JP2021193905A - 育毛を促進するための組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】ヒトなどの動物において、より効率よく育毛を促進するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドなどを提供する。【解決手段】育毛のサイクルにおける成長期中にＦＧＦ−５の機能をノックダウンさせることが可能な新規なアンチセンスオリゴヌクレオチドを見出し、本発明を完成させた。【選択図】なし

Description

本発明は、主にヒトなどの動物の育毛を促進するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド、このアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物（剤など）に関する。

育毛のサイクルは、休止期と成長期と退行期からなる。正常のヒトの育毛のサイクルは、休止期が３〜４か月程度、成長期が２〜６年程度、退行期が２週間程度である。一方で、ＡＧＡ（男性型脱毛症）などの異常なヒトの育毛のサイクルは、休止期が３〜４か月程度、成長期が数か月〜１年程度、退行期が２週間程度であり、正常のヒトの育毛のサイクルに比べ、成長期が短い。

育毛のメカニズムは複数知られているが、そのメカニズムの１つとして、ＦＧＦ−５（線維芽細胞増殖因子５、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−５）の関わりが知られている。ｆｇｆ−５遺伝子によってコードされているＦＧＦ−５タンパク質は、毛成長を阻害し、毛周期を成長期から退行期に移行させる役割を持つことが知られている。また、ｆｇｆ−５遺伝子から、オルタナティブスプライシング（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ）によって、ＦＧＦ−５Ｓという低分子量のタンパク質が作られる。このＦＧＦ−５Ｓは成長期の後半に毛包で作られ、ＦＧＦ−５の働きをアンタゴナイズすることにより、成長期中にＦＧＦ−５が機能することを防ぐことも知られている（特許文献１、非特許文献１）。このＦＧＦ−５の働きをアンタゴナイズすることは、ＦＧＦ−５Ｓによる拮抗阻害と考えられる。

Ｓｕｚｕｋｉ，Ｓ．； Ｏｔａ，Ｙ．； Ｏｚａｗａ，Ｋ．； Ｉｍａｍｕｒａ，Ｔ． Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ． ２０００， １１４， ４５６−

特開２００２−２９６２６７

本発明が解決しようとする課題は、主にヒトなどの動物の育毛を促進するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド、このアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物（剤など）を提供することである。

本発明の発明者は、育毛のサイクルにおける成長期中にＦＧＦ−５の機能をノックダウンさせることが可能な新規なアンチセンスオリゴヌクレオチドを見出し、本発明を完成させた。

本発明は、以下の項を含む。
〔項１〕（ｉ）配列番号１〜２７で示される塩基配列のアンチセンスオリゴヌクレオチド、
（ｉｉ）（ｉ）の塩基配列と９０％以上の同一性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は
（ｉｉｉ）（ｉ）の塩基配列において、１個又は２個の塩基の欠失、付加及び／又は置換を有する塩基配列のアンチセンスオリゴヌクレオチド、からなる群より選択される少なくとも１種のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
〔項２〕〔項１〕に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、
（ｉ）配列番号２、４、５、６、７及び８で示される塩基配列のアンチセンスオリゴヌクレオチド、
（ｉｉ）（ｉ）の塩基配列と９０％以上の同一性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は
（ｉｉｉ）（ｉ）の塩基配列において、１個又は２個の塩基の欠失、付加及び／又は置換を有する塩基配列の核酸分子、からなる群より選択される少なくとも１種のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

本発明により、より効率よく育毛を促進するための核酸分子などを提供することができ、例えば新たな育毛を促進するための素材を提供できると期待される。

以下、本発明の実施形態について説明する。

（アンチセンスオリゴヌクレオチド）
本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドは、天然に存在するＤＮＡまたはＲＮＡが化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドを含む。このような修飾は、オリゴヌクレオチドの活性を変更する。例えば、標的核酸に対する親和性を高め、核酸分解酵素（ヌクレアーゼ）に対する耐性を高め、オリゴヌクレオチドの薬物動態または組織分布を変更する。その標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性を高めることにより、より短いオリゴヌクレオチドの使用を可能にし得る。

本発明は、下述するようなアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびその薬理学上許容される塩を包含する。

