CN113777181A - 一种用于诊断早期食管癌的标志物及试剂盒 - Google Patents

一种用于诊断早期食管癌的标志物及试剂盒 Download PDF

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CN113777181A CN202110767747.XA CN202110767747A CN113777181A CN 113777181 A CN113777181 A CN 113777181A CN 202110767747 A CN202110767747 A CN 202110767747A CN 113777181 A CN113777181 A CN 113777181A
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杨苗苗
胡景峰
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徐瑞华
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Abstract

本发明属于疾病检测诊断领域，具体公开了一种用于诊断早期食管癌的标志物及试剂盒。本发明提供的用于诊断早期食管癌的标志物为己六醇、丙二酸、癸二酸中的至少一种，该标志物的检测试剂能够用于制备早期食管癌诊断产品。本发明还提供一种用于诊断早期食管癌的试剂盒，该试剂盒含有检测上述第一方面所述标志物的检测试剂，检测试剂为通过色谱法、质谱法或色谱‑质谱联用法检测样本中的所述标志物的试剂。本发明通过检测人血清中己六醇、丙二酸、癸二酸的表达水平，可以有效检测食管癌，其检测灵敏度高达84%，特异性达到了76%，可用于食管癌高发区无症状人群的大规模筛查，有利于无症状高危人群筛查和早期发现。

Description

一种用于诊断早期食管癌的标志物及试剂盒
技术领域
本发明涉及疾病检测诊断领域，具体涉及一种用于诊断早期食管癌的标志物及试剂盒。
背景技术
食管癌是全球范围内最常见的消化系统恶性肿瘤之一，死亡率位居第六位。在我国食管 癌不仅发病率高，还存在显著的地域差异。中晚期食管癌患者5年生存率仅10％左右，而早 期食管癌则可达90％以上。由于食管癌患者在早期阶段缺乏明显的特异症状，并且缺乏适宜 大范围高危人群筛查的经济、高效和敏感的生物标志物，导致目前临床上就诊的食管癌患者 在确诊时多已为中晚期阶段。
由于食管癌起病非常隐匿，早期发现和诊断极为困难,导致治疗预后不理想，5年生存率 偏低。目前，色素内镜和粘膜活检病理检查是食管癌早期发现的重要筛查方法。但是，因内 镜筛查有创伤，且成本高，效率低，限制了内镜筛查在无症状人群食管癌早发现中的推广。 食管癌早期发现，有助于干预和阻断食管癌的多阶段衍变过程，从而能够有效地降低食管癌 的发病率和死亡率，是提高食管癌患者生存率的有效手段，对食管癌的一级预防具有重要意 义。因此筛选高效、特异的食管癌分子标志物对于食管癌患者的早期发现、早期筛查尤为重 要，也是亟待解决的问题。
已有研究表明，食管癌的发生发展与多种小分子代谢物紊乱密切相关，例如氨基酸代谢， 脂质代谢，胆汁酸代谢等。代谢组学是一种高通量的方法，既可以综合地评估代谢产物，又 能够定性和定量代谢产物以及分析相关代谢途径。相比于其他组学，整体性、宏观性和高通 量的特点使代谢组学在生物标志物筛选和应用方面有着无可比拟的优势，比如代谢组的结构 比蛋白质组和基因组都简单得多，而且基因和蛋白质表达的微小变化在代谢物水平上可以放 大，更容易被检测到等。因此，通过代谢组学检测来比较疾病组和对照组中代谢物的差异， 从而初步确定与疾病相关的潜在标志物，辅助于临床疾病的早期诊断。
己六醇、丙二酸、癸二酸都是人体重要的代谢物，参与人体多种病理生理过程。研究发 现，己六醇、丙二酸、癸二酸是食管癌患者血液中的代谢物，这些代谢物与癌症的发病情况 有着密切的关系，本发明利用代谢组学技术，将己六醇、丙二酸、癸二酸作为检测指标用于 于诊断食管癌，用于食管癌的早期筛查，以期提高食管癌的早期检出率，为食管癌的早期诊 断提供实验基础。
