BR112019025290A2 - Oligonucleotídeos anti-sentido para modulação da expressão de htra1 - Google Patents

Oligonucleotídeos anti-sentido para modulação da expressão de htra1 Download PDF

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Rubén Alvarez Sánchez
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Roberto Iacone
Kammler Susanne
Peter Hagedorn
Ottosen Søren
Susanne Kammler
Traustason Sindri
Søren OTTOSEN
Rye Hudlebusch Heidi
Sindri Traustason
PEDERSEN Lykke
Heidi Rye Hudlebusch
Berrera Marco
Lykke Pedersen
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Abstract

Refere-se a presente invenção a oligonucleotídeos (oligômeros) anti-sentido que são complementares a HTRA1, que conduzem à modulação da expressão de HTRA1. A expressão da modulação de HTRA1 é benéfica para uma gama de distúrbios medicinais, tais como degeneração macular, por exemplo, degeneração macular relacionada à idade.

Description

“OLIGONUCLEOTÍDEOS ANTI-SENTIDO PARA MODULAÇÃO DA EXPRESSÃO DE HTRA1”
CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção refere-se a oligonucleotídeos anti-sentido (oligômeros) que são complementares ao HTRA1, levando à modulação da expressão de HTRA1. A modulação da expressão de HTRA1 é benéfica para uma série de distúrbios médicos, tais como degeneração macular, por exemplo, degeneração macular relacionada à idade.
ANTECEDENTES
[002] A família de requisitos de alta temperatura A (HTRA) humana de proteases de serina são proteases PDZ expressas ubiquitosamente que estão envolvidas na manutenção da homeostase proteica em compartimentos extracelulares combinando as funções duplas de uma protease e uma acompanhante. As proteases HTRA estão implicadas na organização da matriz extracelular, proliferação celular e envelhecimento. A modulação da atividade da HTRA está relacionada a enfermidades graves, incluindo a distrofia muscular de Duchenne (Bakay et al. 2002, Neuromuscul. Disord. 12: 125-141), artrite, tal como osteoartrite (Grau et al. 2006, JBC 281: 6124-6129 ), câncer, enfermidade cerebral isquêmica familiar de pequenos vasos e degeneração macular relacionada à idade, bem como doença de Parkinson e doença de Alzheimer. O HTRA1 humano contém um domínio de ligação ao fator de crescimento semelhante à insulina (IGF). Já se propôs regular a disponibilidade de IGF e o crescimento celular (Zumbrunn e Trueb, 1996, FEES Letters 398: 189-192) e exibir propriedades supressoras de tumores. A expressão de HTRA1 é regulada negativamente no melanoma metastático e, por essa razão, pode indicar o grau de progressão do melanoma. A super expressão de HTRA1 em uma linha celular de melanoma metastático reduziu a proliferação e invasão in vitro e reduziu o crescimento de tumores em um modelo de camundongo de xenoenxerto (Baldi et al., 2002, Oncogene 21: 6684- 6688). A expressão de HTRA1 também é regulada para baixo no câncer de ovário. Nas linhas de células de câncer de ovário, a superexpressão do HTRA1 induz a morte celular, enquanto a expressão anti-sentido do HTRA1 promoveu um crescimento independente da ancoragem (Chien et al., 2004, Oncogene 23: 1636-1644).
[003] Além do seu efeito na via IGF, o HTRA1 também inibe a sinalização pela família TGFβ de fatores de crescimento (Oka et al., 2004, Development 131: 1041-1053). O HTRA1 pode clivar a proteína precursora de amilóide (APP) e os inibidores de HTRA1 causam o acúmulo de peptídeo Aβ nas células cultivadas. Deste modo, o HTRA1 também está implicado na doença de Alzheimer (Grau et al.,2005, Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 102:6021-6026).
[004] Além disso, a regulação positiva do HTRA1 foi observada e parece estar associada à distrofia muscular de Duchenne (Bakay et al. 2002, Neuromuscul. Disord. 12: 125-141) e osteoartrite (Grau et al. 2006, JBC 281: 6124-6129) e AMD (Fritsche, et al. Nat Gen 2013 45(4):433-9).
[005] Um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) na região promotora do HTRA1 (rs11200638) está associado a um aumento de 10 vezes o risco de desenvolver degeneração macular relacionada à idade (AMD). Além disso, os SNPs HTRA1 estão em desequilíbrio de ligação com o SNP ARMS2 (rs10490924) associado ao aumento do risco de desenvolver degeneração macular relacionada à idade (DMRI). O alelo de risco está associado a um aumento de 2-3 vezes no mRNA de HTRA1 e na expressão de proteínas, e o HTRA1 está presente nas glândulas em pacientes com AMD (Dewan et al., 2006, Science 314: 989-992; Yang et al., 2006, Science 314: 992-993). A super expressão do HtrA1 induz fenótipo do tipo AMD em camundongos. O camundongo transgênico hHTRA (Veierkottn, PlosOne 2011) revela degradação da lâmina elástica da membrana de Bruch, determina anormalidades vasculares coróides (Jones, PNAS 2011) e aumenta as lesões de vasculopatia polipoidal coroidal (PCV) (Kumar, IOVS 2014). Além disso, foi relatado que os danos à membrana de Bruch em camundongos hHTRA1 Tg, que determinam a exposição à fumaça do cigarro, aumentam 3 vezes a CNV (Nakayama, IOVS 2014).
[006] A degeneração macular relacionada à idade (DMRI) é a principal causa de perda irreversível da visão em pessoas com mais de 65 anos. Com o início da DMRI, ocorre uma perda gradual das células fotorreceptoras sensíveis à luz na parte posterior do olho, o epitélio pigmentar subjacente células que os sustentam metabolicamente e a visão central nítida que eles proporcionam. A idade é o principal fator de risco para o aparecimento da AMD: a probabilidade de desenvolver a AMD triplica após os 55 anos. Fumar, cor da íris clara, sexo (as mulheres têm maior risco), obesidade e exposição repetida à radiação UV também aumentam o risco de DMRI.
AMD. A progressão da AMD pode ser definida em três etapas: 1) AMD inicial, 2) AMD intermediária e 3) AMD avançada. Existem duas formas de AMD avançada: AMD seca (também chamada atrofia geográfica, GA) e AMD úmida (também conhecida como AMD exsudativa). A AMD seca é caracterizada pela perda de fotorreceptores e células epiteliais do pigmento da retina, levando à perda visual. A DMRI úmida está associada à neovascularização coroidal patológica (também conhecida como sub-retiniana). O vazamento de vasos sanguíneos anormais que se formam nesse processo danifica a mácula e prejudica a visão, levando à cegueira. Em alguns casos, os pacientes podem apresentar patologias associadas aos dois tipos de DMRI avançada. As estratégias de tratamento para a DMRI úmida requerem injeções freqüentes no olho e concentram-se principalmente em retardar a progressão da enfermidade. Atualmente, nenhum tratamento está disponível para AMD seca. Existe, portanto, uma necessidade médica não atendida no sentido de se proporcionarem medicamentos eficazes para tratar condições degenerativas maculares, tais como a DMRI úmida e seca. O documento WO 2008/013893 reivindica uma composição para o tratamento de um paciente que sofre de degeneração macular relacionada à idade, que compreende moléculas de ácido nucleico que compreende uma sequência anti-sentido que hibrida com o gene HTRA1 ou mRNA: Não se encontra exposta qualquer molécula anti-sentido.
[007] O documento WO2009/006460 proporciona siRNAs direcionados ao HTRA1 e seu uso no tratamento da AMD.
OBJETIVO DA INVENÇÃO
[008] A presente invenção proporciona oligonucleotídeos anti-sentido (antisense) que modulam HTRA1 in vivo ou in vitro. A invenção identificou motivos de sequência alvo críptica presentes no mRNA de HTRA1 humano (incluindo pré-mRNA) que podem ser direcionados por oligonucleotídeos anti-sentido para dar inibição efetiva de HTRA1. A invenção também proporciona sequências e compostos anti-sentido de oligonucleotídeo anti-sentido capazes de inibir o HTRA1 e seu uso no tratamento de enfermidades ou distúrbios em que é indicado o HTRA1.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[009] A presente invenção refere-se a oligonucleotídeos direcionados a um ácido nucleico de HTRA1 de mamífero, isto é, são capazes de inibir a expressão de HTRA1 e de tratar ou de prevenir enfermidades relacionadas ao funcionamento do HTRA1. Os oligonucleotídeos direcionados ao HTRA1 são oligonucleotídeos anti-sentido, ou seja, são complementares ao seu alvo de ácido nucleico HTRA1.
[0010] O oligonucleotídeo da invenção pode estar na forma de um sal farmaceuticamente aceitável, tal como um sal de sódio ou um sal de potássio.
[0011] Por essa razão, a invenção proporciona oligonucleotídeos anti-sentido que compreendem uma sequência nucleotídica contígua de 10 a 30 nucleotídeos de comprimento com pelo menos 90% de complementaridade, tal como totalmente complementar a um ácido nucleico de HTRA1 de mamífero, tal como SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3 ou SEQ ID NO 4.
[0012] De acordo com um aspecto adicional, a invenção proporciona composições farmacêuticas que compreendem os oligonucleotídeos da invenção e diluentes, carreadores, sais e/ou adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis.
[0013] A invenção proporciona oligonucleotídeos anti-sentido LNA, tais como oligonucleotídeos espaçâmero de LNA, que compreendem uma sequência nucleotídica contígua de 10 a 30 nucleotídeos de comprimento com pelo menos 90% de complementaridade, tal como totalmente complementar a um ácido nucleico HTRA1, como uma sequência selecionada a partir do grupo constituído por SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3 ou SEQ ID NO 4.
[0014] A invenção proporciona um oligonucleotídeo anti-sentido que compreende uma região nucleotídica contígua de 10 a 30, tais como 12 a 22 nucleotídeos, em que a região nucleotídica contígua é pelo menos 90%, tal como 100% complementar à SEQ ID NO 113.
[0015] A invenção proporciona um oligonucleotídeo anti-sentido de 10 a 30 nucleotídeos de comprimento, em que o referido oligonucleotídeo anti- sentido compreende uma região nucleotídica contígua de 10 a 30, tais como 12 a 22, nucleotídeos que são pelo menos 90%, tal como complementaridade de 100% à SEQ ID NO 113: 5’
GACAGTCAGCATTTGTCTCCTCCTTTAACTGAGTCATCATCTTAGTCCAACTAATGCAG TCGATACAATGCGTAGATAGAAGAAGCCCCACGGGAGCCAGGATGGGACTGGTCGTGTT TGTGCTTTTCTCCAAGTCAGCACCCAAAGGTCAATGCACAGAGACCCCGGGTGGGTGAG CGCTGGCTTCTCAAACGGCCGAAGTTGCCTCTTTTAGGAATCTCTTTGGAATTGGGAGC
ACGATGACTCTGAGTTTGAGCTATTAAAGTACTTCTTAC 3’.
[0016] O complemento inverso da SEQ ID NO 113 é compreendido pela SEQ ID NO 119:
GTAAGAAGTACTTTAATAGCTCAAACTCAGAGTCATCGTGCTCCCAATTCCAAAGAGAT TCCTAAAAGAGGCAACTTCGGCCGTTTGAGAAGCCAGCGCTCACCCACCCGGGGTCTCT GTGCATTGACCTTTGGGTGCTGACTTGGAGAAAAGCACAAACACGACCAGTCCCATCCT GGCTCCCGTGGGGCTTCTTCTATCTACGCATTGTATCGACTGCATTAGTTGGACTAAGA TGATGACTCAGTTAAAGGAGGAGACAAATGCTGACTGTC.
[0017] A invenção proporciona um oligonucleotídeo anti-sentido que compreende uma região nucleotídica contígua de 10 a 30, tais como 12 a 22 nucleotídeos, em que a região nucleotídica contígua é pelo menos 90%, tal como 100% complementar à SEQ ID NO 114.
[0018] A invenção proporciona um oligonucleotídeo anti-sentido de 10 a 30 nucleotídeos de comprimento, em que o referido oligonucleotídeo anti- sentido compreende uma região nucleotídica contígua de 10 a 30, tal como 12 a 22 nucleotídeos que são pelo menos 90%, tal como complementaridade de 100% à SEQ ID NO 114: 5’
GACAGTCAGCATTTGTCTCCTCCTTTAACTGAGTCATCATCTTAGTCCAACTAATGCAG TCGATACAATGCGTAGATAGAAGAAGCCCCACGGGAGCCAGGATGGGACTGGTCGTGTT TGTGCTTTTCTCCAAGTCAGCACCCAAAGGTCAATGCACAGAGACCCCGGGTGGGTGAG
CGCTGGCTTCTCAAACGGCCGAAGTTGCCTCTTTTAGGAATCTCTTTGGAATTGGGAGC ACGATGACTCTGAGTTTGAGCTATTAAAGTACTTCTTACACATTGC 3’.
[0019] O complemento inverso da SEQ ID NO 114 é compreendido por SEQ ID NO 120:
GCAATGTGTAAGAAGTACTTTAATAGCTCAAACTCAGAGTCATCGTGCTCCCAATTCCA AAGAGATTCCTAAAAGAGGCAACTTCGGCCGTTTGAGAAGCCAGCGCTCACCCACCCGG GGTCTCTGTGCATTGACCTTTGGGTGCTGACTTGGAGAAAAGCACAAACACGACCAGTC CCATCCTGGCTCCCGTGGGGCTTCTTCTATCTACGCATTGTATCGACTGCATTAGTTGG ACTAAGATGATGACTCAGTTAAAGGAGGAGACAAATGCTGACTGTC.
[0020] A invenção proporciona um oligonucleotídeo anti-sentido que compreende uma região nucleotídica contígua de 10 a 30, tais como 12 a 22 nucleotídeos, em que a região nucleotídica contígua é pelo menos 90%, tal como 100% complementar à SEQ ID NO 115.
[0021] A invenção proporciona um oligonucleotídeo anti-sentido de 10 a 30 nucleotídeos de comprimento, em que o referido oligonucleotídeo anti- sentido compreende uma região nucleotídica contígua de 10 a 30, tais como 12 a 22 nucleotídeos que são pelo menos 90%, como complementaridade a 100% para a SEQ ID NO 115: 5’.
GACAGTCAGCATTTGTCTCCTCCTTTAACTGAGTCATCATCTTAGTCCAACTAATGCAG TCGATACAATGCGTAGATAGAAGAAGCCCCACGGGAGCCAGGATGGGACTGGTCGTGTT TGTGCTTTTCTCCAAGTCAGCACCCAAAGGTCAATGCACAGAGACCCCGGGTGGGTGAG
CGCTGGCTTCTCAAACGGCCGAAGTTGCCTCTTTTAGGAATCTCTTTGGAATTGGGAGC ACGATGACTCTGAGTTTGAGCTATTAAAGT 3’.
[0022] O complemento inverso da SEQ ID NO 115 é compreendido pela SEQ ID NO 121:
ACTTTAATAGCTCAAACTCAGAGTCATCGTGCTCCCAATTCCAAAGAGATTCCTAAAAG AGGCAACTTCGGCCGTTTGAGAAGCCAGCGCTCACCCACCCGGGGTCTCTGTGCATTGA CCTTTGGGTGCTGACTTGGAGAAAAGCACAAACACGACCAGTCCCATCCTGGCTCCCGT GGGGCTTCTTCTATCTACGCATTGTATCGACTGCATTAGTTGGACTAAGATGATGACTC AGTTAAAGGAGGAGACAAATGCTGACTGTC.
[0023] A invenção proporciona um oligonucleotídeo anti-sentido que compreende uma região nucleotídica contígua de 10 a 30, tais como 12 a 22 nucleotídeos, em que a região nucleotídica contígua é compreendida por pelo menos 90%, tal como 100% complementar à SEQ ID NO 116.
[0024] A invenção proporciona um oligonucleotídeo anti-sentido de 10 a 30 nucleotídeos de comprimento, em que o referido oligonucleotídeo anti- sentido compreende uma região nucleotídica contígua de 10 a 30, tais como 12 a 22 nucleotídeos que são pelo menos 90%, como complementaridade a 100% a SEQ ID NO 116: 5 '
CAACTAATGCAGTCGATACAATGCGTAGATAGAAGAAGCCCCACGGGAGCCAGGATGGG ACTGGTCGTGTTTGTGCTTTTCTCCAAGTCAGCACCCAAAGGTCAATGCACAGAGACCC CGGGTGGGTGAGCGCTGGCTTCTCAAACGGCCGAAGTTGCCTCTTTTAGGAATCTCTTT
GGAATTGGGAGCACGATGACTCTGAGTTTGAGCTATTAAAGTACTTCTTACACATTGC 3’.
[0025] O complemento inverso da SEQ ID NO 116 é compreendido pela SEQ ID NO 122:
GCAATGTGTAAGAAGTACTTTAATAGCTCAAACTCAGAGTCATCGTGCTCCCAATTCCA AAGAGATTCCTAAAAGAGGCAACTTCGGCCGTTTGAGAAGCCAGCGCTCACCCACCCGG GGTCTCTGTGCATTGACCTTTGGGTGCTGACTTGGAGAAAAGCACAAACACGACCAGTC CCATCCTGGCTCCCGTGGGGCTTCTTCTATCTACGCATTGTATCGACTGCATTAGTTG.
[0026] A invenção proporciona um oligonucleotídeo anti-sentido que compreende uma região nucleotídica contígua de 10 a 30, tais como 12 a 22 nucleotídeos, em que a região nucleotídica contígua é compreendida por pelo menos 90%, tal como 100% complementar à SEQ ID NO 117.
[0027] A invenção proporciona um oligonucleotídeo anti-sentido de 10 a 30 nucleotídeos de comprimento, em que o referido oligonucleotídeo anti- sentido compreende uma região nucleotídica contígua de 10 a 30, tais como 12 a 22 nucleotídeos que são pelo menos 90%, tal como complementaridade de 100% a SEQ ID NO 117: 5 '
CAACTAATGCAGTCGATACAATGCGTAGATAGAAGAAGCCCCACGGGAGCCAGGATGGG ACTGGTCGTGTTTGTGCTTTTCTCCAAGTCAGCACCCAAAGGTCAATGCACAGAGACCC
CGGGTGGGTGAGCGCTGGCTTCTCAAACGGCCGAAGTTGCCTCTTTTAGGAATCTCTTT GGAATTGGGAGCACGATGACTCTGAGTTTGAGCTATTAAAGTTACTTCTTAC 3’.
[0028] O complemento inverso da SEQ ID NO 117 é compreendido pela SEQ ID NO 123:
GTAAGAAGTAACTTTAATAGCTCAAACTCAGAGTCATCGTGCTCCCAATTCCAAAGAGA TTCCTAAAAGAGGCAACTTCGGCCGTTTGAGAAGCCAGCGCTCACCCACCCGGGGTCTC TGTGCATTGACCTTTGGGTGCTGACTTGGAGAAAAGCACAAACACGACCAGTCCCATCC TGGCTCCCGTGGGGCTTCTTCTATCTACGCATTGTATCGACTGCATTAGTTG.
[0029] De acordo com algumas concretizações, o oligonucleotídeo anti-sentido da invenção não é da sequência 5 'gcaatgtgtaagaagt 3' (SEQ ID NO 112). Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo anti-sentido da invenção não compreende ou consiste na sequência 5’ gcaatgtgtaagaagt 3'. De acordo com algumas concretizações, o oligonucleotídeo anti-sentido da invenção não compreende ou consiste em 10 ou mais nucleotídeos contíguos presentes na sequência 5 'gcaatgtgtaagaagt 3'. De acordo com algumas concretizações, o oligonucleotídeo da invenção é diferente de 5 'GCAatgtgtaagaAGT 3', em que letras maiúsculas representam nucleosídeos LNA (foram usados nucleosídeos LNA beta-D-oxi), todas as citosinas LNA são 5-metil citosina, letras minúsculas representam nucleosídeos DNA , Citosinas de DNA precedidas por um sobrescrito m representam um nucleosídeo C-DNA 5-metil. Todas as ligações internucleosídicas são ligações internucleosídicas de fosforotioato.
[0030] A invenção proporciona um oligonucleotídeo anti-sentido que compreende uma região nucleotídica contígua de pelo menos 10 nucleotídeos contíguos presentes em qualquer uma das SEQ ID NOs 5 a 111. A invenção proporciona um oligonucleotídeo anti-sentido que compreende uma região nucleotídica contígua de pelo menos 12 nucleotídeos contíguos presentes em qualquer uma das SEQ ID NOs 5 - 111. A invenção proporciona um oligonucleotídeo anti-sentido que compreende uma região nucleotídica contígua de pelo menos 14 nucleotídeos contíguos presentes em qualquer uma das SEQ ID NOs 5 - 111. A invenção proporciona uma oligonucleotídeo anti-sentido que compreende uma região nucleotídica contígua de pelo menos 15 ou 16 nucleotídeos contíguos presentes em qualquer uma das SEQ ID NOs 5 - 111. A invenção proporciona um oligonucleotídeo anti-sentido, em que a sequência nucleotídica contígua do oligonucleotídeo compreende ou consiste de uma sequência de nucleobases selecionada do grupo que consiste em qualquer uma das SEQ ID NOs 5 - 111.
[0031] A invenção proporciona um oligonucleotídeo anti-sentido que compreende uma região nucleotídica contígua de pelo menos 10, ou pelo menos 12, pelo menos 13, ou pelo menos 14 ou pelo menos 14 ou pelo menos 15 ou pelo menos 16 nucleotídeos contíguos presentes na SEQ ID NO 118: 5 ' CTTCTTCTATCTACGCATTG 3 '. O COMPLEMENTO INVERSO DA SEQ ID NO 118 é SEQ ID NO 231: CAATGCGTAGATAGAAGAAG.
[0032] A invenção proporciona um oligonucleotídeo anti-sentido que compreende uma região nucleotídica contígua de pelo menos 10, ou pelo menos 12, pelo menos 13, ou pelo menos 14 ou pelo menos 15 ou pelo menos 16 ou pelo menos 16 nucleotídeos contíguos complementares à SEQ ID NO 231.
[0033] A invenção proporciona um oligonucleotídeo anti-sentido que compreende uma região nucleotídica contígua de pelo menos 10, ou pelo menos 12 ou pelo menos 13, ou pelo menos 14 ou pelo menos 15 ou 16 nucleotídeos contíguos presentes na SEQ ID NO 67.
[0034] A invenção proporciona um oligonucleotídeo anti-sentido que compreende uma região nucleotídica contígua de pelo menos 10, ou pelo menos 12, ou pelo menos 13, ou pelo menos 14 ou pelo menos 15 ou 16 nucleotídeos contíguos presentes na SEQ ID NO 86.
[0035] A invenção proporciona um oligonucleotídeo anti-sentido que compreende uma região nucleotídica contígua de pelo menos 10, ou pelo menos 12, ou pelo menos 13, ou pelo menos 14 ou pelo menos 15 ou pelo menos 16 ou pelo menos 17 ou 18 nucleotídeos contíguos presentes na SEQ ID NO 73.
[0036] A invenção proporciona um oligonucleotídeo anti-sentido que compreende uma região nucleotídica contígua de pelo menos 10, ou pelo menos 12, ou pelo menos 13, ou pelo menos 14 ou pelo menos 15 ou 16 nucleotídeos contíguos complementares à SEQ ID NO 186.
[0037] A invenção proporciona um oligonucleotídeo anti-sentido que compreende uma região nucleotídica contígua de pelo menos 10, ou pelo menos 12, ou pelo menos 13, ou pelo menos 14 ou pelo menos 15 ou 16 nucleotídeos contíguos complementares à SEQ ID NO 205.
[0038] A invenção proporciona um oligonucleotídeo anti-sentido que compreende uma região nucleotídica contígua de pelo menos 10 ou pelo menos 12 ou pelo menos 13, ou pelo menos 14 ou pelo menos 15 ou pelo menos 16 ou pelo menos 17 ou 18 nucleotídeos contíguos complementares a SEQ ID NO 192.
[0039] A invenção proporciona um oligonucleotídeo que compreende ou consiste em um oligonucleotídeo selecionado a partir do grupo que consiste em: TsTsmCstsastscstsasmcsgscsasTsTsG (SEQ ID NO 67,1), m CsTsTsmCststscstsastscstsasmcsgscsAsT (SEQ ID NO 73,1), e TsAsmCsTststsasastsasgscsTsmCsAsA (SEQ ID NO 86,1); em que as letras maiúsculas representam nucleosídeos beta-D-oxi LNA, as letras minúsculas são nucleosídeos de DNA, o subscrito s representa uma ligação internucleosídeos de fosforotioato e mC representa 5 nucleosídeos de metil-citosina beta-D- oxi LNA e mc representa 5 nucleosídeos de DNA de metil-citosina.
[0040] A invenção proporciona um oligonucleotídeo de fórmula: TsTsmCstsastscstsasmcsgscsasTsTsG (SEQ ID NO 67,1), em que as letras maiúsculas representam nucleosídeos LNA beta-D-oxi, as letras minúsculas são nucleosídeos DNA, o subscrito s representa uma ligação internucleosídeos fosforotioato e mC representa 5 nucleosídeos metil-citosina beta-D-oxi LNA e mc representa 5 nucleosídeos DNA de metil citosina.
[0041] A invenção proporciona um oligonucleotídeo da fórmula:
m CsTsTsmCststscstsastscstsasmcsgscsAsT (SEQ ID NO 73,1) em que as letras maiúsculas representam nucleosídeos LNA beta-D-oxi, as letras minúsculas são nucleosídeos DNA, o subscrito s representa uma ligação internucleosídeos fosforotioato e mC representa 5 nucleosídeos metil-citosina beta-D-oxi LNA e mc representa 5 nucleosídeos DNA de metil citosina.
[0042] A invenção proporciona um oligonucleotídeo da fórmula: TsAsmCsTststsasastsasgscsTsmCsAsA (SEQ ID NO 86,1) em que letras maiúsculas representam nucleosídeos beta-D-oxi LNA, letras minúsculas são nucleosídeos de DNA, subscrito s representa uma ligação internucleosídeos de fosforotioato e mC representa 5 nucleosídeos de metil-citosina beta-D-oxi LNA e mc representa 5 nucleosídeos de DNA de metil- citosina.
