CN117890592A - 一种用于筛查、诊断多种癌症的生物标志物及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域,具体涉及一种用于筛查、诊断早期多种癌种的生物标志物及其应用。本发明所述方案通过筛选全新的标志物组合,即以外泌体表面磷酯酰丝氨酸(PS)和CD63为生物标志物,可以实现对多种癌种进行早期的筛查和诊断,显著优于现有标志物的结果。本发明所述方案不仅能够实现对多种癌种进行无创、快速、方便的诊断,同时具有高灵敏度和高特异性的特点,能够在肿瘤的超早期或早期进行诊断,有望成为一种新型的肿瘤无创诊断技术。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,具体涉及一种适用于筛查及诊断多种癌种的生物标志物及其应用。
背景技术
近年来,随着人口老龄化和生活方式的改变,癌症的发病率逐年上升,成为全球公共卫生问题之一。癌症是一种常见的疾病,常常需要高昂的医疗费用和时间,而且随着病情的恶化,治疗难度也会增加,早期发现和治疗癌症是预防和控制癌症的关键。因此,超早期的癌症筛查和早期的癌症诊断非常重要,可以提高癌症治疗的成功率,并大大改善患者的预后。然而,大多数癌症类型只有在症状出现时才被诊断出来,这通常表明疾病已进展到晚期,尽管癌症治疗取得了巨大进展,但一旦形成转移性肿瘤,治愈前景就很暗淡。这主要受限于传统的癌症筛查和诊断方法存在着一定的局限性和缺陷。目前,癌症研究的主要目标之一是在肿瘤可以有效治疗的早期阶段检测出癌症,从而为患者提供更好的长期生存机会。在某些情况下,局部癌症可以仅通过手术治愈,而无需任何全身治疗,即使已经开始转移但尚未出现放射学上的证据,细胞毒性药物和免疫疗法等全身治疗仍然可以治愈多达50%的病例。因此,本领域需要新的筛查和诊断方法来提高准确性和精度。
但是,传统肿瘤筛查仍面临诸多挑战,这些挑战阻碍了其广泛的应用,尤其是在欠发达地区。尽管有许多临床方法可用,但其有效性仍受到多种因素的限制。首先,现有技术的高假阳性和假阴性率会导致不必要的治疗或未能诊断实际疾病;其次,组织活检等侵入性操作会造成重大的身体创伤,放射性成像技术的使用可能会使患者面临辐射风险;第三,某些肿瘤筛查测试的高成本使其经济不可行,这使得这些测试对于大多数人来说不可行或难以获得;最后,现有的方法无法同时检测高发性肿瘤,需要为每种肿瘤类型制定特定的筛查方案,这使得这些筛查对于无症状个体来说难度较大,同时费用昂贵。为克服这些挑战,必须开发一种新的肿瘤筛查技术,该技术需精准、经济、安全,并能涵盖多种癌症类型,从而使其能够广泛应用于大众中。
目前,癌症诊断依赖于包括成像和组织病理分析方面的方法或者诸如结肠镜检查、乳腺X线摄影、低剂量计算机断层扫描(LDCT)和宫颈抹片等筛查程序,活检也通常用于诊断癌症和评估治疗反应,且已经证明可以减少特定癌症的死亡率。但上述方法普遍具有显著的风险,并且在资源有限的情况下可能对早期癌症不敏感。尤其是随着人们健康意识的提高,无创诊断技术在临床应用中受到越来越广泛的关注。与传统诊断技术相比,无创诊断具有无创、快速、可重复性好等优点,能够为临床医生提供更加准确、及早、全面的诊断信息。然而,当前无创诊断技术的局限性依然存在,如检测灵敏度和特异性等方面仍然需要进一步提高。因此,本领域需要一种微创的、多癌症筛查测试来早期检测多种癌症类型。