发明内容
针对现有技术总存在的问题和不足，本发明的目的之一旨在提供一种用于诊断早期食管 癌的标志物，本发明的目的之二旨在提供用于诊断早期食管癌的标志物的检测试剂在制备早 期食管癌诊断产品中的应用，本发明的目的之三旨在提供一种用于诊断早期食管癌的试剂盒。
基于上述目的，本发明采用如下技术方案：
第一方面，本发明提供一种用于诊断早期食管癌的标志物，所述标志物为己六醇、丙二 酸、癸二酸中的至少一种。
根据上述的标志物，优选地，所述标志物为血清标志物。
第二方面，本发明提供了一种上述第一方面所述标志物的检测试剂在制备用于早期食管 癌诊断产品中的应用。
根据上述的应用，优选地，所述产品的检测样本为血清。
根据上述的应用，优选地，所述检测试剂为通过色谱法、质谱法或色谱-质谱联用法检测 样本中所述标志物的试剂。
根据上述的应用，优选地，所述色谱法为气相色谱法、液相色谱法或高效液相色谱法。
根据上述的应用，优选地，所述色谱-质谱联用法为气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质 谱联用法、高效液相色谱-质谱联用法、气相色谱-串联质谱联用法、液相色谱-串联质谱联用 法或高效液相色谱-串联质谱联用法。
第三方面，本发明提供了一种用于诊断早期食管癌的试剂盒，所述试剂盒含有检测第一 方面所述标志物的检测试剂，所述标志物为己六醇、丙二酸、癸二酸中的至少一种。
根据上述的试剂盒，优选地，所述检测试剂为通过色谱法质谱法或色谱-质谱联用法检测 样本中的所述标志物的试剂。
根据上述的试剂盒，优选地，所述色谱法为气相色谱法、液相色谱法或高效液相色谱法； 所述色谱-质谱联用法为气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱联用法或高效液相色谱-质谱联 用法。
根据上述的试剂盒，优选地，所述试剂盒还含有上述第一方面所述标志物的标准品与内 标。
根据上述的试剂盒，优选地，所述试剂盒的检测样本为血清。
根据上述的试剂盒，优选地，所述内标为L-2氯苯丙氨酸或酮洛芬。
与现有技术相比，本发明取得的积极有益效果如下：
(1)本发明通过代谢组学的方法首次发现己六醇、丙二酸、癸二酸这三种物质能够用于 食管癌诊断检测，通过检测人血清中己六醇、丙二酸、癸二酸的表达水平，可以有效检测食 管癌，尤其是早期食管癌；经验证，本发明单独采用己六醇、丙二酸、癸二酸中任意一个标 志物进行食管癌筛查时，ROC曲线的AUC值均在0.7以上；多个标志物联合使用时，ROC曲线的AUC值比单个指标更接近于1，区分效果好，诊断效果好。因此，本发明用于食管癌 筛查的标志物可用于食管癌的早期筛查。
(2)本发明将己六醇、丙二酸、癸二酸这三种标志物作为一个组合用于早期食管癌诊断 检测时，其检测灵敏度高达84％(即早期食管癌患者中应用这三个标志物进行诊断时被正确 的诊断为早期食管癌的比率为84％)，特异度达到了76％(即非食管癌患者中应用这三个标 志物进行诊断时确定为未患食管癌者的比率为76％)，因此，本发明的标志物具有较高的灵敏 度和特异度，极大地提高了早期食管癌的检出率，而且，对食管癌的检出率远高于现有临床 内镜筛查食管癌的检出率(2％-3％)，可用于食管癌高发区无症状高危人群人群的大规模筛查， 同时也为实现食管癌高发区无症状高危人群长期跟踪提供重要的检测手段，有利于无症状食 管癌高危人群早期发现，从而大大降低了食管癌患者的死亡率，为食管癌患者和家庭带来极 大的福祉。
(3)本发明用于了食管癌诊断的标志物为血清检测标志物，可避免侵入性诊断，通过微 创方式取血清检测即可在早期获得了食管癌的患病风险，从而为临床医生进一步深入检查提 供依据，为快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度、及时采取更具个性化的防治方案 提供支持，延缓和阻止疾病进展。