本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＦＧＦ−５遺伝子と結合し得る。本明細書において、本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドの「ＦＧＦ−５遺伝子との結合」は、本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドのＦＧＦ−５遺伝子への直接結合、本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドのＦＧＦ−５遺伝子のｍＲＮＡへの結合、および本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドのＦＧＦ−５遺伝子のｍＲＮＡ前駆体への結合を包含する。

ここで、「結合し得る」とは、異なる複数の１本鎖のオリゴヌクレオチドまたは核酸が、核酸塩基の相補性により２本鎖以上の鎖の核酸を形成し得ることをいう。好適には、２本鎖の核酸を形成し得ることをいう。結合の熱安定性の指標である２本鎖以上の鎖の核酸の融解温度（Ｔｍ）は特に限定されない。２本鎖核酸の融解温度（Ｔｍ）は、例えば、下記のように決定され得る。

緩衝液（８．１ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、２．６８ｍＭ ＫＣｌ、１．４７ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ７．２）中で、オリゴヌクレオチドと標的ＲＮＡとを等モル混合し、９５℃にて５分間加熱後、室温まで徐冷してアニーリングさせ、２本鎖核酸を形成させる。２本鎖核酸の温度を２０℃から９５℃まで０．５℃／分の速度で加温していき、２６０ｎｍにおける吸光度（Ａ）の温度（Ｔ）による変化を測定し、この測定結果よりｄＡ／ｄＴ ｖｓ Ｔのグラフを描き、ｄＡ／ｄＴの値が最も大きくなる温度、つまりＡのＴによる変化が最も大きくなる温度を、２本鎖核酸のＴｍとする。融解温度（Ｔｍ）は、例えば、４０℃以上であり、好ましくは５０℃以上である。

本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＦＧＦ−５遺伝子と相補的であるが、完全な相補性を有する必要はなく、ミスマッチを有していてもよい。例えば、本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドは、２本鎖を形成する領域の塩基配列が完全に相補性を有する必要はなく、２本鎖核酸を形成し得、発現抑制作用を有する限り、１もしくは数個のミスマッチを有し得る。１又は数個のミスマッチとは、オリゴヌクレオチドの長さに依存し得るが、１〜４個、好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１又は２個のミスマッチを意味している。本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは、２本鎖を形成する領域の塩基配列に対して完全に（１００％）相補性を有するものである。

本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドの標的遺伝子であるＦＧＦ−５としては、例えば、ヒトＦＧＦ−５（「ｈＦＧＦ−５」）、マウスＦＧＦ−５（「ｍＦＧＦ−５」）などが挙げられる。

ｈＦＧＦ−５のｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｍ＿３７８２５．１）のＤＮＡ配列（塩基配列）を配列表の配列番号３０に、そしてアミノ酸配列を配列番号３１に記載する。本発明における「ＦＧＦ−５」は、これらの配列に限定されるものではなく、タンパク質の機能が保持される限り（例えば配列番号３１のタンパク質の機能が保持される限り）、アミノ酸やＤＮＡ変異数や変異部位に制限はないものとする。
アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列は、当該アンチセンスオリゴヌクレオチドを構成する塩基数（オリゴヌクレオチドの塩基長に対応する）分、３’から５’の方向（３’→ ５’）に、例えば配列番号３０に示される標的領域の塩基に対して相補的な塩基を並べるように設計され得る。

本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＦＧＦ−５遺伝子の発現を抑制する活性を有する。ＦＧＦ−５発現抑制活性（ノックダウン活性）は、公知の方法により測定することが可能である。例えば、後述の実施例で記載するヒト新生児の皮膚由来の正常二倍体線維芽細胞（Ｈｓ６８、ＪＣＲＢ細胞バンクの細胞番号がＩＦＯ５０３５０）に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドのトランスフェクションの方法などにより測定することができる。

本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えばオフターゲット作用が発生しないようにする観点で、例えば１２〜２５塩基長、好ましくは１２〜２０塩基長、より好ましくは１４〜２０塩基長、よりさらに好ましくは１５〜１９塩基長、特に好ましくは１５〜１８塩基長である。より具体的には、１５塩基長、１６塩基長、１７塩基長などのアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドが上記のような長さであることにより、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＦＧＦ−５標的遺伝子、ＦＧＦ−５標的遺伝子のｍＲＮＡ又はＦＧＦ−５標的遺伝子のｍＲＮＡ前駆体へ結合され、より効果的にＦＧＦ−５発現抑制（ノックダウン）がおきる。

