献(Yahara, A. et al., ChemBioChem, (2012), 13, 2513-2516)又は国際公開第2014/109384号記載のAmNA、又は、S−cEt(2’,4’−constrained ethyl)が含まれていてもよい。数は、特に限定されず、目的に応じて適宜設計され得る。2つ以上の2’−O−アルキル化ヌクレオシド、AmNA、S−cEtは、互いに、同じものであってもよく、異なるものであってもよい。
2’−O−アルキル化ヌクレオシドとしては、D−リボフラノースの2’−O−アルキル化(例えば、2’−O−メチル化、2’−O−アミノエチル化、2’−O−プロピル化、2’−O−アリル化、2’−O−メトキシエチル化、2’−O−ブチル化、2’−O−ペンチル化、2’−O−プロパルギル化など)を用いてもよい。
本発明のオリゴヌクレオチドとしては、例えば、実施例23、28、29、32、170のオリゴヌクレオチド等が挙げられる。これらの配列において、SNCA発現抑制活性を有する限り、1もしくは数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入されたものであってもよい。好ましくは、1〜3個、より好ましくは1〜2個、さらに好ましくは1個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入されたものであってもよい。
本発明のオリゴヌクレオチドは、上述したような糖修飾ヌクレオシドおよび天然ヌクレオシドを用いて、常法によって合成することができ、例えば、市販の核酸自動合成装置(例えば、BioAutomation製、Applied Biosystems製、株式会社ジーンデザイン製など)によって容易に合成することができる。合成法はホスホロアミダイトを用いた固相合成法、ハイドロジェンホスホネートを用いた固相合成法等がある。例えば、Tetrahedron Letters,1981, vol. 22. pp.1859-1862、国際公開第2011/052436号等に開示されている。
本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドを含有するα−シヌクレイン発現抑制剤も包含する。本開示において「α−シヌクレイン発現抑制剤」は、α−シヌクレイン遺伝子に結合しα−シヌクレイン遺伝子の発現を抑制することにより、α−シヌクレインの生合成を阻害する。さらに本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドを含有する医薬組成物も包含する。本発明のα−シヌクレイン発現抑制剤または医薬組成物の投与方法および製剤は、当該分野で公知の投与方法および製剤であれば、いずれも利用可能である。
本発明の医薬組成物は、局所的あるいは全身的な治療、または治療すべき領域に応じて様々な方法により投与することができる。投与方法としては、例えば、局所的(点眼、膣内、直腸内、鼻腔内、経皮を含む)、経口的、または、非経口的であってもよい。非経口的投与としては、静脈内注射もしくは点滴、皮下、腹腔内もしくは筋肉内注入、吸引もしくは吸入による肺投与、髄腔内投与、脳室内投与等が挙げられる。
本発明の医薬組成物を局所投与する場合、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴下剤、坐剤、噴霧剤、液剤、散剤等の製剤を用いることができる。
経口投与用組成物としては、散剤、顆粒剤、水もしくは非水性媒体に溶解させた懸濁液または溶液、カプセル、粉末剤、錠剤等が挙げられる。
非経口、髄腔内、または、脳室内投与用組成物としては、バッファー、希釈剤およびその他の適当な添加剤を含む無菌水溶液等が挙げられる。
本発明の医薬組成物は、本発明のオリゴヌクレオチドの有効量にその剤型に適した賦形剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤等の各種医薬用添加剤を必要に応じて混合して得ることができる。注射剤の場合には適当な担体と共に滅菌処理を行なって製剤とすればよい。
賦形剤としては、乳糖、白糖、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウムまたは結晶セルロース等が挙げられる。結合剤としては、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンまたはポリビニルピロリドン等が挙げられる。崩壊剤としてはカルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末またはラウリル硫酸ナトリウム等が挙げられる。滑沢剤としてはタルク、ステアリン酸マグネシウムまたはマクロゴール等が挙げられる。坐剤の基剤としてはカカオ脂、マクロゴールまたはメチルセルロース等を用いることができる。また、液剤または乳濁性、懸濁性の注射剤として調製する場合には通常使用されている溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、安定化剤、保存剤、等張剤等を適宜添加してもよい。経口投与の場合には嬌味剤、芳香剤等を加えてもよい。
本発明の医薬組成物は、α−シヌクレイン(SNCA)遺伝子に関連した疾患の治療または予防に用いられ得る。本発明の医薬組成物は、例えば、SNCA発現抑制活性(ノックダウン活性)に基づく治療または予防に用いられ得る。本発明の医薬組成物が用いられ得る疾患としては、例えば、α−シヌクレイン過剰症が挙げられる。本発明の医薬組成物によれば、そのSNCA発現抑制活性(ノックダウン活性)により、神経変性の進行の予防および認知症の発症の予防(特にDLBなど)が期待できる。本発明の医薬組成物は、例えば、パーキンソン病またはレビー小体型認知症の治療または予防に用いられ得る。
本発明は、α−シヌクレイン発現抑制方法を提供する。さらに本発明は、α−シヌクレイン過剰症の治療または予防方法;ならびにパーキンソン病またはレビー小体型認知症の治療または予防方法も提供する。これらの方法は、本発明のオリゴヌクレオチド個体に投与する工程を含む。「個体」とは、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくは、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ラットおよびマウスであり、さらに好ましくはヒトである。これらの方法においては、本発明のオリゴヌクレオチドの有効量が投与される限り、投与方法および剤型は問わない。投与有効量は、投与される個体に依存するが、個体の性別、年齢、体重、症状等、ならびに投与の方法、経路、頻度などに応じて任意に定めることができる。例えば、投与量として0.1〜10mg/kgが挙げられる。投与方法等は上述したとおりである。
