CN105506171A - Lyrm2基因及其表达产物的新用途 - Google Patents

Lyrm2基因及其表达产物的新用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体涉及LYRM2基因及其表达产物的新用途。为解决目前骨质疏松分子标记物稀缺的问题，发明人基于高通量测序结合生物信息学方法分析进行致病靶点基因的筛选，挑选出候选基因LYRM2，进一步，通过分子生物学实验证实了LYRM2基因与骨质疏松具有很好的相关性，同时设计了针对LYRM2的高效干扰RNA。本发明提供的骨质疏松辅助诊疗靶点具有很好的临床应用价值。

Description

LYRM2基因及其表达产物的新用途
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及LYRM2基因及其表达产物的新用途，更具体的涉及LYRM2基因及其表达产物在检测骨质疏松中的新应用。
背景技术
骨质疏松症是一种以低骨量和骨组织微结构破坏为特征，导致骨质脆性增加和易于骨折的代谢性骨病。骨质疏松症后果严重，是老年人群致死、致残的常见原因。发生骨折后大多数的老年病人都存在慢性疼痛，永久的残疾，失去独立生活的能力，严重降低了生活质量；椎体骨折也常致背痛、身体畸形，身高缩短、驼背甚至残疾。此外，骨质疏松症医疗费用高，由其引起的骨折导致巨大的医疗资源占用，给社会带来沉重负担。鉴于骨质疏松症所带来的严重后果和社会经济负担及医疗资源的占用已经随社会的进步而日益明显，迫切需要寻找新的解决途径。科研工作者已经在尝试从分子生物学的角度寻找骨质疏松致病机理，并取得一定进展，研究表明骨质疏松症之所以出现特征性的低骨矿物密度(BMD)，主要原因是由于出现了不平衡的骨吸收和骨形成体系，也即破骨细胞骨吸收程度超过了成骨细胞作用的骨形成程度，免疫系统与骨代谢也具有很强的关联，特别是外周血单核细胞直接参与了破骨细胞形成。它们是破骨细胞的前体细胞，并分泌破骨细胞诱导因子。对人类自身的研究显示：外周血单核细胞中特定基因的表达水平和骨质疏松症密切相关。但是，目前人们对于骨质疏松症病因研究方面任然不是很清楚，相关的研究成果也十分匮乏。
为解决目前骨质疏松分子标记物稀缺的问题，发明人对9例骨质疏松外周血样本及6例健康人对照外周血样本进行高通量测序，结合生物信息学方法分析进行致病靶点基因的筛选，挑选出候选基因LYRM2，进一步，通过实验证实了LYRM2基因与骨质疏松具有很好的相关性，同时设计了针对LYRM2的高效干扰RNA。本发明提供的骨质疏松辅助诊疗靶点具有很好的临床应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供LYRM2基因和/或其表达的蛋白在制备抗骨质疏松制剂和/或骨质疏松诊断制剂中的应用。
本发明的目的在于提供检测LYRM2基因和/或其表达蛋白的制剂在制备骨质疏松诊断制剂中的应用。
进一步，所述的骨质疏松的诊断制剂包括用荧光定量PCR方法、基因芯片方法检测外周血中LYRM2基因和/或LYRM2蛋白的表达。
荧光定量PCR法是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。荧光定量PCR的出现，极大地简化了定量检测的过程，而且真正实现了绝对定量。多种检测系统的出现，使实验的选择性更强。自动化操作提高了工作效率，反应快速、重复性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰。
基因芯片又称为DNA微阵列(DNAmicroarray)，可分为三种主要类型：1)固定在聚合物基片(尼龙膜，硝酸纤维膜等)表面上的核酸探针或cDNA片段，通常用同位素标记的靶基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测。2)用点样法固定在玻璃板上的DNA探针阵列，通过与荧光标记的靶基因杂交进行检测。3)在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷酸探针阵列，与荧光标记的靶基因杂交进行检测。基因芯片作为一种先进的、大规模、高通量检测技术，应用于疾病的诊断，其优点有以下几个方面：一是高度的灵敏性和准确性；二是快速简便；三是可同时检测多种疾病。
所述的用于荧光定量PCR方法检测骨质疏松中LYRM2基因的产品含有一对特异性扩增LYRM2基因的引物；所述的基因芯片包括与LYRM2基因的核酸序列杂交的探针。
进一步，所述的骨质疏松的诊断制剂包括用免疫方法检测LYRM2蛋白的表达。优选所述免疫检测方法检测骨质疏松中LYRM2蛋白表达的为westernblot和/或ELISA和/胶体金检测方法。