基于血液的液体活检技术,可以采样循环DNA、RNA、蛋白质和细胞外囊泡(EVs),具有检测癌症早期、更易治愈的潜力,并且是一种最小侵入性和敏感的方法,但目前技术面临着许多挑战。目前,唯一被广泛采用的早期癌症血液检测方法依赖于测量前列腺特异性抗原的水平,其适当使用仍是一个持续争议的议题。循环肿瘤DNA(ctDNA)有望用于非侵入性肺癌分子分析,但在早期疾病的灵敏度方面存在限制。如CancerSEEK和Tumour-educatedblood platelet(TEP)的液体活检可以检测多种癌症类型,但却存在成本昂贵的问题,而且需要专门的实验室和熟练的人员来解释结果。而WB和ELISA等外泌体检测技术具有灵敏度低、成本高、操作不便等缺点。因此,寻找易于操作和具有区分早期癌症类型的低成本液体活检循环生物标志物是非常有价值的。
外泌体是一种重要的细胞外囊泡,具有丰富的生物学功能和多种功能性分子,能够释放多种功能性分子,包括DNA、RNA、蛋白质等,这些分子在肿瘤发生和发展中起着重要的作用。因此,外泌体作为一种新型的肿瘤标志物逐渐引起了研究人员的重视。然而,目前对外泌体的研究主要集中在分离和纯化技术、外泌体内分子的筛选和鉴定等方面,对外泌体表面标志物的研究还相对较少。
细胞外囊泡(EVs)包含其母细胞的分子特征,包括膜和胞内核酸、脂质和蛋白质。肿瘤来源的EVs是液体活检的有希望的生物标志物,因为它们在血液循环中的浓度高(每毫升高达1011个)且稳定。最近的研究表明,肿瘤细胞释放的EV生物标志物可以提供一种非侵入性、经济实惠的手段来早期检测癌症。而所需模型预测,随着人体肿瘤每增加一个立方毫米,相应的每毫升血液中23-1900个ctEV的增加是可以预期的。数据表明,在最敏感的测定中,仅通过1毫升的血液样本可能检测到小于1mm3的肿瘤。然而,由于非特异性背景信号和所有循环肿瘤EV上缺乏癌症特异性标记,大多数批量测定(如Western blot和ELISA)不太可能检测到小于约1cm3的肿瘤。单个囊泡分析为解决这些敏感性问题提供了最佳机会,同时通过识别唯一亚群的EV上的多个癌症标记来增加特异性。但是,同样受限于液体活检的诊断敏感性,到目前为止,尚未确定一种在EV上表现出高灵敏度且能够检测多种肿瘤,特别是早期肿瘤的可靠肿瘤生物标志物。
发明内容
为此,本发明所要解决的技术问题在于提供一种适用于多癌种筛查和/或诊断的生物标志物,将其作为肿瘤的生物标志物进行多癌种的筛查及诊断;
本发明所要解决的第二个技术问题在于提供上述生物标志物用于制备适用于多癌种筛查的产品的用途;
本发明所要解决的第三个技术问题在于提供一种通过检测外泌体表面的生物标志物进行多癌种肿瘤的筛查和诊断的产品,该方法基于外泌体在肿瘤发生过程中的重要作用,针对外泌体表面标志物的特异性,将其作为肿瘤的生物标志物进行检测。
为解决上述技术问题,本发明所述的一种用于筛查、诊断多种癌症的生物标志物,所述生物标志物包括磷酯酰丝氨酸(PS)和溶酶体相关膜蛋白-3(CD63)。
具体地,所述用于筛查、诊断早期癌症的生物标志物,所述生物标志物来源于外泌体;
优选地,所述生物标志物来源于尿液或血液中。
在本发明方案中,外泌体样品可以通过尿液、血液等体液中获得,处理过程主要包括离心、超声破碎等常规步骤。
本发明还公开了一种检测上述生物标志物的产品的应用,包括下列任一应用:
(1)在用于制备早期筛查或辅助筛查多种癌症产品的应用;
(2)在用于制备早期诊断或辅助诊断多种癌症产品的应用;
(3)在用于制备评估癌症患者患病风险的产品的应用;
(4)在用于制备评估癌症患者预后效果的产品的应用;
(5)在用于制备预测治疗癌症药物效果的产品的应用。
具体地,所述生物标志物适用的癌症种类包括肝癌、胰腺癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌或胃癌中的一种或多种。
具体地,所述的产品为试剂、试剂盒或基因芯片。
优选地,所述的试剂包括磷酯酰丝氨酸(PS)的抗体和溶酶体相关膜蛋白-3(CD63)的抗体、蛋白和/或多肽。
