CN111505296B - 食管癌相关抗体蛋白组合在胶体金试纸条中的应用 - Google Patents

食管癌相关抗体蛋白组合在胶体金试纸条中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111505296B
CN111505296B CN202010374469.7A CN202010374469A CN111505296B CN 111505296 B CN111505296 B CN 111505296B CN 202010374469 A CN202010374469 A CN 202010374469A CN 111505296 B CN111505296 B CN 111505296B
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
colloidal gold
protein
esophageal cancer
test strip
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010374469.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111505296A (zh
Inventor
王立东
宋昕
王伟
赵学科
李贝
韩雪娜
范宗民
王苒
杨苗苗
王盼盼
陈瑶
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
First Affiliated Hospital of Zhengzhou University
Original Assignee
First Affiliated Hospital of Zhengzhou University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by First Affiliated Hospital of Zhengzhou University filed Critical First Affiliated Hospital of Zhengzhou University
Priority to CN202010374469.7A priority Critical patent/CN111505296B/zh
Publication of CN111505296A publication Critical patent/CN111505296A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111505296B publication Critical patent/CN111505296B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57488—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds identifable in body fluids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/60—Complex ways of combining multiple protein biomarkers for diagnosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明属于分子生物学和肿瘤学领域，具体公开了FAM84A蛋白、USP15蛋白、FAM212B蛋白、ALDH3A1蛋白、RAB33B蛋白的组合在食管癌检测胶体金试纸条或试剂盒中的应用。还公开了一种用于无症状高危人群筛查和早期发现的胶体金试纸条，包括底板，底板上设有从其一端开始依次连接的样品垫、胶体金标记的结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。本发明提供的胶体金试纸条提高了食管癌无症状高危人群筛查和早期食管癌的灵敏度及特异性，当5种肿瘤标志物同时组合时，检测效果达到最好（灵敏度92.3%，特异性98.3%）。

Description

食管癌相关抗体蛋白组合在胶体金试纸条中的应用
技术领域
本发明属于分子生物学和肿瘤学领域，具体涉及食管癌相关抗体蛋白组合在无症状高危人群筛查和早期发现胶体金试纸条中的应用。
背景技术