酶联免疫吸附实验(ELISA)即将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。该技术可用于检测大分子抗原和特异性抗体等，具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。ELISA检测试剂盒根据检测目的和操作步骤可分为间接法、双抗夹心法、竞争法、双位点一步法、捕获法测IgM抗体、应用亲和素和生物素的ELISA。ELISA检测试剂盒中生色底物可选择辣根过氧化物酶(HRP)或者碱性磷酸酶(AP)。
常用的免疫胶体金检测技术：(1)免疫胶体金光镜染色法细胞悬液涂片或组织切片，可用胶体金标记的抗体进行染色，也可在胶体金标记的基础上，以银显影液增强标记，使被还原的银原子沉积于已标记的金颗粒表面，可明显增强胶体金标记的敏感性。(2)免疫胶体金电镜染色法可用胶体金标记的抗体或抗抗体与负染病毒样本或组织超薄切片结合，然后进行负染。可用于病毒形态的观察和病毒检测。(3)斑点免疫金渗滤法应用微孔滤膜作载体，先将抗原或抗体点于膜上，封闭后加待检样本，洗涤后用胶体金标记的抗体检测相应的抗原或抗体。(4)胶体金免疫层析法将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金标记试剂(抗体或单克隆抗体)吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，当移动至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。该法现已发展成为诊断试纸条，使用十分方便。
进一步，所述检测LYRM2蛋白的ELISA法为使用ELISA检测试剂盒。所述试剂盒中的抗体可采用市售的LYRM2单克隆抗体。进一步，所述的试剂盒包括：包被LYRM2单克隆抗体的固相载体，酶标二抗，酶的底物，蛋白标准品，阴性对照品，稀释液，洗涤液，酶反应终止液等。
进一步，所述检测LYRM2蛋白的胶体金法为使用检测试剂盒，所述的抗体可采用市售的LYRM2单克隆抗体。进一步，所述的胶体金检测试剂盒采用胶体金免疫层析技术或胶体金渗滤法。进一步，所述的胶体金检测试剂盒硝酸纤维素膜上的检测区(T)喷点有抗LYRM2单克隆抗体、质控区(C)喷点有免疫球蛋白IgG。
本发明的目的在于提供一种检测骨质疏松的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒检测基因LYRM2，采用特异的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQIDNO.9，下游引物序列为SEQIDNO.10。
进一步，该PCR试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，灵敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。
进一步，上述荧光定量PCR试剂盒组分包括：特异性引物、内参引物、荧光定量PCR反应液。其中所述的特异性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQIDNO.9，下游引物序列为SEQIDNO.10。所述内参引物为β-actin内参引物，上游引物序列为SEQIDNO.11，下游引物序列为SEQIDNO.12。
所述的试剂盒还包含RNA抽提试剂。优选Reagent进行样本RNA提取。
本发明目的是提供了一种骨质疏松检测试剂盒，所述的检测试剂盒检测LYRM2蛋白。进一步的，所述的试剂盒还包括其他检测试剂。
本发明目的是提供了一种检测骨质疏松的基因芯片，所述的基因芯片包括与LYRM2基因的核酸序列杂交的探针。
本发明的目的在于提供LYRM2基因和/或其蛋白抑制剂在制备抗骨质疏松制剂中的应用。
为实现上述目的，本发明首先通过高通量测序结合生物信息学方法筛选到候选基因LYRM2，继而通过分子生物学方法验证了LYRM2与骨质疏松的关系：LYRM2与骨质疏松具有很好的相关性，可用于制备抗骨质疏松制剂和/或骨质疏松诊断制剂，具有重要的临床应用价值。
进一步，所述抗骨质疏松制剂是指可以抑制LYRM2基因的表达的制剂。本领域人员熟知抑制基因的表达通常可以采用下述方法中的一种和/或几种：通过激活LYRM2基因的抑制基因、激活LYRM2基因的抑制基因表达的蛋白、采用RNA干扰技术抑制LYRM2基因表达、激活促进LYRM2基因mRNA降解的microRNA、导入促进LYRM2基因编码蛋白降解的分子、抑制促进LYRM2基因表达的因子及蛋白的表达。即通过激活LYRM2基因的抑制基因、激活抑制LYRM2基因表达的蛋白、导入抑制LYRM2基因表达的siRNA、激活促进LYRM2mRNA降解的microRNA、导入促进LYRM2蛋白降解的分子、抑制促进LYRM2基因表达的因子及蛋白的表达。
RNA干扰(RNAi)是指外源性和内源性双链RNA在生物体内诱导同源靶基因的mRNA特异性降解，导致转录后基因沉默的现象，是一种使用小的双链RNA高效、特异地阻断体内某种特定基因的表达，促使mRNA降解，使细胞表现出特定基因缺失表型的技术。siRNA设计完成后可以采用直接合成法或者构建siRNA表达载体，制备好的siRNA可以通过磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene法、显微注射或基因枪等机械法、阳离子脂质体试剂法等途径转染细胞。