[0043] A invenção proporciona os oligonucleotídeos que são proporcionados nos exemplos.
[0044] A invenção proporciona um conjugado que compreende o oligonucleotídeo de acordo com a invenção, e pelo menos uma porção de conjugado ligada de forma covalente ao dito oligonucleotídeo.
[0045] A invenção proporciona um sal farmaceuticamente aceitável do oligonucleotídeo ou conjugado da invenção.
[0046] De acordo com outro aspecto, a invenção proporciona métodos para o método in vivo ou in vitro para modulação da expressão de HTRA1 em uma célula que está expressando HTRA1, administrando um oligonucleotídeo, conjugado ou composição da invenção em uma quantidade eficaz para a referida célula.
[0047] De acordo com outro aspecto a invenção proporciona métodos para o tratamento ou prevenção de uma enfermidade, distúrbio ou disfunção associada com a atividade in vivo de HTRA1 que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente efetivo do oligonucleotídeo da invenção, ou conjugado do mesmo, a um paciente que sofre ou é suscetível à enfermidade, distúrbio ou disfunção.
[0048] De acordo com outro aspecto o oligonucleotídeo ou composição da invenção é usado para o tratamento ou prevenção de degeneração macular, e outros distúrbios onde está indicado HTRA1.
[0049] A invenção proporciona o oligonucleotídeo oro conjugado da invenção, para o uso no tratamento de uma enfermidade ou distúrbio selecionado a partir da lista que compreende distrofia muscular de Duchenne, artrite, tal como osteoartrite, enfermidade cerebral isquêmica familiar de pequenos vasos, doença de Alzheimer e doença de Parkinson.
[0050] S invenção proporciona o oligonucleotídeo ou conjugado da invenção, para o uso no tratamento de degeneração macular, tal como degeneração macular úmida ou seca relacionada à idade (por exemplo, wAMD, dAMD, atrofia geográfica, DMRI precoce, DMRI intermediária) ou retinopatia diabética.
[0051] A invenção proporciona o uso de oligonucleotídeo, conjugado ou composição da invenção, para a fabricação de um medicamento adequado para o tratamento de degeneração macular, tal como degeneração macular úmida ou seca relacionada à idade (por exemplo, wAMD, dAMD, atrofia geográfica, dAMD intermediária) ou retinopatia diabética.
[0052] A invenção proporciona o uso do oligonucleotídeo, conjugado ou composição da invenção, para a manufatura de um medicamento para o tratamento de uma enfermidade ou distúrbio selecionado a partir do grupo que consiste de distrofia muscular de Duchenne, artrite, tais como osteoartrite, enfermidade cerebral isquêmica familiar de pequenos vasos, doença de Alzheimer e doença de Parkinson.
[0053] A invenção proporciona um método de tratamento de um paciente que sofre de uma enfermidade ou distúrbio selecionado a partir do grupo que consiste de distrofia muscular de Duchenne, artrite, tais como osteoartrite, enfermidade cerebral isquêmica familiar de pequenos vasos, doença de Alzheimer e doença de Parkinson, o dito método compreendendo a etapa de administrar ao paciente uma quantidade efetiva do oligonucleotídeo, conjugado ou composição da invenção.
[0054] A invenção proporciona um método de tratamento de um paciente que sofre de uma enfermidade ocular, tal como degeneração macular, tais como degeneração macular úmida ou seca relacionada à idade (por exemplo, wAMD, dAMD, atrofia geográfica, dAMD intermediário) ou retinopatia diabética, o referido método compreendendo a etapa de administrar ao paciente uma quantidade eficaz do oligonucleotídeo, conjugado ou composição da invenção.
[0055] A invenção proporciona um método de tratamento de um paciente que sofre de uma enfermidade ocular, tal como degeneração macular, tais como degeneração macular úmida ou seca relacionada à idade (por exemplo, wAMD, dAMD, atrofia geográfica, DMRI intermediária) ou retinopatia diabética, o referido método compreendendo a administração de pelo menos duas dosagens do oligonucleotídeo da invenção, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em uma injeção intraocular em uma dosagem de cerca de 10 µg - 200 µg, em que o intervalo de dosagem entre a administração consecutiva é de pelo menos 4 semanas (ou seja, um intervalo de dosagem é ≥ 4 semanas) ou pelo menos mensalmente (ou seja, um intervalo de dosagem é ≥ 1 mês).
DESCRIÇÃO BREVE DOS DESENHOS
[0056] Figura 1. Uma biblioteca de n = 231 oligonucleotídeos HTRA1 LNA foi rastreada em linhas de células U251 a 5 µM. O nível de expressão de mRNA de HTRA1 residual foi medido por meio de qPCR e é mostrado como % de controle (células tratadas com PBS). n = 10 oligos localizados entre a posição 53113 - 53384 estavam relativamente ativos.
[0057] Figura 2. Uma biblioteca de n = 210 oligonucleotídeos HTRA1 LNA foi rastreada em linhas de células U251 a 5 µM. O nível de expressão de mRNA de HTRA1 residual foi medido por qPCR e é mostrado como % de controle (células tratadas com PBS). n = 33 oligos localizados entre a posição 53113 - 53384 estavam relativamente ativos.
[0058] Figura 3. Uma biblioteca de n = 305 oligonucleotídeos HTRA1 LNA foi rastreada nas linhas de células U251 e ARPE19 a 5 e 25 µM, respectivamente. O nível de expressão de mRNA de HTRA1 residual foi medido por qPCR e é mostrado como % de controle (células tratadas com PBS). n = 95 oligos localizados entre a posição 53113 - 53384 foram relativamente ativos em comparação com o restante.
[0059] Figura 4. Resposta da dose do nível de mRNA de HTRA1 após o tratamento de células RPE primárias humanas com oligonucleotídeos de LNA, 10 dias de tratamento. Está codificado um oligo de controle com uma sequência codificada não relacionada à sequência alvo Htra1.
[0060] Figura 5. Estudo NHP PK/PD, administração de IVT, 25 µg/olho. A) nível de mRNA de HTRA1 medido na retina por qPCR. B) teor de oligo na retina medido por oligo ELISA. C) nível de mRNA de HTRA1 ilustrado por ISH. D-E) Quantificação do nível de proteína HTRA1 na retina e no vítreo, respectivamente, por IP-MS. Os pontos mostram dados para animais individuais. As barras de erro mostram erros padrão para réplicas técnicas (n = 3). F-G) Redução do nível de proteína HTRA1 na retina e no vítreo, respectivamente ilustrados por transferência Western.
[0061] Figura 6. Um composto da invenção (Composto ID NO 67,1). O composto pode estar na forma de um sal farmacêutico, tal como um sal de sódio ou um sal de potássio.
[0062] Figura 7. Um composto da invenção (Composto ID NO 86,1). O composto pode estar na forma de um sal farmacêutico, tal como um sal de sódio ou um sal de potássio.
[0063] Figura 8. Um composto da invenção (composto NO 73,1). O composto pode estar na forma de um sal farmacêutico, tal como um sal de sódio ou um sal de potássio.
[0064] Figura 9. Um exemplo de um sal farmacêutico do composto 67,1: M + é um cátion adequado, tipicamente um íon metálico positivo, tal como um íon sódio ou potássio. A razão estequiométrica do cátion para o ânion de oligonucleotídeo dependerá da carga do cátion utilizado. Adequadamente, poderão ser utilizados cátions com uma, duas ou três cargas positivas (M +, M ++ ou M +++). Para fins ilustrativos, são necessárias duas vezes mais cátions monovalentes + (monovalentes),tais como Na + ou K +, em comparação com um cátion divalente como Ca2+..
[0065] Figura 10. Um exemplo de um sal farmacêutico do composto 86,1: Vide a legenda da figura para a figura 9 para a descrição do cátion M+.
[0066] Figura 11. Um exemplo de um sal farmacêutico do composto 73,1: Vide a legenda da figura para a Figura 9 para a descrição do cátion M+.
[0067] Figura 12A. Os compostos #15,3 e #17 foram administrados por via intravítrea em macacos cinomolgos e amostras de humor aquoso foram coletadas nos dias 3, 8, 15 e 22 após a injeção. As proteínas de amostras não diluídas foram analisadas por eletroforese capilar usando-se um dispositivo Peggy Sue (Protein Simple). O HTRA1 foi detectado usando-se um anti-soro policlonal de coelho personalizado. São apresentados dados dos animais #J60154 (Veículo), J60158 (C. Id # 15,3), J60162 (C. Id #17).
[0068] Figura 12B. As intensidades de sinal foram quantificadas por comparação com a proteína HTRA1 recombinante purificada (mutante S328A) (Origene, # TP700208). No presente caso é ilustrada a curva de calibração.
[0069] Figura 12C. Painel superior: A concentração calculada de humor aquoso de HTRA1 de cada animal foi traçada contra o tempo após a injeção. Painel inferior: foi determinada a concentração média de HTRA1 para o grupo veículo em cada momento e calculada a concentração relativa correspondente nos animais tratados. Círculo aberto: valor individual, círculo fechado: média do grupo. Esta indicada a % de redução de HTRA1 para o dia 22.
[0070] Figura 13. O mRNA de HTRA1 foi traçado contra os níveis de proteína HTRA1 no humor aquoso (diamantes azuis) ou na retina (quadrados vermelhos) em macacos cinomolgos tratados com várias moléculas de LNA direcionadas ao transcrito HTRA1. Os valores são expressos como percentagem normalizada para controles PBS.
[0071] Figura 14. Correlação da proteína HTRA1 no humor aquoso com a proteína (A) HTRA1 na retina e (B) mRNA de HTRA1 na retina em macacos cinomolgos tratados com várias moléculas de LNA direcionadas ao transcrito HTRA1. Os valores são expressos como percentagem normalizada para controles PBS.
DEFINIÇÕES Oligonucleotídeo
[0072] Da forma que é utilizado no presente caso, o termo “oligonucleotídeo” é definido da forma que ele é de um modo geral compreendido pela pessoa vetada na técnica como uma molécula que compreende dois ou mais nucleosídeos ligados de forma covalente. Esses nucleosídeos ligados de forma covalente também podem ser referidos como moléculas de ácido nucleico ou oligômeros. Os oligonucleotídeos são comumente produzidos em laboratório por síntese química em fase sólida seguida de purificação. Quando se refere a uma sequência de o oligonucleotídeo, faz-se referência à sequência ou ordem das porções de nucleobases, ou modificações das mesmas, dos nucleotídeos ou nucleosídeos ligados de forma covalente. O oligonucleotídeo da invenção é fabricado pelo homem e é sintetizado quimicamente e normalmente é purificado ou isolado. O oligonucleotídeo da invenção pode compreender um ou mais nucleosídeos ou nucleotídeos modificados. Oligonucleotídeos anti-sentido
[0073] Da forma que é utilizado no presente caso, o termo “oligonucleotídeo anti-sentido” é definido como oligonucleotídeos capazes de modular a expressão de um gene alvo por hibridação com um ácido nucleico alvo, em particular com uma sequência contígua em um ácido nucleico alvo. Os oligonucleotídeos anti-sentido não são essencialmente de fita dupla e, portanto, não são siRNAs. De preferência, os oligonucleotídeos anti-sentido da presente invenção são de cadeia simples. Região Contígua de Nucleotídeos
[0074] O termo "região nucleotídica contígua" refere-se à região do oligonucleotídeo que é complementar ao ácido nucleico alvo. O termo pode ser usado no presente caso de forma intercambiável com o termo "sequência nucleotídica contígua" ou "sequência nucleobásica contígua"
e o termo "sequência do motivo oligonucleotídico". De acordo com algumas modalidades, todos os nucleotídeos do o oligonucleotídeo estão presentes na região nucleotídica contígua. De acordo com modalidades, o oligonucleotídeo compreende a região nucleotídica contígua e pode, opcionalmente, compreender nucleotídeos adicionais, por exemplo, uma região de ligação de nucleotídeos que pode ser usada para conectar um grupo funcional à sequência nucleotídica contígua. A região de ligação de nucleotídeo pode ou não ser complementar ao ácido nucleico alvo. De acordo com algumas concretizações, as ligações internucleosídeos presentes entre os nucleotídeos da região nucleotídica contígua são todas as ligações internucleosídeos de fosforotioato. De acordo com algumas modalidades, a região nucleotídica contígua compreende um ou mais nucleosídeos modificados por açúcar. Nucleotídeos
[0075] Os nucleotídeos são os blocos de construção de oligonucleotídeos e polinucleotídeos e, para os fins da presente invenção, incluem nucleotídeos de ocorrência natural e não natural. Na natureza, nucleotídeos, tais como nucleotídeos de DNA e RNA, compreendem uma porção de açúcar ribose, uma porção de nucleobase e um ou mais grupos fosfato (que está ausente nos nucleosídeos). Nucleosídeos e nucleotídeos também podem ser referidos de forma intercambiável como "unidades" ou "monômeros". Nucleosídeo modificado
[0076] Da forma que é utilizado no presente caso,, o termo “nucleosídeo modificado” ou “modificação de nucleosídeo” refere-se a nucleosídeos modificados quando comparados ao nucleosídeo equivalente de DNA ou RNA pela introdução de uma ou mais modificações da porção açúcar ou da porção de base (nucleo). De acordo com uma concretização preferida, o nucleosídeo modificado compreende uma porção de açúcar modificada. O termo nucleosídeo modificado também pode ser usado neste caso alternadamente com o termo "análogo de nucleosídeo" ou "unidades" modificadas ou "monômeros" modificados. Ligação internucleosídeos modificada
[0077] O termo "ligação internucleosídeos modificada" é definido como geralmente entendido pelas pessoas versadas na técnica como ligações diferentes das ligações fosfodiéster (PO), que acopla de forma covalente dois nucleosídeos. Os nucleotídeos com ligação internucleosídica modificada também são denominados "nucleotídeos modificados". De acordo com algumas concretizações, a ligação internucleosídica modificada aumenta a resistência à nuclease do oligonucleotídeo em comparação com uma ligação fosfodiéster. Para oligonucleotídeos de ocorrência natural, a ligação internucleosídeos inclui grupos fosfato, criando uma ligação fosfodiéster entre os nucleosídeos adjacentes. As ligações internucleosídicas modificadas são particularmente úteis na estabilização de oligonucleotídeos para uso in vivo e podem servir para proteger contra a clivagem de nucleases em regiões de nucleosídeos de DNA ou RNA no oligonucleotídeo da invenção, por exemplo, na região de lacuna de um espaçâmero de oligonucleotídeo, bem como em regiões de nucleosídeos modificados.
[0078] De acordo com uma concretização, o oligonucleotídeo compreende uma ou mais ligações internucleosídeos modificadas do fosfodiéster natural para uma ligação que é, por exemplo, mais resistente ao ataque de nuclease. A resistência à nuclease pode ser determinada incubando-se o oligonucleotídeo no soro sanguíneo ou utilizando-se um ensaio de resistência à nuclease (por exemplo, fosfodiesterase de veneno de cobra (SVPD)), ambos bem conhecidos na técnica. As ligações internucleosídicas que são capazes de aumentar a resistência à nuclease de um oligonucleotídeo são referidas como ligações internucleosídicas resistentes à nuclease. De acordo com algumas concretizações, todas as ligações internucleosídicas do oligonucleotídeo, ou sequência nucleotídica contígua dos mesmos, são modificadas. Reconhece-se que, de acordo com algumas concretizações, os nucleosídeos que ligam o oligonucleotídeo de uma invenção a um grupo funcional não nucleotídico, tal como um conjugado, podem ser fosfodiéster. De acordo com algumas concretizações, todas as ligações internucleosídicas do oligonucleotídeo, ou sua sequência nucleotídica contígua, são ligações internucleosídicas resistentes à nuclease.
[0079] De acordo com algumas concretizações as ligações internucleosídeos modificadas podem ser compreendidas por ligações internucleosídeos fosforotioato. De acordo com algumas concretizações, as ligações internucleosídicas modificadas são compatíveis com o recrutamento pela RNaseH do oligonucleotídeo da invenção, por exemplo, fosforotioato.
[0080] De acordo com algumas concretizações a ligação internucleosídeos compreende enxofre (S), tal como uma ligação internucleosídeos de fosforotioato.
[0081] Uma ligação internucleosídeos de fosforotioato é particularmente útil devido à resistência à nuclease, farmacocinética benéfica e facilidade de fabricação. De acordo com algumas concretizações, todas as ligações internucleosídicas do oligonucleotídeo ou sua sequência nucleotídica contígua são fosforotioato. Nucleobase
[0082] O termo nucleobase inclui a fração purina (por exemplo, adenina e guanina) e pirimidina (por exemplo, uracil, timina e citosina) presente em nucleosídeos e nucleotídeos que formam ligações de hidrogênio na hibridação de ácidos nucleicos. No contexto da presente invenção, o termo nucleobase também abrange nucleobases modificadas que podem diferir das nucleobases que ocorrem naturalmente, mas são funcionais durante a hibridação de ácidos nucleicos. Nesse contexto, "nucleobase" refere-se a nucleobases de ocorrência natural, tais como adenina, guanina, citosina, timidina, uracil, xantina e hipoxantina, bem como variantes de ocorrência não natural. Tais variantes encontram-se descritas, por exemplo, em Hirao et al (2012) Accounts of Chemical Research vol 45, página 2055, e Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1.
[0083] De acordo com algumas concretizações a porção de nucleobase é modificada pela modificação da purina ou pirimidina em uma purina modificada ou pirimidina, tais como purina substituída ou pirimidina substituída, tal como uma nucleobase selecionada a partir de isocitina, pseudoisocitina, 5-metil citosina, 5-tiozolo- citosina, 5-propinil-citosina, 5- propinil-uracil, 5- bromouracil 5-tiazolo-uracil, 2-tio-uracil, 2'-tio-timina, inosina, diaminopurina, 6-aminopurina, 2-aminopurina, 2,6- diaminopurina e 2-cloro-6-aminopurina.
[0084] As porções de nucleobases podem ser indicadas pelo código da letra para cada nucleobase correspondente, p. A, T, G, C ou U, em que cada letra pode opcionalmente incluir nucleobases modificadas de função equivalente. Por exemplo, nos oligonucleotídeos exemplificados, as porções de nucleobases são selecionadas dentre A, T, G, C e 5-metil citosina. Opcionalmente, para espaçâmeros de LNA, podem ser utilizados nucleosídeos de 5- metil citosina LNA. De acordo com algumas concretizações, as nucleobases de citosina em um motivo 5'cg3 'são compreendidas por 5-metil citosina. Oligonucleotídeo Modificado
[0085] O termo oligonucleotídeo modificado descreve um oligonucleotídeo que compreende um ou mais nucleosídeos modificados com açúcar e/ou ligações internucleosídeos modificadas. O termo oligonucleotídeo quimérico é um termo que tem sido utilizado na literatura para descrever oligonucleotídeos com nucleosídeos modificados. Complementaridade
[0086] O termo complementaridade descreve a capacidade de emparelhamento de bases de nucleosídeos/nucleotídeos de Watson-Crick. Os pares de bases Watson-Crick são compreendidos por guanina (G) - citosina (C) e adenina (A) - timina (T)/uracil (U). Deve ser compreendido que os oligonucleotídeos podem compreender nucleosídeos com nucleobases modificadas, por exemplo, 5- metil-citosina é freqüentemente usada no lugar da citosina e, como tal, o termo complementaridade abrange o pareamento de bases de Watson Crick entre nucleobases não modificadas e modificadas (vide, por exemplo, Hirao et al (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 página 2055 e Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1).
[0087] Da forma que é utilizado no presente caso, o termo "% complementar", refere-se ao número de nucleotídeos em porcentagem de uma região ou sequência nucleotídica contígua em uma molécula de ácido nucleico (por exemplo, oligonucleotídeo) que, em uma determinada posição, são complementares a (ou seja, formam a base Watson Crick emparelha com) uma sequência nucleotídica contígua, em uma determinada posição de uma molécula de ácido nucleico separada (por exemplo, o ácido nucleico alvo). A porcentagem é calculada contando-se o número de bases alinhadas que formam pares entre as duas seqüências, dividindo-se pelo número total de nucleotídeos no oligonucleotídeo e multiplicando-se por 100. Nessa comparação, um nucleobase / nucleotídeo que não se alinha (forma uma base par) é denominado incompatível.
[0088] Será entendido que, quando se refere à complementaridade entre duas sequências, a determinação da complementaridade é medida ao longo do comprimento da mais curta das duas sequências, como o comprimento da região ou sequência nucleotídica contígua.
[0089] O termo "totalmente complementar"
refere-se a 100% de complementaridade. Na ausência de um valor de % de prazo ou indicação de uma incompatibilidade, complementar significa plenamente complementar. Identidade
[0090] O termo "Identidade", conforme usado neste contexto, refere-se ao número de nucleotídeos em percentagem de uma sequência de nucleotídeos contíguos em uma molécula de ácido nucleico (por exemplo, oligonucleotídeo) que, em uma determinada posição, são idênticos a (ou seja, em sua capacidade de formar Watson Crick pares de bases com o nucleosídeo complementar) uma sequência nucleotídica contígua, em uma determinada posição de uma molécula de ácido nucleico separada (por exemplo, o ácido nucleico alvo). A percentagem é calculada contando-se o número de bases alinhadas que são idênticas entre as duas seqüências, incluindo as lacunas, dividindo-se pelo número total de nucleotídeos no oligonucleotídeo e multiplicando- se por 100. Identidade percentual = (Corresponde a 100) / Comprimento da região alinhada (com lacunas).
[0091] Ao se determinar a identidade da região nucleotídica contígua de um oligonucleotídeo, a identidade é calculada através do comprimento da região nucleotídica contígua. Nas modalidades em que toda a sequência nucleotídica contígua do oligonucleotídeo é a região nucleotídica contígua, a identidade é, portanto, calculada através do comprimento da sequência nucleotídica do oligonucleotídeo. Sob este aspecto, a região nucleotídica contígua pode ser idêntica a uma região da sequência de ácidos nucleicos de referência, ou de acordo com algumas concretizações pode ser idêntica a todo o ácido nucleico de referência. Salvo indicação em contrário, uma sequência que possui 100% de identidade para uma sequência de referência é referida como sendo idêntica.
[0092] Por exemplo, a sequência de referência pode ser selecionada a partir de do grupo que consiste em qualquer uma das SEQ ID NOs 5 - 111.
[0093] Não obstante, se o oligonucleotídeo compreender nucleotídeos adicionais que flanqueiam a região nucleotídica contígua, por exemplo, a região D’ ou D”, esses nucleotídeos de flanqueamento adicionais podem ser desconsiderados ao se determinar a identidade. De acordo com algumas concretizações, a identidade pode ser calculada em toda a sequência oligonucleotídica.
[0094] De acordo com algumas concretizações, o oligonucleotídeo anti-sentido da invenção compreende uma região nucleotídica contígua de pelo menos 10 nucleotídeos contíguos idênticos a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste da SEQ ID NO 5 - 111.
[0095] De acordo com algumas concretizações, o oligonucleotídeo anti-sentido da invenção compreende uma região nucleotídica contígua de pelo menos 12 nucleotídeos contíguos idênticos a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste da SEQ ID NO 5 - 111..
[0096] De acordo com algumas concretizações, o oligonucleotídeo anti-sentido da invenção compreende uma região nucleotídica contígua de pelo menos 13 nucleotídeos contíguos idênticos a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste da SEQ ID NO 5 - 111..
[0097] De acordo com algumas concretizações, o oligonucleotídeo anti-sentido da invenção compreende uma região nucleotídica contígua de pelo menos 14 nucleotídeos contíguos idênticos a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste da SEQ ID NO 5 - 111.
[0098] De acordo com algumas concretizações, o oligonucleotídeo anti-sentido da invenção compreende uma região nucleotídica contígua de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos idênticos a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste da SEQ ID NO 5 - 111.
[0099] De acordo com algumas concretizações, o oligonucleotídeo anti-sentido da invenção compreende uma região nucleotídica contígua de pelo menos 16 nucleotídeos contíguos idênticos a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste da SEQ ID NO 5 - 111.
[00100] De acordo com algumas concretizações, a região de nucleotídeos contíguos consiste ou compreende pelo menos 10 nucleotídeos contíguos, tais como 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, nucleotídeos contíguos, tais como a partir de 12-22, tais como a partir de 14-18 nucleotídeos contíguos de uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID NO 113 – 118, ou SEQ ID NO 5 – 111.. . De acordo com algumas concretizações, toda a sequência contígua do oligonucleotídeo consiste ou compreende pelo menos 10 nucleotídeos contíguos, tais como 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, nucleotídeos contíguos, tais como a partir de 12-22, tais como a partir de 14-18 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO.
[00101] De acordo com algumas concretizações, a sequência contígua do oligonucleotídeo consiste ou compreende pelo menos 10 nucleotídeos contíguos, tais como 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,
nucleotídeos contíguos, tais como 12- 22, tais como 14-18 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 119.
[00102] De acordo com algumas concretizações, a sequência contígua de o oligonucleotídeo consiste ou compreende pelo menos 10 nucleotídeos contíguos, tais como 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, nucleotídeos contíguos, tais como 12- 22, tais como 14-18 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 120.
[00103] De acordo com algumas concretizações, a sequência contígua de o oligonucleotídeo consiste ou compreende pelo menos 10 nucleotídeos contíguos, tais como 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, nucleotídeos contíguos, tais como 12- 22, tais como 14-18 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 121.
[00104] De acordo com algumas concretizações, a sequência contígua de o oligonucleotídeo consiste ou compreende pelo menos 10 nucleotídeos contíguos, tais como 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, nucleotídeos contíguos, tais como 12- 22, tais como 14-18 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO122.
[00105] De acordo com algumas concretizações, a sequência contígua de o oligonucleotídeo consiste ou compreende pelo menos 10 nucleotídeos contíguos, tais como 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, nucleotídeos contíguos, tais como 12- 22, tais como 14-18 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO 123.
[00106] A invenção proporciona um oligonucleotídeo anti-sentido que compreende uma região nucleotídica contígua de pelo menos 10 ou pelo menos 12 ou pelo menos 13 ou pelo menos 14 ou pelo menos 15 ou pelo menos 16 ou pelo menos 16 ou pelo menos 17 ou pelo menos 18 nucleotídeos contíguos presentes na SEQ ID NO 118: 5 'CTTCTTCTATCTACGCATTG 3'.