优选地,所述试剂盒包括用于检测生物标志物表达水平的试剂,所述基因芯片包括用于检测生物标志物的组合物的表达水平的探针,所述的生物标志物包括磷酯酰丝氨酸(PS)和溶酶体相关膜蛋白-3(CD63)。
本发明还公开了一种用于诊断或辅助诊断、筛查或辅助筛查早期多种癌症的系统,包括:
检测装置,所述检测装置用于测定生物样品中外泌体表面磷酯酰丝氨酸(PS)和/或溶酶体相关膜蛋白-3(CD63)水平和/或含量;
判断装置,所述判断装置用于基于所述生物样品中外泌体表面磷酯酰丝氨酸(PS)和/或溶酶体相关膜蛋白-3(CD63)水平和/或含量,进行诊断或辅助诊断、筛查或辅助筛查待测人是否患有相关癌症。
本发明还公开了上述系统的使用方法,包括如下步骤:
(1)收集外泌体样品并进行预处理;
(2)将所述检测试剂与外泌体表面标志物PS和CD63相结合;
(3)检测所述试剂与外泌体表面标志物PS和CD63的结合情况;
(4)根据检测结果进行筛查或诊断结果的判断。
具体地,本发明的方法首先从患者的血液或其他体液中提取外泌体,然后利用标准的分离和纯化技术得到纯净的外泌体样品。接下来,对外泌体表面的标志物PS和CD63进行检测和定量分析,以判断患者是否患有癌症。
具体地,所述的使用方法:
所述步骤(1)中,所述预处理步骤包括超速离心、密度梯度离心、超滤法、柱层析、色谱法、免疫磁珠微球法、沉淀法或超声破碎;和/或,
所述步骤(3)中,所述检测方法包括流式细胞仪检测或免疫发光法。需要说明的是,由于外泌体样品中的标志物浓度通常很低,因此在本方法中需要使用高灵敏度的检测方法,如流式细胞仪或者免疫发光等方法。
有益效果
1、本发明通过筛选全新的标志物组合,即以外泌体表面磷酯酰丝氨酸(PS)和CD63为生物标志物,可以实现对多种癌种进行筛查和诊断,显著优于现有标志物的结果。本发明所述方案不仅能够实现对多种癌种进行无创、快速、方便的诊断,同时具有高灵敏度和高特异性的特点,能够在肿瘤的超早期或早期进行诊断,有望成为一种新型的肿瘤无创诊断技术。
2、本发明特别适用于常见高发肿瘤的筛查和诊断,如肺癌、乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌等。通过对大量的临床样本进行分析和验证,本发明的研究人员发现,外泌体表面标志物PS和CD63组合具有高度的特异性和灵敏性,能够有效地区分癌症患者和健康人群。
3、本发明结合流式细胞仪或者免疫发光等高灵敏度的检测方法,实现了对外泌体表面标志物的快速、准确检测,为肿瘤的筛查和诊断提供了一种新的、高效的方法,有效解决了外泌体样品中的标志物浓度较低的缺陷,同时可以避免误诊和漏诊等问题的出现。
4、本发明提供了一种新的基于血液检测进行多种癌种早期筛查或诊断的方式,可以称为CD63+PS+EV-CancerDx(基于CD63+PS+外泌体的多种癌症检测),并进一步基于流式细胞术检测细胞外囊泡表面脂质,这种方法既方便又快速、成本也很低,有效解决了多癌种的早期筛查和诊断,具有特异性高、结果准确性高的优势。在分析超过2,000个样本时,该测试表现出高度的灵敏度和特异性,并在三个独立中心进行的盲测中展现出极高的准确性。
5、本发明通过脂质组学的研究揭示了一种潜在的多种癌症诊断的生物标志物。具体来说,本发明发现细胞外囊泡表面的CD63+PS+外泌体数量作为癌症诊断标志物具有潜在价值。本发明方案分析了来自1000多名患有六种高风险类型癌症I-III期的血清样本,以及300名健康对照组,发现CD63+PS+外泌体具有90%的灵敏度和特异性,使其成为一个有前途的癌症诊断生物标志物。在三个独立中心,分别观察到生物标志物的诊断准确率分别为90%、90%和85%(图10,包括癌症患者、健康个体和干扰因素)。此外,为了研究CD63+PS+外泌体与肿瘤生长之间的关系,本发明方案利用了六种小鼠移植肿瘤模型,结果显示CD63+PS+外泌体与肿瘤生长密切相关,并且手术后CD63+PS+外泌体显著减少。这些发现进一步凸显了CD63+PS+外泌体作为敏感的癌症生物标志物的潜在价值。
