WO2021193802A1 - 肺がん患者に対する免疫チェックポイント阻害剤による治療の有効性を予測するための方法 - Google Patents

肺がん患者に対する免疫チェックポイント阻害剤による治療の有効性を予測するための方法 Download PDF

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immune checkpoint
lung cancer
antibody
checkpoint inhibitor
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勝 上野
世紀 和久井
素晶 水内
新樹 脇内
河上　裕
茂樹 大多
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Jsr株式会社
学校法人慶應義塾
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Definitions

  • the present invention relates to methods for predicting the effectiveness of treatment with immune checkpoint inhibitors in lung cancer patients.
  • the present application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2020-056752 filed in Japan on March 26, 2020, the contents of which are incorporated herein by reference.
  • exosomes are composed of lipid bilayer membranes containing various cell contents such as proteins, nucleic acids, lipids, and sugars, to the outside of the cells. Exosomes are important clues for understanding the pathophysiology of living organisms, and research on how exosomes are involved in various diseases is active.
  • Patent Document 1 discloses that perforin in a blood sample is used as a biomarker for evaluating the effect of cancer treatment by ICI.
  • Non-Patent Document 1 discloses PD-L1-positive exosomes as a biomarker for predicting the therapeutic effect of PD-1 inhibitors in metastatic gastric cancer.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and provides a novel method for predicting the effectiveness of treatment with an immune checkpoint inhibitor for lung cancer patients.
  • the present invention includes the following aspects.
  • the protein is one or more membrane proteins selected from the protein group shown in Table 2 below.
  • the immune checkpoint inhibitor is an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody.
  • the immune checkpoint inhibitor is at least one selected from the group consisting of nivolumab, pembrolizumab, and atezolizumab.
  • a mixture of magnetic particles to which an anti-CD9 antibody, an anti-CD81 antibody, or an anti-CD63 antibody is bound is used. The method described in any one of.
  • immune checkpoint refers to a mechanism that suppresses the activity of immune-related cells (including T cells) and suppresses an immune response. This system suppresses inappropriate immune responses and excessive inflammatory responses to own cells and tissues.
  • An immune checkpoint molecule is a molecule that is expressed on an immune-related cell and, by binding to a ligand, transmits a signal that suppresses an immune response to the immune-related cell. Examples of the immune checkpoint molecule and its ligand include PD-1, CTLA-4, TIM-3 (T-cell immunoglobulin and mucin binding protein-3), LAG-3 (lymphocyte activation gene-3), PD-L1 and PD.
  • immune checkpoint inhibitor refers to an agent that inhibits signal transduction by an immune checkpoint molecule by inhibiting the binding of the immune checkpoint molecule to its ligand.
  • immune checkpoint molecules PD-L1, PD-L2 and CD80 are highly repetitive immune checkpoint molecules that are associated with T cells.
  • Immune checkpoint inhibitors are effective in cancer by the immune function of the living body by inhibiting the ligand-receptor interaction, etc., which controls the transmission of inhibitory signals from such cancer tissues to immune function. It enables exclusion.
  • ⁇ Immune checkpoint inhibitor examples include PD-1 inhibitors, PD-L1 inhibitors, CTLA-4 inhibitors and the like.
  • PD-1 inhibitors include anti-PD-1 antibodies such as nivolumab (sold as Obdivo®) and pembrolizumab (sold as Keytruda®). However, it is not limited to these.
  • PD-L1 inhibitors include, but are not limited to, anti-PD-L1 antibodies such as avelumab, durvalumab, and atezolizumab (sold as Atezolizumab (registered trademark)).
  • CTLA-4 inhibitors include, but are not limited to, anti-CTLA-4 antibodies such as ipilimumab and tremerylumab.
  • immune checkpoint inhibitors include drugs targeting immune checkpoint proteins such as TIM-3, LAG-3, B7-H3, B7-H4, B7-H5 (VISTA), TIGIT and the like. ..
  • a PD-1 inhibitor or a PD-L1 inhibitor is preferable, and an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody is more preferable. If it is an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody, it is similarly preferable to apply it to one or more selected from the group consisting of nivolumab, pembrolizumab, and atezolizumab described in this example.
  • Exosome-derived protein for determining susceptibility to immune checkpoint inhibitors The inventors analyzed exosomes in the blood of 10 responders and 10 non-responders of lung cancer patients whose susceptibility to immune checkpoint inhibitors was revealed, as shown in Examples described later. As a result, 2406 kinds of proteins existing in exosomes were identified, and among them, proteins derived from exosomes having an AUC (Area Under the Curve) value of 0.8 or more on the ROC curve, which is an index of discriminative ability in drug susceptibility determination. I found. Furthermore, an algorithm was constructed in Python based on the AUC value and the best cutoff value of the ROC curve, and a multi-marker having clinically usable sensitivity and specificity was found by combining the above proteins.
  • AUC Average Under the Curve
  • the method for predicting the effectiveness of treatment with an immune checkpoint inhibitor for a lung cancer patient according to an embodiment of the present invention is derived from a lung cancer patient.
  • This method includes isolating an exosome from a biological sample and determining the expression level of a protein present in the exosome by mass spectrometry (hereinafter, may be referred to as "this step").
  • a "companion diagnostic” is a test performed prior to the actual initiation of medication to predict the efficacy of the medication, the risk of side effects, and the appropriate dosage for individual lung cancer patients. Refers to the diagnostic agent used in.
  • the protein is one or more proteins selected from the protein group shown in Tables 4-1 to 4-19 below. As shown in Examples described later, these proteins have an AUC value of 0.8 or more on the ROC curve, which is an index of discriminative ability in drug susceptibility determination, and show the effectiveness of treatment with an immune checkpoint inhibitor for lung cancer patients. It can be said that it is a biomarker having excellent sensitivity and specificity for prediction. Therefore, according to the method of the present embodiment, the effectiveness of treatment with an immune checkpoint inhibitor for lung cancer patients can be predicted with high accuracy.
  • the protein groups shown in Tables 4-1 to 4-19 below are the same as the protein groups shown in Tables 1-1 to 1-6, and are shown in Tables 1-1 to 1-6.
  • the Genbank accession number of the nucleotide sequence of the mRNA encoding each protein in human the Genbank accession number of the amino acid sequence of each protein in human
  • the gene name encoding each protein in human the gene name encoding each protein in human
  • each in human Information on the accession number of UniProt for the amino acid sequence of the protein is shown.