本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下のいずれかの核酸分子を意味する。
（ｉ）配列番号１〜２７で示される塩基配列のアンチセンスオリゴヌクレオチド、
（ｉｉ）（ｉ）の塩基配列と９０％以上の同一性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は
（ｉｉｉ）（ｉ）の塩基配列において、１個又は２個の塩基の欠失、付加及び／又は置換を有する塩基配列のアンチセンスオリゴヌクレオチド、からなる群より選択される少なくとも１種のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列表にて示される配列番号１〜２７の配列で示されるアンチセンスオリゴヌクレオチドである。配列表において、「ａ」はアデニン（アデニニル基）、「ｔ」はチミン（チミニル基）、「ｃ」はシトシン（シトシニル基）、「ｇ」はグアニン（グアニニル基）、「ｎ」はシトシン（シトシニル基）又は５−メチルシトシン（５−メチルシトシニル基）、である。下記実施例の表１で示す配列は、「ｎ」が５−メチルシトシン（５−メチルシトシニル基）である。配列表において示す配列は、５’→ ３’配列で示す。例えば、酵素耐性能の向上を図るために、本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下表１で示すように、ヌクレオシド間のホスホジエステル結合のリン酸基部の酸素原子が硫黄原子で置換されたＰＳ骨格を有する、Ｓ−オリゴ（ホスホロチオエート）にすることが好ましい。例えば、標的ｍＲＮＡとの親和性の向上を図るために、本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下表１で示すように、所定部位において糖修飾ヌクレオシド（例えば、下記式（ａ）で示されるＬＮＡ）を含むことが好ましい。
なお、配列表（配列番号２９）と以下表１に記載の「ＮＥＧ」の配列は、Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌの配列であり、アンチセンスオリゴヌクレオチドとしての機能がない（ＦＧＦ−５に結合しない）配列である。

本発明のオリゴヌクレオチドは、常法によって合成することができ、例えば、市販の核酸自動合成装置（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、株式会社ジーンデザイン製など）によって容易に合成することができる。合成法はホスホロアミダイトを用いた固相合成法、ハイドロジェンホスホネートを用いた固相合成法等がある。例えば、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２，１８５９−１８６２（１９８１）、国際公開第２０１１／０５２４３６号等に開示されている。
なお、表１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２，１８５９−１８６２（１９８１）、国際公開第２０１１／０５２４３６号等に記載される方法によって合成した。具体的には、式（ａ）で示されるＬＮＡを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドに関しては、株式会社ジーンデザインに合成委託した。

式（ａ）で示されるＬＮＡを含有するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、核酸自動合成機（ｎＳ−８ 型、株式会社ジーンデザイン製） を用いて、０．２μｍｏｌスケールで合成した。鎖長の伸長は標準的なホスホロアミダイトプロトコール（固相担体：ＣＰＧレジン、硫化はＤＤＴ（３Ｈ−１，２−Ｂｅｎｚｏｄｉ ｔｈｉｏｌｅ−３−ｏｎｅ，１，１−ｄｉｏｘｉｄｅ）等を使用）にて実施し、末端の５’位の水酸基がＤＭＴｒ（ジメトキシトリチル）基で保護され、かつ３’位が固相に担持されたオリゴヌクレオチドを得た。続いて、酸処理により、ＤＭＴｒ基を除去した後、塩基処理することにより、目的物を固相担体から切り出した。希酸にて中和後、溶媒を留去し、得られた粗生成物をゲルろ過カラムクロマト、逆相ＨＰＬＣにて精製することにより目的物を得た。

本実施例で使用したＬＮＡの架橋構造及び得られた各オリゴヌクレオチドの純度および構造をＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＢＲＵＫＥＲ ＤＡＬＴＯＮＩＣＳ社製）により確認した。

