CN104962658A - Myoz1基因及其表达产物在帕金森病诊治中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了MYOZ1在帕金森病诊断和治疗中的作用，属于基因新用途技术领域。经实验证明，与正常人相比，帕金森病患者血液中的MYOZ1基因表达上调，表明可以通过检测血液中MYOZ1表达量来诊断受试者是否患有帕金森。本发明通过体外MTT实验发现，MYOZ1基因表达不利于人神经母细胞瘤细胞的生长。因此，MYOZ1在制备诊断和治疗帕金森病的产品中，具有良好的开发应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地涉及人MYOZ1基因在帕金森病诊断、治疗中的用途。
背景技术
帕金森病是一种常见的神经系统变性疾病，多见于老年人，平均发病年龄为60岁左右。我国65岁以上人群帕金森的患病率大约是1.7％。大部分的帕金森患者为散发病例，男性稍多于女性。该病最主要的病理改变是中脑黑质多巴胺能神经元的变性死亡，由此引起纹状体多巴胺含量显著减少而致病。帕金森病是一种慢性进展性疾病，具有高度异质性，目前尚不能治愈。严重者可全身僵硬，生活不能自理，甚至长期卧床，最终多死于肺炎等并发症。
帕金森病的诊断主要依靠病史、临床症状及体征。由于缺乏疾病特异性生物标志物和有效的实验室辅助检测方法，所以帕金森病在临床前期无法检测。当该病发展到临床期时，患者中脑多巴胺神经元蜕变已达70％。因此早诊早治是目前改善帕金森病患者长期生存的最佳途径。帕金森病的辅助检测方法如99mTc-TRODAT-1等作为示踪剂行多巴胺转运体功能显像可支持诊断，但是检查费用较贵，难以在临床大规模地推广。因此寻找一种特异和敏感的诊断方法愈发重要。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于帕金森病诊断的分子标志物MYOZ1基因。相比传统的帕金森病的诊断方法，使用基因标志物来诊断帕金森病具有及时性、特异性和灵敏性，从而使患者在早期就能知晓疾病风险，针对风险高低，采取相应的预防和治疗措施。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一种人MYOZ1基因及其表达产物在制备诊断帕金森病的产品中的应用。
进一步，上面所提到的诊断产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片检测MYOZ1基因及其表达产物的表达水平以诊断帕金森病的产品。
进一步，所述用RT-PCR诊断帕金森病的产品至少包括一对特异扩增MYOZ1基因的引物；所述用实时定量PCR诊断帕金森病的产品至少包括一对特异扩增MYOZ1基因的引物；所述用免疫检测诊断帕金森病的产品包括：与MYOZ1蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断帕金森病的产品包括：与MYOZ1基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断帕金森病的产品包括：蛋白质芯片和基因芯片；其中，蛋白质芯片包括与MYOZ1蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与MYOZ1基因的核酸序列杂交的探针。
优选地，所述产品包括芯片、试剂盒。
本发明还提供了人MYOZ1基因在高通量测序平台中的应用。随着高通量测序技术的发展，构建人的基因表达谱将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知人MYOZ1基因的表达异常与帕金森病相关也属于人MYOZ1基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。
本发明还提供了一种诊断帕金森病的产品，所述产品包括但不限于芯片、试剂盒。
其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测MYOZ1基因转录水平的针对MYOZ1基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体上的MYOZ1蛋白的特异性抗体。所述基因芯片可用于检测包括人MYOZ1基因在内的多个基因(例如与帕金森病相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括人MYOZ1蛋白在内的多个蛋白质(例如与帕金森病相关的多个蛋白质)的表达水平。通过将多个帕金森病的标志物同时检测，可大大提高帕金森诊断的准确率。
其中，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测MYOZ1基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括MYOZ1蛋白的特异性抗体。
进一步，所述试剂包括使用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片方法检测MYOZ1基因表达水平的试剂。优选地，所述试剂包括针对MYOZ1基因的引物和/或探针。根据MYOZ1核苷酸序列信息容易设计出可以用于检测MYOZ1基因表达水平的引物和探针。
