CN108374043B

CN108374043B - 帕金森相关的生物标志物及其应用

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Publication number: CN108374043B
Application number: CN201810168896.2A
Authority: CN
Inventors: 肖枫; 汪冰怡
Original assignee: Qingdao Yangshen Biomedical Co Ltd
Current assignee: Qingdao Yangshen Biomedical Co Ltd
Priority date: 2018-02-28
Filing date: 2018-02-28
Publication date: 2020-08-11
Anticipated expiration: 2038-02-28
Also published as: CN108374043A

Abstract

本发明公开了帕金森相关生物标志物及其应用，所述生物标志物为LOC101927369。本发明通过高通量测序技术发现了LOC101927369基因在帕金森患者中呈现差异表达，进一步细胞实验证明，下调LOC101927369的表达水平可以影响帕金森细胞系的增殖，提示LOC101927369可作为分子靶点应用于帕金森的临床诊断和治疗。

Description

帕金森相关的生物标志物及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种帕金森相关的生物标志物及其应用，具体的生物标志物为LOC101927369。

背景技术

帕金森病(Parkinson's disease，PD)，是一种突发的，进展缓慢的中枢神经系统变性疾病，其共同临床特征为节律性静止性震颤，动作的缓慢与缺失，肌肉僵直和姿势不稳，因此又被称震颤麻痹(paralysis agitans)。除上述典型的运动症状外，PD另外一重要的临床表现为非运动症状，包括认知障碍、精神及行为异常(抑郁、焦虑、强迫、冲动等)、睡眠障碍、自主神经功能紊乱(胃肠、心血管、尿便、体温等功能异常)和感觉障碍等(Lai SW,Lin CL,Liao KF,et al.Increased risk of Parkinson's disease in cataractpatients:a population-based cohort study[J].Parkinsonism Relat Disord.2015,21(1):68-71)。相对于有明确病因(如药物、感染、中毒、脑损伤等)所导致的继发性帕金森综合症而言，目前尚无法通过病史资料或客观检查确定本病病因，故PD也被称原发性帕金森病。

由于PD致病原因十分复杂，因此目前的治疗，主要为改善临床症状、延缓疾病发展，提高生活质量(Pachana NA,Egan SJ,Laidlaw K,et al.Clinical issues in thetreatment of anxiety and depression in older adults with Parkinson's disease[J].Mov Disord.2013,28(14):1930-1934.)。治疗本病的药物主要包括复方左旋多巴制剂、单胺氧化酶抑制剂、多巴胺受体激动剂、抗胆碱能药物和金刚烷胺等(Connolly BS,Lang AE.Pharmacological treatment of Parkinson disease:a review[J].JAMA.2014,311(16):1670-1683.)；部分患者可考虑神经核团毁损术或脑深部电刺激手术。然而，截至目前，仍缺乏有效的治愈方法。

鉴于PD发病率逐年升高，致残率高，严重影响患者生存质量，且目前缺乏根治方法，因此揭示PD的发病机理，寻找一种有价值的分子为PD的治疗提供新的靶点，对于有效预防治疗PD具有重要的临床意义。

发明内容

本发明的目的之一，在于提供一种可用于帕金森病诊断的分子标志物，相比传统的帕金森病的诊断方法，使用基因标志物来诊断帕金森病具有及时性、特异性和灵敏性，从而使患者在早期就能知晓疾病风险，从而采取相应的措施。

本发明的目的之二，在于提供一种可用于帕金森治疗的分子靶点，通过靶向分子靶点，改变分子靶点的表达情况，从而达到治疗或缓解疾病的效果。

本发明的目的之三，在于提供一种筛选治疗帕金森的候选化合物的方法，通过检测待筛选化合物是否改变标志物的水平，判断化合物是否具有潜在的治疗帕金森的作用。

本发明的目的之四，在于提供一种诊疗帕金森的产品，所述产品包括针对分子标志物的试剂。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面提供了一种试剂，所述试剂能够检测LOC101927369的水平。