「同一性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのヌクレオチド配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全ヌクレオチド残基に対する、同一ヌクレオチド残基の割合（％）を意味する。
例えば、ヌクレオチド配列における同一性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＢＬＡＳＴ−２を用い、以下の条件（ギャップオープン＝５ペナルティ；ギャップエクステンション＝２ペナルティ；ｘ＿ドロップオフ＝５０；期待値＝１０；フィルタリング＝ＯＮ）にて２つのヌクレオチド配列をアラインすることにより、計算することができる。

本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドは、これらの配列において、ＦＧＦ−５発現抑制活性を有する限り、例えば、１又は２個の塩基が欠失、付加及び／又は置換を有するものであってもよい。

本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＦＧＦ−５発現抑制活性を有する限り、所定の修飾を行うことも可能である。ヌクレオチドの修飾としては、例えばリン酸修飾、核酸塩基修飾が挙げられる。このような修飾（核酸修飾）は、所定の公知の方法に基づいて行うことができる。リン酸修飾としては、例えば、天然の核酸が有するリン酸ジエステル結合、Ｓ−オリゴ（ホスホロチオエート）、Ｄ−オリゴ（ホスホジエステル）、Ｍ−オリゴ（メチルフォスフォネイト）、ボラノホスフェート等が挙げられる。Ｓ−オリゴ（ホスホロチオエート）は、ヌクレオシド間のホスホジエステル結合のリン酸基部の酸素原子が硫黄原子で置換されたＰＳ骨格を有する。この修飾は公知の方法に従って、オリゴヌクレオチドに取り込まれる。この修飾をオリゴヌクレオチド中に１又は複数もつアンチセンスオリゴヌクレオチドをＳ−オリゴ型（ホスホロチオエート型）という。核酸塩基修飾としては、例えば、５−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、５−プロピニルシトシン等が挙げられる。

本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップマーであることが好ましい。ギャップマーとは、中心領域となる「ギャップ」と該ギャップの両側の領域、２つのウイング、すなわち、５’側の「５’ウイング」及び３’側の「３’ウイング」を含むオリゴヌクレオチドを意味する。

本発明におけるギャップマーのギャップ領域は６〜１０塩基長、好ましくは７〜１０塩基長、より好ましくは８〜１０塩基長、さらに好ましくは８〜９塩基長、特に好ましくは９塩基長であり得る。ギャップは、天然ヌクレオシドから構成されている。

本発明におけるギャップマーのウイング領域は３〜５塩基長、好ましくは３〜４塩基長、さらに好ましくは３ 塩基長であり得る。本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドは、「５’ウイング」及び／又は「３’ウイング」に、糖修飾ヌクレオシドを少なくとも１つ含む。好ましくは、「５ ’ウイング」に、糖修飾ヌクレオシドを少なくとも１つ、好ましくは１〜５、より好ましくは２〜４、さらに好ましくは２〜３、特に好ましくは３つ含む。好ましくは、「３’ウイング」に、糖修飾ヌクレオシドを少なくとも１つ、好ましくは１〜５、より好ましくは２〜４、さらに好ましくは２〜３、特に好ましくは２つ含む。

１つの実施形態では、６〜１０塩基のギャップ領域、３〜５塩基の５’ウイング及び３〜５塩基の３’ウイングからなり、ギャップ領域が５’ウイングと３’ウイングの間に位置づけられる。さらに、リン酸修飾、塩基修飾などを含んでいてもよい。一方のウイング内の修飾の種類、数、位置は、他方のウイングにおける修飾の種類、数、位置と同じであっても又は異なっていてもよい。

１つの好ましい実施形態では、８〜１０塩基のギャップ領域、３塩基の５’ウイングおよび３塩基の３’ウイングからなり、５’ウイングおよび３’ウイングは、各々少なくとも２つの前記式（ａ）で表されるヌクレオシド構造を含むことがある。

より好ましい実施形態では、９塩基のギャップ領域、３塩基の５’ウイングおよび３塩基の３’ウイングからなり、５’ウイングの３塩基は前記式（ａ）で表されるヌクレオシドである。