进一步，所述抑制LYRM2基因表达的siRNA序列选自下列序列中的一种和/或几种：SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6。优选siRNA序列为SEQIDNO.1、SEQIDNO.2和SEQIDNO.5、SEQIDNO.6。
本发明的目的在于提供一种抗骨质疏松制剂，所述抗骨质疏松制剂抑制LYRM2基因的表达。进一步，所述的抗骨质疏松制剂中含有抑制LYRM2基因表达的siRNA。
附图说明
图1是LYRM2基因在骨质疏松外周血及健康人外周血中相对表达量图
图2是RNA干扰后各组LYRM2mRNA相对表达水平图：C组：空白对照组；C1组：转染脂质体组；C2组：转染非特异性的siRNA组；S1，S2，S3组：转染特异性的siRNA组。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1高通量测序及分析
分别收集9例骨质疏松患者外周血样本及6例健康人外周血样本，进行RNA提取，RNA提取后琼脂糖凝胶电泳，从电泳结果可以初步判定提取的RNA样品质量合格与否，是否可以用于进一步的转录组分析。进而通过NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品的提取情况，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。
测序平台为Illumina公司的HiSeq2500高通量测序平台，进行高通量转录组深度测序，测序后我们运用Fast-QC(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)软件对测序数据的质量进行整体评估，包括碱基的质量值分布，质量值的位置分布，GC含量，PCRduplication含量，kmer的frequency等。在差异基因表达分析时，根据得到的FPKM值，采用国际公认算法EBSeq进行差异筛选。其中，筛选时，LOG2FC>1或<-1,FDR<0.05。为了更好的理解差异表达基因的功能，我们对差异表达基因进行了GeneOnlogy和信号通路分析，并对差异表达基因进行功能注释和蛋白质互相作用网络分析，鉴于以上数据分析的结果，结合文献我们筛选了差异表达基因LYRM2。
实施例2骨质疏松患者外周血及健康人外周血中LYRM2基因表达情况
一材料和方法
1、材料
收集74例骨质疏松患者外周血及46例健康人外周血，对其进行分组及编号。
2、方法
2.1骨质疏松外周血及健康人外周血总RNA的提取
采用Reagent进行样本RNA提取，实验操作按产品说明书进行。
RNA质量判定标准：RNA样本的OD260/OD280值为1.8-2.2之间；总RNA电泳图谱有清晰的28S、18S条带；70℃水浴保温1小时后的电泳图谱与水浴保温前的图谱无明显差异。
2.2逆转录合成cDNA
采用IIIReverseTranscriptase(invitrogen，货号18080-044)进行cDNA反转录，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：
使用逆转录试剂盒，用逆转录缓冲液对lμg总RNA进行逆反录合成cDNA。采用25μl反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入以下组分：
5×逆转录缓冲液5μl，10mmol/ldNTP1.25μl，0.1mmol/lDTT2.5μl，30μmmol/lOligodT2μl,200U/μlMMLV1.25μl，模板RNA1μg，加入灭菌水至总体系25μl。42℃孵育1小时，72℃10分钟，短暂离心。cDNA保存放-20℃冰箱备用。
2.3Real-TimePCR
2.3.1仪器及分析方法
用ABI7500型荧光定量PCR仪，采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析。
2.3.2引物设计
采用在线引物设计软件，模板序列为NM_020466，引物设计后由invitrogen公司合成。具体引物序列如下：
表1引物序列
操作过程如下：
(一)反应体系：用PowerGreenPCRMasterMix(invitrogen，货号4367659)进行扩增，实验操作按产品说明书进行。扩增程序为：95°10min，(95℃15sec，55℃60sec)×45个循环。
表2RealTime反应体系
组分 加入量
2×mix 10μl
上游引物(10uM) 0.5μl
下游引物(10uM) 0.5μl
模板 2μl
加入灭菌蒸馏水 至25μl
(二)样品RealTimePCR检测
将各样品cDNA10倍稀释后取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增。同时在60-95℃进行溶解曲线分析。
