CN105385774B - Tmf1作为帕金森症诊断标志物的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了TMF1基因可以作为帕金森症早期诊断的分子标志物。本发明利用基因芯片和QPCR的方法发现TMF1基因在正常人和帕金森症患者的血液中的表达存在显著差异，即可以通过检测血液中TMF1基因表达情况来判断受试者是否患有帕金森症。根据两者的相关性，本发明开发了一种诊断帕金森症的试剂盒，该试剂盒通过检测TMF1基因的表达从而进行帕金森的诊断。本发明的诊断试剂盒可用于疾病的早期诊断，在临床上具有广泛的应用前景。

Description

TMF1作为帕金森症诊断标志物的用途

技术领域

本发明属于分子诊断领域，涉及一种用于帕金森症诊断的分子标志物，具体涉及血液中的分子标志物-TMF1基因在制备诊断帕金森症的产品中的应用。

背景技术

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一种常见的神经系统变性疾病，老年人多见，平均发病年龄为60岁左右，40岁以下起病的青年帕金森病较少见。我国65岁以上人群PD的患病率大约是1.7％。大部分帕金森病患者为散发病例，仅有不到10％的患者有家族史。帕金森病最主要的病理改变是中脑黑质多巴胺(dopamine,DA)能神经元的变性死亡，由此而引起纹状体DA含量显著性减少而致病。导致这一病理改变的确切病因目前仍不清楚，遗传因素、环境因素、年龄老化、氧化应激等均可能参与PD多巴胺能神经元的变性死亡过程.

一般来说，确诊帕金森病主要靠临床症状和体征，即医生的询问、观察和检查。症状的出现和发展可以非常缓慢，没有一定顺序，有些震颤或运动障碍甚至在几年后才引起重视。主要症状和体征的特点：

1、震颤(颤抖)。并不是所有的帕金森病患者都有震颤，但可能发生轻微或明显震颤如手呈搓丸样动作，通常首发于一只手或手、臂、腿。震颤很可能发生于患者休息或行走时，以及心情焦虑或兴奋时。一些患者可能为此感到难为情，但轻微震颤通常不影响正常的动作行为。实际上，当手或手臂工作时，颤抖通常会暂时的减轻或消失。约有15％的患者始终无震颤；另有15％的患者是发生在单纯性震颤的基础之上。

2、肌肉僵硬。肌肉僵硬感常是帕金森病的早期症状之一。四肢呈"铅管样"或"齿轮样"强直；在转身、从座位上站起、解钮扣和其它的日常动作逐渐变得缓慢、越来越困难。有时肌肉僵直会而疼痛、难以形容的不适。

3、动作迟缓。动作迟缓是早期患者的另一个常见症状。表现为行走起步困难、走路会越来越费力，有时行走中一旦停下，再次起步会非常困难。主动运动和伴随动作减少。

4、姿势不稳定。姿势不稳定表现为患症者下意识调节身躯和四肢方位的能力障碍。可发现患者保持直立姿势、弯腰摸脚、行走中摆动双臂、碰撞时保持身体平衡均有困难。有特殊的姿势，如头前倾屈曲，肘及膝关节屈曲"三曲姿势"等，转弯时容易跌倒。

5、书写困难和步态障碍。明显震颤会影响写字，连续写几行字，字体会逐渐变小或潦草难以辨认。步态障碍表现如小碎步、步态慌张、前冲步态或单侧下肢拖曳。上述主要症状存在着明显的个体差异，并且主要症状会相互影响将而导致一些其它症状，包括：表情减少"面具脸"、语言和声音异常、吞咽困难(流涎)、便秘、出汗异常、睡眠障碍、易疲劳等。

