CN106834486B

CN106834486B - 骨肉瘤分子诊疗标志物及其应用

Info

Publication number: CN106834486B
Application number: CN201710112966.8A
Authority: CN
Inventors: 任静; 孙锦云; 边洋
Original assignee: Gu'an Bojian Biotechnology Co ltd
Current assignee: GU'AN BOJIAN BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.
Priority date: 2017-02-28
Filing date: 2017-02-28
Publication date: 2021-03-02
Anticipated expiration: 2037-02-28
Also published as: CN106834486A

Abstract

本发明涉及骨肉瘤分子标志物及其应用，具体的涉及NPC2基因及其表达产物在制备骨肉瘤诊断试剂中的应用，NPC2抑制剂在制备治疗骨肉瘤药物中的应用。发明人采用生物信息学方法进行基因筛选，挑选出候选基因NPC2，并通过分子细胞生物学实验证实了NPC2与骨肉瘤具有很好的相关性，在骨肉瘤细胞的增殖及侵袭中具有重要的作用，可以作为骨肉瘤分子标志物，在标志物紧缺的骨肉瘤中具有很好的临床应用价值。

Description

骨肉瘤分子诊疗标志物及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及骨肉瘤分子标志物及其应用，更具体的涉及NPC2基因及其表达产物在制备骨肉瘤诊断试剂中的应用，NPC2抑制剂在制备治疗骨肉瘤药物中的应用。

背景技术

骨肉瘤(Oseteosarcoma)是一种起源于骨间叶细胞的原发性恶性骨肿瘤，特征为增殖的肿瘤细胞直接形成未成熟骨或骨样组织。骨肉瘤发病率约为0.3/万，约占恶性肿瘤的0.2％，原发骨肿瘤的15％，发病年龄多为8-25岁，社会危害性极大，其血行转移发生早且发生率高，进展迅速，80％的患者在确诊时己有微小转移灶，从外科治疗到出现肺转移的平均时间为8个月，5年总体生存率低。随着化学治疗、手术技术、骨重建等治疗方法的发展，骨肉瘤保肢治疗己逐渐取代截肢术，5年总体生存率提高到55％-75％。但是，近年来骨肉瘤的治疗遇到瓶颈，尤其是一些转移骨肉瘤，需要研发新的诊断和治疗策略，如何能早发现早预防是骨肉瘤目前急需解决的难题。

分子诊断和靶向治疗等技术的发展也为骨肉瘤的诊疗开辟了新的道路。分子标志物的存在或量变可以提示肿瘤的性质，借以了解肿瘤的组织发生、细胞分化、细胞功能，以帮助肿瘤的诊断、分类、预后判断以及治疗指导。骨肉瘤由于发病率低、样本收集困难等原因，没有被深入研究，目前骨肉瘤的分子标志物并不多，亟待寻找更多的分子标志物，为骨肉瘤的临床诊断提供参考，为骨肉瘤患者带来希望。

发明人对骨肉瘤病例样本及对照进行高通量测序，结合生物信息学方法进行基因筛选，挑选出候选基因NPC2，并且分析结果显示其与肿瘤转移密切相关。进一步，本发明通过分子细胞生物学实验证实NPC2与骨肉瘤具有很好的相关性，并且其在骨肉瘤细胞的增殖及侵袭中具有重要的作用，可用于制备骨肉瘤辅助诊疗制剂，可以作为骨肉瘤分子标志物，为临床应用奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于提供检测NPC2基因或蛋白的试剂在制备骨肉瘤诊断制剂中的应用。

进一步，检测NPC2在生物学样品中的表达水平是通过检测NPC2部分或全部mRNA和/或检测编码NPC2蛋白的部分或全部氨基酸序列进行。

优选的，生物学样品为来源于患者的生物样品，包括细胞、组织等，可以是血液或者尿液等，优选为外周血。

进一步，骨肉瘤患病组中NPC2基因或蛋白的表达水平与正常对照组织或者癌旁组织相比，表达水平升高。

进一步，骨肉瘤的诊断制剂包括用荧光定量PCR方法、基因芯片方法检测骨肉瘤组织中NPC2基因的表达。

荧光定量PCR法是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。荧光定量PCR的出现，极大地简化了定量检测的过程，而且真正实现了绝对定量。

