CN105695617A - 乳头状癌的肿瘤标志物及其应用 - Google Patents

乳头状癌的肿瘤标志物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及乳头状癌的肿瘤标志物及其应用。发明人对高通量测序结果通过生物信息学方法进行筛选，挑选出TMEM255A基因。进一步，进行了扩大样本检测发现TMEM255A与甲状腺乳头状癌具有很好的相关性，可用于制备甲状腺乳头状癌辅助诊疗制剂，此外，还通过RNA干扰实验，寻找到几对能有效降低TMEM255A基因表达的干扰RNA，为临床甲状腺乳头状癌的治疗提供研究基础。

Description

乳头状癌的肿瘤标志物及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体的本发明涉及乳头状癌的肿瘤标志物及其应用，更具体涉及TMEM255A基因及其表达产物作为肿瘤标志物在诊治乳头状癌中的应用。
背景技术
甲状腺是人体重要的内分泌腺，它在机体新陈代谢方面具有重要地位，是内分泌系统中发病率最高的器官。甲状腺癌是常见的内分泌系统恶性肿瘤之一，约占全身恶性肿瘤的1.5％。与一般恶性肿瘤好发于老年人不同，甲状腺癌多发于青壮年，平均年龄约40岁，统计显示近年来甲状腺癌的发病率呈增高趋势。乳头状癌是指由滤泡细胞分化、具有典型的乳头/滤泡结构及其核特征性改变的恶性上皮细胞肿瘤，从生物学特性的相似而言，此类肿瘤包括单纯性乳头状癌和混合性甲状腺癌。此种类型临床最常见，分化程度高，恶性程度也最轻，约占甲状腺癌的60％-80％，好发于40岁以下的年轻女性以及15岁以下的少年儿童。随着分子生物学技术的不断进步，发现甲状腺癌的发生、演化与其它肿瘤类似，均与癌基因和抑癌基因有关。研究显示，甲状腺滤泡细胞肿瘤的癌变过程和结肠肿瘤的癌变过程类似，同样经历了一个多基因参与、多步骤的过程。
肿瘤标志物是指在恶性肿瘤的发生、发展过程中，由肿瘤细胞合成并且分泌到生物体组织或体液中，或者是宿主对体内的新生物反应而异常产生的，在组织或体液中含量明显升高的一类活性物质。随着对肿瘤细胞反应产生人体自身细胞的正常成分，但在性质和数量水平与正常或良性疾病时比较有显著性差异。不管是细胞、组织、还是体液或者血液中都可能有肿瘤标志物的存在，而肿瘤标志物的存在是可以使用生物化学、免疫学或分子生物学等方法检测出来的。随着后基因时代的到来以及分子生物学的发展，基因结构的差异、基因功能的改变以及基因产物的表达异常与肿瘤的发生和发展存在密切的联系，癌基因、抑癌基因以及其产物也属于肿瘤标志物。
发明人对6例甲状腺乳头状癌(PTC)病例样本及5例正常对照进行高通量测序，通过生物信息学方法进行筛选后备基因，挑选出TMEM255A。进一步，发明进行了扩大样本检测发现TMEM255A与甲状腺乳头状癌具有很好的相关性，可用于制备甲状腺乳头状癌辅助诊疗制剂，此外，还通过RNA干扰实验，寻找到几对能有效降低TMEM255A基因表达的干扰RNA，为临床甲状腺乳头状癌的治疗提供研究基础。
发明内容
本发明的目的在于提供检测TMEM255A基因或蛋白在制备甲状腺乳头状癌诊断制剂中的应用。
为实现上述目的，本发明通过高通量测序结合生物信息学方法筛选到基因TMEM255A，进而通过分子细胞生物学方法验证了TMEM255A与甲状腺乳头状癌具有很好的相关性，可用于制备甲状腺乳头状癌辅助诊疗制剂，具有重要的临床应用价值。
进一步，甲状腺乳头状癌的诊疗制剂包括用荧光定量PCR方法、基因芯片方法检测甲状腺乳头状癌组织中TMEM255A基因的表达。
荧光定量PCR法是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。荧光定量PCR的出现，极大地简化了定量检测的过程，而且真正实现了绝对定量。多种检测系统的出现，使实验的选择性更强。自动化操作提高了工作效率，反应快速、重复性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰。
基因芯片又称为DNA微阵列(DNAmicroarray)，可分为三种主要类型：1)固定在聚合物基片(尼龙膜，硝酸纤维膜等)表面上的核酸探针或cDNA片段，通常用同位素标记的靶基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测。2)用点样法固定在玻璃板上的DNA探针阵列，通过与荧光标记的靶基因杂交进行检测。3)在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷酸探针阵列，与荧光标记的靶基因杂交进行检测。基因芯片作为一种先进的、大规模、高通量检测技术，应用于疾病的诊断，其优点有以下几个方面：一是高度的灵敏性和准确性；二是快速简便；三是可同时检测多种疾病。