进一步，所述试剂包括：

特异性识别LOC101927369的探针；或

特异性扩增LOC101927369的引物。

在本发明的具体实施方式中，特异性扩增LOC101927369的引物的引物序列如SEQID NO.2～3所示。

本发明的第二方面提供了一种试剂盒，包括本发明第一方面所述的试剂，所述试剂能够检测LOC101927369的水平。

本发明的第三方面提供了一种芯片，包括本发明第一方面所述的试剂，所述试剂能够检测LOC101927369的水平。

本发明的第四方面提供了一种药物组合物，包括LOC101927369的抑制剂。其中，所述抑制剂选自：以LOC101927369基因为靶序列、且能够抑制LOC101927369基因的干扰分子，包括：shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。

进一步，所述抑制剂为siRNA，优选的，siRNA的序列如SEQ ID NO.6～7所示。

本发明的药物还可与其他治疗帕金森的药物联用，多种药物联合使用可以大大提到治疗的成功率。

本发明的第五方面提供了一种筛选治疗帕金森的候选物质的方法，所述方法包括：

用待筛选物质处理表达或含有LOC101927369基因的培养体系；和

检测所述体系中LOC101927369基因的表达；

其中，若待筛选物质可降低LOC101927369基因的表达或活性，则表明该物质是预防或治疗帕金森的候选物质。

所述培养体系包括(但不限于)细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物模型，优选非人哺乳动物的动物模型，如鼠、兔、羊、猴等)等。

本发明的第六方面提供了如下任一项所述的应用：

a.本发明第一方面所述的试剂在制备诊断帕金森的产品中的应用；

b.本发明第二方面所述的试剂盒在制备诊帕金森的产品中的应用；

c.本发明第三方面所述的芯片在制备诊断帕金森的产品中的应用；

d.本发明第四方面所述的药物组合物在制备治疗帕金森的产品中的应用；

e.LOC101927369在筛选治疗帕金森的候选物质中的应用；

f.本发明第五方面所述的方法在筛选治疗帕金森的候选物质中的应用。

附图说明

图1显示利用QPCR检测LOC101927369基因在帕金森病患者血液中的表达情况；

图2显示利用QPCR检测siRNA对LOC101927369基因表达的影响；

图3显示利用MTT检测LOC101927369基因表达对帕金森神经细胞生长的影响。

具体的实施方式

本发明经过广泛而深入的研究，通过高通量方法，采检测帕金森患者和正常人血液中lncRNA的水平，发现其中具有明显差异的lncRNA基因，探讨其与帕金森的发生之间的关系，从而为帕金森的早期检测及靶向治疗寻找更好的途径和方法。通过筛选，本发明首次发现了帕金森中LOC101927369显著性上调。实验证明，siRNA干扰沉默LOC101927369，能够有效地抑制帕金森细胞的增殖，为帕金森的个性化治疗提供了新途径。

LOC101927369基因

LOC101927369基因位于17号染色体长臂1区上，本发明中的LOC101927369包括野生型、突变型或其片段。本发明的LOC101927369具有如目前国际公共核酸数据库GeneBank中LOC101927369基因(NC_000017.11)所示的序列。在本发明的具体实施例中，一种代表性的人LOC101927369基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。

检测技术

本发明的lncRNA使用本领域普通技术人员已知的多种核酸技术进行检测，这些技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交和核酸扩增技术。

核酸测序技术的示例性非限制性实例包括但不限于链终止子(Sanger)测序和染料终止子测序。本领域的普通技术人员将认识到，由于RNA在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击，因此在测序前通常将RNA逆转录成DNA。

本发明可在检测前或与检测同时地对核酸(例如，ncRNA)进行扩增。核酸扩增技术的示例性非限制性实例包括但不限于：聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。本领域的普通技术人员将认识到，某些扩增技术(例如，PCR)需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(例如，RT-PCR)，而其他扩增技术则直接扩增RNA(例如，TMA和NASBA)。