现有技术中用于诊断帕金森的方法不能在疾病发生的早期即可作为判断，从而错过了疾病的最佳治疗时期。基于现有技术中检测帕金森症的手段的局限性，寻找一种有效的能够在早期即可诊断帕金森症发生的方法是亟待解决的问题。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于帕金森症早期诊断的分子标志物。相比传统的帕金森症的诊断方法，使用基因标志物来诊断帕金森症的具有及时性、特异性和灵敏性，从而使患者在疾病早期就能知晓疾病风险，针对风险高低，采取相应的预防和治疗措施。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了检测TMF1基因表达的产品在制备诊断帕金森症的工具中的应用。

进一步，上面所提到的检测TMF1基因表达的产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测TMF1基因表达水平以诊断帕金森症的产品。

进一步，所述用RT-PCR诊断帕金森症的产品至少包括一对特异扩增TMF1基因的引物；所述用实时定量PCR诊断帕金森症的产品至少包括一对特异扩增TMF1基因的引物；所述用免疫检测诊断帕金森症的产品包括：与TMF1蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断帕金森症的产品包括：与TMF1基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断帕金森症的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与TMF1蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与TMF1基因的核酸序列杂交的探针。

在本发明的具体实施方案中，所述用实时定量PCR诊断帕金森症的产品至少包括一对特异扩增TMF1基因的引物的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

优选地，所述诊断工具包括芯片、试剂盒、试纸或高通量测序平台。其中，高通量测序平台是一种特殊的诊断工具，检测TMF1基因表达的产品可以应用于该平台实现对TMF1基因的表达情况的检测。随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知TMF1基因的异常与帕金森症相关也属于TMF1基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。

本发明还提供了一种诊断帕金森症的工具，所述诊断工具包括芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台。

其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测TMF1基因转录水平的针对TMF1基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的TMF1蛋白的特异性抗体；所述基因芯片可用于检测包括TMF1基因在内的多个基因(例如，与帕金森症相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括TMF1蛋白在内的多个蛋白质(例如与帕金森症相关的多个蛋白质)的表达水平。通过将多个与帕金森症的标志物同时检测，可大大提高帕金森症诊断的准确率。

其中，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测TMF1基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括TMF1蛋白的特异性抗体。进一步，所述试剂包括使用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片方法检测TMF1基因表达水平过程中所需的试剂。优选度，所述试剂包括针对TMF1基因的引物和/或探针。根据TMF1基因的核苷酸序列信息容易设计出可以用于检测TMF1基因表达水平的引物和探针。

与TMF1基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。

所述高通量测序平台包括检测TMF1基因表达水平的试剂。

所述试纸包括试纸载体和固定在试纸载体上的寡核苷酸，所述寡核苷酸能够检测TMF1基因的转录水平。

进一步，所述TMF1蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述TMF1蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰(例如，，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能够保留与TMF1蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。

在本发明的具体实施方案中，所述针对TMF1基因的引物序列如下：正向引物序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物如SEQ ID NO.4所示。

用于诊断帕金森症的TMF1基因及其表达产物的来源包括但不限于血液、组织液、尿液、唾液、脊髓液等可以获得基因组DNA的体液。在本发明的具体实施方案中，用于诊断帕金森症的TMF1基因及其表达产物的来源是血液。

在本发明的上下文中，“TMF1基因”包括TMF1基因以及TMF1基因的任何功能等同物的多核苷酸。TMF1基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中TMF1基因(NC_000003.12)DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

优选地，TMF1基因的编码序列包括以下任一一种DNA分子：

(1)序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列；

(2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

(3)与(1)或(2)限定的DNA序列具有70％、优选地，90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。

在本发明的具体实施方案中，所述TMF1基因的编码序列是SEQ ID NO.1所示的DNA序列。

在本发明的上下文中，TMF1基因表达产物包括TMF1蛋白以及TMF1蛋白的部分肽。所述TMF1蛋白的部分肽含有与帕金森症相关的功能域。

“TMF1蛋白”包括TMF1蛋白以及TMF1蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括TMF1蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与TMF1的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。