本发明所述方案提出了一种新的癌症诊断技术,它依赖于血清中CD63+PS+阳性EV的数量作为诊断生物标志物。本发明方案基于液体活检技术在多个中心验证的1500多个样本中表现出令人印象深刻的超过90%的准确性。本发明所述方案仅需要1毫升的血液,可以在2-3小时内完成,并具有极低的测试成本(每个测试约1美元成本)。此外,通过已经在六个主要肿瘤样本中进行的大规模的验证以及在至少五种其他肿瘤类型的小规模验证中表现出了高度的准确性。值得注意的是,本发明所述方法具有早期癌症筛查的显著潜力,随后进行外科手术治疗。本发明研究结果揭示了该技术在未来作为大规模癌症筛查应用的可行性和实用性,对癌症诊断领域做出了重要贡献,并有可能改善患者预后。
本发明所述方法开发了一种基于流式细胞术的简便EV检测方法,具有如下优点:首先,它通过使用直接结合到标记的抗体或蛋白质来直接定量特定标记的EV数量,从而实现准确可靠的定量而不依赖扩增;其次,当使用流式细胞术时,无需依赖EV结合到大粒子微球,可以进行单个EV分析;第三,它不需要纯化EV来检测循环EV,而是可以在两步低速离心去除细胞碎片后直接分析单个EV,使其成为一种方便快速的方法;第四,它可以同时分析多达10个标记,在不超过1美元的每次分析成本和不超过60分钟的时间要求下,使用不超过1毫升的血液体积。本发明所述方法不仅易于实施,可实现早期癌症检测的更广泛应用,可以在临床实验室中扩大规模应用。
本发明所述方法为使用单次血液检测同时筛查多种癌症类型奠定了概念和实践基础。本发明所述方法估计的检测成本为1美元,远远低于其他单种癌症筛查方法(如CT或内窥镜),因此有望成为在人口众多的发展中国家进行癌症筛查的潜在选择。本发明研究中针对的六种高发癌症类型占全球癌症死亡率的60%,因此早期筛查这些癌症可能会导致死亡人数的显著减少。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解,下面根据本发明的具体实施例并结合附图,对本发明作进一步详细的说明,其中,
图1为多种细胞系提取外泌体表征结果;
图2为不同细胞系超高效液相色谱-质谱联用检测结果;
图3为本发明具体检测流程示意图;
图4为不同细胞系检测CD63+PS+EVs结果;
图5为实施例2中患者相关检测结果;
图6为实施例3中癌症I-III期患者样本采用CD63+PS+EV-CancerDx的检测结果;
图7为实施例3中非癌症干扰患者样本CD63+PS+外泌体的检测结果;
图8为实施例4中循环的CD63+PS+外泌体反映了癌症负荷结果;
图9为实施例5中动物模型采用CD63+PS+EV-CancerDx的检测结果;
图10为实施例6中针对CD63+PS+外泌体在癌症诊断中的三家医院独立盲法结果。
具体实施方式
实施例1 CD63+PS是多种癌细胞外囊泡的特异性标记物
本实施例从八种人类常见癌细胞(胰腺癌细胞系PANC1、结肠癌细胞系HCT-116、宫颈癌细胞系Hela、肺癌细胞系A549、乳腺癌细胞系MCF-7、肝细胞癌细胞系HepG2、膀胱癌细胞系5637和胃癌细胞系MKN45)和五种非肿瘤人类细胞(293T胚胎肾细胞系、LO2正常肝细胞系、MRC-5胚肺成纤维细胞系、HPNE胰管细胞系和HBE支气管上皮细胞系)中,通过连续超速离心法(SUC)分离细胞外囊泡(EVs)。
本实施例通过纳米颗粒跟踪分析、透射电子显微镜(TEM)和免疫印迹等方法,对异质性EVs进行了大小范围(30-200 nm)、EV蛋白标记和形态表征,通过超高效液相色谱-质谱联用(UPLC-MS)评估EV的脂质组成。