用于荧光定量PCR方法检测甲状腺乳头状癌中TMEM255A基因的产品含有一对特异性扩增TMEM255A基因的引物；基因芯片包括与TMEM255A基因的核酸序列杂交的探针。
进一步，甲状腺乳头状癌的诊疗制剂包括用免疫方法检测甲状腺乳头状癌中TMEM255A蛋白的表达。优选所述免疫检测方法检测甲状腺乳头状癌中TMEM255A蛋白表达的为westernblot和/或ELISA和/胶体金检测方法。
酶联免疫吸附实验(ELISA)即将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。该技术可用于检测大分子抗原和特异性抗体等，具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。ELISA检测试剂盒根据检测目的和操作步骤可分为间接法、双抗夹心法、竞争法、双位点一步法、捕获法测IgM抗体、应用亲和素和生物素的ELISA。ELISA检测试剂盒中生色底物可选择辣根过氧化物酶(HRP)或者碱性磷酸酶(AP)。
常用的免疫胶体金检测技术：(1)免疫胶体金光镜染色法细胞悬液涂片或组织切片，可用胶体金标记的抗体进行染色，也可在胶体金标记的基础上，以银显影液增强标记，使被还原的银原子沉积于已标记的金颗粒表面，可明显增强胶体金标记的敏感性。(2)免疫胶体金电镜染色法可用胶体金标记的抗体或抗抗体与负染病毒样本或组织超薄切片结合，然后进行负染。可用于病毒形态的观察和病毒检测。(3)斑点免疫金渗滤法应用微孔滤膜作载体，先将抗原或抗体点于膜上，封闭后加待检样本，洗涤后用胶体金标记的抗体检测相应的抗原或抗体。(4)胶体金免疫层析法将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金标记试剂(抗体或单克隆抗体)吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，当移动至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。该法现已发展成为诊断试纸条，使用十分方便。
进一步，检测TMEM255A蛋白的ELISA法为使用ELISA检测试剂盒。试剂盒中的抗体可采用市售的TMEM255A单克隆抗体。进一步，所述的试剂盒包括：包被TMEM255A单克隆抗体的固相载体，酶标抗体，酶的底物，蛋白标准品，阴性对照品，稀释液，洗涤液，酶反应终止液等。
进一步，检测TMEM255A蛋白的胶体金法为使用检测试剂盒，抗体可采用市售的TMEM255A单克隆抗体。进一步，胶体金检测试剂盒采用胶体金免疫层析技术或胶体金渗滤法。进一步，胶体金检测试剂盒硝酸纤维素膜上的检测区(T)喷点有抗TMEM255A单克隆抗体、质控区(C)喷点有免疫球蛋白IgG。
本发明的目的在于提供一种检测甲状腺乳头状癌的基因检测试剂盒，试剂盒检测基因TMEM255A，采用特异的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQIDNO.9，下游引物序列为SEQIDNO.10。
进一步，该PCR试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，灵敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。
进一步，上述荧光定量PCR试剂盒组分包括：特异性引物、内参引物、荧光定量PCR反应液。其中所述的特异性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQIDNO.9，下游引物序列为SEQIDNO.10。所述内参引物为GAPDH内参引物，上游引物序列为SEQIDNO.11，下游引物序列为SEQIDNO.12。
所述的试剂盒还包含RNA抽提试剂。
本发明目的是提供了一种甲状腺乳头状癌蛋白检测试剂盒，检测试剂盒检测TMEM255A蛋白。进一步的，试剂盒还包括其他检测试剂。
本发明目的是提供了一种检测甲状腺乳头状癌的基因芯片，基因芯片包括与TMEM255A基因的核酸序列杂交的探针。
本发明的目的在于提供TMEM255A基因或蛋白抑制剂在制备抗甲状腺乳头状癌制剂中的应用。
进一步，抗甲状腺乳头状癌制剂是指可以抑制甲状腺乳头状癌细胞中TMEM255A基因的表达的制剂。本领域人员熟知抑制基因的表达通常可以采用下述方法中的一种和/或几种：通过激活目的基因的抑制基因、激活目的基因的抑制基因表达的蛋白、采用RNA干扰技术抑制目的基因表达、激活促进目的基因mRNA降解的microRNA、导入促进目的基因编码蛋白降解的分子、抑制促进目的基因表达的因子及蛋白的表达。即通过激活TMEM255A基因的抑制基因、激活抑制TMEM255A基因表达的蛋白、导入抑制TMEM255A基因表达的siRNA、激活促进TMEM255AmRNA降解的microRNA、导入促进TMEM255A蛋白降解的分子、抑制促进TMEM255A基因表达的因子及蛋白的表达。