(4)本发明用于了食管癌诊断的试剂盒的检测样本为血清，需血量少，群众痛苦小、接 受度高；而且，操作简单，检测出结果时间短，具有广阔的市场前景和社会效益。
附图说明
图1为己六醇、丙二酸、癸二酸在正常对照组(NC)、食管癌组(EC)血清样本中的含量图；其中a为己六醇、b为丙二酸、c为癸二酸；
图2为采用己六醇诊断区分食管癌患者组和正常对照组的ROC曲线图；
图3为采用丙二酸诊断区分食管癌患者组和正常对照组的ROC曲线图；
图4为采用癸二酸诊断区分食管癌患者组和正常对照组的ROC曲线图；
图5为采用己六醇和丙二酸组合诊断区分食管癌患者组和正常对照组的ROC曲线图；
图6为采用己六醇和癸二酸组合诊断区分食管癌患者组和正常对照组的ROC曲线图；
图7为采用丙二酸和癸二酸组合诊断区分食管癌患者组和正常对照组的ROC曲线图；
图8为采用己六醇、丙二酸和癸二酸组合诊断区分食管癌患者组和正常对照组的ROC曲 线图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例和附图对本发明 作进一步说明。本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制 本发明的范围。
实施例1：食管癌血清差异代谢标志物的筛选
1、实验样本
按严格的筛选和排除标准收集郑州大学第一附属医院经过年龄与性别匹配的100例健康 受试者(正常对照组)和100例食管癌患者(食管癌组)。
健康受试者的入组标准为：(1)年龄在40岁至79岁间，在医院进行体检的正常人或陪同 患者就诊的家属；(2)食管上皮无异常增生。
健康受试者的排除标准：(1)近一年内曾服用青霉素、四环素、磺胺类药物、喹诺酮类等 抗生素；(2)患有其他肿瘤、心脑血管疾病、精神分裂、老年痴呆、消化性溃疡、消化道息肉 以及其他重要脏器功能不全者；(3)孕妇和哺乳期妇女。
食管癌患者的入组标准为：(1)年龄在40岁至79岁间；(2)内镜检查诊断后经病理活检确 诊为食管癌的新发病例。
食管癌患者的排除标准：(1)近一年内曾服用青霉素、四环素、磺胺类药物、喹诺酮类等 抗生素；(2)患有其他肿瘤、心脑血管疾病、精神分裂、老年痴呆、消化性溃疡、消化道息肉 以及其他重要脏器功能不全者；(3)孕妇和哺乳期妇女。
2、实验方法
(1)血清样本的采集及储存：
采集前，纳入研究的所有志愿者签署知情同意书。
100例食管癌患者组和100例正常对照组均是均为晨起空腹12小时静脉血液样本，采样 时不做激烈运动，保持平稳的状态。采样后将血液样本收集于5ml非抗凝真空采血管中，移 至4℃冰箱内静置至血细胞凝集，然后在相对离心力为2000g下离心10min，将上清液转移至 冻存管中，在-80℃条件下冻存储存备用。
(2)主要试剂：
甲醇及乙腈(UPLC纯)购于美国merk公司，色谱级甲酸及乙酸铵购于美国ROE公司；去 离子水由美国密理博(Millipore)公司的MIlli-Q超纯水系统制备；标准品己六醇、丙二酸和癸 二酸均购于美国Sigma-Aldrich公司。内标L-2氯苯丙氨酸购于上海麦克林生化科技有限公司， 酮洛芬购自中国食品药品检定研究院。
(3)UPLC-Q/TOF-MS检测：
A)检测仪器：
Acquity TM UPLC液相色谱仪(美国Waters公司)，Triple TOF 5600质谱仪(美国ABSCIEX 公司)
B)色谱条件：
色谱仪为Acquity TM UPLC液相色谱仪(美国Waters公司)；色谱柱为SeQuant ZIC-HILIC (150mm X 2.1mm，3μm)(德国Merk公司)；流动相A为包含10mM乙酸铵和0.02％(v/v)乙酸 的95％(v/v)乙腈水溶液；流动相B为包含10mM乙酸铵和0.02％(v/v)乙酸的水溶液；洗脱 梯度：0～8min为100％A相，8～20min线性变化到75％A相，20～25min线性变化到43％A 相，25～25.1min变化到初始100％A相，并保持10min；流动相流速为0.3mL/min；柱温维持在40℃；进样量为5μL。