通常称为PCR的聚合酶链式反应使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；TMA的转录介导的扩增(在基本上恒定的温度、离子强度和pH的条件下自身催化地合成靶核酸序列的多个拷贝，其中靶序列的多个RNA拷贝自身催化地生成另外的拷贝；LCR的连接酶链式反应使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补DNA寡核苷酸；其他扩增方法包括例如：通常称为NASBA的基于核酸序列的扩增；使用RNA复制酶(通常称为Qβ复制酶)扩增探针分子本身的扩增；基于转录的扩增方法；以及自我维持的序列扩增。

本发明中非扩增或扩增的核酸可通过任何常规的手段检测。

芯片、试剂盒

在本发明中芯片包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于LOC101927369所示的部分或全部序列。

所述固相载体包括无机载体和有机载体，所述无机载体包括但不限于有硅载体、玻璃载体、陶瓷载体等；所述有机载体包括聚丙烯薄膜、尼龙膜等。

“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

本发明中的示例性探针包括PCR引物以及基因特异性DNA寡核苷酸探针，例如固定于微阵列基底上的微阵列探针、定量核酸酶保护检验探针、与分子条形码连接的探针、以及固定于珠上的探针。

这些探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里，所谓“互补”，只要是杂交即可，可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选100％的同源性。这些探针可以是DNA，也可以是RNA，另外，可以为在其一部分或全部中核苷酸通过PNA(Polyamide nucleicacid，肽核酸)、LNA(注册商标，locked nucleic acid，Bridged Nucleic Acid，交联化核酸)、ENA(注册商标，2′-O,4′-C-Ethylene-bridged nucleic acids)、GNA(Glycerolnucleic acid，甘油核酸)、TNA(Threose nucleic acid，苏糖核酸)等人工核酸置换得到的多核苷酸。

本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒可用于检测LOC101927369的表达水平。在本发明的具体实施例中用于检测LOC101927369的表达水平的试剂包括特异性扩增LOC101927369的引物，所述引物序列序列如SEQ ID NO.2～3所示。所述的试剂盒中还含有用于标记RNA样品的标记物，以及与所述标记物相对应的底物。此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取RNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液等。此外，所述的试剂盒中还包括使用说明书和/或芯片图像分析软件。

本发明中基因检测试剂盒或基因芯片可用于检测包括LOC101927369基因在内的多个基因(例如，与帕金森相关的多个基因)的表达水平，将帕金森的多个标志物同时进行检测，可大大提高帕金森诊断的准确率。

抑制剂和药物组合物

基于发明人的发现，本发明提供了一种LOC101927369功能性表达的抑制剂，所述抑制剂的性质对本发明来说并不重要，只要它抑制LOC101927369基因的水平即可，这些抑制剂作为对于下调LOC101927369有用的物质，可用于预防或治疗帕金森。

在本发明中，关于LOC101927369的“功能性表达”，意指功能性基因产物的转录和/或翻译。对于像LOC101927369的非蛋白编码基因，“功能性表达”可以在至少两个水平上失调。第一，在DNA水平上，例如通过基因的缺失或破坏，或者是没有转录发生(在两种情况下都阻止相关基因产物的合成)。转录的缺失可以例如由表观遗传的变化(例如DNA甲基化)或由功能缺失性突变导致。如本文中所使用的“功能缺失”或“LOF”突变是，相对于赋予蛋白质增强的或新的活性的功能获得性突变而言，阻止、减少或消除基因产物的功能的突变。功能性缺失可由广泛的突变类型引起，包括但不限于整个基因或基因部分的删除、剪接位点突变、由小的插入和删除引起的移码突变、无义突变、取代了必需氨基酸的错义突变、和阻止产物的正确细胞定位的突变。该定义也包括LOC101927369基因的启动子或调控区域的突变，如果这些突变干扰了基因的功能。无效突变是完全破坏基因产物功能的LOF突变。一个等位基因中的无效突变通常将使表达水平降低50％但可能对基因产物的功能具有严重影响。值得注意的是，功能性表达也可以因为功能获得性突变而失调：通过赋予蛋白质新的活性，蛋白质的正常功能失调，表达的功能活性蛋白减少。反之亦然，功能性表达可以例如通过基因复制或通过缺乏DNA甲基化而增加。功能性表达也可以因为功能获得性突变而失调：通过赋予蛋白质新的活性，蛋白质的正常功能失调，表达的功能活性蛋白减少。反之亦然，功能性表达可以例如通过基因复制或通过缺乏DNA甲基化而增加。

