CN114167059A

CN114167059A - 一种用于食管鳞癌诊断的生物标志物及检测试剂盒

Info

Publication number: CN114167059A
Application number: CN202111294764.2A
Authority: CN
Inventors: 王鹏; 孙桂英; 叶华; 陈慧丽; 史健翔; 代丽萍; 王科妍
Original assignee: Zhengzhou University
Current assignee: Zhengzhou University
Priority date: 2021-11-03
Filing date: 2021-11-03
Publication date: 2022-03-11
Anticipated expiration: 2041-11-03
Also published as: CN114167059B

Abstract

本发明属于医药生物技术领域，具体公开了一种用于食管鳞癌辅助诊断的生物标志物及检测试剂盒。本发明提供的用于食管鳞癌辅助诊断的生物标志物为抗肿瘤相关抗原ZPR1、HSF1、MAGEA4、HDAC1的自身抗体中的至少一种，该标志物在食管鳞癌患者血清中的表达水平高于正常人，差异具有统计学意义。本发明还提供一种用于食管鳞癌辅助诊断的试剂盒，该试剂盒含有用于检测上述标志物的试剂，所述试剂为通过酶联免疫吸附、蛋白芯片、免疫印迹或微流控免疫检测样本中所述生物标志物的试剂。本发明通过检测人血清中上述生物标志物的表达水平，可以有效区分食管鳞癌患者和正常人，可用于食管鳞癌诊断。

Description

一种用于食管鳞癌诊断的生物标志物及检测试剂盒

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，具体公开了一种用于食管鳞癌诊断的生物标志物及检测试剂盒。

背景技术

食管癌是全球肿瘤致死的第六大病因，而中国食管癌的发病率和病死率均居世界之首。全球癌症流行病学统计数据显示，2020年全球新增60.4万食管癌病例，有54.4万人因食管癌而死亡，食管癌死亡率居于恶性肿瘤第6位。食管癌的病理类型主要有鳞癌和腺癌，其中90％的病例是食管鳞状细胞癌(又称食管鳞癌，esophageal squamous cellcarcinoma，ESCC)。由于早期症状不具有特异性容易被忽视，因而大部分ESCC患者确诊时已经是中晚期。另外，由于目前对ESCC的治疗手段非常有限，因此，患者的预后较差，其总的5年生存率不足20％。但是，与中晚期ESCC不同的是，现有的治疗方法对早期ESCC患者治疗的5年生存率可达60％以上。目前ESCC的检查手段主要有X线钡餐检查、CT/PET-CT扫描、电子内窥镜检查及病理组织活检，但由于早诊效果有限、费用较高或侵袭性操作限制了广泛用于筛查的可能性。因此，探索ESCC早期诊断的分子标记物，具有重要的潜在临床价值。目前尚没有理想的可供临床使用的非侵袭性的ESCC诊断标志物。

越来越多的研究证实肿瘤患者血清中也存在各种类型的抗细胞自身抗原的抗体，这些与肿瘤发生有关的抗原被称为肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen,TAA)，肿瘤患者血清中存在的肿瘤相关抗原自身抗体有可能作为肿瘤发生过程中识别异常或失调细胞机制的早期信使员。同时机体通过免疫系统的级联放大效应针对这些异常表达的蛋白产生相应的抗体，这类抗体被称为肿瘤相关抗原自身抗体(autoantibody against tumor-associated antigen,TAAb)。这些自身抗体可出现于肿瘤患者的临床症状之前，可在患者的血液中存在较长时间，同时易于被检测以及检测过程对患者创伤性小，因此具有肿瘤早期免疫学诊断的潜力。

目前关于能够用于食管鳞癌诊断的自身抗体的研究相对较少，为了提高食管鳞癌早期诊断的效率，提高食管鳞癌患者的生存率，亟需筛选更多的能够用于食管鳞癌诊断的血清学自身抗体标志物。

发明内容

针对现有技术中存在的问题和不足，本发明的目的之一是提供一种用于食管鳞癌诊断的生物标志物，本发明的目的之二旨在提供一种用于检测上述生物标志物的试剂在制备用于食管鳞癌诊断的产品中的应用，本发明的目的之三在于提供一种用于食管鳞癌诊断的试剂盒。

基于上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明第一方面提供了一种用于食管鳞癌诊断的生物标志物，所述生物标志物为抗肿瘤相关抗原ZPR1自身抗体、抗肿瘤相关抗原HSF1自身抗体、抗肿瘤相关抗原MAGEA4自身抗体、抗肿瘤相关抗原HDAC1自身抗体中的至少一种。抗肿瘤相关抗原ZPR1自身抗体、抗肿瘤相关抗原HSF1自身抗体、抗肿瘤相关抗原MAGEA4自身抗体、抗肿瘤相关抗原HDAC1自身抗体在食管鳞癌患者血清中的表达水平均高于正常人，且差异具有统计学意义。

根据上述的生物标志物，优选地，抗肿瘤相关抗原ZPR1自身抗体、抗肿瘤相关抗原HSF1自身抗体、抗肿瘤相关抗原MAGEA4自身抗体、抗肿瘤相关抗原HDAC1自身抗体均为受试者血清、血浆、组织间隙液或尿液中抗肿瘤相关抗原自身抗体。

根据上述的生物标志物，优选地，抗肿瘤相关抗原ZPR1自身抗体、抗肿瘤相关抗原HSF1自身抗体、抗肿瘤相关抗原MAGEA4自身抗体、抗肿瘤相关抗原HDAC1自身抗体为受试者接受肿瘤治疗之前血清、血浆、组织间隙液或尿液中的抗肿瘤相关抗原自身抗体。更加优选地，所述肿瘤治疗为化疗、放疗或肿瘤手术切除。

