CN105063194A - 一种帕金森的诊断标志物及其应用 - Google Patents

一种帕金森的诊断标志物及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105063194A
CN105063194A CN201510464905.9A CN201510464905A CN105063194A CN 105063194 A CN105063194 A CN 105063194A CN 201510464905 A CN201510464905 A CN 201510464905A CN 105063194 A CN105063194 A CN 105063194A
Authority
CN
China
Prior art keywords
fam102a
gene
parkinson
expression
preparation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201510464905.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105063194B (zh
Inventor
杨承刚
肖枫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qingdao Yangshen Biomedical Co Ltd
Original Assignee
Beijing Medintell Bioinformatic Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Medintell Bioinformatic Technology Co Ltd filed Critical Beijing Medintell Bioinformatic Technology Co Ltd
Priority to CN201510464905.9A priority Critical patent/CN105063194B/zh
Publication of CN105063194A publication Critical patent/CN105063194A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105063194B publication Critical patent/CN105063194B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2835—Movement disorders, e.g. Parkinson, Huntington, Tourette

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种帕金森的诊断标志物及其应用，更具体的涉及FAM102A在制备帕金森诊疗试剂中的应用。发明人基于高通量测序结果采用生物信息学方法分析进行基因筛选，挑选出候选基因FAM102A，进一步，通过分子生物学方法证实了FAM102A基因与帕金森病的关系：FAM102A基因在帕金森患者外周血中低表达，与帕金森病具有很好的相关性，可用于制备帕金森病辅助诊疗制剂，具有重要的临床应用价值。