[00107] De acordo com algumas concretizações, a região de nucleotídeos contíguos compreende 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 nucleotídeos contíguos que são idênticos à SEQ ID NO 67.
[00108] De acordo com algumas concretizações, a região de nucleotídeos contíguos compreende 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou 18 nucleotídeos contíguos que são idênticos à SEQ ID NO 73.
[00109] De acordo com algumas concretizações, a região de nucleotídeos contíguos compreende 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 nucleotídeos contíguos que são idênticos à SEQ ID NO 86.
[00110] A invenção proporciona um oligonucleotídeo anti-sentido de 11 – 30 nucleotídeos de comprimento, tais como 12 – 20 nucleotídeos de comprimento, em que o oligonucleotídeo compreende uma sequência nucleotídica contígua idêntica à sequência selecionada a partir do grupo que consiste da SEQ ID NO 5 – 111.
[00111] Uma invenção proporciona um oligonucleotídeo anti-sentido que compreende ou que consiste em uma sequência nucleotídica contígua, em que a sequência nucleotídica contígua é idêntica a uma sequência de referência selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO 5 - 111 em pelo menos 10 nucleotídeos contíguos da sequência de referência.
[00112] Uma invenção proporciona um oligonucleotídeo anti-sentido que compreende ou que consiste em uma sequência nucleotídica contígua, em que a sequência nucleotídica contígua é idêntica a uma sequência de referência selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO 5 - 111 em pelo menos 12 nucleotídeos contíguos da sequência de referência.
[00113] Uma invenção proporciona um oligonucleotídeo anti-sentido que compreende ou que consiste em uma sequência nucleotídica contígua, em que a sequência nucleotídica contígua é idêntica a uma sequência de referência selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO 5 - 111 em pelo menos 14 nucleotídeos contíguos da sequência de referência.
[00114] A invenção proporciona um oligonucleotídeo anti-sentido que compreende ou que consiste de uma sequência de nucleotídeos contíguos, em que a sequência de nucleotídeos contíguos é idêntica a uma sequência de referência selecionada a partir do grupo que consiste da SEQ ID NO 5 – 111 por todo o comprimento da sequência de referência. Hibridização
[00115] Da forma que é utilizado no presente caso, o termo "hibridização" ou "hibridiza", deve ser entendido como duas cadeias de ácidos nucleicos (por exemplo, um oligonucleotídeo e um ácido nucleico alvo) que formam ligações de hidrogênio entre pares de bases em cadeias opostas, formando assim um duplex. A afinidade da ligação entre duas cadeias de ácidos nucleicos é a força da hibridização. É frequentemente descrito em termos da temperatura de fusão (Tm) definida como a temperatura na qual metade dos oligonucleotídeos são duplexados com o ácido nucleico alvo. Em condições fisiológicas, Tm não é estritamente proporcional à afinidade (Mergny e Lacroix, 2003, Oligonucleotídeos 13: 515-537). A energia livre de Gibbs no estado padrão ΔG ° é uma representação mais precisa da afinidade de ligação e está relacionada à constante de dissociação (Kd) da reação por ΔG ° = -RTln (Kd), onde R é a constante de gás e T é a temperatura absoluta. Por essa razão, um ΔG ° muito baixo da reação entre um oligonucleotídeo e o ácido nucleico alvo reflete uma forte hibridização entre o oligonucleotídeo e o ácido nucleico alvo. ΔG° é a energia associada a uma reação em que as concentrações aquosas são 1M, o pH é 7 e a temperatura é de 37ºC. A hibridização de oligonucleotídeos com um ácido nucleico alvo é uma reação espontânea e para reações espontâneas ΔG° é menor que zero. O ΔG° pode ser medido experimentalmente, por exemplo, pelo uso do método de calorimetria de titulação isotérmica (ITC), tal como se encontra descrito em Hansen et al., 1965, Chem. Comm. 36–38 e Holdgate et al., 2005, Drug Discov Today. A pessoa versada na técnica saberá que o equipamento comercial encontra-se disponível para medições de ΔG°. O ΔG° também pode ser estimado numericamente usando-se o modelo de vizinho mais próximo, conforme descrito por SantaLucia, 1998, Proc Natl Acad Sci USA. 95: 1460-1465, usando-se parâmetros termodinâmicos derivados de maneira apropriada, descritos por Sugimoto et al., 1995, Biochemistry 34: 11211-11216 e McTigue et al., 2004, Biochemistry 43: 5388-
5405. Para se ter a possibilidade de modular seu alvo de ácido nucleico pretendido por hibridização, os oligonucleotídeos da presente invenção hibridizam com um ácido nucleico alvo com valores estimados de ΔG° abaixo de -10 kcal para oligonucleotídeos que são compreendidos por 10-30 nucleotídeos de comprimento. De acordo com algumas concretizações, o grau ou a força da hibridização é medido pelo estado padrão da energia livre de Gibbs ΔG°. Os oligonucleotídeos podem hibridizar com um ácido nucleico alvo com valores estimados de ΔG° abaixo da faixa de -10 kcal, tal como abaixo de -15 kcal, tal como abaixo de -20 kcal e abaixo de -25 kcal para oligonucleotídeos com 8 a 30 nucleotídeos de comprimento. De acordo com algumas concretizações ou oligonucleotídeos, são hibridizados com um ácido nucleico alvo tal com um valor estimado de ΔG° de -10 a -60 kcal, tal como -12 a -40, tal como de -15 a -30 kcal ou de 16 a 27 kcal, tal como -18 a -25 kcal. Sequência Alvo
[00116] O oligonucleotídeo compreende uma região nucleotídica contígua que é complementar ou hibridiza com uma sub-sequência da molécula de ácido nucleico alvo. O termo "sequência alvo", conforme utilizado no presente caso, refere-se a uma sequência de nucleotídeos presentes no ácido nucleico alvo que compreende a sequência de nucleobases que é complementar a uma região de nucleotídeos contíguos ou sequência de um oligonucleotídeo da invenção. De acordo com algumas concretizações, a sequência alvo consiste em uma região no ácido nucleico alvo que é complementar a uma região de nucleotídeos contíguos ou sequência do oligonucleotídeo da invenção. De acordo com algumas concretizações, a sequência alvo é mais longa do que a sequência complementar de um único oligonucleotídeo e pode, por exemplo, representar uma região preferida do ácido nucleico alvo que pode ser direcionada por vários oligonucleotídeos da invenção.
[00117] O oligonucleotídeo da invenção compreende uma região de nucleotídeos contíguos que é complementar ao ácido nucleico alvo, tal como uma sequência visada.
[00118] O oligonucleotídeo compreende uma região nucleotídica contígua de pelo menos 10 nucleotídeos que é complementar ou hibridiza com uma sequência alvo presente na molécula de ácido nucleico alvo. Uma região de nucleotídeos contíguos (e, portanto, a sequência alvo) compreende pelo menos 10 nucleotídeos contíguos, tais como 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, nucleotídeos contíguos, tal como a partir de 12-22, tal como de 14 a 18 nucleotídeos contíguos.
[00119] De acordo com algumas concretizações a sequência alvo está presente dentro de uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste das SEQ ID NO 113, 114, 115, 116, 117 e 118. Célula Alvo
[00120] Da forma que é utilizado no presente caso, o termo célula alvo refere-se a uma célula que está expressando o ácido nucleico alvo. De acordo com algumas concretizações, a célula alvo pode ser in vivo ou in vitro. De acordo com algumas concretizações, a célula alvo é uma célula de mamífero, tal como uma célula de primata, tal como uma célula de macaco ou uma célula humana. De acordo com algumas concretizações, a célula alvo pode ser compreendida por uma célula da retina, tal como uma célula do epitélio pigmentar da retina (PRE). De acordo com algumas concretizações, a célula é selecionada a partir do grupo que consiste em células RPE, célula bipolar, células “amacrinas”, células endoteliais, células ganglionares e células Microglia. Para avaliação in vitro, a célula alvo pode ser uma célula primária ou uma linha celular estabelecida, tais como U251, ARPE19. Ácido nucleico alvo
[00121] De acordo com a presente invenção, o ácido nucleico alvo é compreendido por um ácido nucleico que codifica HTRA1 de mamífero e pode, por exemplo, ser um gene, um RNA, um mRNA e um pré-mRNA, um mRNA maduro ou uma sequência de cDNA. Por essa razão, o alvo pode ser referido como um ácido nucleico alvo do HTRA1.
[00122] Adequadamente, o ácido nucleico alvo codifica uma proteína HTRA1, em particular o HTRA1 de mamífero, como o HTRA1 humano (veja, por exemplo, as tabelas 1 e 2 que fornecem as seqüências de mRNA e pré-mRNA para HTRA1 humano e de rato).
[00123] De acordo com algumas concretizações, o ácido nucleico alvo é selecionado a partir do grupo que consiste de SEQ ID NO: 1, 2, 3, e 4, de suas variantes que ocorrem naturalmente (por exemplo, as sequências que codificam uma proteína TRA1 de mamífero.
[00124] Uma célula alvo é uma célula que está expressando o ácido nucleico alvo HTRA1. De acordo com concretizações preferidas, o ácido nucleico alvo é compreendido pelo mRNA de HTRA1, tal como o pré-mRNA de HTRA1 ou o mRNA maduro de HTRA1. A cauda poli A do mRNA de HTRA1 é tipicamente desconsiderada para o direcionamento de oligonucleotídeo anti-sentido.
[00125] Se empregar o oligonucleotídeo da invenção em pesquisa ou diagnóstico, o ácido nucleico alvo pode ser um cDNA ou um ácido nucleico sintético derivado de DNA ou RNA.
[00126] A sequência alvo pode ser compreendida por uma subsequências do ácido nucleico visado. De acordo com algumas concretizações o oligonucleotídeo ou região de nucleotídeos contiguo us é plenamente complementar, ou compreende apenas uma ou duas incompatibilidades com uma sub-sequência HTRA1, tal como uma sequência selecionada no grupo que consiste da SEQ ID NO 113, 114, 115, 116, 117 ou
231.
[00127] A sequência alvo pode ser compreendida por uma subseqüência do ácido nucleico alvo. De acordo com algumas concretizações o oligonucleotídeo ou região de nucleotídeos contíguos é plenamente complementar, ou apenas compreende uma ou duas incompatibilidades para uma subseqüência HTRA1, tal como uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste da SEQ ID NO 124 – 230. De acordo com algumas concretizações o oligonucleotídeo ou região nucleotídica contígua é plenamente complementar ou compreende apenas uma ou duas incompatibilidades com uma sub-sequência HTRA1 SEQ ID NO 231.
[00128] A complementaridade com o alvo ou sua sub-sequência é medida ao longo do comprimento do oligonucleotídeo ou região nucleotídica contígua do mesmo.
[00129] Para aplicação in vivo ou in vitro, o oligonucleotídeo da invenção é tipicamente capaz de inibir a expressão do ácido nucleico alço HTRA1 em uma célula que é expressora do ácido nucleico alvo HTRA1. A sequência contígua de nucleobases do oligonucleotídeo da invenção é tipicamente complementar ao ácido nucleico alvo do HTRA1, medido ao longo do comprimento do oligonucleotídeo, opcionalmente com exceção de uma ou duas incompatibilidades, e opcionalmente excluindo regiões de ligação baseadas em nucleotídeos que podem ligar o oligonucleotídeo a um grupo funcional opcional, tal como um conjugado ou outros nucleotídeos terminais não complementares (por exemplo, região D). O ácido nucleico alvo pode ser, de acordo com algumas concretizações, compreendido por um RNA ou DNA, tal como um RNA mensageiro, tal como um mRNA maduro ou um pré-mRNA.
De acordo com algumas concretizações, o ácido nucleico alvo é um RNA ou DNA que codifica a proteína HTRA1 de mamífero, tal como HTRA1 humano, por exemplo, a sequência de mRNA de HTRA1 humana, como aquela exposta como SEQ ID NO 1 (NM_002775.4, GI: 190014575). Informação complementar sobre os ações nucleicos alvo está proporcionada nas tabelas 1 & 2. Tabela 1. Informações sobre o genoma e a montagem de HTRA1 humanos e de Cyno Espé- Chr Fia- Coordenadas Montagem Sequência de cie . da Genômicas referência Início NCBI * número Fim de acesso para o mRNA Humana 10 fwd 1224615 1225149 GRCh38.p2, NM_002775.4 25 08 liberação 107 Cyno 9 fwd 1217649 1218175 Macaca_fascic NC_022280.1** 94 18 ularis_5.0 Fwd = fiada para a frente.
As coordenadas do genoma proporcionam a sequência pré-mRNA (sequência genômica). A referência NCBI proporciona a sequência de mRNA (sequência de cDNA).
[00130] *O banco de dados de seqüências de referência do National Center for Biotechnology Information é um conjunto abrangente, integrado, não redundante e bem anotado de sequências de referência, incluindo genômica, transcrição e proteína. Está hospedado em www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq.
[00131] ** Na sequência de referência NCBI, há um trecho de 100 nucleotídeos da posição 126 para a posição 227 cuja identidade não é conhecida. Nas SEQ ID NO 3 e 4, esse trecho foi substituído pelos nucleotídeos que aparecem nas sequências de pré-RNA de HTRA1 humana e mulatta mulaca de Macaca nessa região. Tabela 2. Detalhes de sequência para HTRA1 humano e Cyno. Espécie Tipo de RNA Comprimento SEQ ID NO (nt) Humana mRNA 2138 1 Humana premRNA 53384 2 Cyno mRNA 2123 3 Cyno premRNA 52575 4 Variante de ocorrência natural
[00132] O termo "variante de ocorrência natural" refere-se a variantes do gene ou transcritos HTRA1 que se originam a partir dos mesmos locais genéticos que o ácido nucleico alvo, mas podem diferir, por exemplo, em virtude da degeneração do código genético, causando uma multiplicidade de códons que codificam o mesmo aminoácido, ou devido ao emendado (splicing) alternativo do pré-mRNA ou à presença de polimorfismos, tais como polimorfismos de nucleotídeo único e variantes alélicas. Com base na presença da sequência complementar suficiente para o oligonucleotídeo, o oligonucleotídeo da invenção pode, por essa razão, ter como alvo o ácido nucleico alvo e suas variantes que ocorrem naturalmente. De acordo com algumas concretizações, as variantes que ocorrem naturalmente têm pelo menos 95%, como pelo menos 98% ou 99%, de homologia com um ácido nucleico alvo de HTRA1 de mamífero, tal como um ácido nucleico alvo selecionado a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NO 1, 2, 3 ou 4. Modulação de expressão
[00133] O termo "modulação da expressão", conforme utilizado no presente caso deve ser entendido como um termo geral para a capacidade de um oligonucleotídeo de alterar a quantidade de HTRA1 quando comparado à quantidade de HTRA1 antes da administração do oligonucleotídeo. Alternativamente, a modulação da expressão pode ser determinada por referência a uma experiência de controle em que o oligonucleotídeo da invenção não é administrado. Um tipo de modulação consiste na capacidade de um oligonucleotídeo inibir, regular, reduzir, suprimir, remover, parar, bloquear, impedir, diminuir, evitar ou terminar a expressão de HTRA1, por exemplo, por meio de degradação do mRNA ou bloqueio da transcrição. O oligonucleotídeo anti-sentido da invenção é capaz de inibir, regular, reduzir, suprimir, remover, parar, bloquear, impedir, diminuir, evitar ou encerrar a expressão de HTRA1. Nucleotídeos modificados de alta afinidade
[00134] Um nucleosídeo modificado de alta afinidade é um nucleotídeo modificado que, quando acrescentado ao oligonucleotídeo, aumenta a afinidade do oligonucleotídeo para seu alvo complementar, por exemplo, medido pela temperatura de fusão (Tm). Um nucleosídeo modificado de alta afinidade da presente invenção resulta preferencialmente em um aumento na temperatura de fusão entre +0,5 a + 12ºC, com maior preferência entre +1,5 e + 10ºC e com maior preferência entre +3 a + 8ºC por nucleosídeo modificado. Numerosos nucleosídeos modificados de alta afinidade são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, muitos nucleosídeos substituídos em 2', bem como ácidos nucleicos bloqueados (LNA) (vide, por exemplo, Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 e Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3 (2), 293-213). Modificações de açúcar
[00135] O oligômero da presente invenção pode compreender um ou mais nucleosídeos que são dotados de uma porção de açúcar modificada, isto é, uma modificação da porção de açúcar quando comparada à porção de açúcar ribose encontrada no DNA e no RNA.
[00136] Proporcionaram-se numerosos nucleosídeos com modificação da porção de açúcar ribose, principalmente com o objetivo de aperfeiçoar determinadas propriedades dos oligonucleotídeos, tais como afinidade e/ou resistência à nuclease.
[00137] Essas modificações incluem aquelas em que a estrutura do anel ribose é modificada, por exemplo, por substituição por um anel de hexose (HNA) ou um anel bicíclico, que normalmente é dotado de uma ponte de birradícula entre os carbonos C2 e C4 no anel ribose (LNA)
ou um anel ribose não-ligado que normalmente não é dotado de uma ligação entre os carbonos C2 e C3 (por exemplo, UNA). Outros nucleosídeos modificados com açúcar incluem, por exemplo, ácidos nucleicos de biciclo-hexose (WO2011/017521) ou ácidos nucleicos tricíclicos (WO2013/154798). Os nucleosídeos modificados também incluem nucleosídeos onde a porção de açúcar é substituída por uma porção que não seja de açúcar, por exemplo, no caso de ácidos nucleicos peptídicos (PNA) ou ácidos nucleicos de morfolino.
[00138] As modificações de açúcar também incluem modificações feitas através da alteração dos grupos substituintes no anel da ribose para outros grupos que não o hidrogênio ou o grupo 2’-OH encontrado naturalmente nos nucleosídeos de DNA e RNA. Substituintes podem, por exemplo, ser introduzidos nas posições 2', 3', 4’ 'ou 5'. Nucleosídeos com porções de açúcar modificadas também incluem 2 'nucleosídeos modificados, como 2' nucleosídeos substituídos. De fato, muito foco foi gasto no desenvolvimento de nucleosídeos substituídos em 2’ e vários nucleosídeos substituídos em 2' foram encontrados com propriedades benéficas quando incluídos em oligonucleotídeos, tais como resistência a nucleosídeos e afinidade aumentadas. Nucleosídeos 2’ modificados.
[00139] Um nucleosídeo modificado por açúcar 2 'é um nucleosídeo que possui um substituinte diferente de H ou –OH na posição 2' (nucleosídeo substituído 2') ou compreende uma birradícula ligada a 2' e inclui nucleosídeos substituídos em 2 'e LNA (2' -Nucleosídeos em ponte de birradícula 4 '). Por exemplo, o açúcar 2' modificado pode proporcionar afinidade de ligação aperfeiçoada e/ou resistência à nuclease aumentada para o oligonucleotídeo. Exemplos de nucleosídeos modificados substituídos em 2’ são nucleosídeo 2'-O-alquila-RNA, 2'-O- metil-RNA, 2'-alcoxi-RNA, 2'-O-metoxietil-RNA (MOE), 2'- amino- DNA, 2'-Fluoro-RNA e 2'-F-ANA. Para mais exemplos, vide, por exemplo, Freier e Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 e Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3 (2), 293-213 e Deleavey e Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937. Em seguida estão expostas ilustrações de alguns nucleosídeos modificados substituídos em 2'.
Nucleosídeos de ácidos nucléicos bloqueados (LNA).
[00140] Os nucleosídeos LNA são nucleosídeos modificados que compreendem um grupo ligante (referido como uma birradícula ou uma ponte) entre C2’ e C4' do anel de açúcar ribose de um nucleotídeo. Estes nucleosídeos também são denominados na literatura de ácido nucleico em ponte ou ácido nucleico bicíclico (BNA). De acordo com algumas concretizações, o nucleosídeo modificado ou os nucleosídeos LNA do oligômero da invenção é dotado de uma estrutura geral da fórmula I ou II: or beta-D alfa-L Fórmula I Formula II em que W é selecionado a partir de -O-, -S-, -N(Ra)-, - C(RaRb)-, tais como, de acordo com algumas concretizações – O-; B designa uma porção de nucleobase; Z designa uma ligação de internucleosídeos a um nucleosídeo adjacente, ou um grupo terminal 5'; Z* designa um acoplamento internucleosídeos para um nucleosídeo adjacente, ou um grupo terminal 3'; X designa um grupo selecionado a partir da lista que consiste de -C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -O-, - Si(Ra)2-, -S-, -SO2-, -N(Ra)-, e >C=Z.
[00141] De acordo com algumas concretizações, X é selecionado a partir do grupo que consiste de: –O-, -S-, NH-, NRaRb, -CH2-, CRaRb, -C(=CH2)-, e -C(=CRaRb)-.
[00142] De acordo com algumas concretizações, X é compreendido por -O-
Y designa um grupo selecionado a partir do grupo que consiste de -C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -O-, - a a Si(R )2-, -S-, -SO2-, -N(R )-, e >C=Z.
[00143] De acordo com algumas concretizações, Y é selecionado a partir do grupo que consiste de: –CH2-, - C(RaRb)-, –CH2CH2-, -C(RaRb)-C(RaRb)-, –CH2CH2CH2-, - C(RaRb)C(RaRb)C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Rb)-, e -C(Ra)=N-.
[00144] De acordo com algumas concretizações, Y é selecionado a partir do grupo que consiste de: -CH2-, - CHRa-, -CHCH3-, CRaRb- ou -X-Y- em conjunto designam um grupo de ligação bivalente (também referido como uma radícula) que consiste de 1, 2, ou 3 grupos/átomos selecionados a partir do grupo que consiste de -C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -O-, - Si(Ra)2-, -S-, -SO2-, -N(Ra)-, e >C=Z,
[00145] De acordo com algumas concretizações, - X-Y- designa uma birradícula selecionada a partir dos grupos que consistem de: -X-CH2-, -X-CRaRb-, -X-CHRa-, -X- C(HCH3)-, -O-Y-, -O-CH2-, -S-CH2-, -NH-CH2-, -O-CHCH3-, -CH2- O-CH2, -O-CH(CH3CH3)-, -O-CH2-CH2-, OCH2-CH2-CH2-,-O-CH2OCH2-, -O-NCH2-, -C(=CH2)-CH2-, -NRa-CH2-, N-O-CH2, -S-CRaRb- e -S- CHRa-.
[00146] De acordo com algumas concretizações – X-Y- designa –O-CH2- ou –O-CH(CH3)-, em que Z é selecionado a partir de -O-, -S-, e -N(Ra)-, e Ra e, quando presente Rb, cada um é selecionado independentemente a partir de hidrogênio, C1-6-alquila opcionalmente substituído, C2-6-alquenila opcionalmente substituído, C2-6-alquinila opcionalmente substituído, hidroxi, C1-6-alcoxi opcionalmente substituído, C2-6-
alcoxialquila, C2-6-alqueniloxi, carboxi, C1-6- alcoxicarbonil, C1-6-alquilcarbonil, formil, aril, ariloxi- carbonil, ariloxi, arilcarbonil, heteroaril, heteroariloxi- carbonil, heteroariloxi, heteroarilcarbonil, amino, mono- e di(C1-6-alquil) amino, carbamoil, mono- e di(C1-6-alquila)- amino-carbonil, amino-C1-6-alquila -aminocarbonil, mono- e di(C1-6-alquila) amino-C1-6-alquila -aminocarbonil, C1-6- alquila -carbonilamino, carbamido, C1-6-alcanoiloxi, sulfono, C1-6-alquilsulfoniloxi, nitro, azido, sulfanil, C1- 6-alquila tioquiltio halogênio, onde aril e heteroaril podem ser opcionalmente substituídos e onde dois substituintes geminais Ra e Rb juntos podem designar metileno opcionalmente substituído (= CH2), em que para todos os centros quirais, grupos assimétricos podem ser encontrados na orientação R ou S. em que R1, R2, R3, R5 e R5* são selecionados independentemente a partir do grupo que consiste de: hidrogênio, C1-6-alquila opcionalmente substituído, C2-6- alquenila opcionalmente substituído, C2-6-alquinil opcionalmente substituído, hidroxi, C1-6-alcoxi, C2-6- alcoxialquila, C2-6-alqueniloxi, carboxi, C1-6- alcoxicarbonil, C1-6-alquilcarbonil, formil, aril, ariloxi - carbonil, ariloxi, arilcarbonil, heteroaril, heteroariloxi- carbonil, heteroariloxi, heteroarilcarbonil, amino, mono- e di(C1-6-alquila) amino, carbamoil, mono- e di(C1-6-alquila)- amino-carbonil, amino-C1-6-alquila -aminocarbonil, mono- e di(C1-6-alquila) amino-C1-6-alquila -aminocarbonil, C1-6- alquila -carbonilamino, carbamido, C1-6-alcanoiloxi, sulfono, C1-6-alquilsulfoniloxi, nitro, azido, sulfanil, C1- 6-alquiltio, halogênio, onde aril e heteroarila podem ser opcionalmente substituídos, e onde dois substituintes geminais em conjunto podem designar oxo, tioxo, imino, ou metileno opcionalmente substituído.
[00147] De acordo com algumas concretizações R1, R2, R3, R5 e R5* são selecionados independentemente a partir de C1-6 alquila, tais como metil, e hidrogênio.
[00148] De acordo com algumas concretizações R1, R2, R3, R5 e R5* são todos eles hidrogênio.
[00149] De acordo com algumas concretizações R1, R2, R3, são todos eles hidrogênio, e cada um de R5 e R5* é compreendido também por hidrogênio e o outro de R5 e R5*é compreendido por outro diferente de hidrogênio, tal como C1-6 alquila, tal como metil.
[00150] De acordo com algumas concretizações, Ra é compreendido por hidrogênio ou metil. De acordo com algumas concretizações, quando presente, Rb é compreendido por hidrogênio ou metil.
[00151] De acordo com algumas concretizações, um ou os dois de Ra e Rb é compreendido por hidrogênio.