根据上述的生物标志物，优选地，所述受试者为哺乳动物，更加优选地，所述受试者为灵长类哺乳动物；最优选地，所述受试者为人。

本发明第二方面提供了用于检测上述第一方面所述生物标志物的试剂在制备用于食管鳞癌诊断的产品中的应用。

根据上述的应用，优选地，所述试剂为通过酶联免疫吸附、蛋白芯片、免疫印迹或微流控免疫检测样本中所述生物标志物的试剂。

根据上述的应用，优选地，所述样本为血清、血浆、组织间隙液或尿液。

根据上述的应用，优选地，所述试剂为检测所述生物标志物的抗原。更加优选地，所述试剂为ZPR1蛋白、HSF1蛋白、MAGEA4蛋白、HDAC1蛋白中的至少一种。

根据上述的应用，优选地，所述产品为蛋白芯片、试剂盒或制剂。

本发明第三方面提供了一种用于食管鳞癌诊断的试剂盒，所述试剂盒包含用于检测上述第一方面所述生物标志物的试剂。

根据上述的试剂盒，优选地，所述试剂盒通过酶联免疫吸附、蛋白芯片、免疫印迹或微流控免疫检测样本中的所述生物标志物。更加优选地，所述试剂盒通过抗原抗体反应对样本中的所述生物标志物进行检测。

根据上述的试剂盒，优选地，所述试剂盒为ELISA检测试剂盒。更加优选地，所述ELISA检测试剂盒包括固相载体和包被在固相载体上的抗原；所述抗原为ZPR1蛋白、HSF1蛋白、MAGEA4蛋白、HDAC1蛋白中的至少一种。

根据上述的试剂盒，优选地，所述样本为血清、血浆、组织间隙液或尿液。

根据上述的试剂盒，优选地，所述ELISA检测试剂盒还包括样品稀释液、第二抗体、抗体稀释液、洗涤液、显色液和终止液。

本发明中肿瘤相关抗原ZPR1、HSF1、MAGEA4、HDAC1的基本信息为：

ZPR1是一种锌指蛋白，作为一种信号分子，将增殖生长信号从细胞质传递到细胞核。在亚核小体(包括gems和Cajal小体)中对存活运动神经元蛋白SMN1的定位和积累起作用。HSF1是热休克因子蛋白1，是一种转录因子，在温度胁迫后迅速诱导并结合热休克启动子元件，该基因的表达被磷酸化抑制，磷酸化促进热休克蛋白90的结合。MAGEA4是MAGEA基因家族的一员，MAGEA基因的启动子和第一外显子表现出相当大的变异性，表明该基因家族的存在使相同的功能能够在不同的转录控制下表达。HDAC1属于组蛋白去乙酰化酶家族，是组蛋白去乙酰化酶复合物的组成部分，是控制细胞增殖和分化的关键元素，它与转移相关蛋白-2一起，使p53脱乙酰并调节其对细胞生长和凋亡的影响。在NCBI中ZPR1蛋白的蛋白序列号为：NP_003895.1；HSF1蛋白的蛋白序列号为：NP_005517.1；MAGEA4蛋白的蛋白序列号为：NP_001011548.1；HDAC1蛋白的蛋白序列号为：NP_004955.2。

与现有技术相比，本发明取得的积极有益效果为：

(1)本发明首次发现抗肿瘤相关抗原ZPR1、HSF1、MAGEA4、HDAC1的自身抗体在食管鳞癌患者血清中的表达水平均显著高于正常人，且差异具有统计学意义，通过检测人血清中抗肿瘤相关抗原ZPR1、HSF1、MAGEA4、HDAC1的自身抗体的表达水平，可以有效检测食管鳞癌；经验证，本发明单独采用抗肿瘤相关抗原ZPR1、HSF1、MAGEA4、HDAC1的自身抗体中任意一个标志物进行食管鳞癌诊断时，其ROC曲线的AUC值均在0.60以上；多个标志物联合使用时，ROC曲线的AUC值比单个指标更接近于1，区分效果好，诊断效果好。因此，本发明用于食管鳞癌诊断的标志物可用于食管鳞癌的辅助诊断。

(2)本发明将抗肿瘤相关抗原ZPR1自身抗体、抗肿瘤相关抗原HSF1自身抗体、抗肿瘤相关抗原MAGEA4自身抗体、抗肿瘤相关抗原HDAC1自身抗体者这四种标志物作为一个组合用于食管鳞癌诊断检测时，其ROC曲线的AUC为0.740(95％CI:0.686-0.794)，检测灵敏度高达65.22％(即食管鳞癌患者中应用这四个标志物进行诊断时被正确的诊断为食管鳞癌的比率为65.22％)，特异度达到了70.19％(即健康对照中应用这四个标志物进行诊断时确定为健康者的比率为70.19％)，因此，本发明的标志物具有较高的灵敏度和特异度，极大地提高了食管鳞癌的检出率，有利于无症状食管鳞癌高危人群筛查和早期发现，从而大大降低了食管鳞癌患者的死亡率，为食管鳞癌患者和家庭带来极大的福祉。

(3)本发明的试剂盒通过间接ELISA的方法检测人血清中抗肿瘤相关抗原ZPR1自身抗体、抗肿瘤相关抗原HSF1自身抗体、抗肿瘤相关抗原MAGEA4自身抗体、抗肿瘤相关抗原HDAC1自身抗体的表达水平，可以较准确地将食管鳞癌患者和健康对照诊断区分开来，为临床医生对食管鳞癌的诊断提供了新的参考依据。

