CN113466370A - 一种用于食管鳞癌早期筛查的标志物及检测试剂盒 - Google Patents

一种用于食管鳞癌早期筛查的标志物及检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于医药生物技术领域，公开了一种基于代谢组学的食管鳞癌早期筛查标志物及其试剂盒。本发明提供的用于食管鳞癌筛查的标志物为N‑邻甲苯酸甘氨酸、D‑山梨糖醇、N‑乙酰‑D‑甘露糖胺中的至少一种，该标志物的检测试剂能够用于制备食管鳞癌筛查产品。本发明还提供一种用于食管鳞癌筛查的试剂盒，该试剂盒含有检测上述标志物的检测试剂。本发明通过检测人血清中N‑邻甲苯酸甘氨酸、D‑山梨糖醇、N‑邻甲苯酸甘氨酸的表达水平，可以有效检测食管鳞癌，尤其是早期食管鳞癌；三个标志物联合时，其检测灵敏度高达92.2%，特异性达到了98.0%，可用于食管鳞癌高发区无症状人群的大规模筛查，有利于无症状高危人群筛查和早期发现。

Description

一种用于食管鳞癌早期筛查的标志物及检测试剂盒
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，具体公开了基于代谢组学的食管鳞癌早期诊断标志物及其试剂盒。
背景技术
食管鳞癌是世界上最常见的六大恶性肿瘤之一，具有显著的地域分布差异和家族聚集现象，我国是世界上食管鳞癌发病率和死亡率最高的国家，全世界每年心法食管鳞癌患者约50万例，一半以上发生在中国。在中国，半数患者发生在河南、河北和山西三省交界的太行山地区，其中河南临县是世界上食管鳞癌发病率和死亡率最高的地区，比西方国家高百倍。食管鳞癌是极具中国人特色的疾病，在中国，食管鳞癌的病理类型主要为鳞状细胞癌，所占比例达到97％，与西方主要的病理类型(80％为腺癌)有极大的区别。此外，在流行特征、发病危险因素等方面与西方国家人群也存在着巨大的差异。
食管鳞癌的以后较差，中晚期患者术后5年生存率仅为10％左右；而早期食管鳞癌(病灶局限于粘膜层和粘膜下层，不伴有淋巴结转移)5年生存率可高达95％，由此可见，食管鳞癌早期诊断和早期治疗是食管鳞癌预后的重要影响因素。但是由于早期患者无特异性症状，患者就诊时大多数患者已经处于中晚期，早期食管鳞癌检出率不足2％，使得中国食管鳞癌高发区人群该病死亡率无明显改善。内镜筛查时发现食管早期癌的重要方法，国家在食管鳞癌高发地区把“40岁以上、男性、吸烟、饮酒、家族史阳性的无症状人群”笼统的界定为“高危或者高风险人群”，对这些人群通过色素内镜和粘膜活检行早期筛查。然而内镜检查有创、费用高，且早期癌检出率仅为2％，超过90％的无症状人群为陪伴检查，这些因素严重阻碍的了食管鳞癌早期筛查懂得进步。同时寻找侵入性低、花费少的检查方法，提高食管鳞癌早期筛查的效率是食管鳞癌防治工作的重要趋势。
随着代谢组学技术的飞速发展，食管鳞癌大规模的关联研究大量涌现，发现了一批食管鳞癌高表达代谢产物，为无症状高危人群预警和精准筛查、食管鳞癌早期诊断奠定了坚实基础。然而目前还没有有效的食管鳞癌早期诊断和普查的制剂，若能筛选出可用于食管鳞癌筛查的代谢标志物，对我国食管鳞癌早期诊断现状必将是一次有力的推动，也为其药物筛选及精准治疗开辟新的途径。
发明内容
针对现有技术总存在的问题和不足，本发明的目的之一旨在提供一种用于食管鳞癌筛查的标志物，本发明的目的之二旨在提供用于食管鳞癌筛查的标志物的检测试剂在制备食管鳞癌筛查产品中的应用，本发明的目的之三旨在提供一种用于食管鳞癌筛查的试剂盒。