RNA干扰(RNAi)是指外源性和内源性双链RNA在生物体内诱导同源靶基因的mRNA特异性降解，导致转录后基因沉默的现象，是一种使用小的双链RNA高效、特异地阻断体内某种特定基因的表达，促使mRNA降解，使细胞表现出特定基因缺失表型的技术。siRNA设计完成后可以采用直接合成法或者构建siRNA表达载体，制备好的siRNA可以通过磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene法、显微注射或基因枪等机械法、阳离子脂质体试剂法等途径转染细胞。
进一步，抑制TMEM255A基因表达的siRNA序列选自下列序列中的一种和/或几种：SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6。
优选siRNA序列为SEQIDNO.5和SEQIDNO.6。
本发明的目的在于提供一种抗甲状腺乳头状癌制剂，抗甲状腺乳头状癌制剂抑制甲状腺乳头状癌细胞中TMEM255A基因的表达。
进一步，抗甲状腺乳头状癌制剂中含有抑制TMEM255A基因表达的siRNA。
附图说明
图1是TMEM255A基因在癌组织及正常组织中相对表达量图
图2是RNA干扰后各组TMEM255AmRNA表达水平
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1病例的收集
取2012年3月到2014年10月期间在医院因甲状腺肿瘤住院手术，经术中冰冻快速病理以及术后石蜡慢病理确认为甲状腺乳头状癌的患者，选择经甲功八项和甲状腺彩超检查正常的健康人群作为对照组，选取6例甲状腺乳头状癌病例样本及5例正常对照组织。
实施例2高通量测序及分析
对组织进行RNA提取，RNA提取后琼脂糖凝胶电泳，从电泳结果可以初步判定提取的RNA样品质量合格与否，是否可以用于进一步的转录组分析。进而通过NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品的提取情况，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。
测序平台为Illumina公司的HiSeq2500高通量测序平台，进行高通量转录组深度测序，测序后我们运用Fast-QC软件对测序数据的质量进行整体评估，包括碱基的质量值分布，质量值的位置分布，GC含量，PCRduplication含量，kmer的frequency等。在差异基因表达分析时，根据得到的FPKM值，采用国际公认算法EBSeq进行差异筛选。其中，筛选时，LOG2FC>1或<-1,FDR<0.05。为了更好的理解差异表达基因的功能，我们对差异表达基因进行了GeneOnlogy和信号通路分析，并对差异表达基因进行功能注释和蛋白质互相作用网络分析，鉴于以上数据分析的结果，结合文献我们筛选了差异表达基因TMEM255A。
实施例3甲状腺乳头状癌组织及正常组织TMEM255A基因表达情况
一、材料和方法
1、材料
选取52例甲状腺乳头状癌组织及23例正常组织，对其进行分组及编号。
2、方法
2.1甲状腺乳头状癌组织及正常组织总RNA的提取
采用Reagent进行样本RNA提取，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：
收集样本后冻存于液氮，取出后把组织放入已预冷的研钵中进行研磨，待组织样本成粉末状后：
①加入Trizol，室温静置5min；
②每毫升Trizol加0.2ml氯仿，用力振荡离心管，充分混匀，室温下放置5-10min；
③4℃12000rpm高速离心15min后EP管分3层，吸取上层水相到另一新离心管管中，注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质。移入新管，加入等体积的-20℃预冷过的异丙醇，充分颠倒混匀，冰上静置10min；
④4℃12000rpm高速离10min后小心弃掉上清液，加入75％DEPC乙醇洗沉淀(4℃保存)，振荡混合，4℃12000rpm高速离心5min；
⑤弃去乙醇液体，室温下放置5分钟以充分晾干沉淀，加入20-40微升DEPC处理过的水溶解沉淀；
⑥用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，冻存于-70℃。RNA质量判定标准：RNA样本的OD260/OD280值为1.7-2.2之间；总RNA电泳图谱有清晰的28S、18S条带；70℃水浴保温1小时后的电泳图谱与水浴保温前的图谱无明显差异。
