WO2021079717A1 - エクソソームの分離及び検出方法、並びに、分離及び検出キット - Google Patents

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世紀 和久井
河上　裕
智憲 谷口
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Definitions

  • the present invention relates to a method for separating and detecting exosomes, and a separation and detection kit.
  • exosomes which are composed of lipid bilayers and contain various cell contents such as proteins, nucleic acids, lipids, and sugars, to the outside of the cells. Exosomes are attracting attention as important clues for understanding the pathophysiology of living organisms, and research on various diseases such as cancer is being actively conducted.
  • vimentin is one of the important proteins for cytoplasm formation and is known as a marker for intracellular epithelial-mesenchymal transition (EMT). Vimentin is overexpressed in cancer cells, and it has been clarified that there is a correlation between the expression level and the progression of cancer. Under certain circumstances, vimentin migrates to the cell surface. The vimentin that has migrated to the cell surface is called cell surface vimentin (CSV).
  • CSV cell surface vimentin
  • CTC peripheral circulating tumor cells
  • CTC is present in a very small amount in blood, and it is difficult to detect an antigen marker of CTC for the purpose of cancer diagnosis or companion diagnosis.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and provides a method for separating and detecting exosomes, which can be used for cancer diagnosis or companion diagnosis, and a kit used for the method.
  • the present invention includes the following aspects.
  • Including A method for separating and detecting an exosome, wherein the antigen expressed on the surface of the cancer cell in at least one of the capture molecule and the detection molecule is CSV.
  • the specific binding substance for the antigen expressed on the cancer cell surface in the capture molecule is an anti-CSV antibody, and the specific binding substance for the antigen expressed on the cancer cell surface in the detection molecule is anti-CSV antibody.
  • the specific binding substance for the antigen expressed on the cancer cell surface in the detection molecule is an anti-CSV antibody, and the specific binding substance for the antigen expressed on the cancer cell surface in the capture molecule is anti-CSV antibody.
  • a capture molecule containing a specific binding substance for an antigen expressed on the surface of cancer cells A detection molecule containing a specific binding substance and a labeling substance for an antigen expressed on the surface of cancer cells.
  • the kit according to (8), wherein the specific binding substance for the antigen expressed on the cell surface is an anti-CSV antibody.
  • the specific binding substance for the antigen expressed on the cancer cell surface in the capture molecule is an anti-CSV antibody
  • the specific binding substance for the antigen expressed on the cancer cell surface in the detection molecule is anti-CSV antibody.
  • the specific binding substance for the antigen expressed on the cancer cell surface in the detection molecule is an anti-CSV antibody
  • the specific binding substance for the antigen expressed on the cancer cell surface in the capture molecule is anti-CSV antibody.
  • the kit according to (8) or (9), which is a CSV antibody, an anti-EpCAM antibody, or an anti-PD-L1 antibody (12) The kit according to any one of (8) to (11), wherein the capture molecule is fixed to magnetic particles. (13) The kit according to any one of (8) to (12), which is used for diagnosing cancer.
  • exosomes can be separated and detected, and can be used for cancer diagnosis or companion diagnosis.
  • FIG. 1 It is a graph which shows the measurement result of the CSV positive exosome in the lung cancer patient sample or the healthy person sample in analysis example 1.
  • FIG. 1 the numbers in parentheses indicate the number of cases. It is a graph which shows the ROC curve created from the measurement result shown in FIG. It is a graph which shows the measurement result of CSV and EpCAM positive exosome in the lung cancer patient sample or the healthy person sample in analysis example 2.
  • the numbers in parentheses indicate the number of cases.
  • FIG. 3 shows the measurement result of CSV and PD-L1-positive exosome in the lung cancer patient sample or the healthy person sample in analysis example 3.
  • the numbers in parentheses indicate the number of cases. It is a graph which shows the ROC curve created from the measurement result shown in FIG. It is a graph which classified the measurement result shown in FIG. 1 by the type of lung cancer. In the figure, the numbers in parentheses indicate the number of cases. It is a graph which classified the measurement result shown in FIG. 3 by the type of lung cancer. In the figure, the numbers in parentheses indicate the number of cases. However, (12000) in the Ad group represents a Signal / Noise value. It is a graph which classified the measurement result shown in FIG. 5 by the type of lung cancer. In the figure, the numbers in parentheses indicate the number of cases. It is a graph which classified the measurement result shown in FIG. 1 by the pathological stage of lung cancer.
  • the numbers in parentheses indicate the number of cases. It is a graph which classified the measurement result shown in FIG. 3 by the pathological stage of lung cancer. In the figure, the numbers in parentheses indicate the number of cases. However, (12000) in group III represents a Signal / Noise value. It is a graph which classified the measurement result shown in FIG. 5 by the pathological stage of lung cancer. In the figure, the numbers in parentheses indicate the number of cases. It is a graph which classified the measurement result shown in FIG. 1 by the pathological stage of adenocarcinoma or squamous epithelial cancer. In the figure, the numbers in parentheses indicate the number of cases. It is a graph which classified the measurement result shown in FIG.
  • the present invention provides a method for separating and detecting exosomes, which comprises a complex formation step and a detection step.
  • the complex formation step the biological sample is brought into contact with a capture molecule containing a specific binding substance for an antigen expressed on the surface of cancer cells to form a complex of the exosome and the capture molecule.
  • the detection step the complex is brought into contact with a detection molecule containing a specific binding substance and a labeling substance for an antigen expressed on the surface of cancer cells, and the complex is detected by the detection molecule.
  • the antigen expressed on the surface of cancer cells in at least one of the capture molecule and the detection molecule is cell surface vimentin (CSV).
  • CSV is mainly expressed on the surface of exosomes released from cancer cells, and have completed the present invention.
  • CTC antigen marker detection method since 10 mL of blood contains only 1 to 10 CTCs, a large amount of blood sample is required for detection, and CTCs are used for the purpose of cancer diagnosis. It is difficult to detect antigen markers.
  • promptness and accuracy of diagnosis are required, but detection of antigen markers of CTC cannot satisfy the needs.
  • the exosome is about several tens of ⁇ L of blood. Since the sample contains a sufficient amount for measurement, it is suitable as a detection target for cancer diagnosis or companion diagnosis. Further, among the antigen markers existing in one exosome, by targeting a combination of CSV and a known cancer antigen marker, exosomes released from cancer cells can be specifically separated. As a result, the accuracy of cancer diagnosis can be improved. Furthermore, companion diagnostics can be performed by selecting a cancer antigen that is a target of a therapeutic agent as a known cancer antigen marker to be combined with CSV. Next, each step of the separation and detection method of the present embodiment will be described in detail.
  • the biological sample is brought into contact with a capture molecule containing a specific binding substance for an antigen expressed on the surface of cancer cells. This contact forms a complex of the exosome and the capture molecule.
  • biological samples include various liquids such as body fluids, cell culture supernatants, and tissue cell crushed fluids. Of these, body fluids or cell culture supernatants are preferable.
  • Body fluids include whole blood, serum, plasma, various blood cells, blood clots, platelets, etc., as well as urine, semen, breast milk, sweat, interstitial fluid, interstitial lymph, bone marrow fluid, tissue fluid, saliva, gastric fluid, and joint fluid.
  • the plasma may be treated with an anticoagulant such as citric acid, heparin, or EDTA.
  • the species from which the biological sample is derived is not particularly limited, and examples thereof include humans, mice, rats, rabbits, dogs, pigs, sheep, cows, horses, camels, and monkeys. Of these, human-derived samples are preferred. In addition, human-derived plasma is preferable as the combination of seed and body fluid.
  • the biological sample may be pretreated by adding it to a known buffer or the like, but the biological sample taken from the living body can also be used as it is. That is, according to the separation and detection method of the present embodiment, exosomes can be easily and selectively separated without pretreatment by a PEG precipitation method, an isolation method using an ultracentrifuge or the like.
  • the amount of the biological sample can be adjusted as appropriate, but may be, for example, 1 ⁇ L or more and 50 ⁇ L or less, and may be, for example, 1 ⁇ L or more and 20 ⁇ L or less.
  • the capture molecule used in the complex formation step contains a specific binding substance to the antigen expressed on the surface of cancer cells. Since exosomes released from cancer cells have an antigen expressed on the surface of cancer cells on the surface, exosomes released from cancer cells can be captured by using a specific binding substance for the antigen. Can be done.
  • the antigen expressed on the surface of cancer cells it is known that the antigen is highly expressed in cancer cells than in normal cells, or is specifically expressed only in cancer cells. Means an antigen that is present.
  • antigens include cell surface vimentin (CSV), epithelial cell adhesion molecule (EpCAM, CD326), programmed cell death ligand-1 (PD-L1), glycocan-3 (GPC3), glyconan-1 (GPC1).
  • Carcinoembryonic antigen CEA
  • CD4 CD5, CD16, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD38, CD44, CD52, CD123, CD171, Cancer Agent 125, Claudin18, receptor-type tyrosine kinase ROR1, sialyl.
  • Le x- i (SLX), Sialyl Lewis A (CA19-9), immunocostimulatory protein B7-homlog6 (B7H6), cell surface glycoprotein (CS-1), receptor-type tyrosine kinase 3 (FLT3), prostate-specific membrane Antigen (PSMA), B cell maturation antigen (BCMA), Wilms tumor 1 (WT1), NY-ESO-1, Caveolin-1, Fas ligand (FasL), TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL), Galectine3, CD151, Tetraspanin 8.
  • Information on the base sequence and amino acid sequence of the antigen expressed on the surface of various human cancer cells can be obtained from a database such as Genbank.
  • the amino acid sequence of human CSV (as vimentin) is disclosed, for example, as Genbank accession number NP_003371.2.
  • the amino acid sequence of human EpCAM is disclosed, for example, as Genbank's accession number NP_002345.2.
  • the amino acid sequence of human PD-L1 is disclosed, for example, as Genbank's accession number NP_054862.1.
  • the amino acid sequence of human GPC3 is disclosed, for example, as Genbank's accession number NP_001158089.1.
  • the capture molecule contains a specific binding agent for the antigen.
  • the specific binding substance include a substance that specifically binds to an antigen.
  • the substance that specifically binds to the antigen include antibodies, aptamers and the like.
  • the antibody may be any antibody that has the ability to bind to an antigen sequence (epitope) on cancer cells, and specifically, for example, an anti-CSV antibody, an anti-EpCAM antibody, an anti-PD-L1 antibody, and an anti-GPC3 antibody. Can be mentioned. These antibodies may be monoclonal antibodies or polyclonal antibodies, but are preferably monoclonal antibodies. Furthermore, these antibodies may be bispecific antibodies. Examples of the antibody class include IgG and IgM, but IgG is more preferable. Further, the antibody may be a chimeric antibody such as a humanized antibody.
  • the antibody may be derived from, for example, mammals such as mice, rabbits, cows, pigs, horses, sheep and goats, birds such as chickens, and animal species such as humans, and is not particularly limited.
  • the antibody may be prepared, for example, from the serum derived from the animal species by a conventionally known method, or an antibody may be prepared from a vector synthesized using known antibody gene sequence information, and a commercially available antibody may be used. You may.
  • Examples of commercially available anti-CSV monoclonal antibodies include mouse anti-human CSV monoclonal antibodies (isotypes: IgG2b, ⁇ ) manufactured by Abnova.
  • an antibody fragment can be used as an antibody.
  • the antibody fragment include Fv, Fab, Fab', F (ab') 2, rIgG, scFv and the like.
  • An aptamer is a substance that has a specific binding ability to a target substance.
  • examples of the aptamer include nucleic acid aptamers and peptide aptamers.
  • Nucleic acid aptamers having an antigen-specific binding ability can be selected by, for example, the systematic evolution of ligand by exponential evolution (SELEX) method.
  • peptide aptamers having an antigen-specific binding ability can be selected by, for example, the Two-hybrid method using yeast.
  • the antigen is CSV, Nkp46 protein or the like, which is known to have a binding ability to CSV, can also be used as a specific binding substance.
  • the capture molecule is preferably immobilized on a solid phase carrier.
  • Examples of the material of the solid phase carrier include polystyrenes, polyethylenes, polypropylenes, polyesters, poly (meth) acrylonitriles, styrene-butadiene copolymers, poly (meth) acrylic acid esters, fluororesins, and crosslinked dextran. , Polystyrene and other polymer compounds; glass; metals; magnetic materials; resin compositions containing magnetic materials; combinations thereof.