食管癌是世界上第8位常见的恶性肿瘤和第5位常见癌症死亡原因。食管癌具有明显的地域分布差异，每年全球食管癌新发病例数有一半以上均发生在我国，特别是以河南、河北、山西三省交界的太行山地区的发病率和死亡率更是位居世界首位。食管癌的高发病率和高死亡率也是这些地区居民因病致贫、因病返贫的重要原因之一。中晚期食管癌患者预后极差，早期食管癌患者5年生存率可达90％，而由于食管癌早期无明显特异症状，并且临床尚缺乏有效检测分子指标的试剂，导致首次就诊时早期食管癌检出率仅约5％，大多数患者就诊时已为中晚期。目前，内镜检查和粘膜活检、组织病理学检查仍是食管癌早期诊断的主要手段，然而，内镜检查需要丰富的操作经验、复杂的设备和程序，并且会给接受检查者造成微创和不适，高成本和低效率的检测不容易被大众所接受。例如，常规高发区内镜筛查上述“高危人群”，早期癌的发现率仅2％左右，癌前病变的发现率在10％左右，约90％的无症状“高危人群”均为“陪伴检查”或无检查等，这些局限性限制了内镜在无症状高危人群食管癌预警筛查和早期发现中的推广应用。因此，开发高通量、高特异性和敏感性、低成本的检测方法是提高早期食管癌检出率、降低食管癌发病率的关键问题。
肿瘤标志物是由肿瘤组织和细胞产生的异常表达的生物活性物质，根据其生化后免疫特性可以识别或诊断肿瘤。单独使用一种肿瘤标志物检测，灵敏度和特异性都比较低，容易出现误诊或者漏诊，因此选择更有诊断价值的标志物组合，对食管癌早期发现和早期诊断就显得极为重要。这5种特异性抗原在92％的早期食管癌和癌前病变患者血清中被检测到，而在正常人血清中检出率仅为15％。因此提示我们，这5种特异抗原的检测对于食管癌无症状高危人群筛查和早期发现具有十分重要的意义。
FAM84A(重组人序列相似家族84成员A)蛋白，属于LRATD家族，也称NSE1,PP11517。该蛋白参与细胞形态以及细胞运动功能，仅存在于正常人睾丸组织内，但在结直肠癌细胞中高度表达。有研究证明结直肠癌中过度表达的FAM84A，增强癌细胞运动能力可能参与结肠癌细胞的侵袭或转移。同时FAM84A在膀胱癌、胰腺癌、胆管癌(CCC)、肺癌中表达也显著增强。
USP15也称KIAA0529，是去泛素化酶(DUBs)的一种，其主要负责移除蛋白质和其它分子上的泛素链。USP15能对某些生理条件下蛋白质的正常水平起决定性的作用，通过这种方式，USP15参与调控和调节了TGFβ受体稳定性，是TGFβ链式反应的活化因子，USP15酶的扩增会导致TGFβ异常激活，TGFβ是一个重要的致癌因子，通过发挥强大的免疫抑制功能使得肿瘤能够逃逸宿主免疫系统的攻击。目前已发现USP15是胰腺癌、乳腺癌和卵巢癌的一种潜在的肿瘤生物标志物，并在胶质母细胞瘤发生过程中扮演极其重要致癌因子角色。
FAM212B又称INKA2，是一种肌动蛋白调节基因。通过动物模型和人类基因组数据库分析发现INKA2以p53依赖的方式在mRNA和蛋白质水平上被诱导，p53通过内含子结合位点直接调控INKA2，INKA2是P53的下游靶点，可以通过阻断PAK4-β-catenin途径而抑制肿瘤细胞生长。
ALDH3A1又称ALDH3,ALDHIII。ALDH3A1是乙醛脱氢酶家族中的一种亚型，其存在于胃、食管以及肺组织当中，但在肝、肾中表达较低。其与胃癌分化程度以及胃癌患者预后密切相关。Urano团队通过细胞系研究发现高加索食管鳞状细胞系(OE21)中ALDH3A1高表达。另有研究发现ALDH3的上调表达可诱导再生增殖期的肿瘤细胞增殖，也可刺激正常细胞的细胞增殖。
RAB33B又称SMC2，是RAS癌基因家族蛋白，参与染色体结构的维持，在高尔基体到内质网的高尔基酶循环中广泛表达，参与小GTP酶介导信号转导蛋白运输，可能为hsa-miR-1273e作用的靶基因。有研究发现RAB33B可作为肺癌的特异性分子标志物。
20世纪70年代，Faulk和Taylor首次将胶体金作为示踪物用于免疫电镜检测技术，后来随着该技术蓬勃发展，出现了如免疫渗滤试验和免疫层析试验等方法。其中胶体金免疫层析试纸条就是最常见的一种，因其快速，简便和灵敏度较高，从而在多个领域得到了广泛应用。氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下，由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，故称胶体金。胶体金颗粒表面负电荷与蛋白质的正电荷基团会因静电吸附牢固结合，这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。由于胶体金颗粒具有高电子密度的特性，因此金标蛋白在相应的配体处大量聚集时，在显微镜下可见黑褐色颗粒或肉眼可见红色或粉红色斑点。