2.2逆转录合成cDNA
进行cDNA反转录，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：
使用逆转录试剂盒，用逆转录缓冲液对2μl总RNA进行逆反录合成cDNA。采用10μl反应体系，每个样品取2μl总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入以下组分：
5×PrimeScriptBuffer2μl；PrimeScriptRTEmzymeMix0.5μl；OligodTPrimer(50μM)0.5μl；Random6mer(100μM)0.5μl；RNaseFreedH2O4.5μl；模板RNA2μl。
42℃孵育1小时，72℃10分钟，短暂离心。cDNA保存放-20℃冰箱备用。
2.3Real-TimePCR
2.3.1仪器及分析方法
用ABI7500型荧光定量PCR仪，采用2-ΔΔCT法进行数据的相对定量分析。
2.3.2引物设计
采用在线引物设计软件，基因序列参照NCBI:NM_001104544.1，引物设计后由invitrogen公司合成。具体引物序列如下：
TMEM255A基因引物：
5’-ACTGGTCTTATCGGTCCTT-3’(SEQIDNO.9)
5’-CTTGAAGCGGCATTGTAAC-3’(SEQIDNO.10)
扩增长度为83bp。
GAPDH基因引物：
5’-ACTGGTCTTATCGGTCCTT-3’(SEQIDNO.11)
5’-ACTGGTCTTATCGGTCCTT-3’(SEQIDNO.12)
扩增长度为191bp。
操作过程如下：
(一)反应体系：用PowerGreenPCRMasterMix(invitrogen，货号4367659)进行扩增：2×PCRTaqMix25μl；上游引物(10uM)和下游引物(10uM)各2μl；模板2μl；加入灭菌蒸馏水至50μl。
扩增程序为：95°5min，(95℃15sec，60℃40sec)×35个循环。
(二)引物筛选
将各样本cDNA混合后，以此为模板进行5倍梯度稀释，稀释后样品各取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增，同时在60-95℃进行融解曲线分析，根据扩增效率高和溶解曲线单峰原则进行引物筛选。
(三)样品RealTimePCR检测
将各样品cDNA10倍稀释后取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增。同时在60-95℃进行溶解曲线分析。
二、实验结果
实时定量PCR扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增效率相近，极限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本扩增产物溶解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增；根据qRT-PCR的相对定量公式：2-ΔCt×100％，比较TMEM255A基因在甲状腺乳头状癌组织和正常组织中的表达水平。结果显示(具体见图1)：qRT-PCR扩增结果稳定，其中TMEM255A在癌组织中的表达水平高于正常组织近2.5倍，以上结果验证了高通量转录组表达数据的整合分析TMEM255A在甲状腺乳头状癌组织中高表达的结果。
实施例4RNAi抑制TMEM255A基因表达及其对人甲状腺乳头状癌BCPAP细胞的影响
一、材料
(一)标本来源
人甲状腺乳头状癌细胞系BCPAP购自上海慧颖生物细胞库。
(二)主要试剂
LipofectamineTM2000TransfectionReagent(Invitrogen)，MTT(Solarbio)，Transwell小室(Corning)，Matrigel胶(BD)。
(三)siRNA构建与合成
依据在线设计软件siDirectversion2.0(http://design.rnai.jp/)，根据TMEM255A基因在GenBank(NCBIReferenceSequence:NM_001104544.1)中序列设计相应的siRNA。设计后送往合成公司合成。
二、实验方法
(一)RNA干扰技术特异性抑制人甲状腺乳头状癌细胞TMEM255A基因的表达
1、人甲状腺乳头状癌细胞BCPAP的培养
置于含10％FBS的RPMI1640培养基中常规培(20％O2，5％CO2)养。
2、siRNA的设计与合成