为实现发明目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明第一方面提供了一种用于食管鳞癌筛查的标志物，所述标志物为N-邻甲苯酸甘氨酸、D-山梨糖醇、N-乙酰-D-甘露糖胺中的至少一种。
根据上述的标志物，优选地，所述标志物为血清标志物。
本发明第二方面提供了一种上述第一方面所述标志物的检测试剂在制备用于食管鳞癌筛查产品中的应用。
根据上述的应用，优选地，所述产品的检测样本为血清。
根据上述的应用，优选地，所述检测试剂为通过色谱法、质谱法或色谱-质谱联用法检测样本中所述标志物的试剂。
根据上述的应用，优选地，所述色谱法为气相色谱法、液相色谱法或高效液相色谱法。
根据上述的应用，优选地，所述色谱-质谱联用法为气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱联用法、高效液相色谱-质谱联用法、气相色谱-串联质谱联用法、液相色谱-串联质谱联用法或高效液相色谱-串联质谱联用法。
本发明第三方面提供了一种用于食管鳞癌筛查的试剂盒，所述试剂盒含有检测上述第一方面所述标志物的检测试剂；所述标志物为N-邻甲苯酸甘氨酸、D-山梨糖醇、N-乙酰-D-甘露糖胺中的至少一种。
根据上述的试剂盒，优选地，所述检测试剂为通过色谱法质谱法或色谱-质谱联用法检测样本中的所述标志物的试剂。
根据上述的试剂盒，优选地，所述色谱法为气相色谱法、液相色谱法或高效液相色谱法；所述色谱-质谱联用法为气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱联用法、高效液相色谱-质谱联用法、气相色谱-串联质谱联用法、液相色谱-串联质谱联用法或高效液相色谱-串联质谱联用法。
根据上述的试剂盒，优选地，所述试剂盒还含有上述第一方面所述标志物的标准品。
根据上述的试剂盒，优选地，所述试剂盒的检测样本为血清。
与现有技术相比，本发明取得的积极有益效果如下：
(1)本发明通过代谢组学的方法首次发现N-邻甲苯酸甘氨酸、D-山梨糖醇、N-乙酰-D-甘露糖胺这三种物质能够用于食管鳞癌早期筛查检测，通过检测人血清中N-邻甲苯酸甘氨酸、D-山梨糖醇、N-乙酰-D-甘露糖胺的表达水平，可以有效检测食管鳞癌，尤其是早期食管鳞癌；经验证，本发明单独采用N-邻甲苯酸甘氨酸、D-山梨糖醇、N-乙酰-D-甘露糖胺中任意一个标志物进行食管鳞癌筛查时，ROC曲线的AUC值均在0.8以上；多个标志物联合使用时，ROC曲线的AUC值比单个指标更接近于1，区分效果好，诊断效果好。因此，本发明用于食管鳞癌筛查的标志物可用于食管鳞癌的早期筛查。
(2)本发明将N-邻甲苯酸甘氨酸、D-山梨糖醇、N-乙酰-D-甘露糖胺者三种标志物作为一个组合用于早期食管鳞癌筛查检测时，其检测灵敏度高达95.0％(即早期食管鳞癌患者中应用这三个标志物进行诊断时被正确的诊断为早期食管鳞癌的比率为95.％)，特异度达到了90.0％(即非食管鳞癌患者中应用这三个标志物进行诊断时确定为未患食管鳞癌者的比率为90.0％，因此，本发明的标志物具有较高的灵敏度和特异度，极大地提高了早期食管鳞癌的检出率，而且，对食管鳞癌的检出率远高于现有临床内镜筛查食管鳞癌的检出率(2％-3％)，可用于食管鳞癌高发区无症状高危人群人群的大规模筛查，同时也为实现食管鳞癌高发区无症状高危人群长期跟踪提供重要的检测手段，有利于无症状食管鳞癌高危人群早期发现，从而大大降低了食管鳞癌患者的死亡率，为食管鳞癌患者和家庭带来极大的福祉。
(3)本发明用于食管鳞癌筛查的标志物为血清检测标志物，可避免侵入性诊断，通过微创方式取血清检测即可在早期获得食管鳞癌的患病风险，从而为临床医生进一步深入检查提供依据，为快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度、及时采取更具个性化的防治方案提供支持，延缓和阻止疾病进展。