[00152] De acordo com algumas concretizações, um de Ra e Rb é compreendido por hidrogênio e o outro é compreendido por outro que não seja hidrogênio.
[00153] De acordo com algumas concretizações, a b um de R e R é compreendido por metil e o outro é compreendido por hidrogênio.
[00154] De acordo com algumas concretizações, os dois de Ra e Rb são compreendidos por metil.
[00155] De acordo com algumas concretizações, a birradícula –X-Y- é compreendido por –O-CH2-, W é O e todos os R1, R2, R3, R5 e R5 * são todos eles hidrogênio. Tais nucleosídeos de LNA encontram-se expostos nos documentos WO99/014226, WO00/66604, WO98/039352 e WO2004/046160, que são todos aqui incluídos por referência e incluem o que é comumente conhecido como nucleosídeos LNA beta-D-oxi e LNA alfa-L-oxi.
[00156] De acordo com algumas concretizações, a birradícula –X-Y- é compreendida por –S-CH2-, W é compreendido por O, e todos de R1, R2, R3, R5 e R5* são todos compreendidos por hidrogênio. Esses nucleosídeos tio LNA encontram-se expostos nos documentos WO99/014226 e WO2004/046160 os quais são incluídos no presente caso por referência.
[00157] De acordo com algumas concretizações, a birradícula –X-Y- é compreendida por –NH-CH2-, W é compreendido por O, e todos de R1, R2, R3, R5 e R5* são todos eles compreendidos por hidrogênio. Esses nucleosídeos de amino LNA encontram-se expostos nos documentos WO99/014226 e WO2004/046160 os quais são incluídos no presente caso por referência.
[00158] De acordo com algumas concretizações, a birradícula –X-Y- é compreendida por –O-CH2-CH2- ou –O-CH2- CH2- CH2-, W is O, e todos de R1, R2, R3, R5 e R5* são todos eles compreendidos por hidrogênio. Esses nucleosídeos de LNA encontram-se expostos nos documentos WO00/047599 e Morita et al, Bioorganic & Med.Chem. Lett. 12 73-76, os quais são incluídos no presente caso por referência, e incluem os que são comumente conhecidos como ácidos nucleicos em ponte com 2’-O-4’C-etileno (ENA).
[00159] De acordo com algumas concretizações, a birradícula –X-Y- é compreendida por –O-CH2-, W é compreendido por O, e todos de R1, R2, R3, e um de R5 e R5* é compreendido por hidrogênio, e o outro de R5 e R5* é compreendido por outro que não seja hidrogênio tais como C1-6 alquila, tal como metil. Esses nucleosídeos LNA substituídos em 5 'encontram-se expostos no documento WO2007/134181, o qual fica incluído no presente caso por referência.
[00160] De acordo com algumas concretizações, a birradícula –X-Y- é compreendida por –O-CRaRb-, em que um ou ambos Ra e Rb são diferentes de hidrogênio, como metil, W é O, e todos R1, R2, R3 e um de R5 e R5 * são compreendidos por hidrogênio e o outro de R5 e R5 * é outro que não seja hidrogênio tal como alquila C1-6, tal como metil. Esses nucleosídeos de LNA bis modificados encontram- se expostos no documento WO2010/077578 o qual é incluído no presente caso por referência.
[00161] De acordo com algumas concretizações, a birradícula –X-Y- designa o grupo ligante bivalente –O-CH (CH2OCH3) - (ácido nucleico 2 'O-metoxietil biciclico - Seth et al., 2010, J. Org. Chem. Vol. 75 (5) pp. 1569-81). De acordo com algumas concretizações, a birradícula –XY- designa o grupo ligante bivalente –O-CH (CH2CH3) - (ácido nucleico bicíclico 2'O-etílico - Seth et al., 2010, J. Org. Chem. Vol. 75 ( 5) pp. 1569-81). De acordo com algumas concretizações, a birradícula –X-Y- é –O-CHRa-, W é O e todos os R1, R2, R3, R5 e R5* são todos hidrogênio. Tais nucleosídeos de LNA substituídos em 6 encontram-se expostos nos documentos WO10036698 e WO07090071 os quais são incluídos no presente caso por referência.
[00162] De acordo com algumas concretizações, a birradícula –X-Y- é compreendida por –O-CH(CH2OCH3)-, W é compreendido por O, e todos de R1, R2, R3, R5 e R5* são compreendidos por hidrogênio. Esses nucleosídeos de LNA também são conhecidos como MOEs cíclico na técnica (cMOE) e encontram-se expostos no documento WO07090071.
[00163] De acordo com algumas concretizações, a birradícula –X-Y- designa o grupo de ligação bivalente –O- CH (CH3) -. - na configuração R ou S. De acordo com algumas concretizações, a birradícula –X-Y- designa em conjunto o grupo de ligação bivalente –O-CH2-O-CH2- (Seth et al., 2010, J. Org. Chem). De acordo com algumas concretizações, a birradícula –X-Y- é –O-CH (CH3)-, W é O e todos os R1, R2, R3, R5 e R5 * são todos compreendidos por hidrogênio. Esses nucleosídeos de metil LNA 6 'também são conhecidos como nucleosídeos cET na técnica e podem ser estereoisômeros (S) cET ou (R) cET, tal como se encontra exposto nos documentos WO07090071 (beta-D) e WO2010 / 036698 (alfa-L) os quais são incluídos no presente caso por referência.
[00164] De acordo com algumas concretizações, a birradícula –X-Y- é compreendida por –O-CRaRb-, em que nem Ra ou Rb é hidrogênio, W é compreendido por O e todos os R1, R2, R3, R5 e R5 * são todos eles compreendidos por hidrogênio. De acordo com algumas concretizações, Ra e Rb são os dois compreendidos por metil. Esses nucleosídeos LNA bi-substituídos em 6’ encontram-se expostos no documento WO 2009006478, o qual é incluído no presente caso por referência.
[00165] De acordo com algumas concretizações, a birradícula –X-Y- é compreendida por –S-CHRa-, W é compreendido por O, e todos os R1, R2, R3, R5 e R5* são todos eles hidrogênio. Esses nucleosídeos de tio LNA substituídos em 6’ encontram-se expostos no documento WO11156202 o qual fica incluído no presente caso por referência. Em algumas concretizações de tio LNA substituídas em 6', Ra é compreendido por metil .
[00166] De acordo com algumas concretizações, a birradícula –X-Y- é compreendida por –C(=CH2)-C(RaRb)-, tal como –C(=CH2)-CH2- , ou –C(=CH2)-CH(CH3)-W é compreendido por O, e todos de R1, R2, R3, R5 e R5* são compreendidos por hidrogênio. Esses nucleosídeos de vinil carbo LNA encontram-se expostos nos documentos WO08154401 e WO09067647 os quais são incluídos no presente caso por referência.
[00167] De acordo com algumas concretizações a birradícula –X-Y- é compreendida por –N(-ORa)-, W é compreendido por O, e todos de R1, R2, R3, R5 e R5* são compreendidos por hidrogênio. De acordo com algumas concretizações Ra é compreendido por C1-6 alquila tal como metil. Esses nucleosídeos de LNA são também conhecidos como LNAs substituídos por N e encontram=se expostos no documento WO2008/150729, que fica incluído por referência no presente caso. De acordo com algumas concretizações, uma birradícula –X-Y- designa em conjunto o grupo de ligação bivalente –O-NRa-CH3- (Seth et al., 2010, J. Org. Chem). De acordo com algumas concretizações de birradícula –X-Y- é –N (Ra) -, W é compreendido por O, e todos os R1, R2, R3, R5 e R5 * são todos eles hidrogênio. De acordo com algumas concretizações, Ra é alquila C1-6, tal como metil.
[00168] De acordo com algumas concretizações,
um ou ambos de R5 e R5* é hidrogênio e, quando substituído, o outro de R5 e R5 * é alquila C1-6, tal como metil. Em tal concretização, R1, R2, R3, podem ser todos eles compreendidos por hidrogênio, e uma birradícula –X-Y- pode ser selecionada a partir de –O-CH2- ou –O-C (HCRa)-, tal como –O-C (HCH3.
[00169] De acordo com algumas concretizações, uma birradícula é compreendida por –CRaRb-O-CRaRb-, tais como CH2-O-CH2-, W is O e todos de R1, R2, R3, R5 e R5* são todos eles compreendidos por hidrogênio. De acordo com algumas concretizações Ra é compreendido por C1-6 alquila tal como metil. Esses nucleosídeos de LNA são conhecidos como nucleosídeos restringidos de forma conformacional (CRNs) e encontram-se expostos no documento WO2013036868 o qual fica incluído no presente caso por referência.
[00170] De acordo com algumas concretizações, a birradícula é compreendida por –O-CRaRb-O-CRaRb-, tal como O-CH2-O-CH2-, W é compreendido por O e todos de R1, R2, R3, R5 e R5* são todos eles compreendidos por hidrogênio. De acordo com algumas concretizações Ra é compreendido por C1-6 alquila tal como metil. Esses nucleosídeos LNA também são conhecidos como nucleotídeos COC e encontram-se expostos em Mitsuoka et al., Nucleic Acids Research 2009 37(4), 1225- 1238, o qual fica incluído no presente caso por referência.
[00171] Será reconhecido que, a não ser que especificado, os nucleosídeos LNA podem estar no estéreo formato beta-D ou alfa-L.
[00172] Exemplos de nucleosídeos LNA são apresentados no Esquema 1.
Esquema 1
[00173] Tal como se encontram ilustrado nos exemplos, de acordo com algumas concretizações da invenção os nucleosídeos do LNA nos oligonucleotídeos são compreendidos por nucleosídeos beta-D-oxi-LNA.
Degradação mediada por nuclease
[00174] A degradação mediada por nuclease refere-se a um oligonucleotídeo capaz de mediar a degradação de uma sequência nucleotídica complementar ao formar um duplex com essa sequência.
[00175] De acordo com algumas concretizações, o oligonucleotídeo pode funcionar via degradação mediada por nuclease do ácido nucleico alvo, onde os oligonucleotídeos da invenção são capazes de recrutar uma nuclease, com particularidade a endonuclease, de preferência a endoribonuclease (RNase), tal como a RNase H. Exemplos de projetos de oligonucleotídeos que operam via mecanismos mediados pela nuclease são oligonucleotídeos que compreendem tipicamente uma região de pelo menos 5 ou 6 nucleosídeos de DNA e são flanqueados de um lado ou de ambos os lados por nucleosídeos que aumentam a afinidade, por exemplo, espaçâmeros, “headmers” e “tailmers”. Atividade e Recrutamento de RNase H
[00176] A atividade da RNase H de um oligonucleotídeo anti-sentido refere-se à sua capacidade de recrutar a RNase H quando em um duplex com uma molécula de RNA complementar. O documento WO01/23613 proporciona métodos in vitro para se determinar a atividade da RNaseH, que pode ser usada para se determinar a capacidade de recrutar a RNaseH. Tipicamente, um oligonucleotídeo é considerado capaz de recrutar RNase H se, quando proporcionado com uma sequência alvo complementar de ácido nucleico, tiver uma taxa inicial, medida em pmol/l/min., de pelo menos 5%, tal como pelo menos 10% ou mais de 20% da taxa inicial determinada ao usar-se um oligonucleotídeo com a mesma sequência de bases que o oligonucleotídeo modificado que está sendo testado, mas que contém apenas monômeros de DNA, com ligações de fosforotioato entre todos os monômeros no oligonucleotídeo e usando-se a metodologia proporcionada pelo Exemplos 91 - 95 do documento WO01/23613 (incluído por referência no presente caso). Espaçâmero
[00177] Da forma que é utilizado no presente caso, o termo espaçâmero refere-se a um oligonucleotídeo anti-sentido que compreende uma região de oligonucleotídeos de recrutamento da RNase H (lacuna) que é flanqueada 5’ e 3' por regiões que compreendem um ou mais nucleosídeos modificados que aumentam a afinidade (flancos ou asas). Vários projetos de espaçâmero são descritos no presente caso. Cabeçâmeros e “tailmers” são oligonucleotídeos capazes de recrutar RNase H onde um dos flancos está ausente, isto é, apenas uma das extremidades do oligonucleotídeo compreende nucleosídeos modificados que aumentam a afinidade. Para cabeçâmeros, o flanco 3 'está ausente (ou seja, o flanco 5' compreende nucleosídeos modificados para melhorar a afinidade) e, para “tailmers”, o flanco 5 'está ausente (ou seja, o flanco 3' compreende nucleosídeos modificados para aumentar a afinidade). Espaçâmero de LNA
[00178] O termo espaçâmero de LNA é um oligonucleotídeo de espaçâmero em que pelo menos um dos nucleosídeos modificados para aumentar a afinidade é compreendido por um nucleosídeo de LNA. De acordo com algumas concretizações, o (s) nucleosídeo (s) LNA em um espaçâmero de LNA são compreendidos por nucleosídeos LNA beta-D-oxi e/ou nucleosídeos LNA 6'metil beta-D-oxi (tais como nucleosídeos (S)cET).
Espaçâmero Asa Mista
[00179] O termo espaçâmero de asa mista refere- se a um espaçâmero de LNA em que as regiões do flanco compreendem pelo menos um nucleosídeo de LNA e pelo menos um nucleosídeo não modificado por LNA, tal como pelo menos um nucleosídeo de DNA ou pelo menos um nucleosídeo modificado substituído 2', como, por exemplo, 2'-O-alquil- RNA, 2'-O-metil-RNA, 2'-alcoxi-RNA, 2'-O-metoxietil-RNA (MOE), 2'-amino-DNA, 2'- Fluoro-RNA e 2'-F-ANA nucleosídeo (s). De acordo com algumas concretizações, o espaçâmero de asa mista é dotado de um flanco que compreende nucleosídeos LNA (por exemplo, 5' ou 3') e o outro flanco (3' ou 5' respectivamente) compreende 2' nucleosídeo modificado substituído(s). De acordo com algumas concretizações o(s) nucleosídeo(s) LNA em um espaçâmero de asa mista são nucleosídeos LNA beta-D-oxi e/ou nucleosídeos L'6-beta-D- oxi LNA (tais como nucleosídeos (S)cET). Conjugado
[00180] Da forma que é utilizado no presente caso, o termo conjugado refere-se a um oligonucleotídeo que está ligado de forma covalente a uma porção não nucleotídica (porção conjugada ou região C ou terceira região).
[00181] De acordo com algumas concretizações, a fração não nucleotídica selecionada a partir do grupo que consiste de uma proteína, tal como uma enzima, um anticorpo ou um fragmento de anticorpo ou um peptídeo; uma porção lipofílica tal como um lipídeo, um fosfolípido, um esterol; um polímero, tal como polietilenoglicol ou polipropileno glicol; um ligando receptor; uma pequena molécula; uma molécula repórter; e um carboidrato não nucleosídico.. Ligantes
[00182] Uma ligação ou ligante é uma conexão entre dois átomos que liga um grupo químico ou segmento de interesse a outro grupo químico ou segmento de interesse por meio de uma ou mais ligações covalentes. As porções conjugadas podem ser ligadas ao oligonucleotídeo diretamente ou através de uma porção de ligação (por exemplo, ligante ou amarra). Os ligantes servem para conectar covalentemente uma terceira região, por exemplo, uma porção conjugada com um oligonucleotídeo (por exemplo, os terminais da região A ou C).
[00183] De acordo com algumas concretizações da invenção o conjugado ou conjugado de oligonucleotídeo da invenção pode, compreender opcionalmente uma região de ligação que está posicionada entre o oligonucleotídeo e a fração conjugada. De acordo com algumas concretizações, o ligante entre o conjugado e o oligonucleotídeo é suscetível de ser bioclivado.
[00184] Ligantes biocliváveis que compreendem ou consistem em uma ligação fisiologicamente lábil que é clivável sob condições normalmente encontradas ou análogas às encontradas dentro de um corpo de mamífero. As condições sob as quais os ligantes fisiologicamente instáveis sofrem transformação química (por exemplo, clivagem) incluem condições químicas tais como pH, temperatura, condições ou agentes oxidativos ou redutores e concentração de sal encontrada ou análoga à encontrada nas células de mamíferos. As condições intracelulares de mamíferos também incluem a presença de atividade enzimática normalmente presente em uma célula de mamífero, tal como a partir de enzimas proteolíticas ou enzimas hidrolíticas ou nucleases. De acordo com uma concretização, o ligante bioclivável é suscetível à clivagem de nuclease S1. de acordo com uma concretização preferida, o ligante suscetível a nuclease compreende entre 1 e 10 nucleosídeos, tais como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 nucleosídeos, mais preferencialmente entre 2 e 6 nucleosídeos e com maior preferência entre 2 e 4 nucleosídeos ligados que compreendem pelo menos duas ligações fosfodiéster consecutivas, tais como pelo menos 3 ou 4 ou 5 ligações fosfodiéster consecutivas. Preferencialmente, os nucleosídeos são DNA ou RNA. Fosfodiéster contendo ligantes biocliváveis são descritos de forma mais detalhada no documento WO 2014/076195 (incluído no presente caso por referência) e podem ser referidos no presente caso como região D.
[00185] Os conjugados também podem ser ligados ao oligonucleotídeo por meio de ligantes não biocliváveis ou, de acordo com algumas concretizações, o conjugado pode compreender um agente de ligação não clivável que é ligado de forma covalente ao agente de ligação bioclivável. Tem agentes de ligação que não são necessariamente biocliváveis, mas servem principalmente para conectar de forma covalente uma porção conjugada a um oligonucleotídeo ou agente de ligação bioclivável. Tais ligantes podem compreender uma estrutura de cadeia ou um oligômero de unidades de repetição, tais como etileno glicol, unidades de aminoácidos ou grupos amino alquila. De acordo com algumas concretizações, o agente de ligação (região Y) é um amino alquila, tal como um grupo amino alquila C2-C36, incluindo, por exemplo, grupos amino alquila C6 a C12. De acordo com algumas concretizações, o agente de ligação (região Y) é compreendido por um grupo amino alquila C6. Grupos de agentes de ligação conjugados podem ser rotineiramente ligados a um oligonucleotídeo através do uso de um oligonucleotídeo modificado em amino e um grupo éster ativado no grupo conjugado. Tratamento
[00186] Da forma que é utilizado no presente caso, o termo ’tratamento’ refere-se tanto ao tratamento de uma enfermidade existente (por exemplo, uma enfermidade ou distúrbio tal como se encontra mencionado no presente caso), ou prevenção de uma enfermidade, ou seja, profilaxia. Por essa razão será compreendido que tratamento tal como referido neste contexto pode, de acordo com algumas concretizações, ser profilático.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Os oligonucleotídeos da invenção
[00187] A invenção refere-se a oligonucleotídeos capazes de inibir a expressão de HTRA1. A modulação pode ser alcançada por meio de hibridação com um ácido nucleico alvo que codifica HTRA1 ou que está envolvido na regulação de HTRA1. O ácido nucleico alvo pode ser uma sequência de HTRA 1 de mamífero, tal como uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste da SEQ ID 1, 2, 3 ou 4.
[00188] O oligonucleotídeo da invenção é compreendido por um oligonucleotídeo anti-sentido que é direcionado a um HTRA1, tal como um HTRA1 humano.
[00189] De acordo com algumas concretizações o oligonucleotídeo anti-sentido da invenção é capaz de modular a expressão do alvo inibindo ou sub-regulando o mesmo. De preferência, essa modulação produz uma inibição da expressão de pelo menos 20% em comparação com o nível de expressão normal do alvo, tal como pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% de inibição em comparação com o nível de expressão normal do alvo. De acordo com algumas concretizações, os compostos da invenção podem ser capazes de inibir os níveis de expressão do mRNA de HTRA1 em pelo menos 60% ou 70% in vitro usando-se células ARPE-19. De acordo com algumas concretizações, os compostos da invenção podem ser capazes de inibir os níveis de expressão do mRNA de HTRA1 em pelo menos 60% ou 70% in vitro usando células ARPE-19. De acordo com algumas concretizações os compostos da invenção podem ser capazes de inibir os níveis de expressão da proteína HTRA1 em pelo menos 50% in vitro mediante utilização de células ARPE-19. Adequadamente, os exemplos proporcionam ensaios que podem ser utilizados para medir a inibição de RNA ou proteína HTRA1. A modulação alvo é desencadeada por meio da hibridação entre uma sequência nucleotídica contígua do oligonucleotídeo e o ácido nucleico alvo. De acordo com algumas concretizações o oligonucleotídeo da invenção compreende incompatibilidades entre o oligonucleotídeo e o ácido nucleico alvo. Apesar das incompatibilidades, a hibridação com o ácido nucleico alvo ainda pode ser suficiente para mostrar uma modulação desejada da expressão de HTRA1. A afinidade de ligação reduzida resultante de incompatibilidades pode ser vantajosamente compensada pelo aumento do número de nucleotídeos no oligonucleotídeo e/ou um número aumentado de nucleosídeos modificados capazes de aumentar a afinidade de ligação ao alvo, tais como nucleosídeos modificados em 2', incluindo LNA, presentes dentro de sequência oligonucleotídica.
[00190] Um aspecto da presente invenção refere- se a um oligonucleotídeo anti-sentido que compreende uma região nucleotídica contígua de 10 a 30 nucleotídeos de comprimento com pelo menos 90% de complementaridade com a sequência alvo HTRA1, tal como totalmente complementar a uma sequência alvo HTRA1, por exemplo, um ácido nucleico selecionado a partir do grupo que consiste da SEQ ID NO 1, 2, 3 e 4.
[00191] De acordo com algumas concretizações, o oligonucleotídeo compreende uma sequência contígua que é pelo menos 90% complementar, tal como pelo menos 91%, tal como pelo menos 92%, tal como pelo menos 93%, tal como pelo menos 93%, tal como pelo menos 94%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98% ou 100% complementar com uma região do ácido nucleico alvo.
[00192] De acordo com algumas concretizações, o oligonucleotídeo da invenção, ou uma sequência nucleotídica contígua da mesma é totalmente complementar (100% complementar) a uma região do ácido nucleico alvo, ou de acordo com algumas concretizações pode compreender uma ou duas incompatibilidades entre o oligonucleotídeo e o ácido nucleico alvo.
[00193] De acordo com algumas concretizações o oligonucleotídeo, ou uma sequência nucleotídica contígua de pelo menos 12 nucleotídeos do mesmo, é pelo menos 90% complementar, tal como totalmente (ou 100%) complementar a uma região de uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste da SEQ ID NO 119, 120, 121, 122 ou 123.
[00194] De acordo com algumas concretizações o oligonucleotídeo, ou uma sequência nucleotídica contígua de pelo menos 12 nucleotídeos do mesmo, é pelo menos 90% complementar, tal como totalmente (ou 100%) complementar a uma região de uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs 124 a 230.
[00195] De acordo com algumas concretizações o oligonucleotídeo, ou uma sequência nucleotídica contígua de pelo menos 12 nucleotídeos do mesmo, é pelo menos 90% complementar, tal como totalmente (ou 100%) complementar a uma região da SEQ ID NO 186.
[00196] De acordo com algumas concretizações o oligonucleotídeo, ou uma sequência nucleotídica contígua de pelo menos 12 nucleotídeos deste, é pelo menos 90% complementar, tal como totalmente (ou 100%) complementar a uma região da SEQ ID NO 192.
[00197] De acordo com algumas concretizações o oligonucleotídeo, ou uma sequência nucleotídica contígua de pelo menos 12 nucleotídeos do mesmo, é pelo menos 90% complementar, tal como totalmente (ou 100%) complementar a uma região da SEQ ID NO 205.
[00198] De acordo com algumas concretizações o oligonucleotídeo, ou uma sequência nucleotídica contígua de pelo menos 13 nucleotídeos do mesmo, é pelo menos 90%
complementar, tal como totalmente (ou 100%) complementar a uma região da SEQ ID NO 186.
[00199] De acordo com algumas concretizações o oligonucleotídeo, ou uma sequência nucleotídica contígua de pelo menos 13 nucleotídeos do mesmo, é pelo menos 90% complementar, tal como totalmente (ou 100%) complementar a uma região da SEQ ID NO 192.
[00200] De acordo com algumas concretizações o oligonucleotídeo, ou uma sequência nucleotídica contígua de pelo menos 13 nucleotídeos do mesmo, é pelo menos 90% complementar, tal como totalmente (ou 100%) complementar a uma região da SEQ ID NO 205.
[00201] De acordo com algumas concretizações o oligonucleotídeo, ou uma sequência nucleotídica contígua de pelo menos 14 nucleotídeos, é totalmente (ou 100%) complementar a uma sequência selecionada do grupo que consiste da SEQ ID NO 113, 114, 115, 116, 117 e 231.
[00202] De acordo com algumas concretizações o oligonucleotídeo, ou uma sequência nucleotídica contígua de pelo menos 14 nucleotídeos dos mesmos, é pelo menos 90% complementar, tal como totalmente (ou 100%) complementar a uma região da SEQ ID NO 186.
[00203] De acordo com algumas concretizações o oligonucleotídeo, ou uma sequência nucleotídica contígua de pelo menos 14 nucleotídeos dos mesmos, é pelo menos 90% complementar, tal como totalmente (ou 100%) complementar a uma região da SEQ ID NO 192.
[00204] De acordo com algumas concretizações o oligonucleotídeo, ou uma sequência nucleotídica contígua de pelo menos 14 nucleotídeos deste, é pelo menos 90%
complementar, tal como plenamente (ou 100%) complementar a uma região da SEQ ID NO 205.
[00205] De acordo com algumas concretizações o oligonucleotídeo, ou uma sequência nucleotídica contígua de pelo menos 15 nucleotídeos deste, é pelo menos 90% complementar, tal como plenamente (ou 100%) complementar a uma região da SEQ ID NO 186.
[00206] De acordo com algumas concretizações o oligonucleotídeo, ou uma sequência nucleotídica contígua de pelo menos 15 nucleotídeos deste, é pelo menos 90% complementar, tal como plenamente (ou 100%) complementar a uma região da SEQ ID NO 192.
[00207] De acordo com algumas concretizações o oligonucleotídeo, ou uma sequência nucleotídica contígua de pelo menos 15 nucleotídeos deste, é pelo menos 90% complementar, tal como plenamente (ou 100%) complementar a uma região da SEQ ID NO 205.
