CN111060585B - 一种血浆外泌体质谱峰及其运用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种血浆外泌体质谱峰及其运用,所述的质谱峰如摘要附图所示,其可用于骨肉瘤肺转移检测以及骨肉瘤肺转移理论研究。本发明还涉及一种基于质谱技术检测外泌体特征谱早期诊断骨肉瘤肺转移的方法:利用外泌体在骨肉瘤肺转移和非肺转移患者中的差异不同及存在特征质谱峰,通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI‑TOFMS)技术检测患者血浆外泌体样本,从而早期诊断骨肉瘤肺转移。其中基质是由芥子酸和乙腈、三氟乙酸和去离子水组成的混合溶剂配制而成。本发明优点是:提供了判定骨肉瘤肺转移的标准外泌体质谱峰,其判定结果准确可靠、可信度高,具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及骨肉瘤肺转移检测技术领域,具体地说,是一种血浆外泌体质谱峰及其运用。
背景技术
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(Matrix-assisted laserdesorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)自1980年代发展起来,具有超高灵敏度和特异性,目前已广泛应用于临床实验室诊断。MALDI-TOF MS技术通过对生物分子的分子量进行准确测定,实现生物大分子的鉴定分析。通过分析不同细菌的指纹图谱,MALDI-TOFMS能实现临床微生物快速鉴定。此外,MALDI-TOF MS技术也广泛应用于蛋白质组学研究。
外泌体是胞外囊泡(ExtracellularVesicles,EV,胞外囊泡尺寸约30-1000nm)的一种,其直径约为30-150nm,外泌体囊壁由磷脂双分子层组成,囊壁富含膜蛋白。外泌体囊泡内含有蛋白质、核酸(miRNA、mRNA等)、膜蛋白或脂质等物质。大量文献和临床实践表明,外泌体可以作为各种具有外泌体分泌的临床疾病诊断或鉴别诊断广泛的运用。MALDI-TOFMS技术可以通过对外泌体样本的检测分析获得不同某一类疾病人体个体背景相同情况下,高灵敏度的发现疾病的变化,其中在肿瘤复发或转移进展中,患者自身的各种肿瘤相关的生物学信息可以通过外泌体数量、携带蛋白、核酸的不同被检测除差异。在不同肿瘤之中,该质谱特征谱峰会有所不同特征。
骨肉瘤是异质性非常强的恶性骨肿瘤,在传统各种肿瘤相关蛋白或标志物检测方面没有获得研究进展或临床上可以区分骨肉瘤肺转移的标志物或有效的高灵敏度的技术方法,在临床上一般通过CT影像学来发现骨肉瘤肺转移,存在早期骨肉瘤微小肺转移燥很难诊断和鉴别的临床困境。血液外泌体是最早就能反应骨肉瘤肺转移的生物学信息,利用骨肉瘤外泌体的质谱特征谱的差异,理论上可以在极早期诊断和鉴别诊断骨肉瘤肺转移。
关于本发明一种血浆外泌体质谱峰及其用途目前还未见报道。
发明内容
本发明的第一个目的是针对现有技术的不足,提供一种血浆外泌体质谱峰的用途。
本发明的第二个目的是针对现有技术的不足,提供一种检测血浆外泌体质谱峰的试剂的用途。
为实现上述第一个目的,本发明采取的技术方案是:
一种血浆外泌体质谱峰在骨肉瘤肺转移理论研究中的应用,所述的血浆外泌体质谱峰满足两个峰分别在3520-3530道尔顿和5130-5170道尔顿均存在时,检测结果为骨肉瘤肺转移阳性,否则为阴性。
为实现上述第二个目的,本发明采取的技术方案是:
检测血浆外泌体质谱峰的试剂在制备检测骨肉瘤肺转移试剂盒中的应用。
作为本发明的一个优选实施方案,所述的试剂是由芥子酸和乙腈、三氟乙酸和去离子水制成,其中,乙腈、三氟乙酸和去离子水的体积比为(45-55):(0.01-0.2):(44.9-54.9);乙腈、三氟乙酸和去离子水制成混合溶剂,芥子酸和混合溶剂的质量体积比为(15-25):(0.1-2)mg/ml。
作为本发明的一个优选实施方案,所述的试剂是由芥子酸和乙腈、三氟乙酸和去离子水制成,其中,乙腈、三氟乙酸和去离子水的体积比为50:0.1:49.9;乙腈、三氟乙酸和去离子水制成混合溶剂,芥子酸和混合溶剂的质量体积比为20:1mg/ml。
优选地,所述试剂盒的使用方法为:先将血浆外泌体样本经过分离纯化富集,然后采用基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱技术检测血浆外泌体样本并通过聚类分析检测数据,获得骨肉瘤肺转移的质谱特征谱,最后通过验证确认骨肉瘤肺转移的质谱特征谱波峰标准,符合该质谱特征谱波峰标准的即为骨肉瘤肺转移,否则为骨肉瘤非肺转移。
作为本发明的一个优选实施方案,所述的血浆外泌体样本是骨肉瘤患者的血浆外泌体样本。
作为本发明的一个优选实施方案,血浆外泌体样本分离纯化富集的方法是采用标准的超高速离心法。
作为本发明的一个优选实施方案,所述的基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱技术的仪器条件为:线性正离子模式,离子加速电压20kV,离子延迟提取时间为1000ns,激光强度83%。