优选地，TMF1蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质：

(1)由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个。

(3)与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(又称为序列同一性)，更优选地，与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列至少约90％至95％的同源性，常为96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列构成的多肽。

在本发明的具体实施方案中，所述TMF1蛋白是具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的蛋白质。

通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。

通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是TMF1蛋白的融合蛋白。对于与TMF1蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留TMF1蛋白的生物学活性即可。

本发明的TMF1蛋白也包括对SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的非保守修饰，只要经过修饰的蛋白质仍然能够保留TMF1蛋白的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突变的氨基酸数目通常是10个或者更少，例如6个或者更少，例如3个或者更少。

在本发明的上下文中，“诊断帕金森症”既包括判断受试者是否已经患有帕金森症、也包括判断受试者是否存在患有帕金森症的风险。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了TMF1基因表达与帕金森症相关，通过检测受试者中TMF1的表达，可以判断受试者是否患有帕金森症、或者判断受试者是否存在患有帕金森症的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。

本发明发现了一种新的分子标记物-TMF1基因，相比传统的检测手段，基因诊断更及时、更特异、更灵敏，能够实现帕金森症的早期诊断，从而降低帕金森症的死亡率。

附图说明

图1显示利用基因芯片检测TMF1基因在帕金森症患者和正常人中的表达差异；

图2显示利用QPCR检测TMF1基因在帕金森症患者和正常人中的表达差异。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1 筛选帕金森症患者和正常人中差异表达的基因

1、研究对象：

收集原发性PD患者10例，男5例，女5例，年龄30-85岁，病程3个月-22年。PD入组标准：诊断标准均符合PD临床诊断标准(参考“蒋雨平，王坚，丁正同，等，原发性帕金森病的诊断标准，2005，中国临床神经科学，2006，14:40”)。排除标准：(1)特发性震颤；(2)继发性帕金森综合征；(3)严重痴呆、构音障碍者；(4)患有其他精神疾患者。此项研究己通过医院伦理委员会批准且所有患者签署知情同意书。

正常组：选取年龄30-85岁的健康志愿者10例，男女各5例。

两组之间年龄、性别差异无统计学意义(P>0.10)，具有可比性。

2、血液中总RNA的提取

(1)匀浆处理(Homogenization)

直接取新鲜的血液(外周血)，加入3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10分钟，10,000rpm离心1分钟。彻底吸弃上清，收集白细胞沉淀。每100-200μl血液收集的白细胞沉淀加入1ml TRIzol。

(2)分层(Phase Separation)

a.样品加入TRIzol后，室温放置5min，使样品充分裂解。

b.每1ml TRIzol加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀后室温放置3-5min使其自然分相。

(3)RNA沉淀(RNA Precipitation)

a.4℃12,000rpm离心10-15min。样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，把水相(通常可吸取550μl)转移到新管中。

b.在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，室温放置10-20min。4℃12,000rpm离心10min，弃上清，RNA沉淀于管底。

(4)RNA漂洗(RNA Wash)

a.RNA沉淀中加入1ml 75％乙醇(用RNase-free水配制)，温和振荡离心管，悬浮沉淀。每1ml TRIzol加入1ml 75％乙醇。

b.4℃5,000-8,000rpm离心1-2min，弃上清；短暂快速离心，用移液器小心吸弃上清，室温放置1-2分钟晾干沉淀。

(5)溶解RNA(Redissolving the RNA)

沉淀中加入50-100μl RNase-free水，轻弹管壁，以充分溶解RNA，-70℃保存。

3、RNA质量和纯度检测

RNA质量：通过RNA完整性来表示，可用普通琼脂糖凝胶电泳(电泳条件：1.2％胶；0.5×TBE电泳缓冲液；150v，15分钟)检测完整性。

RNA纯度：OD260/OD280比值是衡量RNA样品中蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA样品，OD260/OD280值(10mM Tris,pH7.5)在2.0左右。

4、基因芯片杂交及扫描

总RNA经线性化扩增后，cy3-UTP标记，荧光标记后的cRNAs采用RNEASY Mini Kit纯化，用Amhion的RNA Fragmentation Reagents对标记好的cRNAs进行片段化处理。采用美国Agilent公司的人全基因表达谱芯片(4 x 44K基因)，在芯片杂交炉中65℃杂交17h，然后洗脱、染色，最后用Agilent DNA MicroarrayScanner扫描仪扫描。

5、芯片数据处理与分析

杂交后的芯片经芯片扫描仪读取数据点后，将数据导入分析软件，对于两组比值的自然对数绝对值大于2.0或小于0.5的基因作为差异表达基因。

6、统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，组间差异比较采用单因素方差分析法，P<0.05差异有显著性意义。

7、结果

结果显示(如图1所示)，与正常人相比，帕金森症患者血液中TMF1基因的mRNA水平显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。

实施例2 QPCR实验验证帕金森症患者和正常人中差异表达的基因

1、研究对象：

筛选标准同实施例1，帕金森症患者和正常人各50例。

2、血液中总RNA的提取

步骤同实施例1。

3、逆转录

用逆转录缓冲液对lμg总RNA进行逆转录合成cDNA。采用25μl反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入以下组分：DEPC水，5×逆转录缓冲液，10mmol/L dNTP，0.1mmol/l DTT，30μmmol/l Oligo dT,200U/μl M-MLV，模板RNA。42℃孵育1h，72℃10min，短暂离心。

4、QPCR

(1)引物设计

根据Genbank中TMF1基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如下：

TMF1基因：

正向引物为5’-GAGACAAGAGACTACAGATTCAA-3’(SEQ ID NO.3)；

反向引物为5’-GATTATATTCAGGACAAGCAGATG-3’(SEQ ID NO.4),

GAPDH基因：

正向引物为5’-TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3’(SEQ ID NO.5)；

反向引物为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO.6)。

(2)按照表1配制PCR反应体系：

其中，SYBR Green聚合酶链式反应体系购自Invitrogen公司。

表1 PCR反应体系

(3)PCR反应条件：95℃10min，(95℃10s，60℃40s)*45个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

5、统计学方法

结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

6、结果

结果如图2所示，与正常人相比，帕金森症患者血液中TMF1基因的mRNA水平显著增加，差异具有统计学意义(P<0.05)，结果同基因芯片实验。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.检测TMF1基因表达的产品在制备诊断帕金森症的工具中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测TMF1基因表达水平以诊断帕金森症的产品。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述用RT-PCR诊断帕金森症的产品至少包括一对特异扩增TMF1基因的引物；所述用实时定量PCR诊断帕金森症的产品至少包括一对特异扩增TMF1基因的引物；所述用免疫检测诊断帕金森症的产品包括：与TMF1蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断帕金森症的产品包括：与TMF1基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断帕金森症的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与TMF1蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与TMF1基因的核酸序列杂交的探针。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述用实时定量PCR诊断帕金森症的产品至少包括的一对特异扩增TMF1基因的引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述工具能够通过检测样本中TMF1基因的表达来诊断帕金森症。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述工具包括芯片、试剂盒、试纸或高通量测序平台。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测TMF1基因转录水平的针对TMF1基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的TMF1蛋白的特异性抗体；所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测TMF1基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括TMF1蛋白的特异性抗体；所述试纸包括用于检测TMF1基因转录水平的试剂；所述高通量测序平台包括用于检测TMF1基因转录水平的试剂。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述检测TMF1基因转录水平的试剂包括针对TMF1基因的引物和/或探针。

9.根据权利要求8所述的应用，其特特征在于，所述针对TMF1基因的引物序列如下：正向引物序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物如SEQ ID NO.4所示。

10.根据权利要求5-9中任一项所述的应用，其特征在于，所述样本是血液。