CN112415197A - 一组肿瘤标志物在食管鳞癌早期筛查试纸条中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药生物技术领域，公开了一组肿瘤标志物在食管鳞癌早期筛查试纸条中的应用，所述标志物为CFHR3蛋白或CFHR3蛋白与C1QTNF6蛋白的组合或CFHR3蛋白与RFC2蛋白的组合。本发明还公开了上述标志物的检测试剂在制备用于早期食管鳞癌筛查产品中的应用。本发明首次将CFHR3蛋白或CFHR3蛋白与C1QTNF6蛋白的组合或CFHR3蛋白与RFC2蛋白的组合作为早期食管鳞癌筛查的标志物，该标志物具有较高的灵敏度和特异度，极大地提高了早期食管鳞癌的检出率，而且，对食管鳞癌的检出率远高于现有临床内镜筛查食管癌的检出率，可用于食管鳞癌高发区无症状高危人群人群的大规模筛查。

Description

一组肿瘤标志物在食管鳞癌早期筛查试纸条中的应用

本申请是申请号为CN 2020104612093，申请日为2020-05-27，名称为“一种用于高危人群早期食管鳞癌筛查的试纸条”的发明专利的分案申请。

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，具体涉及一种用于高危人群早期食管鳞癌筛查的试纸条。

背景技术

食管鳞癌是世界上最常见的六大恶性肿瘤之一，全球发病率和死亡率占第6 位，中国是食管鳞癌发病率和死亡率最高的国家，全国发病率占第6位，死亡率占第4位，比西方国家发病率高100倍。全球每年新增50万例食管鳞癌患者中，一半以上发生在中国。

食管鳞癌中晚期患者预后极差，5年生存率仅15％左右，而早期食管鳞癌5 年生存率可提高到90％以上。但是，目前临床上首次确诊的食管鳞癌患者中，95％以上均为中晚期。导致此现象的主要原因是早期食管鳞癌患者无明显特异症状，食管鳞癌发病风险预测的分子基础不清楚，并且缺乏无症状高危人群早期筛查的分子靶标。传统上，“高发区、40岁以上、男性、吸烟、饮酒、家族史阳性的无症状人群”被笼统界定为“食管鳞癌高危人群”，也是食管鳞癌早期筛查的主要对象。由于色素内镜和活检病理及内镜下治疗技术的快速推广应用，传统的食管拉网脱落细胞学早期发现筛查手段已完全被色素内镜所取代。但是，需要特别指出的是，内镜检查需要经验、复杂的设备和程序，并且因微创和不适，特别是高成本和低效率，不容易被大众接受。这些局限性限制了内镜在无症状高危人群食管鳞癌预警筛查和早期发现中的推广应用。

因而，寻找有效的食管鳞癌特异性分子诊断标志物用于食管鳞癌早期诊断，对食管鳞癌的早发现、早治疗，从而为最终降低食管鳞癌发病率和死亡率提供重要技术支撑。

食管鳞癌的发生是由多种抑癌基因和癌基因共同参与，并与环境因素交互作用的多阶段演进的过程。癌细胞在其发生和发展过程中会合成并释放出一组其特有的分泌性抗原，即肿瘤相关抗原(Tumor-associated Antigen,TAA)，根据其生化或免疫特性可以识别或诊断肿瘤，例如早已在肝癌诊断中熟练应用的甲胎蛋白 (AFP)。同时由于肿瘤具有异质性，即使同一肿瘤也可能有不同的抗原表达，目前人们尚未找到针对某一肿瘤的单一分子标志物。因此，与单个肿瘤相关抗原检测方法相比，用多个自身抗体来联合检查患者体内肿瘤相关抗原的表达情况，有利于提高针对某一肿瘤的检出率。然而，针对食管鳞癌早期诊断的多种肿瘤标志物联合检测方法以及相应试剂盒的应用还比较少见。

本研究团队在前期利用全基因组关联分析、全基因组测序和全基因组外显子测序等技术建立的基因组学数据库的基础上，采用蛋白芯片技术对早期食管鳞癌患者、高发区无症状高危人群以及正常人血清进行检测和分析，筛选出三种在食管鳞癌患者和正常人中差异化表达的肿瘤血清标志物——RFC2蛋白、C1QTNF6 蛋白和CFHR3蛋白。