本实施例中,所述纳米颗粒跟踪分析具体操作如下:
A:用过滤之后的PBS将所有外泌体蛋白的浓度调整至5μg/ml,混匀备用;
B:将外泌体稀释100-500倍后用0.22μm滤器过滤;
C:仪器组装参数调整完毕后,将外泌体缓缓注入样品池,这个过程尽可能保持桌面平稳,动作缓慢避免产生气泡;
D:待液流平稳后,以30桢/秒的速度记录3次,利用计算机分析技术获取最终的外泌体粒径和数量。
本实施例中,所述透射电子显微镜分析具体操作如下:
A:将新鲜制备好的外泌体置于洁净的封口膜上;
B:将载网的膜面放在外泌体液滴上,悬浮10min后用滤纸吸干;
C:转移载网至2.5%戊二醛液滴上,悬浮5min后用滤纸吸干;
D:将载网转移至去离子水液滴上,悬浮2min后用滤纸吸干,此操作重复10次;
E:转移载网至40g/L醋酸双氧铀液滴上,悬浮10min后用滤纸吸干;
F:转移载网至10g/L甲基纤维素液滴上,悬浮5min后用滤纸吸干;
G:自然晾干30min后使用透射电镜记录成像。
本实施例中,所述免疫印迹具体操作如下:
A:测定新鲜提取的外泌体蛋白浓度,并调整至1μg/μL,加入1/5体积的5×SDS上样缓冲液,充分混合均匀后置于金属浴上加热5min;
B:将30μg总蛋白加入到对应的泳道中,两边加上蛋白marker。恒压80 V电泳至样本进入分离胶,恒压120V电泳至对应蛋白位置,停止电泳;
C:以“海绵-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵”的三明治夹心层顺序固定好转膜夹,整个过程应尽量避免产生气泡,向转膜槽中加入预冷的缓冲液和冰袋,整个装置置于低温环境中,转膜过程中设定恒流电流300mA,转膜时间设定为1h10min;
D:将PVDF膜取出浸泡到封闭液里,室温放置于摇床上轻摇1h,将封闭结束的PVDF膜浸泡在一抗中于4℃过夜孵育;
E:TBST缓冲液洗尽未结合的抗体,整个过程注意保持PVDF膜湿润的环境,220rpm摇床充分洗涤,15min一次,洗4次,将PVDF膜小心放入二抗中,室温轻摇1h;
F:用TBST溶液在220rpm摇床上清洗条带,10min一次,洗3次,使用Thermo的Supersignal West Pico化学发光底物,利用曝光机器或者胶片显影。
本实施例中,所述超高效液相色谱-质谱联用操作步骤如下:
样品采用UHPLC Nexera LC-30A超高效液相色谱系统进行分离,使用C18色谱柱;
柱温控制在45℃;
流速为300μL/min;
流动相组成:A-乙腈水溶液(乙腈:水=6:4,v/v),B-乙腈异丙醇溶液(乙腈:异丙醇=1:9,v/v);
梯度洗脱程序如下:0-2 min,B维持在30%;2-25 min,B从30%线性变化至100%;25-35min,B维持在30%。整个分析过程中样品置于10℃自动进样器中。为避免仪器检测信号波动而造成的影响,采用随机顺序,进行样本的连续分析。
本实施例中,外泌体的具体表征结果如附图1所示,纳米颗粒追踪分析显示正常细胞和肿瘤细胞分泌的外泌体粒径均在30-200nm之间(如图1中a),免疫印迹(Western-blot)显示在正常细胞和肿瘤细胞分泌的外泌体上都检测到了外泌体特异性标志蛋白CD63、CD9、TSG101和HSP70的存在,在所有外泌体中均未检测到外泌体阴性蛋白Calnexin的存在(如图1中b),通过外泌体负染,透射电子显微镜显示在肿瘤细胞和正常细胞来源的外泌体上均观察到了具有双层膜的茶托状结构,且粒径均在100 nm左右(如图1中c)。