本願は、2017年7月5日に出願された日本国特許出願第2017−132290号に基づく優先権の利益を主張するものである。2017年7月5日に出願された日本国特許出願第2017−132290号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。
以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
実施例1: HO−Ce2s−Cm1s−Te2s−5meCs−5meCs−Ts−Ts−Gs−Gs−5meCs−Ce2s−Tm1s−Te2t−H(40−13A)(配列番号2)の合成
核酸自動合成機(「MerMade 192X」BioAutomation製)を用い、ホスホロアミダイト法(Nucleic Acids Research,12,4539(1984))を用いて標記オリゴヌクレオチドを合成した。但し、縮合には、アクチベーター溶液−3(0.25mol/L 5−ベンジルチオ−1H−テトラゾール・アセトニトリル溶液,和光純薬工業社製,product No.013−20011)に、1−メチルイミダゾール(和光純薬工業社製,product No.134−12801)を0.4%加えた溶液を用い、反応時間は約10分間とした。ホスホロチオエート結合を形成するためのチオ化試薬として、0.2Mになるようにフェニルアセチルジスルフィド(CARBOSYNTH製,product No.FP07495)を、脱水アセトニトリル(関東化学製,product No.01837−05):脱水ピリジン(関東化学製,product No.11339−05)=1:1(v/v)混合液を用いて溶解して用いた。その他使用した試薬としては、CAP A for AKTA(1−メチルイミダゾール・アセトニトリル溶液,Sigma−Aldrich製,product No.L040050)、Cap B1 for AKTA(無水酢酸・アセトニトリル溶液,Sigma−Aldrich製,product No.L050050)、Cap B2 for AKTA(ピリジン・アセトニトリル溶液,Sigma−Aldrich製,product No.L050150)、DCA Deblock(ジクロロ酢酸・トルエン溶液,Sigma−Aldrich製,product No.L023050)を用いた。アミダイト試薬としては、2’−O−Meヌクレオシドのホスホロアミダイト(アデノシン体product No.ANP−5751,シチジン体product No.ANP−5752,グアノシン体product No.ANP−5753,ウリジン体product No.ANP−5754)はChemGenes製のものを用いた。非天然型のホスホロアミダイトは特開2000−297097の実施例14(5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O,4’−C−エチレン−6−N−ベンゾイルアデノシン−3’−O−(2−シアノエチル N,N−ジイソプロピル)ホスホロアミダイト)、実施例27(5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O,4’−C−エチレン−2−N−イソブチリルグアノシン−3’−O−(2−シアノエチル N,N−ジイソプロピル)ホスホロアミダイト)、実施例22(5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O,4’−C−エチレン−4−N−ベンゾイル−5−メチルシチジン−3’−O−(2−シアノエチル N,N−ジイソプロピル)ホスホロアミダイト)、実施例9(5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O,4’−C−エチレン−5−メチルウリジン−3’−O−(2−シアノエチル N,N−ジイソプロピル)ホスホロアミダイト)、の化合物を用いた。固相担体として、Glen Unysupport FC 96ウェルフォーマット0.2μmol(GlenResearch製)を用い、標記の化合物を合成した。
目的配列を有する保護されたオリゴヌクレオチド類縁体を600μLの濃アンモニア水で処理することによってオリゴマーを支持体から切り出すとともに、リン原子上の保護基シアノエチル基と核酸塩基上の保護基をはずした。オリゴマーの混合溶液を、Clarity QSP DNA Loading Buffer(Phenomenex製)300μLと混合し、Clarity SPE 96 well plate(Phenomenex製)上にチャージした。Clarity QSP DNA Loading Buffer:水=1:1溶液1mL、0.1Mテトラブチルアンモニウムブロミド水溶液:アセトニトリル=8:2(v/v)溶液2mL、3%ジクロロ酢酸(DCA)水溶液3mL、水4mL、20mM Tris水溶液2mLの順に添加した後、20mM Tris水溶液:アセトニトリル=9:1溶液にて抽出される成分を集めた。溶媒留去後、目的化合物を得た。本化合物は、逆相HPLC(カラム(Phenomenex,Clarity 2.6μm Oligo−MS 100A(2.1×50mm))、A溶液:100mMヘキサフルオロイソプロパノール(HFIP)、8mMトリエチルアミン水溶液、B溶液:メタノール、B%:10%→25%(4min,linear gradient);60℃;0.5mL/min;260nm)で分析すると、2.849分に溶出された。化合物は負イオンESI質量分析により同定した(計算値:4326.51、実測値:4326.51)。
本化合物の塩基配列は、Homo sapiens synuclein,alpha(SNCA),transcript variant 1,mRNA(NCBI−GenBank accession No.NM_000345)のコーディング領域のヌクレオチド番号28−40に相補的な配列である。
なお、配列表には、天然ヌクレオシドと2’−O,4’−C−エチレンヌクレオシドとを区別することなく塩基配列を示す。
実施例2〜12
表2に示す実施例2乃至12の化合物を、実施例1と同様に合成した。
Figure 2019009299
表中の配列において大文字はDNA、小文字は2’−OMe−RNA、下線を付した大文字は2’−O,4’−C−エチレンヌクレオシドを示す。但し、DNAと2’−O,4’−C−エチレンヌクレオシドのCの塩基部位は、5−メチルシトシンである。各ヌクレオシドはホスホロチオエートで結合している。標的領域は、Homo sapiens synuclein,alpha(SNCA),transcript variant 1,mRNA(NCBI−GenBank accession No.NM_000345)のコーディング領域のヌクレオチド番号を示す。分子量は、負イオンESI質量分析による実測値を示す。