RFC2负责在DNA复制过程中将PCNA加载到染色质上，它与DNA复制修复和细胞周期检查点信号传导有关，并参与DNA损伤后PCNA相关的失配和损伤修复机制。RFC2还可以和RFC3与癌基因c-MYC相互作用以诱导细胞分裂和增殖；C1QTNF6介导的肿瘤发生机制包括细胞周期、G2M检测点、上皮-间质转化和血管生成信号通路。

C1QTNF6(Recombinant Human Complement C1q Tumor Necrosis Factor-Related Protein 6，重组人补体C1q肿瘤坏死因子相关蛋白6)，高表达 C1QTNF6可激活Akt信号通路，增加肿瘤血管生成，C1QTNF6的抑制通过灭活 AKT信号途径阻断肝癌的迁移和存活，C1QTNF6的过度表达有助于胃癌细胞的增殖和迁移。

CFHR3(Recombinant Complement Factor H Related Protein 3，补体因子H相关蛋白3)是一种在多种疾病中起作用的蛋白编码基因，是先天免疫的关键组成部分，可以促进或抑制肿瘤的发生。CFHR3的低表达表型在重要的生物学功能和途径中显著富集，并与肿瘤的发生有关，如细胞活化周期的调节、WNT和 NOTCH信号途径等。

RFC2蛋白、C1QTNF6蛋白和CFHR3蛋白在正常人血清中低表达，在食管鳞癌患者血清中高表达，而且，进一步采用统计学检验发现，RFC2蛋白、 C1QTNF6蛋白和CFHR3蛋白在食管鳞癌患者人群中的阳性率均显著高于正常人群，有显著差异。由此说明，RFC2蛋白、C1QTNF6蛋白和CFHR3蛋白可以用于食管鳞癌的诊断。针对该发现，本研究团队利用RFC2蛋白、C1QTNF6蛋白和CFHR3蛋白作为检测指标制备用于高危人群早期食管鳞癌检测的产品，用于对食管鳞癌高发区无症状人群进行食管鳞癌早期筛查(无创、简便、经济)，以期提高食管鳞癌早期检出率，改善患者生存质量，减轻家庭和社会负担。

发明内容

针对现有技术中存在的问题和不足，本发明的目的之一旨在提供一种用于早期食管鳞癌筛查的标志物，本发明的目的之二旨在提供一种用于早期食管鳞癌筛查的标志物的检测试剂的应用，本发明的目的之三旨在提供一种用于高危人群早期食管鳞癌筛查的试纸条。

为实现发明目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明首先提供了一种用于早期食管鳞癌筛查的标志物，所述标志物为 CFHR3蛋白、C1QTNF6蛋白和RFC2蛋白中的任意一种或多种的组合。

本发明还提供了一种上述标志物的检测试剂在制备用于早期食管鳞癌筛查产品中的应用。

根据上述的应用，优选地，所述检测试剂为与所述标志物特异性结合的抗体。更加优选地，所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。

根据上述的应用，优选地，所述产品通过免疫层析法或酶联免疫法检测样本中的所述标志物。

根据上述的应用，优选地，所述样本为血清。

根据上述的应用，优选地，所述产品为试纸条或试剂盒。

本发明还提供了一种用于高危人群早期食管鳞癌筛查的试纸条，所述试纸条包括结合垫和层析垫，所述结合垫上包被有捕获抗体，所述捕获抗体为CFHR3 抗体A、C1QTNF6抗体A、RFC2抗体A的混合物，CFHR3抗体A、C1QTNF6 抗体A、RFC2抗体A均带有可检测的标记物；所述层析垫上设有三条检测线和一条质控线，所述检测线上均固定有检测抗体，三条检测线固定的检测抗体分别为CFHR3抗体B、C1QTNF6抗体B、RFC2抗体B，同种抗原的抗体A、抗体B识别抗原的不同表位；所述质控线上固定有兔抗鼠IgG。

根据上述的用于高危人群早期食管鳞癌筛查的试纸条，优选地，所述标记物为胶体金颗粒；CFHR3抗体A、C1QTNF6抗体A、RFC2抗体A分别用不同粒径的胶体金颗粒标记。