作为本发明的一个优选实施方案,所述的血浆外泌体样本的量为0.5-1.5ml。
作为本发明的一个优选实施方案,所述的血浆外泌体样本的量为1ml。
本发明的骨肉瘤肺转移的诊断依据来源临床随访和肺部CT诊断,骨肉瘤患者血样,外泌体分离纯化后,采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF MS)对外泌体样本进行检测,然后对无骨肉瘤肺转移组和骨肉瘤肺转移组质谱检测分析数据,获得骨肉瘤肺转移的质谱特征谱,并通过验证确认诊断标准的骨肉瘤肺转移的质谱特征谱波峰标准。
本发明优点在于:
提供了判定骨肉瘤肺转移的标准外泌体质谱峰,其判定结果准确可靠、可信度高,因此,本发明为骨肉瘤肺转移的检测提供了一种新方法,该方法可对骨肉瘤患者的血浆外泌体进行质谱收集,通过对质谱数据的分析,可直接用于检测诊断骨肉瘤患者是否存在肺转移现象,弥补了现有技术中早期骨肉瘤微小肺转移燥很难诊断和鉴别的临床困境的缺陷,具有很好的应用前景。
附图说明
附图1是实验基本流程示意图。
附图2是骨肉瘤患者非肺转移和肺转移的外泌体样本在3520-3530Da质谱数据分析结果图。
附图3是骨肉瘤患者非肺转移和肺转移的外泌体样本在5130-5170Da质谱数据分析结果图。
附图4是其骨肉瘤肺转移患者血浆外泌体特征峰的特异性、敏感性及统计学分级图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明记载的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
本发明从患者血样中分离纯化外泌体后,采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF MS)对骨肉瘤患者外泌体进行检测,分析得到明确的骨肉瘤肺转移的质谱特征谱波峰,通过验证后明确了骨肉瘤肺转移的早期诊断特征谱。
实施例1本发明质谱峰的获得
1实验设备与材料
1.1实验设备
设备来源:
超速离心机:Optima XE-90Ultracentrifuge(BECKMAN COULTER)
MALDI-TOF质谱仪:Bruker Microflex LRF MALDI-TOF mass spectrometer(Bremen,Germany)
1.2实验材料
20毫克芥子酸、1毫升50%的乙腈、0.1%三氟乙酸、49.9%(v/v)去离子水;
质谱校准的标准品CM,细胞色素C和肌红蛋白。
材料来源:芥子酸、三氟乙酸、细胞色素C和肌红蛋白购置Sigma公司;乙腈购置MERCK公司;靶板型号MSPAnchorChip 96BC。检测样本:人体静脉血来源血浆。
2研究方法
2.1外泌体的分离纯化过程:1.5ml临床血浆样本(经过2000g离心10mim和3500g离心10min)室温解冻,取出1ml样品,离心10000g*20min,PBS稀释至10ml,离心110000g*11h,弃上清,沉淀再用PBS重悬,调整体积至10ml,离心110000g*90min,100μl去离子水重悬。
2.2基质配制:称取20毫克的芥子酸加入到1毫升50%的乙腈,0.1%三氟乙酸和49.9%(v/v)去离子水混合溶液中充分溶解。
2.3 MALDI-TOF MS质谱检测:仪器条件:线性正离子模式,离子加速电压20kV,离子延迟提取时间1000ns,激光强度83%。
2.4 MALDI-TOF-MS检测外泌体样本方法:在靶板上的特定检测点上加上质谱校准的标准品(CM:细胞色素C和肌红蛋白,已知分子质量),每一个样本取1μl的外泌体溶液点到质谱的靶板上,分别点样。自然晾干后,每个点上加SA基质辅助电离。把加过SA基质的靶板自然晾干。将靶板放入MALDI-TOF-MS的进样仓进样。抽真空,打开高电压,等待机器进入检测环境。机器准备好后先检测标准品对机器进行校准。检测临床样本,每个点搜集大概4-6张谱图,检测分析。导出原始数据,对数据进行分析。
2.5 MALDI-TOF-MS数据分析过程:mmass软件浏览每一个峰图,对于没有出峰的谱图进行删除,挑选质量高的谱图。对每一个同一样本的谱图进行合并。对每个样本的合并分进行基地线的扣除、平滑、识别主要的质谱峰,并导出质谱分的原始数据。将各样本识别的主要的质谱峰数据用R语言工具进行对齐并合并至一个数据框中,方便接下来数据分析。采用PLS-DA数据分析寻找两组的主要差异峰,采用heatmap聚类分析,并用多元ROC曲线勘探对这些差异因素进行建模并验证模型的准确性。
3实验结果
实验结果表明骨肉瘤患者的血浆外泌体质谱特征峰满足两个峰分别在3520-3530道尔顿和5130-5170道尔顿均存在时,检测结果为骨肉瘤肺转移阳性,否则为阴性。
实施例2本发明质谱峰可用于判定骨肉瘤肺转移的验证
1样本来源
收集在临床采集就诊患者的血浆外泌体共10例,其中有5例骨肉瘤肺转移患者的血浆外泌体和5例骨肉瘤非肺转移患者的血浆外泌体。受试者均被告知实验目的并签署知情同意书。
2方法