因此，本研究发明出一种可用于早期食管癌检测的胶体金试纸条，可同时检测5种适用于食管癌高发区无症状人群筛查和早期发现的分子标志物，此技术与以往检测技术相比，除具有快速、简便、操作误差小等特点以外，由于该层析法为通过硝酸纤维素膜进行横向流动，允许并联多个试剂条进行多项指标联合检测，采用此技术更能实现高通量、高特异性和高灵敏度进行高危人群筛查和早期发现，从而达到提高食管癌患者生存率、降低食管癌发病率的最终目标。
发明内容
本发明的目的在于提供食管癌相关蛋白组合FAM84A蛋白、USP15蛋白、FAM212B蛋白、ALDH3A1蛋白、RAB33B蛋白在在无症状高危人群筛查和早期发现胶体金试纸条中的应用。
基于上述目的，本发明采用的技术方案如下：
第一个方案为：FAM84A蛋白在食管癌检测胶体金试纸条中的应用。
第二个方案为：USP15蛋白在食管癌检测胶体金试纸条中的应用。
第三个方案为：FAM212B蛋白在食管癌检测胶体金试纸条中的应用。
第四个方案为：RAB33B蛋白在食管癌检测胶体金试纸条中的应用。
本发明还请求保护FAM84A蛋白、USP15蛋白、FAM212B蛋白、ALDH3A1蛋白、RAB33B蛋白的组合在食管癌检测胶体金试纸条中的应用。
在上述应用中，所述蛋白为抗体。
在上述应用中，所述检测是指通过免疫层析法或组织芯片法进行的检测。
基于上述应用，本申请还请求保护一种用于无症状高危人群筛查和早期发现的胶体金试纸条，包括底板，底板上设有从其一端开始依次连接的样品垫、胶体金标记的结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述胶体金标记的结合垫上包被有分别用胶体金标记的FAM84A抗体A、USP15抗体A、FAM212B抗体A、ALDH3A1抗体A、RAB33B抗体A的混合物；所述硝酸纤维素膜上设有一条对照线和五条检测线，五条检测线上分别固定有FAM84A抗体B、USP15抗体B、FAM212B抗体B、ALDH3A1抗体B、RAB33B抗体B，所述抗体A与抗体B分别与其相应的抗原的不同决定簇(抗原表位)相结合；所述对照线上固定有羊抗鼠IgG。
所述抗体A为相应抗原的单克隆抗体，具体为FAM84A单克隆抗体、USP15单克隆抗体、FAM212B单克隆抗体、ALDH3A1单克隆抗体、RAB33单克隆抗体；所述抗体B为相应抗原的兔抗人多克隆抗体，具体为兔抗人RAB33B多克隆抗体、兔抗人ALDH3A1多克隆抗体、兔抗人FAM212B多克隆抗体、兔抗人USP15多克隆抗体、兔抗人FAM84A多克隆抗体。
所述的对照线上固定有羊抗鼠IgG，简称C线。利用自动微量喷点设备，将相应的抗原的兔抗人多克隆抗体固定在己预处理合格的硝酸纤维素膜上，既得检测线。所述硝酸纤维素膜从靠近胶体金标记的结合垫的一端开始，分别为兔抗人RAB33B多克隆抗体T1线、兔抗人ALDH3A1多克隆抗体T2线、兔抗人FAM212B多克隆抗体T3线、兔抗人USP15多克隆抗体T4线、兔抗人FAM84A多克隆抗体T5线，羊抗鼠IgG的C线。
在上述试纸条中，胶体金标记的结合垫上包被的五种蛋白FAM84A单克隆抗体、USP15单克隆抗体、FAM212B单克隆抗体、ALDH3A1单克隆抗体、RAB33B单克隆抗体分别用不同粒径的胶体金颗粒标记，以使每种肿瘤标志物即血清中的肿瘤相关抗原显色不同，其制备过程为：将FAM84A单抗用粒径为14.8nm的胶体金颗粒标记，USP15单抗用粒径为24.8nm的胶体金颗粒标记，FAM212B单抗用粒径为41nm的胶体金颗粒标记，ALDH3A1单抗用粒径为71nm的胶体金颗粒标记，RAB33B单抗用粒径为97.5nm的胶体金颗粒标记，将胶体金颗粒标记的5种单抗等比例混合后，包被于玻璃纤维上，即可得到胶体金标记的结合垫。
上述试纸条还配备有吸滴管、血清加样杯和一次性注射器。
优选地，上述胶体金试纸条的检测对象为人类血清，血清中肿瘤相关抗原为检测目标。
上述试纸条的使用方法为：
用吸滴管将待检样品(血清)收集在血清加样杯中，将试纸条的样品垫一端浸入血清中，等候约4-5分钟，将样品完全被吸收之后，取出试纸条进行鉴定。