(4)本发明的试剂盒的检测样本为血清，可避免侵入性诊断，通过微创方式取血清检测即可获得食管鳞癌的患病风险，需血量少，被检测人员痛苦小、依从性高；而且，操作简单，检测出结果时间短，具有广阔的市场前景和社会效益。

附图说明

图1为蛋白芯片检测四种抗肿瘤相关抗原自身抗体在食管鳞癌组和正常对照组中的表达水平结果图，其中横坐标中1-10为混合食管鳞癌血清样本，11-17为混合正常血清样本，18-20为正常人血清样本；

图2为ELISA检测四种抗肿瘤相关抗原自身抗体在食管鳞癌组和正常对照组中的表达水平结果图；其中，N表示正常对照组，C表示食管鳞癌组；

图3为训练集中四种抗肿瘤相关抗原自身抗体诊断区分食管鳞癌患者和正常人的ROC曲线图；

图4为验证集中四种抗肿瘤相关抗原自身抗体诊断区分食管鳞癌患者和正常人的ROC曲线图；

图5为训练集中不同抗肿瘤相关抗原自身抗体组合诊断区分食管鳞癌患者和正常人的ROC曲线图；

图6为验证集中不同抗肿瘤相关抗原自身抗体组合诊断区分食管鳞癌患者和正常人的ROC曲线图。

具体实施方式

以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、部件和/或它们的组合。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，均采用本技术领域常规技术，或按照生产厂商所建议的条件；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1：采用人类蛋白质组芯片筛选用于食管鳞癌诊断的标志物

1、实验样本：

收集来自河南省肿瘤流行病学重点实验室标本库的30例食管鳞癌患者血清(食管鳞癌组)和24例正常人血清(正常对照组)；其中，30例食管鳞癌患者血清来源于经病理组学确诊且未经任何治疗的食管鳞癌患者；24例正常人血清来源于健康受试者，健康受试者的入组标准为：无心血管、呼吸、肝脏、肾脏、胃肠道、内分泌、血液、精神、或神经系统疾病以及上述疾病病史，无急性或者慢性疾病，无自身免疫性疾病，无任何肿瘤相关的证据；而且，30例食管鳞癌患者和24例健康受试者在性别之间的差异没有统计学意义。本研究获得郑州大学伦理委员会批准，所有的研究对象均已签署知情同意书。

将30例食管鳞癌患者血清中每3例血清混合为1例混合食管鳞癌血清样本，共得到10例混合食管鳞癌血清样本；将21例正常人血清中每3例混合为1例混合正常血清样本，共得到7例混合正常血清样本。

血清采集：采集研究对象在空腹状态时的外周血液5ml放于无抗凝剂的采血管中，室温静置1h后置于离心机中，设定为4℃，3000rpm离心10min。然后将采血管上层的血清吸出并分装至1.5ml的EP管中，在EP管的顶部和侧面均标记样本编号，放于-80℃冰箱进行冷冻保存，记录采血日期以及储存位置。在使用之前，取出血清放于4℃冰箱解冻并分装，避免反复冻融血清。

2、人类蛋白质组芯片检测

使用HuProt TM人类蛋白质组芯片检测10例混合食管鳞癌血清样本，7例混合正常血清样本和3例正常人血清样本中自身抗体的表达水平。每张芯片可以同时检测14个血清样本，固定在芯片上的蛋白与血清中的特异性自身抗体相互作用以结合。

(1)实验方法：

1)复温：将HuProt^TM人类蛋白质组芯片从-80℃冰箱中取出，放置4℃冰箱复温30min，随后室温继续复温15min；

2)封闭：将已复温的芯片正面朝上置于芯片孵育盒中，并加入10mL封闭液(3ml10％BSA，加入7ml 1×PBS溶液)，放置于侧摆摇床中，50-60rpm，室温封闭1h；

3)血清样本孵育：封闭完成后，弃去封闭液，迅速加入预先稀释好的血清孵育液(用稀释液将血清样本按1:200的比例进行稀释，得到稀释后的血清孵育液，稀释液的成分组成为：1ml 10％BSA加入9ml 1×PBST溶液中制备而成)，放置于侧摆摇床中，20rpm，4℃过夜孵育；

4)清洗：待孵育完成后，取出芯片放置于含有清洗液的芯片清洗盒，水平摇床，室温80rpm，清洗3次，每次10min；

5)二抗孵育：待清洗结束后，将芯片转移至孵育盒中，并加入按1：1000比例稀释的二抗孵育液(二抗为荧光标记的抗人IgM、IgG抗体，稀释液成分组成为：1gBSA，100ml 1×PBST溶液，将二抗用稀释液按1：1000比例进行稀释得到二抗孵育液)3mL，置于侧摆摇床40rpm，避光，室温孵育1h；

6)清洗：将芯片取出(注意不能触及或划破芯片的上表面)，置于芯片清洗盒，并加入芯片清洗液(1×PBST溶液)，放置水平摇床上，80rpm，清洗3次，每次10min。完成后用ddH₂O重复清洗2次，每次10min；