第二，在RNA水平上，例如通过缺乏有效的翻译，例如因为mRNA的不稳定(例如通过UTR变体)，可以导致在转录物翻译之前mRNA被降解。或者通过缺乏有效的转录，例如因为突变诱导了新的剪接变体。

作为本发明的一种优选方式，所述LOC101927369的抑制剂是一种LOC101927369特异性的小干扰RNA分子。如本文所用，所述的“小干扰RNA”是指一种短片段双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA干扰(RNAinterference)过程。小干扰RNA可以制备成双链核酸的形式，它含有一个正义链和一个反义链，这两条链仅在杂交的条件下形成双链。一个双链RNA复合物可以由相互分离的正义链和反义链来制备。因此，举例来讲，互补的正义链和反义链是化学合成的，其后可通过退火杂交，产生合成的双链RNA复合物。

在筛选有效的siRNA序列时，本发明人通过大量的比对分析，从而找出最佳的有效片段。本发明人设计合成了多种siRNA序列，并将它们分别通过转染试剂转染帕金森细胞系进行验证，选出干扰效果最佳的siRNA，进一步地在细胞水平实验，结果证明对于该siRNA在能有效的抑制细胞中LOC101927369基因的表达水平，以及帕金森细胞的增殖。

本发明的核酸抑制物如siRNA可以化学合成，也可以通过一个重组核酸结构里的表达盒转录成单链RNA之后进行制备。siRNA等核酸抑制物，可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。

在本发明中，药学上可接受的载体包括(但不限于)缓冲剂、乳化剂、悬浮剂、稳定剂、防腐剂、生理食盐、赋形剂、填充剂、凝结剂与调和剂、界面活性剂、扩散剂、消泡剂。

本发明提供了一种药物组合物，它含有有效量的所述的LOC101927369的抑制剂，以及药学上可接受的载体。所述的组合物可用于抑制帕金森。任何前述的LOC101927369的抑制剂均可用于药物组合物的制备。

如本文所用，所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞(宿主细胞)转染试剂。

术语“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞(宿主细胞)转染试剂。

本发明可以采用用本领域熟知的多种方法来将所述的抑制剂或其编码基因、或其药物组合物给药于哺乳动物。包括但不限于：皮下注射、肌肉注射、经皮给予、局部给予、植入、缓释给予等；优选的，所述给药方式是非肠道给予的。

优选的，可采用基因治疗的手段进行。比如，可直接将LOC101927369的抑制剂通过诸如注射等方法给药于受试者；或者，可通过一定的途径将携带LOC101927369的抑制剂的表达单位(比如表达载体或病毒等，或siRNA或shRNA)递送到靶点上，并使之表达活性的LOC101927369抑制剂，具体情况需视所述的抑制剂的类型而定，这些均是本领域技术人员所熟知的。

统计学分析

在本发明的具体实施例中，实验都是按照至少重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1 筛选与帕金森病相关的基因标志物

1、样品收集

各收集10例正常人血液和帕金森病患者血液样本，写明样本名称、编号、取样日期、样本处理过程等情况，上述所有标本的取得均通过伦理委员会的同意。

2、RNA样品的制备

利用Invitrogen的血液RNA提取试剂盒提取RNA样品，具体操作详见说明书。

3、RNA样品的质量分析

将上述提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，利用Nanodrop2000对所提RNA的浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，Agilent2100测定RIN值。单次建库要求RNA总量5ug，浓度≥200ng/μL，OD260/280介于1.8～2.2之间。