血清中的肿瘤相关抗原与胶体金标记的结合垫上的对应的单克隆抗体结合成抗原-抗体复合体，复合体在免疫层析作用下向硝酸纤维素膜上层析，层析到与相应多克隆抗体对应的检测线处时，与检测线上固定的与其对应的多克隆抗体结合，并被固定下来，富集、进而显色，其余几种未被固定的复合体继续层析至相应多克隆抗体对应的检测线处，固定、富集、显色。以血清中的肿瘤相关抗原ALDH3A1为例，抗原ALDH3A1与胶体金标记的ALDH3A1单克隆抗体结合形成复合体，复合体在层析作用下移动至T2检测线，在T2检测线处被兔抗人ALDH3A1多克隆抗体结合，并被固定下来，进而富集显色，与FAM212B、USP15、FAM84A相关的复合体继续层析，具体见图1。
根据胶体金标记的物种抗体的颜色变化进行鉴定，自样品垫至吸水纸分别为检测RAB33B，ALDH3A1，FAM212B，USP15，FAM84A的条带，相对应颜色为紫灰、紫红、红、橙红、橙。
检测时，反应4-5分钟后，若试纸条的五条检测带至少有一条检测带显色，且对照带位置上也出现相应的颜色，则待测样品检测为阳性；若仅在对照带位置上出现显色条带，而检测带位置上无显色条带，则待检样品检测为阴性；若在对照带位置上未出现显色条带，无论检测带位置上是否出现显色条带，检测结果都无效。
本发明采用双抗体夹心法原理，快速检测人全血或血清、血浆中的FAM84A，USP15，FAM212B，ALDH3A1，RAB33B抗原，创伤小，检测快，一滴血就可以检测5种肿瘤标志物。其次，5种肿瘤标志物的金标抗体分别用不同大小的胶体金颗粒标记，使每种肿瘤标志物的显色颜色不同，结果判断更加直观，同时提高了食管癌无症状高危人群筛查和早期食管癌的灵敏度及特异性，当5种肿瘤标志物同时组合时，检测效果达到最好(灵敏度92.3％，特异性98.3％)。
与试纸条相对应的，发明人王立东教授研究团队在前期利用自身抗体芯片技术，通过对早期食管癌患者、高发区无症状高危人群以及正常人血清中特异抗原的检测和分析，发现了5种抗原FAM84A，USP15，FAM212B，ALDH3A1，RAB33B在人类血清中高表达，对应的其血清自身抗体也会高表达，因此，如果以血清中对应的自身抗体为检测目标，肿瘤相关抗原标志物FAM84A，USP15，FAM212B，ALDH3A1，RAB33B也可在检测试剂中应用，作为食管癌尤其是早期食管癌的发现、诊断、治疗和预后判断的一个检测指标。
与现有技术相比，本发明取得的积极有益效果为：
本发明提供的可用于早期食管癌检测的胶体金试纸条，可同时检测5种适用于食管癌高发区无症状人群筛查和早期发现的分子标志物，此技术与以往检测技术相比，除具有快速、简便、操作误差小等特点以外，由于该层析法为通过硝酸纤维素膜进行横向流动，允许并联多个试剂条进行多项指标联合检测，采用此技术更能实现高通量、高特异性和高灵敏度进行高危人群筛查和早期发现，从而达到提高食管癌患者生存率、降低食管癌发病率的最终目标。
附图说明
图1是试纸条的结构示意图；
图2FAM84A，USP152种肿瘤相关标志物在血清中的分布；
图3FAM212B，ALDH3A1，RAB33B3种肿瘤相关标志物在血清中的分布；
图4是5种肿瘤标志物的31种显色组合的灵敏度和特异性。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步阐释。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径买到。
实施例1肿瘤相关抗原在食管癌检测中的应用
通过对60例早期食管癌患者和60例来自高发区正常人血清中特异抗原的检测和分析，发现了FAM84A，USP15，FAM212B，ALDH3A1，RAB33B这5种抗原在早期食管癌血清中的表达明显高于正常人群。
一.实验样本
选取来自安阳市肿瘤医院60例早期食管癌患者的血清和新乡市孟庄镇郑屯村60例正常人对照血清。
60例早期食管癌患者血清来源于经组织病理学证实的早期(0期+I期)食管癌患者，均未接受放疗或化疗；60例正常人中均无肿瘤相关病史。60例食管癌患者中，男性41例，女性19例，平均年龄54.3±5.6岁，年龄范围48-76岁。60例正常人中，男性32例，女28例，平均年龄为53.5±7.2岁，年龄范围为44-75岁。
二、实验方法
1、样品要求：血清≥30ul，新鲜制备或冻存于-80℃。
2、试剂：
(1)封闭液：3ml10％BSA，加入7ml1×PBS溶液，混匀，置于冰上。
(2)孵育液：1ml10％BSA，加入9ml1×PBST溶液，混匀，置于冰上。
(3)清洗液：1×PBST，存放于4℃冰箱。
(4)HuProtTM蛋白芯片(购自美国CDILaboratories,Inc.货号HM-1001)
3、样品检测