根据上述的用于高危人群早期食管鳞癌筛查的试纸条，优选地，CFHR3抗体A、C1QTNF6抗体A、RFC2抗体A分别为CFHR3单克隆抗体、C1QTNF6 单克隆抗体、RFC2单克隆抗体；其中，RFC2单克隆抗体用粒径为24.5nm的胶体金颗粒标记，C1QTNF6单克隆抗体用粒径为41nm的胶体金颗粒标记，CFHR3 单克隆抗体用粒径为71nm的胶体金颗粒标记，相对应的颜色分别为橙红色、红色和紫红色。

根据上述的用于高危人群早期食管鳞癌筛查的试纸条，优选地，CFHR3抗体B、C1QTNF6抗体B、RFC2抗体B分别为CFHR3多克隆抗体、C1QTNF6 多克隆抗体、RFC2多克隆抗体。

根据上述的用于高危人群早期食管鳞癌筛查的试纸条，优选地，所述试纸条还包括样品垫、吸样垫和底板，所述样品垫、结合垫、层析垫和吸样垫依次固定在底板上；其中，结合垫的一端压在样品垫的下方，结合垫的另一端压在层析垫的上方；层析垫的一端压在结合垫的下方，层析垫的另一端压在吸样垫的下方。

根据上述的用于高危人群早期食管鳞癌筛查的试纸条，优选地，所述捕获抗体中CFHR3单克隆抗体、C1QTNF6单克隆抗体、RFC2单克隆抗体的质量比为 1:1:1。

根据上述的用于高危人群早期食管鳞癌筛查的试纸条，优选地，所述层析垫上的三条检测线和一条质控线按照以下次序排列而成：从靠近吸样垫一端到靠近结合垫一端依次为包被有兔抗鼠IgG的质控线C、固定有RFC2多克隆抗体的检测线T3、固定有C1QTNF6多克隆抗体的检测线T2、固定有CFHR3多克隆抗体的检测线T1。

根据上述的用于高危人群早期食管鳞癌筛查的试纸条，优选地，层析垫上检测线T1、T2、T3以及质控线C之间的间隔均不小于5mm。

根据上述的用于高危人群早期食管鳞癌筛查的试纸条，优选地，所述样品垫的材质为吸水性玻璃纤维，所述结合垫的材质为玻璃纤维膜，所述层析垫的材质为硝酸纤维膜；所述吸样垫的材质为吸水纸或吸水性玻璃纤维膜；所述底板为 PVC底板、硬纸板或硬质纤维板。

本发明还提供了一种包含上述用于高危人群早期食管鳞癌筛查的试纸条的试剂盒。

根据上述的试剂盒，优选地，所述试剂盒还包括吸滴管、血清加样杯、一次性注射器。

本发明用于高危人群早期食管鳞癌筛查的试纸条的使用方法为：

将待测血清样品滴加在试纸条的样品垫上或将试纸条样品垫插入待测血清样品中，取出试纸条后5～15min内观察检测线和质控线颜色变化并记录结果。其中，血清样品在检测前可以用样品稀释液进行稀释。