  • the shape of the solid phase carrier is not particularly limited, and examples thereof include a tray shape, a spherical shape, a particle shape, a fibrous shape, a rod shape, a disc shape, a container shape, and a microchannel.
  • the magnetic particles include a magnetic material made of a metal such as iron trioxide (Fe 3 O 4 ), iron sesquioxide ( ⁇ -Fe 2 O 3 ), various ferrites, iron, manganese, nickel, cobalt, and chromium.
  • magnetic fine particles made of fine particles and alloys of these metals include magnetic particles containing these magnetic fine particles in a resin.
  • the resin include hydrophobic polymers and hydrophilic polymers. Among them, magnetic particles containing a magnetic substance in the resin are preferable, and those in which a polymer layer is formed on the surface of mother particles containing superparamagnetic fine particles are more preferable.
  • a hydrophobic first polymer layer is formed on the surface of mother particles containing ultranormal magnetic fine particles described in JP-A-2008-32411 (Reference 1), and at least the surface is formed on the first polymer layer.
  • Examples thereof include magnetic particles in which a second polymer layer having a glycidyl group is formed in the particle, and a polar group is introduced by chemically modifying the glycidyl group.
  • the monomer for forming the hydrophobic first polymer layer is roughly classified into a monofunctional monomer and a crosslinkable monomer.
  • the monofunctional monomer include aromatic vinyl-based monomers such as styrene, ⁇ -methylstyrene, and styrene halide; methyl acrylate, methyl methacrylate, ethyl acrylate, ethyl methacrylate, stearyl acrylate, stearyl methacrylate, cyclohexyl acrylate, and cyclohexyl methacrylate.
  • Isobonyl acrylate, isobonyl methacrylate and other ethylenically unsaturated carboxylic acid alkyl ester-based monomers for example, ethylene glycol diacrylate, ethylene glycol dimethacrylate, trimethylolpropane triacrylate, trimethylolpropane trimethacrylate, pentaerythritol triacrylate, pentaerythritol trimethacrylate, dipentaerythritol hexaacrylate, dipenta Polyfunctional (meth) acrylates such as erythritol hexamethacrylate; in addition to conjugated diolefins such as butadiene and iprene, divinylbenzene, diallyl phthalate, allyl acrylate, and allyl methacrylate can be mentioned.
  • conjugated diolefins such as butadiene and iprene, divinylbenzene, diallyl
  • the monomer for forming the second polymer layer has the main purpose of introducing a functional group onto the particle surface, and contains a glycidyl group-containing monomer.
  • the content of the glycidyl group-containing monomer is preferably 20% by mass or more in the monomer for forming the second polymer layer.
  • examples of the copolymerizable monomer containing a glycidyl group include glycidyl acrylate, glycidyl methacrylate, and allyl glycidyl ether.
  • the polar group introduced by chemically modifying the glycidyl group of the second polymer layer is preferably a functional group capable of reacting with a specific binding substance for an antigen expressed on the surface of cancer cells, and is preferably an oxygen atom or nitrogen. More preferably, it contains at least one atom selected from the group consisting of atoms and sulfur atoms. Of these, an amino group, an aldehyde group, a carboxy group, or an active ester group is more preferable.
  • the second polymer layer of the magnetic particles has the polar group and the 2,3-dihydroxypropyl group, it is a specific binding substance for an antigen expressed on the surface of cancer cells (particularly, for an antigen expressed on the surface of cancer cells). Good binding to antibody).
  • a physical adsorption method As a method for binding a specific binding substance to an antigen expressed on the surface of cancer cells to a solid phase carrier, a physical adsorption method, a covalent bonding method, an ionic bonding method, or a chemical bonding method is used.
  • Physical adsorption methods include a method of directly immobilizing a specific binding substance to an antigen expressed on the surface of cancer cells on a solid phase carrier, and a method of chemically adsorbing and immobilizing another protein such as albumin. And so on.
  • a method of chemically binding a method of directly binding to the solid phase carrier using a functional group introduced into the surface of the solid phase carrier and capable of reacting with a specific binding substance for an antigen expressed on the surface of cancer cells.
  • a spacer molecule carbodiimide compound, etc.
  • a specific binding substance for an antigen expressed on the surface of cancer cells by a chemical bond and then binding, cancer to other proteins such as albumin.
  • examples thereof include a method of binding a specific binding substance to an antigen expressed on the cell surface and then chemically binding the protein to a solid phase carrier.
  • the complex formation step may be carried out by using salts, proteins such as albumin, surfactants and the like, if necessary, in addition to the above-mentioned components.
  • the reaction temperature in the complex forming step is usually in the range of 2 ° C. or higher and 42 ° C. or lower, and the reaction time is usually 5 minutes or longer and 24 hours or lower.
  • the reaction time is preferably 8 hours or longer and 30 hours or lower, and when the reaction is carried out at room temperature (20 ° C.) or higher and 42 ° C. or lower, the reaction time is preferably 5 minutes or longer and 4 hours or lower. Is.
  • the pH in the system is not particularly limited, but is preferably in the range of pH 5 or more and 10 or less, and more preferably in the range of pH 6 or more and 8 or less.
  • a buffer solution is usually used to maintain the desired pH, and examples thereof include phosphate buffer solution, tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer solution, HEPES buffer solution, and MES buffer solution.
  • the complex is brought into contact with a detection molecule containing a specific binding substance and a labeling substance for an antigen expressed on the surface of cancer cells.
  • the detection molecule is bound to the exosome in the complex, and the complex is detected by the detection molecule.
  • the detection molecule contains a specific binding substance and a labeling substance for an antigen expressed on the surface of cancer cells.
  • the detection molecule preferably contains a specific binding substance for an antigen expressed on the surface of cancer cells to which a labeling substance is bound.
  • Examples of the specific binding substance for the antigen expressed on the surface of cancer cells include the same substances as those exemplified in the above-mentioned "capture molecule".
  • the specific binding substance contained in the capturing molecule and the specific binding substance contained in the detecting molecule may be the same or different.
  • the specific binding substance is a specific binding substance for CSV and may be an anti-CSV antibody. preferable.
  • the specific binding substance of the capture molecule or the specific binding substance of the detection molecule is an antibody
  • those consisting of bispecific antibodies can be used, or a plurality of substances having different antigens can be used.
  • a mixture of the antibodies of the above can also be used.
  • the specific binding substance contained in the capture molecule is an anti-CSV antibody
  • the specific binding substance possessed by the detection molecule is an anti-CSV antibody, an anti-EpCAM antibody or an anti-PD-L1 antibody.
  • the specific binding substance of the detection molecule is an anti-CSV antibody
  • the specific binding substance of the capture molecule is an anti-CSV antibody, an anti-EpCAM antibody or an anti-PD-L1 antibody. ..
  • the labeling substance examples include charged molecules such as biotin, avidin, streptavidin, neutravidin, glutathione-S-transferase, glutathione, alkaline phosphatase (ALP), fluorescent dye, polyethylene glycol, and mellitic acid.
  • ALP alkaline phosphatase
  • exosomes can be detected with high accuracy by adding an ALP luminescent substrate.
  • the ALP luminescent substrate include p-nitrophenyl phosphate (PNP), 4-methylumbelliferyl phosphate (4MUP), 3- (2'-spirodamantane) 4-methoxy-4- (3 ′′ -phosphoryloxy).
  • Phenyl-1,2-dioxetane (AMPPD), Disodium 3- (4-methoxyspiro ⁇ 1,2-dioxetane-3,2'-(5'-chromo) tricyclo [3.3.1.1 3,7 ]] decan ⁇ -4-yl) phenyl phosphate (CSPD), 2-chloro-5- (4-methoxyspiro ⁇ 1,2-dioxetane-3,2'-(5'-chloro) -tricyclo [3.3.1] .1 3,7 ] Decane ⁇ -4-yl) -1-phenylphosphate disodium (CDP-Star).
  • the detection method in the detection step may be performed by an immunoassay, for example, an enzyme-linked immunosorbent assay (EIA), an ELISA, a chemoluminescent enzyme immunoassay (CLEIA), a fluorescence immunoassay (FIA), or a radiation immunoassay (FIA).
  • EIA enzyme-linked immunosorbent assay
  • ELISA chemoluminescent enzyme immunoassay
  • FIA fluorescence immunoassay
  • FIA radiation immunoassay
  • RIA luminescent immunoassay
  • immunoblotting immunoblotting
  • western blot examples include a competitive method and a sandwich method.
  • An example of separation and detection method when using the CLEIA method is shown.
  • an antibody against an antigen expressed on the surface of cancer cells is bound to a solid-phase carrier to immobilize a capture molecule, and then a biological sample is brought into contact to form a complex.
  • a detection molecule containing an antibody against the antigen expressed on the surface of the cancer cell to which the labeling substance is bound is added thereto to form a further complex. Then, by detecting the labeled amount in the formed complex, the signal derived from the exosome contained in the biological sample can be measured.
  • the separation and detection method of the present embodiment may include other steps in addition to the complex formation step and the detection step.
  • a cleaning step may be provided after the complex forming step and before the detection step.
  • the washing step the complex of the exosome formed in the complex forming step and the capture molecule is washed. As a result, impurities such as unreacted components are removed.
  • the above washing step usually has a different method depending on the shape of the solid phase carrier which is a constituent component of the capture molecule.
  • the solid phase carrier is in the form of particles such as magnetic particles, for example, a method of dispersing the magnetic particles in a cleaning liquid for cleaning, or a method of cleaning by dipping while concentrating the magnetism can be mentioned.
  • the solid-phase carrier is in the form of a microplate, a method of repeatedly dispensing and sucking the cleaning liquid on the plate to clean the plate can be mentioned.
  • the cleaning step includes a magnetic collection step of collecting the magnetic particles by a magnetic force to separate the magnetic particles and the liquid phase, and a magnetic particle separated in the magnetic collection step in the cleaning liquid. It is preferable to include a dispersion step of dispersing in. As a result, unreacted substances and impurities in the sample can be more efficiently washed and separated and removed from the surface of the magnetic particles. Specifically, a magnetic field was applied to the reaction vessel, magnetic particles were attached to the wall of the reaction vessel and collected, the reaction supernatant was removed, and if necessary, a cleaning solution was added, and the magnetic field was applied in the same manner. This may be performed by repeating the operation of removing the post-supernatant.
  • a cleaning liquid containing a surfactant and the buffer solution mentioned in the above-mentioned complex forming step is preferable.
  • the pH of the cleaning solution is preferably in the range of pH 5 or more and 10 or less, and more preferably in the range of pH 6 or more and 8 or less. Specific examples thereof include Tris Buffered Saline (TBS) containing 0.1% by mass of Tween 20 with respect to the total mass of the solution.
  • TBS Tris Buffered Saline
  • a washing solution is added to the detection molecule. It is also possible to wash the complex to which the is bound. Thereby, unreacted substances and impurities in the sample can be removed, and the complex can be detected with the detection molecule with higher sensitivity.
  • exosomes are carried out in parallel by using a combination of two or more types of capture molecules and detection molecules.
  • An exosome separation and detection kit includes a capture molecule and a detection molecule.
  • the capture molecule contains a specific binding agent for an antigen expressed on the surface of cancer cells.
  • the detection molecule contains a specific binding substance and a labeling substance for an antigen expressed on the surface of cancer cells.
  • the antigen expressed on the surface of cancer cells in at least one of the capture molecule and the detection molecule is CSV.
  • the capture molecule and the detection molecule are the same as those exemplified in the above-mentioned "Method for separating and detecting exosomes”.
  • the separation and detection kit of the present embodiment can further include a cleaning solution in addition to the capture molecule and the detection molecule.
  • the cleaning solution is the same as that exemplified in the above-mentioned "Method for separating and detecting exosomes".
  • the separation and detection method of the present embodiment and the separation and detection kit are suitably used for diagnosing cancer, particularly early stage cancer. That is, in one embodiment, the present invention uses a biological sample collected from a subject, a signal derived from an exosome detected by the above-mentioned separation and detection method, and a background in the biological sample collected from a control. In contrast to the exosome-derived signal, the subject develops cancer when the exosome-derived signal in the subject sample is stronger than the exosome-derived signal (background) in the control sample.
  • a method for determining cancer which includes a determination step for determining that the disease is present.
  • the above-mentioned separation and detection kit can be paraphrased as a cancer diagnostic kit.
  • Cancers to be diagnosed include colon cancer, breast cancer, uterine body cancer, cervical cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, stomach cancer, esophageal cancer, liver cancer, lung cancer, renal cancer, and skin. Cancer and the like can be mentioned, but among them, lung cancer is preferable.
  • the exosome-derived signal in the subject sample measured in the above detection step is statistically analyzed based on the exosome-derived signal in the control sample and compared. It is possible to determine whether or not the subject has developed cancer. For example, if the exosome-derived signal in the subject sample is stronger than the exosome-derived signal in the control sample, it is judged that there is a high possibility of developing cancer.
  • the control in the determination step is the average of those who are of the same age and sex as the subject and who have not developed cancer, and the exosome-derived signal in the control is derived from the exosome in the subject. It may be measured together with the signal, or a statistical value obtained from a separately measured value in advance may be used.
  • the separation and detection method of the present embodiment and the separation and detection kit are suitably used for companion diagnostics for selecting a cancer therapeutic agent. That is, in one embodiment, the present invention uses a biological sample collected from a subject, and collects a signal derived from an exosome positive for a specific cancer antigen detected by the above separation and detection method and a control. In contrast to the exosome-derived signal that is positive for a specific cancer antigen in the biological sample, the exosome-derived signal that is positive for the specific cancer antigen in the subject is positive for the specific cancer antigen in the control.
  • a cancer therapeutic drug targeting the specific cancer antigen is used.
  • a method for selecting a cancer therapeutic agent including a selection process for selecting the cancer therapeutic agent to be used in the above.
  • the separation and detection kit can be paraphrased as a companion diagnostic kit for a cancer therapeutic agent.
  • the exosome-derived signal in the subject sample measured in the above detection step is statistically analyzed based on the exosome-derived signal in the control sample and compared. It is possible to select a cancer therapeutic drug to be used for the subject. For example, if the signal from an exosome that is positive for a particular cancer antigen in a subject sample is comparable or higher than the signal from an exosome that is positive for that cancer antigen in a control sample.
  • a cancer therapeutic agent that targets an exosome as a molecular target can be selected as a cancer therapeutic agent to be used for a subject.
  • the controls in the selection process are those of the same age and sex as the subjects, and are the average of cancer patients who have obtained therapeutic effects with the candidate cancer therapeutic agents. For the signal derived from exosomes positive for cancer, statistical values obtained from the values measured before dosing in the control can be used.
  • the present invention relates to exosome-derived signals detected by the above separation and detection methods using biological samples collected from subjects before and after administration of a cancer therapeutic agent.
  • the exosome-derived signal in the biological sample collected from the subject after administration of the therapeutic drug is lower than the signal derived from the exosome in the biological sample collected from the subject before administration of the cancer therapeutic drug.
  • a method for evaluating the efficacy of a cancer therapeutic drug which includes an evaluation step for evaluating that the cancer therapeutic drug is likely to show a drug efficacy.
  • the evaluation step statistical analysis is performed on the exosome-derived signals detected by the above separation and detection methods based on the exosome-derived signals in the biological sample collected from the subject before administration of the cancer therapeutic drug. Go and make a comparison.
  • the analysis method is not particularly limited, and a known method can be used.
  • the signal derived from the exosome in the biological sample collected from the subject after the administration of the cancer therapeutic drug is the signal derived from the exosome in the biological sample collected from the subject before the administration. When it is lower than that, it can be evaluated that there is a high possibility that the cancer therapeutic agent has an effect of suppressing cancer.
  • ⁇ Sample preparation> [Preparation of heparin plasma sample] Blood was collected from a healthy subject or a lung cancer patient into a blood collection tube containing heparin sodium, centrifuged at room temperature of 1500 to 1800 ⁇ g for 15 minutes, and the supernatant was collected in another container to prepare a heparin plasma sample. Stored at -80 ° C until use.
  • Example 1 Lung cancer patient heparin plasma samples (47 cases) including stage 1 or 2 early stage lung cancer patients were used as sample solutions, and each of them was measured according to the above-mentioned measurement method A. The value (S / N: Signal / Noise ratio) obtained by dividing the measured value of each sample by the blank value was calculated.
  • Example 1 The results of Example 1 and Comparative Example 1 are shown in FIG.
  • “Healthy” is a healthy subject heparin plasma sample
  • “Cancer” is a lung cancer patient heparin plasma sample.
  • the ROC curve created from the measurement results shown in FIG. 1 is shown in FIG.
  • the S / N of a healthy subject obtained in Comparative Example 1 was used as a control group and the S / N of a lung cancer patient obtained in Example 1 was verified as a discriminated group
  • the sensitivity was set to a cutoff value of 29.47.
  • the (specificity) was 0.98, suggesting that lung cancer patients can be distinguished from healthy subjects.
  • Example 2 Lung cancer patient heparin plasma samples (47 cases) including stage 1 or 2 early stage lung cancer patients were used as sample solutions, and each of them was measured according to the above-mentioned measurement method B. The value (S / N) obtained by dividing the measured value of each sample by the blank value was calculated.
  • Example 2 The results of Example 2 and Comparative Example 2 are shown in FIG. Further, the ROC curve created from the measurement results shown in FIG. 3 is shown in FIG.
  • the sensitivity was set to a cutoff value of 4.00.
  • the (specificity) was 1.00, suggesting that lung cancer patients can be distinguished from healthy subjects.
  • Example 3 Lung cancer patient heparin plasma samples (47 cases) including stage 1 or 2 early stage lung cancer patients were used as sample solutions, and each of them was measured according to the above-mentioned measurement method C. The value (S / N) obtained by dividing the measured value of each sample by the blank value was calculated.
  • Example 3 The results of Example 3 and Comparative Example 3 are shown in FIG. Further, the ROC curve created from the measurement results shown in FIG. 5 is shown in FIG.
  • the sensitivity was set to a cutoff value of 2.91.
  • the (specificity) was 0.94, suggesting that lung cancer patients can be distinguished from healthy subjects.
  • Example 1 and Comparative Example 1 CSV / CSV evaluation system
  • FIG. 7B Example 2 and Comparative Example 2: EpCAM / CSV evaluation system
  • FIG. 7C Example 3 and Comparative Example 3: CSV).
  • PD-L1 evaluation system PD-L1 evaluation system
  • Ad is an abbreviation for Adenocarcinoma, which is adenocarcinoma
  • Sq is an abbreviation for Squamous, which is squamous cell carcinoma.
  • “Small” is a small cell lung cancer.
  • FIGS. 7A to 7B the S / N of lung cancer patients was higher than that of healthy subjects in all cancer types.
  • Example 1 and Comparative Example 1 CSV / CSV evaluation system
  • FIG. 8B Example 2 and Comparative Example 2: EpCAM / CSV evaluation system
  • FIG. 8C Example 3 and Comparative Example 3: CSV). / PD-L1 evaluation system
  • FIGS. 8A-8C the pathological stages are as follows. The same applies to the subsequent drawings.
  • the S / N of lung cancer patients is higher than the S / N of healthy subjects from the early stage of the pathological stage, and for lung cancer patients, regardless of the pathological stage from stage I to stage IV. I was able to identify it as a healthy person.
  • Example 6 The measurement results of adenocarcinoma patients and squamous epithelial cancer patients among the measurement results of Example 1 and Comparative Example 1, Example 2, Comparative Example 2, Example 3 and Comparative Example 3 were classified according to the pathological stage. The results are shown in FIGS. 9A (Example 1 and Comparative Example 1: CSV / CSV evaluation system), FIG. 9B (Example 2 and Comparative Example 2: EpCAM / CSV evaluation system) and FIG. 9C (Example 3 and Comparative Example 3: CSV). / PD-L1 evaluation system).
  • carcinoembryonic antigen is an existing lung markers (CEA), squamous cell carcinoma associated antigen (SCC), sialyl Le x -i antigen (SLX), neuron-specific enolase (NSE), The concentrations of gastrin-releasing peptide precursor (Pro GRP) and cytokeratin 19 fragment (Cyfra) were measured.
  • CCA lung markers
  • SCC squamous cell carcinoma associated antigen
  • SLX sialyl Le x -i antigen
  • NSE neuron-specific enolase
  • the concentrations of gastrin-releasing peptide precursor (Pro GRP) and cytokeratin 19 fragment (Cyfra) were measured.
  • the CSV / CSV evaluation system of Example 1 and Comparative Example 1 1, the EpCAM / CSV evaluation system of Example 2 and Comparative Example 2, and the CSV / PD-L1 evaluation system of Example 3 and Comparative Example 3, respectively.
  • the correlation with the above existing lung cancer markers was
  • Example 1 and Comparative Example 1 the CSV / CSV evaluation system of Example 1 and Comparative Example 1, the EpCAM / CSV evaluation system of Example 2 and Comparative Example 2, and the CSV / PD-L1 evaluation system of Example 3 and Comparative Example 3, respectively.
  • the correlation between the evaluation systems was examined, but no correlation was found.
  • each of the healthy subject heparin plasma sample and the lung cancer patient heparin pool plasma sample was diluted with a 50 mM Tris buffer containing 2% (w / v) BSA and 150 mM NaCl as appropriate to prepare a sample solution.
  • Anti-CSV antibody catalog number: H0000007431-M08, manufactured by Abnova
  • anti-EpCAM antibody manufactured by JSR
  • anti-gypican-3 antibody anti-GPC3 antibody
  • Antibodies to 0.05% (w / v) antibody-bound magnetic particles (Magnosphere MS300 / Carboxyl (product number: MSP-S300-CA, manufactured by JSR Life Science)) to which any one of (manufactured by JSR) is bound.
  • 25 ⁇ L / well of each of the dispersions (3 types) was added to different wells, and then 25 ⁇ L / well of the sample solution was added. Further, 25 ⁇ L / well of a solution containing an alkaline phosphatase-labeled anti-CSV antibody (catalog number: H0000007431-M08, labeled by Abnova by JSR) was added. Then, the 96-well white microplate was stirred at 25 ° C.
  • Example 5 In advance, a healthy person heparin plasma sample was diluted with a 50 mM Tris buffer containing 2% (w / v) BSA and 150 mM NaCl to prepare a sample solution. 0.05% (w / v) antibody-bound magnetic particles (Magnosphere MS300 / Carboxyl (product number: MSP-S300)) in which an anti-PD-L1 antibody (manufactured by MBL) is bound to a 96-well white microplate (manufactured by Corning).
  • MSP-S300 antibody-bound magnetic particles
  • the antibody was sensitized by JSR to CA (manufactured by JSR Life Science Co., Ltd.) 25 ⁇ L / well of the dispersion was added, and then 25 ⁇ L / well of the sample solution was added. Further, 25 ⁇ L / well of an alkaline phosphatase-labeled anti-CSV antibody (catalog number: H000004731-M08, labeled by Abnova by JSR) was added. Then, the 96-well white microplate was stirred at 25 ° C. for 20 minutes, and then reacted with a washing buffer (TBS containing 0.1% by mass of Tween 20) while concentrating with a microplate washer (Tecan Hydroflex). The latter particles were washed 5 times.
  • a washing buffer TBS containing 0.1% by mass of Tween 20
  • exosomes can be separated and used for cancer diagnosis and companion diagnosis.

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Abstract

エクソソームの分離及び検出方法は、生体試料と、がん細胞表面に発現する抗原に対する特異的結合物質を含む捕捉用分子とを接触させて、エクソソームと前記捕捉用分子との複合体を形成させる複合体形成工程と、前記複合体と、がん細胞表面に発現する抗原に対する特異的結合物質及び標識物質を含む検出用分子とを接触させて、前記複合体を前記検出用分子で検出する検出工程と、を含み、前記捕捉用分子及び前記検出用分子のうち少なくともいずれか一方の分子における前記がん細胞表面に発現する抗原が細胞表面ビメンチンである。

Description

エクソソームの分離及び検出方法、並びに、分離及び検出キット
　本発明は、エクソソームの分離及び検出方法、並びに、分離及び検出キットに関する。
　細胞は、エクソソームと呼ばれる、その内部にタンパク質、核酸、脂質、糖等の様々な細胞内容物を含む、脂質二重膜からなる小胞を、細胞外に放出することが知られている。エクソソームは、生体の病態を知るための重要な手掛かりとなる物質として注目されており、がんを始めとした各種疾患における研究が盛んに行われている。
　一方、ビメンチンは、細胞質形成に重要なタンパク質の一つであり、細胞内の上皮間葉転換（ＥＭＴ）のマーカーとして知られている。がん細胞ではビメンチンが過剰発現し、その発現量とがんの進展に相関があることが明らかになっている。特定の環境下ではビメンチンは細胞表面に移動する。この細胞表面に移動したビメンチンは、細胞表面ビメンチン（ＣＳＶ）と呼ばれる。
　ＣＳＶは、自己免疫不全やウイルス感染、がんに関与していることや、活性化マクロファージや血小板、アポトーシスを起こしたＴリンパ球でＣＳＶが発現していることから、炎症性疾患に関与していることが明らかになっている。最近では、抗ＣＳＶ抗体と、癌腫の診断マーカーとして知られている上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３２６）に対する抗体とを組み合わせて、末梢循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を検出する方法が報告されている（例えば、非特許文献１参照）。
　しかしながら、ＣＴＣは血液中に極少量しか存在せず、がん診断又はコンパニオン診断を目的としたＣＴＣの抗原マーカーの検出は困難である。
　本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、がん診断又はコンパニオン診断に利用可能な、エクソソームを分離及び検出する方法、並びに、当該方法に使用するキットを提供する。
　すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
（１）　生体試料と、がん細胞表面に発現する抗原に対する特異的結合物質を含む捕捉用分子とを接触させて、エクソソームと前記捕捉用分子との複合体を形成させる複合体形成工程と、
　前記複合体と、がん細胞表面に発現する抗原に対する特異的結合物質及び標識物質を含む検出用分子とを接触させて、前記複合体を前記検出用分子で検出する検出工程と、
を含み、
　前記捕捉用分子及び前記検出用分子のうち少なくともいずれか一方の分子における前記がん細胞表面に発現する抗原がＣＳＶである、エクソソームの分離及び検出方法。
（２）　前記ＣＳＶに対する特異的結合物質が抗ＣＳＶ抗体である、（１）に記載の方法。
（３）　前記捕捉用分子におけるがん細胞表面に発現する抗原に対する特異的結合物質が、抗ＣＳＶ抗体であり、前記検出用分子におけるがん細胞表面に発現する抗原に対する特異的結合物質が、抗ＣＳＶ抗体、抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）　前記検出用分子におけるがん細胞表面に発現する抗原に対する特異的結合物質が、抗ＣＳＶ抗体であり、前記捕捉用分子におけるがん細胞表面に発現する抗原に対する特異的結合物質が、抗ＣＳＶ抗体、抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、（１）又は（２）に記載の方法。
（５）　前記捕捉用分子が磁性粒子に固定されている、（１）～（４）のいずれか一つに記載の方法。
（６）　前記複合体形成工程の後であって、前記検出工程の前に、
　洗浄液を添加して、前記複合体以外の夾雑物を除去する洗浄工程を更に含む、（１）～（５）のいずれか一つに記載の方法。
（７）　前記検出工程において、前記複合体と、前記検出用分子とを接触させ、次いで、洗浄液を添加して、前記検出用分子が結合した前記複合体以外の夾雑物を除去した後、前記複合体を前記検出用分子で検出する、（１）～（６）のいずれか一つに記載の方法。
（８）　がん細胞表面に発現する抗原に対する特異的結合物質を含む捕捉用分子と、
　がん細胞表面に発現する抗原に対する特異的結合物質及び標識物質を含む検出用分子と、を備え、
　前記捕捉用分子及び前記検出用分子のうち少なくともいずれか一方の分子における前記がん細胞表面に発現する抗原が、ＣＳＶである、エクソソームの分離及び検出キット。
（９）　前記細胞表面に発現する抗原に対する特異的結合物質が抗ＣＳＶ抗体である、（８）に記載のキット。
（１０）　前記捕捉用分子におけるがん細胞表面に発現する抗原に対する特異的結合物質が、抗ＣＳＶ抗体であり、前記検出用分子におけるがん細胞表面に発現する抗原に対する特異的結合物質が、抗ＣＳＶ抗体、抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、（８）又は（９）に記載のキット。
（１１）　前記検出用分子におけるがん細胞表面に発現する抗原に対する特異的結合物質が、抗ＣＳＶ抗体であり、前記捕捉用分子におけるがん細胞表面に発現する抗原に対する特異的結合物質が、抗ＣＳＶ抗体、抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、（８）又は（９）に記載のキット。
（１２）　前記捕捉用分子が磁性粒子に固定されている、（８）～（１１）のいずれか一つに記載のキット。
（１３）　がんの診断用である、（８）～（１２）のいずれか一つに記載のキット。
（１４）　初期がんの診断用である、（８）～（１３）のいずれか一つに記載のキット。
（１５）　肺がんの診断用である（８）～（１４）のいずれか一つに記載のキット。
（１６）　コンパニオン診断用である、（８）～（１２）のいずれか一つに記載のキット。
　上記態様のエクソソームの分離及び検出方法、並びに、分離及び検出キットによれば、エクソソームを分離及び検出することができ、がん診断又はコンパニオン診断に利用することができる。
解析例１における肺がん患者検体又は健常者検体中のＣＳＶ陽性エクソソームの測定結果を示すグラフである。図中、（）内の数値は症例数を表す。 図１に示す測定結果から作成したＲＯＣ曲線を示すグラフである。 解析例２における肺がん患者検体又は健常者検体中のＣＳＶ及びＥｐＣＡＭ陽性エクソソームの測定結果を示すグラフである。図中、（）内の数値は症例数を表す。 図３に示す測定結果から作成したＲＯＣ曲線を示すグラフである。 解析例３における肺がん患者検体又は健常者検体中のＣＳＶ及びＰＤ－Ｌ１陽性エクソソームの測定結果を示すグラフである。図中、（）内の数値は症例数を表す。 図５に示す測定結果から作成したＲＯＣ曲線を示すグラフである。 図１に示す測定結果を肺がんの種類で分類したグラフである。図中、（）内の数値は症例数を表す。 図３に示す測定結果を肺がんの種類で分類したグラフである。図中、（）内の数値は症例数を表す。ただし、Ａｄ群の（１２０００）はＳｉｇｎａｌ／Ｎｏｉｓｅ値を表す。 図５に示す測定結果を肺がんの種類で分類したグラフである。図中、（）内の数値は症例数を表す。 図１に示す測定結果を肺がんの病理病期で分類したグラフである。図中、（）内の数値は症例数を表す。 図３に示す測定結果を肺がんの病理病期で分類したグラフである。図中、（）内の数値は症例数を表す。ただし、III群の（１２０００）はＳｉｇｎａｌ／Ｎｏｉｓｅ値を表す。 図５に示す測定結果を肺がんの病理病期で分類したグラフである。図中、（）内の数値は症例数を表す。 図１に示す測定結果を腺がん又は扁平上皮がんの病理病期で分類したグラフである。図中、（）内の数値は症例数を表す。 図３に示す測定結果を腺がん又は扁平上皮がんの病理病期で分類したグラフである。図中、（）内の数値は症例数を表す。ただし、Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ　III群の（１２０００）はＳｉｇｎａｌ／Ｎｏｉｓｅ値を表す。 図５に示す測定結果を腺がん又は扁平上皮がんの病理病期で分類したグラフである。図中、（）内の数値は症例数を表す。 実施例４における肺がん患者検体又は健常者検体中のＣＳＶ陽性エクソソーム、ＣＳＶ及びＥｐＣＡＭ陽性エクソソーム、並びに、ＣＳＶ及びＧＰＣ３陽性エクソソームの測定結果を示すグラフである。 実施例５におけるＣＳＶ／ＰＤ－Ｌ１評価系及びＰＤ－Ｌ１／ＣＳＶ評価系でのＣＳＶ及びＰＤ－Ｌ１陽性エクソソームの測定結果を示すグラフである。
　以下、実施形態を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施形態に何ら限定されるものではない。
＜エクソソームの分離及び検出方法＞
　一実施形態において、本発明は、複合体形成工程と、検出工程と、を含む、エクソソームの分離及び検出方法を提供する。
　複合体形成工程では、生体試料と、がん細胞表面に発現する抗原に対する特異的結合物質を含む捕捉用分子とを接触させて、エクソソームと前記捕捉用分子との複合体を形成させる。
　検出工程では、前記複合体と、がん細胞表面に発現する抗原に対する特異的結合物質及び標識物質を含む検出用分子とを接触させて、前記複合体を前記検出用分子で検出する。
　前記捕捉用分子及び前記検出用分子のうち少なくともいずれか一方の分子におけるがん細胞表面に発現する抗原が、細胞表面ビメンチン（ＣＳＶ）である。
　発明者らは、ＣＳＶが、がん細胞から放出されたエクソソームの表面に主に発現していることを見出し、本発明を完成するに至った。
　従来のＣＴＣの抗原マーカーの検出法では、血液１０ｍＬ中にＣＴＣが１個以上１０個以下程度しか含まれないことから、大量の血液試料が検出に必要であり、がん診断を目的としてＣＴＣの抗原マーカーを検出することは困難である。特に、がん診断及びコンパニオン診断においては、診断の迅速性、正確性が求められるが、ＣＴＣの抗原マーカーの検出は、そのニーズを充足することができない。
　これに対して、本発明の一実施形態に係るエクソソームの分離及び検出方法（以下、単に「本実施形態の分離及び検出方法」と略記する場合がある）では、エクソソームは、血液数十μＬ程度の試料に、測定に十分量含まれることから、がん診断又はコンパニオン診断の検出対象として好適である。また、エクソソーム１個に存在する抗原マーカーのうち、ＣＳＶと既知のがん抗原マーカーとを組み合わせて標的とすることで、がん細胞から放出されたエクソソームを特異的に分離することができる。これにより、がん診断の精度を高めることができる。さらに、ＣＳＶと組み合わせる既知のがん抗原マーカーとして治療薬の標的となるがん抗原を選択することで、コンパニオン診断を行うことができる。
　次いで、本実施形態の分離及び検出方法の各工程について詳細を説明する。
［複合体形成工程］
　複合体形成工程では、生体試料と、がん細胞表面に発現する抗原に対する特異的結合物質を含む捕捉用分子とを接触させる。この接触により、エクソソームと前記捕捉用分子との複合体が形成される。
　生体試料としては、例えば、体液、細胞培養上清、組織細胞の破砕液等の各種液体が挙げられる。中でも、体液、又は細胞培養上清が好ましい。体液としては、全血、血清、血漿、各種血球、血餅、血小板等の他、尿、精液、母乳、汗、間質液、間質性リンパ液、骨髄液、組織液、唾液、胃液、関節液、胸水、胆汁、腹水、羊水等が挙げられる。中でも、血漿が好ましい。なお、血漿は、クエン酸、ヘパリン、ＥＤＴＡ等の抗凝固剤で処理されたものでもよい。
　生体試料が由来する種は特に限定されず、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、サル等が挙げられる。これらのうち、ヒト由来試料が好ましい。また、種と体液の組み合わせとしては、ヒト由来血漿が好ましい。
　上記生体試料は、公知のバッファーに添加しておく等して予め前処理したものを用いてもよいが、生体から摂取したものをそのまま用いることもできる。すなわち、本実施形態の分離及び検出方法によれば、ＰＥＧ沈殿法、超遠心機等を用いた単離法等による前処理を行わず簡便に、エクソソームの選択的な分離を行うことができる。
　生体試料の量は、適宜調整することができるが、例えば、１μＬ以上５０μＬ以下であってもよく、例えば、１μＬ以上２０μＬ以下であってもよい。
　複合体形成工程で用いられる捕捉用分子は、がん細胞表面に発現する抗原に対する特異的結合物質を含む。がん細胞から放出されたエクソソームは、その表面にがん細胞表面に発現する抗原を有することから、当該抗原に対する特異的結合物質を用いることで、がん細胞から放出されたエクソソームを捕捉することができる。
　がん細胞表面に発現する抗原としては、正常細胞よりもがん細胞で高発現していることが知られている抗原、或いは、がん細胞でのみ特異的に発現していることが知られている抗原を意味する。このような抗原としては、例えば、細胞表面ビメンチン（ＣＳＶ）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３２６）、プログラム細胞死リガンド－１（ＰＤ－Ｌ１）、ｇｌｙｐｉｃａｎ－３（ＧＰＣ３）、ｇｌｙｐｉｃａｎ－１（ＧＰＣ１）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ１２３、ＣＤ１７１、Ｃａｎｃｅｒ　Ａｎｔｉｇｅｎ　１２５、Ｃｌａｕｄｉｎ１８、受容体型チロシンキナーゼＲＯＲ１、シアリルＬｅｘ－ｉ（ＳＬＸ）、シアリルルイスＡ（ＣＡ１９－９）、免疫共刺激タンパク質Ｂ７－ｈｏｍｏｌｏｇ６（Ｂ７Ｈ６）、細胞表面糖タンパク質（ＣＳ－１）、受容体型チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ウィルムス腫瘍１（ＷＴ１），ＮＹ－ＥＳＯ－１、Ｃａｖｅｏｌｉｎ－１、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、Ｇａｌｅｃｔｉｎｅ３、ＣＤ１５１、Ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎ　８、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＨＥＲ２、Ｒｉｂｏｐｈｏｒｉｎ　２（ＲＰＮ２）、ＣＤ４４、ＴＧＦ－βが挙げられるが、これらに限定されない。
　ヒトの上記各種がん細胞表面に発現する抗原の塩基配列及びアミノ酸配列の情報は、Ｇｅｎｂａｎｋ等のデータベースから入手できる。ヒトＣＳＶ（ビメンチンとして）のアミノ酸配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＮＰ＿００３３７１．２として開示されている。ヒトＥｐＣＡＭのアミノ酸配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＮＰ＿００２３４５．２として開示されている。ヒトＰＤ－Ｌ１のアミノ酸配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＮＰ＿０５４８６２．１として開示されている。ヒトＧＰＣ３のアミノ酸配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＮＰ＿００１１５８０８９．１として開示されている。
　捕捉用分子は、上記抗原に対する特異的結合物質を含む。
　特異的結合物質としては、例えば、抗原に特異的に結合する物質が挙げられる。抗原に特異的に結合する物質としては、例えば、抗体、アプタマー等が挙げられる。
　抗体としては、がん細胞上の抗原配列（エピトープ）に対する結合能を有するものであればよく、具体的には、例えば、抗ＣＳＶ抗体、抗ＥｐＣＡＭ抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＧＰＣ３抗体が挙げられる。これらの抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましい。さらに、これらの抗体は、二重特異性抗体であってもよい。抗体のクラスとしては、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭが挙げられるが、ＩｇＧがより好ましい。また、抗体は、ヒト化抗体等のキメラ抗体であってもよい。抗体は、例えば、マウス、ウサギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ等の哺乳動物、ニワトリ等の鳥類、ヒト等の動物種由来のものでもよく、特に制限されない。抗体は、例えば、前記動物種由来の血清から、従来公知の方法により調製してもよく、公知の抗体遺伝子配列情報を用いて合成したベクターから抗体を調製してもよく、市販の抗体を使用してもよい。市販の抗ＣＳＶモノクローナル抗体としては、Ａｂｎｏｖａ社製のマウス抗ヒトＣＳＶモノクローナル抗体（アイソタイプ：ＩｇＧ２ｂ、κ）等が挙げられる。
　また、抗体として抗体断片を用いることもできる。抗体断片としては、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、ｒＩｇＧ、ｓｃＦｖ等が挙げられる。
　アプタマーとは、標的物質に対する特異的結合能を有する物質である。アプタマーとしては、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー等が挙げられる。抗原に特異的結合能を有する核酸アプタマーは、例えば、ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｉｇａｎｄ　ｂｙ　ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ　ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（ＳＥＬＥＸ）法により選別することができる。また、抗原に特異的結合能を有するペプチドアプタマーは、例えば酵母を用いたＴｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ法により選別することができる。
　また、抗原がＣＳＶである場合に、ＣＳＶへの結合能を有することが知られている、Ｎｋｐ４６タンパク質等を特異的結合物質として用いることもできる。
　捕捉用分子は、固相担体に固定されていることが好ましい。
　固相担体の材質としては、例えば、ポリスチレン類、ポリエチレン類、ポリプロピレン類、ポリエステル類、ポリ（メタ）アクリロニトリル類、スチレン－ブタジエン共重合体、ポリ（メタ）アクリル酸エステル類、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライド等の高分子化合物；ガラス；金属；磁性体；磁性体を含む樹脂組成物；これらの組み合わせが挙げられる。
　また、固相担体の形状は特に限定されるものではなく、例えば、トレイ状、球状、粒子状、繊維状、棒状、盤状、容器状、マイクロ流路が挙げられる。
　本工程においては、固液分離や洗浄の容易性の観点から、固相担体として磁性粒子を用いることが好ましい。
　上記磁性粒子としては、例えば、四三酸化鉄（Ｆｅ３Ｏ４）、三二酸化鉄（γ－Ｆｅ２Ｏ３）、各種フェライト、鉄、マンガン、ニッケル、コバルト、クロム等の金属からなる磁性体微粒子、及びこれら金属の合金からなる磁性体微粒子であって、これら磁性体微粒子を樹脂中に含む磁性粒子が挙げられる。樹脂としては、例えば、疎水性ポリマー、親水性ポリマー等が挙げられる。
　中でも、磁性体を樹脂中に含む磁性粒子が好ましく、超常磁性微粒子を含む母粒子の表面にポリマー層が形成されたものがより好ましい。例えば、特開２００８－３２４１１号公報（参考文献１）に記載の、超常磁性微粒子を含む母粒子の表面に、疎水性の第１ポリマー層が形成され、当該第１ポリマー層上に、少なくとも表面にグリシジル基を有する第２ポリマー層が形成され、当該グリシジル基を化学修飾することにより極性基が導入された磁性粒子が挙げられる。
　ここで、超常磁性微粒子としては、粒子径２０ｎｍ以下（好ましくは粒子径５ｎｍ以上２０ｎｍ以下）の酸化鉄系の微粒子が代表的であり、ＸＦｅ２Ｏ４（Ｘ＝Ｍ ｎ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｇ、Ｃｕ、Ｌｉ０．５Ｆｅ０．５等）で表現されるフェライト、Ｆｅ３Ｏ４で表現されるマグネタイト、γ－Ｆｅ２Ｏ３が挙げられ、飽和磁化が強く、かつ残留磁化が少ない点で、γ－Ｆｅ２Ｏ３及びＦｅ３Ｏ４のいずれか一方を含むことが好ましい。
　また、上記疎水性の第１ポリマー層を形成するためのモノマーは、単官能性モノマー、架橋性モノマーに大別される。
　上記単官能性モノマーとして、例えば、スチレン、α－メチルスチレン、ハロゲン化スチレン等の芳香族ビニル系モノマー；メチルアクリレート、メチルメタクリレート、エチルアクリレート、エチルメタクリレート、ステアリルアクリレート、ステアリルメタクリレート、シクロヘキシルアクリレート、シクロヘキシルメタクリレート、イソボニルアクリレート、イソボニルメタクリレート等のエチレン性不飽和カルボン酸アルキルエステル系モノマーが挙げられる。
　また、上記架橋性モノマーとして、例えば、エチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレート、ペンタエリスリトールトリアクリレート、ペンタエリスリトールトリメタクリレート、ジペンタエリスリトールヘキサアクリレート、ジペンタエリスリトールヘキサメタクリレート等の多官能性（メタ）アクリレート； ブタジエン、イプレン等の共役ジオレフィンの他、ジビニルベンゼン、ジアリルフタレート、アリルアクリレート、アリルメタクリレートが挙げられる。
　また、上記第２ポリマー層を形成するためのモノマーは、粒子表面への官能基導入を主目的とするものであり、グリシジル基含有モノマーを含むものである。グリシジル基含有モノマーの含有量としては、第２ポリマー層を形成するためのモノマー中、２０質量％以上が好ましい。ここで、グリシジル基を含む共重合性モノマーとしては、グリシジルアクリレート、グリシジルメタクリレート、アリルグリシジルエーテル等が挙げられる。
　第２ポリマー層のグリシジル基を化学修飾することにより導入される極性基としては、がん細胞表面に発現する抗原に対する特異的結合物質と反応可能な官能基であることが好ましく、酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群より選ばれた少なくとも１種の原子を１個以上含むものがより好ましい。中でも、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシ基、又は活性エステル基がより好ましい。特に、磁性粒子の第２ポリマー層が前記極性基及び２，３－ジヒドロキシプロピル基を有する場合、がん細胞表面に発現する抗原に対する特異的結合物質（特に、がん細胞表面に発現する抗原に対する抗体）との結合性が良好となる。
　がん細胞表面に発現する抗原に対する特異的結合物質を固相担体に結合する方法としては、物理的吸着法や、共有結合法、イオン結合法といった化学的に結合する方法等が用いられる。物理的吸着法としては、固相担体にがん細胞表面に発現する抗原に対する特異的結合物質を直接固定する方法、アルブミン等の他のタンパク質に化学的に結合させてから吸着させて固定する方法等が挙げられる。化学的に結合させる方法としては、固相担体表面に導入した、がん細胞表面に発現する抗原に対する特異的結合物質と反応可能な官能基を利用して、固相担体上に直接結合する方法、固相担体とがん細胞表面に発現する抗原に対する特異的結合物質との間にスペーサー分子（カルボジイミド化合物等）を化学結合で導入してから結合する方法、アルブミン等の他のタンパク質にがん細胞表面に発現する抗原に対する特異的結合物質を結合させた後、そのタンパク質を固相担体に化学結合する方法等が挙げられる。
　複合体形成工程は、上記各成分の他に、必要に応じて、塩類や、アルブミン等のタンパク質、界面活性剤等を用いて行ってもよい。
　複合体形成工程における反応温度は、通常２℃以上４２℃以下の範囲内であり、反応時間は、通常５分間以上２４時間以下である。２℃以上８℃以下で反応を行う場合、反応時間は好ましくは８時間以上３０時間以下、室温（２０℃）以上４２℃以下で反応を行う場合、反応時間は好ましくは５分間以上４時間以下である。
　複合体形成工程において、系中のｐＨは特に限定されないが、好ましくはｐＨ５以上１０以下の範囲、より好ましくはｐＨ６以上８以下の範囲である。目的のｐＨを維持するために、通常、緩衝液が用いられ、例えば、リン酸緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液が挙げられる。
［検出工程］
　検出工程では、前記複合体と、がん細胞表面に発現する抗原に対する特異的結合物質及び標識物質を含む検出用分子とを接触させる。この接触により、前記複合体中のエクソソームに前記検出用分子を結合させて、前記複合体を前記検出用分子で検出する。
　検出用分子は、がん細胞表面に発現する抗原に対する特異的結合物質及び標識物質を含む。中でも、検出用分子は、標識物質が結合した、がん細胞表面に発現する抗原に対する特異的結合物質を含むことが好ましい。
　がん細胞表面に発現する抗原に対する特異的結合物質としては、上記「捕捉用分子」において例示されたものと同様のものが挙げられる。捕捉用分子が有する特異的結合物質と、検出用分子が有する特異的結合物質とは、同一であってもよく、異なっていてもよい。捕捉用分子が有する特異的結合物質と、検出用分子が有する特異的結合物質とが同一である場合、当該特異的結合物質は、ＣＳＶに対する特異的結合物質であり、抗ＣＳＶ抗体であることが好ましい。
　また、捕捉用分子が有する特異的結合物質又は検出用分子が有する特異的結合物質が抗体である場合に、それらは二重特異性抗体からなるものを用いることもでき、或いは、抗原の異なる複数の抗体の混合物を用いることもできる。
　また、前記捕捉用分子が有する特異的結合物質が、抗ＣＳＶ抗体であり、前記検出用分子が有する特異的結合物質が、抗ＣＳＶ抗体、抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体であることが好ましい。
　また、前記検出用分子が有する特異的結合物質が、抗ＣＳＶ抗体であり、前記捕捉用分子が有する特異的結合物質が、抗ＣＳＶ抗体、抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体であることも好ましい。
　捕捉用分子が有する特異的結合物質と、検出用分子が有する特異的結合物質とが上記組み合わせであることで、後述する実施例に示すように、エクソソームを高い精度で検出することができる。
　標識物質としては、例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラビジン、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ、グルタチオン、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、蛍光色素、ポリエチレングリコール、メリト酸等の電荷分子等が挙げられる。標識物質がＡＬＰである場合には、ＡＬＰ発光基質を添加することで、エクソソームを高い精度で検出することができる。ＡＬＰ発光基質としては、例えば、ｐ－ニトロフェニルリン酸（ＰＮＰ）、４－メチルウンベリフェリルリン酸（４ＭＵＰ）、３－（２'－ｓｐｉｒｏａｄａｍａｎｔａｎｅ）４－ｍｅｔｈｏｘｙ－４－（３’’－ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ－１，２－ｄｉｏｘｅｔａｎｅ（ＡＭＰＰＤ）、Ｄｉｓｏｄｉｕｍ　３－（４－ｍｅｔｈｏｘｙｓｐｉｒｏ｛１，２－ｄｉｏｘｅｔａｎｅ－３，２’－（５’－ｃｈｌｏｒｏ）ｔｒｉｃｙｃｌｏ［３．３．１．１３，７］ｄｅｃａｎ｝－４－ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＣＳＰＤ）、２－クロロ－５－（４－メトキシスピロ｛１，２－ジオキセタン－３，２’－（５’－クロロ）－トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン｝－４－イル）－１－フェニルホスフェート・二ナトリウム（ＣＤＰ－Ｓｔａｒ）が挙げられる。
　検出工程における検出方法は、免疫測定法により行えばよく、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、放射線免疫測定法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法、イムノブロット法、ウェスタンブロット法が挙げられ、特異的結合物質が抗体である場合に、簡便に感度よく抗体を検出できる点から、ＣＬＥＩＡ法又はＥＬＩＳＡ法が好ましい。ＥＬＩＳＡ法としては、競合法、サンドイッチ法等が挙げられる。
　ＣＬＥＩＡ法を使用する場合の分離及び検出方法の一例を示す。まず、がん細胞表面に発現する抗原に対する抗体を固相担体に結合して捕捉用分子を固定させた後、生体試料を接触させて複合体を形成させる。そこに、標識物質を結合させたがん細胞表面に発現する抗原に対する抗体を含む検出用分子を添加して、さらなる複合体を形成させる。そして、形成された複合体中の標識量を検出することにより、生体試料に含まれるエクソソーム由来のシグナルを測定することができる。
　本実施形態の分離及び検出方法は、上記複合体形成工程及び上記検出工程に加えて、その他の工程を備えることができる。
　例えば、上記複合体形成工程の後であって、上記検出工程の前に、洗浄工程を備えてもよい。
　洗浄工程では、上記複合体形成工程で形成されたエクソソームと捕捉用分子との複合体を洗浄する。これによって、未反応の成分等の夾雑物が除去される。
　上記洗浄工程は、通常、捕捉用分子の構成成分である固相担体の形状により異なる方法がある。磁性粒子のように固相担体が粒子状である場合には、例えば洗浄液中に磁性粒子を分散させて洗浄する方法、又は集磁したまま浸漬により洗浄する方法が挙げられる。一方、固相担体がマイクロプレートのような形態である場合には、プレートに洗浄液の分注及び吸引を繰り返して洗浄する方法が挙げられる。
　また、固相担体が磁性粒子の場合、洗浄工程としては、磁性粒子を磁力により集めて磁性粒子と液相とを分離する集磁工程、及び該集磁工程で分離された磁性粒子を洗浄液中に分散させる分散工程とを含むことが好ましい。これによって、未反応の物質や試料中の夾雑物を磁性粒子表面から更に効率よく洗浄及び分離除去できる。
　具体的には、反応容器に磁場を作用させ、磁性粒子を反応容器壁に付着させて集めた後、反応上清を除去し、さらに必要に応じて洗浄液を加え、同様に磁場を作用させた後上清を除去する操作を繰り返すことにより行えばよい。
　洗浄液としては、界面活性剤と上記複合体形成工程で挙げた緩衝液を含む洗浄液が好ましい。洗浄液のｐＨは、好ましくはｐＨ５以上１０以下の範囲、より好ましくはｐＨ６以上８以下の範囲である。具体的には、溶液の総質量に対して０．１質量％のＴｗｅｅｎ２０を含むＴｒｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ（ＴＢＳ）等が挙げられる。
　また、上記検出工程において、前記複合体と、がん細胞表面に発現する抗原に対する特異的結合物質及び標識物質を含む検出用分子とを接触させた後、洗浄液を添加して、前記検出用分子が結合した前記複合体を洗浄することもできる。これにより、未反応の物質や試料中の夾雑物を除去することができ、前記複合体を前記検出用分子でより高感度で検出することができる。
　また、本実施形態の分離及び検出方法では、後述する実施例に示すように、２種類以上の捕捉用分子及び検出用分子の組み合わせを用いて、並行して各工程を実施することで、エクソソームの検出感度をより高めることができる。
＜エクソソームの分離及び検出キット＞
　本発明の一実施形態に係るエクソソームの分離及び検出キット（以下、単に「本実施形態の分離及び検出キット」と略記する場合がある）は、捕捉用分子と、検出用分子とを備える。捕捉用分子は、がん細胞表面に発現する抗原に対する特異的結合物質を含む。検出用分子は、がん細胞表面に発現する抗原に対する特異的結合物質及び標識物質を含む。前記捕捉用分子及び前記検出用分子のうち少なくともいずれか一方の分子におけるがん細胞表面に発現する抗原が、ＣＳＶである。
　捕捉用分子及び検出用分子としては、上記「エクソソームの分離及び検出方法」に例示されたものと同様である。
　本実施形態の分離及び検出キットは、捕捉用分子と、検出用分子とに加えて、洗浄液を更に備えることができる。洗浄液としては、上記「エクソソームの分離及び検出方法」に例示されたものと同様である。
＜使用用途＞
　本実施形態の分離及び検出方法、並びに、分離及び検出キットは、がんの診断、特に初期がんの診断に好適に用いられる。すなわち、一実施形態において、本発明は、被検者より採取した生体試料を用いて、上記分離及び検出方法で検出されたエクソソーム由来のシグナルと、対照者より採取した生体試料中のバックグラウンドとなるエクソソーム由来のシグナルとを対比して、被検者試料中のエクソソーム由来のシグナルが対照者試料中のエクソソーム由来のシグナル（バックグラウンド）よりも強い場合に、被検者ががんを発症していると判定する判定工程を含む、がんの判定方法を提供する。
　また、上記分離及び検出キットは、がんの診断用キットと言い換えることができる。
　診断対象となるがんとしては、大腸がん、乳がん、子宮体がん、子宮頸がん、卵巣がん、膵がん、胃がん、食道がん、肝がん、肺がん、腎がん、皮膚がん等が挙げられるが、中でも、肺がんが好ましい。
　判定工程では、上記検出工程で測定された被検者試料中のエクソソーム由来のシグナルについて、対照者試料中のエクソソーム由来のシグナルに基づいて統計学的な解析を行なって、比較を行うことで、被検者が、がんを発症しているか否かを判定することができる。例えば、被検者試料中のエクソソーム由来のシグナルが対照者試料中のエクソソーム由来のシグナルと比べて強い場合に、がんを発症している可能性が高いと判断される。なお、判定工程における対照者は、被検者と同年代及び同性の者であって、がんを発症していない者の平均であり、対照者におけるエクソソーム由来のシグナルは被検者におけるエクソソーム由来のシグナルと共に測定してもよく、別途予め測定した値から得られた統計値を用いてもよい。
　また、本実施形態の分離及び検出方法、並びに、分離及び検出キットは、がん治療薬を選定するためのコンパニオン診断に好適に用いられる。すなわち、一実施形態において、本発明は、被検者より採取した生体試料を用いて、上記分離及び検出方法で検出された特定のがん抗原が陽性のエクソソーム由来のシグナルと、対照者より採取した生体試料中の特定のがん抗原が陽性のエクソソーム由来のシグナルとを対比して、被検者における特定のがん抗原が陽性のエクソソーム由来のシグナルが対照者における特定のがん抗原が陽性のエクソソーム由来のシグナルと同程度、又は対照者における特定のがん抗原が陽性のエクソソーム由来のシグナルよりも強い場合に、当該特定のがん抗原を分子標的とするがん治療薬を被検者に使用するがん治療薬として選定する選定工程を含む、がん治療薬の選定方法を提供する。
　また、上記分離及び検出キットは、がん治療薬のコンパニオン診断用キットと言い換えることができる。
　選定工程では、上記検出工程で測定された被検者試料中のエクソソーム由来のシグナルについて、対照者試料中のエクソソーム由来のシグナルに基づいて統計学的な解析を行なって、比較を行うことで、被検者に使用するがん治療薬を選定することができる。例えば、被検者試料中の特定のがん抗原が陽性のエクソソーム由来のシグナルが、対照者試料中の当該がん抗原が陽性のエクソソーム由来のシグナルと比べて同程度又は高い場合に、当該がん抗原を分子標的とするがん治療薬を被検者に使用するがん治療薬として選定することができる。なお、選定工程における対照者は、被検者と同年代及び同性の者であって、候補となるがん治療薬で治療効果が得られたがん患者の平均であり、対照者における特定のがん抗原が陽性のエクソソーム由来のシグナルは、対照者において投薬前に測定した値から得られた統計値を用いることができる。
　また、エクソソームは、種々の細胞、例えば免疫系の細胞や各種がん細胞から分泌されることから、がん治療薬の投与の前後での血中エクソソームの変化（存在量の増減だけに加え、膜タンパク質の量の変動を含む）を測定することにより、患者における薬効を評価することができる。すなわち、一実施形態において、本発明は、がん治療薬の投与前及び投与後の被検者より採取した生体試料を用いて、上記分離及び検出方法で検出されたエクソソーム由来のシグナルについて、がん治療薬の投与後の被検者より採取した生体試料中のエクソソーム由来のシグナルが、がん治療薬の投与前の被検者より採取した生体試料中のエクソソーム由来のシグナルよりも低い場合に、がん治療薬が薬効を示している可能性が高いと評価する評価工程を含む、がん治療薬の薬効評価方法を提供する。
　評価工程では、上記分離及び検出方法で検出されたエクソソーム由来のシグナルについて、がん治療薬の投与前の被検者より採取した生体試料中のエクソソーム由来のシグナルに基づいて統計学的な解析を行って比較を行う。解析方法は特に限定されるものではなく、公知の方法を用いることができる。また、その後の判定は、例えば、がん治療薬の投与後の被検者より採取した生体試料中のエクソソーム由来のシグナルが、投与前の被検者より採取した生体試料中のエクソソーム由来のシグナルと比べて低い場合に、該がん治療薬ががんを抑える効果を有している可能性が高いと評価することができる。
　以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
＜サンプルの調製＞
［ヘパリン血漿検体の調製］
　健常者又は肺がん患者からへパリンナトリウム入りの採血管に採血し、室温、１５００～１８００×ｇ、１５分間遠心し、上清を別の容器に回収し、ヘパリン血漿検体とした。使用時まで－８０℃で保存した。
＜エクソソームの測定方法＞
　後述する実施例及び比較例におけるエクソソームの測定は、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ法）により発光強度を測定することで行った。各実施例での測定方法について以下に詳細を説明する。
［測定方法Ａ］
（ＣＳＶ／ＣＳＶ評価系でのＣＬＥＩＡ法による発光強度測定）
　予め、ヘパリン血漿検体それぞれを、適宜２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ及び１５０ｍＭ　ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ　Ｔｒｉｓバッファーで希釈し、試料溶液とした。９６ウェル白色マイクロプレート（コーニング社製）に、抗ＣＳＶ抗体（カタログ番号：Ｈ００００７４３１－Ｍ０８、Ａｂｎｏｖａ社製）を結合した０．０５％（ｗ／ｖ）の抗体結合磁性粒子（Ｍａｇｎｏｓｐｈｅｒｅ　ＭＳ３００／Ｃａｒｂｏｘｙｌ（品番：ＭＳＰ－Ｓ３００－ＣＡ、ＪＳＲライフサイエンス社製）に抗体をＪＳＲ社で感作）分散液２５μＬ／ウェルを添加し、次いで、試料溶液２５μＬ／ウェルを添加した。さらに、アルカリホスファターゼ標識抗ＣＳＶ抗体（カタログ番号：Ｈ００００７４３１－Ｍ０８、Ａｂｎｏｖａ社製をＪＳＲ社で標識）含有溶液２５μＬ／ウェルを添加した。その後、９６ウェル白色マイクロプレートを２５℃で２０分間撹拌し、次いで、マイクロプレートウォッシャー（テカン社製　ハイドロフレックス）を用いて集磁しながら洗浄バッファー（Ｔｗｅｅｎ２０を０．１質量％含むＴＢＳ）で反応後の粒子を５回洗浄した。さらにＴＢＳ　５０μＬを添加し、２５℃で５分間撹拌し、次いで、マイクロプレートウォッシャー（テカン社製　ハイドロフレックス）を用いて集磁しながら洗浄バッファー（Ｔｗｅｅｎ２０を０．１質量％含むＴＢＳ）で反応後の粒子を５回洗浄した。次いで、発光基質（ＬＳＩ社製、基質液（Ｒ５）、ＣＤＰ－Ｓｔａｒ）５０μＬを添加し、５分後に発光測定機（Ｐｒｏｍｅｇａ社製　ＧｌｏＭａｘ（登録商標）　Ｄｉｓｃｏｖｅｒ　Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて発光強度を測定した。
［測定方法Ｂ］
（ＥｐＣＡＭ／ＣＳＶ評価系でのＣＬＥＩＡ法による発光強度測定）
　予め、ヘパリン血漿検体それぞれを、適宜２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ及び１５０ｍＭ　ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ　Ｔｒｉｓバッファーで希釈し、試料溶液とした。９６ウェル白色マイクロプレート（コーニング社製）に、抗ＥｐＣＡＭ抗体（ＪＳＲ社製）を結合した０．０５％（ｗ／ｖ）の抗体結合磁性粒子（Ｍａｇｎｏｓｐｈｅｒｅ　ＭＳ３００／Ｃａｒｂｏｘｙｌ（品番：ＭＳＰ－Ｓ３００－ＣＡ、ＪＳＲライフサイエンス社製）に抗体をＪＳＲ社で感作）分散液２５μＬ／ウェルを添加し、次いで、試料溶液２５μＬ／ウェルを添加した。さらに、アルカリホスファターゼ標識抗ＣＳＶ抗体（カタログ番号：Ｈ００００７４３１－Ｍ０８、Ａｂｎｏｖａ社製をＪＳＲ社で標識）含有溶液２５μＬ／ウェルを添加した。その後、９６ウェル白色マイクロプレートを２５℃で２０分間撹拌し、次いで、マイクロプレートウォッシャー（テカン社製　ハイドロフレックス）を用いて集磁しながら洗浄バッファー（Ｔｗｅｅｎ２０を０．１質量％含むＴＢＳ）で反応後の粒子を５回洗浄した。さらにＴＢＳ　５０μＬを添加し、２５℃で５分間撹拌し、次いで、マイクロプレートウォッシャー（テカン社製　ハイドロフレックス）を用いて集磁しながら洗浄バッファー（Ｔｗｅｅｎ２０を０．１質量％含むＴＢＳ）で反応後の粒子を５回洗浄した。次いで、発光基質（ＬＳＩ社製、基質液（Ｒ５）、ＣＤＰ－Ｓｔａｒ）５０μＬ／ウェルを添加し、５分後に発光測定機（Ｐｒｏｍｅｇａ社製　ＧｌｏＭａｘ（登録商標）　Ｄｉｓｃｏｖｅｒ　Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて発光強度を測定した。
［測定方法Ｃ］
（ＣＳＶ／ＰＤ－Ｌ１評価系でのＣＬＥＩＡ法による発光強度測定）
　予め、ヘパリン血漿検体それぞれを、適宜２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ及び１５０ｍＭ　ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ　Ｔｒｉｓバッファーで希釈し、試料溶液とした。９６ウェル白色マイクロプレート（コーニング社製）に、抗ＣＳＶ抗体（カタログ番号：Ｈ００００７４３１－Ｍ０８、Ａｂｎｏｖａ社製）を結合した０．０５％（ｗ／ｖ）の抗体結合磁性粒子（Ｍａｇｎｏｓｐｈｅｒｅ　ＭＳ３００／Ｃａｒｂｏｘｙｌ（品番：ＭＳＰ－Ｓ３００－ＣＡ、ＪＳＲライフサイエンス社製）に抗体をＪＳＲ社で感作）分散液２５μＬを添加し、次いで、試料溶液２５μＬを添加した。さらに、アルカリホスファターゼ標識抗ＰＤ－Ｌ１抗体（ＭＢＬ社製抗体をＪＳＲ社で標識）含有溶液２５μＬ／ウェルを添加した。その後、９６ウェル白色マイクロプレートを２５℃で２０分間撹拌し、次いで、マイクロプレートウォッシャー（テカン社製　ハイドロフレックス）を用いて集磁しながら洗浄バッファー（Ｔｗｅｅｎ２０を０．１質量％含むＴＢＳ）で反応後の粒子を５回洗浄した。さらにＴＢＳ　５０μＬを添加し、２５℃で５分間撹拌し、次いで、マイクロプレートウォッシャー（テカン社製　ハイドロフレックス）を用いて集磁しながら洗浄バッファー（Ｔｗｅｅｎ２０を０．１質量％含むＴＢＳ）で反応後の粒子を５回洗浄した。次いで、発光基質（ＬＳＩ社製、基質液（Ｒ５）、ＣＤＰ－Ｓｔａｒ）５０μＬ／ウェルを添加し、５分後に発光測定機（Ｐｒｏｍｅｇａ社製　ＧｌｏＭａｘ（登録商標）　Ｄｉｓｃｏｖｅｒ　Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて発光強度を測定した。
＜肺がん患者検体中のＣＳＶ陽性エクソソームの測定＞
［実施例１］
　ステージ１又は２の初期肺がん患者を含む、肺がん患者ヘパリン血漿検体（４７例）を試料溶液として、それぞれについて、上記測定方法Ａに従い測定を行った。各試料の測定値をブランクの値で除した値（Ｓ／Ｎ：Ｓｉｇｎａｌ／Ｎｏｉｓｅ　ｒａｔｉｏ）を算出した。
［比較例１］
　健常者ヘパリン血漿検体（８例）を試料溶液として、それぞれについて、上記測定方法Ａに従い測定を行った。各試料の測定値をブランクの値で除した値（Ｓ／Ｎ）を算出した。
［解析例１］
　実施例１及び比較例１の結果を図１に示す。図１において、「Ｈｅａｌｔｈｙ」は健常者ヘパリン血漿検体、「Ｃａｎｃｅｒ」は肺がん患者ヘパリン血漿検体である。以降の図面においても同様である。また、図１に示す測定結果から作成したＲＯＣ曲線を図２に示す。
　比較例１で得られた健常者のＳ／Ｎを対照群として、実施例１で得られた肺がん患者のＳ／Ｎを被判別群として検証したところ、カットオフ値２９．４７とすると、感度（特異度）は０．９８となり、肺がん患者を健常者と識別できることが示唆された。
［実施例２］
　ステージ１又は２の初期肺がん患者を含む、肺がん患者ヘパリン血漿検体（４７例）を試料溶液として、それぞれについて、上記測定方法Ｂに従い測定を行った。各試料の測定値をブランクの値で除した値（Ｓ／Ｎ）を算出した。
［比較例２］
　健常者ヘパリン血漿検体（８例）を試料溶液として、それぞれについて、上記測定方法Ｂに従い測定を行った。各試料の測定値をブランクの値で除した値（Ｓ／Ｎ）を算出した。
［解析例２］
　実施例２及び比較例２の結果を図３に示す。また、図３に示す測定結果から作成したＲＯＣ曲線を図４に示す。
　比較例２で得られた健常者のＳ／Ｎを対照群として、実施例２で得られた肺がん患者のＳ／Ｎを被判別群として検証したところ、カットオフ値４．００とすると、感度（特異度）は１．００となり、肺がん患者を健常者と識別できることが示唆された。
［実施例３］
　ステージ１又は２の初期肺がん患者を含む、肺がん患者ヘパリン血漿検体（４７例）を試料溶液として、それぞれについて、上記測定方法Ｃに従い測定を行った。各試料の測定値をブランクの値で除した値（Ｓ／Ｎ）を算出した。
［比較例３］
　健常者ヘパリン血漿検体（８例）を試料溶液として、それぞれについて、上記測定方法Ｃに従い測定を行った。各試料の測定値をブランクの値で除した値（Ｓ／Ｎ）を算出した。
［解析例３］
　実施例３及び比較例３の結果を図５に示す。また、図５に示す測定結果から作成したＲＯＣ曲線を図６に示す。
　比較例３で得られた健常者のＳ／Ｎを対照群として、実施例３で得られた肺がん患者のＳ／Ｎを被判別群として検証したところ、カットオフ値２．９１とすると、感度（特異度）は０．９４となり、肺がん患者を健常者と識別できることが示唆された。
［解析例４］
　実施例１及び比較例１、実施例２及び比較例２、実施例３及び比較例３の測定結果それぞれについて、肺がんの種類によって分類した。結果を図７Ａ（実施例１及び比較例１：ＣＳＶ／ＣＳＶ評価系）、図７Ｂ（実施例２及び比較例２：ＥｐＣＡＭ／ＣＳＶ評価系）及び図７Ｃ（実施例３及び比較例３：ＣＳＶ／ＰＤ－Ｌ１評価系）に示す。図７Ａ～図７Ｃにおいて、「Ａｄ」はＡｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａの略であり、腺がんである。「Ｓｑ」はＳｑｕａｍｏｕｓの略であり、扁平上皮がんである。「Ｌａｒｇｅ」は大細胞がんである。「Ｓｍａｌｌ」は小細胞肺がんである。
　図７Ａ～図７Ｂにおいて、肺がん患者のＳ／Ｎについて、いずれのがん種においても健常者のＳ／Ｎよりも高値を示した。
［解析例５］
　実施例１及び比較例１、実施例２及び比較例２、実施例３及び比較例３の測定結果それぞれについて、病理病期によって分類した。結果を図８Ａ（実施例１及び比較例１：ＣＳＶ／ＣＳＶ評価系）、図８Ｂ（実施例２及び比較例２：ＥｐＣＡＭ／ＣＳＶ評価系）及び図８Ｃ（実施例３及び比較例３：ＣＳＶ／ＰＤ－Ｌ１評価系）に示す。図８Ａ～図８Ｃにおいて、病理病期は以下のとおりである。以降の図面においても同様である。
（病理病期）
　日本肺癌学会編：肺癌取扱い規約第８版　ＴＮＭ臨床病期分類に従った。
　図８Ａ～図８Ｃから、肺がん患者のＳ／Ｎについて、病理病期の初期から健常者のＳ／Ｎよりも高い値であり、肺がん患者について、Ｉ～ＩＶ期まで病理病期にかかわらず、健常者と識別できた。
［解析例６］
　実施例１及び比較例１、実施例２及び比較例２、実施例３及び比較例３の測定結果中の腺がん患者及び扁平上皮がん患者の測定結果について病理病期によって分類した。結果を図９Ａ（実施例１及び比較例１：ＣＳＶ／ＣＳＶ評価系）、図９Ｂ（実施例２及び比較例２：ＥｐＣＡＭ／ＣＳＶ評価系）及び図９Ｃ（実施例３及び比較例３：ＣＳＶ／ＰＤ－Ｌ１評価系）に示す。
　図９Ａ～図９Ｃから、腺がん患者及び扁平上皮がん患者のＳ／Ｎについて、病理病期の初期から値が高くなる傾向がみられた。このことから、がん細胞表面に発現する抗原に対する抗体と抗ＣＳＶ抗体を組み合わせた評価系により、腺がん患者及び扁平上皮がん患者を健常者と識別できることが示唆される。
　また、肺がん患者ヘパリン血漿検体について、既存の肺がんマーカーであるがん胎児性抗原（ＣＥＡ）、扁平上皮癌関連抗原（ＳＣＣ）、シアリルＬｅｘ－ｉ抗原（ＳＬＸ）、神経特異エノラーゼ（ＮＳＥ）、ガストリン放出ペプチド前駆体（Ｐｒｏ　ＧＲＰ）及びサイトケラチン１９フラグメント（Ｃｙｆｒａ）の濃度を測定した。次いで、実施例１及び比較例１のＣＳＶ／ＣＳＶ評価系、実施例２及び比較例２のＥｐＣＡＭ／ＣＳＶ評価系、並びに、実施例３及び比較例３のＣＳＶ／ＰＤ－Ｌ１評価系について、それぞれ上記既存の肺がんマーカーとの相関を検討したが、相関は見られなかった。
　さらに、実施例１及び比較例１のＣＳＶ／ＣＳＶ評価系、実施例２及び比較例２のＥｐＣＡＭ／ＣＳＶ評価系、並びに、実施例３及び比較例３のＣＳＶ／ＰＤ－Ｌ１評価系について、各評価系間の相関を検討したが、相関は見られなかった。
　なお、上記相関の検討において、ＥｐＣＡＭ／ＣＳＶ評価系のＳ／Ｎ＝１２０００であった検体は異常値として除外して検討を行った。
　これらのことから、既存のマーカーと本評価系、又は本評価系を複数組み合わせて行うことで、がんの診断の精度を向上できる。
［実施例４］
　予め、健常者ヘパリン血漿検体及び肺がん患者ヘパリンプール血漿検体それぞれを、適宜２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ及び１５０ｍＭ　ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ　Ｔｒｉｓバッファーで希釈し、試料溶液とした。９６ウェル白色マイクロプレート（コーニング社製）に、抗ＣＳＶ抗体（カタログ番号：Ｈ００００７４３１－Ｍ０８、Ａｂｎｏｖａ社製）、抗ＥｐＣＡＭ抗体（ＪＳＲ社製）、又は抗ｇｌｙｐｉｃａｎ－３抗体（抗ＧＰＣ３抗体）（ＭＢＬ社製）のいずれか一つを結合した０．０５％（ｗ／ｖ）の抗体結合磁性粒子（Ｍａｇｎｏｓｐｈｅｒｅ　ＭＳ３００／Ｃａｒｂｏｘｙｌ（品番：ＭＳＰ－Ｓ３００－ＣＡ、ＪＳＲライフサイエンス社製）に抗体をＪＳＲ社で感作）分散液（３種類）をそれぞれ異なるウェルに２５μＬ／ウェルずつ添加し、次いで、試料溶液２５μＬ／ウェルを添加した。さらに、アルカリホスファターゼ標識抗ＣＳＶ抗体（カタログ番号：Ｈ００００７４３１－Ｍ０８、Ａｂｎｏｖａ社製をＪＳＲ社で標識）含有溶液２５μＬ／ウェルを添加した。その後、９６ウェル白色マイクロプレートを２５℃で２０分間撹拌し、次いで、マイクロプレートウォッシャー（テカン社製　ハイドロフレックス）を用いて集磁しながら洗浄バッファー（Ｔｗｅｅｎ２０を０．１質量％含むＴＢＳ）で反応後の粒子を５回洗浄した。さらにＴＢＳ　５０μＬを添加し、２５℃で５分間撹拌し、次いで、マイクロプレートウォッシャー（テカン社製　ハイドロフレックス）を用いて集磁しながら洗浄バッファー（Ｔｗｅｅｎ２０を０．１質量％含むＴＢＳ）で反応後の粒子を５回洗浄した。次いで、発光基質（ＬＳＩ社製、基質液（Ｒ５）、ＣＤＰ－Ｓｔａｒ）５０μＬ／ウェルを添加し、５分後に発光測定機（Ｐｒｏｍｅｇａ社製　ＧｌｏＭａｘ（登録商標）　Ｄｉｓｃｏｖｅｒ　Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて発光強度を測定した。各試料の測定値をブランクの値で除した値（Ｓ／Ｎ）を算出した。結果を図１０に示す。図１０において、「Ｃａｐｔｕｒｅ」は捕捉用分子であり、「Ｄｅｔｅｃｔｏｒ」は検出用分子である。
　図１０から、ＥｐＣＡＭとは別のがん抗原であるＧＰＣ３とＣＳＶの共発現をマーカーとしても、評価系を構築できたことから、がん細胞表面に発現する抗原に対する抗体と抗ＣＳＶ抗体を組み合わせた評価系により、肺がん患者を健常者と識別できることが示唆された。
［実施例５］
　予め、健常者ヘパリン血漿検体を、２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ及び１５０ｍＭ　ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ　Ｔｒｉｓバッファーで希釈し、試料溶液とした。９６ウェル白色マイクロプレート（コーニング社製）に、抗ＰＤ－Ｌ１抗体（ＭＢＬ社製）を結合した０．０５％（ｗ／ｖ）の抗体結合磁性粒子（Ｍａｇｎｏｓｐｈｅｒｅ　ＭＳ３００／Ｃａｒｂｏｘｙｌ（品番：ＭＳＰ－Ｓ３００－ＣＡ、ＪＳＲライフサイエンス社製）に抗体をＪＳＲ社で感作）分散液２５μＬ／ウェルを添加し、次いで、試料溶液２５μＬ／ウェルを添加した。さらに、アルカリホスファターゼ標識抗ＣＳＶ抗体（カタログ番号：Ｈ００００７４３１－Ｍ０８、Ａｂｎｏｖａ社製をＪＳＲ社で標識）溶液２５μＬ／ウェルを添加した。その後、９６ウェル白色マイクロプレートを２５℃で２０分間撹拌し、次いで、マイクロプレートウォッシャー（テカン社製　ハイドロフレックス）を用いて集磁しながら洗浄バッファー（Ｔｗｅｅｎ２０を０．１質量％含むＴＢＳ）で反応後の粒子を５回洗浄した。さらにＴＢＳ　５０μＬを添加し、２５℃で５分間撹拌し、次いで、マイクロプレートウォッシャー（テカン社製　ハイドロフレックス）を用いて集磁しながら洗浄バッファー（Ｔｗｅｅｎ２０を０．１質量％含むＴＢＳ）で反応後の粒子を５回洗浄した。次いで、発光基質（ＬＳＩ社製、基質液（Ｒ５）、ＣＤＰ－Ｓｔａｒ）５０μＬ／ウェルを添加し、５分後に発光測定機（Ｐｒｏｍｅｇａ社製　ＧｌｏＭａｘ（登録商標）　Ｄｉｓｃｏｖｅｒ　Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて発光強度を測定した（以降、当該評価系を「ＣＳＶ／ＰＤ－Ｌ１評価系」と称する場合がある）。
　別途、抗ＰＤ－Ｌ１抗体（ＭＢＬ社製）を結合した０．０５％（ｗ／ｖ）の抗体結合磁性粒子（Ｍａｇｎｏｓｐｈｅｒｅ　ＭＳ３００／Ｃａｒｂｏｘｙｌ（品番：ＭＳＰ－Ｓ３００－ＣＡ、ＪＳＲライフサイエンス社製）に抗体をＪＳＲ社で感作）分散液の代わりに抗ＣＳＶ抗体（カタログ番号：Ｈ００００７４３１－Ｍ０８、Ａｂｎｏｖａ社製）を結合した０．０５％（ｗ／ｖ）の抗体結合磁性粒子（Ｍａｇｎｏｓｐｈｅｒｅ　ＭＳ３００／Ｃａｒｂｏｘｙｌ（品番：ＭＳＰ－Ｓ３００－ＣＡ、ＪＳＲライフサイエンス社製）に抗体をＪＳＲ社で感作）分散液を、アルカリホスファターゼ標識抗ＣＳＶ抗体（カタログ番号：Ｈ００００７４３１－Ｍ０８、Ａｂｎｏｖａ社製をＪＳＲ社で標識）の代わりにアルカリホスファターゼ標識抗ＰＤ－Ｌ１抗体（ＭＢＬ社製抗体をＪＳＲ社で標識）を用いた以外は、上記「ＣＳＶ／ＰＤ－Ｌ１評価系」と同様の方法を用いて、発光強度を測定した（以降、当該評価系を「ＰＤ－Ｌ１／ＣＳＶ評価系」と称する場合がある）。結果を図１１に示す。図１１において、「Ｃａｐｔｕｒｅ」は捕捉用分子であり、「Ｄｅｔｅｃｔｏｒ」は検出用分子である。
　図１１から、「ＣＳＶ／ＰＤ－Ｌ１評価系」及び「ＰＤ－Ｌ１／ＣＳＶ評価系」のＩｎｔｅｎｓｉｔｙを比較したところ、捕捉用分子と検出用分子の組み合わせを逆にしても、評価系を構築できることが示唆された。
　本実施形態のエクソソームの分離及び検出方法、並びに、分離及び検出キットによれば、エクソソームを分離することができ、がん診断やコンパニオン診断に利用することができる。

Claims (16)

  1. 　生体試料と、がん細胞表面に発現する抗原に対する特異的結合物質を含む捕捉用分子とを接触させて、エクソソームと前記捕捉用分子との複合体を形成させる複合体形成工程と、
    　前記複合体と、がん細胞表面に発現する抗原に対する特異的結合物質及び標識物質を含む検出用分子とを接触させて、前記複合体を前記検出用分子で検出する検出工程と、
    を含み、
    　前記捕捉用分子及び前記検出用分子のうち少なくともいずれか一方の分子における前記がん細胞表面に発現する抗原が細胞表面ビメンチンである、エクソソームの分離及び検出方法。
  2. 　前記細胞表面ビメンチンに対する特異的結合物質が抗ＣＳＶ抗体である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記捕捉用分子におけるがん細胞表面に発現する抗原に対する特異的結合物質が、抗ＣＳＶ抗体であり、前記検出用分子におけるがん細胞表面に発現する抗原に対する特異的結合物質が、抗ＣＳＶ抗体、抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記検出用分子におけるがん細胞表面に発現する抗原に対する特異的結合物質が、抗ＣＳＶ抗体であり、前記捕捉用分子におけるがん細胞表面に発現する抗原に対する特異的結合物質が、抗ＣＳＶ抗体、抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、請求項１又は２に記載の方法。
  5. 　前記捕捉用分子が磁性粒子に固定されている、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　前記複合体形成工程の後であって、前記検出工程の前に、
    　洗浄液を添加して、前記複合体以外の夾雑物を除去する洗浄工程を更に含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 　前記検出工程において、前記複合体と、前記検出用分子とを接触させ、次いで、洗浄液を添加して、前記検出用分子が結合した前記複合体以外の夾雑物を除去した後、前記複合体を前記検出用分子で検出する、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 　がん細胞表面に発現する抗原に対する特異的結合物質を含む捕捉用分子と、
    　がん細胞表面に発現する抗原に対する特異的結合物質及び標識物質を含む検出用分子と、を備え、
    　前記捕捉用分子及び前記検出用分子のうち少なくともいずれか一方の分子における前記がん細胞表面に発現する抗原が、細胞表面ビメンチンである、エクソソームの分離及び検出キット。
  9. 　前記細胞表面に発現する抗原に対する特異的結合物質が抗ＣＳＶ抗体である、請求項８に記載のキット。
  10. 　前記捕捉用分子におけるがん細胞表面に発現する抗原に対する特異的結合物質が、抗ＣＳＶ抗体であり、前記検出用分子におけるがん細胞表面に発現する抗原に対する特異的結合物質が、抗ＣＳＶ抗体、抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、請求項８又は９に記載のキット。
  11. 　前記検出用分子におけるがん細胞表面に発現する抗原に対する特異的結合物質が、抗ＣＳＶ抗体であり、前記捕捉用分子におけるがん細胞表面に発現する抗原に対する特異的結合物質が、抗ＣＳＶ抗体、抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、請求項８又は９に記載のキット。
  12. 　前記捕捉用分子が磁性粒子に固定されている、請求項８～１１のいずれか一項に記載のキット。
  13. 　がんの診断用である、請求項８～１２のいずれか一項に記載のキット。
  14. 　初期がんの診断用である、請求項８～１３のいずれか一項に記載のキット。
  15. 　肺がんの診断用である、請求項８～１４のいずれか一項に記載のキット。
  16. 　コンパニオン診断用である、請求項８～１２のいずれか一項に記載のキット。
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