7)干燥：待清洗完成后，将芯片放置于芯片干燥机进行离心干燥；

8)扫描：按照扫描仪的使用说明对干燥后的芯片进行规范性荧光扫描并记录荧光信号(荧光信号的强弱与相应抗体的亲和力以及数量具有正相关关系)；

9)数据提取：打开对应的GAL文件，将GAL文件上的每个阵列与芯片图像整体对齐后，点击自动对齐按钮，提取数据并保存为GPR。

(2)数据处理：

F532 Median是指在532nm通道下的信号点前景值的中位数，B532 Median是指在532nm通道下的信号点背景值的中位数。为消除同一张芯片内不同蛋白点之间由于背景值不一致导致的信号不均一的情况，故通过背景归一化方法进行处理，即定义信噪比(signal-noise ratio，SNR)＝F532 Median/B532 Median，按照SNR的计算公式进行计算，分别得到10例混合食管鳞癌血清样本、7例混合正常血清样本和3例正常血清样本的SNR值，然后对血清样本的SNR值进行中位值线性归一化处理。对于任意一个自身抗体，计算食管鳞癌癌症组与正常对照组的差异倍数(差异倍数＝食管鳞癌组中位值线性归一化后的SNR均值/正常对照组中位值线性归一化后的SNR均值)，用以表示食管鳞癌组高于正常对照组的程度，进一步设置筛选条件：差异倍数>2、灵敏度≥60％、特异度＝100％，从中筛选出符合条件的抗肿瘤相关抗原自身抗体。

(3)实验结果：

经过筛选，最终筛选出了4种抗肿瘤相关抗原自身抗体，分别为抗肿瘤相关抗原ZPR1自身抗体、抗肿瘤相关抗原HSF1自身抗体、抗肿瘤相关抗原MAGEA4自身抗体和抗肿瘤相关抗原HDAC1自身抗体；其中，抗肿瘤相关抗原ZPR1自身抗体的差异倍数为2.77，灵敏度为70.00％，特异度为100.00％；抗肿瘤相关抗原HSF1自身抗体的差异倍数为2.27，灵敏度为60.00％，特异度为100.00％；抗肿瘤相关抗原MAGEA4自身抗体的差异倍数为5.52，灵敏度为70.00％，特异度为100.00％；抗肿瘤相关抗原HDAC1自身抗体的差异倍数为3.16，灵敏度为60.00％，特异度为100.00％。

筛选出的4种抗肿瘤相关抗原自身抗体的在食管鳞癌组和正常对照组的表达水平如图1所示。由图1可知，抗肿瘤相关抗原ZPR1自身抗体、抗肿瘤相关抗原HSF1自身抗体、抗肿瘤相关抗原MAGEA4自身抗体和抗肿瘤相关抗原HDAC1自身抗体在食管鳞癌组血清中的表达水平均高于正常对照组，且差异具有统计学意义。

实施例2：ELISA检测抗肿瘤相关抗原ZPR1、HSF1、MAGEA4、HDAC1自身抗体的血清表达水平

采用酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测实施例1筛选出的4种抗肿瘤相关抗原自身抗体在人体血清中的表达水平。

1、实验样本：

本研究纳入的229例食管鳞癌患者(食管鳞癌组)和229例正常对照血清(正常对照组)样本均来源于河南省肿瘤流行病学重点实验室标本库；其中，229例食管鳞癌患者血清来源于经病理组学确诊且未经任何治疗的食管鳞癌患者；229例正常人血清来源于健康受试者，健康受试者的入组标准为：无心血管、呼吸、肝脏、肾脏、胃肠道、内分泌、血液、精神、或神经系统疾病以及上述疾病病史，无急性或者慢性疾病，无任何肿瘤相关的证据；而且，229例食管鳞癌患者和229例健康受试者在性别和年龄之间的差异没有统计学意义。本研究获得郑州大学伦理委员会批准，所有的研究对象均已签署知情同意书。

2、实验材料及试剂：

(1)4种肿瘤相关抗原蛋白：ZPR1重组蛋白和MAGEA4重组蛋白，购买于武汉华美生物工程有限公司；HSF1重组蛋白和HDAC1重组蛋白，购买于武汉云克隆科技股份有限公司；

(2)96孔酶标板(8行×12列)；

(3)包被液：含0.15％碳酸钠(Na₂CO₃)和0.29％碳酸氢钠(NaHCO₃)的水溶液；

(4)封闭液：含2％(v/v)牛血清白蛋白(BSA)的0.2％(v/v)吐温20的PBST缓冲液；

(5)血清样本稀释液：含有1％(W/V)BSA的PBST缓冲液；

(6)酶标第二抗体：辣根过氧化物酶(HRP)标记小鼠抗人免疫球蛋白抗体(以下简称HRP标记小鼠抗人IgG抗体)；

(7)抗体稀释液：含有1％(W/V)BSA的PBST缓冲液；

(8)洗涤液：含0.2％(v/v)吐温20的PBST缓冲液；

(9)显色液：显色液由显色液A和显色液B组成，其中，显色液A为20％四甲基联苯胺二盐酸的水溶液，显色液B：3.7％Na₂HPO₄·12H₂O，0.92％柠檬酸，0.75％过氧化氢脲素的水溶液)；使用时将显色液A和显色液B按照1:1等体积混合均匀，现用现配；