进一步，与MYOZ1基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要能完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。
进一步，所述MYOZ1蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述MYOZ1蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰(例如，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能够保留与MYOZ1蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备是本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。
本发明还提供了人MYOZ1基因及其表达产物在制备治疗帕金森病的药物中的应用。
进一步，所述药物的主要活性成分包括抑制MYOZ1基因表达的物质、影响MYOZ1基因表达产物稳定性的物质、和/或抑制MYOZ1基因表达产物活性的物质。
进一步，本发明所述的治疗帕金森病的药物包括：通过干扰RNA抑制MYOZ1基因表达的双链核糖核酸，或基于MYOZ1抗原蛋白的肿瘤疫苗、或用于抑制MYOZ1蛋白活性的蛋白质。
本发明还提供了一种用于治疗帕金森病的药物组合物，所述药物组合物包含MYOZ1基因和/或其表达产物抑制剂。所述抑制剂包括抑制MYOZ1基因表达的物质、抑制MYOZ1基因表达产物稳定性的物质、和/或抑制MYOZ1基因表达产物活性的物质。
进一步，本发明所述抑制剂包括：通过干扰RNA抑制MYOZ1基因表达的双链核糖核酸，或基于MYOZ1抗原蛋白的肿瘤疫苗、或用于抑制MYOZ1蛋白活性的蛋白质。
在本发明中，所述RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指内源性或外源性双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)介导的细胞内mRNA发生特异性降解，从而导致靶基因的表达沉默，产生相应的功能表型缺失的现象。RNAi技术是一种典型的负调控机制，使用该技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，该技术已被广泛用于探索基因功能、基因治疗及新药开发领域。以细胞为基础的RNAi筛选在功能基因学研究方面具有许多优势，主要表现在大多数细胞类型都能使用RNAi方法，并且相对较容易下调或沉默目的基因的表达。
为了确保MYOZ1基因能够被高效剔除或沉默，根据MYOZ1基因的mRNA序列设计了siRNA特异性片段。siRNA的设计根据已发表的通用设计原则(Elbashiret.al 2001，Schwarz et.al 2003，Khvorova et.al 2003，Reynolds et.al 2004，Hsieh et.al2004，Ui-Tei et.al 2004)，通过在线工具完成设计，该在线工具为：siRNASelectionProgram of Whitehead Institute(BingbingYuan et.al 2004，http://jura.wi.mit.edu/bi℃/siRNAext/)和BL℃K-iTTM RNAi DesignerofINVITROGEN(winner of the 2004Frost&Sullivan Excellence in ResearchAward，https://rnaidesigner.invitrogen.com/sirna/)。为了进一步提高siRNA片断的有效性，综合两个在线设计工具的优点来设计用于筛选的siRNA片断。最后，通过同源性比对(NCBI BLAST)来过滤siRNA序列，以提高siRNA片断的特异性并减少RNAi干扰的脱靶效应。
本发明的药物还包括药学上可接受的载体，这类载体包括但并不限于：稀释剂、赋形剂如水等、填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇等。
本发明的药物还可与其他治疗帕金森的药物联用，多种药物联合使用可以大大提到治疗的成功率。
在本发明的上下文中，“MYOZ1基因”包括人MYOZ1基因以及与人MYOZ1基因的任何功能等同的多核苷酸。MYOZ1基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中MYOZ1基因(NC_000010.11)DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
优选地，MYOZ1基因的编码序列包括以下任一一种DNA分子：
(1)序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列；
(2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