  • one or more membrane proteins selected from the protein groups shown in Table 2 can be preferably used in the method of the present embodiment. ..
  • the protein group shown in Table 2 above is a group consisting of 36 types of membrane proteins having an AUC value of 0.8 or more on the ROC curve, which is an index of discriminative ability in drug susceptibility determination. Is.
  • one or more proteins selected from the protein groups shown in Table 3 above are preferably used in the method of the present embodiment.
  • the proteins shown in Table 3 have an AUC value of 0.8 or more on the ROC curve, which is an index of discriminative ability in drug susceptibility determination, and have drug susceptibility (responder).
  • AUC value 0.8 or more on the ROC curve, which is an index of discriminative ability in drug susceptibility determination, and have drug susceptibility (responder).
  • Examples of the biological sample used in the method of the present embodiment include various liquids such as body fluids, cell culture supernatants, and tissue cell crushed fluids. Of these, body fluids or cell culture supernatants are preferable.
  • Body fluids include whole blood, serum, plasma, various blood cells, blood clots, platelets, etc., as well as urine, semen, pleural effusion, sweat, interstitial fluid, interstitial fluid, bone marrow fluid, tissue fluid, saliva, gastric fluid, and joint fluid. , Pleural effusion, bile, ascites, amniotic fluid, etc. Of these, plasma is preferable.
  • the plasma may be treated with an anticoagulant such as citric acid, heparin, or EDTA.
  • a pretreated one may be used by adding it to a known buffer, but a biological sample taken from the living body can also be used as it is.
  • the amount of the sample can be adjusted as appropriate, but may be, for example, 1 ⁇ L or more and 1000 ⁇ L or less, and may be, for example, 1 ⁇ L or more and 500 ⁇ L or less.
  • Examples of the method for isolating exosomes from a biological sample include, but are not limited to, a PEG precipitation method, an isolation method using an ultracentrifuge, and an immunoprecipitation method using a molecule for capturing exosomes. Above all, it is preferable to use an immunoprecipitation method using a molecule for capturing exosomes because selective separation of exosomes can be easily performed without pretreatment.
  • the exosome capture molecule consists of a specific binding substance for the antigen expressed on the surface of the exosome.
  • antigen expressed on the surface of the exosome examples include, but are not limited to, CD9, CD63, and CD81.
  • Molecules for exosome capture consist of specific binding agents for these antigens.
  • specific binding substance include those that specifically bind to an antigen.
  • examples of those that specifically bind to an antigen include antibodies and aptamers.
  • the antibody may be any antibody that has the ability to bind to an antigen sequence (epitope) on the surface of an exosome, and specific examples thereof include anti-CD9 antibody, anti-CD63 antibody, and anti-CD81 antibody.
  • These antibodies may be monoclonal antibodies or polyclonal antibodies, but are preferably monoclonal antibodies. Further, a plurality of antibodies can be mixed and used. Furthermore, these antibodies may be bispecific antibodies. Examples of the antibody class include IgG and IgM, but IgG is preferable. Further, the antibody may be a chimeric antibody such as a humanized antibody.
  • the antibody may be derived from animal species such as mammals such as humans, mice, rabbits, cows, pigs, horses, sheep and goats, and birds such as chickens, and is not particularly limited.
  • the antibody may be prepared, for example, from the serum derived from the animal species by a conventionally known method, an antibody synthesized from known antibody gene sequence information may be used, or a commercially available antibody may be used. ..
  • an antibody fragment can be used instead of the antibody.
  • the antibody fragment include Fv, Fab, Fab', F (ab') 2, rIgG, and scFv.
  • An aptamer is a substance that has a specific binding ability to a target substance.
  • examples of the aptamer include nucleic acid aptamers and peptide aptamers.
  • Nucleic acid aptamers having an antigen-specific binding ability can be selected by, for example, the systematic evolution of ligand by exponential evolution (SELEX) method.
  • peptide aptamers having an antigen-specific binding ability can be selected by, for example, the Two-hybrid method using yeast.
  • the exosome capture molecule is preferably immobilized on a solid phase carrier.
  • Materials of the solid phase carrier include polystyrenes, polyethylenes, polypropylenes, polyesters, poly (meth) acrylonitriles, styrene-butadiene copolymers, poly (meth) acrylic acid esters, fluororesins, crosslinked dextran, and poly.
  • Polymer compounds such as polystyrene; glass; metals; magnetic materials; resin compositions containing magnetic materials; combinations thereof can be mentioned.
  • the shape of the solid phase carrier is not particularly limited, and examples thereof include tray shape, spherical shape, particle shape, fibrous shape, rod shape, disc shape, container shape, cell, microplate, microfluidic device, and test tube. Be done. Magnetic particles are preferred in this step.
  • magnétique particles examples include iron trioxide (Fe 3 O 4 ), iron sesquioxide ( ⁇ -Fe 2 O 3 ), various ferrites, iron, manganese, nickel, cobalt, chromium and other metals; cobalt, nickel, manganese.
  • the resin examples include hydrophobic polymers and hydrophilic polymers. Among them, magnetic particles containing a magnetic substance in the resin are preferable, and those in which a polymer layer is formed on the surface of mother particles containing superparamagnetic fine particles are more preferable.
  • a hydrophobic first polymer layer is formed on the surface of a mother particle containing ultranormal magnetic fine particles described in JP-A-2008-32411 (Reference 1), and at least the surface is formed on the first polymer layer.
  • Examples thereof include magnetic particles in which a second polymer layer having a glycidyl group is formed and a polar group is introduced by chemically modifying the glycidyl group.
  • the monomer for forming the hydrophobic first polymer layer is roughly classified into a monofunctional monomer and a crosslinkable monomer.
  • aromatic vinyl-based monomers such as styrene, ⁇ -methylstyrene, and halogenated styrene; methyl acrylate, methyl methacrylate, ethyl acrylate, ethyl methacrylate, stearyl acrylate, stearyl methacrylate, cyclohexyl acrylate, cyclohexyl methacrylate, and iso Examples thereof include ethylenically unsaturated carboxylic acid alkyl ester-based monomers such as bonyl acrylate and isobonyl methacrylate.