(10)终止液：10％的硫酸。

3、实验方法：

(1)制备4种肿瘤相关抗原包被的酶标板：

分别制备肿瘤相关抗原ZPR1包被的酶标板、肿瘤相关抗原HSF1包被的酶标板、肿瘤相关抗原MAGEA4包被的酶标板和肿瘤相关抗原HDAC1包被的酶标板。

以制备肿瘤相关抗原ZPR1包被的酶标板为例，其具体操作步骤如下：

1)制备肿瘤相关抗原ZPR1蛋白溶液：将ZPR1蛋白采用包被液配制成浓度为0.25μg/mL的ZPR1蛋白溶液。

2)包被酶标板：将步骤1)制备的ZPR1蛋白溶液加入到96孔酶标板的每个反应孔中，加样量为50μL/孔，在4℃下包被过夜，然后将剩余的包被液甩出并拍干。

3)封闭：向包被后的96孔酶标板的反应孔中加入封闭液，加样量为100μL/孔，在37℃水浴中封闭2h，然后去除封闭液，用洗涤液洗涤(加样量为300μl/孔)3次并拍干，得到肿瘤相关抗原ZPR1包被的酶标板。

肿瘤相关抗原HSF1包被的酶标板、肿瘤相关抗原MAGEA4包被的酶标板和肿瘤相关抗原HDAC1包被的酶标板制备的操作步骤与肿瘤相关抗原ZPR1包被的酶标板基本相同，其不同之处在于：步骤1)采用的肿瘤相关抗原不同，制备的肿瘤相关抗原溶液的浓度不同，其中，肿瘤相关抗原HSF1溶液的浓度为0.25μg/mL、肿瘤相关抗原MAGEA4溶液的浓度为0.125μg/mL、肿瘤相关抗原HDAC1溶液的浓度为0.25μg/mL。

(2)血清样本中4种抗肿瘤相关抗原的自身抗体表达水平的检测：

同一血清样本，分别采用上述制备的4种肿瘤相关抗原包被的酶标板通过ELISA方法检测血清样本中抗肿瘤相关抗原ZPR1、HSF1、MAGEA4、HDAC1的自身抗体表达水平。

以检测抗肿瘤相关抗原ZPR1自身抗体表达水平为例，其具体操作步骤如下：

1)血清样本孵育：

将待检测的血清样本用血清样本稀释液按体积比1:100的比例进行稀释。将稀释后的血清样本加入上述步骤(1)制备的已包被ZPR1蛋白的96孔酶标板第1～11列的反应孔中，加样量为50μl/孔；在已包被ZPR1蛋白的96孔酶标板的第12列的第1-6反应孔加入按照1:100稀释的质控血清，加样量为50μl/孔，质控血清是作为质控，以进行不同酶标板之间的标化；在已包被ZPR1蛋白的96孔酶标板第12列的第7-8反应孔加入不含血清的抗体稀释液(加样量为50μl/孔)作为空白对照；然后将96孔酶标置于37℃水浴孵育1h，然后弃去反应孔中液体，用洗涤液(加样量为300μl/孔)洗涤5次并拍干。

2)二抗孵育：

将HRP标记小鼠抗人IgG抗体用抗体稀释液按1:5000(v/v)的比例进行稀释，然后将稀释后的HRP标记小鼠抗人IgG抗体加入96孔酶标板对应的反应孔中，加样量为50μl/孔，置于37℃水浴孵育1h，然后弃去反应孔中液体，用洗涤液洗涤(加样量为300μl/孔)5次并拍干。

3)显色及终止反应：

将显色液A和显色液B按照1:1等体积混合均匀，然后将混合后的显色液迅速加入96孔酶标板的反应孔中，加样量为50μl/孔，室温避光显色反应5-15min，然后向每个反应孔中再加入25μl终止液，终止显色反应；使用酶标仪分别读取其在450nm和620nm波长处的吸光度OD₄₅₀、OD₆₂₀，其中，620nm波长的吸光度OD₆₂₀为背景值，以OD₄₅₀与OD₆₂₀的差值作为检测的吸光度值最终结果。

检测血清样本中抗肿瘤相关抗原HSF1、MAGEA4、HDAC1的自身抗体表达水平的具体操作步骤与上述检测抗肿瘤相关抗原ZPR1自身抗体基本相同，其不同之处在于：步骤1)中，检测时采用的酶标板分别为肿瘤相关抗原HSF1蛋白包被的酶标板、肿瘤相关抗原MAGEA4蛋白包被的酶标板、肿瘤相关抗原HDAC1蛋白包被的酶标板；步骤2)中，对于包被肿瘤相关抗原HSF1的反应孔，加入的HRP标记小鼠抗人IgG抗体按体积比1:10000的比例进行稀释；对于包被肿瘤相关抗原MAGEA4的反应孔，加入的HRP标记小鼠抗人IgG抗体按体积比1:5000的比例进行稀释；对于包被肿瘤相关抗原HDAC1的反应孔，加入的HRP标记小鼠抗人IgG抗体按体积比1:10000的比例进行稀释。

4、数据处理

对食管鳞癌组和正常对照组血清样本的吸光度值进行Kolmogorov-Smirnova检验，结果发现，研究对象血清样本中4种抗肿瘤相关抗原自身抗体的表达水平不符合正态分布(P<0.05)，因此采用第25百分位数(P25)、中位数(P50)以及第75百分位数(P75)来描述4种抗肿瘤相关抗原的自身抗体的表达水平分布；然后采用非参数检验(Mann-Whitney U)比较食管鳞癌组和正常对照组中自身抗体的表达水平是否有差异。

5、实验结果

食管鳞癌组和正常对照组血清样本中4种抗肿瘤相关抗原自身抗体的表达水平分布如图2所示。由图2可知，抗肿瘤相关抗原ZPR1自身抗体、抗肿瘤相关抗原HSF1自身抗体、抗肿瘤相关抗原MAGEA4自身抗体和抗肿瘤相关抗原HDAC1自身抗体在食管鳞癌组血清样本中表达水平均明显高于正常对照组，而且差异具有统计学意义(P<0.05)。由此说明，4种抗肿瘤相关抗原的自身抗体可以用于食管鳞癌的辅助诊断。