(4)本发明用于食管鳞癌筛查的试剂盒的检测样本为血清，需血量少，群众痛苦小、接受度高；而且，操作简单，检测出结果时间短，具有广阔的市场前景和社会效益。
附图说明
图1为分别采用N-邻甲苯酸甘氨酸、D-山梨糖醇、N-乙酰-D-甘露糖胺诊断区分食管鳞癌患者组和正常对照组的ROC曲线图；其中，A为N-邻甲苯酸甘氨酸诊断区分食管鳞癌患者组和正常对照组的ROC曲线，B为D-山梨糖醇诊断区分食管鳞癌患者和正常人的ROC曲线，C为N-乙酰-D-甘露糖胺诊断区分食管鳞癌患者组和正常对照组的ROC曲线；
图2为N-邻甲苯酸甘氨酸和D-山梨糖醇组合诊断区分食管鳞癌患者组和正常对照组的ROC曲线；
图3为N-邻甲苯酸甘氨酸和N-乙酰-D-甘露糖胺组合诊断区分食管鳞癌患者组和正常对照组的ROC曲线；
图4为D-山梨糖醇和N-乙酰-D-甘露糖胺组合诊断区分食管鳞癌患者组和正常对照组的ROC曲线；
图5为N-邻甲苯酸甘氨酸、D-山梨糖醇、N-乙酰-D-甘露糖胺组合诊断区分食管鳞癌组与正常对照组的ROC曲线图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。
下列实施例所述的实验方法，如无特殊说明，均为本技术领域常规技术，或按照生产厂商所建议的条件；所用试剂、材料和仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：食管鳞癌血清差异代谢标志物的筛选
1、血清样本的采集
收集来自郑州大学第一附属医院河南省食管鳞癌重点开放实验室79例血清样本，其中正常人血清39例(正常对照组)，食管鳞癌患者血清40例(食管鳞癌组)。39例正常人血清来自该实验室合作医院体检中心的正常体检人群，无任何肿瘤相关的证据。40份食管鳞癌患者血清来源于经组织病理学证实的早期(0期+I期)食管鳞癌患者，均未接受放疗或化疗治疗。
2、实验方法
(1)血清样本预处理：
血清样本在-80℃冰箱中保存。在代谢组学分析前，室温下解冻所有样品，取50μL的血清样本，然后加入3倍量的甲醇150μL，涡旋30s进行混匀，混匀之后放入高速离心机中进行离心，13000rpm条件下离心10min。吸取离心过后的上清液各75μL分别放入到2个1.5ml离心管中，利用氮吹仪将上清液吹干，吹干后再分别利用含有内标液(L-2-氯苯丙氨酸)的甲醇100μL或含有内标液(酮洛芬)的甲醇100μL进行复溶，L-2-氯苯丙氨酸、酮洛芬的终浓度分别为100ng/mL、1μg/mL，分别作为正负离子模式检测样本。复溶后再涡旋30s进行混匀，混匀之后放入高速离心机中进行离心，13000rpm条件下离心10min，吸取离心过后的上清液，后将上清液放置于液质小瓶中进行UPLC-Q/TOF-MS检测。
(2)UPLC-Q/TOF-MS检测：
1)色谱条件：
仪器：快速高分辨液相色谱仪(UPLC，Agilent 1290，USA)；
色谱柱为Inertsil ODS-3C18柱，其尺寸为250mm×4.6mm(日本Shimadzu公司)；流动相：A相为水，B相为乙腈(分别含0.1％甲酸)；流速：1mL/min；柱温：25℃；进样体积：10μL。线性梯度洗脱条件如下：
Figure BDA0003142254400000051
2)质谱条件：
仪器：四极杆/飞行时间质谱检测器(Agilent 6530Q-TOF/MS，USA)；