二实验结果
实时定量PCR扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增效率相近，极限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本扩增产物溶解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增；根据qRT-PCR的相对定量公式，比较LYRM2基因在骨质疏松患者外周血和健康人外周血中的表达水平。结果显示(具体见图1)：qRT-PCR扩增结果稳定，其中LYRM2在骨质疏松外周血中的表达水平高于健康人外周血中的表达水平，前者是后者的近三倍，以上结果验证了高通量转录组表达数据的整合分析LYRM2在骨质疏松患者外周血中高表达的结果。
实施例3细胞系MG-63的培养
一、材料
细胞系MG-63购自中科院上海细胞研究所。
二、主要溶液
细胞培养液：DMEM培养基+10％标准胎牛血清。
0.25％胰蛋白酶消化液：0.25g胰蛋白酶加入100m1去离子水中，滤器过滤灭菌，分装备用。
三、细胞传代
1将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去，加入0.25％胰蛋白酶液1m1，覆盖细胞层，瓶口消毒，加盖；
2倒置显微镜下观察细胞变化，随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，细胞间质回缩，细胞间隙加大，在还未漂起时将胰酶弃去，加入5ml含10％胎牛血清的培养液终止消化；
3细胞计数：取上述细胞悬液0.5mI，适当稀释后滴入血细胞计数板内，按白细胞计数法数四角四大格内细胞总数，计数时仅计数细胞核和细胞浆完整的细胞，成堆的细胞按一个细胞计算，将4大方格内的细胞总数按下列公式换算成每毫升细胞悬液中的细胞数：细胞总数/ml＝4大格细胞总数/4×104×稀释倍数；
4根据细胞计数结果，用DMEM完全培养液进一步稀释为每毫升含3×105个细胞浓度，分装于培养瓶中(8m1/每瓶)，放置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
实施例4RNAi抑制LYRM2基因表达
一、材料
siRNA构建与合成
根据LYRM2基因在GenBank(NCBIReferenceSequence:NM_020466)中序列设计相应的siRNA。设计后送往合成公司合成。
二、实验方法
(一)RNA干扰技术特异性抑制MG-63细胞中LYRM2基因的表达
1、MG-63细胞的培养
方法步骤同实施例3。
2、siRNA的设计与合成
siRNA表达载体pSIREN-DNR含新霉素抗性基因和GFP绿色荧光标记，可以实时监测载体在细胞中的转染效率。根据目的mRNA序列，设计3条RNA干扰靶序列及阴性对照(表3)。对于每条选定的siRNA靶序列，设计siRNA正义链和反义链，以loop(9nt)相连，称为shRNA(shorthairpinRNA)。合成每条编码shRNA的DNA模板的两条单链，退火DNA单链得到shRNA的DNA双链模板。模板链后面接有RNAPoIyIII聚合酶转录中止位点，同时两端分别设计BamHI和HindIII酶切位点，可以克隆到siRNA载体多克隆位点的BamHI和HindIII酶切位点之间。siRNA空载体用BamHI和HindIII双酶切后，1％琼脂糖凝胶电泳，回收线性载体。把退火的DNA模板双链连接到线性载体中。采用T4连接酶，插入片断与载体的摩尔比约为3:1。连接产物转化DH5α大肠杆菌，在LBAmp培养基上涂板，37℃培养过夜。PCR鉴定；测序鉴定。柱抽提阳性克隆载体并定量。
表3siRNA转录模板序列
3、细胞分组及转染
(1)细胞分组
C组：空白对照组；C1组：转染脂质体组；C2组：转染非特异性的siRNA组；S1，S2，S3组：转染特异性的siRNA组。
(2)转染
按照LipofectamineTM2000TransfectionReagent提供的步骤进行。
①转染前24h，取对数生长期的细胞用胰酶消化并计数，用DMEM培养基调整细胞浓度为1×105/ml，取2m1接种于六孔板，放置于37℃，5％CO2培养箱中培养，在细胞达80％融合时用于转染。在转染前用不含血清的DMEM培养基培养3-4h。
②配制转染液体：
A液：250u1无血清培养基稀释4.0ugDNA，温和混匀；
B液：250u1无血清培养基稀释10u1Lipofectamine，温和混匀，室温放置5min；
③转染：A液与B液混合在一起，室温保温20min，直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。在CO2培养箱中37℃保温24-48h，6h后换液，加入含血清的培养基。
4、转染效率的验证
(1)荧光倒置显微镜下观察细胞形态和转染情况