Description

一种帕金森的诊断标志物及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种帕金森的诊断标志物及其应用，更具体的涉及FAM102A在制备帕金森诊疗试剂中的应用。
背景技术
帕金森病(Parkinson'sdisease，PD)是一种慢性进展性疾病，目前无法治愈，它于1817年被英国人Parkinson首先描述，随着对PD的研究进展，我们对这个疾病也有了更深的了解，它在临床上表现为运动性症状如静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势步态障碍及非运动性症状如便秘、睡眠障碍、精神行为异常等。目前PD的发病机制还不清楚，可能与遗传因素、线粒体功能缺陷、氧化应激、免疫异常、细胞凋亡、环境因素等有关。在PD中，约10％的患者为家族型PD患者，具有明显的遗传特性，剩下的90％为散发性PD患者。现在许多研究认为，PD是遗传因素和环境因素共同作用的结果，而对PD致病基因的研究是目前对PD发病机制研究的一大热点。迄今为止，己经发现与遗传性PD相关的基因有SNCA，LRRK2，DJ-1，PINK-1，Parkin等，这些致病基因还需进一步研究，且远远不能满足临床的需求。对于PD患者，提前发现提前制定有针对性的个性化治疗方案及最适合患者的疗法，从而改善左旋多巴类药物的治疗状况和最大限度提高患者的生存质量，减轻患者的痛苦、减少家庭和社会的经济负担，这就需要提供更多的分子标记以便能及早诊断出帕金森病。
为解决目前帕金森分子标记稀缺的问题，发明人对15例帕金森外周血样本及9例健康人对照外周血样本进行高通量测序，结合生物信息学方法进行基因筛选，挑选出候选基因FAM102A。现有的报道表明FAM102A基因和由RSV感染引起的儿科重症呼吸道合胞病毒毛细支气管炎有关。进一步，本发明进行了分子生物学方法证实了FAM102A与帕金森病的关系：FAM102A在帕金森患者外周血中低表达，与帕金森病具有很好的相关性，可用于制备帕金森辅助诊疗制剂，具有重要的临床应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供FAM102A基因和/其表达产物在制备帕金森诊断剂中的应用。
为实现上述目的，本发明首先通过高通量测序结合生物信息学方法筛选到候选基因FAM102A，进一步通过分子生物学方法验证了FAM102A与帕金森的关系：FAM102A在帕金森患者外周血中低表达，与帕金森病具有很好的相关性，可用于制备治疗帕金森制剂和/或帕金森诊断制剂，具有重要的临床应用价值。
本发明的目的在于提供FAM102A基因在制备帕金森诊断制剂中的应用。
进一步，所述的帕金森的诊断制剂包括用荧光定量PCR方法、基因芯片方法检测帕金森外周血中FAM102A基因的表达。
荧光定量PCR法是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。荧光定量PCR的出现，极大地简化了定量检测的过程，而且真正实现了绝对定量。多种检测系统的出现，使实验的选择性更强。自动化操作提高了工作效率，反应快速、重复性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰。
基因芯片又称为DNA微阵列(DNAmicroarray)，可分为三种主要类型：1)固定在聚合物基片(尼龙膜，硝酸纤维膜等)表面上的核酸探针或cDNA片段，通常用同位素标记的靶基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测。2)用点样法固定在玻璃板上的DNA探针阵列，通过与荧光标记的靶基因杂交进行检测。3)在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷酸探针阵列，与荧光标记的靶基因杂交进行检测。基因芯片作为一种先进的、大规模、高通量检测技术，应用于疾病的诊断，其优点有以下几个方面：一是高度的灵敏性和准确性；二是快速简便；三是可同时检测多种疾病。
所述的用于荧光定量PCR方法检测帕金森中FAM102A基因的产品含有一对特异性扩增FAM102A基因的引物；所述的基因芯片包括与FAM102A基因的核酸序列杂交的探针。
本发明的目的在于提供FAM102A基因表达产物在制备帕金森诊断制剂中的应用。进一步，所述的帕金森的诊断制剂包括用免疫方法检测FAM102A蛋白的表达。优选所述免疫检测方法检测帕金森中FAM102A蛋白表达的为westernblot和/或ELISA和/胶体金检测方法。
酶联免疫吸附实验(ELISA)即将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。该技术可用于检测大分子抗原和特异性抗体等，具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。ELISA检测试剂盒根据检测目的和操作步骤可分为间接法、双抗夹心法、竞争法、双位点一步法、捕获法测IgM抗体、应用亲和素和生物素的ELISA。ELISA检测试剂盒中生色底物可选择辣根过氧化物酶(HRP)或者碱性磷酸酶(AP)。
常用的免疫胶体金检测技术：(1)免疫胶体金光镜染色法细胞悬液涂片或外周血切片，可用胶体金标记的抗体进行染色，也可在胶体金标记的基础上，以银显影液增强标记，使被还原的银原子沉积于已标记的金颗粒表面，可明显增强胶体金标记的敏感性。(2)免疫胶体金电镜染色法可用胶体金标记的抗体或抗抗体与负染病毒样本或外周血超薄切片结合，然后进行负染。可用于病毒形态的观察和病毒检测。(3)斑点免疫金渗滤法应用微孔滤膜作载体，先将抗原或抗体点于膜上，封闭后加待检样本，洗涤后用胶体金标记的抗体检测相应的抗原或抗体。(4)胶体金免疫层析法将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金标记试剂(抗体或单克隆抗体)吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，当移动至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。该法现已发展成为诊断试纸条，使用十分方便。