实施例3：4种抗肿瘤相关抗原的自身抗体诊断食管鳞癌的能力评估

1、实验样本：

将实施例2中纳入的229例食管鳞癌患者血清和229例正常对照血清按7:3的比例随机分为训练集和验证集；训练集中食管鳞癌患者血清161例(记作食管鳞癌组)，正常对照血清161例(记作正常对照组)；验证集中食管鳞癌患者血清68例，正常对照血清68例。然后根据实施例2采用ELISA检测到的训练集、验证集中各血清样本中抗肿瘤相关抗原ZPR1、HSF1、MAGEA4、HDAC1自身抗体的表达水平结果，采用GraphPad Prism8.0绘制ROC曲线分析4种抗肿瘤相关抗原自身抗体对食管鳞癌的诊断价值。

2、单一抗肿瘤相关抗原的自身抗体诊断区分食管鳞癌患者和正常人的能力：

(1)采用训练集评估单一抗肿瘤相关抗原的自身抗体诊断区分食管鳞癌和正常对照的能力

基于训练集中161例食管鳞癌患者和161例正常对照血清样本中抗肿瘤相关抗原ZPR1自身抗体(记作抗ZPR1自身抗体)、抗肿瘤相关抗原HSF1自身抗体(记作抗HSF1自身抗体)、抗肿瘤相关抗原MAGEA4自身抗体(记作抗MAGEA4自身抗体)和抗肿瘤相关抗原HDAC1自身抗体(记作抗HDAC1自身抗体)的表达水平，绘制每一种抗肿瘤相关抗原自身抗体的ROC曲线，通过ROC曲线来评估每一种抗肿瘤相关抗原自身抗体单独诊断区分食管鳞癌患者和正常人的能力。

抗ZPR1自身抗体、抗HSF1自身抗体、抗MAGEA4自身抗体和抗HDAC1自身抗体诊断区分食管鳞癌患者和正常人的ROC曲线如图3所示。根据ROC曲线，以特异度大于90％，且约登指数(约登指数＝灵敏度+特异度-1)最大的吸光度值为截断值，同时计算相应的AUC以及95％置信区间、灵敏度和特异度。

由图3可知，4种抗肿瘤相关抗原自身抗体单独用于诊断区分食管鳞癌患者和正常人时，其ROC曲线的AUC均能达到0.6以上，特异度在90％以上；其中，抗ZPR1自身抗体具有最高的诊断价值，AUC为0.692，灵敏度和特异度分别为38.51％和90.06％。由此说明4种抗肿瘤相关抗原自身抗体均可以用于食管鳞癌的辅助诊断。

(2)采用验证集验证单一抗肿瘤相关抗原的自身抗体诊断食管鳞癌的价值

基于验证集中68例食管鳞癌患者和68例正常对照血清样本中抗ZPR1自身抗体、抗HSF1自身抗体、抗MAGEA4自身抗体和抗HDAC1自身抗体的表达水平，绘制每一种抗肿瘤相关抗原自身抗体的ROC曲线(如图4所示)，并根据ROC曲线计算相应的AUC以及95％置信区间、灵敏度和特异度，验证每一种抗肿瘤相关抗原自身抗体单独诊断食管鳞癌的价值。

由图4可知，验证集中，4种抗肿瘤相关抗原自身抗单独诊断区分食管鳞癌患者和正常人的AUC也均能达到0.6以上，与训练集中基本一致。

3、两种抗肿瘤相关抗原自身抗体组合诊断区分食管鳞癌患者和正常人的能力：

(1)采用训练集评估两种抗肿瘤相关抗原的自身抗体组合诊断食管鳞癌的能力

以训练集中161例食管鳞癌患者和161例正常对照血清样本中抗ZPR1自身抗体和抗MAGEA4自身抗体的表达量作为自变量，是否为食管鳞癌事件作为因变量，对抗ZPR1自身抗体和抗MAGEA4自身抗体在食管鳞癌组和正常对照组血清样本中的表达量进行Logistic回归分析，构建诊断区分食管鳞癌患者和正常对照的诊断模型，该诊断模型为：PRE(P＝ESCC)＝1/(1+EXP(-(-2.101+3.879×ZPR1+2.861×MAGEA4)))，该诊断模型中：PRE表示预测概率，ZPR1表示ZPR1自身抗体在受试者血清中的表达量(表达量以实施例2记载的ELISA方法检测到的吸光度值结果计量)，MAGEA4表示MAGEA4自身抗体在受试者血清中的表达量(表达量以实施例2记载的ELISA方法检测到的吸光度值结果计量)。再将各血清样本中抗ZPR1自身抗体和抗MAGEA4自身抗体的表达量代入该诊断模型，即可得到各个血清样本的预测概率(即PRE值)，以预测概率PRE＝0.5为诊断区分食管鳞癌患者和正常人的最佳截断值(若PRE值大于等于截断值，则判定受试者为食管鳞癌患者，若PRE值小于截断值，则判定受试者为正常人)，并计算对应的灵敏度和特异度。根据预测概率绘制ROC曲线，ROC曲线如图5中A所示。由图5中A可知，抗ZPR1自身抗体和抗MAGEA4自身抗体组合诊断区分食管鳞癌患者和正常人的ROC曲线下面积AUC为0.705，对应的灵敏度为53.39％，特异度为72.67％。