ESI离子源，采用Agilent MasshunterQualitative 4.0软件进行数据在线采集，采用Agilent Masshunter Qualitative 6.0软件进行离线数据处理。详细质谱条件如下：干燥气：氮气，温度325℃，流速12L/min，雾化气压35psi；毛细管电压：+4000V；碎裂电压：100V；分离器电压：60V；质量采集范围：50-1000Da。
(3)数据处理及分析：
1)数据的前处理
基于UPLC-Q/TOF-MS得到的数据，在R软件平台下采用XCMS程序代码进行峰的提取，对齐和反卷积分析，并根据80％原则进行峰的筛选，得到包含变量(保留时间Rt，质荷比m/z)、观测和峰强的三维可视化矩阵，将此数据矩阵导入SIMCA-P软件(版本13.0)进行多变量统计分析。
2)多变量统计分析
为了考察食管鳞癌组与正常对照组相比代谢的变化，首先对所有变量采用无监督的主成分分析(PCA)，观察各组数据的聚类情况并去除离群值，最后采用正交偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)模型进行有监督的数据分析，放大组间差异，以获得最显著的组间分离。
3)基于UPLC-Q/TOF-MS检测食管鳞癌组和正常对照组之间差异性代谢产物的挖掘及鉴定：
采用食管鳞癌组和正常对照组PLS-DA模型下的VIP值与单因素统计分析的P值相结合，VIP>1.0且P<0.05的变量认为有显著差异性，有显著差异性的变量认为是差异代谢生物标志物。
筛选出的差异变量，需要归属其所代表的生物标志物。基于UPLC-Q/TOF-MS技术的代谢物鉴定主要是通过代谢物谱库进行匹配：在UPLC-Q/TOF-MS总离子流图上找到差异变量的质谱图，将差异代谢物的精确分子量与网络数据库进行比，比如HMDB(http://www.hmdb.ca)，METLIN(http://metlin.scripps.edu)和KEGG(http://www.kegg.jp)，初步鉴定上述差异代谢物的结构，最终通过购买标准品，用标准品的分子量、色谱保留时间和相应的多级MS裂解谱比对，确定差异代谢物的结构，并配制已知浓度的系列标准品溶液，通过标准曲线进一步确定差异代谢物含量。
3、实验结果
按照上述思路，最终鉴定出3个区分食管鳞癌组和正常对照组的差异代谢物，具体如表1所示。而且，与正常对照组相比，食管鳞癌组患者血清中N-邻甲苯酸甘氨酸、D-山梨糖醇、N-乙酰-D-甘露糖胺的含量显著上调。
表1基于UPLC-Q/TOF-MS检测的食管鳞癌组和正常对照组的差异代谢物统计数据结果
编号 差异代谢物 VIP P值 倍值
1 N-邻甲苯酸甘氨酸 1.97 0.02 2.50
2 D-山梨糖醇 2.04 0.01 3.08
3 N-乙酰-D-甘露糖胺 1.93 0.01 2.38
实施例2：差异代谢物诊断区分食管鳞癌患者和健康人的能力评估
1、单个差异代谢物诊断区分食管鳞癌患者和正常人的能力：
基于实施例1中UPLC-Q/TOF-MS检测的食管鳞癌组(40例食管鳞癌患者)和正常对照组(39例正常人)血清样本中N-邻甲苯酸甘氨酸、D-山梨糖醇、N-乙酰-D-甘露糖胺的含量数据进行分析，采用受试者工作曲线(ROC曲线)来评估每一种差异代谢物单独诊断区分食管鳞癌患者和正常人的能力。
N-邻甲苯酸甘氨酸、D-山梨糖醇、N-乙酰-D-甘露糖胺单独诊断区分食管鳞癌患者和正常人的ROC曲线如图1所示。根据ROC曲线统计各差异代谢物的ROC曲线的曲线下面积AUC、灵敏度和特异度，结果如表2所示。
表2三种差异代谢物单独诊断区分食管鳞癌患者和正常人的AUC
编号 差异代谢物 AUC 灵敏度 特异度
1 N-邻甲苯酸甘氨酸 0.80 78.3％ 93.7％