进一步，所述检测FAM102A蛋白的ELISA法为使用ELISA检测试剂盒。所述试剂盒中的抗体可采用市售的FAM102A单克隆抗体，优选abcam抗体(HumanFAM102Afulllengthprotein，货号ab166482)。进一步，所述的试剂盒包括：包被FAM102A单克隆抗体的固相载体，酶标二抗，酶的底物，蛋白标准品，阴性对照品，稀释液，洗涤液，酶反应终止液等。
进一步，所述检测FAM102A蛋白的胶体金法为使用检测试剂盒，所述的抗体可采用市售的FAM102A单克隆抗体。进一步，所述的胶体金检测试剂盒采用胶体金免疫层析技术或胶体金渗滤法。进一步，所述的胶体金检测试剂盒硝酸纤维素膜上的检测区(T)喷点有抗FAM102A单克隆抗体、质控区(C)喷点有免疫球蛋白IgG。
本发明的目的在于提供一种检测帕金森的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒检测基因FAM102A，采用特异的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQIDNO.1，下游引物序列为SEQIDNO.2。
进一步，该PCR试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，灵敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。
进一步，上述荧光定量PCR试剂盒组分包括：特异性引物、内参引物、荧光定量PCR反应液。其中所述的特异性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQIDNO.1，下游引物序列为SEQIDNO.2。所述内参引物为β-actin内参引物，上游引物序列为SEQIDNO.3，下游引物序列为SEQIDNO.4。
所述的试剂盒还包含RNA抽提试剂。优选康为世纪血液RNA提取试剂盒进行样本RNA提取。
本发明还检测了本试剂盒灵敏性，结果显示本试剂盒检测范围为106-102copies/μl，最小检出浓度为100copies/μl。
本发明目的是提供了一种帕金森检测试剂盒，所述的检测试剂盒检测FAM102A蛋白。进一步的，所述的试剂盒还包括其他检测试剂。
本发明目的是提供了一种检测帕金森的基因芯片，所述的基因芯片包括与FAM102A基因的核酸序列杂交的探针。
本发明的目的在于提供一种治疗帕金森制剂，所述治疗帕金森制剂促进FAM102A基因的表达。进一步，所述的治疗帕金森制剂中含有促进FAM102A基因表达的载体。
进一步，所述治疗帕金森制剂是指可以促进FAM102A基因的表达的制剂。本领域人员熟知促进基因的表达通常可以采用下述方法中的一种和/或几种：通过DNA水平调控目的基因：包括但不限于增加FAM102A基因的拷贝数、转染含FAM102A基因的过表达载体；通过转录水平调控FAM102A基因：包括但不限于激活FAM102A基因的表达、激活调控FAM102A基因表达的启动子、抑制负调控FAM102A基因表达的转录因子、采用RNA干扰技术对抑制FAM102A基因表达的抑制子进行干扰；通过转录后水平调控FAM102A基因：包括但不限于抑制促进FAM102A基因mRNA降解的microRNA转录表达、导入促进FAM102A基因表达的microRNA；通过翻译后水平调控FAM102A基因：包括但不限于导入促进目的基因编码蛋白的分子、抑制负调控FAM102A基因表达的蛋白、促进FAM102A基因表达的因子及蛋白的表达。
RNA干扰(RNAi)是指外源性和内源性双链RNA在生物体内诱导同源靶基因的mRNA特异性降解，导致转录后基因沉默的现象，是一种使用小的双链RNA高效、特异地阻断体内某种特定基因的表达，促使mRNA降解，使细胞表现出特定基因缺失表型的技术。siRNA设计完成后可以采用直接合成法或者构建siRNA表达载体，制备好的siRNA可以通过磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene法、显微注射或基因枪等机械法、阳离子脂质体试剂法等途径转染细胞。
附图说明
图1FAM102A基因在帕金森外周血及健康人外周血中相对表达量图
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1高通量测序及分析
样本来源于北京协和医院，均征得试验对象知情同意。分别收集15例帕金森病例外周血样本及9例健康人对照外周血样本，进行RNA提取，RNA提取后琼脂糖凝胶电泳，从电泳结果可以初步判定提取的RNA样品质量合格与否，是否可以用于进一步的转录组分析。进而通过NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品的提取情况，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。
测序平台为Illumina公司的HiSeq2500高通量测序平台，进行高通量转录组深度测序，测序后我们运用Fast-QC
(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)软件对测序数据的质量进行整体评估，包括碱基的质量值分布，质量值的位置分布，GC含量，PCRduplication含量，kmer的frequency等。在差异基因表达分析时，根据得到的FPKM值，采用国际公认算法EBSeq进行差异筛选。其中，筛选时，LOG2FC>1或<-1,FDR<0.05。为了更好的理解差异表达基因的功能，我们对差异表达基因进行了GeneOnlogy和信号通路分析，并对差异表达基因进行功能注释和蛋白质互相作用网络分析，鉴于以上数据分析的结果，结合文献我们筛选了差异表达基因FAM102A。
实施例2帕金森患者外周血及健康人外周血FAM102A基因表达情况
一材料和方法
1、材料
收集135例帕金森患者外周血及33例健康人外周血，对其进行分组及编号。
2、方法
2.1帕金森患者外周血及健康人外周血总RNA的提取
采用康为世纪血液RNA提取试剂盒(货号CW0538)进行样本RNA提取，实验操作按产品说明书进行，具体操作见说明书。
RNA质量判定标准：RNA样本的OD260/OD280值为1.7-2.2之间；总RNA电泳图谱有清晰的28S、18S条带；70℃水浴保温1小时后的电泳图谱与水浴保温前的图谱无明显差异。
2.2FAM102A检测引物设计与合成
根据PCR引物设计原则，应用Premier5.0和增强版的OligoArchitectTM软件进行引物设计。