実施例13: HO−Ge2s−Cm1s−Te2s−Gm1s−Ts−5meCs−As−5meCs−As−5meCs−Ce2s−Cm1s−Ge2t−H(227−13B)(配列番号4)の合成
実施例1と同様の条件で合成および精製を行い、目的化合物を得た。本化合物は、逆相HPLC(カラム(Phenomenex,Clarity 2.6μm Oligo−MS 100A(2.1×50mm))、A溶液:100mMヘキサフルオロイソプロパノール(HFIP)、8mMトリエチルアミン水溶液、B溶液:メタノール、B%:10%→25%(4min,lineargradient);60℃;0.5mL/min;260nm)で分析すると、2.326分に溶出された。化合物は負イオンESI質量分析により同定した(計算値:4399.55、実測値:4399.54)。
本化合物の塩基配列は、Homo sapiens synuclein,alpha(SNCA),transcript variant 1,mRNA(NCBI−GenBank accession No.NM_000345)のコーディング領域のヌクレオチド番号215−227に相補的な配列である。
実施例14〜20
表3に示す実施例14乃至20の化合物を、実施例13と同様に合成した。
Figure 2019009299
表3中の配列において大文字はDNA、小文字は2’−OMe−RNA、下線を付した大文字は2’−O,4’−C−エチレンヌクレオシドを示す。但し、DNAと2’−O,4’−C−エチレンヌクレオシドのCの塩基部位は、5−メチルシトシンである。各ヌクレオシドはホスホロチオエートで結合している。標的領域は、Homo sapiens synuclein,alpha(SNCA),transcript variant 1,mRNA(NCBI−GenBank accession No.NM_000345)のコーディング領域のヌクレオチド番号を示す。分子量は、負イオンESI質量分析による実測値を示す。
実施例21: HO−Te2s−Cm1s−Ce2s−Cm1s−Ts−5meCs−5meCs−Ts−Ts−Gs−Gs−Cm1s−Ce2s−Um1s−Te2t−H(42−15A)(配列番号34)の合成
実施例1と同様の条件で合成および精製を行い、目的化合物を得た。本化合物は、逆相HPLC(カラム(Phenomenex, Clarity 2.6μm Oligo−MS 100A(2.1×50mm))、A溶液:100mMヘキサフルオロイソプロパノール(HFIP)、8mMトリエチルアミン水溶液、B溶液:メタノール、B%:10%→25%(4min,linear gradient);60℃;0.5mL/min;260nm)で分析すると、3.01分に溶出された。化合物は負イオンESI質量分析により同定した(計算値:4997.56、実測値:4997.55)。
本化合物の塩基配列は、Homo sapiens synuclein,alpha(SNCA),transcript variant 1,mRNA(NCBI−GenBank accession No.NM_000345)のコーディング領域のヌクレオチド番号28−42に相補的な配列である。
実施例22〜34
表4に示す実施例22乃至34の化合物を、実施例21と同様に合成した。
Figure 2019009299
表4中の配列において大文字はDNA、小文字は2’−OMe−RNA、下線を付した大文字は2’−O,4’−C−エチレンヌクレオシドを示す。但し、DNAと2’−O,4’−C−エチレンヌクレオシドのCの塩基部位は、5−メチルシトシンである。各ヌクレオシドはホスホロチオエートで結合している。標的領域は、Homo sapiens synuclein,alpha(SNCA),transcript variant 1,mRNA(NCBI−GenBank accession No.NM_000345)のコーディング領域のヌクレオチド番号を示す。分子量は、負イオンESI質量分析による実測値を示す。
実施例35: HO−Ae2s−Um1s−Ge2s−Cm1s−Ts−5meCs−5meCs−5meCs−Ts−Gs−5meCs−Um1s−Ce2s−Cm1s−Ce2t−H(263−15A)(配列番号39)の合成
実施例1と同様の条件で合成および精製を行い、表5に示す目的化合物を得た。本化合物は、逆相HPLC(カラム(Phenomenex,Clarity 2.6μm Oligo−MS 100A(2.1×50mm))、A溶液:100mMヘキサフルオロイソプロパノール(HFIP)、8mMトリエチルアミン水溶液、B溶液:メタノール、B%:10%→25%(4min,linear gradient);60℃;0.5mL/min;260nm)で分析すると、2.969分に溶出された。化合物は負イオンESI質量分析により同定した(計算値:5005.59、実測値:5005.58)。
本化合物の塩基配列は、Homo sapiens synuclein,alpha(SNCA),transcript variant 1,mRNA(NCBI−GenBank accession No.NM_000345)のコーディング領域のヌクレオチド番号249−263に相補的な配列である。
実施例36,37
表5に示す実施例36及び37の化合物を、実施例35と同様に合成した。
Figure 2019009299
表5中の配列において大文字はDNA、小文字は2’−OMe−RNA、下線を付した大文字は2’−O,4’−C−エチレンヌクレオシドを示す。但し、DNAと2’−O,4’−C−エチレンヌクレオシドのCの塩基部位は、5−メチルシトシンである。各ヌクレオシドはホスホロチオエートで結合している。標的領域は、Homo sapiens synuclein,alpha(SNCA),transcript variant 1,mRNA(NCBI−GenBank accession No.NM_000345)のコーディング領域のヌクレオチド番号を示す。分子量は、負イオンESI質量分析による実測値を示す。
実施例38: HO−Te2s−Cm1s−Ce2s−Cm1s−Te2s−5meCs−5meCs−Ts−Ts−Gs−Gs−Cm1s−Ce2s−Um1s−Te2t−H(42−15B)(配列番号34)の合成