(1)封闭：使用芯片清洗盒，用10ml移液枪加入10ml封闭液，将芯片从-80℃冰箱取出，正面朝上迅速置于清洗盒中；轻轻震荡，用封口膜封住清洗盒，再横向放在侧摆摇床上，室温3h，记录芯片编号。
(2)血清样本孵育：将预先准备好的样本孵育液加到芯片孵育盒，将芯片转移到对应的样本孵育液中(记录样品名称及对应的芯片编号)，再将芯片孵育盒放入保湿盒内，侧摆摇床上，4℃冷库，过夜孵育。(血清以1：200比例稀释，总体积3ml)
(3)清洗：用镊子将芯片取出(注意不能触及或划破芯片的上表面)，置于加入有清洗液的芯片清洗盒中，放置水平摇床上，100rpm/min，清洗3次，每次10min。
(4)二抗孵育：用镊子将芯片转移到加入了3ml二抗孵育液的孵育盒中，侧摆摇床40rpm，避光，室温60min。二抗孵育液：使用anti-humanIgG和IgM荧光二抗，孵育液稀释抗体至其工作液浓度(注意二抗孵育时避光)
(5)清洗：同步骤“3”。注意该过程应避光操作。
(6)完成后用ddH2O清洗2次，每次10min。注意该过程应避光操作。
(7)干燥：将芯片置于芯片干燥机离心干燥。
(8)扫描：按照扫描仪的操作规范和使用说明操作，设置参数为：Power90％，PMTvalue650，若存在爆点，调节PMT或者Power至扫描无爆点。
(9)数据提取：将对应GAL文件打开，将芯片图像和GAL文件每个阵列整体对齐，按下自动对齐按钮，提取数据并保存。
三、判定标准
经过对实验数据的提取、重复性分析、数据校正等一系列分析。对于任意一个蛋白，计算癌症组与对照组的差异倍数，即foldchange＝癌症组均值/对照组均值，用以表示癌症组高于对照组的程度；定义，foldchange≥2即为潜在差异，一般认为差异倍数越大，两组间区别越明显。对于不同样本组，为避免出现阴性蛋白之间的比较，在进行样本比对前，根据归一化之后芯片上蛋白点信号SNR值的分布设置阳性蛋白判断阈值，定义IgG-SNR>4、IgM-SNR>5时判断该蛋白为阳性蛋白。在此基础上，以对照组在该蛋白上的SNR为计算对象设定cutoff阈值(cutoff-IgG≥4，cutoff-IgM≥5)，分别计算癌症组的阳性率(sensitivity)和健康对照组的阳性率(1-specificity)。
四、判定结果
根据对60例早期食管癌患者血清河南60例正常人血清中自身抗体的检测和计算分析，发现FAM84A，USP15，FAM212B，ALDH3A1，RAB33B这5种自身抗体在早期食管癌血清中明显高于正常人群，具体见图2和图3。
通过比较5种自身抗体在早期食管癌患者血清和对照组血清中中含量(图2、图3)可知，这5种肿瘤自身抗体在食管癌组中平均表达量与对照组中表达量均具有明显差异，由于自身抗体是在患者血清中产生的，与血清中肿瘤相关抗原的丰度呈正比，因此该5种自身抗体对应的肿瘤相关抗原可以用作早期食管癌筛查。
实施例25种蛋白在制备食管癌无症状高危人群筛查和早期发现的胶体金试纸条中的应用
本申请制备了一种用于食管癌无症状高危人群筛查和早期发现的胶体金试纸条，包括PVC底板，底板上设有从其一端开始依次连接的样品垫、胶体金标记的结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述胶体金标记的结合垫为包被有分别用胶体金标记的FAM84A单克隆抗体、USP15单克隆抗体、FAM212B单克隆抗体、ALDH3A1单克隆抗体、RAB33B单克隆抗体的混合物；所述硝酸纤维素膜上设有一条对照线和五条检测线，五条检测线上分别固定有兔抗人FAM84A多克隆抗体、兔抗人USP15多克隆抗体、兔抗人FAM212B多克隆抗体、兔抗人ALDH3A1多克隆抗体、兔抗人RAB33B多克隆抗体。
一、胶体金试纸条的制备
1、含有5条检测带(T线)和1条对照带(C线)的硝酸纤维素膜的制备
试剂来源：FAM84A单克隆抗体(货号MAB8508)、USP15单克隆抗体(货号H00009958-M01)、RAB33B单克隆抗体(货号H00083452-M01)、ALDH3A1单克隆抗体(货号H00000218-M08)均购自上海群己生物科技有限公司、FAM212B单克隆抗体(货号orb183590)购自武汉博欧特生物科技有限公司。
兔抗人FAM84A多克隆抗体(货号H00151354-W01P)、兔抗人USP15多克隆抗体(货号PAB6412)、兔抗人FAM212B多克隆抗体(货号PAB22074)、兔抗人ALDH3A1多克隆抗体(货号PAB18542)、兔抗人RAB33B多克隆抗体(货号H00083452-B01)均购自上海群己生物科技有限公司