FAM102A的上、下游引物序列分别为：
上游引物：5'-TTCTTGGTCTTGGAACTC-3'；SEQIDNO.1
下游引物：5'-GGCACCTTCTAACATTCA-3'；SEQIDNO.2
产物长度为101bp。
内参β-actin上、下游引物序列分别为：
上游引物：5'-AGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3'；SEQIDNO.3
下游引物：5'-TCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3'；SEQIDNO.4
产物长度为150bp。
2.3定量标准曲线的建立
标准DNA模板的制备
按照说明书，从外周血中利用康为世纪血液RNA提取试剂盒(货号CW0538)提取总RNA，接着用康为世纪SuperRTcDNA第一链合成试剂盒(货号CW0741)进行逆转录反应，具体步骤如下：
1.将RNA模板、PrimerMix、dNTPMix、RTBuffer、SuperRT和RNase-FreeWater溶解并置于冰上备用。
2.配置反应体系，总体积为20μl：终浓度为50pg-5μg的RNA模板、2μlPrimerMix、4μldNTPMix、4μlRTBuffer、1μlSuperRT，加RNase-FreeWater补平到20μl。
3.涡旋震荡混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
4.42℃孵育30-50分钟，85℃孵育5分钟。反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。
将逆转录反应得到的cDNA用康为世纪2×TaqMasterMix(货号CW0682)进行常规PCR，反应体系和条件如下：2×TaqMasterMix25μl、上下游引物各2μl、cDNA0.5μg、补平至50μl。反应条件为94℃预变性2min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，30cycles；最后72℃延伸2min。
取样5μL，对PCR扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，进行切胶回收并纯化，将纯化产物连接到pGM-T克隆载体，随后转化到DH5α感受态细胞中。通过序列为SEQIDNO.1和SEQIDNO.2的特异性引物筛选阳性克隆。阳性克隆扩增后提取质粒DNA，质粒DNA采用NanoDropND-1000核酸定量仪定量(NanoDropTechnologies，Wilmington，Delaware)并做10倍系列稀释作为标准品用于标准曲线的制备(标准DNA模板浓度范围在108-102copies/μl)。
2.3敏感性实验
取重组质粒按比例稀释为108、107、106、105、104、103、102个拷贝/μL，进行荧光定量PCR，以检测为阳性的最低浓度为该方法的检测灵敏度。本研究所建立的方法检测范围为108-102copies/μL，最小检出浓度为100copies/μL。
2.4qRT-PCR检测FAM102A基因表达量
取上述135例帕金森患者外周血和33例健康人外周血用康为世纪血液RNA提取试剂盒(货号CW0538)提取总RNA，进而用UltraSYBR一步法荧光定量PCR试剂盒(货号CW0660)进行RT-PCR。具体步骤：
1.将RNA模板、引物、2×UltraSYBROneStepRT-qPCRBuffer(WithROX)、SuperEnzymeMix和RNase-FreeWater溶解并置于冰上备用。
2.RT-PCR反应体系(25μl)：2×UltraSYBROneStepRT-qPCRBuffer(WithROX)12.5μl、上游引物(10μM)0.5μl、下游引物(10μM)0.5μl、SuperEnzymeMix0.5μl、加RNA模板(终浓度为10pg–100ng)、RNase-FreeWater补平至25μl。
3.涡旋震荡混匀，短暂离心，将溶液收集到管底。
4.将热循环仪预热到45℃，将PCR管置于热循环仪中，按以下反应条件进行反应：反转录：45℃10min；95℃10min预变性，接45个循环：95℃15s，60℃60s。
对qRT-PCR反应结果使用SPSSForWindows11.5软件，相关数据采用χ2检验和Fisher确切概率法进行处理，P＜0.05有统计学意义；qRT-PCR反应利用MedCalc统计分析软件来计算。
二结果
实时定量PCR扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增效率相近，极限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本扩增产物溶解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增；根据qRT-PCR的相对定量公式：2-ΔCt×100％，比较FAM102A基因在帕金森外周血和健康人外周血中的表达水平。结果显示(具体见图1)：qRT-PCR扩增结果稳定，其中FAM102A在帕金森患者外周血中的表达水平低于健康人外周血，
以上结果验证了高通量转录组表达数据的整合分析FAM102A在帕金森外周血中低表达的结果。
实施例3一种检测帕金森的检测试剂盒及使用方法
RNA提取试剂：超纯RNA提取试剂盒(货号CW0597)
荧光定量试剂：UltraSYBR一步法荧光定量PCR试剂盒(货号CW0660)
荧光定量PCR反应体系及方法：
RT-PCR反应体系(25μl)：2×UltraSYBROneStepRT-qPCRBuffer(WithROX)12.5μl、上游引物(10μM)0.5μl、下游引物(10μM)0.5μl、SuperEnzymeMix0.5μl、加RNA模板(终浓度为10pg–100ng)、RNase-FreeWater补平至25μl。
反应调节：反转录：45℃10min；95℃10min预变性，接30-40个循环：95℃15s，60℃60s。
本发明采用高通量测序筛选出帕金森致病相关基因FAM102A，结合分子生物学实验验证，证实了FAM102A在帕金森疾病中具有重要的作用。本发明为帕金森临床诊疗提供了新的靶标，具有很好的临床应用前景。