実施例1と同様の条件で合成および精製を行い、表6に示す目的化合物を得た。本化合物は、逆相HPLC(カラム(Phenomenex, Clarity 2.6μm Oligo−MS 100A(2.1×50mm))、A溶液:100mMヘキサフルオロイソプロパノール(HFIP)、8mMトリエチルアミン水溶液、B溶液:メタノール、B%:10%→25%(4min,linear gradient);60℃;0.5mL/min;260nm)で分析すると、2.750分に溶出された。化合物は負イオンESI質量分析により同定した(計算値:5039.57、実測値:5039.59)。
本化合物の塩基配列は、Homo sapiens synuclein,alpha(SNCA),transcript variant 1,mRNA(NCBI−GenBank accession No.NM_000345)のコーディング領域のヌクレオチド番号28−42に相補的な配列である。
実施例39〜88
表6に示す実施例39乃至88の化合物を、実施例38と同様に合成した。
Figure 2019009299
表6中の配列において大文字はDNA、小文字は2’−OMe−RNA、下線を付した大文字は2’−O,4’−C−エチレンヌクレオシドを示す。但し、DNAと2’−O,4’−C−エチレンヌクレオシドのCの塩基部位は、5−メチルシトシンである。各ヌクレオシドはホスホロチオエートで結合している。標的領域は、Homo sapiens synuclein,alpha(SNCA),transcript variant 1,mRNA(NCBI−GenBank accession No.NM_000345)のコーディング領域のヌクレオチド番号を示す。分子量は、負イオンESI質量分析による実測値を示す。
実施例89: HO−Ce2s−Cm1s−Ce2s−Um1s−5meCs−5meCs−Ts−Ts−Gs−Gs−Cm1s−Ce2s−Um1s−Te2t−H(41−14A)(配列番号14)の合成
実施例1と同様の条件で合成および精製を行い、表7に示す目的化合物を得た。本化合物は、逆相HPLC(カラム(Phenomenex, Clarity 2.6μm Oligo−MS 100A(2.1×50mm))、A溶液:100mMヘキサフルオロイソプロパノール(HFIP)、8mMトリエチルアミン水溶液、B溶液:メタノール、B%:10%→25%(4min,linear gradient);60℃;0.5mL/min;260nm)で分析すると、3.101分に溶出された。化合物は負イオンESI質量分析により同定した(計算値:4677.54、実測値:4677.54)。
本化合物の塩基配列は、Homo sapiens synuclein,alpha(SNCA),transcript variant 1,mRNA(NCBI−GenBank accession No.NM_000345)のコーディング領域のヌクレオチド番号28−41に相補的な配列である。
実施例90〜108
表7に示す実施例90乃至108の化合物を、実施例89と同様に合成した。実施例89乃至108のデータについて表7に記載する。
Figure 2019009299
表7中の配列において大文字はDNA、小文字は2’−OMe−RNA、下線を付した大文字は2’−O,4’−C−エチレンヌクレオシドを示す。但し、DNAと2’−O,4’−C−エチレンヌクレオシドのCの塩基部位は、5−メチルシトシンである。各ヌクレオシドはホスホロチオエートで結合している。標的領域は、Homo sapiens synuclein,alpha(SNCA),transcript variant 1,mRNA(NCBI−GenBank accession No.NM_000345)のコーディング領域のヌクレオチド番号を示す。分子量は、負イオンESI質量分析による実測値を示す。
実施例109: HO−Ce2s−Um1s−Ce2s−Cm1s−Ce2s−Ts−5meCs−5meCs−Ts−Ts−Gs−Ge2s−Cm1s−Ce2s−Um1s−Te2t−H(43−16A)(配列番号51)の合成
実施例1と同様の条件で合成および精製を行い、表8に示す目的化合物を得た。本化合物は、逆相HPLC(カラム(Phenomenex, Clarity 2.6μm Oligo−MS 100A(2.1×50mm))、A溶液:100mMヘキサフルオロイソプロパノール(HFIP)、8mMトリエチルアミン水溶液、B溶液:メタノール、B%:10%→25%(4min,linear gradient);60℃;0.5mL/min;260nm)で分析すると、3.132分に溶出された。化合物は負イオンESI質量分析により同定した(計算値:5400.62、実測値:5400.61)。
本化合物の塩基配列は、Homo sapiens synuclein,alpha(SNCA),transcript variant 1,mRNA(NCBI−GenBank accession No.NM_000345)のコーディング領域のヌクレオチド番号28−43に相補的な配列である。
実施例110〜117
表8に示す実施例110乃至117の化合物を、実施例109と同様に合成した。
Figure 2019009299
表8中の配列において大文字はDNA、小文字は2’−OMe−RNA、下線を付した大文字は2’−O,4’−C−エチレンヌクレオシドを示す。但し、DNAと2’−O,4’−C−エチレンヌクレオシドのCの塩基部位は、5−メチルシトシンである。各ヌクレオシドはホスホロチオエートで結合している。標的領域は、Homo sapiens synuclein,alpha(SNCA),transcript variant 1,mRNA(NCBI−GenBank accession No.NM_000345)のコーディング領域のヌクレオチド番号を示す。分子量は、負イオンESI質量分析による実測値を示す。
実施例118: HO−Cm1s−Ce2s−Te2s−5meCs−5meCs−Ts−Ts−Gs−Gs−5meCs−Ce2s−Te2s−Um1t−H(40−13E)(配列番号2)の合成
実施例1と同様の条件で合成および精製を行い、表9に示す目的化合物を得た。本化合物は、逆相HPLC(カラム(Phenomenex,Clarity 2.6μm Oligo−MS 100A(2.1×50mm))、A溶液:100mMヘキサフルオロイソプロパノール(HFIP)、8mMトリエチルアミン水溶液、B溶液:メタノール、B%:10%→25%(4min,linear gradient);60℃;0.5mL/min;260nm)で分析すると、2.509分に溶出された。化合物は負イオンESI質量分析により同定した(計算値:4326.51、実測値:4326.51)。