(3)与(1)或(2)限定的DNA序列具有70％、优选地，90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。
在本发明的具体实施方案中，所述MYOZ1基因的编码序列是SEQ ID NO.1所示的DNA序列。
在本发明的上下文中，MYOZ1基因表达产物包括人MYOZ1蛋白以及人MYOZ1蛋白的部分肽。所述MYOZ1蛋白的部分肽含有与帕金森病相关的功能域。
“MYOZ1蛋白”包括人MYOZ1蛋白以及人MYOZ1蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括人MYOZ1蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与人MYOZ1的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。
优选地，MYOZ1蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质：
(1)由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(2)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个。
(3)与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(又称为序列同一性)，更优选地，与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列至少约90％至95％的同源性，常为96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列构成的多肽。
在本发明的具体实施方案中，所述MYOZ1蛋白是具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的蛋白质。
通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中氨基酸的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。
通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是MYOZ1蛋白的融合蛋白。对于与MYOZ1蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留MYOZ1蛋白的生物学活性即可。
本发明的MYOZ1蛋白也包括对SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的非保守修饰，只要经过修饰的蛋白质仍然能够保留MYOZ1蛋白的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突变的氨基酸数目通常是10个或者更少，例如6个或者更少，例如3个或者更少。
在本发明的上下文中，“诊断帕金森病”既包括判断受试者是否已经患有帕金森病、也包括判断受试者是否存在患有帕金森病的风险。
在本发明的上下文中，“治疗帕金森病”从疾病的状态变化来分，可以包括疾病的缓解、疾病的完全治愈；从药物发挥的作用不同，可以包括提高多巴胺效应、促进多巴胺的合成和释放、阻断多巴胺的降解。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现了MYOZ1基因表达与帕金森病相关，通过检测受试者血液中MYOZ1的表达，可以判断受试者是否患有帕金森病、或者判断受试者是否存在患有帕金森病的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。
本发明发现了一种新的分子标记物MYOZ1基因，相比传统的检测手段，基因诊断更及时、更特异、更灵敏，能够实现帕金森病的早期诊断，从而降低帕金森病的死亡率。
附图说明
图1显示利用QPCR检测MYOZ1基因在帕金森病患者血液中的表达情况；
图2显示利用QPCR检测siRNA对MYOZ1基因表达的影响；
图3显示利用MTT检测MYOZ1基因表达对帕金森神经细胞生长的影响。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:ColdSpring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1筛选与帕金森病相关的基因标志物
1.1样品收集
各收集10例正常人血液和帕金森病患者血液样本，上述所有标本的取得均通过伦理委员会的同意。
1.2RNA样品的制备及质量分析
1.2.1RNA样品的制备
使用U-gene公司的Blood RNA提取试剂盒提取总RNA。具体步骤如下：
1)每体积新鲜血液(最大1ml)加入5倍体积的1×XR-I缓冲液，例如：每1ml血液中加入5ml的XR-I缓冲液，漩涡振荡混匀；
2)冰浴15分钟，在漩涡振荡器上迅速混匀两次，溶液变清表明红血细胞已裂解。如果个别样品的血细胞计容或ECR升高时，延长冰浴时间至20min；
3)4℃下450g离心10min沉淀白细胞，完全弃去含有裂解红细胞的上清液；