基因芯片又称为DNA微阵列(DNA microarray)，可分为三种主要类型：1)固定在聚合物基片(尼龙膜，硝酸纤维膜等)表面上的核酸探针或cDNA片段，通常用同位素标记的靶基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测。2)用点样法固定在玻璃板上的DNA探针阵列，通过与荧光标记的靶基因杂交进行检测。3)在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷酸探针阵列，与荧光标记的靶基因杂交进行检测。

用于荧光定量PCR方法检测骨肉瘤中NPC2基因的产品含有一对特异性扩增NPC2基因的引物；所述的基因芯片包括与NPC2基因的核酸序列杂交的探针。

进一步，骨肉瘤的诊断制剂包括用免疫方法检测样品中NPC2蛋白的表达。优选的，免疫检测方法检测骨肉瘤中NPC2蛋白表达的为western blot和/或ELISA和/或胶体金检测方法。

酶联免疫吸附实验(ELISA)即将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。ELISA检测试剂盒根据检测目的和操作步骤可分为间接法、双抗夹心法、竞争法、双位点一步法、捕获法测IgM抗体、应用亲和素和生物素的ELISA。ELISA检测试剂盒中生色底物可选择辣根过氧化物酶(HRP)或者碱性磷酸酶(AP)。

常用的免疫胶体金检测技术：(1)免疫胶体金光镜染色法细胞悬液涂片或组织切片，可用胶体金标记的抗体进行染色，也可在胶体金标记的基础上，以银显影液增强标记，使被还原的银原子沉积于已标记的金颗粒表面，可明显增强胶体金标记的敏感性。(2)免疫胶体金电镜染色法可用胶体金标记的抗体或抗抗体与负染病毒样本或组织超薄切片结合，然后进行负染。可用于病毒形态的观察和病毒检测。(3)斑点免疫金渗滤法应用微孔滤膜作载体，先将抗原或抗体点于膜上，封闭后加待检样本，洗涤后用胶体金标记的抗体检测相应的抗原或抗体。(4)胶体金免疫层析法将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金标记试剂(抗体或单克隆抗体)吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，当移动至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。

进一步，检测NPC2蛋白的ELISA法为使用ELISA检测试剂盒。试剂盒中的抗体可采用市售的NPC2单克隆抗体。进一步，试剂盒包括：包被NPC2单克隆抗体的固相载体，酶标二抗，酶的底物，蛋白标准品，阴性对照品，稀释液，洗涤液，酶反应终止液等。

进一步，检测NPC2蛋白的胶体金法为使用检测试剂盒，所述的抗体可采用市售的NPC2单克隆抗体。进一步，胶体金检测试剂盒采用胶体金免疫层析技术或胶体金渗滤法。进一步，胶体金检测试剂盒硝酸纤维素膜上的检测区(T)喷点有抗NPC2单克隆抗体、质控区(C)喷点有免疫球蛋白IgG。

本发明的目的在于提供一种检测骨肉瘤的荧光定量PCR试剂盒，试剂盒检测基因NPC2，采用特异的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO.7，下游引物序列为SEQID NO.8。

进一步，该PCR试剂盒适合于目前存在市场上的各个类型荧光定量基因扩增仪，灵敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。

进一步，上述荧光定量PCR试剂盒组分包括：特异性引物、内参引物、荧光定量PCR反应液。其中所述的特异性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO.7，下游引物序列为SEQ ID NO.8。所述内参引物为β-actin内参引物。