2 D-山梨糖醇 0.88 86.9％ 79.8％
3 N-乙酰-D-甘露糖胺 0.84 79.0％ 90.0％
ROC曲线的曲线下面积AUC作为诊断试验真实性评价的固有准确度指标已被普遍认可，AUC为0.5时，即无诊断意义；AUC在0.5～0.7时，表示诊断准确率较低；AUC在0.7～0.9时，表示诊断准确性中等；AUC＞0.9时，表示诊断有较高的准确性。由图1和表2可知，N-邻甲苯酸甘氨酸、D-山梨糖醇、N-乙酰-D-甘露糖胺三个标志物单独用于区分食管鳞癌患者和正常人的ROC曲线的AUC均能达到0.8以上，表明N-邻甲苯酸甘氨酸、D-山梨糖醇、N-乙酰-D-甘露糖胺能够单独诊断区分食管鳞癌患者和正常人，且具有较好的准确性。
进一步根据ROC曲线的坐标计算约登指数(约登指数＝灵敏度+特异度-1)，约登指数最大时对应的代谢物相对含量为诊断区分食管鳞癌患者和正常人的最佳截断值，具体如表3所示。
表3三种差异代谢物单独诊断区分食管鳞癌患者和正常人的约登指数和截断值
编号 差异代谢物 约登指数 最佳截断值
1 N-(邻甲苯酰)甘氨酸 0.589 0.67
2 D-山梨糖醇 0.714 0.40
3 N-乙酰-D-甘露糖胺 0.693 0.73
2、多个差异代谢物组合诊断区分食管鳞癌患者和正常人的能力：
(1)N-邻甲苯酸甘氨酸和D-山梨糖醇组合诊断区分食管鳞癌患者和正常人的能力：
以实施例1中UPLC-Q/TOF-MS检测的食管鳞癌组(40例食管鳞癌患者)和正常对照组(39例正常人)血清样本中N-邻甲苯酸甘氨酸和D-山梨糖醇的相对含量作为自变量(设X1＝N-邻甲苯酸甘氨酸相对含量，X2＝D-山梨糖醇相对含量)，以组别(食管鳞癌组和正常对照组)作为应变量，对N-邻甲苯酸甘氨酸和D-山梨糖醇在食管鳞癌组和正常对照组血清样本中的相对含量进行二元逻辑回归，得到二元逻辑回归方程：logit[p]＝-5.28+0.27X1+0.26X2；再将各血清样本中N-邻甲苯酸甘氨酸和D-山梨糖醇的相对含量代入该二元逻辑回归方程，即可得到各个血清样本的回归值logit[p]，以可能的回归值logit[p]作为诊断点，计算灵敏度和特异度，然后根据计算得到的灵敏度和特异度绘制ROC曲线，ROC曲线如图2所示。
由ROC曲线可知，N-邻甲苯酸甘氨酸和D-山梨糖醇组合诊断区分食管鳞癌患者和正常人的ROC曲线下面积AUC为0.93，具有较高的准确性。进一步根据ROC曲线的坐标计算约登指数(约登指数＝灵敏度+特异度-1)，约登指数最大时对应的logit[p]值为诊断区分食管鳞癌患者和正常人的最佳截断值，最佳截断值为0.77。
(2)N-邻甲苯酸甘氨酸和N-乙酰-D-甘露糖胺组合诊断区分食管鳞癌患者和正常人的能力：
以实施例1中UPLC-Q/TOF-MS检测的食管鳞癌组(40例食管鳞癌患者)和正常对照组(39例正常人)血清样本中N-邻甲苯酸甘氨酸和N-乙酰-D-甘露糖胺的相对含量作为自变量(设X1＝N-邻甲苯酸甘氨酸相对含量，X2＝N-乙酰-D-甘露糖胺相对含量)，以组别(食管鳞癌组和正常对照组)作为应变量，对N-邻甲苯酸甘氨酸和N-乙酰-D-甘露糖胺在食管鳞癌组和正常对照组血清样本中的相对含量进行二元逻辑回归，得到二元逻辑回归方程：logit[p]＝-8.23+0.41X1+0.32X2；再将各血清样本中N-邻甲苯酸甘氨酸和N-乙酰-D-甘露糖胺的相对含量代入该二元逻辑回归方程，即可得到各个血清样本的回归值logit[p]，以可能的回归值logit[p]作为诊断点，计算灵敏度和特异度，然后根据计算得到的灵敏度和特异度绘制ROC曲线，ROC曲线如图3所示。