  • crosslinkable monomer ethylene glycol diacrylate, ethylene glycol dimethacrylate, trimethylolpropane triacrylate, trimethylolpropane trimethacrylate, pentaerythritol triacrylate, pentaerythritol trimethacrylate, dipentaerythritol hexaacrylate, and dipentaerythritol hexaacrylate are used.
  • Polyfunctional (meth) acrylates such as methacrylate; in addition to conjugated diolefins such as butadiene and iprene, divinylbenzene, diallyl phthalate, allyl acrylate, and allyl methacrylate can be mentioned.
  • the monomer for forming the second polymer layer has the main purpose of introducing a functional group onto the particle surface, and contains a glycidyl group-containing monomer.
  • the content of the glycidyl group-containing monomer is preferably 20% by mass or more in the monomer for forming the second polymer layer.
  • examples of the copolymerizable monomer containing a glycidyl group include glycidyl acrylate, glycidyl methacrylate, and allyl glycidyl ether.
  • the polar group introduced by chemically modifying the glycidyl group of the second polymer layer is preferably a functional group capable of reacting with a specific binding substance for an antigen expressed on the surface of cancer cells, and is preferably an oxygen atom or nitrogen. More preferably, it contains at least one atom selected from the group consisting of atoms and sulfur atoms. Of these, an amino group, an aldehyde group, a carboxy group, or an active ester group is more preferable.
  • the second polymer layer of the magnetic particles has the polar group and the 2,3-dihydroxypropyl group, it with a specific binding substance for an antigen expressed on the surface of an exosome (particularly, an antibody against an antigen expressed on the surface of an exosome). Good binding.
  • a physical adsorption method As a method for binding a specific binding substance to an antigen expressed on the surface of an exosome to a solid phase carrier, a physical adsorption method, a covalent bonding method, an ionic bonding method, or a chemical bonding method is used.
  • the physical adsorption method include a method of directly immobilizing a specific binding substance to an antigen expressed on the surface of an exosome on a solid phase carrier, a method of chemically adsorbing to another protein such as albumin, and then adsorbing and immobilizing the substance. Can be mentioned.
  • a method of chemically binding a method of directly binding to the solid phase carrier using a functional group introduced into the surface of the solid phase carrier and capable of reacting with a specific binding substance for an antigen expressed on the surface of the exosome, or solidification
  • a spacer molecule carbbodiimide compound, etc.
  • Examples thereof include a method of chemically binding the protein to a solid phase carrier after binding a specific binding substance to the substance.
  • the immunoprecipitation method using an exosome-capturing molecule may be carried out by using salts, a protein such as albumin, a surfactant or the like, if necessary, in addition to each of the above components.
  • the reaction temperature in the immunoprecipitation method using an exosome capture molecule is usually in the range of 2 ° C. or higher and 42 ° C. or lower, and the reaction time is usually 5 minutes or longer and 24 hours or lower.
  • the reaction time is preferably 8 hours or longer and 30 hours or lower, and when the reaction is carried out at 8 ° C. or higher and 42 ° C. or lower, the reaction time is preferably 5 minutes or longer and 24 hours or shorter.
  • the pH in the system is not particularly limited, but is preferably in the range of pH 5 or more and 10 or less, and more preferably in the range of pH 6 or more and 8 or less.
  • a buffer solution is usually used, for example, a phosphate buffer solution, a tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer solution, a HEPES buffer solution, or a MES buffer solution is used.
  • the amount used and the mixing ratio are not particularly limited, but 0.00001 to 10 w / v% with respect to the total amount of the liquid phase in the system. Is preferable, 0.00001 to 5 w / v% is more preferable, and 0.001 to 0.1 w / v% is further preferable.
  • Mass spectrometry is then used to determine the expression level of the protein present in the isolated exosomes.
  • the protein whose expression level is to be determined is one or more proteins selected from the group consisting of the proteins shown in Tables 4-1 to 4-19 above.
  • liquid chromatography Liquid chromatographic; LC), high performance liquid chromatography (High performance liquid chromatography; HPLC), gas chromatography.
  • gas chromatography Gas chromatography; GC
  • thin layer chromatography size exclusion chromatography, but not limited to these.
  • liquid chromatography or high performance liquid chromatography is preferable.
  • mass spectrometry examples include tandem quadrupole mass spectrometry (MS / MS), direct injection mass spectrometry, and Fourier transformation ion cyclotron resonance mass spectrometry (FT-ICR-MS).
  • Capillary Electrophoresis mass spectrometry (CE-MS) method Inductive Coupled Plasma mass spectrometry; ICP-MS method, Thermal decomposition mass spectrometry (ICP-MS) method Examples thereof include ion mobility mass spectrometry and time-of-fly mass spectrometry (TOF MS).
  • mass spectrometry method a mass spectrometry method combined with the above-mentioned separation method is preferable, and for example, GC-MS method, LC-MS method, HPLC-MS method, LC-MS / MS method, HPLC-MS / MS.
  • GC-MS method a mass spectrometry method combined with the above-mentioned separation method is preferable, and for example, GC-MS method, LC-MS method, HPLC-MS method, LC-MS / MS method, HPLC-MS / MS.
  • the law is, but is not limited to.
  • the expression level of a protein can be determined, for example, by analysis using a DIA (data-independent acquisition) method in mass spectrometry.
  • the DIA method is a data-independent analysis method, and is a comprehensive analysis method that performs MS / MS analysis of all ions contained in a certain mass range.
  • the SWATH method which is one of the DIA methods, repeats the work of acquiring MS / MS 10 times while shifting the window having a width of 100 Da, and records the MS / MS spectrum of all ions having a total width of 1,000 Da. (The window width and the number of acquisitions are variable).
  • the effectiveness of treatment with an immune checkpoint inhibitor in a lung cancer patient from which the biological sample to be evaluated is derived is predicted based on the determined protein expression level. Specifically, when the protein expression level is below a preset reference value, the lung cancer patient from which the biological sample to be evaluated is derived may be sensitive to an immune checkpoint inhibitor, that is, , Can be evaluated or predicted that treatment with immune checkpoint inhibitors may be effective. On the other hand, if the protein expression level exceeds a preset reference value, the lung cancer patient from which the biological sample to be evaluated is derived may not be sensitive to the immune checkpoint inhibitor, that is, , Can be evaluated or predicted that treatment with immune checkpoint inhibitors may not be effective.