本发明用于高危人群早期食管鳞癌筛查的试纸条的结果判定方法为：

阳性结果：在试纸条的层析垫T1、T2、T3检测线中至少有一条检测线显色，且质控线C显色，判定检测结果为阳性。

阴性结果：试纸条层析垫上的T1、T2、T3检测线均未显色，仅质控线C 显色，判定检测结果为阴性。

无效结果：质控线C未显色，判断检测结果为无效，需重新检测。

本发明用于高危人群早期食管鳞癌筛查的试纸条的检测原理为：

本发明试纸条以食管鳞癌标志物RFC2、C1QTNF6和CFHR3为被检测物，利用抗原抗体反应原理，以及胶体金免疫层析技术检测人体血液中存在的RFC2、 C1QTNF6和CFHR3抗原。当将待测血清样品滴加在试纸条的样品垫上时，待测血清样品会在吸样垫吸水性材料的毛细管作用下流向吸样垫的方向，当流到结合垫上时，结合垫上包被的胶体金标记CFHR3单克隆抗体、胶体金标记 C1QTNF6单克隆抗体、胶体金标记RFC2单克隆抗体溶解，其中，胶体金标记 CFHR3单克隆抗体与血清样品中可能含有的CFHR3抗原(CFHR3蛋白)结合，形成胶体金标记CFHR3单克隆抗体-CFHR3抗原复合物，胶体金标记C1QTNF6 单克隆抗体与血清样品中可能含有的C1QTNF6抗原(C1QTNF6蛋白)结合，形成胶体金标记C1QTNF6单克隆抗体-C1QTNF6抗原复合物，胶体金标记RFC2 单克隆抗体与血清样品中可能含有的RFC2抗原(RFC2蛋白)结合，形成胶体金标记RFC2单克隆抗体-RFC2抗原复合物；由于毛细管效应，三种胶体金标记的捕获抗体-抗原复合物继续向层析垫移动，当移动至检测线T1时，胶体金标记CFHR3单克隆抗体-CFHR3抗原复合物与CFHR3多克隆抗体特异性结合，形成固化的免疫复合物，被截留在检测线T1上；当移动至检测线T2时，胶体金标记C1QTNF6单克隆抗体-C1QTNF6抗原复合物与C1QTNF6多克隆抗体特异性结合，形成固化的免疫复合物，被截留在检测线T2上；当移动至检测线T3 时，胶体金标记RFC2单克隆抗体-RFC2抗原复合物与RFC2多克隆抗体特异性结合，形成固化的免疫复合物，被截留在检测线T3上；游离的胶体金标记捕获抗体由于毛细管效应继续向前移动，与质控线C上包被的兔抗鼠IgG发生结合而被截留在质控线上；多余的未结合的物质在毛细作用下继续移动到吸样垫上。因此，通过检测线T1、T2、T3的显色情况以及质控线的显色情况，能够定性判断待测样本中CFHR3、C1QTNF6和RFC2肿瘤相关抗原。

由于血清中肿瘤相关抗原的表达丰度与其对应的自身抗体的表达丰度成正比，肿瘤相关抗原高表达，其对应的自身抗体也会高表达。因此，也可以将CFHR3 蛋白、C1QTNF6蛋白、RFC2蛋白作为检测试剂来应用，用于检测血清中CFHR3 蛋白、C1QTNF6蛋白、RFC2蛋白对应的自身抗体，以三种肿瘤相关抗原的自身抗体作为食管鳞癌的诊断和筛查指标。

与现有技术相比，本发明取得的积极有益效果为：

(1)本发明首次将CFHR3蛋白、C1QTNF6蛋白、RFC2蛋白这三种蛋白用于食管鳞癌早期筛查检测，通过检测人血清中CFHR3蛋白、C1QTNF6蛋白的表达水平，可以有效检测食管鳞癌，尤其是早期食管鳞癌；而且，将CFHR3 蛋白、C1QTNF6蛋白作为一个组合用于早期食管鳞癌筛查检测时，其检测灵敏度高达88.8％(即早期食管鳞癌患者中应用这3个蛋白进行诊断时被正确的诊断为早期食管鳞癌的比率为88.8％)，特异度达到了77.5％(即非食管鳞癌患者中应用这3个蛋白进行诊断时确定为未患食管鳞癌者的比率为77.5％)，因此，本发明的标志物具有较高的灵敏度和特异度，极大地提高了早期食管鳞癌的检出率，而且，对食管鳞癌的检出率远高于现有临床内镜筛查食管鳞癌的检出率(2％-3％)，可用于食管鳞癌高发区无症状高危人群人群的大规模筛查，有利于无症状食管鳞癌高危人群早期发现，从而大大降低了食管鳞癌患者的死亡率，为食管鳞癌患者和家庭带来极大的福祉。

(2)本发明的该试纸条能够快速检测人血清中的CFHR3蛋白、C1QTNF6 蛋白、RFC2蛋白，实现了三种肿瘤标志物的联合检测，而且，试纸条具有较高的灵敏度和特异度，针对早期癌的检测准确性高，极大地提高了早期食管鳞癌的检出率，有利于无症状食管鳞癌高危人群早期发现，同时也为实现食管鳞癌高发区无症状高危人群长期跟踪提供重要的检测手段，具有广阔的市场前景和社会效益。

(3)本发明用于早期食管鳞癌筛查的试纸条操作简便，使用方便，而且检测出结果时间短，只需将其测试端插入待检的样品液中10s左右，然后在15min 内即可判定检测结果，极大地提高了早期食管鳞癌的诊断效率。

(4)本发明结合垫上包被的三种捕获抗体分别采用不同粒径的胶体金颗粒进行标记，使层析垫上每种肿瘤标标志物显示不同的颜色，结果判断更加直观。

(5)本发明用于早期食管鳞癌筛查的试纸条不需其它仪器及试剂，非专业人员也可随时检测，可极大的降低检测成本和检测费用，而且人为操作误差小、稳定性好。

(6)本发明用于早期食管鳞癌筛查的试纸条的检测样本为血清，需血量少，群众痛苦小、接受度高。

附图说明

图1为本发明实施例1制备的用于早期食管鳞癌筛查的试纸条的结构示意图。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。

肿瘤标志物是由肿瘤组织和细胞产生的异常表达的生物活性物质，根据其生化后免疫特性可以识别或诊断肿瘤。本研究团队在前期利用全基因组关联分析、全基因组测序和全基因组外显子测序等技术建立的基因组学数据库的基础上，采用蛋白芯片技术对早期食管鳞癌患者、高发区无症状高危人群以及正常人血清进行检测和分析，筛选出三种在食管鳞癌患者和正常人中差异化表达的肿瘤血清标志物——RFC2蛋白、C1QTNF6蛋白和CFHR3蛋白。RFC2蛋白、C1QTNF6蛋白和CFHR3蛋白在正常人血清中低表达，在食管鳞癌患者血清中高表达，而且，进一步采用统计学检验发现，RFC2蛋白、C1QTNF6蛋白和CFHR3蛋白在食管鳞癌患者人群中的阳性率均显著高于正常人群，有显著差异。由此说明，RFC2 蛋白、C1QTNF6蛋白和CFHR3蛋白可以用于食管鳞癌的诊断。针对该发现，本研究团队利用CFHR3蛋白、C1QTNF6蛋白、RFC2蛋白作为检测指标制备用于早期食管鳞癌检测的试纸条，用于检测样本中CFHR3蛋白、C1QTNF6蛋白、 RFC2蛋白的表达水平，实现食管鳞癌的早期筛查。

下列实施例所述的实验方法，如无特殊说明，均为本技术领域常规技术，或按照生产厂商所建议的条件；所用试剂、材料和仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：试纸条的制备

1、实验材料

本发明中所用的生物活性原料均为市售产品。其中，CFHR3单克隆抗体购自上海生物钰博生物科技有限公司，货号为MAL329Hu21；CFHR3多克隆抗体购自上海科敏生物科技有限公司，货号K005454P；C1QTNF6单克隆抗体购自上海群己生物科技有限公司，货号MAB16078；C1QTNF6多克隆抗体购自艾美捷科技有限公司，货号为H00114904-B01P；RFC2单克隆抗体购自厦门研科生物科技有限公司，货号为YKA-AT3620a；RFC2多克隆抗体购自艾美捷科技有限公司，货号H00005982-B01P。

PVC底板、硝酸纤维素膜、玻璃纤维膜、吸水纸等均为现有市售产品。

2、制备结合垫

(1)胶体金的制备：

采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液。柠檬酸三钠还原法制备胶体金是本领域的常规方法，在此不再详述。

(2)胶体金标记CFHR3单克隆抗体、胶体金标记C1QTNF6单克隆抗体、胶体金标记RFC2单克隆抗体的制备：

分别对CFHR3单克隆抗体溶液、C1QTNF6单克隆抗体溶液、RFC2单克隆抗体溶液透析除盐(4℃过夜)，调整蛋白质浓度至1mg/ml；在电磁搅拌下，RFC2 单克隆抗体用粒径为24.5nm的胶体金标记，C1QTNF6单克隆抗体用粒径为41nm 的胶体金标记，CFHR3单克隆抗体用粒径为71nm的胶体金标记，得到三种胶体金标记的单克隆抗体。然后将三种胶体金标记的单克隆抗体按质量比1:1:1的比例混合，得到捕获抗体溶液。

(3)结合垫的制备：

选用玻璃纤维膜作为结合垫材料，将玻璃纤维膜放入预处理液(预处理为含 2％BSA、3％蔗糖、0.6M NaCl、0.2％Tween-20的硼酸盐缓冲液)中浸泡10～15min，然后于36～38℃烘干或真空冷冻干燥；将预处理后的玻璃纤维膜浸入上述捕获抗体溶液中，充分浸泡后取出，冷冻干燥，得到结合垫。

3、制备层析垫

选用硝酸纤维素膜作为层析垫材料，在硝酸纤维素膜上标记好3条检测线 T1、T2、T3和1条质控线C的位置，彼此之间间隔6mm。将CFHR3多克隆抗体、C1QTNF6多克隆抗体、RFC2多克隆抗体均稀释至1mg/mL，兔抗鼠IgG 稀释至1.5mg/mL，用分别用划膜仪在硝酸纤维素膜上3条检测线T1、T2、T3 和质控线C的位置上按0.1-0.5μL/mm用量进行划线，37℃烘干过夜；然后将硝酸纤维素膜浸入含1％BSA的0.01mol/L PBS缓冲液(PH8.0)中，然后取出硝酸纤维素膜用PBS缓冲液清洗，干燥后得到层析垫。

4、样品垫制备

样品垫的材质为玻璃纤维膜，将玻璃纤维膜放入样品垫封闭液中浸泡30min， 37℃烘干，即得样品垫；其中样品垫封闭液为含1％BSA、1.0％～2.0％蔗糖、 0.1％-0.5％Tween-20、0.1-1.0％PVP聚乙烯基吡咯烷酮的0.01mol/L PBS缓冲液 (pH＝7.4)。

5、试纸条组装

试纸条由样品垫、结合垫、层析垫、吸样垫和底板组成，吸样垫的材料为吸水滤纸。

将层析垫贴合在底板的中间，为检测区和质控区，即在层析垫上设置用以判读结果的检测线T1、T2、T3以及质控线C；层析垫右端(上段)为手持部位，固定有吸样垫(吸水滤纸)，吸收检测样品中多余液体；层析垫左端固定结合垫，结合垫上包被有胶体金标记的CFHR3单克隆抗体、C1QTNF6单克隆抗体和 RFC2单克隆抗体；结合垫和吸样垫分别与层析垫的两端重叠；结合垫远离层析垫的一端(下段)固定有样品垫，用于接触待检测样品，组装完成后切割成宽 4mm的试纸条，试纸条经干燥处理，即得用于高危人群早期食管鳞癌筛查的试纸条(参见图1)。

6、试纸条的使用方法

将待测血清样本滴加在试纸条的样品垫上，将试纸条平放，5～15min内观察检测线和质控线颜色变化并记录结果。

7、试纸条的检测结果判定

阳性结果：在试纸条的层析垫T1、T2、T3检测线中至少有一条检测线显色，且质控线C显色，判定检测结果为阳性。

阴性结果：试纸条层析垫上的T1、T2、T3检测线均未显色，仅质控线C 显色，判定检测结果为阴性。

无效结果：质控线C未显色，判断检测结果为无效，需重新检测。

8、试纸条检测时的注意事项

(1)被检样品在室温(20℃左右)条件下检测。

(2)要求被检样品为新鲜样品。样品收集1h内检测，保证结果的可靠性。

(3)本试纸条仅供体外检测粗筛，不能作为确认试剂，阳性结果必须进行进一步上消化道内镜检查协诊。

(4)30min后观察结果无效。

(5)试纸条应避光保存。

实施例2：试纸条的诊断价值分析

用本发明实施例1制备的试纸条检测经病理确诊的早期食管鳞癌患者和正常人的血清样品，评估分析本发明试纸条用于早期食管鳞癌筛查和诊断的价值。

1、样本来源

收集来自郑州大学第一附属医院河南省食管鳞癌重点开放实验室份血清样本，其中正常人血清80份(对照组)，早期食管鳞癌患者血清80份(食管鳞癌组)。80例正常人血清来自该实验室合作医院体检中心的健康体检人群，无任何肿瘤相关的证据。80例正常人中，男性42例，女性38例，平均年龄55.9±6.2 岁，年龄范围40-75岁。80份早期食管鳞癌患者血清来源于经组织病理学证实的早期(0期+I期)食管鳞癌患者，均未接受放疗或化疗治疗。80例食管鳞癌患者中，男性57例，女性23例，平均年龄58.5±7.0岁，年龄范围45-78岁。

2、实验方法

采用本发明实施例1制备的试纸条分别对食管鳞癌组、对照组的血清样本进行检测，具体检测的方法为：将待测血清样本滴加在试纸条的样品垫上，将试纸条平放，5～15min内观察检测线和质控线颜色变化并记录结果。

同时为了与本发明实施例1制备的试纸条检测性能进行对比，本发明制备了 6种对比试纸条，6种对比试纸条的检测指标分别为RFC2蛋白、C1QTNF6蛋白、 CFHR3蛋白、RFC2蛋白+C1QTNF6蛋白、C1QTNF6蛋白+CFHR3蛋白、RFC2 蛋白+CFHR3蛋白。采用2种对比试纸条分别对食管鳞癌组、对照组的血清样本进行检测。