本化合物の塩基配列は、Homo sapiens synuclein,alpha(SNCA),transcript variant 1,mRNA(NCBI−GenBank accession No.NM_000345)のコーディング領域のヌクレオチド番号28−43に相補的な配列である。
実施例119〜129
表9に示す実施例119乃至129の化合物を、実施例118と同様に合成した。
Figure 2019009299
表9中の配列において大文字はDNA、小文字は2’−OMe−RNA、下線を付した大文字は2’−O,4’−C−エチレンヌクレオシドを示す。但し、DNAと2’−O,4’−C−エチレンヌクレオシドのCの塩基部位は、5−メチルシトシンである。各ヌクレオシドはホスホロチオエートで結合している。標的領域は、Homo sapiens synuclein,alpha(SNCA),transcript variant 1,mRNA(NCBI−GenBank accession No.NM_000345)のコーディング領域のヌクレオチド番号を示す。分子量は、負イオンESI質量分析による実測値を示す。
実施例130: HO−Ce3s−Cm1s−Te3s−Cs−Cs−Ts−Ts−Gs−Gs−Cs−Ce3s−Um1s−Te2t−H(40−13F)(配列番号2)の合成
核酸自動合成機を用い、ホスホロアミダイト法(Nucleic Acids Research, 12, 4539 (1984))を用いて合成を行った。但し、AmNAのホスホロアミダイトは、国際公開第2011/052436号に記載の方法を参照して合成した。
本化合物の塩基配列は、Homo sapiens synuclein,alpha(SNCA),transcript variant 1,mRNA(NCBI−GenBank accession No.NM_000345)のコーディング領域のヌクレオチド番号28−40に相補的な配列である。
実施例131〜164
表10に示す実施例131乃至164の化合物を、実施例130と同様に合成した。
Figure 2019009299
表10中の配列において大文字はDNA、小文字は2’−OMe−RNA、下線を付した大文字は2’−O,4’−C−エチレンヌクレオシド、下線を付した小文字はAmNAを示す。但し、2’−O,4’−C−エチレンヌクレオシドとAmNAのCの塩基部位は、5−メチルシトシンである。各ヌクレオシドはホスホロチオエートで結合している。標的領域は、Homo sapiens synuclein,alpha(SNCA),transcript variant 1,mRNA(NCBI−GenBank accession No.NM_000345)のコーディング領域のヌクレオチド番号を示す。分子量は、負イオンESI質量分析による実測値を示す。
実施例165: HO−Ge2s−Cm1p−Te2p−Gs−Ts−5meCs−As−5meCs−As−5meCs−Ce2p−Cm1p−Ge2t−H(227−13A1)(配列番号4)の合成
実施例1と同様の条件で合成および精製を行い、表11に示す目的化合物を得た。但し、ホスホジエステル結合を形成するための試薬として、Oxidizer 0.05M for AKTA(ヨウ素/ピリジン/水混合溶液、Sigma−Aldrich製、product No.L560250−04)を用いた。本化合物は、逆相HPLC(カラム(Phenomenex,Clarity 2.6μm Oligo−MS 100A(2.1×50mm))、A溶液:100mMヘキサフルオロイソプロパノール(HFIP)、8mMトリエチルアミン水溶液、B溶液:メタノール、B%:10%→25%(4min,linear gradient);60℃;0.5mL/min;260nm)で分析すると、2.508分に溶出された。化合物は負イオンESI質量分析により同定した(計算値:4305.63、実測値:4305.64)。
本化合物の塩基配列は、Homo sapiens synuclein,alpha(SNCA),transcript variant 1,mRNA(NCBI−GenBank accession No.NM_000345)のコーディング領域のヌクレオチド番号215−227に相補的な配列である。
実施例166〜174
表11に示す実施例166乃至174の化合物を、実施例165と同様に合成した。
Figure 2019009299
表11中の配列において大文字はDNA、小文字は2’−OMe−RNA、下線を付した大文字は2’−O,4’−C−エチレンヌクレオシドを示す。但し、DNAと2’−O,4’−C−エチレンヌクレオシドのCの塩基部位は、5−メチルシトシンである。各ヌクレオシドの間は、oであればホスホジエステル結合を、無記載であればホスホロチオエート結合を表す。標的領域は、Homo sapiens synuclein,alpha(SNCA),transcript variant 1,mRNA(NCBI−GenBank accession No.NM_000345)のコーディング領域のヌクレオチド番号を示す。分子量は、負イオンESI質量分析による実測値を示す。
実施例175: HO−Ce2s−Cm1p−Te2p−5meCs−5meCs−Ts−Ts−Gs−Gs−5meCs−Ce2p−Um1p−Te2t−H(40−13A1)(配列番号2)の合成
実施例165と同様の条件で合成および精製を行い、表12に示す目的化合物を得た。本化合物は、逆相HPLC(カラム(Phenomenex,Clarity 2.6μm Oligo−MS 100A(2.1×50mm))、A溶液:100mMヘキサフルオロイソプロパノール(HFIP)、8mMトリエチルアミン水溶液、B溶液:メタノール、B%:10%→25%(4min,linear gradient);60℃;0.5mL/min;260nm)で分析すると、1.999分に溶出された。化合物は負イオンESI質量分析により同定した(計算値:4262.60、実測値:4262.61)。
本化合物の塩基配列は、Homo sapiens synuclein,alpha(SNCA),transcript variant 1,mRNA(NCBI−GenBank accession No.NM_000345)のコーディング領域のヌクレオチド番号28−40に相補的な配列である。
実施例176〜197
表12に示す実施例176乃至197の化合物を、実施例175と同様に合成した。
Figure 2019009299
表12中の配列において大文字はDNA、小文字は2’−OMe−RNA、下線を付した大文字は2’−O,4’−C−エチレンヌクレオシドを示す。但し、DNAと2’−O,4’−C−エチレンヌクレオシドのCの塩基部位は、5−メチルシトシンである。各ヌクレオシドの間は、oであればホスホジエステル結合を、無記載であればホスホロチオエート結合を表す。標的領域は、Homo sapiens synuclein,alpha(SNCA),transcript variant 1,mRNA(NCBI−GenBank accession No.NM_000345)のコーディング領域のヌクレオチド番号を示す。分子量は、負イオンESI質量分析による実測値を示す。