C)质谱条件:
质谱仪为Triple TOF 5600质谱仪(美国AB SCIEX公司)；采用电喷雾电离正、负离子模 式分别检测；质谱扫描范围m/z：50～1000，质量偏差为50mDa。正离子模式下离子源雾化 气和辅助气都为344.75Pa，气帘气为241.33Pa，温度为500℃，喷雾电压为5500V，去簇电压为80V，碰撞能为30eV；负离子模式下离子源雾化气和辅助气都为379.23Pa，气帘气为241.33Pa，温度为600℃，喷雾电压为-4500V，去簇电压为-100V，碰撞能为-30eV。
D)样本处理：
取50μL的血清样本，然后加入3倍量的甲醇150μL，涡旋30s进行混匀，混匀之后放入 高速离心机中进行离心，13000rpm条件下离心10min。吸取离心过后的上清液各75μL分别 放入到2个1.5mL离心管中，利用氮吹仪将上清液吹干，吹干后再分别利用含有内标液(L-2- 氯苯丙氨酸)的甲醇复溶液100μL或含有内标液(酮洛芬)的甲醇复溶液100μL进行复溶，L-2- 氯苯丙氨酸、酮洛芬的终浓度分别为100ng/mL、1μg/mL，分别作为正负离子模式检测样本。 复溶后再涡旋30s进行混匀，混匀之后放入高速离心机中进行离心，13000rpm条件下离心 10min，吸取离心过后的上清液，后将上清液放置于液质小瓶中进行UPLC-Q/TOF-MS检测。
(4)数据处理方法
a)数据的前处理
基于UPLC-Q/TOF-MS得到的数据，在R软件平台下采用XCMS程序代码进行峰的提取， 对齐和反卷积分析，并根据80％原则进行峰的筛选，得到包含变量(保留时间Rt，质荷比m/z)、 观测和峰强的三维可视化矩阵，将此数据矩阵导入SIMCA-P软件(版本13.0)进行多变量统计 分析。
b)多变量统计分析
为了考察食管癌组与正常对照组相比代谢的变化，首先对所有变量采用无监督的主成分 分析(PCA)，观察各组数据的聚类情况并去除离群值，最后采用正交偏最小二乘法判别分析 (PLS-DA)模型进行有监督的数据分析，放大组间差异，以获得最显著的组间分离。
c)基于UPLC-Q/TOF-MS检测食管癌组和正常对照组之间差异性代谢产物的挖掘及鉴 定：
采用食管癌组和正常对照组PLS-DA模型下的VIP值与单因素统计分析的P值相结合， VIP>1.0且P<0.05的变量认为有显著差异性，有显著差异性的变量认为是差异代谢生物标志 物。
筛选出的差异变量，需要归属其所代表的生物标志物。基于UPLC-Q/TOF-MS技术的代 谢物鉴定主要是通过代谢物谱库进行匹配：在UPLC-Q/TOF-MS总离子流图上找到差异变量 的质谱图，将差异代谢物的精确分子量与网络数据库进行比，比如HMDB
(http://www.hmdb.ca)，METLIN(http://metlin.scripps.edu)和KEGG(http://www.kegg.jp)， 初步鉴定上述差异代谢物的结构，最终通过购买标准品，用标准品的分子量、色谱保留时间 和相应的多级MS裂解谱比对，确定差异代谢物的结构，并配制已知浓度的系列标准品溶液， 通过标准曲线进一步确定差异代谢物含量。
3、实验结果
按照上述实验方法，结合PLS-DA中的VIP值与t检验结果筛选出组间差异代谢物，通 过人类代谢组数据库(HMDB)检索鉴定，最终得到3种在食管癌组和正常对照组间中存差异 的代谢物，具体见如表1所示。
基于UPLC-Q/TOF-MS分析获得的正常对照组和早期食管癌组中的己六醇，丙二酸、癸 二酸三种差异代谢物的含量结果图如图1所示。由图1可知，与正常对照组相比，在早期食 管癌病人中己六醇、丙二酸、癸二酸的含量显著性上调。
表1基于UPLC-Q/TOF-MS分析检测食管癌组和正常对照组差异代谢物统计数据结果
差异代谢物 食管癌组相对含量 正常对照组相对含量 P值 VIP值 比值