4、去除rRNA

使用Ribo-Zero试剂盒除去总RNA中的核糖体RNA。

5、构建cDNA文库

利用Illumina TruseqTM RNA sample Prep Kit进行cDNA文库的构建，具体操作按说明书进行。

6、上机测序

使用Illumina X-Ten测序平台对cDNA文库进行测序，具体操作按说明书进行。

7、高通量转录组测序数据分析

对测序结果进行生物信息学分析，利用TopHat v1.3.1进行RNA-seq读段定位，通过Cufflinks v1.0.3将RNA-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度，利用cuffdiff检测差异表达，当p值<0.05时，认为基因显著差异表达。

8、结果

RNA-seq结果显示，LOC101927369基因在帕金森病患者血液中的表达量显著高于正常人血液中的水平。

实施例2 QPCR测序验证LOC101927369基因的差异表达

1、根据高通量测序的检测结果选择LOC101927369基因进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式选择帕金森患者血液和正常人血液各60例。

2、RNA提取

3、逆转录：

(1)取总RNA 2μg进行逆转录，加入Oligo(dT)2μl，充分混匀。70℃水浴5分钟后立即冰浴2-3分钟。

(2)构建25μl反应体系，其中包括5×逆转录缓冲液5μl，dNTP(2.5mM)5μl，RNasin40U/μl，M-MLV 200U/μl，补无核酶水至预期体积。

(3)42℃水浴60分钟后，95℃水浴5分钟以灭活M-MLV。

(4)-20℃储存备用。

4、QPCR扩增

(1)引物设计

根据Genbank中LOC101927369基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如下：

LOC101927369基因：

正向引物为5’-AAGTTGCTGAGTGAAGTC-3’(SEQ ID NO.2)；

反向引物为5’-AGGTTCTATGCTCTGTCT-3’(SEQ ID NO.3)。

GAPDH基因：

正向引物为5’-TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3’(SEQ ID NO.4)；

反向引物为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO.5)。

(2)PCR反应体系：正向引物和反向引物各0.6μl，2×SuperReal PreMix Plus 10μl，DNA模板2μl，ddH₂O 7.4μl，50×ROX Reference Dye^△2μl，灭菌蒸馏水4.8μl。

(3)PCR反应条件：95℃15min，(95℃10s，55℃30s，72℃32s)×40个循环，95℃15s，60℃60s，95℃15s。在ABI 7300型荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

5、统计学方法

实验采用3次重复实验，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，使用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

6、结果

结果如图1所示，与正常人血液相比，LOC101927369基因在帕金森病患者血液中的表达上调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同RNA-sep结果一致，提示LOC101927369作为生物标志物应用于帕金森患者的诊断。

实施例3 抑制LOC101927369基因表达

1、细胞培养

多巴胺神经元细胞SH-SY5Y，以含10％胎牛血清、1％P/S的DMEM培养液中(pH7.2～7.4)，在37℃、5％CO₂、相对湿度为90％的培养箱中培养。每隔2天换液一次，待细胞生长至90％接触时进行传代，用PBS清洗后加入0.25％-EDTA胰蛋白酶消化使细胞从瓶壁上分离下来，用含胎牛血清的DMEM培养液终止胰酶消化反应，1000g离心2min，弃上清，用新配置的培养液重悬，以1:3～1:4比例传代，24小时后细胞进入对数生长期更换培养液，并根据实验要求给予不同的干预。