実施例198−295
実施例165と同様の条件で合成することにより、下記の表13乃至19に記載の化合物も合成することができる。
Figure 2019009299
表13中の配列において大文字はDNA、小文字は2’−OMe−RNA、下線を付した大文字は2’−O,4’−C−エチレンヌクレオシドを示す。但し、DNAと2’−O,4’−C−エチレンヌクレオシドのCの塩基部位は、5−メチルシトシンである。各ヌクレオシドの間は、oであればホスホジエステル結合を、無記載であればホスホロチオエート結合を表す。標的領域は、Homo sapiens synuclein,alpha(SNCA),transcript variant 1,mRNA(NCBI−GenBank accession No.NM_000345)のコーディング領域のヌクレオチド番号を示す。
Figure 2019009299
表14中の配列において大文字はDNA、小文字は2’−OMe−RNA、下線を付した大文字は2’−O,4’−C−エチレンヌクレオシドを示す。但し、DNAと2’−O,4’−C−エチレンヌクレオシドのCの塩基部位は、5−メチルシトシンである。各ヌクレオシドの間は、oであればホスホジエステル結合を、無記載であればホスホロチオエート結合を表す。標的領域は、Homo sapiens synuclein,alpha(SNCA),transcript variant 1,mRNA(NCBI−GenBank accession No.NM_000345)のコーディング領域のヌクレオチド番号を示す。
Figure 2019009299
表15中の配列において大文字はDNA、小文字は2’−OMe−RNA、下線を付した大文字は2’−O,4’−C−エチレンヌクレオシドを示す。但し、DNAと2’−O,4’−C−エチレンヌクレオシドのCの塩基部位は、5−メチルシトシンである。各ヌクレオシドの間は、oであればホスホジエステル結合を、無記載であればホスホロチオエート結合を表す。標的領域は、Homo sapiens synuclein,alpha(SNCA),transcript variant 1,mRNA(NCBI−GenBank accession No.NM_000345)のコーディング領域のヌクレオチド番号を示す。
Figure 2019009299
表16中の配列において大文字はDNA、小文字は2’−OMe−RNA、下線を付した大文字は2’−O,4’−C−エチレンヌクレオシドを示す。但し、DNAと2’−O,4’−C−エチレンヌクレオシドのCの塩基部位は、5−メチルシトシンである。各ヌクレオシドの間は、oであればホスホジエステル結合を、無記載であればホスホロチオエート結合を表す。標的領域は、Homo sapiens synuclein,alpha(SNCA),transcript variant 1,mRNA(NCBI−GenBank accession No.NM_000345)のコーディング領域のヌクレオチド番号を示す。
Figure 2019009299
表17中の配列において大文字はDNA、小文字は2’−OMe−RNA、下線を付した大文字は2’−O,4’−C−エチレンヌクレオシドを示す。但し、DNAと2’−O,4’−C−エチレンヌクレオシドのCの塩基部位は、5−メチルシトシンである。各ヌクレオシドの間は、oであればホスホジエステル結合を、無記載であればホスホロチオエート結合を表す。標的領域は、Homo sapiens synuclein,alpha(SNCA),transcript variant 1,mRNA(NCBI−GenBank accession No.NM_000345)のコーディング領域のヌクレオチド番号を示す。
Figure 2019009299
表18中の配列において大文字はDNA、小文字は2’−OMe−RNA、下線を付した大文字は2’−O,4’−C−エチレンヌクレオシドを示す。但し、DNAと2’−O,4’−C−エチレンヌクレオシドのCの塩基部位は、5−メチルシトシンである。各ヌクレオシドの間は、oであればホスホジエステル結合を、無記載であればホスホロチオエート結合を表す。標的領域は、Homo sapiens synuclein,alpha(SNCA),transcript variant 1,mRNA(NCBI−GenBank accession No.NM_000345)のコーディング領域のヌクレオチド番号を示す。
Figure 2019009299
表19中の配列において大文字はDNA、小文字は2’−OMe−RNA、下線を付した大文字は2’−O,4’−C−エチレンヌクレオシドを示す。但し、DNAと2’−O,4’−C−エチレンヌクレオシドのCの塩基部位は、5−メチルシトシンである。各ヌクレオシドはホスホロチオエートで結合している。標的領域は、Homo sapiens synuclein,alpha(SNCA),transcript variant 1,mRNA(NCBI−GenBank accession No.NM_000345)のコーディング領域のヌクレオチド番号を示す。
なお、本明細書において、At、Gt、5meCt、Ct、Tt、Ut、Ap、Gp、5meCp、Cp、Tp、Up、As、Gs、5meCs、Cs、Ts、Us、Am1t、Gm1t、Cm1t、5meCm1t、Um1t、Am1p、Gm1p、Cm1p、5meCm1p、Um1p、Am1s、Gm1s、Cm1s、5meCm1s、Um1s、A2t、G2t、C2t、T2t、Ae2p、Ge2p、Ce2p、Te2p、Ae2s、Ge2s、Ce2s、Te2s、A1t、G1t、C1t、T1t、Ae1p、Ge1p、Ce1p、Te1p、Ae1s、Ge1s、Ce1s、Te1s、A3t、G3t、C3t、T3t、Ae3p、Ge3p、Ce3p、Te3p、Ae3s、Ge3s、Ce3s、Te3s、Am2t、Gm2t、5meCm2t、Tm2t、Am2p、Gm2p、5meCm2p、Tm2p、Am2s、Gm2s、5meCm2s、Tm2sは、下記に示す構造を有する基である。
Figure 2019009299
Figure 2019009299
Figure 2019009299
Figure 2019009299
Figure 2019009299
Figure 2019009299
試験例1: HEK293A細胞に対するASOのトランスフェクションに基づく追加スクリーニング(1)