己六醇 0.426-0.921 0.245-0.723 0.001 1.923 ＞1
丙二酸 1.003-1.521 0.724-1.345 0.004 2.514 ＞1
癸二酸 0.772-1.562 0.642-1.247 0.015 2.272 ＞1
注：比值表示该化合物在食管癌实验组的浓度相对水平，>1表示升高，<1表示降低。
实施例2：差异代谢物诊断区分食管癌患者和健康人的能力评估
1、单个差异代谢物诊断区分食管癌患者和正常人的能力：
基于实施例1中UPLC-Q/TOF-MS检测的食管癌组(100例食管癌患者)和正常对照组(100例健康受试者)血清样本中己六醇、丙二酸、癸二酸的含量数据进行分析，采用受试 者工作曲线(ROC曲线)来评估每一种差异代谢物单独诊断区分食管癌患者和正常人的能力。己六醇、丙二酸、癸二酸单独诊断区分食管癌患者和正常人的ROC曲线如图2、图3，图4 所示。根据ROC曲线统计各差异代谢物的ROC曲线的曲线下面积AUC、灵敏度和特异度， 结果如表2所示。
表2三种差异代谢物单独诊断区分食管癌患者和正常人的AUC
差异代谢物 AUC 灵敏度 特异度
己六醇 0.761 76％ 62％
丙二酸 0.775 82％ 60％
癸二酸 0.766 62％ 82％
ROC曲线的曲线下面积AUC作为诊断试验真实性评价的固有准确度指标已被普遍认可， AUC为0.5时，即无诊断意义；AUC在0.5～0.7时，表示诊断准确率较低；AUC在0.7～0.9 时，表示诊断准确性中等；AUC＞0.9时，表示诊断有较高的准确性。由表2和图2、图3，图4可知，己六醇、丙二酸、癸二酸三种标志物单独用于区分食管癌患者和正常人的ROC曲线的AUC均能达到0.7以上，表明己六醇、丙二酸、或癸二酸能够单独诊断区分食管癌患者和正常人，且具有较好的准确性。
进一步地根据ROC曲线的坐标计算约登指数(约登指数＝灵敏度+特异度-1)，约登指数 最大时对应的代谢物相对含量为诊断区分食管癌患者和正常人的最佳截断值，具体如表3所 示。
表3三种差异代谢物单独诊断区分食管癌患者和正常人的约登指数和最佳截断值
差异代谢物 约登指数 最佳截断值
己六醇 0.38 0.534
丙二酸 0.42 1.104
癸二酸 0.44 0.937
2、多个差异代谢物组合诊断区分食管癌患者和正常人的能力：
(1)己六醇和丙二酸组合诊断区分食管癌患者和正常人的能力：
以实施例1中UPLC-Q/TOF-MS检测的食管癌组(100例食管癌患者)和正常对照组(100 例健康受试者)血清样本中己六醇和丙二酸的相对含量作为自变量(设X1＝己六醇相对含量， X2＝丙二酸相对含量)，以组别(食管癌组和正常对照组)作为应变量，对己六醇和丙二酸 在食管癌组和正常对照组血清样本中的相对含量进行二元逻辑回归，得到二元逻辑回归方程：logit[p]＝0.348X1+0.416X2-4.83；再将各血清样本中己六醇和丙二酸的相对含量代入该二元逻 辑回归方程，即可得到各个血清样本的回归值logit[p]，以可能的回归值logit[p]作为诊断点， 计算灵敏度和特异度，然后根据计算得到的灵敏度和特异度绘制ROC曲线，ROC曲线如图5 所示。由ROC曲线可知，己六醇和丙二酸组合诊断区分食管癌患者和正常人的ROC曲线下 面积AUC为0.784，具有较高的准确性。进一步根据ROC曲线的坐标计算约登指数(约登 指数＝灵敏度+特异度-1)，约登指数最大时对应的logit[p]值为诊断区分食管癌患者和正常人 的最佳截断值，最佳截断值为0.093。
(2)己六醇和癸二酸组合诊断区分食管癌患者和正常人的能力：