siRNA表达载体pSIREN-DNR含新霉素抗性基因和GFP绿色荧光标记，可以实时监测载体在细胞中的转染效率。根据目的mRNA序列，设计3条RNA干扰靶序列及阴性对照(表1)。对于每条选定的siRNA靶序列，设计siRNA正义链和反义链，以loop(9nt)相连，称为shRNA(shorthairpinRNA)。合成每条编码shRNA的DNA模板的两条单链，退火DNA单链得到shRNA的DNA双链模板。模板链后面接有RNAPoIyIII聚合酶转录中止位点，同时两端分别设计BamHI和HindIII酶切位点，可以克隆到siRNA载体多克隆位点的BamHI和HindIII酶切位点之间。siRNA空载体用BamHI和HindIII双酶切后，1％琼脂糖凝胶电泳，回收线性载体。把退火的DNA模板双链连接到线性载体中。采用T4连接酶，插入片断与载体的摩尔比约为3:1。连接产物转化DH5α大肠杆菌，在LBAmp培养基上涂板，37℃培养过夜。PCR鉴定；酶切鉴定；测序鉴定。
表1siRNA转录模板序列
3、重组质粒的细胞转染
(1)细胞分组
C组：空白对照组；NC组：转染非特异性的siRNA组；转染特异性的siRNA组：TMEM255A-siRNA1、TMEM255A-siRNA2、TMEM255A-siRNA3。
(2)细胞培养
人甲状腺乳头状癌BCPAP细胞株常规培养，选择对数期细胞，待细胞生长达到80％左右时按8×104个/孔接种于6孔板，用不含抗生素的培养基培养1-2h；
加4μlg质粒于含250μl无血清无抗生素培养基的EP管中；加10μlLipofectaminTM2000于另一含250μl无血清无抗生素培养基的EP管中；静置5min；
将上述质粒混入含LipofectaminTM2000的培养基中，静置20min；
弃6孔板中培养基，加入l.5m1无血清无抗生素的培养基，然后将上述混合液体加入6孔板中，常规培养；
6h后，换成含10％FBS培养基常规培养，24h后在荧光显微镜下观察。
24小时后注意密切观察细胞长势，当贴壁细胞密度达到70％左右时，准备使用LipofectaminTM2000转染试剂进行转染。
(2)转染
按照LipofectamineTM2000TransfectionReagent提供的步骤进行。
①转染前24h，取对数生长期的细胞用胰酶消化并计数，调整细胞浓度为1×105/ml，取2m1接种于六孔板，放置于37℃，5％CO2培养箱中培养，在细胞达80％融合时用于转染。在转染前用无血清无抗生素培养基培养3-4h。
②配制转染液体：
A液：250u1无血清培养基稀释4.0ugDNA，温和混匀；
B液：250u1无血清培养基稀释10u1Lipofectamine，温和混匀，室温放置5min；
③转染：A液与B液混合在一起，室温保温20min，直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。在CO2培养箱中37℃保温24-48h，6h后换液，加入含血清的培养基。
4、转染效率的验证
(1)荧光倒置显微镜下观察细胞形态和转染情况
转染24h后，将培养板置于荧光倒置显微镜下观察细胞形态及生长状态，绿色荧光下观察转染情况。
(2)应用Real-timePCR方法检测转染前后TMEM255A基因表达的变化
①标准曲线的构建：选取在50mI培养瓶中正常培养的甲状腺乳头状癌BCPAP细胞1瓶，提取RNA，测定RNA浓度和纯度，进行逆转录反应，将反应生成的DNA模板十倍稀释，得到相当于104-100copies/ul的DNA模板，分别加入TMEM255A引物和内参照GAPDH引物，配制25u1反应体系，使用Real-timePCR扩增仪，进行PCR扩增反应。得到TMEM255A和GAPDH的标准曲线。
②Real-timePCR方法检测转染前后TMEM255A基因表达的变化：提取各组细胞的RNA，测定RNA浓度和纯度，进行逆转录反应，每组DNA模板同时进行TMEM255A和GAPDH的Real-timePCR反应，实验重复三次。
③对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。
三、实验结果
结果显示本发明构建的三个干扰载体都对甲状腺乳头状癌BCPAP细胞中TMEM255A基因表达起到一定抑制作用，其中TMEM255A-siRNA1和TMEM255A-siRNA3抑制效果最明显，抑制率达75％和78％，具体见图2。
实施例5一种甲状腺乳头状癌基因检测试剂盒
荧光定量试剂：基因扩增上游引物SEQIDNO.9、下游引物SEQIDNO.10、内参扩增上游引物SEQIDNO.11、下游引物SEQIDNO.12；qRT-PCR反应液：2×UltraSYBROneStepRT-qPCRBuffer(WithROX)、SuperEnzymeMix以及RNase-FreeWater；标准DNA模版：质粒水溶液，浓度梯度为109-101拷贝/μl，在PCR反应的每个反应中加1μl。