トランフェクションの前日に、24ウェルプレート(Thermo Fisher Scientific社製)を用いて、10%FBS(HyClone社製)を添加したDMEM培地(Thermo Fisher Scientific社製)0.5mL中に、HEK293A細胞(「型番R705−07」ATCC社製)を5×104個まいた。ASO1種類あたり1ウェル、ASOを含まないコントロールとしてdistilled deionized water(「ddW」ナカライテスク社製)用に2ウェル分作成した。
96ウェルプレート(Applied Biosystems社製)を用いて、35μL Opti−MEM(Thermo Fisher Scientific社製)に2.5μL ASO(濃度は10μM)を加えたものに、さらに37.5μL OptiMEMと0.9μL Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen社製)を加えたものを1ウェル分として作成し、室温で約20分放置し、その後細胞に添加した。ASOを含まないコントロールのウェルは次のように作成した。35μL Opti−MEMに2.5μL ddWを加えたものに、さらに37.5μL OptiMEMに0.9μL Lipofectamine RNAiMAXを加えたものを1ウェル分として2ウェル分作成し、室温で約20分静置した後、細胞に添加した。そしておよそ24時間後に各ウェルをPBS(Thermo Fisher Scientific社製)を用いて2回洗浄した。
RNA抽出及び逆転写反応は、SuperPrep Cell Lysis RT Kit for qPCR(タカラバイオ社製)を用いて、キットのプロトコルに従って実施した。これにより得られたcDNAをddWで3倍希釈し、定量的PCRにより内因性ヒトα−synulclein(hSNCA)のmRNA量を定量した。
定量的PCRはTagMan Gene Expression Assay(Applied Biosystems社製)を用いて、以下のように行った。得られたcDNAをddWで5倍希釈した(cDNA20μLおよびddW80μL)。384 PCRプレート(Applied Biosystems社製)の1ウェルあたり、2×Taqman probe master mix:ddW:5倍希釈済のcDNA:hSNCAプライマー(「Hs01103383」Applied Biosystems社製):β−Actinプライマー(「Hs99999903」Applied Biosystems社製)=5:2:2:0.5:0.5(μL)の割合で混ぜて計10μLを調製し、各cDNAに対して2well分作製した。Viia 7(Applied Biosystems社製)によりリアルタイムPCRを行い、SNCAのmRNA量をduplicateの平均値として定量した。ASOを含まないddWをトランスフェクションした2ウェルのcDNAそれぞれの2well間の平均値を平均したものをコントロールとして用いた。
上述の実験を3回行い、実験間の平均値および標準偏差(SD)を算出した。
結果を図1に示す。図1の縦軸は、mRNA量を示す。コントロール(図1中「No ASO」)におけるmRNA量を1.0として、ASOのトランスフェクション後のmRNA量を相対的に表した。配列名称が40−13A,215−13A,227−13A,229−13A,234−13A,266−13A,267−13A,273−13A,274−13A,275−13A,277−13A、及び、412−13AであるASOが優れたα−シヌクレインmRNAを抑制する効果を示した。
試験例2: HEK293A細胞に対するASOのトランスフェクションに基づく追加スクリーニング(2)
試験例1と同様に、HEK293A細胞に対するASOのトランスフェクションを行い、mRNA量を定量し、4回の実験の平均値とSDを算出した。
結果を図2に示す。図2の縦軸は、mRNA量を示す。コントロール(図2中「No ASO」)におけるmRNAを1.0として、ASOのトランスフェクション後のmRNA量を相対的に表した。配列名称が227−13B,227−13D,266−13D,273−13C,275−13B,275−13D、及び、277−13BであるASOが優れたα−シヌクレインmRNAを抑制する効果を示した。
試験例3: HEK293A細胞に対するASOのトランスフェクションに基づく追加スクリーニング(3)
試験例1と同様に、HEK293A細胞に対するASOのトランスフェクションを行い、mRNA量を定量し、3回の実験の平均値とSDを算出した。
結果を図3に示す。図3の縦軸は、mRNA量を示す。コントロール(図3中「No ASO」)におけるmRNAを1.0として、ASOのトランスフェクション後のmRNA量を相対的に表した。配列名称が234−13CであるASOが優れたα−シヌクレインmRNAを抑制する効果を示した。
試験例4: HEK293A細胞に対するASOのトランスフェクションに基づく追加スクリーニング(4)
試験例1と同様に、HEK293A細胞に対するASOのトランスフェクションを行い、mRNA量を定量し、4回の実験の平均値とSDを算出した。
結果を図4に示す。図4の縦軸は、mRNA量を示す。コントロール(図4中「No ASO」)におけるmRNAを1.0として、ASOのトランスフェクション後のmRNA量を相対的に表した。配列名称が42−15A,75−15A,229−15A,254−15A,255−15A,269−15A,274−15A,278−15A,285−15A,286−15A,367−15A,413−15A,414−15A、及び、415−15AであるASOが優れたα−シヌクレインmRNAを抑制する効果を示した。これらのASOは、特表2014−501507号公報記載のISIS387985と比較して高いmRNA抑制効果を示した。
試験例5: HEK293A細胞に対するASOのトランスフェクションに基づく追加スクリーニング(5)
試験例1と同様に、HEK293A細胞に対するASOのトランスフェクションを行い、mRNA量を定量し、4回の実験の平均値とSDを算出した。
結果を図5に示す。図5の縦軸は、mRNA量を示す。コントロール(図5中「No ASO」)におけるmRNAを1.0として、ASOのトランスフェクション後のmRNA量を相対的に表した。配列名称が227−13A1,227−13A2,227−13B1,227−13B2,227−13B3,227−13B4,227−13B5,227−13D1,227−13D2、及び、227−13D3であるASOが優れたα−シヌクレインmRNAを抑制する効果を示した。これらのASOは、特表2014−501507号公報記載のISIS387985と比較して高いmRNA抑制効果を示した。