このようなギャップマーとしては、例えば、３−９−２−１（表１にて例示）、３−８−２−１、３−１０−２−１、３−１０−３、５−１０−５などが挙げられる。例えば、３−９−２−１の表記の場合、ギャップの９ 塩基が天然ヌクレオシド（ＤＮＡ）であり、５’ ウイング（５’末端から３’塩基）が糖修飾ヌクレオシド（例えば、式（ａ）で示すＬＮＡを含むヌクレオチド）であり、そして３’ウイング（３’末端から３塩基）のうち中心側からの２塩基が糖修飾ヌクレオシド（例えば、式（ａ）で示すＬＮＡを含むヌクレオチド）であり、最後の１塩基（３’末端塩基）が天然ヌクレオシド（ＤＮＡ）である。配列に依存し得るが、３−９−２−１が好ましい。

（育毛促進）
本明細書等において、「育毛」は、「育毛」だけでなく、例えば「発毛」も含まれる。また、この「育毛」は、例えば、脱毛因子（ＤＫＫ−１、ＩＬ−６など）の発現を抑制することより、毛幹の形成の促進、毛幹の伸長の促進などによる育毛も含む。

（投与形態など）
本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒト等の動物に対して、局所的あるいは全身的な治療、または治療すべき領域に応じて様々な方法により投与することができる。投与方法としては、例えば、局所的（点眼、膣内、直腸内、鼻腔内、経皮を含む）投与、経口的投与、または、非経口的投与であってもよい。非経口的投与としては、静脈内注射もしくは点滴、皮下、腹腔内もしくは筋肉内注入、吸引もしくは吸入による肺投与、髄腔内投与、脳室内投与等が挙げられる。

本発明に係るアンチセンスオリゴを局所投与する場合、本発明に係るアンチセンスオリゴを含有する組成物を作製して、例えば、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴下剤、坐剤、噴霧剤、液剤、散剤等の製剤として用いることができる。
経口的投与用の組成物（本発明に係るアンチセンスオリゴを含有）としては、例えば、散剤、顆粒剤、水もしくは非水性媒体に溶解させた懸濁液または溶液、カプセル、粉末剤、錠剤等が挙げられる。非経口、髄腔内、または脳室内投与用の組成物（本発明に係るアンチセンスオリゴを含有）としては、バッファー、希釈剤およびその他の適当な添加剤を含む無菌水溶液等が挙げられる。

本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する組成物は、本発明のオリゴヌクレオチドの有効量にその剤型に適した賦形剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤等の各種医薬用添加剤を必要に応じて混合して得ることができる。注射剤の場合には、例えば、適当な担体と共に滅菌処理を行なって製剤とすることもできる。
賦形剤としては、乳糖、白糖、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウムまたは結晶セルロース等が挙げられる。結合剤としては、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンまたはポリビニルピロリドン等が挙げられる。崩壊剤としてはカルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末またはラウリル硫酸ナトリウム等が挙げられる。滑沢剤としてはタルク、ステアリン酸マグネシウムまたはマクロゴール等が挙げられる。坐剤の基剤としてはカカオ脂、マクロゴールまたはメチルセルロース等を用いることができる。また、液剤または乳濁性、懸濁性の注射剤として調製する場合には通常使用されている溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、安定化剤、保存剤、等張剤等を適宜添加してもよい。経口投与の場合には嬌味剤、芳香剤等を加えてもよい。

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、ヒト等の動物に対して投与する量（有効量）は、投与される個体に依存するが、個体の性別、年齢、体重、症状等、ならびに投与の方法、経路、頻度などに応じて任意に定めることができる。例えば、注射剤（静脈内注射など）の場合は、投与する量として、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇが挙げられる。

以下、本発明の実施例について、説明する。なお、この実施例の実験で用いられるアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列（配列番号１〜２９）は、以下表１で示すアンチセンスオリゴヌクレオチドである。

表１中の塩基配列の「Ａ又はａ」、「Ｔ又はｔ」、「Ｃ又はｃ」、「Ｇ又はｇ」及び「５」は、次の塩基を表す。「Ａ又はａ」はアデニン（アデニニル基）、「Ｔ又はｔ」はチミン（チミニル基）、「Ｃ又はｃ」はシトシン（シトシニル基）、「Ｇ又はｇ」はグアニン（グアニニル基）、「５」は５−メチルシトシン（５−メチルシトシニル基）である。表１中の塩基配列は、５’→３’配列で示し、全てＰＳ骨格を有する。表１で示す塩基配列において、小文字は天然型のデオキシリボヌクレオシド（ＤＮＡ）であり、大文字（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ）又は「５」は下記の式（ａ）で示されるＬＮＡである。「Ａ」は以下式（ａ）のＢａｓｅがアデニン（アデニニル基）であるもの、「Ｔ」は以下式（ａ）のＢａｓｅがチミン（チミニル基）であるもの、「Ｃ」は以下式（ａ）のＢａｓｅがシトシン（シトシニル基）であるもの、「Ｇ」は以下式（ａ）のＢａｓｅがグアニン（グアニニル基）であるもの、「５」は以下式（ａ）のＢａｓｅが５−メチルシトシン（５−メチルシトシニル基）であるもの、である。