荧光定量PCR反应体系及方法：
RT-PCR反应体系(25μl)：2×UltraSYBROneStepRT-qPCRBuffer(WithROX)12.5μl、上游引物(10μM)0.5μl、下游引物(10μM)0.5μl、SuperEnzymeMix0.5μl、加RNA模板(终浓度为10pg–100ng)、RNase-FreeWater补平至25μl。
反应条件：95℃5min预变性，接30-40个循环：95℃15s，60℃40s。
本发明采用高通量测序筛选出甲状腺乳头状癌致病相关基因TMEM255A，结合分子细胞生物学实验验证，证实了TMEM255A是甲状腺乳头状癌密切的标志物。本发明为甲状腺乳头状癌临床诊疗提供了新的靶标，具有很好的临床应用前景。

Claims (10)

1.检测TMEM255A基因或蛋白的制剂在制备甲状腺乳头状癌诊断制剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，甲状腺乳头状癌诊疗制剂包括用荧光定量PCR方法、基因芯片方法检测TMEM255A基因的表达。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，用于荧光定量PCR方法检测甲状腺乳头状癌中TMEM255A基因的产品含有一对特异性扩增TMEM255A基因的引物；基因芯片包括与TMEM255A基因的核酸序列杂交的探针。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，甲状腺乳头状癌诊疗制剂包括用免疫方法检测肺腺癌中TMEM255A蛋白的表达。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，用ELISA或胶体金方法检测TMEM255A蛋白表达。
6.TMEM255A基因或TMEM255A蛋白的抑制剂在制备抗甲状腺乳头状癌制剂中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，抗甲状腺乳头状癌制剂采用下述方法中的一种和/或几种抑制甲状腺乳头状癌细胞中TMEM255A基因的表达：通过激活TMEM255A基因的抑制基因、激活抑制TMEM255A基因表达的蛋白、导入抑制TMEM255A基因表达的siRNA、激活促进TMEM255AmRNA降解的microRNA、导入促进TMEM255A蛋白降解的分子、抑制促进TMEM255A基因表达的因子及蛋白的表达。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，抑制TMEM255A基因表达的siRNA序列选自下列序列中的一种和/或几种：SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6。
9.一种抗甲状腺乳头状癌制剂，其特征在于，抗甲状腺乳头状癌制剂抑制甲状腺乳头状癌细胞中TMEM255A基因的表达。
10.根据权利要求9所述的抗甲状腺乳头状癌制剂，其特征在于，抗甲状腺乳头状癌制剂中含有抑制TMEM255A基因表达的siRNA；优选的，抑制TMEM255A基因表达的siRNA序列选自下列序列中的一种和/或几种：SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108624695A (zh) * 2018-08-03 2018-10-09 朱伟 一种与甲状腺乳头状癌辅助诊断相关的循环miRNA标志物及其应用
CN113730571A (zh) * 2020-05-29 2021-12-03 天津医科大学 甲状腺乳头状癌检测试剂盒和靶向治疗药物组合

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101541977A (zh) * 2006-09-19 2009-09-23 诺瓦提斯公司 用于raf抑制剂的靶向调节、效力、诊断和/或预后的生物标志物
WO2012022634A1 (en) * 2010-08-16 2012-02-23 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Classification, diagnosis and prognosis of multiple myeloma
AU2014201027A1 (en) * 2008-12-08 2014-03-20 Compugen Ltd. FAM26F polypeptides and polynucleotides, and uses thereof as a drug target for producing drugs and biologics