[00208] De acordo com algumas concretizações o oligonucleotídeo, ou uma sequência nucleotídica contígua de pelo menos 16 nucleotídeos do mesmo, é totalmente (ou 100%) complementar a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste da SEQ ID NO SEQ ID NO 113, 114, 115, 116, 117 e 231.
[00209] De acordo com algumas concretizações o oligonucleotídeo, ou uma sequência nucleotídica contígua de pelo menos 16 nucleotídeos do mesmo, é pelo menos 90% complementar, tal como totalmente (ou 100%) complementar a uma região da SEQ ID NO 186.
[00210] De acordo com algumas concretizações o oligonucleotídeo, ou uma sequência nucleotídica contígua de pelo menos 16, tais como 16, 17 ou 18 nucleotídeos, é pelo menos 90% complementar, tal como totalmente (ou 100%) complementar a uma região da SEQ ID NO 192.
[00211] O acordo com algumas concretizações de oligonucleotídeo, ou uma sequência nucleotídica contígua de pelo menos 16 nucleotídeos, é pelo menos 90% complementar, como totalmente (ou 100%) complementar a uma região da SEQ ID NO 205.
[00212] De acordo com algumas concretizações o oligonucleotídeo, ou sua região nucleotídica contígua é totalmente (ou 100%) complementar a uma sequência selecionada no grupo que consiste em uma sequência selecionada no grupo que consiste da SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO 113, 114, 115, 116, 117 e 231.
[00213] De acordo com algumas concretizações o oligonucleotídeo, ou sua região nucleotídica contígua é totalmente (ou 100%) complementar a uma sequência selecionada no grupo que consiste em uma sequência selecionada no grupo que consiste da SEQ ID NO 124 - 230.
[00214] De acordo com algumas concretizações o oligonucleotídeo, ou sua região nucleotídica contígua é totalmente (ou 100%) complementar à SEQ ID NO 186.
[00215] De acordo com algumas concretizações o oligonucleotídeo, ou sua região nucleotídica contígua é totalmente (ou 100%) complementar à SEQ ID NO 192.
[00216] De acordo com algumas concretizações o oligonucleotídeo, ou sua região nucleotídica contígua é totalmente (ou 100%) complementar à SEQ ID NO 205.
[00217] Entende-se que as sequências de motivo oligonucleotídeo podem ser modificadas para, por exemplo,
aumentar a resistência à nuclease e/ou a afinidade de ligação ao ácido nucleico alvo. As modificações são descritas nas definições e na seção "Traçado de oligonucleotídeos".
[00218] De acordo com algumas concretizações, o oligonucleotídeo da invenção, ou sua região nucleotídica contígua é totalmente complementar (100% complementar) a uma região do ácido nucleico alvo, ou de acordo com algumas concretizações pode compreender uma ou duas incompatibilidades entre o oligonucleotídeo e o ácido nucleico alvo. O acordo com algumas concretizações do oligonucleotídeo, ou sequência nucleotídica contígua de pelo menos 12 nucleotídeos, é pelo menos 90% complementar, tal como totalmente (ou 100%) complementar à sequência de ácido nucleico alvo.
[00219] De acordo com algumas concretizações o oligonucleotídeo, ou uma sequência nucleotídica contígua de pelo menos 12 nucleotídeos, possui 100% de identidade com uma sequência selecionada do grupo que consiste da SEQ ID NOs 5 – 111.
[00220] De acordo com algumas concretizações o oligonucleotídeo, ou uma sequência nucleotídica contígua de pelo menos 14 nucleotídeos, possui 100% de identidade com uma sequência selecionada do grupo que consiste da SEQ ID NOs 5 – 111.
[00221] De acordo com algumas concretizações o oligonucleotídeo, ou uma sequência nucleotídica contígua de pelo menos 16 nucleotídeos, possui 100% de identidade com uma sequência selecionada do grupo que consiste da SEQ ID NOs 5 – 111
[00222] De acordo com algumas concretizações o oligonucleotídeo, ou região nucleotídica contígua do mesmo, compreende ou consiste em uma sequência selecionada a partir da SEQ ID NOs 5 – 111.
[00223] De acordo com algumas concretizações o oligonucleotídeo da invenção é selecionado a partir do seguinte grupo (Observe que a sub-sequência alvo é o complemento inverso do motivo do oligonucleotídeo): Sub-sequência Sub-sequência alvo SEQ ID
SEQ ID NO Concepção Composta Motivo alvo agttaaaggaggagac AGTTaaaggaggagacAA 124 atttgtctcctcct 5 aaat AT ttaact tcagttaaaggaggag TCAgttaaaggaggagaC 125 ttgtctcctccttt 6 acaa AA aactga ctcagttaaaggagga CTCagttaaaggaggaga 126 tgtctcctccttta 7 gaca CA actgag ctcagttaaaggagga CTCagttaaaggaggaGA gtctcctcctttaa 127 8 gac C ctgag actcagttaaaggagg ACTCagttaaaggaggag gtctcctcctttaa 128 9 agac AC ctgagt actcagttaaaggagg ACTCagttaaaggaggaG tctcctcctttaac 129 10 aga A tgagt actcagttaaaggagg ctcctcctttaact 130 11 ag ACtcagttaaaggaGGAG gagt gatgactcagttaaag GAtgactcagttaaaggA cctcctttaactga 131 12 gagg GG gtcatc atgatgactcagttaa ATGAtgactcagttaaag tcctttaactgagt 132 13 agga GA catcat tgatgactcagttaaa cctttaactgagtc 133 14 gg TGAtgactcagttaAAGG atca gatgatgactcagtta GAtgatgactcagttaAA cctttaactgagtc 134 15 aagg GG atcatc gatgatgactcagtta GATGatgactcagttaAA ctttaactgagtca 135 16 aag G tcatc tatcgactgcattagt TATcgactgcattagttG ccaactaatgcagt 136 17 tgg G cgata gtatcgactgcattag Gtatcgactgcattagtt ccaactaatgcagt 137 18 ttgg GG cgatac caactaatgcagtc 138 19 tcgactgcattagttg TCGactgcattagTTG ga 138 caactaatgcagtc 19 tcgactgcattagttg TCGactgcattagtTG ga 138 caactaatgcagtc 19 tcgactgcattagttg TCGActgcattaGTTG ga tatcgactgcattagt 139 caactaatgcagtc 20 tg TAtcgactgcattaGTTG gata gtatcgactgcattag GTAtcgactgcattagtT 140 caactaatgcagtc 21 ttg G gatac tgtatcgactgcatta TGtatcgactgcattagt 141 caactaatgcagtc 22 gttg TG gataca 142 aactaatgcagtcg 23 atcgactgcattagtt ATCgactgcattaGTT at 142 aactaatgcagtcg 23 atcgactgcattagtt ATCGactgcattAGTT at 23 atcgactgcattagtt ATCGactgcattaGTT 142 aactaatgcagtcg at tatcgactgcattagt 143 aactaatgcagtcg 24 t TATCgactgcattaGTT ata gtatcgactgcattag 144 aactaatgcagtcg 25 tt GTATcgactgcattagTT atac tgtatcgactgcatta TGTatcgactgcattagT 145 aactaatgcagtcg 26 gtt T ataca ttgtatcgactgcatt TTGtatcgactgcattag 146 aactaatgcagtcg 27 agtt TT atacaa 147 actaatgcagtcga 28 tatcgactgcattagt TATcgactgcattaGT ta 147 actaatgcagtcga 28 tatcgactgcattagt TATCgactgcatTAGT ta gtatcgactgcattag 148 actaatgcagtcga 29 t GTATcgactgcattaGT tac tgtatcgactgcatta 149 actaatgcagtcga 30 gt TGTatcgactgcattaGT taca 150 ctaatgcagtcgat 31 gtatcgactgcattag GTAtcgactgcatTAG ac 150 ctaatgcagtcgat 31 gtatcgactgcattag GTAtcgactgcattAG ac 150 ctaatgcagtcgat 31 gtatcgactgcattag GTATcgactgcaTTAG ac tgtatcgactgcatta 151 ctaatgcagtcgat 32 g TGtatcgactgcaTTAG aca ttgtatcgactgcatt 152 ctaatgcagtcgat 33 ag TTGtatcgactgcatTAG acaa attgtatcgactgcat ATtgtatcgactgcaTTA 153 ctaatgcagtcgat 34 tag G acaat
154 taatgcagtcgata 35 tgtatcgactgcatta TGTatcgactgcaTTA ca 154 taatgcagtcgata 35 tgtatcgactgcatta TGTAtcgactgcATTA ca attgtatcgactgcat 155 taatgcagtcgata 36 ta ATTGtatcgactgcaTTA caat 156 aatgcagtcgatac 37 ttgtatcgactgcatt TTGtatcgactgcaTT aa 156 aatgcagtcgatac 37 ttgtatcgactgcatt TTGtatcgactgCATT aa 157 atgcagtcgataca 38 attgtatcgactgcat ATTgtatcgactgCAT at 157 atgcagtcgataca 38 attgtatcgactgcat ATTgtatcgactgcAT at 157 atgcagtcgataca 38 attgtatcgactgcat ATTGtatcgactGCAT at 158 agtcgatacaatgc 39 acgcattgtatcgact ACGcattgtatcgACT gt 158 agtcgatacaatgc 39 acgcattgtatcgact ACGCattgtatcGACT gt 159 gtcgatacaatgcg 40 tacgcattgtatcgac TACgcattgtatcGAC ta 159 gtcgatacaatgcg 40 tacgcattgtatcgac TACGcattgtatCGAC ta ctacgcattgtatcga 160 gtcgatacaatgcg 41 c CTacgcattgtatCGAC tag tctacgcattgtatcg 161 gtcgatacaatgcg 42 ac TCTAcgcattgtatcgAC taga 43 atctacgcattgtatc ATCtacgcattgtatcgA 162 gtcgatacaatgcg gac C tagat tatctacgcattgtat TAtctacgcattgtatcG 163 gtcgatacaatgcg 44 cgac AC tagata 164 tcgatacaatgcgt 45 ctacgcattgtatcga CTAcgcattgtatCGA ag 164 tcgatacaatgcgt 45 ctacgcattgtatcga CTACgcattgtaTCGA ag tatctacgcattgtat TAtctacgcattgtatCG 165 tcgatacaatgcgt 46 cga A agata 166 cgatacaatgcgta 47 tctacgcattgtatcg TCTacgcattgtaTCG ga 166 cgatacaatgcgta 47 tctacgcattgtatcg TCTacgcattgtatCG ga 166 cgatacaatgcgta 47 tctacgcattgtatcg TCTAcgcattgtATCG ga atctacgcattgtatc 167 cgatacaatgcgta 48 g ATCTacgcattgtaTCG gat tatctacgcattgtat 168 cgatacaatgcgta 49 cg TATCtacgcattgtatCG gata tctatctacgcattgt TCtatctacgcattgtat 169 cgatacaatgcgta 50 atcg CG gataga 170 gatacaatgcgtag 51 atctacgcattgtatc ATCtacgcattgtATC at 170 gatacaatgcgtag 51 atctacgcattgtatc ATCTacgcattgTATC at tatctacgcattgtat 171 gatacaatgcgtag 52 c TATctacgcattgTATC ata ctatctacgcattgta 172 gatacaatgcgtag 53 tc CTatctacgcattgTATC atag tctatctacgcattgt TCTatctacgcattgtaT 173 gatacaatgcgtag 54 atc C ataga ttctatctacgcattg TTCtatctacgcattgta 174 gatacaatgcgtag 55 tatc TC atagaa 175 atacaatgcgtaga 56 tatctacgcattgtat TATctacgcattgTAT ta 175 atacaatgcgtaga 56 tatctacgcattgtat TATCtacgcattGTAT ta ctatctacgcattgta 176 atacaatgcgtaga 57 t CTAtctacgcattGTAT tag tctatctacgcattgt 177 atacaatgcgtaga 58 at TCtatctacgcattGTAT taga ttctatctacgcattg TTCtatctacgcattgTA 178 atacaatgcgtaga 59 tat T tagaa 179 tacaatgcgtagat 60 ctatctacgcattgta CTAtctacgcattGTA ag 179 tacaatgcgtagat 60 ctatctacgcattgta CTATctacgcatTGTA ag tctatctacgcattgt 180 tacaatgcgtagat 61 a TCTatctacgcattGTA aga ttctatctacgcattg 181 tacaatgcgtagat 62 ta TTCtatctacgcattGTA agaa ttctatctacgcattg 182 acaatgcgtagata 63 t TTCtatctacgcatTGT gaa tcttctatctacgcat TCttctatctacgcattG 183 acaatgcgtagata 64 tgt T gaaga ttcttctatctacgca Ttcttctatctacgcatt 184 acaatgcgtagata 65 ttgt GT gaagaa 66 ttcttctatctacgca TTCttctatctacgcatT 185 caatgcgtagatag ttg G aagaa caatgcgtagatag 186 67 ttctatctacgcattg TTCtatctacgcaTTG aa aatgcgtagataga 187 68 cttctatctacgcatt CTTCtatctacgCATT ag tcttctatctacgcat aatgcgtagataga 188 69 t TCTtctatctacgCATT aga ttcttctatctacgca aatgcgtagataga 189 70 tt TTCTtctatctacgcATT agaa atgcgtagatagaa 190 71 tcttctatctacgcat TCTTctatctacgCAT ga ttcttctatctacgca atgcgtagatagaa 191 72 t TTCTtctatctacgCAT gaa cttcttctatctacgc atgcgtagatagaa 192 73 at CTTCttctatctacgcAT gaag tgcgtagatagaag 193 74 ttcttctatctacgca TTCttctatctacGCA aa cttcttctatctacgc tgcgtagatagaag 194 75 a CTTCttctatctacgCA aag gcttcttctatctacg tgcgtagatagaag 195 76 ca GcttcttctatctacgCA aagc gcgtagatagaaga 196 77 cttcttctatctacgc CTtcttctatctACGC ag cgtagatagaagaa 197 78 gcttcttctatctacg GCTtcttctatctACG gc tagaagaagcccca 198 79 cgtggggcttcttcta CGTggggcttcttCTA cg tgacttggagaaaagc TGacttggagaaaagcac ttgtgcttttctcc 199 80 acaa AA aagtca ctgacttggagaaaag CtgacttggagaaaagcA gtgcttttctccaa 200 81 cac C gtcag ggagcacgatgact 201 82 agagtcatcgtgctcc AGAgtcatcgtgcTCC ct aagtactttaatagct AAGTactttaatagctCA tttgagctattaaa 202 83 caaa AA gtactt aagtactttaatagct AAGTactttaatagcTCA ttgagctattaaag 203 84 caa A tactt gaagtactttaatagc GAAGtactttaatagctC ttgagctattaaag 204 85 tcaa AA tacttc ttgagctattaaag 205 86 tactttaatagctcaa TACTttaatagcTCAA ta aagtactttaatagct tgagctattaaagt 206 87 ca AAGTactttaatagcTCA actt gaagtactttaatagc GAAGtactttaatagcTC tgagctattaaagt 207 88 tca A acttc agaagtactttaatag AGAAgtactttaatagCT gagctattaaagta 208 89 ctc C cttct aagaagtactttaata AAGAagtactttaatagC gagctattaaagta 209 90 gctc TC cttctt gaagtactttaatagc agctattaaagtac 210 91 t GAAGtactttaatAGCT ttc taagaagtactttaat TAAgaagtactttaatAG agctattaaagtac 211 92 agct CT ttctta agaagtactttaatag gctattaaagtact 212 93 c AGAAgtactttaaTAGC tct taagaagtactttaat TAAGaagtactttaaTAG gctattaaagtact 213 94 agc C tctta 95 gtaagaagtactttaa GTaagaagtactttaaTA 214 gctattaaagtact tagc GC tcttac taagaagtactttaat ctattaaagtactt 215 96 ag TAAGaagtactttaATAG ctta gtaagaagtactttaa GTAAgaagtactttaATA ctattaaagtactt 216 97 tag G cttac tgtaagaagtacttta TGTAagaagtactttaAT ctattaaagtactt 217 98 atag AG cttaca aatgtgtaagaagtac AATGtgtaagaagtaCTT aaagtacttcttac 218 99 ttt T acatt caatgtgtaagaagta CAATgtgtaagaagtaCT aaagtacttcttac 219 100 cttt TT acattg atgtgtaagaagtact aagtacttcttaca 220 101 t ATGTgtaagaagtACTT cat aatgtgtaagaagtac aagtacttcttaca 221 102 tt AATGtgtaagaagtACTT catt caatgtgtaagaagta CAATgtgtaagaagtACT aagtacttcttaca 222 103 ctt T cattg gcaatgtgtaagaagt GCaatgtgtaagaagtAC aagtacttcttaca 223 104 actt TT cattgc agtacttcttacac 224 105 atgtgtaagaagtact ATGtgtaagaagtACT at agtacttcttacac 224 105 atgtgtaagaagtact ATGTgtaagaagTACT at gcaatgtgtaagaagt GCAAtgtgtaagaagtAC agtacttcttacac 225 106 act T attgc gtacttcttacaca 226 107 aatgtgtaagaagtac AATGtgtaagaaGTAC tt gtacttcttacaca 226 107 aatgtgtaagaagtac AATgtgtaagaaGTAC tt caatgtgtaagaagta gtacttcttacaca 227 108 c CAATgtgtaagaaGTAC ttg gcaatgtgtaagaagt gtacttcttacaca 228 109 ac GCAatgtgtaagaaGTAC ttgc tacttcttacacat 229 110 caatgtgtaagaagta CAAtgtgtaagaaGTA tg tacttcttacacat 229 110 caatgtgtaagaagta CAAtgtgtaagaAGTA tg tacttcttacacat 229 110 caatgtgtaagaagta CAATgtgtaagaAGTA tg gcaatgtgtaagaagt tacttcttacacat 230 111 a GCAatgtgtaagaAGTA tgc ou conjugado do mesmo; em que para a coluna designada composto, letras maiúsculas são nucleosídeos LNA, letras minúsculas são nucleosídeos DNA, nucleosídeos citosina são opcionalmente 5 metil citosina e ligações internucleosídeos são pelo menos 80%, como pelo menos 90% ou 100% ligações internucleosídeos modificadas, como ligações internucleosídeos de fosforotioato. De acordo com algumas concretizações, todas as ligações internucleosídicas dos compostos na coluna de traçado de compostos na tabela acima são ligações internucleosídicas de fosforotioato. As sequências de sub-sequência motivo e alvo são sequências de nucleobases.
[00224] A invenção proporciona os seguintes oligonucleotídeos:
CMP ID NO
Composto 5,1 AGTTaaaggaggagacAAAT 6,1 TCAgttaaaggaggagaCAA 7,1 CTCagttaaaggaggagaCA 8,1 CTCagttaaaggaggaGAC 9,1 ACTCagttaaaggaggagAC 10,1 ACTCagttaaaggaggaGA 11,1 ACtcagttaaaggaGGAG 12,1 GAtgactcagttaaaggAGG 13,1 ATGAtgactcagttaaagGA 14,1 TGAtgactcagttaAAGG 15,1 GAtgatgactcagttaAAGG 16,1 GATGatgactcagttaAAG 17,1 TATmcgactgcattagttGG 18,1 GtatmcgactgcattagttGG 19,1 TCGactgcattagTTG 19,2 TCGactgcattagtTG 19,3 TCGActgcattaGTTG 20,1 TAtmcgactgcattaGTTG 21,1 GTAtmcgactgcattagtTG 22,1 TGtatmcgactgcattagtTG 23,1 ATCgactgcattaGTT 23,2 ATCGactgcattAGTT 23,3 ATCGactgcattaGTT
24,1 TATCgactgcattaGTT 25,1 GTATmcgactgcattagTT 26,1 TGTatmcgactgcattagTT 27,1 TTGtatmcgactgcattagTT 28,1 TATmcgactgcattaGT 28,2 TATCgactgcatTAGT 29,1 GTATmcgactgcattaGT 30,1 TGTatmcgactgcattaGT 31,1 GTAtmcgactgcatTAG 31,2 GTAtmcgactgcattAG 31,3 GTATmcgactgcaTTAG 32,1 TGtatmcgactgcaTTAG 33,1 TTGtatmcgactgcatTAG 34,1 ATtgtatmcgactgcaTTAG 35,1 TGTatmcgactgcaTTA 35,2 TGTAtmcgactgcATTA 36,1 ATTGtatmcgactgcaTTA 37,1 TTGtatmcgactgcaTT 37,2 TTGtatmcgactgCATT 38,1 ATTgtatmcgactgCAT 38,2 ATTgtatmcgactgcAT 38,3 ATTGtatmcgactGCAT 39,1 ACGcattgtatmcgACT 39,2 ACGCattgtatmcGACT 40,1 TACgcattgtatmcGAC 40,2 TACGcattgtatCGAC 41,1 CTamcgcattgtatCGAC 42,1 TCTAmcgcattgtatmcgAC 43,1 ATCtamcgcattgtatmcgAC
44,1 TAtctamcgcattgtatcGAC 45,1 CTAmcgcattgtatCGA 45,2 CTACgcattgtaTCGA 46,1 TAtctamcgcattgtatCGA 47,1 TCTamcgcattgtaTCG 47,2 TCTamcgcattgtatCG 47,3 TCTAmcgcattgtATCG 48,1 ATCTamcgcattgtaTCG 49,1 TATCtamcgcattgtatCG 50,1 TCtatctamcgcattgtatCG 51,1 ATCtamcgcattgtATC 51,2 ATCTamcgcattgTATC 52,1 TATctamcgcattgTATC 53,1 CTatctamcgcattgTATC 54,1 TCTatctamcgcattgtaTC 55,1 TTCtatctamcgcattgtaTC 56,1 TATctamcgcattgTAT 56,2 TATCtamcgcattGTAT 57,1 CTAtctamcgcattGTAT 58,1 TCtatctamcgcattGTAT 59,1 TTCtatctamcgcattgTAT 60,1 CTAtctamcgcattGTA 60,2 CTATctamcgcatTGTA 61,1 TCTatctamcgcattGTA 62,1 TTCtatctamcgcattGTA 63,1 TTCtatctamcgcatTGT 64,1 TCttctatctamcgcattGT 65,1 TtcttctatctamcgcattGT 66,1 TTCttctatctamcgcatTG
67,1 TTCtatctamcgcaTTG 68,1 CTTCtatctamcgCATT 69,1 TCTtctatctamcgCATT 70,1 TTCTtctatctamcgcATT 71,1 TCTTctatctamcgCAT 72,1 TTCTtctatctamcgCAT 73,1 CTTCttctatctamcgcAT 74,1 TTCttctatctacGCA 75,1 CTTCttctatctamcgCA 76,1 GcttcttctatctamcgCA 77,1 CTtcttctatctACGC 78,1 GCTtcttctatctACG 79,1 CGTggggcttcttCTA 80,1 TGacttggagaaaagcacAA 81,1 CtgacttggagaaaagcAC 82,1 AGAgtcatmcgtgcTCC 83,1 AAGTactttaatagctCAAA 84,1 AAGTactttaatagcTCAA 85,1 GAAGtactttaatagctCAA 86,1 TACTttaatagcTCAA 87,1 AAGTactttaatagcTCA 88,1 GAAGtactttaatagcTCA 89,1 AGAAgtactttaatagCTC 90,1 AAGAagtactttaatagCTC 91,1 GAAGtactttaatAGCT 92,1 TAAgaagtactttaatAGCT 93,1 AGAAgtactttaaTAGC 94,1 TAAGaagtactttaaTAGC 95,1 GTaagaagtactttaaTAGC
96,1 TAAGaagtactttaATAG 97,1 GTAAgaagtactttaATAG 98,1 TGTAagaagtactttaATAG 99,1 AATGtgtaagaagtaCTTT 100,1 CAATgtgtaagaagtaCTTT 101,1 ATGTgtaagaagtACTT 102,1 AATGtgtaagaagtACTT 103,1 CAATgtgtaagaagtACTT 104,1 GCaatgtgtaagaagtACTT 105,1 ATGtgtaagaagtACT 105,2 ATGTgtaagaagTACT 106,1 GCAAtgtgtaagaagtACT 107,1 AATGtgtaagaaGTAC 107,2 AATgtgtaagaaGTAC 108,1 CAATgtgtaagaaGTAC 109,1 GCAatgtgtaagaaGTAC 110,1 CAAtgtgtaagaaGTA 110,2 CAAtgtgtaagaAGTA 110,3 CAATgtgtaagaAGTA 111,1 GCAatgtgtaagaAGTA ou um seu conjugado; em que nos compostos da tabela acima, as letras maiúsculas representam nucleosídeos LNA beta-D- oxi, todas as citosinas LNA são 5-metil citosina (como indicado pelo sobrescrito m), as letras minúsculas representam nucleosídeos de DNA, sobrescrito m antes de uma letra minúscula c representa um nucleosídeo de DNA de 5 metil citosina.
Todas as ligações internucleosídeos são ligações internucleosídeos fosforotioato.
Traçado de oligonucleotídeo
[00225] O traçado de oligonucleotídeo refere-se ao padrão de modificações de açúcar nucleosídico na sequência do oligonucleotídeo. Os oligonucleotídeos da invenção compreendem nucleosídeos modificados por açúcar e também podem compreender nucleosídeos de DNA ou RNA. De acordo com algumas concretizações, o oligonucleotídeo compreende nucleosídeos modificados por açúcar e nucleosídeos de DNA. A inclusão de nucleosídeos modificados no oligonucleotídeo da invenção pode aumentar a afinidade do oligonucleotídeo para o ácido nucleico alvo. Nesse caso, os nucleosídeos modificados podem ser referidos como nucleotídeos modificados que aumentam a afinidade.