表１に記載の配列のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２，１８５９−１８６２（１９８１）、国際公開第２０１１／０５２４３６号等に記載される方法によって合成した。具体的には、式（ａ）で示されるＬＮＡを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドに関しては、株式会社ジーンデザインに合成委託した。

（実験１；Ｈｓ６８細胞を用いてのアンチセンスオリゴヌクレオチドのスクリーニング）
ＦＧＦ−５のノックダウン活性がより高いアンチセンスオリゴヌクレオチドを探索するために、ヒト新生児の皮膚由来の正常二倍体線維芽細胞（Ｈｓ６８細胞、ＪＣＲＢ細胞バンクの細胞番号がＩＦＯ５０３５０）を用いたスクリーニングを行った。スクリーニングの手順を以下記載する。

アンチセンスヌクレオチドの投与の前日に、９６ウェルプレート（コーニング社製）にて、１０％ＦＢＳ（抗生物質なし）を添加したＤＭＥＭ培地（ｈｉｇｈ−ｇｌｕｃｏｓｅ、ナカライテスク社製）１００μＬ中（１ウェル）に、１．０×１０^４個のＨｓ６８細胞（ＪＣＲＢ細胞バンク、細胞番号ＩＦＯ５０３５０）を播種し、３７℃、５％ＣＯ_２下で２４時間培養した。

細胞のトランスフェクションはＣＥＭ法で行った。具体的には、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭに９００ ｍＭの塩化カルシウムを１００倍希釈になるように添加した後、アンチセンスオリゴヌクレオチド（表１の配列番号１から２９に示す配列のアンチセンスオリゴヌクレオチド）を、最終濃度６．２５ｎＭ、２５ｎＭ、又は１００ｎＭとなるように添加して３７℃、５％ＣＯ_２下で更に２４時間培養した。

トランスフェクションした細胞から、Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ ＆ ＲＴ Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ Ｓｕｐｅｒ Ｐｒｅｐ^ＴＭ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ ＆ ＲＴ Ｋｉｔ ｆｏｒ ｑＰＣＲ）を用いてＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに逆転写した。

得られたｃＤＮＡについて、ＡＢＩ ＰｏｗｅｒＵｐ^ＴＭＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ及び以下のプライマー（ＧＡＰＤＨ用プライマー：５０ｎＭ、ＦＧＦ−５用プライマー：１００ｎＭ）を用いてリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を実施した。ＰＣＲは、サーマルサイクラー（ＡＢＩ ＳｔｅｐＯｎｅ Ｐｌｕｓ^ＴＭ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ）を用い、９５℃で２０秒間の後、９５℃で１秒間及び６０℃で３０秒間の４５サイクルの条件で行った。

ＧＡＰＤＨフォワードプライマー：ＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＴＣＧＴ（配列番号３２）
ＧＡＰＤＨリバースプライマー：ＧＡＣＡＡＧＣＴＴＣＣＣＧＴＴＣＴＣＡＧ（配列番号３３）

ＦＧＦ−５フォワードプライマー：ＡＣＧＡＧＧＡＧＴＴＴＴＣＡＧＣＡＡＣＡ（配列番号３４）
ＦＧＦ−５リバースプライマー：ＧＣＴＣＣＣＴＧＡＡＣＴＴＧＣＡＧＴＣＡ（配列番号３５）