以实施例1中UPLC-Q/TOF-MS检测的食管癌组(100例食管癌患者)和正常对照组(100 例健康受试者)血清样本中己六醇和癸二酸的相对含量作为自变量(设X1＝己六醇相对含量， X2＝癸二酸相对含量)，以组别(食管癌组和正常对照组)作为应变量，对己六醇和癸二酸 在食管癌组和正常对照组血清样本中的相对含量进行二元逻辑回归，得到二元逻辑回归方程： logit[p]＝0.673X1+0.315X2-2.751；再将各血清样本中己六醇和癸二酸的相对含量代入该二元逻 辑回归方程，即可得到各个血清样本的回归值logit[p]，以可能的回归值logit[p]作为诊断点， 计算灵敏度和特异度，然后根据计算得到的灵敏度和特异度绘制ROC曲线，ROC曲线如图6 所示。由ROC曲线可知，己六醇和癸二酸组合诊断区分食管癌患者和正常人的ROC曲线下 面积AUC为0.812，具有较高的准确性。进一步根据ROC曲线的坐标计算约登指数(约登 指数＝灵敏度+特异度-1)，约登指数最大时对应的logit[p]值为诊断区分食管癌患者和正常人 的最佳截断值，最佳截断值为0.107。
(3)丙二酸和癸二酸组合诊断区分食管癌患者和正常人的能力：
以实施例1中UPLC-Q/TOF-MS检测的食管癌组(100例食管癌患者)和正常对照组(100 例健康受试者)血清样本中丙二酸和癸二酸的相对含量作为自变量(设X1＝丙二酸相对含量， X2＝癸二酸相对含量)，以组别(食管癌组和正常对照组)作为应变量，对丙二酸和癸二酸 在食管癌组和正常对照组血清样本中的相对含量进行二元逻辑回归，得到二元逻辑回归方程： logit[p]＝0.418X1+0.339X2-1.478；再将各血清样本中丙二酸和癸二酸的相对含量代入该二元逻 辑回归方程，即可得到各个血清样本的回归值logit[p]，以可能的回归值logit[p]作为诊断点， 计算灵敏度和特异度，然后根据计算得到的灵敏度和特异度绘制ROC曲线，ROC曲线如图7 所示。由ROC曲线可知，丙二酸和癸二酸组合诊断区分食管癌患者和正常人的ROC曲线下 面积AUC为0.833，具有较高的准确性。进一步根据ROC曲线的坐标计算约登指数(约登 指数＝灵敏度+特异度-1)，约登指数最大时对应的logit[p]值为诊断区分食管癌患者和正常人 的最佳截断值，最佳截断值为0.032。
(4)己六醇、丙二酸和癸二酸组合诊断区分食管癌患者和正常人的能力：
以实施例1中UPLC-Q/TOF-MS检测的食管癌组(100例食管癌患者)和正常对照组(100 例健康受试者)血清样本中己六醇、丙二酸和癸二酸的相对含量作为自变量(设X1＝己六醇 相对含量，X2＝丙二酸相对含量，X3＝癸二酸)，以组别(食管癌组和正常对照组)作为应 变量，对己六醇、丙二酸和癸二酸在食管癌组和正常对照组血清样本中的相对含量进行二元 逻辑回归，得到二元逻辑回归方程：logit[p]＝0.218X1+0.508X2+0.323X3-5.118；再将各血清样 本中己六醇、丙二酸和癸二酸的相对含量代入该二元逻辑回归方程，即可得到各个血清样本 的回归值logit[p]，以可能的回归值logit[p]作为诊断点，计算灵敏度和特异度，然后根据计算 得到的灵敏度和特异度绘制ROC曲线，ROC曲线如图8所示。由ROC曲线可知，己六醇、 丙二酸和癸二酸组合诊断区分食管癌患者和正常人的ROC曲线下面积AUC为0.928，具有 较高的准确性。进一步根据ROC曲线的坐标计算约登指数(约登指数＝灵敏度+特异度-1)， 约登指数最大时对应的logit[p]值为诊断区分食管癌患者和正常人的最佳截断值，最佳截断值 为0.043。
将上述单个、多个差异代谢物组合诊断区分食管癌患者和正常人的ROC曲线AUC值、 灵敏度、特异度、约登指数和最佳截断值进行统计，具体如表4所示。
表4不同差异代谢物组合用于诊断区分食管癌患者和正常人的AUC值
差异代谢物及其组合 AUC 灵敏度 特异度％ 约登指数 最佳截断值
己六醇 0.761 76％ 62％ 0.38 0.534
丙二酸 0.775 82％ 60％ 0.42 1.104
癸二酸 0.766 62％ 82％ 0.44 0.937
己六醇+丙二酸 0.784 76％ 62％ 0.38 0.093
己六醇+癸二酸 0.812 64％ 84％ 0.48 0.107
丙二酸+癸二酸 0.833 66％ 86％ 0.52 0.032