由ROC曲线可知，N-邻甲苯酸甘氨酸和N-乙酰-D-甘露糖胺组合诊断区分食管鳞癌患者和正常人的ROC曲线下面积AUC为0.94，具有较高的准确性。进一步根据ROC曲线的坐标计算约登指数(约登指数＝灵敏度+特异度-1)，约登指数最大时对应的logit[p]值为诊断区分食管鳞癌患者和正常人的最佳截断值，最佳截断值为0.47。
(3)D-山梨糖醇和N-乙酰-D-甘露糖胺组合诊断区分食管鳞癌患者和正常人的能力：
以实施例1中UPLC-Q/TOF-MS检测的食管鳞癌组(40例食管鳞癌患者)和正常对照组(39例正常人)血清样本中D-山梨糖醇和N-乙酰-D-甘露糖胺的相对含量作为自变量(设X1＝D-山梨糖醇相对含量，X2＝N-乙酰-D-甘露糖胺相对含量)，以组别(食管鳞癌组和正常对照组)作为应变量，对D-山梨糖醇和N-乙酰-D-甘露糖胺在食管鳞癌组和正常对照组血清样本中的相对含量进行二元逻辑回归，得到二元逻辑回归方程：logit[p]＝-7.81+0.32X1+0.61X2；再将各血清样本中D-山梨糖醇和N-乙酰-D-甘露糖胺的相对含量代入该二元逻辑回归方程，即可得到各个血清样本的回归值logit[p]，以可能的回归值logit[p]作为诊断点，计算灵敏度和特异度，然后根据计算得到的灵敏度和特异度绘制ROC曲线，ROC曲线如图4所示。
由ROC曲线可知，D-山梨糖醇和N-乙酰-D-甘露糖胺组合诊断区分食管鳞癌患者和正常人的ROC曲线下面积AUC为0.94，具有较高的准确性。进一步根据ROC曲线的坐标计算约登指数(约登指数＝灵敏度+特异度-1)，约登指数最大时对应的logit[p]值为诊断区分食管鳞癌患者和正常人的最佳截断值，最佳截断值为0.78。
(4)N-邻甲苯酸甘氨酸、D-山梨糖醇和N-乙酰-D-甘露糖胺组合诊断区分食管鳞癌患者和正常人的能力：
以实施例1中UPLC-Q/TOF-MS检测的食管鳞癌组(40例食管鳞癌患者)和正常对照组(39例正常人)血清样本中N-邻甲苯酸甘氨酸、D-山梨糖醇和N-乙酰-D-甘露糖胺的相对含量作为自变量(设X1＝N-邻甲苯酸甘氨酸相对含量，X2＝D-山梨糖醇相对含量，X3＝N-乙酰-D-甘露糖胺相对含量)，以组别(食管鳞癌组和正常对照组)作为应变量，对N-邻甲苯酸甘氨酸、D-山梨糖醇和N-乙酰-D-甘露糖胺在食管鳞癌组和正常对照组血清样本中的相对含量进行二元逻辑回归，得到二元逻辑回归方程：logit[p]＝-13.82+0.30X1+0.43X2+0.50X3；再将各血清样本中N-邻甲苯酸甘氨酸、D-山梨糖醇和N-乙酰-D-甘露糖胺的相对含量代入该二元逻辑回归方程，即可得到各个血清样本的回归值logit[p]，以可能的回归值logit[p]作为诊断点，计算灵敏度和特异度，然后根据计算得到的灵敏度和特异度绘制ROC曲线，ROC曲线和散点图如图5所示。
由ROC曲线可知，N-邻甲苯酸甘氨酸、D-山梨糖醇和N-乙酰-D-甘露糖胺组合诊断区分食管鳞癌患者和正常人的ROC曲线下面积AUC为0.96，具有较高的准确性。进一步根据ROC曲线的坐标计算约登指数(约登指数＝灵敏度+特异度-1)，约登指数最大时对应的logit[p]值为诊断区分食管鳞癌患者和正常人的最佳截断值，最佳截断值为0.72。
将上述单个、多个差异代谢物组合诊断区分食管鳞癌患者和正常人的ROC曲线AUC值、灵敏度、特异度、约登指数和最佳截断值进行统计，具体如表4所示。
表4不同差异代谢物组合用于诊断区分食管鳞癌患者和正常人的AUC值
Figure BDA0003142254400000111
由表4可知，与单一差异代谢物相比，采用N-邻甲苯酸甘氨酸、D-山梨糖醇和N-乙酰-D-甘露糖胺三个差异代谢物联合诊断区分食管鳞癌患者和正常人时，其ROC曲线下面积AUC达到了最高为0.96，明显高于单一差异代谢物诊断和其中任意两个差异代谢物的组合；而且，N-邻甲苯酸甘氨酸、D-山梨糖醇和N-乙酰-D-甘露糖胺三个差异代谢物联合用于诊断食管鳞癌时，其诊断的灵敏度达到了92.2％，特异度达到了98.0％，说明三个差异代谢物联合时对食管鳞癌的诊断效果最佳，诊断的准确度高。此外，约登指数在统计学中是指敏感度和特异度之和减去1，其数值范围是0～1，约登指数越接近于1，其诊断价值越大，表明该方法的应用价值越高。N-邻甲苯酸甘氨酸、D-山梨糖醇和N-乙酰-D-甘露糖胺三个差异代谢物联合时，其约登指数明显高于单一差异代谢物，表明N-邻甲苯酸甘氨酸、D-山梨糖醇和N-乙酰-D-甘露糖胺三个差异代谢物组合用于诊断食管鳞癌的方法具有较好的诊断价值。
实施例3：三种差异代谢物在食管鳞癌筛查中的应用
1、血清样本的采集
另外选取来自郑州大学第一附属医院河南省食管鳞癌重点开放实验室20例食管鳞癌患者血清和20例正常人血清；其中，20例食管鳞癌患者血清来源于经组织病理学证实的早期(0期+I期)食管鳞癌患者，均未接受放疗或化疗治疗，20例正常人血清来自该实验室合作医院体检中心的正常体检人群，无任何肿瘤相关的证据。
2、分析方法
按照实施例1所述的UPLC-Q/TOF-MS技术对20例食管鳞癌患者血清和20例正常人血清进行三种代谢物N-邻甲苯酸甘氨酸、D-山梨糖醇、N-乙酰-D-甘露糖胺)的定性与定量测定。
其中，单独采用N-邻甲苯酸甘氨酸、D-山梨糖醇或N-乙酰-D-甘露糖胺进行食管鳞癌诊断时，根据血清样本中N-邻甲苯酸甘氨酸、D-山梨糖醇或N-乙酰-D-甘露糖胺的含量与实施例2计算得到的对应差异代谢物的最佳截断值大小判断样本的阴性与阳性，若血清样本中差异代谢物的含量高于最佳截断值，则判断为食管鳞癌患者，反之，则判断为正常人。
采用N-邻甲苯酸甘氨酸、D-山梨糖醇、N-乙酰-D-甘露糖胺三种差异代谢物中任意两种或三种的组合进行食管鳞癌诊断时，将血清样本中N-邻甲苯酸甘氨酸、D-山梨糖醇、N-乙酰-D-甘露糖胺含量代入实施例2对应组合的Logistic回归方程中，根据计算得到的logit[p]值与实施例2计算得到的对应组合诊断区分食管鳞癌患者和正常人的最佳截断值大小，判断样本的阴性与阳性，若组合的logit[p]值高于其对应的最佳截断值，则判断为食管鳞癌，反之，则判断为正常人。
3、检测结果
40例血清样本的诊断结果如表5所示。
表5三种代谢标志物组合诊断食管鳞癌的结果
Figure BDA0003142254400000121
40例血清样本的诊断结果如表5所示。单独采用N-邻甲苯酸甘氨酸、D-山梨糖醇或N-乙酰-D-甘露糖胺进行食管鳞癌诊断时，其阳性预测值均能达到70％以上；采用其中任意两个差异代谢物组合进行食管鳞癌诊断时，其阳性预测值和阴性预测值均明显高于单个差异代谢物；而且，采用N-邻甲苯酸甘氨酸、D-山梨糖醇和N-乙酰-D-甘露糖胺三种差异代谢物联合进行食管鳞癌诊断时，其阳性预测值和阴性预测值均达到了最高，分别为90.4％、94.7％。由此说明，使用采用N-邻甲苯酸甘氨酸、D-山梨糖醇和N-乙酰-D-甘露糖胺三种差异代谢物联合进行食管鳞癌诊断的效果最佳。
实施例4：基于本发明的代谢标志物的食管鳞癌筛查试剂盒的制备
基于本发明的筛选得到的3个与食管鳞癌相关的代谢标志物，设计了食管鳞癌筛查试剂盒，该试剂盒包括如下成分：
标志物的标准品：N-邻甲苯酸甘氨酸、D-山梨糖醇、N-乙酰-D-甘露糖胺中的至少一种，该试剂盒可以包含其中一种、或者任意多种、或者3种代谢标志物的标准品，可以根据需求进行组合。当涉及一种以上代谢标志物的标准品时，可以将各个标志物的标准品单独封装，也可以将各个标志物的标准品混合制成混合物封装。
试剂盒应用过程：收集受试者血清于-80℃冰箱冻存，实验前将血清样本在4℃冰箱中解冻后，取50μL的血清样本，然后加入3倍量的甲醇150μL，涡旋30s进行混匀，混匀之后放入高速离心机中进行离心，13000rpm条件下离心10min。吸取离心过后的上清液各75μL分别放入到2个1.5ml离心管中，利用氮吹仪将上清液吹干，吹干后再利用含有内标液(L-2-氯苯丙氨酸或酮洛芬)的甲醇100μL进行复溶，复溶后再涡旋30s进行混匀，混匀之后放入高速离心机中进行离心，13000rpm条件下离心10min，吸取离心过后的上清液，后将上清液放置于液质小瓶中进行UPLC-Q/TOF-MS检测。
按照实施例1的UPLC-Q/TOF-MS仪器设定方法对处理后的血清样本进行分析，并参照实施例1数据处理方法对标志物进行定量与定性分析。
使用此食管鳞癌检测试剂盒时，建议同时检测3个标志物，以进一步提高检测效能。
综上所述，本发明有效克服了现有技术中的不足，且具高度产业利用价值。上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。

Claims (10)

1.一种用于食管鳞癌筛查的标志物，其特征在于，所述标志物为N-邻甲苯酸甘氨酸、D-山梨糖醇、N-乙酰-D-甘露糖胺中的至少一种。
2.权利要求1所述标志物的检测试剂在制备用于食管鳞癌筛查产品中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述产品的检测样本为血清。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测试剂为通过色谱法、质谱法或色谱-质谱联用法检测样本中所述标志物的试剂。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述色谱法为气相色谱法、液相色谱法或高效液相色谱法。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述色谱-质谱联用法为气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱联用法、高效液相色谱-质谱联用法、气相色谱-串联质谱联用法、液相色谱-串联质谱联用法或高效液相色谱-串联质谱联用法。
7.一种用于食管鳞癌筛查的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有检测权利要求1所述标志物的检测试剂。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述检测试剂为通过色谱法质谱法或色谱-质谱联用法检测样本中的所述标志物的试剂。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述色谱法为气相色谱法、液相色谱法或高效液相色谱法；所述色谱-质谱联用法为气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱联用法或高效液相色谱-质谱联用法。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有权利要求1所述标志物的标准品。
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