转染24h后，将培养板置于荧光倒置显微镜下观察细胞形态及生长状态，绿色荧光下观察转染情况。
(2)应用Real-timePCR方法检测转染前后LYRM2基因表达的变化
①标准曲线的构建：选取在50mI培养瓶中正常培养的MG-63细胞1瓶，提取RNA，测定RNA浓度和纯度，进行逆转录反应，将反应生成的DNA模板十倍稀释，得到相当于104-100copies/ul的DNA模板，分别加入LYRM2引物和内参照actin引物，配制25u1反应体系，使用Real-timePCR扩增仪，进行PCR扩增反应。得到LYRM2和actin的标准曲线。
②Real-timePCR方法检测转染前后LYRM2基因表达的变化：提取各组细胞的RNA，测定RNA浓度和纯度，进行逆转录反应，每组DNA模板同时进行LYRM2和actin的Real-timePCR反应，实验重复三次。
③对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。
三、实验结果
Real-timePCR检测转染效率。应用Real-timePCR方法构建LYRM2和actin的标准曲线，相关系数分别为0.9984,0.9978，线性关系良好，符合要求。用双标准曲线的方法比较各组LYRM2基因的表达。空白对照组、脂质体转染组、非特异性转染组基因的表达基本相似，差异无统计学意义。SiRNA1，SiRNA2，SiRNA3均有抑制LYRM2基因表达的作用，LYRM2-siRNA1和LYRM2-siRNA3的作用更明显，抑制效率达79％和81％，而LYRM2-siRNA2的抑制作用为34％，与空白对照组、脂质体转染组、非特异性转染组相比，差异有统计学意义，P<0.05(表4，图2)。
表4各组干扰后LYRM2mRNA相对表达水平
组别 LYRM2/actin相对浓度比值(均数±标准差)
空白对照组 1.0
脂质体转染组 1.0411±0.0365
非特异性转染组 0.9987±0.0693
LYRM2-siRNA1组 0.21469±0.0277
LYRM2-siRNA2组 0.66331±0.0372
LYRM2-siRNA3组 0.20934±0.0253
本发明采用高通量测序筛选出骨质疏松致病相关基因LYRM2，结合分子细胞生物学实验验证，证实了LYRM2与骨质疏松病具有很好的相关性。本发明为骨质疏松临床诊疗提供了新的靶标，具有很好的临床应用前景。

Claims (10)

1.检测LYRM2基因和/或LYRM2蛋白的制剂在制备骨质疏松诊断制剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，诊断制剂检测外周血中LYRM2基因和/或LYRM2蛋白的表达。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，骨质疏松的诊断制剂采用荧光定量PCR方法或基因芯片方法检测LYRM2基因的表达。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，荧光定量PCR方法检测骨质疏松中LYRM2基因的产品含有一对特异性扩增LYRM2基因的引物；基因芯片包括与LYRM2基因的核酸序列杂交的探针。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述一对特异性扩增LYRM2基因的引物上游引物序列为SEQIDNO.9，下游引物序列为SEQIDNO.10。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，骨质疏松的诊断制剂包括用免疫方法检测LYRM2蛋白的表达。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，免疫方法检测LYRM2蛋白表达的为ELISA检测试剂盒和/胶体金检测试剂盒。
8.LYRM2基因和/或LYRM2蛋白抑制剂在制备抗骨质疏松制剂中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，抗骨质疏松制剂可以采用下述方法中的一种和/或几种抑制LYRM2基因的表达：通过激活LYRM2基因的抑制基因、激活抑制LYRM2基因表达的蛋白、导入抑制LYRM2基因表达的siRNA、激活促进LYRM2mRNA降解的microRNA、导入促进LYRM2蛋白降解的分子、抑制促进LYRM2基因表达的因子及蛋白的表达。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，抑制LYRM2基因表达的siRNA序列选自下列序列中的一种和/或几种：SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6，优选的抑制LYRM2基因表达的siRNA序列为SEQIDNO.1、SEQIDNO.2或SEQIDNO.5、SEQIDNO.6。
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