己六醇+丙二酸+癸二酸 0.928 84％ 76％ 0.60 0.043
由表4可知，与单个标志物相比，采用己六醇、丙二酸和癸二酸中任意两种标志物联合 诊断区分食管癌患者和正常人时，其ROC曲线的AUC均能达到0.7以上，AUC明显高于单标志物诊断；当采用己六醇、丙二酸和癸二酸三种标志物联合诊断区分食管癌患者和正常人 时，其ROC曲线的AUC达到最大为0.928，且食管癌诊断的灵敏度也达到了最高，说明三个标志物联合时诊断效果最佳。此外，约登指数在统计学中是指敏感度和特异度之和减去1， 其数值范围是0～1，约登指数越接近于1，其诊断价值越大，表明该方法的应用价值越高。 随着标志物组合数目的增加，约登指数在不断增大且逐渐趋向于1，表明3种标志物组合用 于诊断食管癌的方法具有较好的诊断价值。
实施例3：三种差异代谢物在食管癌筛查中的应用
1、血清样本的采集
按严格的筛选和排除标准收集郑州大学第一附属医院经过年龄与性别匹配的200例健康 受试者(正常对照组)和200例食管癌患者(食管癌组)。
健康受试者的入组标准为：(1)年龄在40岁至79岁间，在医院进行体检的正常人或陪同 患者就诊的家属；(2)食管上皮无异常增生。
健康受试者的排除标准：(1)近一年内曾服用青霉素、四环素、磺胺类药物、喹诺酮类等 抗生素；(2)患有其他肿瘤、心脑血管疾病、精神分裂、老年痴呆、消化性溃疡、消化道息肉 以及其他重要脏器功能不全者；(3)孕妇和哺乳期妇女。
食管癌患者的入组标准为：(1)年龄在40岁至79岁间；(2)内镜检查诊断后经病理活检确 诊为食管癌的新发病例。
食管癌患者的排除标准：(1)近一年内曾服用青霉素、四环素、磺胺类药物、喹诺酮类等 抗生素；(2)患有其他肿瘤、心脑血管疾病、精神分裂、老年痴呆、消化性溃疡、消化道息肉 以及其他重要脏器功能不全者；(3)孕妇和哺乳期妇女。
2、实验方法
(1)血清样本的采集及储存：
采集前，纳入研究的所有志愿者签署知情同意书。
200例食管癌患者组和200例正常对照组均是均为晨起空腹12小时静脉血液样本，采样 时不做激烈运动，保持平稳的状态。采样后将血液样本收集于5ml非抗凝真空采血管中，移 至4℃冰箱内静置至血细胞凝集，然后在相对离心力为2000g下离心10min，将上清液转移至 冻存管中，在-80℃条件下冻存储存备用。
3、实验及分析方法
按照实施例1所述的UPLC-Q/TOF-MS实验方法对200例健康受试者(正常对照组)和200例食管癌患者(食管癌组)血清进行三种差异代谢物(己六醇、丙二酸和癸二酸)的定 性与定量测定。
其中，单独采用己六醇、丙二酸、癸二酸用于食管癌诊断时，根据血清样本中己六醇、 丙二酸、癸二酸的含量与实施例2计算得到的对应差异代谢物的最佳截断值大小判断样本的 阴性与阳性，血清样本中差异代谢物的含量高于最佳截断值，则判断为食管癌患者，反之， 则判断为正常人。
采用己六醇、丙二酸、癸二酸三种标志物中两种或三种组合用于食管癌诊断时，将血清 样本中对应标志物的含量代入实施例2所得的Logistic回归方程中，根据计算得到的Logit(P) 值与实施例2计算得到的对应组合诊断区分食管癌患者和正常人的最佳截断值大小，判断样 本的阴性与阳性，若Logit(P)值高于最佳截断值，则判断为食管癌，反之，则判断为正常人。
4、实验结果
检测结果如表5所示。
表5两种代谢标志物组合诊断食管癌的结果
Figure BDA0003152535860000111
由表5可知，单个代谢物、多个代谢物组合都可应用于食管癌的筛查，其阳性预测值能 够达到0.8以上，阴性预测值能够达到0.78以上；而且，三个标志物联合应用于食管癌诊断 时，其阳性预测值和阴性预测值均能达到0.9，预测的准确度最高。
实施例4：基于本发明的代谢标志物的食管癌筛查试剂盒的制备
基于本发明的筛选得到的3个与食管癌相关的代谢标志物，设计了食管癌筛查试剂盒， 该试剂盒包括如下成分：