WO2014176696A1 (en) * 2013-04-30 2014-11-06 Université de Montréal Novel biomarkers for acute myeloid leukemia
CN104334191A (zh) * 2012-03-29 2015-02-04 纽约市哥伦比亚大学托管会 治疗毛发脱落疾病的方法
CN105288659A (zh) * 2015-06-01 2016-02-03 北京泱深生物信息技术有限公司 Tenm1基因及其表达产物在诊治乳头状腺癌的应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101541977A (zh) * 2006-09-19 2009-09-23 诺瓦提斯公司 用于raf抑制剂的靶向调节、效力、诊断和/或预后的生物标志物
AU2014201027A1 (en) * 2008-12-08 2014-03-20 Compugen Ltd. FAM26F polypeptides and polynucleotides, and uses thereof as a drug target for producing drugs and biologics
WO2012022634A1 (en) * 2010-08-16 2012-02-23 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Classification, diagnosis and prognosis of multiple myeloma
CN104334191A (zh) * 2012-03-29 2015-02-04 纽约市哥伦比亚大学托管会 治疗毛发脱落疾病的方法
WO2014176696A1 (en) * 2013-04-30 2014-11-06 Université de Montréal Novel biomarkers for acute myeloid leukemia
CN105288659A (zh) * 2015-06-01 2016-02-03 北京泱深生物信息技术有限公司 Tenm1基因及其表达产物在诊治乳头状腺癌的应用

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JOSE M. GOMEZ SAEZ: "Diagnostic and Prognostic Markers in Differentiated Thyroid Cancer", 《CURRENT GENOMICS》 *
PAULA SOARES 等: "Prognostic biomarkers in thyroid cancer", 《VIRCHOWS ARCH》 *
W.-B.LI 等: "Identification of Genes Associated with Papillary Thyroid Carcinoma (PTC) for Diagnosis by Integrated Analysis", 《HORM METAB RES》 *
YURI E. NIKIFOROV 等: "Molecular Diagnostics of Thyroid Tumors", 《ARCH PATHOL LAB MED》 *
张丽芳 等: "《临床免疫学》", 31 May 2006, 浙江大学出版社 *
张金山: "《生命之窗：生命科学前沿纵览.发育生物学》", 30 June 2014, 第四军医大学出版社 *
李加美 等: "甲状腺乳头状癌分子标记物研究进展", 《中华临床医师杂志》 *
林军 等: "CK19、Galectin-3、HBME-1、p27及CyclinD1在甲状腺乳头状癌中的表达及意义", 《中国癌症杂志》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108624695A (zh) * 2018-08-03 2018-10-09 朱伟 一种与甲状腺乳头状癌辅助诊断相关的循环miRNA标志物及其应用
CN113730571A (zh) * 2020-05-29 2021-12-03 天津医科大学 甲状腺乳头状癌检测试剂盒和靶向治疗药物组合
CN113730571B (zh) * 2020-05-29 2024-05-28 天津医科大学 甲状腺乳头状癌检测试剂盒和靶向治疗药物组合

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