(2)采用验证集验证两种抗肿瘤相关抗原的自身抗体组合诊断食管鳞癌的价值

将验证集中68例食管鳞癌患者和68例正常对照血清样本中抗ZPR1自身抗体和抗MAGEA4自身抗体的表达水平代入上述步骤(1)构建的诊断模型PRE(P＝ESCC)＝1/(1+EXP(-(-2.101+3.879×ZPR1+2.861×MAGEA4)))中，即可得到各个血清样本的预测概率；以预测概率PRE＝0.5为诊断区分食管鳞癌患者和正常人的最佳截断值，并计算对应的灵敏度和特异度。根据预测概率绘制ROC曲线(如图6中A所示)，验证两种自身抗体组合诊断食管鳞癌的价值。由图6中A可知，验证集中，抗ZPR1自身抗体和抗MAGEA4自身抗体组合诊断区分食管鳞癌患者和正常人的ROC曲线下面积AUC为0.705，与训练集一致。

4、三种抗肿瘤相关抗原的自身抗体组合诊断区分食管鳞癌患者和正常人的能力：

(1)采用训练集评估三种抗肿瘤相关抗原的自身抗体组合诊断食管鳞癌的能力

以训练集中161例食管鳞癌患者和161例正常对照血清样本中抗ZPR1自身抗体、抗MAGEA4自身抗体、抗HSF1自身抗体的表达量作为自变量，是否为食管鳞癌事件作为因变量，对抗ZPR1自身抗体、抗MAGEA4自身抗体、抗HSF1自身抗体在食管鳞癌组和正常对照组血清样本中的表达量进行Logistic回归分析，构建诊断区分食管鳞癌患者和正常对照的诊断模型；诊断模型为：PRE(P＝ESCC)＝1/(1+EXP(-(-2.708+3.186×ZPR1+2.776×MAGEA4+HSF1×2.578)))；该诊断模型中：ZPR1表示ZPR1自身抗体在受试者血清中的表达量(表达量以实施例2记载的ELISA方法检测到的吸光度值结果计量)，MAGEA4表示MAGEA4自身抗体在受试者血清中的表达量(表达量以实施例2记载的ELISA方法检测到的吸光度值结果计量)；HSF1表示HSF1自身抗体在受试者血清中的表达量(表达量以实施例2记载的ELISA方法检测到的吸光度值结果计量)。再将各血清样本中抗ZPR1自身抗体、抗MAGEA4自身抗体、抗HSF1自身抗体的表达量代入该诊断模型，即可得到各个血清样本的预测概率，以预测概率PRE＝0.5为诊断区分食管鳞癌患者和正常人的最佳截断值(若PRE值大于等于截断值，则判定受试者为食管鳞癌患者，若PRE值小于截断值，则判定受试者为正常人)，并计算对应的灵敏度和特异度。根据预测概率绘制ROC曲线，ROC曲线如图5中B所示。

由图5中B可知，抗ZPR1自身抗体、抗MAGEA4自身抗体和抗HSF1自身抗体组合诊断区分食管鳞癌患者和正常人的ROC曲线下面积AUC为0.732，对应的灵敏度为62.73％，特异度为70.81％。

(2)采用验证集验证三种抗肿瘤相关抗原的自身抗体组合诊断食管鳞癌的价值

将验证集中68例食管鳞癌患者和68例正常对照血清样本中抗ZPR1自身抗体、抗MAGEA4自身抗体和抗HSF1自身抗体的表达水平代入上述步骤(1)构建的诊断模型PRE(P＝ESCC)＝1/(1+EXP(-(-2.708+3.186×ZPR1+2.776×MAGEA4+HSF1×2.578)))中，即可得到各个血清样本的预测概率；以预测概率PRE＝0.5为诊断区分食管鳞癌患者和正常人的最佳截断值，并计算对应的灵敏度和特异度。根据预测概率绘制ROC曲线(如图6中B所示)，验证三种自身抗体组合诊断食管鳞癌的价值。由图6中B可知，验证集中，抗ZPR1自身抗体、抗MAGEA4自身抗体和抗HSF1自身抗体组合诊断区分食管鳞癌患者和正常人的ROC曲线下面积AUC为0.723，与训练集基本一致。

5、四种抗肿瘤相关抗原的自身抗体组合诊断区分食管鳞癌患者和正常人的能力：

(1)采用训练集评估四种抗肿瘤相关抗原的自身抗体组合诊断食管鳞癌的能力

以训练集中161例食管鳞癌患者和161例正常对照血清样本中抗ZPR1自身抗体、抗MAGEA4自身抗体、抗HSF1自身抗体和抗HDAC1自身抗体的表达量作为自变量，是否为食管鳞癌事件作为因变量，对抗ZPR1自身抗体、抗MAGEA4自身抗体、抗HSF1自身抗体和抗HDAC1自身抗体在食管鳞癌组和正常对照组血清样本中的表达量进行Logistic回归分析，构建诊断区分食管鳞癌患者和正常对照的诊断模型，该诊断模型为：PRE(P＝ESCC)＝1/(1+EXP(-(-3.094+3.262×ZPR1+3.041×MAGEA4+HSF1×1.735+HDAC1×1.750)))；该诊断模型中：ZPR1表示ZPR1自身抗体在受试者血清中的表达量(表达量以实施例2记载的ELISA方法检测到的吸光度值结果计量)，MAGEA4表示MAGEA4自身抗体在受试者血清中的表达量(表达量以实施例2记载的ELISA方法检测到的吸光度值结果计量)；HSF1表示HSF1自身抗体在受试者血清中的表达量(表达量以实施例2记载的ELISA方法检测到的吸光度值结果计量)；HDAC1表示HDAC1自身抗体在受试者血清中的表达量(表达量以实施例2记载的ELISA方法检测到的吸光度值结果计量)。再将各血清样本中抗ZPR1自身抗体、抗MAGEA4自身抗体、抗HSF1自身抗体、和抗HDAC1自身抗体的表达量代入诊断模型，即可得到各个血清样本的预测概率，以预测概率PRE＝0.5为诊断区分食管鳞癌患者和正常人的最佳截断值(若PRE值大于等于截断值，则判定受试者为食管鳞癌患者，若PRE值小于截断值，则判定受试者为正常人)，并计算对应的灵敏度和特异度。根据预测概率绘制ROC曲线，ROC曲线如图5中C所示。