2、siRNA设计

针对LOC101927369的siRNA序列：

sirna1：

正义链为5’-aauaagguuguacaaucaccu-3’(seq id no.6)，

反义链为5’-gugauuguacaaccuuauuca-3’(seq id no.7)；

sirna2：

正义链为5’-uacuuguaggguuguucugag-3’(seq id no.8)，

反义链为5’-cagaacaacccuacaaguaga-3’(seq id no.9)；

sirna3：

正义链为5’-uuacacaaugggaauuggggc-3’(seq id no.10)，

反义链为5’-cccaauucccauuguguaaaa-3’(seq id no.11)。

3、重组腺病毒

根据腺病毒介导的siRNA的不同，将细胞分为五组，SH组：不转染任何病毒载体的SH-SY5Y细胞，作为空白对照；Ad组：感染空腺病毒质粒细胞组，siRNA1组：腺病毒介导干扰序列1感染细胞组：siRNA2组：腺病毒介导干扰序列2感染细胞组；siRNA3组：腺病毒介导干扰序列3感染细胞组。

将细胞按1×10⁵/孔接种到6孔细胞培养板中，每孔2ml，在37℃、5％CO₂培养箱中细胞培养24h，此时细胞融合密度约为50％-60％；吸出上清弃掉，用无血清培养基1ml洗两遍，用1ml无血清培养基稀释的MOI为50的各组腺病毒，每间隔20min摇晃培养板一次，以增加感染效果，感染48h后，再加入浓度为1000μmol/L MPP⁺完全培养基，孵育24h后。收集细胞用于提取RNA；

3、QPCR检测LOC101927369基因的转录水平

3.1细胞总RNA的提取

采用TRIzol Reagent(Invitrogen Cat.No.15596-018)总RNA提取试剂，按说明书提供方法提取SH-SY5Y细胞的总RNA。

3.2逆转录步骤同实施例2。

3.3 QPCR扩增步骤同实施例2。

4、统计学方法

实验采用3次重复实验，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，使用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，干扰LOC101927369基因表达组与对照组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

5、结果

结果如图2显示，与对照相比，实验组能抑制LOC101927369的水平，相比siRNA1、siRNA3，siRNA2抑制效果更为显著，差异具有统计学意义(P<0.05)，因此选择siRNA2进行后续的实验。

实施例4 LOC101927369基因对神经细胞的影响

采用MTT实验检测LOC101927369基因对SH-SY5Y帕金森病细胞模型细胞增殖能力的影响。

1、细胞培养与腺病毒感染步骤同实施例3。

2、步骤：

调整SH-SY5Y细胞密度至5×10⁴/mL，以每孔100μl细胞接种于96孔培养板中，按照实施例3处理细胞，在处理后每隔12h应用MTT检测，直至72h。

MTT还原分析法检测细胞活性：将孔内溶液弃掉，加入100μl培养基，再每孔加入5mg/mL的MTT液10μl，37℃培养4h后，吸去培养基，每孔加入DMSO100μl，室震荡10min，使紫蓝色沉淀充分溶解，用酶标仪在490nm波长测吸光度值(OD值)。将OD值作为反映SH-SY5Y细胞活性的参数。

3、统计学方法

实验采用3次重复实验，使用SPSS18.0统计软件来进行统计分析，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

4、结果

图3所示的结果显示：siRNA2组的细胞生长速度高于对照组组的细胞生长速度，差异具有统计学意义(P<0.05)。上述结果表明LOC101927369过表达不利于SH-SY5Y细胞的生长，通过抑制LOC101927369基因的表达可以促进神经细胞的生长。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 北京泱深生物信息技术有限公司