5种多克隆抗体在硝酸纤维素膜上的位置，自样品垫到吸水纸的方向，分别为FAM84A、USP15、FAM212B、ALDH3A1、RAB33B；
T线划线：分别将兔抗人FAM84A多克隆抗体、兔抗人USP15多克隆抗体、兔抗人FAM212B多克隆抗体、兔抗人ALDH3A1多克隆抗体、兔抗人RAB33B多克隆抗体。装入胶体金划膜仪中，在硝酸纤维素膜上按0.1μl/mm的量划线(膜规格为25mm×310mm)；
C线划线：羊抗鼠抗体包被液装入胶体金划膜仪中，在硝酸纤维素膜上按0.1μl/mm的量划线。(膜规格为25mm×310mm)包被：37℃包被2小时；封闭：37℃封闭30分钟；
干燥：将包被后的硝酸纤维素膜放入真空干燥器内干燥20小时，真空度0.1。
2、制备胶体金标记的结合垫
胶体金标记：分别对FAM84A单克隆抗体、USP15单克隆抗体、RAB33B单克隆抗体、FAM212B单克隆抗体、ALDH3A1单克隆抗体溶液透析除盐(4℃过夜)，调整蛋白质浓度至1mg/ml；FAM84A单抗，USP15单抗，FAM212B单抗，ALDH3A1单抗，RAB33B单抗和胶体金用量采用目测法；在电磁搅拌下，FAM84A单抗用粒径14.8nm的胶体金颗粒标记，USP15单抗用粒径24.8nm的胶体金颗粒标记，FAM212B单抗用粒径41nm的胶体金颗粒标记，ALDH3A1单抗用粒径71nm的胶体金颗粒标记，RAB33B单抗用粒径97.5nm的胶体金颗粒标记；最终检测FAM84A，USP15，FAM212B，ALDH3A1，RAB33B的条带相对应颜色为橙、橙红、红、紫红、紫灰；然后等比例将5种免疫金混合，得到混合免疫金；
包被：胶体金稀释液稀释至OD＝10.0,10mmx310mm玻璃纤维在溶液中浸泡5-10分钟；
干燥：将标记后玻璃纤维放入真空干燥器内干燥20小时，取出密闭保存待用。
3、组装
备料：样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC背衬等按生产工艺要求裁成一定的规格和尺寸；
黏贴：按生产工艺要求将各组分别贴在白色塑料板上；
裁切：用切条机将组装好的反应板切成3mm宽的试剂条；
装袋：装入铝箔袋内，外加干燥剂防潮。机器封口。
二、试纸条的检测试验
1、样本来源
取1200例早期食管癌或癌前病变患者，均为病理确诊的早期食管鳞癌或者癌前病变患者(病例组)，年龄35-80岁，平均55岁。
另选1200例正常对照(对照组)，均经内镜活检病理诊断排除食管癌或癌前病变，年龄35-80岁，平均54岁。
2、标本收集
采集受检者静脉血3ml，分离血清，置-20℃冰箱保存。采用本发明试纸条(实施例1制备)检测5种标志物(FAM84A蛋白，USP15蛋白，FAM212B蛋白，ALDH3A1蛋白，RAB33B蛋白)。
3、检测过程
用吸滴管将待检样品(血清)收集在血清加样杯中，将试纸条的样品垫一端浸入血清中，等候约4-5分钟，将样品完全被吸收之后，取出试纸条进行鉴定。
4、判断标准
检测时，反应4-5分钟后，若试纸条的五条检测带至少有一条检测带显色，且对照带位置上也出现相应的颜色，则待测样品检测为阳性；若仅在对照带位置上出现显色条带，而检测带位置上无显色条带，则待检样品检测为阴性；若在对照带位置上未出现显色条带，无论检测带位置上是否出现显色条带，检测结果都无效。
5、检测结果与分析
阳性标本若检测结果为阳性的，则判定为真阳性：检测结果为阴性的，则判定为假阴性。阴性样本若检测结果为阴性的，则判定为真阴性：检测结果为阳性的，则判定为假阳性。检测结果见表1,检测试纸条的灵敏度和特异性见图4。灵敏度(％)二真阳性÷(真阳性+假阴性)×100％
特异性(％)二真阴性÷(真阴性+假阳性)×100％
表1 5种肿瘤标志物FAM84A，USP15，FAM212B，ALDH3A1，RAB33B检测结果
Figure GDA0002527169640000111
Figure GDA0002527169640000121
对1200例早期食管癌癌和1200正常人血清进行5种肿瘤标志物的检测，由表1和图2可知，随着肿瘤标志物组合数目的逐渐增加，早期食管癌诊断的灵敏度和特异性也随之增加；当5种肿瘤标志物同时组合时，检测效果达到最好(灵敏度92.3％，特异性98.3％)，相较于单一指标检测有明显提升。因此，使用FAM84A，USP15，FAM212B，ALDH3A1，RAB33B这5种食管癌肿瘤标志物组合进行高危人群的筛查，可以大大提高早期食管癌的发现率。从而达到提高食管癌患者生存率、降低食管癌发病率的最终目标。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，但不仅限于上述实例，凡在本发明精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.FAM212B蛋白的抗体在食管癌检测胶体金试纸条或试剂盒中的应用。