[00226] De acordo com uma concretização, o oligonucleotídeo compreende pelo menos 1 nucleosídeo modificado, tal como pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15 ou pelo menos 16 nucleosídeos modificados. De acordo com uma concretização o oligonucleotídeo compreende de 1 a 10 nucleosídeos modificados, tais como de 2 a 9 nucleosídeos modificados, tais como de 3 a 8 nucleosídeos modificados, tais como de 4 a 7 nucleosídeos modificados, tais como 6 ou 7 nucleosídeos modificados. De acordo com uma concretização, o oligonucleotídeo da invenção pode compreender modificações que são selecionadas independentemente a partir desses três tipos de modificações (açúcar modificado, nucleobase modificada e ligação internucleosídica modificada) ou uma combinação dos mesmos. De preferência o oligonucleotídeo compreende um ou mais nucleosídeos modificados com açúcar, tais como nucleosídeos modificados com açúcar 2'. De preferência, o oligonucleotídeo da invenção compreende o um ou mais nucleosídeos modificados com açúcar 2', selecionados independentemente a partir do grupo que consiste em 2'-O- alquila -RNA, 2'-O-metil-RNA, 2'-alcoxi-RNA, 2’-O- metoxietil-RNA, 2'-amino-DNA, 2'-fluoro-DNA, ácido nucleico arabino (ANA), 2'-fluoro-ANA e nucleosídeos LNA. Ainda com maior preferência, o um ou mais nucleosídeos modificados é (são) compreendido(s) por LNA.
[00227] De acordo com algumas concretizações, pelo menos 1 dos nucleosídeos modificados é compreendido por um ácido nucleico bloqueado (LNA), tais como pelo menos 2, tais como pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7 ou pelo menos 8 dos nucleosídeos modificados são compreendidos por LNA. Ainda de acordo com uma concretização adicional, todos os nucleosídeos modificados são compreendidos por LNA.
[00228] De acordo com outra concretização o oligonucleotídeo compreende pelo menos uma ligação internucleosídeos modificada. De acordo com uma concretização preferida, as ligações internucleosídicas na sequência nucleotídica contígua são ligações internucleosídicas de fosforotioato ou boranofosfato. De acordo com algumas concretizações, todas as ligações internucleotídicas na sequência contígua do oligonucleotídeo são ligações fosforotioato.
[00229] De acordo com algumas concretizações, o oligonucleotídeo da invenção compreende pelo menos um nucleosídeo modificado que é compreendido por um 2’-MOE- RNA, tais como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou 10 unidades de nucleosídeos de 2'-MOE-RNA. De acordo com algumas concretizações, pelo menos um dos ditos nucleosídeos modificados é compreendido por 2’-fluoro DNA, tais como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 unidades de nucleosídeos de 2’- fluoro-DNA.
[00230] De acordo com algumas concretizações, o oligonucleotídeo da invenção compreende pelo menos uma unidade de LNA, tais como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou 8 unidades de LNA, tais como a partir de 2 a 6 unidades de LNA, tais como a partir de 3 a 7 unidades de LNA, 4 a 8 unidades de LNA ou 3, 4, 5, 6 ou 7 unidades de LNA. De acordo com algumas concretizações, todos os nucleosídeos modificados são compreendidos por nucleosídeos de LNA. De acordo com algumas concretizações, todas as unidades de citosina de LNA são compreendidas por 5-metil-citosina. De acordo com algumas concretizações, o oligonucleotídeo ou região nucleotídica contígua do mesmo é dotado de pelo menos 1 unidade de LNA na extremidade 5' e pelo menos 2 unidades de LNA na extremidade 3' da sequência nucleotídica. De acordo com algumas concretizações, todas as nucleobases de citosina presentes no oligonucleotídeo da invenção são compreendidas por 5-metil-citosina.
[00231] De acordo com algumas concretizações, o oligonucleotídeo da invenção compreende pelo menos uma unidade de LNA e pelo menos um nucleosídeo modificado 2’ substituído.
[00232] De acordo com algumas concretizações da invenção, o oligonucleotídeo compreende os dois, os nucleosídeos modificados por açúcar 2’ e as unidades de DNA.
[00233] De acordo com uma concretização da invenção o oligonucleotídeo da invenção é capaz de recrutar RNase H.
[00234] De acordo com algumas concretizações, o oligonucleotídeo da invenção ou sua região nucleotídica contígua é compreendido por um oligonucleotídeo de espaçâmeros. Traçado de espaçâmero
[00235] De acordo com algumas concretizações o oligonucleotídeo da invenção, ou a sua região nucleotídica contígua, é dotado de um traçado de espaçâmero ou estrutura também chamada simplesmente de “espaçâmero”. Em uma estrutura de espaçâmero o oligonucleotídeo compreende pelo menos três regiões estruturais distintas, um flanco 5’, um espaço e um flanco 3', F-G-F 'na orientação '5 -> 3’. Nesse traçado, as regiões de flanqueio F e ‘ (também denominadas regiões de asa) compreendem pelo menos um nucleosídeo modificado por açúcar que fica adjacente à região G e pode, de acordo com algumas concretizações, compreender um trecho contíguo de 2 - 7 nucleosídeo modificado por açúcar, ou um trecho contíguo de nucleosídeos tanto modificados por açúcar quanto de DNA modificados por açúcar (asas misturadas que compreendem nucleosídeos modificados por açúcar e DNA). Consequentemente, os nucleosídeos da região flanqueamento 5’ e a região flanqueamento 3' que ficam adjacentes à região de espaço são nucleosídeos modificados por açúcar, tais como os nucleosídeos 2’ modificados. A região de espaço, G, compreende um trecho contíguo de nucleotídeos que são capazes de recrutar RNase H, quando o oligonucleotídeo está em duplex com o ácido nucleico do alvo HTRA1. De acordo com algumas concretizações, a região G compreende um trecho contíguo de 5 a 16 nucleosídeos de DNA. A região de espaçâmero F-G-F 'é complementar ao ácido nucleico alvo do HTRA1 e, portanto, pode ser uma região de nucleotídeos contidos no oligonucleotídeo.
[00236] As regiões F e F’, flanqueando as extremidades 5' e 3’ da região G, podem compreender um ou mais nucleosídeo modificados que aumentam a afinidade. De acordo com algumas concretizações, o flanco 3 'compreende pelo menos um nucleosídeo LNA, preferencialmente pelo menos 2 nucleosídeos de LNA. De acordo com algumas concretizações, o flanco 5 'compreende pelo menos um nucleosídeo de LNA. De acordo com algumas concretizações, as regiões de flanqueamento 5’ e 3' compreendem um nucleosídeo LNA. De acordo com algumas concretizações, todos os nucleosídeos nas regiões de flanqueamento são nucleosídeos de LNA. De acordo com algumas concretizações, as regiões de flanqueamento podem compreender tanto nucleosídeos de LNA quanto outros nucleosídeos (flancos mistos), tais como nucleosídeos de DNA e/ou nucleosídeos não modificados por LNA, tais como nucleosídeos substituídos 2'. Nesse caso, a diferença é definida como uma sequência contígua de pelo menos 5 nucleosídeos de recrutamento da RNase H (tais como 5 - 16 nucleosídeos de DNA) flanqueados nas extremidades 5’ e 3' por um nucleosídeo modificado para aumentar a afinidade, tal como um LNA, tal como beta-D-oxi-LNA
Região F
[00237] A região F (flanco 5’ ou asa 5’) anexada à extremidade ‘5 da região G compreende, contém ou consiste de pelo menos um nucleosídeo modificado por açúcar tais como pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7 nucleosídeos modificados. De acordo com algumas concretizações, a região F compreende ou consiste em de 1 a 7 nucleosídeos modificados, tais como 2 a 6 nucleosídeos modificados, tais como 2 a 5 nucleosídeos modificados, tais como 2 a 4 nucleosídeos modificados, tais como 1 a 3 nucleosídeos modificados, tais como 1, 2, 3 ou 4 nucleosídeos modificados.
[00238] De acordo com uma concretização, um ou mais ou todos os nucleosídeos modificados na região F são compreendidos por nucleosídeos 2’ modificados.
[00239] De acordo com outra concretização um ou mais dos nucleosídeos modificados em 21 na região F são selecionados a partir de unidades de 2'-O-alquil-RNA, 2'-O- metil-RNA, unidades de 2'-amino-DNA, unidades de 2'-fluoro- DNA, 2'-alcoxi-RNA, unidades MOE, unidades LNA, unidades de ácido nucleico arabino (ANA) e unidades 2'-fluoro-ANA.
[00240] De acordo com uma concretização da invenção todos os nucleosídeos modificados na região F são compreendidos por nucleosídeos de LNA. De acordo com uma concretização adicional, os nucleosídeos do LNA na região F são selecionados independentemente a partir do grupo que consiste em oxi-LNA, tio-LNA, amino-LNA, cET e/ou ENA, nas configurações beta-D ou alfa-L ou combinações dos mesmos. De acordo com uma concretização preferencial, a região F é dotada de pelo menos 1 unidade LNA beta-D-oxi, na extremidade 5’ da sequência contígua. Região G
[00241] A região G (região de espaço) pode compreender, conter ou consistir em de 5 a 16 nucleosídeos de DNA consecutivos capazes de recrutar RNaseH. De acordo com uma concretização adicional, a região G compreende, contém ou consiste de 5 a 12, ou de 6 a 10 ou de 7 a 9, tais como 8 unidades nucleotídicas consecutivas capazes de recrutar RNaseH.
[00242] Ainda de acordo com outra concretização pelo menos uma unidade de nucleosídeo na região G é compreendida por uma unidade de nucleosídeo de DNA, tais como a partir de 4 a 20 ou de 6 a 18 unidades de DNA, tais como de 5 a 16. De acordo com algumas concretizações, todos os nucleosídeos da região G são compreendidos por unidades de DNA.
[00243] De acordo com outras concretizações a região G pode consistir em uma mistura de DNA e outros nucleosídeos capazes de mediar a clivagem da RNase H. De acordo com algumas concretizações, pelo menos 50% dos nucleosídeos da região G são compreendidos por DNA, tais como pelo menos 60%, pelo menos 70% ou pelo menos 80% ou pelo menos 90% de DNA. Região F’
[00244] A região F’ (flanco 3' ou asa 3') anexada à extremidade ‘3 da região G compreende, contém ou consiste em pelo menos um nucleosídeo modificado por açúcar, tal como pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7 nucleosídeos modificados. De acordo com algumas concretizações, a região F’ compreende ou consiste em 1 a 7 nucleosídeos modificados, tais como 2 a 6 nucleosídeos modificados, tais como 2 a 5 nucleosídeos modificados, tais como 2 a 4 nucleosídeos modificados, tais como 1 a 3 nucleosídeos modificados, tais como 1, 2, 3 ou 4 nucleosídeos modificados.
[00245] De acordo com uma concretização, um ou mais ou todos os nucleosídeos modificados na região F’ são compreendidos por nucleosídeos 2' modificados.
[00246] De acordo com uma concretização adicional, um ou mais dos nucleosídeos 2’ modificados na região F' são selecionados a partir de unidades 2'-O- alquil-RNA, 2'-O-metil-RNA, 2'-amino-unidades de DNA, 2'- unidades fluoro-DNA, 2'-alcoxi-RNA, unidades MOE, unidades LNA, unidades de ácido nucleico arabino (ANA) e unidades 2'-fluoro-ANA.
[00247] De acordo com uma concretização da invenção todos os nucleosídeos modificados na região F’ são compreendidos por nucleosídeos de LNA. De acordo com uma concretização adicional, os nucleosídeos do LNA na região F’ são selecionados independentemente a partir do grupo que consiste em oxi-LNA, tio-LNA, amino-LNA, cET e/ou ENA, nas configurações beta-D ou alfa-L ou combinações dos mesmos. De acordo com uma concretização preferida, a região F’ é dotada de pelo menos 1 unidade LNA beta-D-oxi, na extremidade 5' da sequência contígua. Região D, D’ e D”
[00248] O oligonucleotídeo da invenção compreende uma região nucleotídica contígua que é complementar ao ácido nucleico alvo. De acordo com algumas concretizações, o oligonucleotídeo pode compreender ainda nucleotídeos adicionais posicionados 5’ e/ou 3' em uma região de nucleotídeos contíguos, que é referida como região D neste documento. A região D’ e D'’ 'pode ser anexada à extremidade 5' da região F ou à extremidade 3’ da região F', respectivamente. As regiões D (região D 'ou D'’) podem concordar com algumas concretizações que fazem parte da sequência nucleotídica contígua que é complementar ao ácido nucleico alvo ou, de acordo com outras concretizações, a(s) região(ões) D pode(m) não ser complementar(s) ao ácido nucleico alvo.
[00249] De acordo com algumas concretizações o oligonucleotídeo da invenção consiste ou compreende a região de nucleotídeos contíguos e opcionalmente 1 – 5 nucleotídeos 5’ adicionais (região D’).
[00250] De acordo com algumas concretizações o oligonucleotídeo da invenção consiste ou compreende a região de nucleotídeos contíguos e opcionalmente 1 – 5 nucleotídeo 3’ adicionais (região D’’).
[00251] A região D’ ou D' 'pode compreender independentemente 1, 2, 3, 4 ou 5 nucleotídeos adicionais, que podem ser complementares ou não complementares ao ácido nucleico alvo. Sob este aspecto, o oligonucleotídeo da invenção pode, de acordo com algumas concretizações, compreender uma sequência nucleotídica contígua capaz de modular o alvo flanqueado na extremidade 5’ e/ou 3' por nucleotídeos adicionais. Tais nucleotídeos adicionais podem servir como um ligante bioclivável suscetível à nuclease e, portanto, podem ser usados para conectar um grupo funcional, tal como uma porção conjugada, ao oligonucleotídeo da invenção. De acordo com algumas concretizações os nucleotídeos terminais 5’ e/ou 3' adicionais estão ligados a ligações de fosfodiéster e podem ser compreendidas por DNA ou RNA. De acordo com outra concretização, os nucleotídeos terminais adicionais 5’ e/ou 3' são compreendidos por nucleotídeos modificados que podem, por exemplo, ser incluídos para melhorar a estabilidade da nuclease ou para facilitar a síntese. De acordo com algumas concretizações o oligonucleotídeo da invenção compreende uma região D’ e/ou D'’, além de uma região de nucleotídeos contíguos.
[00252] De acordo com algumas concretizações, o oligonucleotídeo de espaçâmero da presente invenção pode ser representado por meio das seguintes fórmulas: F-G-F’; em particular F1-7-G4-12-F’1-7 D’-F-G-F’, em particular D’1-3-F1-7-G4-12-F’1-7 F-G-F’-D’’, em particular F1-7-G4-12-F’1-7-D’’1-3 D’-F-G-F’-D’’, em particular D’1-3-F1-7-G4-12-F’1-7-D’’1-3 Método de manufatura
[00253] De acordo com outro aspecto, a invenção proporciona métodos para manufaturar os oligonucleotídeos da invenção que compreendem fazer reagir as unidades de nucleotídeo e formar desse modo unidades de nucleotídeo contiguas ligadas de forma covalente compreendidas no oligonucleotídeo. De preferência, o método utiliza a química de fosforamidita (vide, por exemplo, Caruthers et al., 1987, Methods in Enzymology vol. 154, páginas 287- 313). De acordo com uma concretização, o método compreende ainda a reação da sequência nucleotídica contígua com uma fração de conjugação (ligando). De acordo com outro aspecto, é proporcionado um método para fabricar a composição da invenção, que compreende a mistura de oligonucleotídeo ou oligonucleotídeo conjugado da invenção com um diluente, solvente, veículo, sal e/ou adjuvante aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. Sais Farmacêuticos
[00254] Para o uso como um terapêutico, o oligonucleotídeo da invenção pode ser proporcionado como um sal farmacêutico adequado, tal como um sal de sódio ou potássio. De acordo com algumas concretizações o oligonucleotídeo de invenção é compreendido por um sal de sódio. Composição Farmacêutica
[00255] De acordo com outro aspecto, a invenção proporciona composições farmacêuticas que compreendem qualquer um dos oligonucleotídeos mencionados anteriormente no presente caso e/ou conjugados de oligonucleotídeos e um diluente, carreador, sal e/ou adjuvante farmaceuticamente aceitáveis. Um diluente farmaceuticamente aceitável inclui solução salina tamponada com fosfato (PBS) e os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, sendo que não se fica limitado aos mesmos, sais de sódio e de potássio. De acordo com algumas concretizações o diluente farmaceuticamente aceitável é compreendido por solução salina tamponada com fosfato estéril. De acordo com algumas concretizações o oligonucleotídeo é usado no diluente farmaceuticamente aceitável sob uma concentração na forma de solução de 50 – 300 µM. De acordo com algumas concretizações, o oligonucleotídeo da invenção é administrado sob uma dose de 10 – 1000 µg.
[00256] O documento WO 2007/031091 proporciona exemplos adequados e preferidos de diluentes, veículos e adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis (incluídos no presente caso por referência). Dosagens, formulações, vias de administração, composições, formas de dosagem adequadas, combinações com outros agentes terapêuticos, também são proporcionadas formulações pró-fármacos no documento WO2007/031091.
[00257] Os oligonucleotídeos ou conjugados de oligonucleotídeos da invenção podem ser misturados com substâncias ativas ou inertes farmaceuticamente aceitáveis para a preparação de composições ou formulações farmacêuticas. As composições e métodos para a formulação de composições farmacêuticas dependem de vários critérios, incluindo, entre outros, via de administração, extensão da enfermidade ou dose a ser administrada.
[00258] De acordo com algumas concretizações, o oligonucleotídeo ou conjugado de oligonucleotídeo da invenção é compreendido por um pró-fármaco. Em particular no que diz respeito aos conjugados oligonucleotídicos, a porção de conjugado é clivada de oligonucleotídeo quando o pró-fármaco é administrado no local da ação, por exemplo, a célula alvo. Aplicações
[00259] Os oligonucleotídeos da invenção podem ser utilizados como reagentes de pesquisa, por exemplo, para diagnóstico, terapêutica e profilaxia.
[00260] Em pesquisa, esses oligonucleotídeos podem ser utilizados para modular especificamente a síntese da proteína HTRA1 em células (por exemplo, culturas celulares in vitro) e animais experimentais, facilitando assim a análise funcional do alvo ou uma avaliação de sua utilidade como alvo para intervenção terapêutica. Tipicamente, a modulação alvo é alcançada degradando-se ou inibindo-se o mRNA que produz a proteína, impedindo-se assim a formação de proteínas ou degradando-se ou inibindo- se um modulador do gene ou mRNA que produz a proteína.
[00261] Nos diagnósticos, os oligonucleotídeos podem ser usados para detectar e quantificar a expressão de HTRA1 nas células e tecidos por meio de transferência de Northern, hibridização in situ ou técnicas semelhantes.
[00262] Para terapêutica, um animal ou um ser humano, suspeito de ter uma enfermidade ou distúrbio, que pode ser tratado modulando-se a expressão de HTRA1.
[00263] A invenção proporciona métodos para o tratamento ou prevenção de uma enfermidade, que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente efetiva de um oligonucleotídeo, um conjugado de oligonucleotídeo ou uma composição farmacêutica da invenção a um paciente que sofre ou é suscetível à enfermidade.
[00264] A invenção também se refere a um oligonucleotídeo, uma composição ou um conjugado tal como definido no presente caso para o uso na forma de um medicamento.
[00265] O oligonucleotídeo, conjugado de oligonucleotídeo ou uma composição farmacêutica de acordo com a invenção é administrado tipicamente em uma quantidade efetiva.
[00266] A invenção também proporciona o uso do oligonucleotídeo ou conjugado de oligonucleotídeo da invenção tal como descrito para a manufatura de um medicamento para o tratamento de um distúrbio tal como referido no presente caso, ou para um método do tratamento de um distúrbio tal como referido no presente caso.
[00267] A enfermidade ou distúrbio, como referido no presente caso, está associado à expressão de HTRA1. De acordo com algumas concretizações, a enfermidade ou distúrbio pode estar associado a uma mutação no gene HTRA1 ou um gene cujo produto protéico está associado ou interage com o HTRA1. Por essa razão, de acordo com algumas concretizações, o ácido nucleico alvo é compreendido por uma forma mutada da sequência de HTRA1 e, em outras concretizações, o ácido nucleico alvo é compreendido por um regulador da sequência de HTRA1.
[00268] Os métodos da invenção são de preferência empregados para tratamento ou profilaxia contra enfermidades causadas por níveis e/ou atividade anormais de HTRA1.
[00269] A invenção refere-se ainda ao uso de um oligonucleotídeo, conjugado de oligonucleotídeo ou uma composição farmacêutica tal como definida no presente caso para a manufatura de um medicamento para o tratamento de níveis e/ou atividade anormais de HTRA1.
[00270] De acordo com uma concretização, a invenção refere-se a oligonucleotídeos, conjugados de oligonucleotídeos ou composições farmacêuticas para uso no tratamento de enfermidades ou distúrbios selecionados a partir de distúrbios oculares, tais como degeneração macular, incluindo degeneração macular relacionada à idade (AMD), tal como DMRI seca ou úmida AMD e retinopatia diabética. De acordo com algumas concretizações os oligonucleotídeos conjugados ou composições farmacêuticas da invenção podem ser utilizados no tratamento de atrofia geográfica ou DAMD intermediário. O HTRA1 também foi indicado na doença de Alzheimer e de Parkinson e, portanto, de acordo com algumas concretizações, oligonucleotídicos conjugados ou composições farmacêuticas da invenção podem ser utilizados no tratamento de doença de Alzheimer ou de Parkinson. O HTRA1 também foi indicado na distrofia muscular de Duchenne, artrite, tal como osteoartrite, enfermidade cerebral isquêmica familiar de pequenos vasos e, portanto, de acordo com algumas concretizações, oligonucleotídicos conjugados ou composições farmacêuticas da invenção podem ser usadas no tratamento de distrofia muscular de Duchenne, artrite, tal como osteoartrite ou enfermidade cerebral isquêmica familiar de pequenos vasos. Administração
[00271] Os oligonucleotídeos ou composições farmacêuticas da presente invenção podem ser para administração tópica (tal como pele, inalação, oftalmologia ou óptica) ou enteral (tal como oralmente ou através do trato gastrointestinal) ou parenteral (tal como intravenosa, subcutânea, intramuscular, intracerebral, intracerebroventricular ou intratecal).
[00272] De acordo com algumas concretizações o oligonucleotídeo, as composições conjugadas ou farmacêuticas da presente invenção são administradas por uma via parentérica, incluindo injeção ou infusão intravenosa, intra-arterial, subcutânea, intraperitoneal ou intramuscular ou infusão, intratecal ou intracraniana, e. administração intracerebral ou intraventricular. De acordo com algumas concretizações, o oligonucleotídeo ativo ou conjugado de oligonucleotídeo é administrado por via intravenosa. De acordo com outra concretização, o oligonucleotídeo ativo ou conjugado de oligonucleotídeo é administrado por via subcutânea.
[00273] Para utilização no tratamento de enfermidades oculares, tais como degeneração macular, por exemplo, pode ser usada Injeção intra-ocular de AMD (úmida ou seca).
[00274] De acordo com algumas concretizações, o composto da invenção, ou o seu sal farmaceuticamente aceitável, é administrado por meio de uma injeção intra ocular em uma dose que varia desde cerca de 10 µg r cerca de 200 µg por olho, tal como cerca de 50 µg até cerca de 150 µg por olho, tal como cerca de 100 µg por olho. De acordo com algumas concretizações, o intervalo de dosagem, ou seja, o período de tempo entre as doses consecutivas é pelo menos mensal, tal como pelo menos duas vezes por mês ou pelo menos uma vez a cada três meses. Terapias de combinação
[00275] De acordo com algumas concretizações o oligonucleotídeo, conjugado de oligonucleotídeo ou composição farmacêutica da invenção destina-se ao uso em um tratamento de combinação com outro agente terapêutico. O agente terapêutico pode ser, por exemplo, o padrão de atendimento para as enfermidades ou distúrbios descritos anteriormente no presente caso.
EXEMPLOS Materiais e métodos Síntese de oligonucleotídeo
[00276] A síntese de oligonucleotídeos é de um modo geral conhecida na técnica. Mais adiante encontra0se exposto um protocolo que pode ser aplicado. Os oligonucleotídeos da presente invenção podem ter sido produzidos por métodos levemente variáveis em termos de aparelhos, suporte e concentrações utilizados.
[00277] Os oligonucleotídeos são sintetizados em suportes universais de uridina usando-se a abordagem de fosforamidita em um Oligomaker 48 na escala de 1 μmol. No final da síntese, os oligonucleotídeos são clivados a partir do suporte sólido usando-se amônia aquosa durante 5- 16 horas sob 60ºC. Os oligonucleotídeos são purificados por HPLC de fase reversa (RP-HPLC) ou por extrações em fase sólida e caracterizados por UPLC, e a massa molecular é confirmada ainda mais por ESI-MS. Alongamento do oligonucleotídeo:
[00278] O acoplamento de β-cianoetil- fosforamiditos (DNA-A (Bz), DNA-G (ibu), DNA-C (Bz), DNA-T, LNA-5-metil-C (Bz), LNA-A (Bz), LNA-G (dmf), LNA-T) é realizado usando-se uma solução de 0,1 M de amidita protegida com 5'-O-DMT em acetonitrila e DCI (4,5 – dicianoimidazol) em acetonitrila (0,25 M) como ativador. Para o ciclo final, pode ser utilizado um fosforamidito com as modificações desejadas, por exemplo, um ligante C6 para anexar um grupo conjugado ou um grupo conjugado como tal. A tiolação para introdução de ligações de fosfotioato é realizada usando-se hidreto de xantano (0,01 M em acetonitrila/piridina 9: 1). As ligações de fosfotriéster podem ser introduzidas usando-se iodo 0,02 M em THF/Piridina/água 7: 2: 1. O restante dos reagentes são aqueles tipicamente usados para a síntese de oligonucleotídeos.