Claims (10)

1.FAM102A基因和/或其表达产物在制备帕金森诊断制剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的帕金森的诊断制剂包括用荧光定量PCR方法、基因芯片方法检测FAM102A基因的表达。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的用于荧光定量PCR方法检测FAM102A基因的产品含有一对特异性扩增FAM102A基因的引物；所述的基因芯片包括与FAM102A基因的核酸序列杂交的探针。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的帕金森的诊断制剂包括用免疫方法检测FAM102A蛋白的表达。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述免疫方法检测FAM102A蛋白表达的为ELISA检测试剂盒和/胶体金检测试剂盒。
6.一种检测帕金森的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒检测基因FAM102A，采用特异的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQIDNO.1，下游引物序列为SEQIDNO.2。
7.FAM102A基因和/或其表达产物在制备帕金森治疗制剂中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述帕金森治疗制剂可以采用下述方法中的一种和/或几种促进FAM102A基因的表达：包括增加FAM102A基因的拷贝数、转染含FAM102A基因的过表达载体；激活FAM102A基因的表达、激活调控FAM102A基因表达的启动子、抑制负调控FAM102A基因表达的转录因子、采用RNA干扰技术对抑制FAM102A基因表达的抑制子进行干扰；抑制促进FAM102A基因mRNA降解的microRNA转录表达、导入促进FAM102A基因表达的microRNA；导入促进目的基因编码蛋白的分子、抑制负调控FAM102A基因表达的蛋白、促进FAM102A基因表达的因子及蛋白的表达。
9.一种治疗帕金森制剂，其特征在于，所述治疗帕金森制剂促进FAM102A基因的表达。
10.根据权利要求9所述的治疗帕金森制剂，其特征在于，所述的治疗帕金森制剂中含有促进FAM102A基因表达的载体。
CN201510464905.9A 2015-07-31 2015-07-31 一种帕金森的诊断标志物及其应用 Active CN105063194B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510464905.9A CN105063194B (zh) 2015-07-31 2015-07-31 一种帕金森的诊断标志物及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510464905.9A CN105063194B (zh) 2015-07-31 2015-07-31 一种帕金森的诊断标志物及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105063194A true CN105063194A (zh) 2015-11-18
CN105063194B CN105063194B (zh) 2018-07-17

Family

ID=54492698

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510464905.9A Active CN105063194B (zh) 2015-07-31 2015-07-31 一种帕金森的诊断标志物及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105063194B (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105385774A (zh) * 2015-12-24 2016-03-09 周丽丽 Tmf1作为帕金森症诊断标志物的用途
CN105617382A (zh) * 2015-12-30 2016-06-01 南方医科大学 miRNA-543-3p在帕金森病的诊断和治疗中的应用
CN106755563A (zh) * 2017-04-05 2017-05-31 天津医科大学总医院 生物标志物在诊断帕金森中的应用
CN109468373A (zh) * 2018-12-24 2019-03-15 潘伟 一种与帕金森发生发展相关的生物标志物
CN110637093A (zh) * 2017-05-18 2019-12-31 株式会社益力多本社 帕金森病的判定标志物和判定方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101661032A (zh) * 2008-08-29 2010-03-03 生物远景技术有限公司 帕金森病的生物标志物
CN101659991A (zh) * 2008-08-29 2010-03-03 首都医科大学宣武医院 帕金森病早期诊断标志物

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101661032A (zh) * 2008-08-29 2010-03-03 生物远景技术有限公司 帕金森病的生物标志物
CN101659991A (zh) * 2008-08-29 2010-03-03 首都医科大学宣武医院 帕金森病早期诊断标志物