本发明目的是提供了一种骨肉瘤检测试剂盒，所述的检测试剂盒检测NPC2蛋白。进一步的，所述的试剂盒还包括其他检测试剂。

本发明目的是提供了一种检测骨肉瘤的基因芯片，所述的基因芯片包括与NPC2基因的核酸序列杂交的探针。

本发明的目的在于提供NPC2基因和/或蛋白抑制剂在制备抗骨肉瘤制剂中的应用。

进一步，NPC2基因和/或蛋白抑制剂为NPC2的反义寡核苷酸或干扰RNA。

进一步，抗骨肉瘤制剂是指可以抑制骨肉瘤细胞中NPC2基因或蛋白的表达的制剂。本领域人员熟知抑制基因或蛋白的表达通常可以采用下述方法中的一种和/或几种：通过激活目的基因的抑制基因、激活目的基因的抑制基因表达的蛋白、采用RNA干扰技术抑制目的基因表达、激活促进目的基因mRNA降解的microRNA、导入促进目的基因编码蛋白降解的分子、抑制促进目的基因表达的因子及蛋白的表达。即通过激活NPC2基因的抑制基因、激活抑制NPC2基因表达的蛋白、导入抑制NPC2基因表达的siRNA、激活促进NPC2mRNA降解的microRNA、导入促进NPC2蛋白降解的分子、抑制促进NPC2基因表达的因子及蛋白的表达。

RNA干扰(RNAi)是指外源性和内源性双链RNA在生物体内诱导同源靶基因的mRNA特异性降解，导致转录后基因沉默的现象，是一种使用小的双链RNA高效、特异地阻断体内某种特定基因的表达，促使mRNA降解，使细胞表现出特定基因缺失表型的技术。siRNA设计完成后可以采用直接合成法或者构建siRNA表达载体，制备好的siRNA可以通过磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene法、显微注射或基因枪等机械法、阳离子脂质体试剂法等途径转染细胞。

反义寡核苷酸(asON)是指那些能与特定的DNA、RNA以碱基互补配对的方式结合，并阻止其转录与翻译的短核苷酸片段。

优选的，干扰RNA包括碱基互补的正义链和反义链，所述正义链为NPC2mRNA上19-25个连续的核苷酸。

进一步，所述抑制NPC2基因表达的siRNA序列选自下列序列中的一种和/或几种：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6。优选siRNA序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。

进一步，抗骨肉瘤制剂抑制骨肉瘤细胞的增值或转移。

本发明的目的在于提供一种抗骨肉瘤制剂，所述抗骨肉瘤制剂抑制骨肉瘤细胞中NPC2基因的表达。进一步，所述的抗骨肉瘤制剂中含有抑制NPC2基因表达的siRNA。

用于治疗或预防骨肉瘤的组合物，包含药学有效量的针对NPC2的反义寡核苷酸或干扰RNA作为活性成分，还包含药剂学上能接受的载体。

用于治疗或预防骨肉瘤的组合物，包含药学有效量的与NPC2蛋白结合的抗体或者免疫学活性片段，还包含药剂学上能接受的载体。

包含在本发明的药剂学上能接受的载体为在制剂时通常利用的载体，该载体包含乳糖(lactose)、右旋糖(dextrose)、蔗糖(sucrose)、山梨醇(sorbitol)、甘露醇(mannitol)、淀粉、阿拉伯橡胶、磷酸钙、藻酸盐(alginate)、凝胶(gelatin)、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)、纤维素(cellulose)、水、糖浆、甲基纤维素(methyl cellulose)、羟基苯甲酸甲酯(methyl hydroxybenzoate)、丙基羟基苯甲酸丙酯(propyl hydroxybenzoate)、滑石、硬脂酸镁(stearic acid magnesium)及矿物油(mineral oil)等，但并非局限于此。

本发明的组合物除了上述成分以外还可以包含润滑剂、湿润剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。药剂学上能接受的载体和制剂详细记载于雷明登氏药学全书。

本发明的组合物能通过口服或非口服进行给药，作为非口服给药时，能通过静脉内注射，鼻腔内注射，局部注射，脑室内注射，脊髓腔注射，皮下注射，腹腔注射，经皮给药等方式进行给药。

本发明的组合物的适合的给药剂量根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、食物、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏性之类的因素而可以进行多种处方，通常，熟练的医生能够容易地决定及处方对所希望的治疗或预防有效的给药剂量。