2.FAM84A蛋白的抗体、USP15蛋白的抗体、FAM212B蛋白的抗体、ALDH3A1蛋白的抗体和RAB33B蛋白的抗体的组合在食管癌检测胶体金试纸条或试剂盒中的应用。
3.一种用于食管癌无症状高危人群筛查和早期发现的胶体金试纸条，其特征在于，包括底板，底板上设有从其一端开始依次连接的样品垫、胶体金标记的结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述胶体金标记的结合垫上包被有分别用胶体金标记的FAM84A抗体A、USP15抗体A、FAM212B抗体A、ALDH3A1抗体A、RAB33B抗体A的混合物；所述硝酸纤维素膜上设有一条对照线和五条检测线，五条检测线上分别固定有FAM84A抗体B、USP15抗体B、FAM212B抗体B、ALDH3A1抗体B、RAB33B抗体B，所述抗体A与抗体B分别与其相应的抗原的不同决定簇相结合；所述对照线上固定有羊抗鼠IgG。
4.根据权利要求3所述的胶体金试纸条，其特征在于，所述抗体A为相应抗原的单克隆抗体，所述抗体B为相应抗原的兔抗人多克隆抗体。
5.根据权利要求3或4所述的胶体金试纸条，其特征在于，所述FAM84A抗体A、USP15抗体A、FAM212B抗体A、ALDH3A1抗体A、RAB33B抗体A这五种蛋白分别用不同粒径的胶体金颗粒标记。
CN202010374469.7A 2020-05-06 2020-05-06 食管癌相关抗体蛋白组合在胶体金试纸条中的应用 Active CN111505296B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010374469.7A CN111505296B (zh) 2020-05-06 2020-05-06 食管癌相关抗体蛋白组合在胶体金试纸条中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010374469.7A CN111505296B (zh) 2020-05-06 2020-05-06 食管癌相关抗体蛋白组合在胶体金试纸条中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111505296A CN111505296A (zh) 2020-08-07
CN111505296B true CN111505296B (zh) 2020-12-22

Family

ID=71877005

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010374469.7A Active CN111505296B (zh) 2020-05-06 2020-05-06 食管癌相关抗体蛋白组合在胶体金试纸条中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111505296B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112881695A (zh) * 2021-03-16 2021-06-01 首都医科大学附属北京友谊医院 一种血清CENPF抗体（IgG和IgM）检测胶体金试纸条
CN116449003A (zh) * 2023-05-06 2023-07-18 郑州市妇幼保健院 宫颈癌相关抗体蛋白组合在胶体金试纸条中的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101273144A (zh) * 2005-07-27 2008-09-24 肿瘤疗法科学股份有限公司 诊断食道癌的方法
CN101539574A (zh) * 2009-04-29 2009-09-23 北京市肿瘤防治研究所 Survivin抗体的应用及以其制备的食管癌免疫层析检测试纸条