  • the reference value is a reference value for distinguishing a lung cancer patient group (responder group) who is sensitive to an immune checkpoint inhibitor and a lung cancer patient group (non-responder group) who is not sensitive to an immune checkpoint inhibitor. ..
  • the reference value can be obtained experimentally, for example, by measuring the expression level of a specific protein present in the exosomes of the responder group and the non-responder group, and as a threshold value capable of distinguishing between the two groups.
  • the method for determining the reference value of the expression level of a specific protein in the method of the present embodiment is not particularly limited, and for example, it can be determined using a general statistical method.
  • the specific protein referred to here means one or more kinds of proteins selected from the protein group shown in Tables 4-1 to 4-19 above.
  • a patient who has been diagnosed with lung cancer by a method such as a commonly used diagnostic imaging is collected in advance before administration of an immune checkpoint inhibitor.
  • the expression level of a specific protein present in an exosome in a set biological sample is measured. After measuring for a plurality of patients, the expression level of a specific protein present in exosomes in these biological samples can be calculated from the average value or the median value, and the numerical value including this can be used as a reference value. Further, it is preferable that the reference value is described in the instruction manual or the like of the kit relating to the evaluation or prediction method.
  • the expression levels of specific proteins present in exosomes in biological samples collected in advance before administration of immune checkpoint inhibitors were measured for a plurality of responder groups and a plurality of non-responder groups, respectively.
  • the two values are distinguished in consideration of the variation.
  • a threshold value can be obtained and used as a reference value.
  • the present invention provides the efficacy of treatment with an immune checkpoint inhibitor for lung cancer patients consisting of one or more proteins selected from the protein groups shown in Tables 1-1 to 1-6 above.
  • the present invention is for predicting or diagnosing the effectiveness of treatment with an immune checkpoint inhibitor for lung cancer patients, which comprises one or more membrane proteins selected from the protein group shown in Table 2 above.
  • the present invention is a bio for predicting or diagnosing the effectiveness of treatment with an immune checkpoint inhibitor for lung cancer patients, which comprises one or more proteins selected from the protein group shown in Table 3 above. Provide markers.
  • the present invention is a method of diagnosing the effectiveness of treatment with an immune checkpoint inhibitor for a lung cancer patient, that is, a companion diagnostic method of an immune checkpoint inhibitor for a lung cancer patient. Including isolating exosomes from a biological sample derived from the lung cancer patient and determining the expression level of proteins present in the exosomes by mass spectrometry. Provided is a method, wherein the protein is one or more proteins selected from the protein group shown in Tables 1-1 to 1-6.
  • the present invention is a method of diagnosing the effectiveness of treatment with an immune checkpoint inhibitor for a lung cancer patient, that is, a companion diagnostic method of an immune checkpoint inhibitor for a lung cancer patient. Including isolating exosomes from a biological sample derived from the lung cancer patient and determining the expression level of proteins present in the exosomes by mass spectrometry.
  • the protein provides a method of being one or more proteins selected from the protein group shown in Table 2 above.
  • the present invention is a method of diagnosing the effectiveness of treatment with an immune checkpoint inhibitor for a lung cancer patient, that is, a companion diagnostic method of an immune checkpoint inhibitor for a lung cancer patient. Including isolating exosomes from a biological sample derived from the lung cancer patient and determining the expression level of proteins present in the exosomes by mass spectrometry.
  • the protein provides a method of being one or more proteins selected from the protein group shown in Table 3 above.
  • Example 1 1. LC-MS analysis of exosomes (1) Preparation of biological samples EDTA plasma (before administration of nivolumab, pembrolizumab, or atezolizumab) of 20 Japanese lung cancer patients was used in the following tests. For the lung cancer patient group, 10 patients (5 patients receiving nivolumab) who were judged to have PR (partial response) after administration of nivolumab (12 cases), pembrolizumab (6 cases), or atezolizumab (2 cases) according to the RECIST guidelines.
  • Antibody-binding particles for exosome capture Magnetic particles manufactured by JSR Life Science Co., Ltd., Monoclonal TM MS300 / Carboxyl
  • Anti-CD9mAb manufactured by MBL, MEX001-3
  • Anti-CD63 LAMP-3)
  • MAb MAb
  • TAPA1 Anti-CD81
  • Example 1 ExoCap TM Ultracentrifuge / Storage Booster (MEX-USB, manufactured by MBL)
  • the antibody-bound particles were transferred to a new 2 mL low adsorption tube and washed twice with TBS. Then, 50 ⁇ L of a 2 mass% sodium dodecyl sulfate (SDS) solution was added, and the mixture was shaken at 25 ° C. for 10 minutes. The supernatant after the reaction was added to a 100 K ultrafiltration spin column (OD100C34 manufactured by PALL), centrifuged at 10,000 ⁇ g for 5 minutes, and the filtrate was collected in a 2 mL low adsorption tube to prepare an exosome extract. ..
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • DTT dithiothreitol
  • iodoacetamide was added to a final concentration of 30 mM and reacted at room temperature for 30 minutes under light-shielded conditions.
  • cysteine was added to a final concentration of 60 mM and the mixture was allowed to stand at room temperature for 10 minutes.
  • Membrane protein group is extracted from the protein groups in Tables 5-1 to 5-54 above based on the Printed membrane protein information of The Human Protein Atlas (https://www.proteinatlas.org/). bottom. A list of the obtained membrane proteins is shown in Tables 6-1 to 6-15.
  • the effectiveness of treatment with an immune checkpoint inhibitor for lung cancer patients can be predicted with high accuracy.