本发明的组合物根据本发明所属技术领域的普通技术人员可以容易实施的方法，利用药剂学上能接受的载体和/或赋形剂来进行制剂化，从而能够以单位用量形态制备或者内装在多容量容器内来制备。此时，剂型是油性或者水性介质中的溶液、悬浮液或乳化液形态，或者也可以是浸膏剂、粉末剂、颗粒剂、片剂或者胶囊剂形态，还可以包括分散剂或者稳定剂。

附图说明

图1 NPC2基因在癌组织及正常组织中相对表达量图

图2 血液中NPC2基因在骨肉瘤组及正常组中相对表达量图

图3 RNA干扰后各组NPC2 mRNA表达水平图

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

实施例1高通量测序及分析

分别收集10例骨肉瘤病例样本及5例正常对照组织，其中10例骨肉瘤病例样本中5例原发样本、5例转移样本。进行RNA提取，RNA提取后琼脂糖凝胶电泳，从电泳结果可以初步判定提取的RNA样品质量合格与否，是否可以用于进一步的转录组分析。进而通过NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品的提取情况，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。

测序平台为Illumina公司的HiSeq 2500高通量测序平台，进行高通量转录组深度测序，测序后我们运用Fast-QC(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)软件对测序数据的质量进行整体评估，包括碱基的质量值分布，质量值的位置分布，GC含量，PCR duplication含量，kmer的frequency等。在差异基因表达分析时，根据得到的FPKM值，采用国际公认算法EBSeq进行差异筛选。其中，筛选时，LOG2FC>1或<-1,FDR<0.05。为了更好的理解差异表达基因的功能，我们对差异表达基因进行了Gene Onlogy和信号通路分析，并对差异表达基因进行功能注释和蛋白质互相作用网络分析，鉴于以上数据分析的结果，结合文献我们筛选了在骨肉瘤组上调表达明显基因NPC2，进一步，通过比较分析转移组和正常组，显示NPC2基因在转移组明显高表达。

实施例2骨肉瘤组及正常组NPC2基因表达情况

一材料和方法

1、材料

收集17例骨肉瘤组织样本、28例骨肉瘤血液样本，6例正常骨组织对照、20例正常血液样本对照，对其进行分组及编号。

组织提取：患者初次手术时，在无菌操作下术中提取组织样本，每块切成黄豆大小，取出后迅速放入冻存管中，并尽快置于液氮中。

血液提取：患者确认后及时采集病例的外周血标本3-5毫升，迅速放入EDTA抗凝管中，尽快置于-80℃冰箱。

2、方法

2.1骨肉瘤及正常对照总RNA的提取

采用

Reagent(invitrogen，货号15596-018)进行样本RNA提取，实验操作按产品说明书进行。

提取后，用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度,冻存于-70℃。RNA质量判定标准：RNA样本的OD260/OD280值为1.7-2.2之间；总RNA电泳图谱有清晰的28S、18S条带；70℃水浴保温1小时后的电泳图谱与水浴保温前的图谱无明显差异。

2.2逆转录合成cDNA

采用

III Reverse Transcriptase(invitrogen，货号18080-044)进行cDNA反转录，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：

使用逆转录试剂盒，用逆转录缓冲液对lμg总RNA进行逆反录合成cDNA。采用25μl反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入以下组分：

5×逆转录缓冲液5μl，10mmol/l dNTP 1.25μl，0.1mmol/l DTT 2.5μl，30μmmol/lOligodT 2μl,200U/μl MMLV 1.25μl，模板RNA 1μg，加入灭菌水至总体系25μl。42℃孵育1小时，72℃10分钟，短暂离心。cDNA保存放-20℃冰箱备用。

2.3 Real-Time PCR

2.3.1仪器及分析方法

用ABI 7500型荧光定量PCR仪，采用-1/2^-△△CT法进行数据的相对定量分析。

2.3.2引物设计

采用在线引物设计软件，引物设计后由invitrogen公司合成。具体引物序列如下：

表1引物序列

操作过程如下：

(一)反应体系：用Power

Green PCR Master Mix(invitrogen，货号4367659)进行扩增，实验操作按产品说明书进行。扩增程序为：95℃10min，(95℃15sec，60℃60sec)×45个循环。