标志物的标准品：己六醇、丙二酸、癸二酸中的至少一种，该试剂盒可以包含其中一种、 或者其中两种、或者3种代谢标志物的标准品，可以根据需求进行组合。当涉及一种以上代 谢标志物的标准品时，可以将各个标志物的标准品单独封装，也可以将各个标志物的校准品 混合制成混合物封装。
内标：L-2-氯苯丙氨酸或酮洛芬。
试剂盒的使用方法为：收集受试者血清于-80℃冰箱冻存，实验前将血清样本在4℃冰箱 中解冻后，取50μL的血清样本，然后加入3倍量的甲醇150μL，涡旋30s进行混匀，混匀之 后放入高速离心机中进行离心，13000rpm条件下离心10min。吸取离心过后的上清液各75μL 分别放入到2个1.5ml离心管中，利用氮吹仪将上清液吹干，吹干后再分别利用含有内标液 (L-2-氯苯丙氨酸)的甲醇复溶液100μL或含有内标液(酮洛芬)的甲醇复溶液100μL进行复溶， 复溶后再涡旋30s进行混匀，混匀之后放入高速离心机中进行离心，13000rpm条件下离心10min，吸取离心过后的上清液，后将上清液放置于液质小瓶中进行UPLC-Q/TOF-MS检测。 UPLC-Q/TOF-MS检测是按照实施例1的UPLC-Q/TOF-MS仪器设定方法对处理后的血清样 本进行分析，并参照实施例1数据处理方法对标志物进行定量与定性分析。
使用此食管癌检测试剂盒时，建议同时检测3个标志物，以进一步提高检测效能。
综上所述，本发明有效克服了现有技术中的不足，且具高度产业利用价值。上述实施例 的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技 术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方 案的实质和保护范围。

Claims (10)

1.一种用于诊断早期食管癌的标志物，其特征在于，所述标志物为己六醇、丙二酸、癸二酸中的至少一种。
2.权利要求1所述标志物的检测试剂在制备用于早期食管癌诊断产品中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述产品的检测样本为血清。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测试剂为通过色谱法、质谱法或色谱-质谱联用法检测样本中所述标志物的试剂。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述色谱法为气相色谱法、液相色谱法或高效液相色谱法。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述色谱-质谱联用法为气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱联用法、高效液相色谱-质谱联用法、气相色谱-串联质谱联用法、液相色谱-串联质谱联用法或高效液相色谱-串联质谱联用法。
7.一种用于诊断早期食管癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有检测权利要求1所述标志物的检测试剂。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述检测试剂为通过色谱法质谱法或色谱-质谱联用法检测样本中的所述标志物的试剂。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述色谱法为气相色谱法、液相色谱法或高效液相色谱法；所述色谱-质谱联用法为气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱联用法或高效液相色谱-质谱联用法。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有权利要求1所述标志物的标准品与内标。
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