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Abstract

肺がん患者に対する免疫チェックポイント阻害剤による治療の有効性を予測するための方法は、前記肺がん患者由来の生体試料からエクソソームを単離し、質量分析法により前記エクソソームに存在するタンパク質の発現量を決定することを含み、前記タンパク質は、表１－１～表１－６に示されるタンパク質群から選択される１種以上のタンパク質である。

Description

肺がん患者に対する免疫チェックポイント阻害剤による治療の有効性を予測するための方法
　本発明は、肺がん患者に対する免疫チェックポイント阻害剤による治療の有効性を予測するための方法に関する。
　本願は、２０２０年３月２６日に、日本に出願された特願２０２０－０５６７５２号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１抗体等の免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）のコンパニオン診断として、腫瘍組織でのＰＤ－Ｌ１発現による診断や、マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）検査による診断等が実用化されている。しかしながら、ＰＤ－Ｌ１発現による診断では、抗体によって判定結果が異なることや、陰性と判定された症例においてもＩＣＩの投与が奏功する例がある。ＭＳＩ検査による診断では、マイクロサテライト不安定性を有する（ＭＳＩ－Ｈｉｇｈ）患者はほとんどの癌種において１０％以下であり、ＭＳＩ－Ｈｉｇｈ患者においても薬剤耐性を示す例がある。よって、これらの診断手法は、その感度及び特異度が十分とは言い難く、治療効果を予測するためのバイオマーカーの探索が大きな課題となっている。
　一方、細胞は、エクソソームと呼ばれる、その内部にタンパク質、核酸、脂質、糖といった様々な細胞内容物を含む脂質二重膜からなる小胞を細胞外に放出することが知られている。エクソソームは生体の病態を知るための重要な手掛かりとなる物質であり、エクソソームが各種疾患にどのように関与するかについての研究が盛んである。
　特許文献１には、ＩＣＩによるがん治療の効果を評価するためのバイオマーカーとして、血液試料中のパーフォリンを利用することが開示されている。
　非特許文献１には、転移性胃癌におけるＰＤ－１阻害剤の治療効果を予測するためのバイオマーカーとして、ＰＤ－Ｌ１陽性のエクソソームが開示されている。
　しかしながら、肺がんにおけるＩＣＩのコンパニオン診断用バイオマーカーは存在するものの、さらに感度及び特異度の高い、肺がんにおけるＩＣＩの効果予測方法の開発が望まれている。
日本国特許第６６３００２６号公報
　本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、肺がん患者に対する免疫チェックポイント阻害剤による治療の有効性を予測するための新規の方法を提供する。
　すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
（１）　肺がん患者に対する免疫チェックポイント阻害剤による治療の有効性を予測するための方法であって、
　前記肺がん患者由来の生体試料からエクソソームを単離し、質量分析法により前記エクソソームに存在するタンパク質の発現量を決定することを含み、
　前記タンパク質は、以下の表１－１～表１－６に示されるタンパク質群から選択される１種以上のタンパク質である、方法。
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　前記タンパク質は、以下の表２に示されるタンパク質群から選択される１種以上の膜タンパク質である、前記（１）に記載の方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
（３）　前記タンパク質は、以下の表３に示されるタンパク質群から選択される１種以上のタンパク質である、前記（１）に記載の方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
（４）　前記免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、前記（１）～前記（３）のいずれか一つに記載の方法。
（５）　前記免疫チェックポイント阻害剤が、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、及びアテゾリズマブからなる群より選ばれる１種以上である、前記（１）～前記（４）のいずれか一つに記載の方法。
（６）　前記肺がん患者由来の生体試料からエクソソームを単離する方法として、抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ８１抗体、又は抗ＣＤ６３抗体を結合した磁性粒子の混合物を用いる、前記（１）～前記（５）のいずれか一つに記載の方法。
　上記態様によれば、肺がん患者に対する免疫チェックポイント阻害剤による治療の有効性を予測するための新規の方法を提供することができる。
＜免疫チェックポイント＞
　本明細書において、「免疫チェックポイント（システム）」とは、免疫関連細胞（Ｔ細胞を含む）の活性を抑えて、免疫応答を抑制する機構をいう。このシステムにより、自己の細胞や組織への不適切な免疫応答や過剰な炎症反応を抑制している。免疫チェックポイント分子は、免疫関連細胞上に発現し、リガンドと結合することによって、当該免疫関連細胞に対し免疫応答を抑制するシグナルを伝達する分子をいう。免疫チェックポイント分子及びそのリガンドとしては、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３（Ｔ－ｃｅｌｌ　ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　ａｎｄ　ｍｕｃｉｎ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ－３）、ＬＡＧ－３（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｇｅｎｅ－３）、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＢＴＮＬ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ５（ＶＩＳＴＡ）、ＣＤ４８、ＣＤ８０、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＣＤ６０、ＣＤ８６、ＴＩＧＩＴ（Ｔ　ｃｅｌｌ　ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｗｉｔｈ　Ｉｇ　ａｎｄ　ＩＴＩＭ　ｄｏｍａｉｎ）等の分子が挙げられるが、これらに限定されない。
　本明細書において、「免疫チェックポイント阻害剤」とは、免疫チェックポイント分子とそのリガンドとの結合を阻害することにより、当該免疫チェックポイント分子によるシグナル伝達を阻害する薬剤をいう。多くのがん細胞は、免疫チェックポイント分子のリガンドであるＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２やＣＤ８０を細胞表面に発現させるが、これが、Ｔ細胞等の免疫関連細胞による攻撃からの回避につながっているため、通常の状態では、生体の免疫機能のみではがん組織を排除できなくなっていると考えられている。免疫チェックポイント阻害剤は、そのようながん組織から免疫機能への抑制的シグナルの伝達を司る、リガンド－受容体相互作用等を阻害することによって、生体の免疫機能による効率的ながんの排除を可能にするものである。
＜免疫チェックポイント阻害剤＞
　免疫チェックポイント阻害剤としては、ＰＤ－１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、ＣＴＬＡ－４阻害剤等が挙げられる。
　ＰＤ－１阻害剤としては、ニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ；オブジーボ（登録商標）として販売されている）、ペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ；キイトルーダ（登録商標）として販売されている）等の抗ＰＤ－１抗体等が挙げられるが、これらに限定されない。
　ＰＤ－Ｌ１阻害剤としては、アベルマブ、デュルバルマブ、アテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ；テセントリク（登録商標）として販売されている）等の抗ＰＤ－Ｌ１抗体等が挙げられるが、これらに限定されない。
　ＣＴＬＡ－４阻害剤としては、イピリムマブ、トレメリルマブ等の抗ＣＴＬＡ－４抗体等が挙げられるが、これらに限定されない。
　免疫チェックポイント阻害剤の他の例としては、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ５（ＶＩＳＴＡ）、ＴＩＧＩＴ等の免疫チェックポイントタンパク質を標的した薬剤等が挙げられる。
　中でも、本実施形態の方法に適用される免疫チェックポイント阻害剤としては、ＰＤ－１阻害剤又はＰＤ－Ｌ１阻害剤が好ましく、抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体がより好ましい。抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体であれば、本実施例に記載のニボルマブ、ペムブロリズマブ、及びアテゾリズマブからなる群より選ばれる１種以上に適用することも同様に好ましい。
＜免疫チェックポイント阻害剤感受性判定用エクソソーム由来タンパク質＞
　発明者らは、後述する実施例に示すように、免疫チェックポイント阻害剤に対する感受性が明らかとなっている肺がん患者のレスポンダー１０例と非レスポンダー１０例の血液中のエクソソームを解析した。その結果、エクソソームに存在する２４０６種のタンパク質を同定し、その中から薬剤感受性判定における判別能の指標となるＲＯＣ曲線のＡＵＣ（Ａｒｅａ　Ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　Ｃｕｒｖｅ）の値が０．８以上のエクソソーム由来のタンパク質を見出した。さらに、ＲＯＣ曲線のＡＵＣ値と最良カットオフ値に基づいてＰｙｔｈｏｎでアルゴリズムを構築し、上記タンパク質を組み合わせた、臨床で使用可能な感度及び特異度を有するマルチマーカーを見出した。
＜肺がん患者に対する免疫チェックポイント阻害剤による治療の有効性を予測するための方法＞
　本発明の一実施形態に係る肺がん患者に対する免疫チェックポイント阻害剤による治療の有効性を予測するための方法（以下、単に「本実施形態の方法」と称する場合がある）は、肺がん患者由来の生体試料からエクソソームを単離し、質量分析法により前記エクソソームに存在するタンパク質の発現量を決定すること（以下、「本工程」という場合がある）を含む方法である。本明細書及び特許請求の範囲において、「コンパニオン診断薬」は、個々の肺がん患者に対する医薬品の効果、副作用のリスク、適切な投薬量を予測するために、実際に投薬を開始する前に行う検査で使用される診断薬をいう。
　前記タンパク質は、以下の表４－１～表４－１９に示されるタンパク質群から選択される１種以上のタンパク質である。これらタンパク質は、後述する実施例に示すように、薬剤感受性判定における判別能の指標となるＲＯＣ曲線のＡＵＣ値が０．８以上であり、肺がん患者に対する免疫チェックポイント阻害剤による治療の有効性を予測するための、感度及び特異度に優れるバイオマーカーといえる。そのため、本実施形態の方法によれば、肺がん患者に対する免疫チェックポイント阻害剤による治療の有効性を高精度に予測することができる。
　以下の表４－１～表４－１９に示されるタンパク質群は、上記表１－１～表１－６に示されるタンパク質群と同一であり、上記表１－１～表１－６に示されるタンパク質群について、ヒトにおける各タンパク質をコードするｍＲＮＡの塩基配列のＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号、ヒトにおける各タンパク質のアミノ酸配列のＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号、ヒトにおける各タンパク質をコードする遺伝子名、ヒトにおける各タンパク質のアミノ酸配列のＵｎｉＰｒｏｔのアクセッション番号の情報が示されている。
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　上記表４－１～表４－１９に示されるタンパク質群の中でも、例えば、上記表２に示されるタンパク質群から選択される１種以上の膜タンパク質を本実施形態の方法に好ましく用いることができる。上記表２に示されるタンパク質群は、後述する実施例に示すように、薬剤感受性判定における判別能の指標となるＲＯＣ曲線のＡＵＣ値が０．８以上である、３６種の膜タンパク質からなる群である。
　また、上記表４－１～表４－１９に示されるタンパク質群の中でも、例えば、上記表３に示されるタンパク質群から選択される１種以上のタンパク質を本実施形態の方法に好ましく用いることができる。上記表３に示されるタンパク質群は、後述する実施例に示すように、薬剤感受性判定における判別能の指標となるＲＯＣ曲線のＡＵＣ値が０．８以上であって、薬剤感受性を有する患者（レスポンダー）についてＹｏｕｄｅｎ　ｉｄｅｘで計算した閾値をもとに偽陰性が生じない、１１種のタンパク質からなる群である。
　以下、本実施形態の方法について、詳細を説明する。
　本実施形態の方法に用いられる生体試料としては、体液、細胞培養上清、組織細胞の破砕液等の各種液体が挙げられる。中でも、体液、又は細胞培養上清が好ましい。体液としては、全血、血清、血漿、各種血球、血餅、血小板等の他、尿、精液、母乳、汗、間質液、間質性リンパ液、骨髄液、組織液、唾液、胃液、関節液、胸水、胆汁、腹水、羊水等が挙げられる。中でも、血漿が好ましい。なお、血漿は、クエン酸、ヘパリン、ＥＤＴＡ等の抗凝固剤で処理されたものでもよい。
　生体試料は、公知のバッファーに添加しておく等して前処理したものを用いてもよいが、生体から摂取したものをそのまま用いることもできる。
　試料の量は、適宜調整することができるが、例えば、１μＬ以上１０００μＬ以下であってもよく、例えば、１μＬ以上５００μＬ以下であってもよい。
　生体試料からエクソソームを単離する方法としては、ＰＥＧ沈殿法、超遠心機等を用いた単離法、エクソソーム捕捉用分子を用いた免疫沈降法等が挙げられるが、これらに限定されない。中でも、前処理を行わず簡便に、エクソソームの選択的な分離を行うことができることから、エクソソーム捕捉用分子を用いた免疫沈降法を用いることが好ましい。
　エクソソーム捕捉用分子は、エクソソーム表面に発現する抗原に対する特異的結合物質からなる。
　エクソソーム表面に発現する抗原としては、例えば、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１が挙げられるが、これらに限定されない。
　エクソソーム捕捉用分子は、これら抗原に対する特異的結合物質からなる。