<120> 帕金森相关的生物标志物及其应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3481

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

ttagcctccc aaaatgctgg gattacaggc atgagccacc atgcctggcc ctgtttcagg 60

tttaaatgcc ataacctcca tgaaaatccc tagcaagcag caggtactca gggtggtgtt 120

tgttcccaca gtgactgtat gtatctgggg gacaacacgg gtaatgcatg agattcacaa 180

gtccatatgt aacccacaca ttgtctgtaa aattaataag tgatgtttta ttcttttcaa 240

atataagtag agactgctgt aaataacaca aactcctatt tagtggcatt actgaatcca 300

ttaggcatgt atgcagatac tttattacta caaatttagc tatcctatga gtaatttaac 360

atttctgatg ttttaaaagg gccctcatga ggcaatttga aaatatgtat ctaaagcctt 420

aatattaggc agggccctgg gctttgaata aagactcgtt ttgaggtcca cagagaggag 480

acacaaggcc acaagatggt cccatggcta gcaagtggca gagtccagat ccaaaggatg 540

tctgtctgac tccagacctc aggatcttaa cccccacacg atgctaatgt tccttactga 600

ccaagggagg ttcagagaag gtacatacct agtgccaact tcacactacc atttatcgag 660

cacttgctat gtactcaata aataagcact aagagctagg tgattgtaca accttattca 720

agtctcagaa caaccctaca agtagaaact attgtctcca ttttagaatg aaagaggctc 780

tgggagtttg attcacttgc acaaagccac agaactagga aaaggagggt gcagggtttg 840

aatcgagtct atctgacttc agcccccctc acaatgctat actgctgcca gtctcggtgg 900

ggcttggact atgatgacgg ccccagaaat ggctgtcgct gtcggatgcc cccatgatct 960

catgtctcac ccagctcctg cttagaaggc gagagagtgg ttgtggagga agtccagcca 1020

gccagccaaa gatgggaaac cccactggga cagaatttgt tttctccagt tcggacttgg 1080

cagagagcag gaacgcatgg gtctgaggtg gaagaaacgg tcctgtggat gagtcagcag 1140

ctgccacagc agaaagcatt tgtggccgct ctgtgcaaag acgctgggta tttcttttgc 1200

tgttatctta tagtttgagt ggtttggagg aaaaggcaga agcatgtgga cagcagctcc 1260

tcatgattac ttcattcggg gaggcagcat gctgtgctga aaagtgttct ggctttggtg 1320

gcaaagagat cagctttgcc atttaccaac tgcttgatgt gggacacatt tcatctctca 1380

aagacccagt ttccatgcat ttgaaataag gatacaatat ttacttcaga aagctgttat 1440

gaagagtaaa tgcagatgtg aaatttacag atatttccac ctcatctgct ccagccagta 1500

ctgcagtggg aaggtcatgc actgcacagt gattgccagt agatggcgca atgggcctgc 1560

cgccatccca ggctttgttt ctgaacccag cgggagaggg agatgacaga aatctttatt 1620

gcaaactggg ggacaccatt agctacagtg gcctcctggg atcaccattt gcaatataag 1680

cccagtgact taaaggagag agtggagagg aatcatggta aggcttgtaa ctccaaggat 1740

gaagaacaac cagggcttgg ggatgggtga agaatcttct gaagaagtga cctggctact 1800

cttataaagc ctctgctggt tcaccctgct cccaagtgga acctctgtgg gtcactgcat 1860

ggcatgcagt atcctcctcc ctcaggctgt gagtataggt gacactaatt ctatgtgcta 1920

ttcatctcat ctcttcagtg tcaggtgtca tgggttcagc catctcacac tatttaaagt 1980

gggggacccg tccttcactg atggagtgga caggtgatca gagaaccatc ccaccaagag 2040

aaagaccctc ttgaggccct ccatctctgc atgtcaggtt cacagtaagt cttaacggtg 2100

ccaaacataa gcccttatgc cactcttctc ttctcttatc acctttgcac ccttctccaa 2160

cccacacaca tgcatacact gggcccctga cttccctctt cctagcttct ctttctgcta 2220

ttaactggca gttgctgcct aaactcgcca accaccttga gagttgtgag aggatagccc 2280

ggcagcctgt agctgtatgc tgggggtggg gagggctgaa aggaagagga cgtccaccct 2340

cccaatgtca agttgctgag tgaagtctcc tttgatgaca atgcagtagg gctaaagtgg 2400