表2 RealTime反应体系

组分	加入量
		2×mix	10μl
上游引物(10uM)	0.5μl
		下游引物(10uM)	0.5μl
模板	2μl
		加入灭菌蒸馏水	至25μl

(二)引物筛选

将各样本cDNA混合后，以此为模板进行5倍梯度稀释，稀释后样品各取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增，同时在60-95℃进行融解曲线分析，根据扩增效率高和溶解曲线单峰原则进行引物筛选。

(三)样品RealTimePCR检测

将各样品cDNA 10倍稀释后取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增。同时在60-95℃进行溶解曲线分析。

二实验结果

实时定量PCR扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增效率相近，极限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本扩增产物溶解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增；根据qRT-PCR的相对定量公式：-1/2^-ΔΔCt，比较NPC2基因在骨肉瘤组织和正常组织、骨肉瘤血液样本和正常对照血液样本中的表达水平。结果显示：qRT-PCR扩增结果稳定，在组织样本中，NPC2在骨肉瘤组的表达水平是正常对照组的3.5倍(具体见图1)，在血液样本中，NPC2在骨肉瘤组的表达水平是正常对照组的1.82倍(具体见图2)，以上结果验证了高通量转录组表达数据的整合分析NPC2在骨肉瘤组中高表达的结果。

实施例3骨肉瘤细胞系MG-63的培养

一、材料

(一)标本来源

人骨肉瘤细胞系MG-63购自中科院上海细胞研究所。

(二)主要试剂

DMEM/HIGH Glucose(1×)(赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司)

(三)主要溶液

1、细胞培养液

DMEM培养基+10％标准胎牛血清。

2、PBS(平衡盐溶液)

在800m1蒸馏水中溶解8g NaCl，0.25g KCl，1.44g Na₂HPO₄和0.24g KH₂PO₄用HCl调节溶液的pH值至7.4，加水定容至1L，高压灭菌，室温保存。

3、0.25％胰蛋白酶消化液

0.25g胰蛋白酶加入100m1去离子水中，滤器过滤灭菌，分装备用。

二、实验方法

(一)细胞培养

1、细胞传代

(1)将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去，加入0.25％胰蛋白酶液1m1，覆盖细胞层，瓶口消毒，加盖；

(2)倒置显微镜下观察细胞变化，随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，细胞间质回缩，细胞间隙加大，在还未漂起时将胰酶弃去，加入5ml含10％胎牛血清的培养液终止消化；

(3)细胞计数：取上述细胞悬液0.5mI，适当稀释后滴入血细胞计数板内，按白细胞计数法数四角四大格内细胞总数，计数时仅计数细胞核和细胞浆完整的细胞，成堆的细胞按一个细胞计算，将4大方格内的细胞总数按下列公式换算成每毫升细胞悬液中的细胞数：细胞总数/ml＝4大格细胞总数/4×10⁴×稀释倍数；

(4)根据细胞计数结果，用DMEM完全培养液进一步稀释为每毫升含3×10⁵个细胞浓度，分装于培养瓶中(8m1/每瓶)，放置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。