　特異的結合物質としては、例えば、抗原に特異的に結合するものが挙げられる。抗原に特異的に結合するものとしては、例えば、抗体、アプタマーが挙げられる。
　抗体としては、エクソソーム表面上の抗原配列（エピトープ）に対する結合能を有するものであればよく、具体的には、例えば、抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体、抗ＣＤ８１抗体が挙げられる。これらの抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましい。また、複数の抗体を混合して用いることもできる。さらに、これらの抗体は、二重特異性抗体であってもよい。抗体のクラスとしては、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭが挙げられるが、ＩｇＧが好ましい。また、抗体は、ヒト化抗体等のキメラ抗体であってもよい。抗体は、ヒト、マウス、ウサギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ等の哺乳動物、ニワトリ等の鳥類等の動物種由来のものでもよく、特に制限されない。抗体は、例えば、前記動物種由来の血清から、従来公知の方法により調製してもよく、公知の抗体遺伝子配列情報から合成した抗体を使用してもよく、市販の抗体を使用してもよい。
　また、抗体の代わりに抗体断片を用いることもできる。抗体断片としては、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、ｒＩｇＧ、ｓｃＦｖが挙げられる。
　アプタマーとは、標的物質に対する特異的結合能を有する物質である。アプタマーとしては、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー等が挙げられる。抗原に特異的結合能を有する核酸アプタマーは、例えば、ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｉｇａｎｄ　ｂｙ　ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ　ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（ＳＥＬＥＸ）法により選別することができる。また、抗原に特異的結合能を有するペプチドアプタマーは、例えば、酵母を用いたＴｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ法により選別することができる。
　エクソソーム捕捉用分子は、固相担体に固定されていることが好ましい。
　固相担体の材質としては、ポリスチレン類、ポリエチレン類、ポリプロピレン類、ポリエステル類、ポリ（メタ）アクリロニトリル類、スチレン－ブタジエン共重合体、ポリ（メタ）アクリル酸エステル類、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライド等の高分子化合物；ガラス；金属；磁性体；磁性体を含む樹脂組成物；これらの組み合わせが挙げられる。
　また、固相担体の形状は特に限定されるものではなく、例えば、トレイ状、球状、粒子状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、マイクロプレート、マイクロ流体デバイス、試験管が挙げられる。
　本工程においては、磁性粒子が好ましい。
　上記磁性粒子としては、四三酸化鉄（Ｆｅ３Ｏ４）、三二酸化鉄（γ－Ｆｅ２Ｏ３）、各種フェライト、鉄、マンガン、ニッケル、コバルト、クロム等の金属；コバルト、ニッケル、マンガン等の合金からなる磁性体微粒子；これら磁性体を樹脂中に含む磁性粒子が挙げられる。樹脂としては、疎水性ポリマー、親水性ポリマー等が挙げられる。
　中でも、磁性体を樹脂中に含む磁性粒子が好ましく、超常磁性微粒子を含む母粒子の表面にポリマー層が形成されたものがより好ましい。例えば、特開２００８－３２４１１号公報（参考文献１）に記載の、超常磁性微粒子を含む母粒子の表面に、疎水性の第１ポリマー層が形成され、当該第１ポリマー層上に、少なくとも表面にグリシジル基を有する第２ポリマー層が形成され、当該グリシジル基を化学修飾することにより極性基が導入された磁性粒子が挙げられる。
　ここで、超常磁性微粒子としては、粒子径２０ｎｍ以下（好ましくは粒子径５ｎｍ以上２０ｎｍ以下）の酸化鉄系の微粒子が代表的であり、ＸＦｅ２Ｏ４（Ｘ＝Ｍ ｎ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｇ、Ｃｕ、Ｌｉ０．５Ｆｅ０．５等）で表現されるフェライト、Ｆｅ３Ｏ４で表現されるマグネタイト、γ－Ｆｅ２Ｏ３が挙げられ、飽和磁化が強く、かつ残留磁化が少ない点で、γ－Ｆｅ２Ｏ３及びＦｅ３Ｏ４のいずれか一方を含むことが好ましい。
　また、上記疎水性の第１ポリマー層を形成するためのモノマーは、単官能性モノマー、架橋性モノマーに大別される。
　上記単官能性モノマーとして、スチレン、α－メチルスチレン、ハロゲン化スチレン等の芳香族ビニル系モノマー；メチルアクリレート、メチルメタクリレート、エチルアクリレート、エチルメタクリレート、ステアリルアクリレート、ステアリルメタクリレート、シクロヘキシルアクリレート、シクロヘキシルメタクリレート、イソボニルアクリレート、イソボニルメタクリレート等のエチレン性不飽和カルボン酸アルキルエステル系モノマーが挙げられる。
　また、上記架橋性モノマーとして、エチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレート、ペンタエリスリトールトリアクリレート、ペンタエリスリトールトリメタクリレート、ジペンタエリスリトールヘキサアクリレート、ジペンタエリスリトールヘキサメタクリレート等の多官能性（メタ）アクリレート；ブタジエン、イプレン等の共役ジオレフィンの他、ジビニルベンゼン、ジアリルフタレート、アリルアクリレート、アリルメタクリレートが挙げられる。
　また、上記第２ポリマー層を形成するためのモノマーは、粒子表面への官能基導入を主目的とするものであり、グリシジル基含有モノマーを含むものである。グリシジル基含有モノマーの含有量としては、第２ポリマー層を形成するためのモノマー中、２０質量％以上が好ましい。ここで、グリシジル基を含む共重合性モノマーとしては、例えば、グリシジルアクリレート、グリシジルメタクリレート、アリルグリシジルエーテルが挙げられる。
　第２ポリマー層のグリシジル基を化学修飾することにより導入される極性基としては、がん細胞表面に発現する抗原に対する特異的結合物質と反応可能な官能基であることが好ましく、酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群より選ばれた少なくとも１種の原子を１個以上含むものがより好ましい。中でも、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシ基、又は活性エステル基がより好ましい。特に、磁性粒子の第２ポリマー層が前記極性基及び２，３－ジヒドロキシプロピル基を有する場合、エクソソーム表面に発現する抗原に対する特異的結合物質（特に、エクソソーム表面に発現する抗原に対する抗体）との結合性が良好となる。