由图5中C可知，抗ZPR1自身抗体、抗MAGEA4自身抗体、抗HSF1自身抗体和抗HDAC1自身抗体组合诊断区分食管鳞癌患者和正常人的ROC曲线下面积AUC为0.740，对应的灵敏度为65.22％，特异度为70.19％。

(2)采用验证集验证四种抗肿瘤相关抗原的自身抗体组合诊断食管鳞癌的价值

将验证集中68例食管鳞癌患者和68例正常对照血清样本中抗ZPR1自身抗体、抗MAGEA4自身抗体、抗HSF1自身抗体和抗HDAC1自身抗体的表达水平代入上述步骤(1)构建的诊断模型PRE(P＝ESCC)＝1/(1+EXP(-(-3.094+3.262×ZPR1+3.041×MAGEA4+HSF1×1.735+HDAC1×1.750)))中，即可得到各个血清样本的预测概率，以预测概率PRE＝0.5为诊断区分食管鳞癌患者和正常人的最佳截断值，并计算对应的灵敏度和特异度。根据预测概率绘制ROC曲线(如图6中C所示)，验证四种自身抗体组合诊断食管鳞癌的价值。由图6中C可知，验证集中，抗ZPR1自身抗体、抗MAGEA4自身抗体、抗HSF1自身抗体和抗HDAC1自身抗体组合诊断区分食管鳞癌患者和正常人的ROC曲线下面积AUC为0.738，与训练集基本一致。

为了便于对比分析，将上述训练集、验证集中单个抗肿瘤相关抗原自身抗体或多个抗肿瘤相关抗原自身抗体组合诊断区分食管鳞癌和健康对照的ROC曲线AUC值、灵敏度和特异度进行统计，具体如表1、表2所示。

表1训练集中四种抗肿瘤相关抗原自身抗体诊断区分食管鳞癌患者和正常人的评价结果

由表1可知，与单一抗肿瘤相关抗原自身抗体相比，两种、三种或四种抗肿瘤相关抗原自身抗体组合诊断区分食管鳞癌患者和正常人时，其ROC曲线的AUC均能达到0.7以上，明显高于单一抗肿瘤相关抗原自身抗体；而且，当四种抗肿瘤相关抗原自身抗体组合诊断区分食管鳞癌患者和正常人时，其ROC曲线的AUC达到了最大为0.740；随着组合中抗肿瘤相关抗原自身抗体数目的增加，食管鳞癌的诊断灵敏度逐渐增大，当四种抗肿瘤相关抗原自身抗体组合诊断区分食管鳞癌患者和正常人时，其诊断的灵敏度达到了最高为65.22％，此时，诊断的特异度达到70.19％，由此说明四种抗肿瘤相关抗原自身抗体联合诊断效果最佳。

表2验证集中四种抗肿瘤相关抗原自身抗体诊断区分食管鳞癌患者和正常人的评价结果

由表2可知，在验证集中，随着组合中抗肿瘤相关抗原自身抗体数目的增加，用于诊断区分食管鳞癌患者和正常人的ROC曲线的AUC逐渐增大，当4种抗肿瘤相关抗原自身抗组合诊断区分食管鳞癌患者和正常人时，其AUC达到了最大，和训练集中的变化趋势基本一致。由此说明，本发明构建的多种抗肿瘤相关抗原自身抗体组合诊断食管鳞癌的模型具有较好的稳定性。

上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。

Claims

1.一种用于食管鳞癌诊断的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物为抗肿瘤相关抗原ZPR1、HSF1、MAGEA4、HDAC1的自身抗体中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的生物标志物，其特征在于，所述抗肿瘤相关抗原ZPR1、HSF1、MAGEA4、HDAC1的自身抗体为受试者血清、血浆、组织间隙液或尿液中抗肿瘤相关抗原ZPR1、HSF1、MAGEA4、HDAC1的自身抗体。

3.用于检测权利要求1或2所述生物标志物的试剂在制备用于食管鳞癌诊断的产品中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂为通过酶联免疫吸附、蛋白芯片、免疫印迹或微流控免疫检测样本中所述生物标志物的试剂。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述样本为血清、血浆、组织间隙液或尿液。

6.根据权利要求5述的应用，其特征在于，所述试剂为检测所述生物标志物的抗原。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述产品为蛋白芯片、试剂盒或制剂。

8.一种用于食管鳞癌诊断的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含用于检测权利要求1或2所述生物标志物的试剂。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒通过酶联免疫吸附、蛋白芯片、免疫印迹或微流控免疫检测样本中的所述生物标志物。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为ELISA检测试剂盒，所述ELISA检测试剂盒包括固相载体和包被在固相载体上的抗原；所述抗原为ZPR1蛋白、HSF1蛋白、MAGEA4蛋白、HDAC1蛋白中的至少一种。