4)用2倍体积的XR-I缓冲液洗涤在步骤1中用到的每体积的全血，漩涡振荡以完全悬浮细胞；
5)4℃下450g离心10min，并再次去掉上清；
6)往成团的白细胞中加入XR-II溶解缓冲液/2－巯基乙醇，漩涡振荡充分混匀。500μl以下的全血就加入400μl XR-II溶解缓冲液，如果在步骤1中用到的是0.5～1.0ml的血液，则加650μl XR-II溶解缓冲液。在加入XR-II溶解缓冲液之后，样品应保存于－70℃的条件下；
7)加入等体积的70％乙醇，漩涡振荡混匀；
8)把所有的样品(包括所有的沉淀)加到一个固定在一个2ml收集试管上的Mu-Pu RNA分离柱上。10,000g离心的15秒，弃去流出液体；
9)重复步骤7、8；
10)用移液枪吸750ul RNA洗涤缓冲液I直接加到自旋柱上洗涤柱子。如上方法离心并弃去2ml收集管；
11)把柱子装到提供的一干净的新2ml收集试管上，加入500μl用乙醇稀释的RNA洗涤缓冲液II，离心，弃去流出液，重复使用该收集试管；
12)加入400μl Wash solution，14000g离心2min；
13)再用500μl的RNA洗涤缓冲液II洗涤柱子，离心并弃去流出液。然后用一个空的收集试管，极速离心空柱子1min以甩干Mu-Pu柱基质；
14)洗脱RNA。把柱子转移到一干凈的1.5ml离心管(试剂盒无提供)并用50～100μl的DEPC-水(由试剂盒提供)洗脱RNA。确保加入的DEPC-水是直接加在柱基质上，极速离心1min；
15)加入100μl Enzyme Incubation Buffer和15μl DNase I，14000g离心1min；
16)将收集管中的溶液重新移入柱，室温放置15min；
17)将收集到的RNA保存在-70℃冰箱中，待用。
1.2.2RNA样品的质量分析(NanoDrop1000分光光度计)
NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。
1.2.3RNA样品的质量分析(Agilent Technologies 2100Bioanalyzer)
将上述提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，Agilent Technologies 2100Bioanalyzer检测RNA样品质量，观察28S rRNA和18S rRNA主带明显、无降解、RNA完整性指数合格、浓度达到要求的符合RNA-seq测序cDNA文库构建的要求，可以用于文库构建及测序。
1.3高通量转录组测序
1.3.1RNA-seq读段定位
首先将低质量的读段去除得到清洁读段，然后利用TopHat v1.3.1将清洁片段与UCSC H.sapiens参考基因组(hg19)进行匹配，H.sapiens UCSC hg19版的预先构建的索引从TopHat主页下载，并作为参考基因组，利用TopHat与基因组匹配时，允许每个读段(默认到20)有多个匹配位点，最多2次错配。TopHat根据外显子区域和GT-AG剪切信号建立可能的剪切位点库，根据这些剪切位点库将没有定位到基因组的读段定位到基因组上。我们使用TopHat方法的系统默认参数。
1.3.2转录丰度评估
匹配上的读段文件通过Cufflinks v1.0.3处理，Cufflinks v1.0.3将RNA-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度。FPKM值指的是每一百万测序片段中匹配到特定基因1kb长的外显子区域的片段数目。通过贝叶斯推理方法计算FPKM估计值的置信区间。Cufflinks使用的参考的GTF注释文件从Ensembl数据库下载(Homo_sapiens.GRCh37.63.gtf)。
1.3.3差异表达基因的检测
将下载的Ensembl GTF文件和通过TopHat匹配的原始文件传输到Cuffdiff，Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的转录本的表达丰度，检测差异表达。在Cuffidff输出中只有q值＜0.01，测试显示成功的比较才被认为是差异表达。
1.4结果
RNA-seq结果显示，MYOZ1基因在帕金森病患者血液中的表达量显著高于正常人。
实施例2QPCR测序验证MYOZ1基因的差异表达
1、根据高通量测序的检测结果选择MYOZ1基因进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式选择帕金森患者血液和正常人血液各90例。
2、RNA提取步骤同实施例1。
3、逆转录：使用TAKARA公司的反转录试剂盒进行操作。具体步骤如下：
(1)取总RNA 2μg进行逆转录，加入Oligo(dT)2μl，充分混匀。70℃水浴5分钟后立即冰浴2-3分钟。
(2)构建25μl反应体系，其中包括5×逆转录缓冲液5μl，dNTP(2.5mM)5μl，RNasin 40U/μl，M-MLV 200U/μl，补无核酶水至预期体积。
(3)42℃水浴60分钟后，95℃水浴5分钟以灭活M-MLV。
(4)-20℃储存备用。
4、QPCR扩增
(1)引物设计
根据Genebank中MYOZ1基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如下：
MYOZ1基因：
正向引物为5’-TATCACTGTGTTCAAGACCTA-3’(SEQ ID NO.3)；
反向引物为5’-GTCAATGCCAAGTTCCAT-3’(SEQ ID NO.4)。
GAPDH基因：
正向引物为5’-TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3’(SEQ ID NO.5)；
反向引物为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO.6)。
(2)按照表1配制PCR反应体系：
其中，SYBR Green聚合酶链式反应体系购自Invitrogen公司。
表1PCR反应体系
| 试剂 | 体积 |
| 正向引物 | 1μl |
| 反向引物 | 1μl |
| SYBR Green聚合酶链式反应 | 12.5μl |
| 体系模板 | 2μl |
| 去离子水 | 补足25μl |
(3)PCR反应条件：95℃10min，(95℃15s，60℃60s)*45个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。
5、统计学方法
实验采用3次重复实验，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，使用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
6、结果
结果如图1所示，与正常人血液相比，MYOZ1基因在帕金森病患者血液中的表达上调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同RNA-sep结果一致。
实施例3抑制MYOZ1基因表达
1、细胞培养：多巴胺神经元细胞SH-SY5Y，以含10％胎牛血清、1％青霉素/链霉素的DMEM/F12培养液中(pH7.2～7.4)，在37℃、5％CO2、相对湿度为90％的培养箱中培养。每隔2天换液一次，待细胞生长至90％接触时进行传代，用PBS清洗后加入0.25％-EDTA胰蛋白酶消化使细胞从瓶壁上分离下来，用含胎牛血清的DMEM/F12培养液终止胰酶消化反应，1000g离心2min，弃上清，用新配置的培养液重悬，以1:3～1:4比例传代，24小时后细胞进入对数生长期更换培养液，并根据实验要求给予不同的干预。
2、siRNA设计
针对MYOZ1的siRNA序列：
siRNA1-MYOZ1：
正义链为5’-UCUCAUAAAUAAACUUCUCCA-3’(SEQ ID NO.7)，
反义链为5’-GAGAAGUUUAUUUAUGAGAAC-3’(SEQ ID NO.8)；
siRNA2-MYOZ1：
正义链为5’-UCUUGAACACAGUGAUAUGUU-3’(SEQ ID NO.9)，
反义链为5’-CAUAUCACUGUGUUCAAGACC-3’(SEQ ID NO.10)；
siRNA3-MYOZ1：
正义链为5’-AAAUAUAGGUCUUGAACACAG-3’(SEQ ID NO.11)，
反义链为5’-GUGUUCAAGACCUAUAUUUCC-3’(SEQ ID NO.12)。
3、重组腺病毒
根据腺病毒介导的siRNA的不同，将细胞分为五组，SH组：不转染任何病毒载体的SH-SY5Y细胞，作为空白对照；Ad组：感染空腺病毒质粒细胞组，siRNA1-MYOZ1组：腺病毒介导干扰序列1感染细胞组：siRNA2-MYOZ1组：腺病毒介导干扰序列2感染细胞组；siRNA3-MYOZ1组：腺病毒介导干扰序列3感染细胞组。
将细胞按1×105/孔接种到6孔细胞培养板中，每孔2ml，在37℃、5％CO2培养箱中细胞培养24h，此时细胞融合密度约为50％-60％；吸出上清弃掉，用无血清培养基1ml洗两遍，用1ml无血清培养基稀释的MOI为50的各组腺病毒，每间隔20min摇晃培养板一次，以增加感染效果，感染48h后，再加入浓度为1000μmol/L MPP+完全培养基，孵育24h后。收集细胞用于提取RNA；
3、QPCR检测MYOZ1基因的转录水平
3.1细胞总RNA的提取
采用TRIzol Reagent(Invitrogen Cat.No.15596-018)总RNA提取试剂，按说明书提供方法提取SH-SY5Y细胞的总RNA。具体方法为：吸去培养液，用PBS清洗一遍，加入适量TRIzol试剂，六孔板中每孔加入1mL，室温放置5min裂解细胞，吹打均匀后以1mL/管分装至1.5mL Eppendorf管中。按400μl氯仿/ml Trizol加入氯仿，用手上下摇动30-50次，室温放置5min。4℃、12000g离心15min，将上层水相移至干净Eppendorf管中，加入0.4mL异丙醇，轻轻混匀，室温放置10min，4℃、7500g离心10min。弃上清，75％乙醇洗涤RNA沉淀，7500g离心5min，室温干燥RNA沉淀，5-10min后溶于适量DEPC水。质量分数为1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测RNA样本的完整性，应用Bio-Photometer对提取的RNA进行定量测定。
3.2逆转录步骤同实施例2。
3.3QPCR扩增步骤同实施例2。