2、细胞冻存

(1)消化细胞(方法同上)，将细胞悬液收集至离心管中，1000rpm离心5min，弃上清液；

(2)沉淀加含保护液的培养液，计数，调整至5×10⁶/ml左右，将悬液分至冻存管中，每管1ml；

(3)将冻存管口封严，否则复苏时易出现爆裂，贴上标签，写明细胞种类，冻存日期；

(4)按下列顺序降温：室温4℃(20分钟)，冰箱冷冻室(30分钟)、低温冰箱(-30℃，1小时)，低温冰箱(-70℃，过夜)、液氮。

3、细胞复苏

(1)从液氮中取出冻存管，迅速置于37℃温水中并不断搅动。使冻存管中的冻存物在1分钟之内融化，管消毒，入台；

(2)打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中，1000rpm离心10分钟，弃去上清液；

(3)沉淀加10ml培养液，吹打均匀，再离心10分钟，弃上清液；

(4)加入新培养液适当稀释，轻轻混匀，接种于培养瓶中培养。

实施例4 RNAi抑制NPC2基因表达及其对人骨肉瘤MG-63细胞的影响

一、材料

(一)标本来源

人骨肉瘤细胞系MG-63购自中科院上海细胞研究所。

(二)主要试剂

Lipofectamine^TM2000 Transfection Reagent(Invitrogen)，MTT(Solarbio)，Transwell小室(Corning)，Matrigel胶(BD)。

(三)siRNA构建与合成

依据在线设计软件siDirect version 2.0(http://design.rnai.jp/)，根据NPC2基因在GenBank(NCBI Reference Sequence:NM_006432.3)中序列设计相应的siRNA。设计后送往合成公司合成。

二、实验方法

(一)RNA干扰技术特异性抑制人骨肉瘤细胞NPC2基因的表达

1、人骨肉瘤细胞MG-63的培养

方法步骤同实施例3。

2、siRNA的设计与合成

siRNA表达载体pSIREN-DNR含新霉素抗性基因和GFP绿色荧光标记，可以实时监测载体在细胞中的转染效率。根据目的mRNA序列，设计3条RNA干扰靶序列(表3)，阴性对照由公司提供。

表3 siRNA转录模板序列

3、细胞分组及转染

(1)细胞分组

C组：空白对照组；C1组：转染脂质体组；C2组：转染非特异性的siRNA组；S1，S2，S3组：转染特异性的siRNA组。

(2)转染

按照Lipofectamine^TM2000 Transfection Reagent提供的步骤进行。

①转染前24h，取对数生长期的细胞用胰酶消化并计数，用DMEM培养基调整细胞浓度为1×10⁵/ml，取2m1接种于六孔板，放置于37℃，5％CO₂培养箱中培养，在细胞达80％融合时用于转染。在转染前用不含血清的DMEM培养基培养3-4h。

②配制转染液体：

A液：250u1无血清培养基稀释4.0ugDNA，温和混匀；

B液：250u1无血清培养基稀释10u1Lipofectamine，温和混匀，室温放置5min；

③转染：A液与B液混合在一起，室温保温20min，直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。在CO₂培养箱中37℃保温24-48h，6h后换液，加入含血清的培养基。

4、转染效率的验证

(1)荧光倒置显微镜下观察细胞形态和转染情况

转染24h后，将培养板置于荧光倒置显微镜下观察细胞形态及生长状态，绿色荧光下观察转染情况。

(2)应用Real-time PCR方法检测转染前后NPC2基因表达的变化

①标准曲线的构建：选取在50mI培养瓶中正常培养的骨肉瘤MG-63细胞1瓶，提取RNA，测定RNA浓度和纯度，进行逆转录反应，将反应生成的DNA模板十倍稀释，得到相当于10⁴-10⁰copies/ul的DNA模板，分别加入NPC2引物和内参照actin引物，配制25u1反应体系，使用Real-time PCR扩增仪，进行PCR扩增反应。得到NPC2和actin的标准曲线。

②Real-time PCR方法检测转染前后NPC2基因表达的变化：提取各组细胞的RNA，测定RNA浓度和纯度，进行逆转录反应，每组DNA模板同时进行NPC2和actin的Real-timePCR反应，实验重复三次。

③对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。

(二)RNAi抑制人骨肉瘤MG-63细胞NPC2基因表达对其相关生物学行为的影响

1、MTT法测细胞增殖

活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的紫色结晶物，用紫外分光光度计在490nm处测定其吸光度，可间接反应活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。

实验步骤：

(1)MTT溶液：称取250mg MTT，放入小烧杯中，加入50mI PBS(0.0lmol/L，pH7.4)，在电磁力搅拌机上搅拌30min，用0.22um的微孔滤膜除菌，分装，4℃保存，两周内有效。

(2)细胞分组：实验分为正常细胞组，阴性对照组和实验组。正常细胞组为常规培养的MG-63；阴性对照组为非特异性siRNA转染后48h；实验组为特异性siRNA转染后48h；每组设3个重复。

(3)接种细胞：用0.25％胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10％胎牛血清DMEM培养液配成单个细胞悬液，以每孔1了个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积100ul。

(4)培养细胞：将培养板放入CO₂孵箱，在37℃，5％CO₂及饱和湿度条件下培养。

(5)呈色：培养后第0h、24h、48h、72h、96h，每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20u1,37℃继续孵育4h，终止培养，小心弃去孔内培养上清夜。吸去上清液，加入二甲基亚砜150ul，振荡10min使结晶完全溶解。

(6)比色：选择490nm波长，在紫外分光光度计上测定各孔吸光度。设与试验孔平行不加细胞只加培养液的空白对照孔。重复3次，记录结果，以时间为横轴，吸光度(A₄₉₀)为纵轴绘制细胞生长曲线。

2、体外侵袭实验

(1)细胞准备

本实验设置空白对照组，阴性对照组和实验组。空白对照组为常规培养的MG-63；阴性对照组为非特异性siRNA转染后48h；实验组为特异性siRNA转染后48h。将各组细胞用0.25％胰蛋白酶消化，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗3遍，重悬于含0.1％BSA的无血清培养基中。

(2)体外侵袭模型的构建与实验步骤

Transwell小室是常用的Matrigel胶重建基底膜系统，是体外研究肿瘤细胞侵袭和转移行为的有效方法。Matrigel是人工重构基底膜材料，主要成分为层黏连蛋白和W型胶原，是一种细胞外基质，4℃时是液体，在37℃会逐渐凝固成胶状，不可逆。将Transwell小室放入24孔培养板中，小室内称上室，培养板内称下室。

①包被基底膜：将Transwell小室放入培养板中，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜(8um孔径)相隔。Matrigel 4℃过夜成液态，用50mg/L Matrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，每个小室使用100u1，分3次涂在Transwell的聚碳酸酯膜上，第一次用50ul，第二、三次各加25u1，每次的间隔时间为10min，使膜上所有的微孔被人工基底胶覆盖并在37℃孵育2h使其成凝胶状，吸取胶层表面析出的水相，形成人工重组基底膜。取10u1纤维粘连蛋白(fibronectin，FN)稀释液涂于小室的下表面，4℃风干。

②接种细胞：将各组细胞调整密度，取2×10⁵/ml细胞200u1加入上室，下室加入作为化学趋化物的含10％FBS的DMEM培养基500u1。

③培养细胞：37℃，5％CO2条件下孵育20h。

④固定与染色：取出小室，弃去上室内培养基，用棉签仔细擦净膜上室面未

侵袭的细胞，下室面用甲醇固定10min后，0.1％结晶紫染色。用小刀沿边缘切下，置于载玻片上，中性树胶封片。

⑤观察与计数：在倒置显微镜下随机选取6个200×视野，计数穿膜细胞数目，取均值。实验重复3次。

三、实验结果

Real-time PCR检测转染效率。应用Real-time PCR方法构建NPC2和actin的标准曲线，相关系数分别为0.9963,0.9957，线性关系良好，符合要求。用双标准曲线的方法比较各组NPC2基因的表达。空白对照组、脂质体转染组、非特异性转染组基因的表达基本相似，差异无统计学意义。SiRNA1，SiRNA2，SiRNA3均有抑制NPC2基因表达的作用，NPC2-siRNA1和NPC2-siRNA2的作用更明显，抑制效率达73％和69％，NPC2-siRNA3的抑制作用为35％，与空白对照组、脂质体转染组、非特异性转染组相比，差异有统计学意义，P<0.05(表4，图2)。

表4各组NPC2 mRNA表达水平

组别	NPC2/actin相对浓度比值(均数±标准差)
		空白对照组	1.0
脂质体转染组	0.9972±0.0793
		非特异性转染组	0.9934±0.0882
NPC2-siRNA1组	0.2741±0.0771
		NPC2-siRNA2组	0.3139±0.0519
NPC2-siRNA3组	0.6463±0.0274