ＦＧＦ−５ ｍＲＮＡ及びＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ（比較対照）の発現量の測定値から、ＦＧＦ−５ ｍＲＮＡの相対発現量を算出した。結果を表２に示す。以下表２において、「１００ｎＭ投与」は所定のアンチセンスオリゴヌクレオチドを最終濃度１００ｎＭとなるように添加した群、「２５ｎＭ投与」は所定のアンチセンスオリゴヌクレオチドを最終濃度２５ｎＭとなるように添加した群、「６．２５ｎＭ投与」は所定のアンチセンスオリゴヌクレオチドを最終濃度６．２５ｎＭとなるように添加した群、「コントロール」は滅菌水を添加した群、を示す。

表２では、コントロール群のｍＲＮＡ量を１（１．００）としたときの相対値を記載している。配列番号２８の群は、コントロール群に比べＲＮＡ量が高いことから、表１の配列番号２８に係る配列はＦＧＦ−５のノックダウン活性がない配列と考えられる。表１の配列番号２８以外の群（表１の配列番号１から２７の群）では、少なくともアンチセンスオリゴヌクレオチドを１００ｎＭ投与した際には、コントロールに比べ、ｍＲＮＡ量が低いことから、表１の配列番号１から２７に係る配列はＦＧＦ−５のノックダウン活性がある配列と考えられる。特に、表１の配列番号２、４、５、６、７及び８の群では、アンチセンスオリゴヌクレオチドを６．２５ｎＭ投与した際でも、コントロールに比べ、ｍＲＮＡ量が低いことから、表１の配列番号２、４、５、６、７及び８に係る配列はＦＧＦ−５のノックダウン活性が高い配列と考えられる。

（実験２：表１の配列番号２、４、５、６、７及び８の群での、Ｈｓ６８細胞を用いてのアンチセンスオリゴヌクレオチドのスクリーニング）
実験１において、アンチセンスオリゴヌクレオチドを６．２５ｎＭ投与した際でも、コントロールに比べ、ｍＲＮＡ量が低いことが示された群（表１の配列番号２、４、５、６、７及び８の群）において、オリゴヌクレオチドの投与量を３種類（２５ｎＭ、６．２５ｎＭ、１．５６ｎＭ）設定して、再度実験１と同様の実験を行った。オリゴヌクレオチドの投与量以外は、実験１と同様の手順でスクリーニングを行った。このスクリーニング結果を表３に示す。以下表３において、「２５ｎＭ投与」は所定のアンチセンスオリゴヌクレオチドを最終濃度２５ｎＭとなるように添加した群、「６．２５ｎＭ投与」は所定のアンチセンスオリゴヌクレオチドを最終濃度６．２５ｎＭとなるように添加した群、「１．５６ｎＭ投与」は所定のアンチセンスオリゴヌクレオチドを最終濃度１．５６ｎＭとなるように添加した群、を示す。

表３では、コントロール群のｍＲＮＡ量を１としたときの相対値を記載している。表１配列番号２、４、５、６、７及び８の群では、アンチセンスオリゴヌクレオチドを１．５６ｎＭ投与した際でも、コントロールに比べ、ｍＲＮＡ量が低いことから、配列番号２、４、５、６、７及び８に係る配列はＦＧＦ−５のノックダウン活性が高い配列と考えられる。

以上、本発明の実施の形態（実施例も含め）について、図面を参照して説明してきたが、本発明の具体的構成は、これに限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において、設計変更等があっても、本発明に含まれるものである。

本発明により、より効率よく育毛を促進するための組成物を提供することができ、例えば新たな育毛を促進するための素材を提供できると期待される。

Claims (2)

1. （ｉ）配列番号１〜２７で示される塩基配列のアンチセンスオリゴヌクレオチド、
   （ｉｉ）（ｉ）の塩基配列と９０％以上の同一性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は
   （ｉｉｉ）（ｉ）の塩基配列において、１個又は２個の塩基の欠失、付加及び／又は置換を有する塩基配列のアンチセンスオリゴヌクレオチド、からなる群より選択される少なくとも１種のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
2. 請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、
   （ｉ）配列番号２、４、５、６、７及び８で示される塩基配列のアンチセンスオリゴヌクレオチド、
   （ｉｉ）（ｉ）の塩基配列と９０％以上の同一性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は
   （ｉｉｉ）（ｉ）の塩基配列において、１個又は２個の塩基の欠失、付加及び／又は置換を有する塩基配列の核酸分子、からなる群より選択される少なくとも１種のアンチセンスオリゴヌクレオチド。