CN109342727A (zh) * 2018-10-15 2019-02-15 汕头大学医学院附属肿瘤医院 食管鳞状细胞癌自身抗体分子标志物模型及其应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170191136A1 (en) * 2015-12-31 2017-07-06 Effector Therapeutics, Inc. Mnk biomarkers and uses thereof
CN109517898B (zh) * 2018-11-21 2021-10-15 新乡医学院 一种食管癌检测、诊断或者预后评价制剂，治疗食管癌的药物及rnd2基因的应用
CN110187108B (zh) * 2019-05-31 2020-02-21 郑州大学第一附属医院 一种用于早期食管癌筛查的自身抗体联合检测elisa试剂盒

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101273144A (zh) * 2005-07-27 2008-09-24 肿瘤疗法科学股份有限公司 诊断食道癌的方法
CN101539574A (zh) * 2009-04-29 2009-09-23 北京市肿瘤防治研究所 Survivin抗体的应用及以其制备的食管癌免疫层析检测试纸条
CN109342727A (zh) * 2018-10-15 2019-02-15 汕头大学医学院附属肿瘤医院 食管鳞状细胞癌自身抗体分子标志物模型及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
8q24区域扩增靶基因在食管癌中的研究;张旭 等;《中国肿瘤临床》;20071231;第34卷(第13期);第724-727页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111505296A (zh) 2020-08-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111505296B (zh) 食管癌相关抗体蛋白组合在胶体金试纸条中的应用
CN111579786B (zh) 一种用于高危人群早期食管鳞癌筛查的试纸条
CN110333352A (zh) 肿瘤相关自身抗体及肿瘤标志物联合检测试剂盒
CN109187979B (zh) 蛋白芯片、蛋白质芯片诊断试剂盒制备及使用方法
CN110187111B (zh) 一种用于早期贲门癌筛查elisa试剂盒
CN109116023B (zh) 一种肺癌标志物抗-mmp12自身抗体及其应用
CN102803968B (zh) 食道癌标志物
CN117890592A (zh) 一种用于筛查、诊断多种癌症的生物标志物及应用
CN105259348B (zh) 一种分泌型Sema4C蛋白及其应用
CN111505300A (zh) 一种早期食管癌联合筛查试纸条
CN112595849B (zh) 用于早期食管癌筛查的血清学检测标志物及其应用
CN111579787B (zh) 一种用于早期食管鳞癌筛查的试纸条
CN109085359A (zh) 血清蛋白标志物组合在结直肠癌筛查和诊治中的应用
CN115372616A (zh) 胃癌相关的生物标志物及其应用
KR102280473B1 (ko) 악성 신생물 질환의 검출을 위한 조성물 및 방법
CN113267626B (zh) 一种用于高危人群贲门腺癌早期筛查的试纸条
EP2129688A2 (en) Compositions and methods for detecting cancers in a subject
JP2021524576A (ja) がんの診断及び治療のための組成物及び方法
CN116449003A (zh) 宫颈癌相关抗体蛋白组合在胶体金试纸条中的应用
CN112198314B (zh) 一种用于食管癌前病变恶性进展风险检测或食管癌早期筛查的标志物及其应用
CN111562379B (zh) 一组用于早期食管癌筛查的多指标联合检测胶体金试纸条
CN117368479B (zh) 一种用于肺腺癌诊断的生物标志物及检测试剂盒
Pant et al. Noninvasive colorectal cancer screening
CN117230188A (zh) Dhx33蛋白作为肾癌诊断标志物的应用
CN111487406A (zh) 一种γ突触核蛋白(SNCG)的胶体金试纸条及其制备方法和用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant