CN111060688A - 胃肠道恶性肿瘤循环肿瘤细胞检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了胃肠道恶性肿瘤循环肿瘤细胞检测试剂盒及检测方法，包括CTCs分离试剂和CTCs鉴定试剂；CTCs分离试剂包括偶联EpCAM和CSV单克隆抗体包被的免疫磁珠，CTCs鉴定试剂包括封闭液、缓冲液、固定液、透化液、染色液和封片剂。将CTCs分离试剂与含有CTCs的血液样本混合，得到分离的CTCs；将分离的CTCs与CTCs鉴定试剂混合，观察细胞染色情况，计算血液样本中的CTCs数目。本发明可同时对上皮性和间皮性CTCs进行分离，联合多种胃肠恶性肿瘤特异性抗体对富集后的细胞进行鉴定，比单一使用CK抗体的敏感度更高。大部分患者能捕捉到数十至数百个CTCs，与现有临床检测方法相比，CTCs捕捉效率大幅提升，为CTCs下游分子分析奠定了物质基础。

Description

胃肠道恶性肿瘤循环肿瘤细胞检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及细胞染色检测领域，尤其涉及的是一种胃肠道恶性肿瘤循环肿瘤细胞检测试剂盒及检测方法。
背景技术
现有技术中，胃肠道恶性肿瘤是我国临床最常见消化系统恶性肿瘤，其发病率和死亡率远高于世界平均水平，且呈发病率和年轻化双线升高趋势。影响胃肠道恶性肿瘤预后的重要指标之一是肿瘤分期，早期胃肠道恶性肿瘤经治疗后，患者的5年存活率可达90～95％以上，但由于胃肠道恶性肿瘤发病早期70％以上患者无明显症状，在我国胃肠道恶性肿瘤早期检出率仅不足10％，绝大多数患者确诊时已为中晚期，此时肿瘤极易发生血管与淋巴管转移，疗效与预后较差，5年生存率长期徘徊在10％左右。
目前，胃肠道恶性肿瘤常规临床检测手段有超声、X射线、血清肿瘤标志物、内镜、CT、组织活检等，但传统的检测方法和技术很难发现早期和微小转移病灶，例如影像学无法发现早期微转移；骨扫描发现转移病灶时，疾病已进展至晚期；肿瘤评分和临床分期的综合判断只能判断预后，无法实时提示肿瘤转移情况。CA125、CA199、CA724、CEA等血清肿瘤标志物已经普遍应用于疗效和复发监控，然其肿瘤标志物的敏感性、特异性、有效性较低，因而无法为医师提供准确的检测依据。因此，迫切需要寻找一种实时监测的新型标志物。
循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells，CTCs)主要是指进入到外周血液中的肿瘤细胞，CTCs在血液中的含量极为稀有，仅占外周血白细胞的 1/106～1/107，可随血液循环迁徙至相关组织或器官，在合适的条件下发展成肿瘤病灶，与癌症患者的临床分期、无进展生存期、总生存期、药物疗效以及早期复发和转移均密切相关。CTCs检测即利用特殊方法对外周血中的CTCs进行分离和富集，并通过细胞计数或基因水平分析等手段对获得的CTCs进行检测。大量研究表明，CTCs具有实时监测功能，对恶性肿瘤的早期诊断、预后判断、疗效评估、个体化用药指导及肿瘤转移复发监测等方面均具有重要的临床应用价值，是一种非侵入性的新型诊断标志，被称为“液体活检”。与胃肠癌常规临床检测手段相比，CTCs检测肿瘤具有灵敏度高、特异性高、准确率高、取样便捷且可多次、重复性检测等优势。
CTCs的富集方法可以分为生物化学特性富集法(亲和性富集法)和物理特性富集法。亲和性富集法主要是根据通过细胞表面特异性表达的蛋白质生物标志物分离靶细胞，包括正向捕获CTCs的阳性富集法和负向去除白细胞的阴性富集法。物理特性富集法主要是根据CTCs的大小、密度、力学和介电性能等物理特性将CTCs筛选出来。
与普通血细胞相比，CTCs具有某些特殊的生物标志物，包括CTCs表面的上皮细胞粘附分子(Epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)、细胞角蛋白 (Cytokeratin，CK)以及肿瘤特异性抗原，而血液中几乎所有的细胞都是反磁性或弱磁性的，利用肿瘤细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单克隆抗体相结合，继而在外加磁场中通过相应抗原抗体复合物与磁珠吸附而滞留在磁场中或定向移动到指定区域，没有表面抗原的其它细胞由于不能与连接磁珠的特异性单克隆抗体结合而不能在磁场中停留，从而使肿瘤细胞得以从血液中分离出来。截至目前为止，免疫磁珠CTCs分离技术是全球唯一一个被美国食药监局(FDA)和中国国家药品监督管理局(NMPA)批准应用与临床诊断的技术。
然而，该方法的敏感性一定程度上受到CTCs表面抗原表达的制约。独采用 EpCAM抗体捕获CTCs，由于EpCAM在CTCs的表达率一般为60-70％，往往会丢失部分CTCs；单一的CK抗体也不能完全识别癌细胞表达的所有CKs；在 CTCs上皮间质化过程中，一些基于标准化上皮标志物的筛选抗体无法检测出所有CTCs等等。这一切都受到目标抗原的表达量与特异性以及与相应抗体的结合能力影响。以上各种因素导致CellSearch对CTCs富集效率较低，绝大部分临床样本仅能检测出数个CTCs，这一方面导致检测的敏感性较低，另一方面，在细胞量如此少的情况下，很难进行下一步深入分子分析。因此，研发富集效率更高的CTCs检测技术、进一步提高CTCs检测敏感度对CTCs检测技术的进一步应用于临床至关重要。
因此，现有技术存在缺陷，需要改进。
附图说明
图1为本发明的CTCs检测胃肠道恶性肿瘤的ROC曲线图。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种胃肠道恶性肿瘤循环肿瘤细胞检测试剂盒及检测方法，通过分离和鉴定两个步骤，将多种胃肠道恶性肿瘤细胞特异性抗体组合使用，提高循环肿瘤细胞检测的敏感度。
本发明的技术方案如下：一种胃肠道恶性肿瘤循环肿瘤细胞检测试剂盒，包括CTCs分离试剂和CTCs鉴定试剂；所述CTCs分离试剂包括偶联EpCAM 和CSV单克隆抗体包被的免疫磁珠，所述CTCs鉴定试剂包括封闭液、缓冲液、固定液、透化液、染色液和封片剂。
采用上述技术方案，所述的胃肠道恶性肿瘤循环肿瘤细胞检测试剂盒中，所述染色液包括多种免疫荧光染色单克隆抗体。
采用上述各个技术方案，所述的胃肠道恶性肿瘤循环肿瘤细胞检测试剂盒中，所述免疫荧光染色单克隆抗体为CK、CEA、CA72-4、CD45。
采用上述各个技术方案，所述的胃肠道恶性肿瘤循环肿瘤细胞检测试剂盒中，所述封片剂含有细胞核染料。
采用上述各个技术方案，所述的胃肠道恶性肿瘤循环肿瘤细胞检测试剂盒中，所述细胞核染料为DAPI。
一种胃肠道恶性肿瘤循环肿瘤细胞检测方法，包括如下步骤：
S1、CTCs分离：将CTCs分离试剂与含有CTCs的血液样本混合，使免疫磁珠与CTCs结合，去除液体后得到分离的CTCs；
S2、CTCs鉴定：将分离的CTCs与CTCs鉴定试剂混合，观察细胞染色情况，计算血液样本中的CTCs数目。
采用上述技术方案，所述的胃肠道恶性肿瘤循环肿瘤细胞检测方法中，所述S2中，还包括如下步骤：
S21、将分离后的CTCs加入固定液；
S22、去除固定液，加入缓冲液洗涤；
S23、去除缓冲液，加入封闭液；
S24、去除封闭液，加入透化液；
S25、去除透化液，加染色液；
S26、去除染色液，加入缓冲液洗涤；
S27、洗涤后的CTCs再加入缓冲液，并转移到载玻片上；
S28、去除缓冲液，滴加一滴封片剂，盖上盖玻片，用指甲油封片。
S29、在荧光显微镜下观察细胞染色情况，计算CK/CEA/CA7-24+、CD45-、 DAPI+细胞的总数目，作为样本中CTCs细胞的数目。
采用上述各个技术方案，所述的胃肠道恶性肿瘤循环肿瘤细胞检测方法中，所述S21中，固定液为50μl；所述S22中，缓冲液为100μl；所述S23中，封闭液为50μl；所述S24中，透化液50μl；所述S25中，染色液为50μl；所述S26 中，缓冲液为100μl；所述S27中，缓冲液为50μl。
采用上述各个技术方案，所述的胃肠道恶性肿瘤循环肿瘤细胞检测方法中，所述S21中，固定时间为20min；所述S22中，缓冲液洗涤一次，且洗涤后直接进入S23或4℃保存；所述S23中，封闭时间为5min；所述S24中，透化时间为5min；所述S25中，染色液中的CK、CEA、CA72-4和CD45的稀释比例为1:100；所述S26中，缓冲液洗涤两次。
采用上述各个技术方案，本发明与现有单一EpCAM标记物CTCs富集技术相比，可同时对上皮性和间皮性CTCs进行分离，将大大提高CTCs富集技术的分离效率。联合多种胃肠恶性肿瘤特异性抗体对富集后的细胞进行鉴定，比单一使用CK抗体的敏感度更高。胃肠道恶性肿瘤患者外周血中CTCs水平随临床分期升高呈升高趋势。大部分患者能捕捉到数十至数百个CTCs，与现有临床检测方法相比，CTCs捕捉效率大幅提升，为CTCs下游分子分析奠定了物质基础。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
本发明中，各缩略语和关键术语定义为：
CTCs：循环肿瘤细胞
EpCAM：上皮细胞粘附分子
CK：角蛋白
CSV：细胞表面波形蛋白
CEA：癌胚抗原
CA7-24：肿瘤标志物糖类抗原
CD45：白细胞共同抗原
DAPI：4',6-二脒基-2-苯基吲哚
实施例一
本实施例提供了胃肠道恶性肿瘤循环肿瘤细胞检测试剂盒，包括CTCs分离试剂和CTCs鉴定试剂；所述CTCs分离试剂包括偶联EpCAM和CSV单克隆抗体包被的免疫磁珠，所述CTCs鉴定试剂包括封闭液、缓冲液、固定液、透化液、染色液和封片剂。所述染色液包括多种免疫荧光染色单克隆抗体。所述免疫荧光染色单克隆抗体为CK、CEA、CA72-4、CD45。所述封片剂含有细胞核染料。所述细胞核染料为DAPI。
根据上述试剂盒，本实施例还提供胃肠道恶性肿瘤循环肿瘤细胞检测方法，包括如下步骤：
S1、CTCs分离：将CTCs分离试剂与含有CTCs的血液样本混合，使免疫磁珠与CTCs结合，去除液体后得到分离的CTCs；
S2、CTCs鉴定：将分离的CTCs与CTCs鉴定试剂混合，观察细胞染色情况，计算血液样本中的CTCs数目。
优选的，在上述S1步骤中，其具体详细的步骤为：
(1)血样的处理及上机样本制备
1)通过常规手臂静脉采血的方式，使用真空采血管采集受试者外周血 7.5ml。
2)根据样本数量准备相应个数的1.5ml小离心管，各加600μl的缓冲液后置于混匀仪上混匀包被待用，4℃混匀至少一个小时。
3)根据样本数量准备相应个数的50ml Leucosep带滤膜离心管，各加入 15.2ml淋巴细胞分离液(Ficoll-PaqueTM PLUS)，室温1000×g离心1min。
4)向步骤3中50ml Leucosep带滤膜离心管中缓慢加入5ml不含钙离子与镁离子的磷酸盐缓冲液(PBS-CMF)；轻柔颠倒真空采血管使血样混匀，将血样缓慢倒入带滤膜离心管中；用5ml PBS-CMF冲洗采血管，盖上采血管管盖，轻柔颠倒混匀后倒入同一带滤膜离心管中。用5ml PBS-CMF重复上述动作一次。
5)800×g转速离心15min(需缓慢降速)。
6)将Leucosep带滤膜离心管中的大部分上清液倒入一支新的50ml普通离心管中，余留5～10ml上清液并轻轻摇晃Leucosep带滤膜离心管，确保粘在管壁内的细胞全部被涮洗下来，倒入同一50ml普通离心管中。向Leucosep带滤膜离心管中加入10mlPBS-CMF，用5ml移液枪反复冲洗管壁后吸出，加入同一50ml 普通离心管中。(注意：枪头请勿带滤膜)
7)室温300×g离心10min。
8)用真空泵小心吸除上清液，仅余留约500μl液体。
9)将离心管在实验台面上轻轻磕打，直至管底细胞团完全松散。
10)将离心管底部细胞悬液用移液枪轻柔吹打混匀，转移入步骤2已包被好的1.5ml小离心管中(分装前需将小离心管中的binding buffer吸出)。
11)向步骤10中的50ml离心管加入200μl缓冲液，轻柔涮洗管底内壁，转移入步骤10中1.5ml小离心管中。
12)向步骤10中的1.5ml小离心管加入50μl封闭液，颠倒混匀后于冰上放置5min。
13)将免疫磁珠用移液枪充分吹打重悬，取适量磁珠(每个样本需50μl，根据样本量取相应体积的磁珠)，置于新的1.5ml小离心管中，将离心管底部紧贴磁铁5s，保持磁铁紧贴在离心管上，将离心管中液体小心吸出。向小离心管中加入1ml缓冲液，将离心管底部紧贴磁铁5s，保持磁铁紧贴在离心管上，将离心管中液体小心吸出。再加入1ml缓冲液，重复上述步骤一次。用适量体积的缓冲液将磁珠重悬(每个样本需50μl，根据样本量加入相应体积的缓冲液)。
14)将免疫磁珠用移液枪充分吹打重悬之后加入步骤12中的1.5ml小离心管，每管加入50μl磁珠，颠倒混匀。
15)将小离心管紧贴在磁铁上3s，之后颠倒混匀。重复该操作5次。
16)将小离心管置于垂直混匀仪上，于4℃冰箱中旋转混匀1.5h。旋转速度为15-18转/分钟。
(2)使用Isoflux仪器进行CTCs分离
1)开机：按住开机按钮直至按钮变绿。
2)待机器完全启动后，点击屏幕上的“Run Protocol”。
3)根据样本数点击相应的样本个数选项(最多可一次运行4个样本)，样本槽会自动滑出(从左至右分别为1，2，3，4号样本槽)。
4)从包装中取出样本盒(Cartridge)，丢弃4号孔中的小管，仅留白色Holder。向2号孔(即圆柱状孔)中加入3ml缓冲液。
5)将样本盒置于样本槽中，点击屏幕上的“Prime”。
6)Prime完成后，点击“Ready to Load Sample”，此时1、2号样本盒会自动滑出。
7)从垂直混匀仪上取下待分选的样品，用枪轻柔吹打均匀加入1号孔中，加样完成后从2号空中吸取50μl缓冲液涮洗小离心管内壁后同样加入1号孔，以确保所有样本均被收集而无残余。加样完成后将样本盒按顺序放置于样本槽上。
8)点击屏幕上的“Load”，1、2号样本槽会自动滑入机器，如果本批样本数≤2，则此时CTC分选将自动开始；如果本批样本数＞2，则此时3、4号样本槽会自动滑出，依照步骤7)中的方法加样。之后点击屏幕上的“Load”，CTC 分选自动开始。
9)整个分选过程约需45min，不同样品分选所需时间稍有差别。
10)分选完成后，屏幕上显示“Extract Sample”，点击“Extract Sample”，样本槽会自动滑出。
11)将白色Holder翻转置于实验桌面上，向每个Holder中加入一滴PBS-CMF 以防止样品干燥。润洗枪头防止细胞粘黏在枪头内壁，吸取100μl PBS-CMF，滴加两滴在一支新的无核糖核酸酶的1.5ml小离心管中，用剩余的PBS-CMF重悬holder中的细胞样本，之后全部转移至小离心管中待用。
优选的，所述S2中，还包括如下步骤：
S21、将分离后的CTCs加入固定液；
S22、去除固定液，加入缓冲液洗涤；
S23、去除缓冲液，加入封闭液；
S24、去除封闭液，加入透化液；
S25、去除透化液，加染色液；
S26、去除染色液，加入缓冲液洗涤；
S27、洗涤后的CTCs再加入缓冲液，并转移到载玻片上；
S28、去除缓冲液，滴加一滴封片剂，盖上盖玻片，用指甲油封片。
S29、在荧光显微镜下观察细胞染色情况，计算CK/CEA/CA7-24+、CD45-、 DAPI+细胞的总数目，作为样本中CTCs细胞的数目。
其中，观察细胞染色并计算细胞数目的方法为：目标细胞光密度值/背景光密度值>2，即认定为该标记物阳性(+)，否则为阴性(-)，计算CK/CEA/CA7-24 这三种标记物为阳性的细胞的数目，CD45这种标记物为阴性的细胞的数目， DAPI这种标记物为阳性的细胞的数目，上述细胞的总数为CTCs细胞的数目。
优选的，所述S21中，固定液为50μl；所述S22中，缓冲液为100μl；所述 S23中，封闭液为50μl；所述S24中，透化液50μl；所述S25中，染色液为50μl；所述S26中，缓冲液为100μl；所述S27中，缓冲液为50μl。
优选的，所述S21中，固定时间为20min；所述S22中，缓冲液洗涤一次，且洗涤后直接进入S23或4℃保存；所述S23中，封闭时间为5min；所述S24 中，透化时间为5min；所述S25中，染色液中的CK、CEA、CA72-4和CD45 的稀释比例为1:100；所述S26中，缓冲液洗涤两次。
本实施例中，通过以上组合对胃肠道恶性肿瘤循环肿瘤细胞进行定量或定性检测的方法均属于本发明保护范围。
实施例二
收集胃肠道恶性肿瘤住院患者67例，经签署知情同意书后，收集其基本信息、病史资料以及入院时采集全血标本10ml，收集术后病理诊断信息进行TNM 分期(胃肠道恶性肿瘤组)。同时，招募21名健康志愿者，采集基本信息及全血标本10ml(健康志愿者组)。胃肠道恶性肿瘤组入组标准：所有临床诊断为胃肠道恶性肿瘤、拟行外科手术治疗的患者。排除标准：1.存在明显手术绝对禁忌症；2.肿瘤临床分期为Ⅳ期且放弃后续治疗的患者；拒绝接受后续观察随访的患者。本研究经医院伦理委员会审批通过。两组受试者年龄、性别指标上差异无统计学意义(均P>0.05)，见表1。胃肠道恶性肿瘤组患者术后TNM病理分期指标参照第7版美国癌症联合会标准，见表2。
抽取受试者全血10ml于EDTA-K2抗凝采血管中，轻柔颠倒混匀，避免凝血，室温下储存、运输，24小时内采用本发明胃肠道恶性肿瘤循环肿瘤细胞检测试剂盒进行CTCs检测。
两组CTCs检测结果分布，见表3。与健康志愿者组CTCs结果比较胃肠道恶性肿瘤组受试者血液CTCs水平明显升高，差异具有统计学意义(P<0.01)，且胃肠道恶性肿瘤组内部各临床分期受试者血液CTCs水平与健康志愿者组 CTCs结果比较，差异均具有统计学意义(P<0.01)。胃肠道恶性肿瘤组各临床分期受试者血液CTCs水平随临床分期升高呈升高趋势，但各组间差异无统计学意义(P>0.05)；见表3。
采用ROC曲线对CTCs的检测结果进行分析(图1)。ROC曲线确定CTCs 的临界值为≥12个CTCs/7.5ml外周血，CTCs对Ⅰ期至Ⅳ期胃肠道恶性肿瘤检测的敏感性分别为84.62％、94.12％、94.44％和100.00％，综合敏感度为94.44％，特异性为95.00％。
表1胃肠道恶性肿瘤组与健康志愿者组基线资料比较
Figure RE-GDA0002406626090000101
表2胃肠道恶性肿瘤组患者肿瘤TNM分期情况[例(％)]
术后病理分期 全组(54例)
肿瘤T分期
T1 5(9.3)
T2 9(16.7)
T3 25(46.3)
T4 15(27.7)
肿瘤N分期
N0 27(50.0)
N1 14(25.9)
N2 13(24.1)
肿瘤M分期
M0 48(88.9)
M1 6(11.1)
肿瘤TNM分期
Ⅰ 13(24.1)
Ⅱ 17(31.5)
Ⅲ 18(33.3)
Ⅳ 6(11.1)
表3胃肠道恶性肿瘤组与健康志愿者组CTCs结果比较
组别 样本数 CTCs结果[M(P<sub>25</sub>～P<sub>75</sub>)]
健康志愿者组 20 2(0.00～6.75)
胃肠道恶性肿瘤组 54 44(21.00～90.25)**
---胃肠道恶性肿瘤组(Ⅰ期) 13 32(18.00～51.50)**
---胃肠道恶性肿瘤组(Ⅱ期) 17 44(29.50～111.00)**
---胃肠道恶性肿瘤组(Ⅲ期) 18 74(20.25～189.25)**
---胃肠道恶性肿瘤组(Ⅳ期) 6 63(33.25～204.00)**
**P<0.01Vs健康志愿者组；胃肠道恶性肿瘤组内各期病例间相互比较P>0.05
采用上述各个技术方案，本发明与现有单一EpCAM标记物CTCs富集技术相比，可同时对上皮性和间皮性CTCs进行分离，将大大提高CTCs富集技术的分离效率。联合多种胃肠恶性肿瘤特异性抗体对富集后的细胞进行鉴定，比单一使用CK抗体的敏感度更高。胃肠道恶性肿瘤患者外周血中CTCs水平随临床分期升高呈升高趋势。大部分患者能捕捉到数十至数百个CTCs，与现有临床检测方法相比，CTCs捕捉效率大幅提升，为CTCs下游分子分析奠定了物质基础。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种胃肠道恶性肿瘤循环肿瘤细胞检测试剂盒，其特征在于：包括CTCs分离试剂和CTCs鉴定试剂；所述CTCs分离试剂包括偶联EpCAM和CSV单克隆抗体包被的免疫磁珠，所述CTCs鉴定试剂包括封闭液、缓冲液、固定液、透化液、染色液和封片剂。
2.根据权利要求1所述的胃肠道恶性肿瘤循环肿瘤细胞检测试剂盒，其特征在于：所述染色液包括多种免疫荧光染色单克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的胃肠道恶性肿瘤循环肿瘤细胞检测试剂盒，其特征在于：所述免疫荧光染色单克隆抗体为CK、CEA、CA72-4、CD45。
4.根据权利要求1所述的胃肠道恶性肿瘤循环肿瘤细胞检测试剂盒，其特征在于：所述封片剂含有细胞核染料。
5.根据权利要求4所述的胃肠道恶性肿瘤循环肿瘤细胞检测试剂盒，其特征在于：所述细胞核染料为DAPI。
6.一种胃肠道恶性肿瘤循环肿瘤细胞检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1、CTCs分离：将CTCs分离试剂与含有CTCs的血液样本混合，使免疫磁珠与CTCs结合，去除液体后得到分离的CTCs；
S2、CTCs鉴定：将分离的CTCs与CTCs鉴定试剂混合，观察细胞染色情况，计算血液样本中的CTCs数目。
7.根据权利要求6所述的胃肠道恶性肿瘤循环肿瘤细胞检测方法，其特征在于：所述S2中，还包括如下步骤：
S21、将分离后的CTCs加入固定液；
S22、去除固定液，加入缓冲液洗涤；
S23、去除缓冲液，加入封闭液；
S24、去除封闭液，加入透化液；
S25、去除透化液，加染色液；
S26、去除染色液，加入缓冲液洗涤；
S27、洗涤后的CTCs再加入缓冲液，并转移到载玻片上；
S28、去除缓冲液，滴加一滴封片剂，盖上盖玻片，用指甲油封片。
S29、在荧光显微镜下观察细胞染色情况，计算CK/CEA/CA7-24+、CD45-、DAPI+细胞的总数目，作为样本中CTCs细胞的数目。
8.根据权利要求7所述的胃肠道恶性肿瘤循环肿瘤细胞检测方法，其特征在于：所述S21中，固定液为50μl；所述S22中，缓冲液为100μl；所述S23中，封闭液为50μl；所述S24中，透化液50μl；所述S25中，染色液为50μl；所述S26中，缓冲液为100μl；所述S27中，缓冲液为50μl。
9.根据权利要求7所述的胃肠道恶性肿瘤循环肿瘤细胞检测方法，其特征在于：所述S21中，固定时间为20min；所述S22中，缓冲液洗涤一次，且洗涤后直接进入S23或4℃保存；所述S23中，封闭时间为5min；所述S24中，透化时间为5min；所述S25中，染色液中的CK、CEA、CA72-4和CD45的稀释比例为1:100；所述S26中，缓冲液洗涤两次。
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