4、统计学方法
实验采用3次重复实验，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，使用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，干扰MYOZ1基因表达组与对照组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
5、结果
结果如图2显示，相比siRNA2-MYOZ1、siRNA3-MYOZ1，siRNA1-MYOZ1能够更有效抑制MYOZ1基因的表达，差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例4MYOZ1基因对神经细胞的影响
采用MTT实验检测MYOZ1基因对SH-SY5Y帕金森病细胞模型细胞增殖能力的影响。
1、细胞培养与腺病毒感染步骤同实施例3。
2、步骤：调整SH-SY5Y细胞密度至5×104/mL，以每孔100μl细胞接种于96孔培养板中，按照实施例3处理细胞，在处理后每隔12h应用MTT检测，直至72h。MTT还原分析法检测细胞活性：将孔内溶液弃掉，加入100μl培养基，再每孔加入5mg/mL的MTT液10μl，37℃培养4h后，吸去培养基，每孔加入DMSO 100μl，室震荡10min，使紫蓝色沉淀充分溶解，用酶标仪在490nm波长测吸光度值(OD值)。将OD值作为反映SH-SY5Y细胞活性的参数。本实验重复3次，每次实验中相同条件设5个平行孔。
3、统计学方法
实验采用3次重复实验，使用SPSS13.0统计软件来进行统计分析，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
4、结果
图3所示的结果显示：siRNA1-MYOZ1组的细胞生长速度高于对照组组的细胞生长速度，差异具有统计学意义(P<0.05)。上述结果表明MYOZ1过表达不利于SH-SY5Y细胞的生长，通过抑制MYOZ1基因的表达可以促进神经细胞的生长。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (10)
1.人MYOZ1基因及其表达产物在制备诊断帕金森病的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片检测MYOZ1基因及其表达产物的表达水平以诊断帕金森病的产品。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述用RT-PCR诊断帕金森病的产品至少包括一对特异性扩增MYOZ1基因的引物；所述用实时定量PCR诊断帕金森病的产品至少包括一对特异性扩增MYOZ1基因的引物；所述用免疫检测诊断帕金森病的产品包括与MYOZ1蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断帕金森病的产品包括与MYOZ1基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断帕金森病的产品包括蛋白质芯片和基因芯片，其中，蛋白质芯片包括与MYOZ1蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与MYOZ1基因的核酸序列杂交的探针。
4.人MYOZ1基因在高通量测序平台中的应用，其特征在于，通过高通量测序可以获知MYOZ1基因的表达异常与帕金森病的发生发展相关。
5.一种诊断帕金森病的产品，其特征在于，所述产品通过检测MYOZ1基因的表达来诊断帕金森病。
6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于，该产品包括芯片、试剂盒。其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片。所述基因芯片包括固相载体及固定在固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测MYOZ1基因转录水平的针对MYOZ1基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体及固定在固相载体上的MYOZ1蛋白的特异性抗体。所述试剂盒所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒。所述基因检测试剂盒包括用于检测基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括MYOZ1蛋白的特异性抗体。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂包括针对MYOZ1基因的引物和/或探针。
8.人MYOZ1基因及其表达产物在制备治疗帕金森病药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药物包括：含有人MYOZ1基因和/或其表达产物抑制剂。
10.根据权利要求9所述的抑制剂，其特征在于，所述抑制剂是针对MYOZ1的siRNA。
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