根据结果判断标准，分别计算食管癌组和对照组中这3种抗原的阳性率(每组中检测出的阳性对象例数除以该组被检测对象总例数即为阳性率)；应用 spss26.0软件进行统计学检验，采用两独立样本卡方检验方法比较食管鳞癌组和对照组中抗原阳性率，检验水平α＝0.05，当p＜0.05时，结果具有统计学意义，然后采用筛检试验的方法评价自身抗体检测食管鳞癌的诊断价值(表1)。

3、结果分析

根据试纸条的检测结果评价其对食管鳞癌的筛查诊断价值，结果如表1示。

表1 不同抗原组合对食管鳞癌诊断价值的真实性评价

由表1可知，食管鳞癌组中RFC2蛋白、C1QTNF6蛋白、CFHR3蛋白的阳性率分别为43.8％、50％、47.5％，对照组中RFC2蛋白、C1QTNF6蛋白、CFHR3 蛋白的阳性率分别为13.8％、11.3％、7.5％，RFC2蛋白、C1QTNF6蛋白、CFHR3 蛋白在食管鳞癌组的阳性率均高于其在对照组中的阳性率，且食管鳞癌组与对照组间的差异具有统计学意义(P＜0.05)。由此可见，RFC2蛋白、C1QTNF6蛋白、CFHR3蛋白可作为早期食管鳞癌诊断检测指标，用于早期食管鳞癌的检测，具有诊断价值。

而且，从由表1还可以看出，随着试纸条检测指标(抗原)的增加，早期食管鳞癌患者血清中，抗原的阳性率(即灵敏度)逐渐增大，而特异度则逐渐减小；当试纸条联合检测RFC2蛋白、C1QTNF6蛋白、CFHR3蛋白三种抗原时，对早期食管鳞癌的检测灵敏度达到了88.8％，也就是说食管鳞癌患者中应用该检测方法能够正确诊断食管鳞癌的百分比为88.8％。随着试纸条检测指标的增加，检测的特异度有所降低，但是联合检测RFC2蛋白、C1QTNF6蛋白、CFHR3蛋白三种抗原时，检测特异度仍能达到77.5％，也就是说非食管鳞癌患者采用这种方法检测时，正确诊断为健康人的百分比为77.5％。

而且，与单独采用检测一种肿瘤相关抗原的试纸条相比，采用联合检测RFC2 蛋白、C1QTNF6蛋白、CFHR3蛋白3种抗原的试纸条进行早期食管鳞癌诊断时，其灵敏度分别为检测单一指标RFC2蛋白、C1QTNF6蛋白、CFHR3蛋白的2.03 倍、1.78倍、1.87倍。

因此，通过联合检测血清样本中的RFC2蛋白、C1QTNF6蛋白、CFHR3蛋白对早期食管鳞癌筛查诊断，可以保证诊断特异度的前提下，大幅提高诊断的灵敏度；对待检测对象食管鳞癌风险评估具有较好的诊断和应用价值。

此外，约登指数在统计学上指灵敏度和特异度之和减去1，其范围为0～1，约登指数越接近1，其诊断价值就越高。本发明中，随着试纸条检测的抗原指标的增加，约登指数不断增加且逐渐趋于1，表明这3种抗原联合用于诊断和筛查早期食管鳞癌具有较好的诊断价值。

综上所述，通过联合检测血清样本中的RFC2蛋白、C1QTNF6蛋白、CFHR3 蛋白对早期食管鳞癌筛查诊断，能保证较高的特异度和灵敏度，对待检测对象食管鳞癌风险评估具有较好的诊断和应用价值。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，但不仅限于上述实例，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种用于早期食管鳞癌筛查的标志物，其特征在于，所述标志物为CFHR3蛋白或CFHR3蛋白与C1QTNF6蛋白的组合或CFHR3蛋白与RFC2蛋白的组合。

2.权利要求1所述标志物的检测试剂在制备用于早期食管鳞癌筛查产品中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测试剂为与所述标志物特异性结合的抗体。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述产品通过免疫层析法或酶联免疫法检测样本中的所述标志物。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述样本为血清。

6.根据权利要求2～5任一所述的应用，其特征在于，所述产品为试纸条或试剂盒。

Images