5例骨肉瘤肺转移和5例骨肉瘤非肺转移患者血浆外泌体样本,按照实施例1中所述的外泌体分离纯化方法纯化后,采用MALDI-TOF-MS质谱检测分析数据,进行聚类分析后发现骨肉瘤肺转移和骨肉瘤非肺转移患者的外泌体完全自动区分出来(见图1)。进一步对MALDI-TOF-MS质谱检测数据进行分析骨肉瘤肺转移的患者外泌体的特征谱波峰,获得了骨肉瘤肺转移患者外泌体的质谱特征谱,符合该特征质谱可用于诊断骨肉瘤肺转移。其转移性特征峰的特异性、敏感性及统计学分级见图4。
3结果
3.1图2主要显示的是骨肉瘤肺转移和骨肉非转移外泌体样本在3520-3530Da(橙色三角箭头指出)的谱图。其中A是5个骨肉瘤肺转移外泌体标本MALDI谱图,(cli-1103、cli-1100、cli-755、cli-576、cli-350)是样品编号;图2B是5个骨肉瘤非转移外泌体标本MALDI谱图,(cli-1112、cli-958、cli-730、cli-723、cli-444)是样品编号。该位置转移性特征峰的特异性、敏感性及统计学分级见图4A。
3.2图3主要显示的是骨肉瘤肺转移和骨肉非转移外泌体样本在5130-5170Da(橙色三角箭头指出)的谱图。其中A是5个骨肉瘤肺转移外泌体标本MALDI谱图,(cli-1103、cli-1100、cli-755、cli-576、cli-350)是样品编号;图3B是5个骨肉瘤非转移外泌体标本MALDI谱图,(cli-1112、cli-958、cli-730、cli-723、cli-444)是样品编号。该位置转移性特征峰的特异性、敏感性及统计学分级见图4B。
3.3对质谱谱图的解读:当骨肉瘤患者血浆外泌体得到的质谱谱图中存在至少两个质谱峰满足两个峰的分别在3520-3530道尔顿(Da)和5130-5170道尔顿(Da)存在时,检测结果为骨肉瘤肺转移阳性。
本发明提供了判定骨肉瘤肺转移的标准外泌体质谱峰,其判定结果准确可靠、可信度高,为骨肉瘤肺转移的检测提供了一种新方法,该方法可对骨肉瘤患者的血浆外泌体进行质谱收集,通过对质谱数据的分析,可直接用于检测诊断骨肉瘤患者是否存在肺转移现象,弥补了现有技术中早期骨肉瘤微小肺转移燥很难诊断和鉴别的临床困境的缺陷,具有很好的应用前景。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和补充,这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.检测血浆外泌体质谱峰的试剂在制备检测骨肉瘤肺转移试剂盒中的应用,其特征在于,所述的血浆外泌体质谱峰满足两个峰分别在3520-3530道尔顿和5130-5170道尔顿均存在时,检测结果为骨肉瘤肺转移,否则为骨肉瘤非肺转移。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的试剂是由芥子酸和乙腈、三氟乙酸和去离子水制成,其中,乙腈、三氟乙酸和去离子水的体积比为(45-55):(0.01-0.2):(44.9-54.9);乙腈、三氟乙酸和去离子水制成混合溶剂,芥子酸和混合溶剂的质量体积比为(15-25):(0.1-2)mg/ml。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的试剂是由芥子酸和乙腈、三氟乙酸和去离子水制成,其中,乙腈、三氟乙酸和去离子水的体积比为50:0.1:49.9;乙腈、三氟乙酸和去离子水制成混合溶剂,芥子酸和混合溶剂的质量体积比为20:1mg/ml。
4.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述试剂盒的使用方法为:先将血浆外泌体样本经过分离纯化富集,然后采用基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱技术检测血浆外泌体样本并通过聚类分析检测数据,获得骨肉瘤肺转移的质谱特征谱,最后通过验证确认骨肉瘤肺转移的质谱特征谱波峰标准,符合该质谱特征谱波峰标准的即为骨肉瘤肺转移,否则为骨肉瘤非肺转移。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述的血浆外泌体样本是骨肉瘤患者的血浆外泌体样本。
6.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,血浆外泌体样本分离纯化富集的方法是采用标准的超高速离心法。
7.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述的基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱技术的仪器条件为:线性正离子模式,离子加速电压20kV,离子延迟提取时间为1000ns,激光强度83%。
8.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述的血浆外泌体样本的量为0.5-1.5ml。
9.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述的血浆外泌体样本的量为1ml。
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