[00279] Para conjugação pós-síntese em fase sólida, um forforamidito de aminoligante C6 disponível no mercado pode ser usado no último ciclo da síntese em fase sólida e após desproteção e clivagem do suporte sólido, o oligonucleotídeo desprotegido aminoligado é isolado. Os conjugados são introduzidos via ativação do grupo funcional usando-se métodos de síntese padrão. Purificação por meio de RP-HPLC:
[00280] Os compostos em bruto são purificados por meio de RP-HPLC de preparação em uma coluna Phenomenex Jupiter C18 10 µ 150x10 mm. Utilizam-se acetato de amônio 0,1 M, pH 8, e acetonitrila como tampões, a um fluxo de 5mL/min. As frações coletadas são liofilizadas para proporcionar o composto purificado tipicamente na forma de um sólido de cor branca. Abreviaturas: DCI: 4,5-Dicianoimidazol DCM: Diclorometano DMF: Dimetilformamida DMT: 4,4’-Dimetoxitritil THF: Tetra hidrofurano Bz: Benzoil Ibu: Isobutiril RP-HPLC: Cromatografia líquida de alta eficiência com fase reversa
Ensaio de Tm:
[00282] Os duplex de oligonucleotídeo e de RNA alvo (fosfato, PO) são diluídos para 3 mM em 500 ml de água isenta de RNase e misturados com 500 ml de tampão Tm 2x (NaCl 200 mM, NaCl 200 mM, EDTA 0,2 mM, Nafosfato 20 mM, pH 7,0). A solução é aquecida a 95ºC durante 3 min. e depois deixada temperar na temperatura ambiente durante 30 min. As temperaturas de fusão duplex (Tm) são medidas em um espectrofotômetro Lambda 40 UV/VIS equipado com um programador de temperatura Peltier PTP6 usando-se o software PE Templab (Perkin Elmer). A temperatura é aumentada de 20ºC para 95ºC e depois reduzida para 25ºC, registrando absorção a 260 nm. A primeira derivada e os máximos locais da fusão e do recozimento são usados para se avaliar a Tm duplex. Oligonucleotídeos usados:
SEQ ID NO
CMP ID NO Composto Motivo 5 agttaaaggaggagacaaat 5,1 AGTTaaaggaggagacAAAT 6 tcagttaaaggaggagacaa 6,1 TCAgttaaaggaggagaCAA 7 ctcagttaaaggaggagaca 7,1 CTCagttaaaggaggagaCA 8 ctcagttaaaggaggagac 8,1 CTCagttaaaggaggaGAC 9 actcagttaaaggaggagac 9,1 ACTCagttaaaggaggagAC 10 actcagttaaaggaggaga 10,1 ACTCagttaaaggaggaGA 11 actcagttaaaggaggag 11,1 ACtcagttaaaggaGGAG 12 gatgactcagttaaaggagg 12,1 GAtgactcagttaaaggAGG 13 atgatgactcagttaaagga 13,1 ATGAtgactcagttaaagGA
14 tgatgactcagttaaagg 14,1 TGAtgactcagttaAAGG 15 gatgatgactcagttaaagg 15,1 GAtgatgactcagttaAAGG 16 gatgatgactcagttaaag 16,1 GATGatgactcagttaAAG 17 tatcgactgcattagttgg 17,1 TATmcgactgcattagttGG 18 gtatcgactgcattagttgg 18,1 GtatmcgactgcattagttGG 19 tcgactgcattagttg 19,1 TCGactgcattagTTG 19 tcgactgcattagttg 19,2 TCGactgcattagtTG 19 tcgactgcattagttg 19,3 TCGActgcattaGTTG 20 tatcgactgcattagttg 20,1 TAtmcgactgcattaGTTG 21 gtatcgactgcattagttg 21,1 GTAtmcgactgcattagtTG 22 tgtatcgactgcattagttg 22,1 TGtatmcgactgcattagtTG 23 atcgactgcattagtt 23,1 ATCgactgcattaGTT 23 atcgactgcattagtt 23,2 ATCGactgcattAGTT 23 atcgactgcattagtt 23,3 ATCGactgcattaGTT 24 tatcgactgcattagtt 24,1 TATCgactgcattaGTT 25 gtatcgactgcattagtt 25,1 GTATmcgactgcattagTT 26 tgtatcgactgcattagtt 26,1 TGTatmcgactgcattagTT 27 ttgtatcgactgcattagtt 27,1 TTGtatmcgactgcattagTT 28 tatcgactgcattagt 28,1 TATmcgactgcattaGT 28 tatcgactgcattagt 28,2 TATCgactgcatTAGT 29 gtatcgactgcattagt 29,1 GTATmcgactgcattaGT 30 tgtatcgactgcattagt 30,1 TGTatmcgactgcattaGT 31 gtatcgactgcattag 31,1 GTAtmcgactgcatTAG 31 gtatcgactgcattag 31,2 GTAtmcgactgcattAG 31 gtatcgactgcattag 31,3 GTATmcgactgcaTTAG 32 tgtatcgactgcattag 32,1 TGtatmcgactgcaTTAG 33 ttgtatcgactgcattag 33,1 TTGtatmcgactgcatTAG 34 attgtatcgactgcattag 34,1 ATtgtatmcgactgcaTTAG 35 tgtatcgactgcatta 35,1 TGTatmcgactgcaTTA
35 tgtatcgactgcatta 35,2 TGTAtmcgactgcATTA 36 attgtatcgactgcatta 36,1 ATTGtatmcgactgcaTTA 37 ttgtatcgactgcatt 37,1 TTGtatmcgactgcaTT 37 ttgtatcgactgcatt 37,2 TTGtatmcgactgCATT 38 attgtatcgactgcat 38,1 ATTgtatmcgactgCAT 38 attgtatcgactgcat 38,2 ATTgtatmcgactgcAT 38 attgtatcgactgcat 38,3 ATTGtatmcgactGCAT 39 acgcattgtatcgact 39,1 ACGcattgtatmcgACT 39 acgcattgtatcgact 39,2 ACGCattgtatmcGACT 40 tacgcattgtatcgac 40,1 TACgcattgtatmcGAC 40 tacgcattgtatcgac 40,2 TACGcattgtatCGAC 41 ctacgcattgtatcgac 41,1 CTamcgcattgtatCGAC 42 tctacgcattgtatcgac 42,1 TCTAmcgcattgtatmcgAC 43 atctacgcattgtatcgac 43,1 ATCtamcgcattgtatmcgAC 44 tatctacgcattgtatcgac 44,1 TAtctamcgcattgtatcGAC 45 ctacgcattgtatcga 45,1 CTAmcgcattgtatCGA 45 ctacgcattgtatcga 45,2 CTACgcattgtaTCGA 46 tatctacgcattgtatcga 46,1 TAtctamcgcattgtatCGA 47 tctacgcattgtatcg 47,1 TCTamcgcattgtaTCG 47 tctacgcattgtatcg 47,2 TCTamcgcattgtatCG 47 tctacgcattgtatcg 47,3 TCTAmcgcattgtATCG 48 atctacgcattgtatcg 48,1 ATCTamcgcattgtaTCG 49 tatctacgcattgtatcg 49,1 TATCtamcgcattgtatCG 50 tctatctacgcattgtatcg 50,1 TCtatctamcgcattgtatCG 51 atctacgcattgtatc 51,1 ATCtamcgcattgtATC 51 atctacgcattgtatc 51,2 ATCTamcgcattgTATC 52 tatctacgcattgtatc 52,1 TATctamcgcattgTATC 53 ctatctacgcattgtatc 53,1 CTatctamcgcattgTATC 54 tctatctacgcattgtatc 54,1 TCTatctamcgcattgtaTC
55 ttctatctacgcattgtatc 55,1 TTCtatctamcgcattgtaTC 56 tatctacgcattgtat 56,1 TATctamcgcattgTAT 56 tatctacgcattgtat 56,2 TATCtamcgcattGTAT 57 ctatctacgcattgtat 57,1 CTAtctamcgcattGTAT 58 tctatctacgcattgtat 58,1 TCtatctamcgcattGTAT 59 ttctatctacgcattgtat 59,1 TTCtatctamcgcattgTAT 60 ctatctacgcattgta 60,1 CTAtctamcgcattGTA 60 ctatctacgcattgta 60,2 CTATctamcgcatTGTA 61 tctatctacgcattgta 61,1 TCTatctamcgcattGTA 62 ttctatctacgcattgta 62,1 TTCtatctamcgcattGTA 63 ttctatctacgcattgt 63,1 TTCtatctamcgcatTGT 64 tcttctatctacgcattgt 64,1 TCttctatctamcgcattGT 65 ttcttctatctacgcattgt 65,1 TtcttctatctamcgcattGT 66 ttcttctatctacgcattg 66,1 TTCttctatctamcgcatTG 67 ttctatctacgcattg 67,1 TTCtatctamcgcaTTG 68 cttctatctacgcatt 68,1 CTTCtatctamcgCATT 69 tcttctatctacgcatt 69,1 TCTtctatctamcgCATT 70 ttcttctatctacgcatt 70,1 TTCTtctatctamcgcATT 71 tcttctatctacgcat 71,1 TCTTctatctamcgCAT 72 ttcttctatctacgcat 72,1 TTCTtctatctamcgCAT 73 cttcttctatctacgcat 73,1 CTTCttctatctamcgcAT 74 ttcttctatctacgca 74,1 TTCttctatctacGCA 75 cttcttctatctacgca 75,1 CTTCttctatctamcgCA 76 gcttcttctatctacgca 76,1 GcttcttctatctamcgCA 77 cttcttctatctacgc 77,1 CTtcttctatctACGC 78 gcttcttctatctacg 78,1 GCTtcttctatctACG 79 cgtggggcttcttcta 79,1 CGTggggcttcttCTA 80 tgacttggagaaaagcacaa 80,1 TGacttggagaaaagcacAA 81 ctgacttggagaaaagcac 81,1 CtgacttggagaaaagcAC
82 agagtcatcgtgctcc 82,1 AGAgtcatmcgtgcTCC 83 aagtactttaatagctcaaa 83,1 AAGTactttaatagctCAAA 84 aagtactttaatagctcaa 84,1 AAGTactttaatagcTCAA 85 gaagtactttaatagctcaa 85,1 GAAGtactttaatagctCAA 86 tactttaatagctcaa 86,1 TACTttaatagcTCAA 87 aagtactttaatagctca 87,1 AAGTactttaatagcTCA 88 gaagtactttaatagctca 88,1 GAAGtactttaatagcTCA 89 agaagtactttaatagctc 89,1 AGAAgtactttaatagCTC 90 aagaagtactttaatagctc 90,1 AAGAagtactttaatagCTC 91 gaagtactttaatagct 91,1 GAAGtactttaatAGCT 92 taagaagtactttaatagct 92,1 TAAgaagtactttaatAGCT 93 agaagtactttaatagc 93,1 AGAAgtactttaaTAGC 94 taagaagtactttaatagc 94,1 TAAGaagtactttaaTAGC 95 gtaagaagtactttaatagc 95,1 GTaagaagtactttaaTAGC 96 taagaagtactttaatag 96,1 TAAGaagtactttaATAG 97 gtaagaagtactttaatag 97,1 GTAAgaagtactttaATAG 98 tgtaagaagtactttaatag 98,1 TGTAagaagtactttaATAG 99 aatgtgtaagaagtacttt 99,1 AATGtgtaagaagtaCTTT 100 caatgtgtaagaagtacttt 100,1 CAATgtgtaagaagtaCTTT 101 atgtgtaagaagtactt 101,1 ATGTgtaagaagtACTT 102 aatgtgtaagaagtactt 102,1 AATGtgtaagaagtACTT 103 caatgtgtaagaagtactt 103,1 CAATgtgtaagaagtACTT 104 gcaatgtgtaagaagtactt 104,1 GCaatgtgtaagaagtACTT 105 atgtgtaagaagtact 105,1 ATGtgtaagaagtACT 105 atgtgtaagaagtact 105,2 ATGTgtaagaagTACT 106 gcaatgtgtaagaagtact 106,1 GCAAtgtgtaagaagtACT 107 aatgtgtaagaagtac 107,1 AATGtgtaagaaGTAC 107 aatgtgtaagaagtac 107,2 AATgtgtaagaaGTAC 108 caatgtgtaagaagtac 108,1 CAATgtgtaagaaGTAC
109 gcaatgtgtaagaagtac 109,1 GCAatgtgtaagaaGTAC 110 caatgtgtaagaagta 110,1 CAAtgtgtaagaaGTA 110 caatgtgtaagaagta 110,2 CAAtgtgtaagaAGTA 110 caatgtgtaagaagta 110,3 CAATgtgtaagaAGTA 111 gcaatgtgtaagaagta 111,1 GCAatgtgtaagaAGTA 112 gcaatgtgtaagaagt 112,1 GCAatgtgtaagaAGT A See below B See below Para os compostos: as letras maiúsculas representam nucleosídeos LNA (foram utilizados nucleosídeos beta-D-oxi LNA), todas as citosinas LNA são 5-metil-citosina, as letras minúsculas representam nucleosídeos de DNA, as citosinas de DNA precedidas por um sobrescrito m representam um C-5-metil Nucleosídeo de DNA. Todas as ligações internucleosídeos são ligações internucleosídeos fosforotioato. O composto A é exposto como composto 143,1 e o composto B é exposto como composto 145,1 em EP16177508.5 e EP17170129.5 e são utilizados como compostos de controle positivo. Exemplo 1. Eficácia de Teste in vitro de oligonucleotídeos de LNA em linha de células U251 sob uma única concentração.
[00285] Identificação de região promissora de "ponto quente" para HTRA1. Uma biblioteca de n = 231 oligonucleotídeos HTRA1 LNA foi rastreada na linha celular U251 a 5 µM, 6 dias de tratamento. A partir desta biblioteca, foi identificada uma série de oligonucleotídeos ativos direcionados ao pré-mRNA de HTRA1 humano entre as posições 53113 - 53384, como mostrado na Figura 1 (SEQ ID NO 116 ou 117).
[00286] A linha celular U251 de glioblastoma humano foi adquirida a partir da ECACC e mantida como recomendado pelo fornecedor em uma incubadora umidificada sob 37ºC com 5% de CO2. Para os ensaios, 15000 células U251 / poço foram semeadas em uma placa de 96 poços em meio de inanição (meio recomendado pelo fornecedor, com exceção de 1% de FBS em vez de 10%). As células foram incubadas durante 24 horas antes da adição de oligonucleotídeos dissolvidos em PBS.
Concentração de oligonucleotídeos: 5 µM. 3-4 dias após a adição de oligonucleotídeos, os meios foram removidos e novos meios (sem oligonucleotídeo) foram adicionados. 6 dias após a adição de oligonucleotídeos, as células foram colhidas.
O RNA foi extraído usando-se o kit de Purificação de RNA PureLink Pro 96 (Ambion, de acordo com as instruções do fabricante). O cDNA foi então sintetizado usando-se M-MLT Reverse Transcriptase, decâmetros aleatórios RETROscript, Inibidor de RNase (Ambion, de acordo com as instruções do fabricante) com 100 mM de dNTP definido para PCR (Invitrogen) e água isenta de DNase/RNase (Gibco). Para análise das expressões gênicas, o qPCR foi realizado usando-se o TagMan Fast Advanced Master Mix (2X) (Ambion) em uma configuração duplex.
Os ensaios do iniciador TaqMan a seguir foram utilizados para qPCR: HTRA1, Hs01016151_m1 (FAM-MGB) e gene de manutenção da casa, TBP, Hs4326322E (VIC-MGB) da Life Technologies. n = 2 repetições biológicas independentes.
O nível de expressão residual de mRNA de HTRA1 na tabela é mostrado como % do controle (células tratadas com PBS).
SEQ ID NO
CMP ID NO nível de mRNAl 19 19,1 16 31 31,1 2 38 38,1 9 47 47,1 3 78 78,1 4 79 79,1 21 82 82,1 35 107 107,1 17 110 110,1 24 112 112,1 15 Exemplo 2. Eficácia do teste in vitro dos oligonucleotídeos de LNA na linha de células U251 sob um ângulo de uma única concentração.
[00288] A região "ponto quente" 53113 - 53384 descrita no Exemplo 1 foi ainda validada em uma nova biblioteca de n = 210 oligonucleotídeos HTRA1 LNA que foram rastreados na linha celular U251 a 5 µM. n = 33 os oligonucleotídeos LNA estavam direcionados ao pré-mRNA do HTRA1 humano entre a posição 53113 - 53384 e esses oligos eram relativamente ativos em comparação com o restante, conforme ilustrado na figura 2.
[00289] O ensaio foi realizado como descrito no exemplo 1. n = 2 réplicas biológicas independentes. O nível de expressão residual de mRNA de HTRA1 está ilustrado na tabela como % de controle (células tratadas com PBS).
SEQ ID NO
CMP ID NO nível de mRNA 19 19,2 3 19 19,3 16 23 23,1 1 23 23,2 44 28 28,1 2 28 28,2 19 31 31,2 0.4 31 31,3 9 35 35,1 24 35 35,2 5 37 37,1 0.3 37 37,2 7 38 38,2 1 38 38,3 17 39 39,1 5 39 39,2 17 40 40,1 6 40 40,2 34 45 45,1 4
45 45,2 23 47 47,2 1 47 47,3 4 51 51,1 6 51 51,2 13 56 56,1 2 56 56,2 12 60 60,1 2 60 60,2 5 105 105,1 30 105 105,2 76 107 107,2 25 110 110,2 27 110 110,3 20 Exemplo 3. Eficácia do teste in vitro dos oligonucleotídeos de LNA em linhas de células U251 e ARPE19 em uma única concentração.
[00291] A região "ponto quente" 53113 - 53384 descrita nos Exemplos 1 e 2 foi ainda validada em uma nova biblioteca de n = 305 oligonucleotídeos HTRA1 LNA que foram rastreados nas linhas de células U251 e ARPE19 a 5 µM e 25 µM, respectivamente. n = 95 os oligonucleotídeos LNA estavam direcionados ao pré-mRNA do HTRA1 humano entre a posição 53113 - 53384 e esses oligos eram relativamente ativos em comparação com o restante, como mostrado na figura 3.
[00292] A linha de células ARPE19 de epitélio pigmentado da retina humana foi adquirida pela ATCC e mantida em DMEM-F12 (Sigma, D8437), 10% de FBS, 1% de
“pen/strep” em uma incubadora umidificada a 37ºC com 5% de CO2. A linha de células U251 foi descrita no exemplo 1. Para ensaios, 2000 células/poço U251 ou ARPE19 foram semeadas em uma placa de 96 poços múltiplos em meio de cultura recomendado pelo fornecedor. As células foram incubadas durante 2 horas antes da adição de oligonucleotídeos dissolvidos em PBS. A concentração de oligo foi de 5 e 25 µM nas células U251 e ARPE19, respectivamente. 4 dias após a adição de oligonucleotídeos, as células foram colhidas. A extração de RNA foi realizada como descrito no Exemplo 1, a síntese de cDNA e o qPCR foram realizados usando-se qScript XLT RT-qPCR ToughMix Low ROX de uma etapa, 95134-100 (Quanta Biosciences). Os ensaios de iniciador TaqMan a seguir foram utilizados para células U251 e ARPE19 em uma configuração dupla: HTRA1, Hs01016151_m1 (FAM-MGB) e gene de manutenção da casa, GAPDH, Hs4310884E (VIC-MGB). Todos os conjuntos de preparadores foram adquiridos a partir da Life Technologies. n = 1 replicado biológico. O nível de expressão relativo de mRNA de HTRA1 na tabela é mostrado como % de controle (células tratadas com PBS). Nível de mRNA do Nível de mRNA
SEQ ID NO
CMP ID NO ARPE19 U251 5 5,1 90 56 6 6,1 107 60
7 7,1 92 74 8 8,1 83 57 9 9,1 98 64 10 10,1 77 67 11 11,1 71 56 12 12,1 81 43 13 13,1 84 65 14 14,1 36 20 15 15,1 37 29 16 16,1 55 28 17 17,1 53 43 18 18,1 69 59 20 20,1 41 42 21 21,1 24 22 22 22,1 38 51 23 23,3 53 37 24 24,1 52 27 25 25,1 27 18 26 26,1 16 26 27 27,1 28 42 29 29,1 24 16 30 30,1 18 22 31 31,2 23 3 32 32,1 14 23 33 33,1 11 23 34 34,1 14 34 35 35,1 8 3 36 36,1 12 18 37 37,1 24 5
41 41,1 51 26 42 42,1 39 26 43 43,1 53 42 44 44,1 67 49 46 46,1 59 43 47 47,2 16 8 48 48,1 23 15 49 49,1 39 29 50 50,1 45 42 51 51,1 14 28 52 52,1 15 22 53 53,1 32 23 54 54,1 12 31 55 55,1 46 36 56 56,1 9 11 57 57,1 62 38 58 58,1 77 30 59 59,1 29 31 60 60,1 47 22 61 61,1 25 18 62 62,1 32 26 63 63,1 32 17 64 64,1 67 43 65 65,1 51 78 66 66,1 24 18 67 67,1 11 0,7 68 68,1 37 17 69 69,1 36 17 70 70,1 23 12
71 71,1 34 15 72 72,1 16 15 73 73,1 16 14 74 74,1 17 8 75 75,1 29 13 76 76,1 74 43 77 77,1 58 13 80 80,1 127 98 81 81,1 119 104 83 83,1 49 49 84 84,1 52 31 85 85,1 29 10 86 86,1 13 5 87 87,1 32 28 88 88,1 29 15 89 89,1 28 16 90 90,1 21 14 91 91,1 74 53 92 92,1 76 51 93 93,1 40 22 94 94,1 33 20 95 95,1 10 31 96 96,1 49 35 97 97,1 34 20 98 98,1 16 21 99 99,1 66 43 100 100,1 51 21 101 101,1 87 66 102 102,1 52 32
103 103,1 49 24 104 104,1 79 51 106 106,1 71 49 108 108,1 47 32 109 109,1 59 48 111 111,1 66 41 A A 21 28 Exemplo 4. Teste de potência e eficácia in vitro de compostos selecionados nas linhas de células U251 e ARPE19 em uma curva de resposta à dose.
[00294] As linhas de células U251 e ARPE19 foram descritas nos exemplos 1 e 3, respectivamente. O ensaio U251 foi realizado da forma que se encontra descrita no Exemplo 1. O ensaio ARPE19 foi realizado da seguinte forma: 5000 células / poço ARPE19 foram semeadas em uma placa de 96 poços em meio de cultura recomendado pelo fornecedor (com exceção de 5% de FBS em vez de 10%) As células foram incubadas durante 2 horas antes da adição de oligonucleotídeos dissolvidos em PBS. Concentração de oligonucleotídeos: a partir de 50μM, diluição semi- logarítmica, 8 pontos. As células foram colhidas 4 dias após a adição de oligonucleotídeos. A extração de RNA, síntese de cDNA e qPCR foram realizadas da forma que se encontra descrita no Exemplo 1. n = 2 réplicas biológicas independentes. O valor de EC50 e o nível residual de mRNA de HTRA1 a 50 µM estão ilustrados na tabela como % de controle (PBS).
ARPE19 U251
SEQ ID NO
CMP ID NO nível de mRNA no nível de EC50 máximo EC50 mRNA no (µM) KD (µM) máximo KD 19 19.2 2,3 54 0,6 3 31 31.2 2,3 12 0,40 0,2 37 37.1 4,0 11 0,46 0,2 38 38.2 7,4 19 0,70 0,2 47 47.2 4,6 8 0,62 0,2 23 23.1 6,8 25 0,80 1 35 35.1 3,5 4 0,38 0,1 Exemplo 5. Teste de potência e eficácia in vitro de compostos selecionados nas linhas de células U251 e ARPE19 em uma curva de resposta à dose.
[00296] Os ensaios foram realizados como descrito no Exemplo 3. Concentração de oligonucleotídeos: a partir de 50 µM, diluição semi-logarítmica, 8 pontos. n = 2 en = 1 réplicas biológicas independentes para U251 e ARPE19, respectivamente. O valor de EC50 e o nível residual de mRNA de HTRA1 sob 50µM estão ilustrados na tabela como % de controle (PBS).
ARPE19 U251
SEQ ID NO
CMP ID NO Nível de Nível de EC50 mRNA no mRNA no (µM) máximo KD EC50 (µM) máximo KD 31 31.2 3,2 15 0,90 0,38 37 37.1 11 22 1,3 0,75 47 47.2 2,8 13 0,89 0,83 35 35.1 2,6 8,3 0,79 0,40 85 85.1 8,2 24 0,48 3,6 90 90.1 3,3 16 0,50 2,2 95 95.1 0,55 28 1,0 4,1 98 98.1 1,7 24 0,86 4,5 30 30.1 1,2 20 1,00 2,2 32 32.1 1,7 22 1,6 1,4 26 26.1 1,1 14 1,4 0,45 33 33.1 0,75 28 0,66 0,63 34 34.1 0,44 21 0,80 0,35 36 36.1 5,2 28 1,1 0,80 52 52.1 2,1 28 1,1 1,1 54 54.1 0,79 25 0,62 1,4 72 72.1 2,9 33 0,71 1,7 70 70.1 1,9 36 0,52 1,5 74 74.1 0,78 24 0,35 1,1 73 73.1 0,78 11 0,59 0,33 75 75.1 1,7 22 0,60 0,80 86 86.1 1,7 6,5 0,47 0,65 67 67.1 0,59 4,3 0,38 0,23
A A 6,5 24 1,2 3,6 B B 8,1 30 0,79 4,2 Exemplo 6. Teste de potência e eficácia in vitro de compostos selecionados na linha de células U251 em uma curva de resposta à dose.
[00298] O ensaio foi realizado como descrito no Exemplo 3. Concentração de oligonucleotídeos: a partir de 50 µM, diluição semi-logarítmica, 8 pontos. n = 2 repetições biológicas independentes. O valor de EC50 e o nível residual de mRNA de HTRA1 a 50 µM estão ilustrados na tabela como % de controle (PBS).
U251
SEQ ID NO
CMP ID NO EC50 Nível de mRNA (µM) no máximo KD 38 38.1 3,3 3 78 78.1 0,58 2 31 31.2 1,2 0,4 37 37.1 1,6 0,6 47 47.2 0,91 0,6 35 35.1 0,52 0,3 39 39.1 0,82 3 40 40.1 1,3 4
45 45.1 0,89 3 51 51.1 2,7 2 56 56.1 2,7 1 60 60.1 2,1 1 37 37.2 8,0 24 31 31.3 2,8 10 35 35.2 1,3 4 47 47.3 0,86 4 60 60.2 1,3 3 26 26.1 0,52 1 73 73.1 0,24 0,7 86 86.1 0,27 0,9 67 67.1 0,46 0,2 A A 1,1 3,1 B B 1,2 3,3 Exemplo 7. Teste de potência e eficácia in vitro de compostos selecionados na linha celular U251 em uma curva de resposta à dose.