本発明によれば、α−シヌクレインの発現抑制に有用なオリゴヌクレオチドが提供される。本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、α−シヌクレイン過剰症の治療または予防、ならびにパーキンソン病やレビー小体型認知症などの治療または予防に有用な核酸医薬としての利用が期待される。

Claims (13)

  1. 2’−O,4’−C−エチレンヌクレオシドを少なくとも1つ含むオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩であって、
    該オリゴヌクレオチドが、α−シヌクレイン遺伝子と結合することができ、該α−シヌクレイン遺伝子の発現を抑制する活性を有し、そして該α−シヌクレイン遺伝子と相補的であり、そして、
    配列番号1の40〜43、74〜76、215、227〜230、234、254、255、263、266〜269、273〜275、277、278、284〜286、288、289、366〜368、及び、412〜415位からなる群から選ばれるいずれか1つのヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを5’末端とし、配列番号1の少なくとも一部と相補的で、13〜16ヌクレオチド長であるオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩。
  2. 配列番号1の40〜42、74〜76、215、227〜230、234、254、255、263、266、267、269、273〜275、277、278、284〜286、288、289、366〜368、及び、412〜415位からなる群から選ばれるいずれか1つのヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを5’末端とし、配列番号1の少なくとも一部と相補的で、13〜16ヌクレオチド長である請求項1に記載のオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩。
  3. 配列番号1の41、42、215、227〜230、234、274、277、278、284〜286、288、366〜368、及び、412〜414位からなる群から選ばれるいずれか1つのヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを5’末端とし、配列番号1の少なくとも一部と相補的で、13〜16ヌクレオチド長である請求項1に記載のオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩。
  4. 配列番号1の42、227〜230、274、277、278、284〜286、413、及び、414位からなる群から選ばれるいずれか1つのヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを5’末端とし、配列番号1の少なくとも一部と相補的で、13〜16ヌクレオチド長である請求項1に記載のオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩。
  5. 配列番号1の42、227、229、274、277、278、285、及び、413位からなる群から選ばれるいずれか1つのヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを5’末端とし、配列番号1の少なくとも一部と相補的で、13〜16ヌクレオチド長である請求項1に記載のオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩。
  6. 配列番号1の227、229、278、285、及び、413位からなる群から選ばれるいずれか1つのヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを5’末端とし、配列番号1の少なくとも一部と相補的で、13〜16ヌクレオチド長である請求項1に記載のオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩。
  7. 配列番号1の229、278、285、及び、413位からなる群から選ばれるいずれか1つのヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを5’末端とし、配列番号1の少なくとも一部と相補的で、15ヌクレオチド長、又は、配列番号1の227位のヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを5’末端とし、配列番号1の少なくとも一部と相補的で、13ヌクレオチド長である請求項1に記載のオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩。
  8. 前記オリゴヌクレオチドが、5〜7塩基のギャップ領域、3〜5塩基の5’ウイングおよび3〜5塩基の3’ウイングからなるギャップマーであり、
    該ギャップ領域が、該5’ウイングと該3’ウイングの間に位置づけられ、そして
    該5’ウイングおよび該3’ウイングが、少なくとも1つの2’−O,4’−C−エチレンヌクレオシドを含む、
    請求項1から7のいずれか1つに記載の13〜16ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩。
  9. リン酸ジエステル結合の修飾がホスホロチオエート結合である請求項1〜8のいずれか1つに記載のオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩。
  10. 請求項1から9のいずれか1つに記載のオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩を有効成分として含有する、α−シヌクレイン発現抑制剤。
  11. 請求項1から9のいずれか1つに記載のオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩を有効成分として含有する医薬組成物。
  12. α−シヌクレイン過剰症の治療または予防に用いられる、請求項11に記載の医薬組成物。
  13. パーキンソン病またはレビー小体型認知症の治療または予防に用いられる、請求項11に記載の医薬組成物。
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