脂质组学分析显示,33种脂质在癌细胞外囊泡中异位表达(见图2)。可见,磷脂酰丝氨酸(PS)是一种生物相容性磷脂,在细胞膜中发挥重要作用。PS在生物pH下呈负电荷,在不同细胞器膜上的浓度不同。PS在双层膜上不对称分布,在内侧叶片中的浓度较高。在某些生理条件下,如在凋亡的早期阶段,PS可从内质膜迁移至外侧,作为吞噬细胞吞噬凋亡细胞的信号,肿瘤细胞也会在表面暴露PS。
但是,本实施例研究也发现,现有的提取和定量EVs的方法不实用,可用的技术如ELISA、Western blot和磁珠流式细胞术分析仅限于大量EV分析,因此限制了EVs的实际临床应用。本实施例中,为了实现对单个EV的表面生物标志物方便准确的定量,选择了基于常用临床设备--流式细胞仪的新型检测技术。该方法旨在克服当前的限制,并使EVs能够在临床上应用。
本实施例中,对于血清、血浆或细胞上清样品,首先使用2000g的低速离心法除去大颗粒碎片并获得上清液,然后在流式细胞仪上使用不同尺寸的微球建立标准的颗粒大小校准曲线,并画出小于500nm的粒子区域,随后使用荧光抗体针对常见的EV标记CD63标记EVs,并在小于500nm的颗粒中筛选CD63阳性颗粒以识别EVs。
本实施例中,使用磷脂酰丝氨酸专一结合的蛋白质--Annexin-V进行标记了EVs,所得信号代表PS阳性EVs的数量或比例(见图3)。该分析技术(基于低速离心的单个EV流式细胞仪,LC-sEVFC)不仅减少了当前EV提取过程中繁琐的步骤,无需高速离心,而且能够精确定量单个EV表面标记物。
本实施例使用LC-sEVFC技术进行了相应的分析,进而发现来自五种不同类型的正常细胞的EVs中,每1万个颗粒中有3.0-6.0个CD63+PS+EVs,而来自八种肿瘤细胞的EVs中每1万个颗粒中有10.0-30.0个CD63+PS+EVs(见图4中a)。这些发现表明,与正常细胞相比,来自肿瘤细胞的CD63+PS+EVs数量显著增加。此外,为了模拟体内固体肿瘤所特有的丰富的细胞凋亡,我们诱导肿瘤细胞凋亡,并观察到来自肿瘤细胞的CD63+PS+ EVs数量显著增加(见图4中b),表明肿瘤细胞可能会释放更多的CD63+PS+ EVs进入血液循环。
实施例2
本实施例继续从诊断为乳腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、结直肠癌和胰腺癌的患者中分离血清样品,每组n=50,使用LC-sEVFC分析健康献血者的血清样品,如图5中a所示结果,显示CD63+PS+外泌体的基线数量在每1万个粒子中为0-15,平均为8个,展示出比健康献血者更高数量的CD63+PS+外泌体(P<0.0001)。
根据上述分析结果,绘制受试者工作特征(ROC)曲线如图5中b所示,结果显示,CD63+PS+外泌体与多种癌症之间有强相关性。具体而言,乳腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、结直肠癌和胰腺癌的曲线下面积(AUC)分别为0.931、0.932、0.946、0.848、0.981和0.933。可见,本发明选择CD63+PS+外泌体与多种癌症之间有强相关性较高。
实施例3
本实施例进一步针对1005例已被诊断为I-III期的乳腺、肺、胃、肝、结直肠、胰腺患者的研究,采用了循环的CD63+PS+外泌体检测。
在采集血样之前,这些患者均未接受新辅助化疗,并且在入组时没有明显的远处转移。诊断时的中位年龄为64岁(范围为22至93岁)。本实施选择上述六种癌症类型,因为它们在人群中很普遍,而且目前常规临床使用的早期检测的血液检测方法并不存在。
在初诊时,根据美国癌症联合委员会(AJCC)的标准,最常见的癌症分期为II期,占49%的患者,其余患者为I期(20%)或III期(31%)疾病。健康对照组包括812名年龄中位数为55岁(范围为17至88岁)且没有已知的癌症、高级别异型增生、自身免疫性疾病或慢性肾脏疾病史的个体。