[00300] A linha de células ARPE19 foi descrita no exemplo 3. Para ensaios, células ARPE19, 24000 células / poço foram semeadas em 100 µL em uma placa de 96 poços em meio de inanição (meio de cultura recomendado pelo fornecedor, com exceção de 1% de FBS em vez de 10%). As células foram incubadas durante 2 horas antes da adição de oligonucleotídeos dissolvidos em PBS. Concentração de oligonucleotídeos: a partir de 50μM, diluição semi- logarítmica, 8 pontos. Nos dias 4 e 7 após a adição de compostos oligonucleotídicos, foram adicionados 75 µL de meio de inanição fresco sem oligonucleotídeos às células
(sem remover o meio antigo). A extração de RNA, síntese de cDNA e qPCR foram realizadas como descrito no Exemplo 3. n = 2 réplicas biológicas independentes. O valor de EC50 e o nível residual de mRNA de HTRA1 a 50µM estão ilustrados na tabela como % de controle (PBS).
ARPE19
SEQ ID NO
CMP ID NO EC50 Nível de mRNA (µM) no máximo KD 30 30,1 0,31 1 33 33,1 0,60 0,5 35 35,1 0,58 1 35 35,2 2,7 4 36 36,1 0,97 2 37 37,1 1,0 4 40 40,1 3,8 21 45 45,1 1,6 3 56 56,1 5,8 2 67 67,1 0,84 1 73 73,1 0,36 2 86 86,1 0,59 4 90 90,1 0,75 5 95 95,1 0,74 3 A A 1,3 1,9 B B 0,84 1,5
Exemplos 8. Teste de eficácia in vitro em células EPR primárias humanas.
[00302] As células primárias do Epitélio Pigmentado da Retina humana (hpRPE) foram adquiridas a partir da Sciencell (Cat # 6540). Para os ensaios, foram semeadas 5000 células / poço hpRPE em uma placa de 96 poços revestida com Laminina (Laminin 521, BioLamina Cat # LN521- 03) em meio de cultura (EpiCM, Sciencell Cat # 4101). Eles foram expandidos com essa mídia durante uma semana e diferenciados usando-se a mídia exposta em seguida durante 2 semanas: Mídia MEM Alpha (Sigma Cat # M-4526) suplementada com suplemento N1 (Sigma Cat # N-6530), Glutamina-Penicilina-Estreptomicina (Sigma Cat # G-1146), Aminoácido não essencial (NEAA, Sigma Cat # M-7145), Taurina (Sigma Cat # T-0625), Hidrocortisona (Sigma Cat # H-03966), Triiodo-tironina (Sigma Cat # T -5516) e albumina de soro bovino (BSA, Sigma Cat # A-9647). As células foram cultivadas em uma incubadora umidificada sob 37ºC com 5% de CO2.
[00303] No dia da experiência, as células foram incubadas durante 1 hora com meio de diferenciação fresco antes da adição de oligonucleotídeos. Estes foram dissolvidos em PBS e aplicados nas células no dia 0 e no dia 4. No dia 7, o meio foi trocado e no dia 10 as células foram colhidas com 50 µl de tampão RLT com β-mercapto- etanol (Qiagen Cat # 79216). A extração do RNA foi realizada de acordo com o manual do usuário do Qiagen RNeasy Mini Kit (Cat # 74104; Lote 151048073), incluindo tratamento com DNase I (Cat # 79254; Lote 151042674). O controle de qualidade do RNA foi realizado com o Agilent Bioanalyzer Nano Kit (Agilent; Cat # 5067-1511; Lote 1446). A transcrição reversa do RNA total em cDNA (síntese de cDNA) foi realizada usando-se o Kit de Transcrição Reversa de cDNA de alta capacidade (baseado em oligonucleotídeos hexâmeros aleatórios), de acordo com as instruções do fabricante (Thermo Fisher Scientific, Cat # 4368814; Lote 00314158). A medição das amostras de cDNA foi realizada em triplicatas, em formato de placa de 384 poços no instrumento de PCR em tempo real 7900HT (Thermo Fisher Scientific). Foram usados os ensaios seguintes de preparadores TaqMan para qPCR: HTRA1, Hs01016151_m1 e Hs00170197_m1, genes de manutenção, GAPDH, Hs99999905_m1 e PPIA, Hs99999904_m1, a partir da Life Technologies. n = 3 repetições biológicas. O nível de expressão de ARNm residual HTRA1 encontra-se ilustrado na Figura 4 e na tabela a seguir como % de controle (PBS). nível de
SEQ ID NO
CMP ID NO mRNA 50µM 10µM 1µM 37 37.1 32 60 77 35 35.1 9 20 64 85 85.1 22 49 46 90 90.1 22 39 61 95 95.1 20 47 74 98 98.1 14 27 55
30 30.1 19 41 75 32 32.1 14 25 53 26 26.1 21 39 73 33 33.1 18 70 58 34 34.1 16 35 63 52 52.1 13 31 61 54 54.1 7 20 53 72 72.1 7 18 56 70 70.1 8 18 53 74 74.1 3 12 40 73 73.1 13 13 65 75 75.1 7 15 55 86 86.1 8 27 70 67 67.1 8 27 77 A A 31 57 72 Exemplo 9. Estudo farmacocinético e farmacodinâmico in vivo de macaco Cynomolgus, 21 dias de tratamento, injeção intravítrea (IVT), dose única.
[00305] Foi observado um “knock down” para 3 oligonucleotídeos do HTRA1 LNA direcionados ao "ponto de acesso" no pré-mRNA do HTRA1 humano entre a posição 53113 - 53384 tanto no mRNA na retina quanto no nível de proteínas na retina e no vítreo (vide a Figura 5). Animais
[00306] Todas as experiências foram realizadas em macacos Cynomolgus (Macaca fascicularis).
[00307] Quatro animais foram incluídos em cada grupo do estudo, 20 no total.
Compostos e procedimentos de dosagem
[00308] A analgesia com buprenorfina foi administrada antes e dois dias após a injeção do composto em teste. Os animais foram anestesiados com uma injeção intramuscular de cetamina e xilazina. O item de teste e o controle negativo (PBS) foram administrados por via intravítrea em ambos os olhos dos animais anestesiados (50 µL por administração) no dia 1 do estudo após a aplicação local do anestésico tetracaína. Eutanásia
[00309] No final da fase em vida (dia 22), todos os macacos foram sacrificados por injeção intraperitoneal de sobredosagem de pentobarbital. Medição do conteúdo de oligo e quantificação da expressão do RNA Htra1 por qPCR.
[00310] Imediatamente após a eutanásia, os tecidos oculares foram rápida e cuidadosamente dissecados no gelo e armazenados a -80ºC até o envio. A amostra de retina foi lisada em 700 µL de tampão de isolamento de RNA de MagNa Pure 96 LC e homogeneizada pela adição de 1 esfera de aço inoxidável por tubo de 2 ml, 2 x 1,5 min, utilizando-se um homogeneizador de evolução de pré-células, seguido de 30 min. de incubação sob a temperatura ambiente. As amostras foram centrifugadas, 13000 rpm, 5 min. Metade foi reservada para bioanálise e, para a outra metade, a extração de RNA continuou diretamente.
[00311] Para a bioanálise, as amostras foram diluídas 10 a 50 vezes para as medições do teor de oligo com um método ELISA de hibridação. Uma sonda de captura de LNA biotinilada e uma sonda de detecção de LNA conjugada com “digoxigenina” (as duas 35 nM em 5xSSCT, cada uma complementar a uma extremidade do oligonucleotídeo LNA a ser detectado) foram misturadas com os homogenatos diluídos ou padrões relevantes, incubados durante 30 minutos sob a temperatura ambiente e depois adicionado a placas ELISA revestidas com estreptavidina (Nunc cat. n ° 436014).
[00312] As placas foram incubadas durante 1 hora sob a temperatura ambiente, lavadas em 2xSSCT (cloreto de sódio 300mM, citrato de sódio 30 mM e Tween-20 a 0,05% v/v, pH 7,0). Os dúplex de LNA capturados foram detectados usando-se anticorpos anti-DIG conjugados com fosfatase alcalina (Roche Applied Science cat. No. 11093274910) e um sistema de substrato de fosfatase alcalina (substrato Blue Phos, código de produto KPL 50-88-00). A quantidade de complexos oligo foi medida como absorvância a 615 nm em uma leitora Biotek.
[00313] Para extração de RNA, o kit de grande volume de RNA celular (05467535001, Roche) foi utilizado no sistema MagNA Pure 96 com o programa: Tissue FF standard LV3.1 de acordo com as instruções do fabricante, incluindo o tratamento com DNAse. O controle da qualidade do RNA e a concentração foram medidos com uma leitora Eon (Biotek). A concentração de RNA foi normalizada entre as amostras e a subsequente síntese de cDNA e qPCR foi realizada em uma reação de uma etapa usando-se qScript XLT RT-qPCR ToughMix Low ROX, 95134-100 (Quanta Biosciences). Os seguintes ensaios de preparador TaqMan foram utilizados em reações simples: Htra1, Mf01016150_, Mf01016152_m1 e Rh02799527_m1 e genes de limpeza, ARFGAP2, Mf01058488_g1 e Rh01058485_m1 e ARL1, Mf02795431_ Technologies. As análises de qPCR foram executadas em uma máquina ViiA7 (Life Technologies). Olhos/grupo: n = 3 olhos. Cada olho foi tratado como uma amostra individual. O nível de expressão relativo do mRNA de Htra1 é mostrado como% de controle (PBS). Histologia
[00314] Os globos oculares foram removidos e fixados em formalina tamponada neutra a 10% durante 24 horas, aparados e embebidos em parafina.
[00315] Para a análise ISH, seções de tecido de cino retina fixado em formalina e parafinado com 4 µm de espessura foram processadas usando-se o Módulo de coloração Ventana Dicovery ULTRA totalmente automatizado (Procedimento: mRNA Discovery Ultra Red 4.0 - v0.00.0152) usando o RNAscope 2.5 VS Probe-Mmu -HTRA1, REF 486979, Advanced Cell Diagnostics, Inc .. O cromogênio usado é o Fastred, contra-coloração de Hematoxilina II. Quantificação da proteína HTRA1 usando-se uma abordagem por espectrometria de massa por imuno precipitação em placas (IP-MS). Preparação de amostra, Retina
[00316] As retinas foram homogeneizadas em 4 volumes (p / v) de tampão RIPA (Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, ácido desoxicólico 0,25%, NP-40 a 1%, NP-40 a 1 mM EDTA, Millipore) com inibidores de protease (EDTA completo Roche) usando-se um Precellys 24 (5500, 15 s, 2 ciclos). Os homogenatos foram centrifugados (13.000 rpm, 3 min) e o conteúdo de proteína dos sobrenadantes foi determinado (ensaio da proteína Pierce BCA). Preparação de amostra, Vítreo
[00317] Os humores vítreos (300 μl) foram diluídos com tampão RIPA 5x (concentração final: Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, ácido desoxicólico a 0,25%, NP- 40 a 1%, EDTA 1 mM) com inibidores de protease (EDTA completo) Roche) e homogeneizado usando-se um Precellys 24 (5500, 15 s, 2 ciclos). Os homogenados foram centrifugados (13.000 rpm, 3 min) e o conteúdo de proteína dos sobrenadantes foi determinado (ensaio da proteína Pierce BCA). Imunoprecipitação HTRA1 baseado em placa e digestão tríptica
[00318] Uma placa de 96 poços (Nunc MaxiSorp) foi revestida com anticorpo monoclonal de camundongo anti- HTRA1 (R&D MAB2916, 500 ng/poço em 50 μl de PBS) e incubada durante a noite sob 4ºC. A placa foi lavada duas vezes com PBS (200 μl) e bloqueada com BSA a 3% (p/v) em PBS por 30 min. a 20ºC, seguida de duas lavagens com PBS. As amostras (75 μg de retina, 100 μg de vítreo em 50 μl de PBS) foram randomizadas e adicionadas à placa, seguidas de incubação durante a noite sob 4ºC em um agitador (150 rpm). A placa foi então lavada duas vezes com PBS e uma vez com água. DTT 10 mM em TEAB 50 mM (30 μl) foram então adicionados a cada poço, seguido de incubação durante 1 h sob 20ºC para reduzir os sulfidrilos de cisteína. 150 mM de Iodoacetamida em TEAB 50 mM (5 μl) foram então adicionados a cada poço, seguido de incubação durante 30 min. sob 20ºC no escuro, a fim de bloquear os sulfidrilos de cisteína. Foram adicionados 10 μl de solução de digestão a cada poço (concentrações finais: 1,24 ng/μl de tripsina, 20 fmol/μl de peptídeos BSA, 26 fmol/μl de peptídeos HTRA1 marcados com isótopos, 1 fmol/μl de peptídeo iRT, Biognosys) seguido de incubação durante a noite sob 20ºC. Quantificação do peptídeo HTRA1 por espectrometria de massa direcionada (monitoramento de reação selecionado, SRM)
[00319] A análise por espectrometria de massa foi realizada em um Ultimate RSLCnano LC acoplado a um espectrômetro de massa com triplo quadrupolo TSQ Quantiva (Thermo Scientific). Amostras (20 μL) foram injetadas diretamente da placa de 96 poços usada para IP e carregadas a 5 μL/min durante 6 min. em uma coluna de retenção Acclaim Pepmap 100 (100 μm x 2 cm, C18, 5 μm, 100 Å, Thermo Scientific ) no tampão de carga (ácido fórmico a 0,5% v/v, ACN a 2% v/v). Os peptídeos foram então convertidos em uma coluna analítica PepMap Easy-SPRAY (75 μm x 15 cm, 3 μm, 100 Å, Thermo Scientific) com emissor de eletropulverização integrado aquecido a 40ºC usando-se o seguinte gradiente sob uma vazão de 250 nL/min: 6 min, 98% de tampão A (2% de ACN, 0,1% de ácido fórmico), 2% de tampão B (ACN + 0,1% de ácido fórmico); 36 min., 30% de tampão B; 41 min., 60% de tampão B; 43 min., 80% de tampão B; 49 min., 80% de tampão B; 50 min., 2% de tampão B. O TSQ Quantiva foi operado na modalidade SRM com os seguintes parâmetros: tempo de ciclo, 1,5 s; tensão de pulverização, 1800 V; pressão do gás de colisão, 2 mTorr; Resolução Q1 e Q3, 0,7 FWHM; temperatura do tubo de transferência de íons 300 ºC. As transições SRM foram adquiridas para o peptídeo HTRA1 "LHRPPVIVLQR" e uma versão sintética marcada com isótopo (L- [U-13C, U-15N] R), a qual foi utilizada como padrão interno. A análise de dados foi realizada utilizando-se Skyline versão 3.6.
Transferência Western
[00320] Amostras de retina dissecadas em tubos de 0,5 pré-gelose (CK14_0,5 ml, Bertin Technologies) foram lisadas e homogeneizadas em tampão de lise RIPA (20-188, Milipore) com inibidores de protease (Proteases-Inhibitor Mini sem EDTA completo, 11 836 170 001, Roche).
[00321] Amostras de vítreo foram adicionadas a tubos de 0,5 Precellyses (CK14_0,5ml, Bertin Technologies) foram lisados e homogeneizados em tampão 1/4x de lise RIPA (20-188, Milipore) com inibidores de protease (Proteases- Inhibitor Mini sem EDTA completo, 11 836 170 001, Roche).
[00322] As amostras (retina 20 µg de proteína, vítreo 40 µg de proteína) foram analisadas em gel de gradiente de 4-15% (# 567-8084 Bio-Rad) sob condições redutoras e transferidas em nitrocelulose (# 170-4159 Bio- Rad) usando-se um Trans- Blot Turbo Device da Bio-Rad.
[00323] Anticorpos primários: coelho anti-HTRA1 humano (SF1) foi um presente gentil de Sascha Fauser (Universidade de Colônia), Gapdh anti-humano de camundongo (# 98795 Sigma-Aldrich). Anticorpo secundário: cabra anti- coelho 800CW e cabra anti-rato 680RD eram de Li-Cor.
[00324] A mancha foi analisada e analisada em um Odyssee CLX da Li-Cor. Exemplo 10 – Avaliação de Macaco Cynomolgus in vivo: determinação da proteína HTRA1 no humor aquoso e comparação com o mRNA do HTRA1 e inibição da proteína na retina.
[00327] Metodologia Experimental: Vide o exemplo acima. Foram colhidas amostras de humor aquoso e as amostras foram preparadas como de acordo com o exemplo 9 amostras de humor vítreo. As amostras de humor aquoso do macaco Cynomolgus (AH) foram analisadas com um ensaio baseado em tamanho em uma Metodologia Analítica: Sistema de Eletroforese Capilar (Peggy SueTM, Proteinsimple).
[00328] As amostras foram descongeladas em gelo e usadas não diluídas. Para quantificação, mutante recombinante HTRA1- S328A (Origene # TP700208). A preparação foi conforme descrito pelo fornecedor.
[00329] O anticorpo anti-HTRA humano coelho SF1 SF1 foi fornecido pelo Prof. Dr. Sascha Fauser e usado diluído 1: 300. Todos os outros reagentes eram da Proteinsimple.
[00330] As amostras foram processadas em triplicata técnica, curva de calibração em duplicado usando-se um módulo de separação de 12 -230 kDa. A área abaixo do pico foi calculada e analisada usando-se Xlfit (software IDBS).
Resultados Numera- Composto ção de ID figuras mRNA_retina proteina_retina proteina_AH PBS - 82 101 95 PBS - 107 99 118 # 15,3 B 56 73 51 # 15,3 B 52 53 68 # 17 # 73,1 23 41 47 # 17 # 73,1 26 44 44 # 18 # 86,1 32 29 44 # 18 # 86,1 23 28 64
# 19 # 67,1 34 39 44 # 19 # 67,1 34 61 42 Nota - Os compostos IDs mostrados nas Figuras 12-14 utilizam um sistema de numeração diferente como o restante dos exemplos. A tabela acima proporciona a chave para a numeração usada nas Figuras 12 a 14, em comparação com aquela usada nos exemplos anteriores e em outras partes deste documento.
[00332] A Figura 12A mostra uma visualização dos níveis de proteína HTRA1 no humor aquoso de macacos administrados com os compostos B e # 73,1, com amostras colhidas nos dias 3, 8, 15 e 22 após a injeção. A Figura 12B proporciona a curva de calibração usada no cálculo dos níveis de proteína HTRA1. A Figura 12C proporciona os níveis calculados de HTRA1 a partir do humor aquoso de cada animal, traçados contra o tempo após a injeção.
[00333] A Figura 13 ilustra uma correlação direta entre o nível de proteína HTRA1 no humor aquoso e o nível de mRNA de HTRA1 na retina. Os níveis de proteína HTRA1 de humor aquoso podem, portanto, ser utilizados como um biomarcador para os níveis de mRNA da retina HTRA1 ou inibição do mRNA da retina HTRA1.
[00334] A Figura 14 mostra que também há uma correlação entre os níveis de proteína HTRA1 na retina e os níveis de proteína HTRA1 no humor aquoso, embora a correlação não tenha sido, nestae experiência, tão forte quanto a correlação entre a inibição do mRNA de HTRA1 na retina e os níveis de proteína HTRA1 na retina. humor aquoso, indicando que os níveis de proteína HTRA1 do humor aquoso são particularmente adequados como biomarcadores para os antagonistas do mRNA do HTRA1.

Claims (23)

REIVINDICAÇÕES
1. Oligonucleotídeo anti-sentido de 10 a 30 nucleotídeos de comprimento, em que o referido oligonucleotídeo anti-sentido tem como alvo um ácido nucleico HTRA1 e compreende uma região nucleotídica contígua de 10 a 22 nucleotídeos que são pelo menos 90%, como complementaridade de 100% a SEQ ID NO 113.
2. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com a reivindicação 1, em que a região de nucleotídeos contíguos é plenamente complementar a uma sequência selecionado a partir do grupo que consiste de SEQ ID No 231, 186, 192 e 205.
3. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a região de nucleotídeos contíguos compreende pelo menos 12 nucleotídeos contíguos plenamente complementares a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste da SEQ ID NO 124 – 230.
4. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 – 3, em que a região de nucleotídeos contíguos compreende pelo menos 12 nucleotídeos contíguos que são plenamente complementares à SEQ ID NO 113.
5. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 – 4, em que a região de nucleotídeos contíguos compreende pelo menos 14 nucleotídeos contíguos que são plenamente complementares à SEQ ID NO 113.
6. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 – 5, em que a região de nucleotídeos contíguos do oligonucleotídeo consiste ou compreende uma sequência selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NO 67, 73 e 86, ou pelo menos 12 nucleotídeos contíguos das mesmas.
7. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 – 6, em que a região de nucleotídeos contíguos do oligonucleotídeo compreende um ou mais nucleosídeos modificados por açúcar 2’ tais como um ou mais nucleosídeos modificados por açúcar 2’ selecionados independentemente a partir do grupo que consiste de 2’-O- alquila -RNA, 2’-O-metil -RNA, 2’-alcoxi -RNA, 2’-O- metoxietil-RNA, 2’-amino-DNA, 2’-fluoro-DNA, ácido arabino nucleico (ANA), 2’-fluoro-ANA e núcleosideos de LNA.
8. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 - 7, onde a região de nucleotídeos contidos em oligonucleotídeo compreende pelo menos uma ligação internucleosídica modificada, tal como uma ou mais ligações internucleosídeos fosforotioato, ou de forma tal que todas as ligações internucleosídeos dentro de uma região de nucleotídeos contíguos são compreendidos por ligações internucleosídeos de fosforotioato.
9. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 - 8, em que o oligonucleotídeo ou sua sequenciado nucleotídeos contiguous é ou compreende um espaçâmero, tal como um espaçâmero de fórmula 5’-F-G-F’-3’, onde a região F e F’ compreendem independentemente 1 - 7 nucleosídeos modificados por açúcar e G é compreendido por uma região de 6 - 16 nucleosídeos que é capaz de recrutar RNaseH, em que os núcleosídeos das regiões F e F’ que ficam adjacentes à região G são sugar modified nucleosídeos modificados por açúcar.
10. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com a reivindicação 9, em que pelo menos um ou ambos da região F e F’ compreendem pelo menos um nucleosídeo LNA.
11. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 – 10, em que a região de nucleotídeos contíguos é selecionada a partir do grupo selecionado a partir de: TTCtatctacgcaTTG (SEQ ID NO 67), CTTCttctatctacgcAT (SEQ ID NO 73), e TACTttaatagcTCAA (SEQ ID NO 86); em que letras maiúsculas são nucleotídeos de LNA e letras minúsculas são nucleosídeos de DNA e resíduos de citosina são opcionalmente 5-metil citosina.
12. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com a reivindicação 10 ou 11, em que os nucleosídeos de LNA são compreendidos por nucleosídeos beta-D-oxi LNA.
13. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 – 12, em que as ligações internucleotídicas entre os nucleotídeos de uma região de nucleotídeos contíguos são todas compreendidas por ligações internucleotídicas de fosforotioato.
14. Oligonucleotídeo que compreende ou que consiste de um oligonucleotídeo selecionado a partir do grupo que consiste de : TsTsmCstsastscstsasmcsgscsasTsTsG (SEQ ID NO 67,1), m CsTsTsmCststscstsastscstsasmcsgscsAsT (SEQ ID NO 73,1), e
TsAsmCsTststsasastsasgscsTsmCsAsA (SEQ ID NO 86,1); em que as letras maiúsculas representam nucleosídeos LNA beta-D-oxi, as letras minúsculas são nucleosídeos DNA, o subscrito s representa uma ligação internucleosídeos fosforotioato e mC representa 5 nucleosídeos metil-citosina beta-D- oxi LNA e mc representa 5 nucleosídeos DNA de metil citosina.
15. Sal farmaceuticamente aceitável de acordo com qualquer um dos oligonucleotídeos das reivindicações 1 – 14.
16. Conjugado que compreende o oligonucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 – 15, e pelo menos uma porção de conjugado anexada de forma covalente ao referido oligonucleotídeo.
17. Composição farmacêutica que compreende o oligonucleotídeo da acordo com a reivindicação 1 – 15 ou o conjugado da reivindicação 16 e um diluente, solvente, carreador, sal e/ou adjuvante farmaceuticamente aceitável.
18. Método in vivo ou in vitro para modular a expressão de HTRA1 em uma célula alvo que é expressora de HTRA1, o dito método compreendendo a administração de um oligonucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 – 15 ou o conjugado de acordo com a reivindicação 16 ou a composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 17 em uma quantidade efetiva à referida célula.
19. Método para tratar ou prevenir uma enfermidade que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente efetiva de um oligonucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15 ou do conjugado de acordo com a reivindicação 16 ou a composição farmacêutica da reivindicação 17 a um paciente que sofre ou é suscetível à enfermidade.
20. Oligonucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 – 15 ou o conjugado de acordo com a reivindicação 16 ou a composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 17 para o uso na medicina.
21. Oligonucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 – 15 ou o conjugado de acordo com a reivindicação 16 ou a composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 17 para o uso no tratamento ou prevenção de uma enfermidade, é selecionado a partir do grupo que consiste em degeneração macular (tais como wetAMD, dryAMD, atrofia geográfica, dAMD intermediária, retinopatia diabética), doença de Parkinson, doença de Alzhiemer, distrofia muscular de Duchenne, artrite, tais como osteoartrite e enfermidade cerebral isquêmica familiar de pequenos vasos.
22. Use do oligonucleotídeo das reivindicações 1 – 15 ou o conjugado de acordo com a reivindicação 16 ou a composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 17, para a preparação de um medicamento destinado ao tratamento ou prevenção de uma enfermidade, é selecionado a partir do grupo que consiste em degeneração macular (tais como wetAMD, dryAMD, atrofia geográfica, dAMD intermediária, retinopatia diabética), doença de Parkinson, doença de
Alzhiemer, distrofia muscular de Duchenne, artrite, tais como osteoartrite e enfermidade cerebral isquêmica familiar de pequenos vasos.
23. Uso do método de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 – 22, em que o método ou uso destina-se ao tratamento de degeneração macular.
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