细胞增殖抑制实验(MTT)。阴性对照组选为非特异性转染，实验组为转染NPC2-siRNA1组。四甲基偶氮哇蓝比色法(MTT)实验显示，在相同的初始条件下，各组细胞增殖速度相近，无统计学差异(P<0.05)。24h后，特异性siRNA转染组(0.1714±0.0287)细胞增殖速度减慢，正常细胞组(0.2097±0.0196)、阴性对照组细胞(0.2105±0.0233)增殖速度相近，特异性siRNA转染组细胞增殖速度减慢，差异有统计学意义(P<0.05)。随着观察时间延长(48h、72h、96h)，前两组组间比较，增殖速度相似，差异无统计学意义(P>0.05)；特异性siRNA转染组与前两组相比，增殖速度明显减慢，有显著性差异(P<0.05)。MTT实验结果表明，特异性siRNA转染组的细胞生长明显受到抑制。

体外侵袭实验。细胞穿过Matrigel重建基底膜数目的多少反映了细胞侵袭能力的变化。通过计数实验组与对照组细胞穿过人工基底膜的细胞数量并进行比较，可以发现RNA干扰NPC2基因表达后肿瘤细胞的运动侵袭能力明显下降，穿过人工基底膜的细胞数量明显减少，空白对照组(34.49±1.35)、阴性对照组(34.26±1.83)及实验组(21.04±2.32)侵袭细胞的相对数目差异有统计学意义(P<0.05)。

本发明采用高通量测序筛选出骨肉瘤致病相关基因NPC2，结合分子细胞生物学实验验证，证实了NPC2在骨肉瘤细胞的增殖及侵袭中具有重要的作用，抑制NPC2基因的表达能够降低骨肉瘤细胞的侵袭和增殖。本发明为骨肉瘤临床诊疗提供了新的靶标，具有很好的临床应用前景。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京泱深生物信息技术有限公司

<120> 骨肉瘤分子诊疗标志物及其应用

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

uuuauagagg gauauucgcu u 21

<210> 2

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 2

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<210> 3

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 3

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<210> 4

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 4

gaaauuuacu cuugaauaaa u 21

<210> 5

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 5

uuugucaucc ugaaguugcc a 21

<210> 6

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 6

gcaacuucag gaugacaaaa a 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

caaaggacag tcttacagcg t 21

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ggatagggca gttaattcca ctc 23

Claims

1.特异性检测NPC2基因或蛋白表达量的试剂在制备骨肉瘤诊断制剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，检测NPC2基因或蛋白是通过检测生物样品中NPC2 mRNA和/或检测编码NPC2蛋白的氨基酸序列进行。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，生物学样品为组织。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，骨肉瘤的诊断制剂包括用荧光定量PCR方法和/或基因芯片方法检测样品中NPC2基因表达的产品；或用western blot和/或ELISA和/或胶体金检测方法检测样品中NPC2蛋白表达的产品。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，用荧光定量PCR方法检测样品中NPC2基因表达的产品含有一对特异性扩增NPC2基因的引物；用基因芯片法检测样品中NPC2基因表达的产品含有与NPC2基因的核酸序列杂交的探针；用western blot和/或ELISA和/或胶体金检测方法检测样品中NPC2蛋白表达的产品含有NPC2单克隆抗体。

6.NPC2基因抑制剂在制备抗骨肉瘤制剂中的应用，其特征在于，所述抑制剂为干扰RNA。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，干扰RNA包括碱基互补的正义链和反义链，所述正义链为NPC2 mRNA上19-25个连续的核苷酸。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，干扰RNA序列选自下列序列：SEQ ID NO.1-2、SEQ ID NO.3-4或SEQ ID NO.5-6。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，干扰RNA序列为SEQ ID NO.1-2。

10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，抗骨肉瘤制剂抑制骨肉瘤细胞的增殖或转移。