绘制整个癌症患者组和对照组的ROC曲线如图6中a所示。如图6中b所示结果,在六种癌症类型中,CD63+PS+EV-CancerDx的中位灵敏度为92%,在肺癌中为96%,在乳腺癌中为94%。
在特异性方面,CD63+PS -PE-CancerDx测试表现出很高的准确性,其特异性大于99%,表明只有812名健康个体中的7人被错误地识别为阳性。虽然这些个体可能有未检测到的癌症,但将其归类为假阳性是最保守的方法。筛查测试的一个关键特征是其能够在早期检测癌症。如附图6中c所示结果,CD63+PS+EV-CancerDx测试对于最常见的分期(II期)的中位灵敏度为91%,对于III期癌症为96%,对于I期癌症为77%。
此外,本实施例通过收集一个干扰组,包括100名参与者,其中包括肺炎(n=15)、肝炎(n=16)、胰腺炎(n=14)、糖尿病(n=15)、SLE(n=20)和干燥综合征(n=20)等患者,进一步量化了CD63+PS+外泌体的数量,并发现与健康个体相比没有显着差异(如图7所示结果)。这些结果均表明,本实施选择的生物标志物即外泌体中CD63+PS+的水平具有良好的特异性。
实施例4 循环CD63+PS+外泌体反应了癌症负荷
本实施例中,进一步试图评估癌症患者术前和术后(术后第7天)血清中的CD63+PS+外泌体的情况;其中,胃癌n=42,肝癌n=25和结直肠癌n=24,结果表明,三种肿瘤患者术后血清中CD63+PS+外泌体数量明显降低,具体结果见附图8中a。
此外,本实施例进一步进行了传统液态活检标记物,包括CA19-9、CEA和AFP与CD63+PS+外泌体的诊断性能比较分析,结果见附图8中b。结果表明,与术前的CA19-9和CEA相比,CD63+PS+外泌体在胃癌和结直肠癌的诊断准确性方面表现出优越性,在肝癌诊断方面也胜过AFP。
实施例5
为了进一步确定循环CD63+PS+外泌体的来源是肿瘤细胞,并与肿瘤大小变化相关,本实施例设计了六种小鼠异种移植模型,并采用CD63+PS+EV-CancerDx进行检测。由于肿瘤形成时间的差异,首先在乳腺癌、肺癌、胃癌和肝癌模型中,分别在移植肿瘤前和移植后7、14和21天采集了小鼠血样,在第21天,摘除小鼠肿瘤,摘除后一周(第28天)采集血样。
如附图9中a-e所示结果显示,在乳腺癌、肺癌、胃癌和肝癌模型中,在肿瘤移植前,血液中无法检测到CD63+PS+外泌体。然而,在肿瘤移植后,随着肿瘤生长,血液中的CD63+PS+外泌体浓度显著增加,于第7天出现明显升高并于第21天达到峰值。相关分析表明,血液中的CD63+PS+外泌体水平与肿瘤生长呈正相关。值得注意的是,手术后7天(第28天),血液中CD63+PS+外泌体浓度明显降低,正如预期的那样。
如附图9中f-h所示结果,在结肠癌和胰腺癌模型中,在小鼠移植肿瘤前和移植后7、14、21和28天采集血样。在第28天,摘除小鼠肿瘤组织,并在第35天采集血样。与其他癌症模型观察到的结果类似,血液中的CD63+PS+外泌体浓度随着肿瘤生长显著增加,并在第28天达到峰值。相关分析显示,血液中的CD63+PS+外泌体浓度与肿瘤生长呈正相关。与其他癌症模型中的观察一致,手术后7天血液中CD63+PS+外泌体浓度显著降低。这些结果确认了循环CD63+PS+外泌体确实来自肿瘤细胞,并且它们的浓度在肿瘤早期发展阶段显著增加,与肿瘤生长密切相关。
实施例6
本实施例为了进一步证明CD63+PS+外泌体在癌症诊断中的准确性和稳定性,进行了三项盲测试以寻找相关性。
样本1由南京鼓楼医院提供,包括103名癌症患者;样本2由浙江省肿瘤医院提供,包括144名已确诊癌症的患者;样本3由连云港第一人民医院的前瞻性队列研究中选择的105名患者的样本组成,检测结果见附图10。