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HAN KYOUNG CHOI ET AL.: "Early estrogen-induced gene 1, a novel RANK signaling component, is essential for osteoclastogenesis", 《CELL RESEARCH》 *
刘华青: "ERK1/2信号通路对genistein和equol雌激素效应的影响", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105385774A (zh) * 2015-12-24 2016-03-09 周丽丽 Tmf1作为帕金森症诊断标志物的用途
CN105385774B (zh) * 2015-12-24 2018-09-25 周丽丽 Tmf1作为帕金森症诊断标志物的用途
CN105617382A (zh) * 2015-12-30 2016-06-01 南方医科大学 miRNA-543-3p在帕金森病的诊断和治疗中的应用
CN106755563A (zh) * 2017-04-05 2017-05-31 天津医科大学总医院 生物标志物在诊断帕金森中的应用
CN110637093A (zh) * 2017-05-18 2019-12-31 株式会社益力多本社 帕金森病的判定标志物和判定方法
US11834695B2 (en) 2017-05-18 2023-12-05 Kabushiki Kaisha Yakult Honsha Marker and method for determination of Parkinson's disease
CN109468373A (zh) * 2018-12-24 2019-03-15 潘伟 一种与帕金森发生发展相关的生物标志物

Also Published As

Publication number Publication date
CN105063194B (zh) 2018-07-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101357032B1 (ko) 도세탁셀에 대한 내성 또는 감수성을 측정하는 방법
US20150184248A1 (en) Method for detecting pancreatic cancer and detection kit
CN105063194A (zh) 一种帕金森的诊断标志物及其应用
CN105483275B (zh) mir-1299及其成熟miRNA的新用途
CN110257499A (zh) 一种预测脑卒中易感性或预后风险的诊断系统或产品及其应用
CN108034707B (zh) Spag7基因在制备老年痴呆诊断制剂中的应用
CN107937515B (zh) 一种阿尔茨海默的诊疗基因靶点及其应用
CN105288659A (zh) Tenm1基因及其表达产物在诊治乳头状腺癌的应用
CN104984363B (zh) Zmym1在制备帕金森诊疗试剂中的应用
KR101604178B1 (ko) 약물에 의한 간 손상의 예측 및 진단을 위한 바이오마커
CN105233290B (zh) C22orf26基因及其表达产物在制备帕金森诊疗试剂中的应用
CN107779503A (zh) 阿尔茨海默相关的差异表达基因及其应用
EP4036233A1 (en) Method for detecting brain tumor
CN110988346A (zh) 一种辅助诊断肺癌的标记物以及检测方法
CN105597109B (zh) 原发骨肉瘤的诊治分子标记
KR20150081631A (ko) 전사체학과 단백질체학을 이용한 약물에 의한 간 손상의 예측 및 진단을 위한 바이오마커
CN105506172B (zh) 含检测gfod2的骨质疏松血液诊断试剂及其应用
US11497817B2 (en) Senile dementia treatment formulation and application thereof
CN105648079B (zh) 一种骨质疏松血液检测靶点及其应用
CN105506171A (zh) Lyrm2基因及其表达产物的新用途
WO2017168031A1 (es) Uso de tcfl5/cha como nuevo marcador para el pronóstico y/o diagnóstico diferencial de leucemias linfoblásticas agudas
CN105648093B (zh) Maff在诊断和区分冠心病和冠心病合并糖尿病中的应用
CN109735617A (zh) 白癜风基因检测标志物及其应用
KR20230136786A (ko) 췌장암의 진단용 조성물
KR20150081632A (ko) 약물에 의한 간 손상 유형을 조기에 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
PE01 Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right

Denomination of invention: Parkinson diagnostic marker and application thereof

Effective date of registration: 20181225

Granted publication date: 20180717

Pledgee: Huaxia Bank Beijing branch Wanliu Limited by Share Ltd

Pledgor: Beijing Yang Shen biology information technology company limited

Registration number: 2018990001252

PE01 Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right
PC01 Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right

Date of cancellation: 20191206

Granted publication date: 20180717

Pledgee: Huaxia Bank Beijing branch Wanliu Limited by Share Ltd

Pledgor: Beijing Yang Shen biology information technology company limited

Registration number: 2018990001252

PC01 Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20191225

Address after: Room 2503, Qianshan building, building D2, Qingdao International Innovation Park Phase II, No. 1, Keyuan Weiyi Road, Laoshan District, Qingdao, Shandong Province

Patentee after: Qingdao Yangshen biomedical Co., Ltd

Address before: 100080 Beijing city Haidian District Shanyuan Street No. 1 cubic court building room 3103

Patentee before: Beijing Yang Shen biology information technology company limited

TR01 Transfer of patent right