actaaaattt gctttctctc tctcaggctg tgagacagag catagaacct gtgtcaggtc 2460

acaggagagt gatcccccaa cactttgggc catgttccaa ccctgcctgc cccaattccc 2520

attgtgtaaa atccatctgc aacctatgcc agccttccag aatgcagagg gaccctggga 2580

agagctggag aagagaagag gaagaaggat gggagacgga agattctcag ttggaaaaaa 2640

aaacagcagc aagaaacttt gtttaccttg ttggtcagat taaatttctg ccaccaaaag 2700

aaatcgagat tgaaaagcta agtttaatta tggagaaaat aaagttacat ttttttttgc 2760

acaacaaagt cattgactat gaaatttata agcatcatat gaaacagaca atcttatgaa 2820

acttaccaag gatgtttcca gcaacccctt gtttagggaa cagagtaaag gggagaaaag 2880

gtagcatttt caaatctcaa gaaagtgttt tatgtcagaa ttcaatttgt cccagagcac 2940

agctgtcaag agctttgtaa atctaggcct ctaggaggag agggctaaag cactttcagg 3000

ataaaggcta gaagcctaag gccctgatca tttgggcaat ccttgttatt gcatttgttg 3060

ttccattctc tgacacttct aaaaggctgt ggaatctcca gatgtgttca taaaatagtg 3120

gtagcaatta ttcattgctt ctaggaaagg gaaatggata tgttaccaac aaagccagtc 3180

cccatacaaa tggagtcttt ccccgtttag tgctgtgaag ccaatataca aaaccaaaag 3240

tgagtgtcaa gtagtgcagg ctttattcca tggccactgt attagtcagg gttctcttag 3300

agggacagaa ctaataggat agatgataga tagatgatag atagagagat agatagatag 3360

agagatagac agatataaag ggaatttatt aagtatcaac ttacatgatc acgaggtccc 3420

acaataggct gtctgcaagc tgaggagcaa gaagggccag tccaagtccc cagactgaag 3480

a 3481

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aagttgctga gtgaagtc 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aggttctatg ctctgtct 18

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tttaactctg gtaaagtgga tat 23

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggtggaatca tattggaaca 20

<210> 6

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aauaagguug uacaaucacc u 21

<210> 7

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gugauuguac aaccuuauuc a 21

<210> 8

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

uacuuguagg guuguucuga g 21

<210> 9

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cagaacaacc cuacaaguag a 21

<210> 10

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

uuacacaaug ggaauugggg c 21

<210> 11

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cccaauuccc auuguguaaa a 21

Claims

1.一种筛选治疗帕金森的候选物质的方法，其特征在于，所述方法包括：

用待筛选物质处理表达或含有LOC101927369 基因的体系；和

检测所述体系中LOC101927369基因的表达；

其中，若待筛选物质可降低LOC101927369基因的表达水平，则表明该物质是治疗帕金森的候选物质。

2.如下任一项所述的应用：

a. 能够检测LOC101927369的表达水平的试剂在制备诊断帕金森的产品中的应用；

b.试剂盒在制备诊断帕金森的产品中的应用，其特征在于，所述试剂盒包括能够检测LOC101927369的表达水平的试剂；

c.芯片在制备诊断帕金森的产品中的应用，其特征在于，所述芯片包括能够检测LOC101927369的表达水平的试剂；

d.药物组合物在制备治疗帕金森的产品中的应用，其特征在于，所述药物组合物包括LOC101927369的抑制剂，所述抑制剂降低LOC101927369的表达水平；

e. LOC100507053在筛选治疗帕金森的候选物质中的应用；

f.权利要求1所述的方法在筛选治疗帕金森的候选物质中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，a、b、c中所述的试剂包括：

特异性识别LOC101927369的探针；

或特异性扩增LOC101927369的引物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，特异性扩增LOC101927369的引物的引物序列如SEQ ID NO.2~3所示。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，d中所述的抑制剂为siRNA。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，d中的药物组合物还包括与所述抑制剂配伍的其他药类以及药学上可接受的辅料。