检测结果显示,本实施例进行的三家医院的盲样本分析表明,与健康人群对照组相比,CD63+PS+外泌体在肿瘤组中明显升高。本实施例的ROC分析进一步确认了三家医院分别为0.97、0.99和0.89的曲线下面积。这些发现有助于支持CD63+PS+外泌体在不同类型癌症诊断中的准确性和稳定性。
显然,上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例,而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种用于筛查、诊断多种癌症的生物标志物,其特征在于,所述生物标志物包括磷酯酰丝氨酸(PS)和溶酶体相关膜蛋白-3(CD63)。
2.根据权利要求1所述用于筛查、诊断多种癌症的生物标志物,其特征在于,所述生物标志物来源于外泌体;
优选地,所述生物标志物来源于尿液或血液。
3.检测权利要求1中生物标志物的产品的应用,包括下列任一应用:
(1)在用于制备早期筛查或辅助筛查多种癌症产品的应用;
(2)在用于制备早期诊断或辅助诊断多种癌症产品的应用;
(3)在用于制备评估癌症患者患病风险的产品的应用;
(4)在用于制备评估癌症患者预后效果的产品的应用;
(5)在用于制备预测治疗癌症药物效果的产品的应用。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述的癌症种类包括肝癌、胰腺癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌或胃癌中的一种或多种。
5.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述的产品为试剂、试剂盒或基因芯片。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述的试剂包括磷酯酰丝氨酸(PS)的抗体和溶酶体相关膜蛋白-3(CD63)的抗体、蛋白和/或多肽。
7.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述试剂盒包括用于检测生物标志物表达水平的试剂,所述基因芯片包括用于检测生物标志物的组合物的表达水平的探针,所述的生物标志物包括磷酯酰丝氨酸(PS)和溶酶体相关膜蛋白-3(CD63)。
8.一种用于诊断或辅助诊断、筛查或辅助筛查多种癌症的系统,其特征在于,包括:
检测装置,所述检测装置用于测定生物样品中外泌体表面磷酯酰丝氨酸(PS)和溶酶体相关膜蛋白-3(CD63)水平和/或含量;
判断装置,所述判断装置用于基于所述生物样品中外泌体表面磷酯酰丝氨酸(PS)和溶酶体相关膜蛋白-3(CD63)水平和/或含量,进行诊断或辅助诊断、筛查或辅助筛查待测人是否患有相关癌症。
9.权利要求8所述系统的使用方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)收集外泌体样品并进行预处理;
(2)将所述检测试剂与外泌体表面标志物PS和CD63相结合;
(3)检测所述试剂与外泌体表面标志物PS和CD63的结合情况;
(4)根据检测结果进行筛查或诊断结果的判断。
10.根据权利要求9所述的使用方法,其特征在于:
所述步骤(1)中,所述预处理的步骤包括超速离心、密度梯度离心、超滤法、柱层析、色谱法、免疫磁珠微球法、沉淀法或超声破碎;和/或,
所述步骤(3)中,所述检测的方法包括流式细胞仪检测或免疫发光法。
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