　エクソソーム表面に発現する抗原に対する特異的結合物質を固相担体に結合する方法としては、物理的吸着法や、共有結合法、イオン結合法といった化学的に結合する方法等が用いられる。物理的吸着法としては、固相担体にエクソソーム表面に発現する抗原に対する特異的結合物質を直接固定する方法、アルブミン等の他のタンパク質に化学的に結合させてから吸着させて固定する方法等が挙げられる。化学的に結合させる方法としては、固相担体表面に導入した、エクソソーム表面に発現する抗原に対する特異的結合物質と反応可能な官能基を利用して、固相担体上に直接結合する方法、固相担体とエクソソーム表面に発現する抗原に対する特異的結合物質との間にスペーサー分子（カルボジイミド化合物等）を化学結合で導入してから結合する方法、アルブミン等の他のタンパク質にエクソソーム表面に発現する抗原に対する特異的結合物質を結合させた後、そのタンパク質を固相担体に化学結合する方法等が挙げられる。
　エクソソーム捕捉用分子を用いた免疫沈降法は、上記各成分の他に、必要に応じて、塩類や、アルブミン等のタンパク質、界面活性剤等を用いて行ってもよい。
　エクソソーム捕捉用分子を用いた免疫沈降法における反応温度は、通常２℃以上４２℃以下の範囲内であり、反応時間は、通常５分間以上２４時間以下である。２℃以上８℃以下で反応を行う場合、反応時間は好ましくは８時間以上３０時間以下、８℃以上４２℃以下で反応を行う場合、反応時間は好ましくは５分間以上２４時間以下である。
　エクソソーム捕捉用分子を用いた免疫沈降法において、系中のｐＨは特に限定されないが、好ましくはｐＨ５以上１０以下の範囲、より好ましくはｐＨ６以上８以下の範囲である。目的のｐＨを維持するために、通常、緩衝液が用いられ、例えば、リン酸緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液が用いられる。
　また、エクソソーム捕捉用分子を固定した固相担体を１種類以上用いる場合、その使用量と混合比率は特に限定されないが、系内の液相の総量に対して、０．００００１～１０ｗ／ｖ％が好ましく、０．００００１～５ｗ／ｖ％がより好ましく、０．００１～０．１ｗ／ｖ％がさらに好ましい。
　次いで、質量分析法を用いて、単離されたエクソソームに存在するタンパク質の発現量を決定する。
　発現量の決定対象となるタンパク質は、上記表４－１～表４－１９に示されるタンパク質群からなる群より選択される１種以上のタンパク質である。
　質量分析法を用いる場合、質量分析の前にエクソソームに存在する物質を分離するための前処理を行ってもよい。分離方法としては、各種クロマトグラフィー分離技術を用いることができ、より具体的には、例えば、液体クロマトグラフィー（Ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィー（Ｇａｓ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ＧＣ）、薄層クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない。中でも、液体クロマトグラフィー又は高速液体クロマトグラフィーが好ましい。
　質量分析法としては、タンデム四重極型質量分析（ＭＳ／ＭＳ）法、直接注入質量分析法、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析（Ｆｏｕｒｉｅｒ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍ　ｉｏｎ　ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ；ＦＴ－ＩＣＲ－ＭＳ）法、キャピラリー電気泳動質量分析（Ｃａｐｉｌｌａｒｙ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ；ＣＥ－ＭＳ）法、誘導結合プラズマ質量分析（Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ　Ｃｏｕｐｌｅｄ　Ｐｌａｓｍａ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ；ＩＣＰ－ＭＳ）法、熱分解質量分析（Ｐｙｒｏｌｙｓｉｓ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ；Ｐｙ－ＭＳ）法、イオン移動度質量分析法、飛行時間型質量分析（Ｔｉｍｅ－ｏｆ－Ｆｌｉｇｈｔ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅ；ＴＯＦ　ＭＳ）法等が挙げられる。
　中でも、質量分析法としては、上述した分離方法と結合した質量分析法が好ましく、例えば、ＧＣ－ＭＳ法、ＬＣ－ＭＳ法、ＨＰＬＣ－ＭＳ法、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法、ＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法が挙げられるが、これに限定されない。
　タンパク質の発現量は、例えば、質量分析法においてＤＩＡ（ｄａｔａ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ）法を用いた解析により、決定することができる。ＤＩＡ法は、データ非依存的解析法であり、ある一定の質量範囲に含まれるイオンを全てＭＳ／ＭＳ分析する網羅的な解析法である。中でもＤＩＡ法の一つであるＳＷＡＴＨ法は、例えば、１００Ｄａ幅のウィンドウをずらしながら１０回ＭＳ／ＭＳを取得する作業を繰り返し行い，合計１，０００Ｄａ幅に入る全イオンのＭＳ/ＭＳスペクトルを記録する（ウィンドウ幅や取得回数は可変）方法である。
　本実施形態の方法では、決定されたタンパク質の発現量を基づいて、評価対象の生体試料の由来となる肺がん患者における免疫チェックポイント阻害剤による治療の有効性を予測する。
　具体的には、タンパク質の発現量が予め設定された基準値以下である場合に、評価対象の生体試料の由来となる肺がん患者は、免疫チェックポイント阻害剤に対する感受性を有する可能性がある、すなわち、免疫チェックポイント阻害剤による治療が有効である可能性があると評価又は予測することができる。一方、タンパク質の発現量が、予め設定された基準値超である場合には評価対象の生体試料の由来となる肺がん患者は、免疫チェックポイント阻害剤に対する感受性を有さない可能性がある、すなわち、免疫チェックポイント阻害剤による治療が有効でない可能性があると評価又は予測することができる。当該基準値は、免疫チェックポイント阻害剤に対する感受性を有する肺がん患者群（レスポンダー群）と免疫チェックポイント阻害剤に対する感受性を有さない肺がん患者群（非レスポンダー群）を識別するための基準値である。
　当該基準値は、例えば、レスポンダー群と非レスポンダー群のエクソソームに存在する特定のタンパク質の発現量を測定し、両群を区別することができる閾値として実験的に求めることができる。本実施形態の方法における特定のタンパク質の発現量の基準値の決定方法としては特に限定されず、例えば、一般的な統計学的手法を用いて決定することができる。ここでいう、特定のタンパク質とは、上記表４－１～４－１９に示されるタンパク質群から選択される１種以上のタンパク質を意味する。
　基準値の決定方法として具体的には、例えば、一般的に行われている画像診断等の方法によって肺がんであると診断されている患者について、予め免疫チェックポイント阻害剤の投与前に採集しておいた生体試料中のエクソソームに存在する特定のタンパク質の発現量を測定する。複数の患者について測定した後に、その平均値又は中央値等からこれらの生体試料中のエクソソームに存在する特定のタンパク質の発現量を算出し、これが含まれる数値を基準値とすることができる。また、該評価又は予測方法に関するキットの説明書等に当該基準値が記載されていることが好ましい。
　また、複数のレスポンダー群と複数の非レスポンダー群に対して、それぞれ予め免疫チェックポイント阻害剤の投与前に採集しておいた生体試料中のエクソソームに存在する特定のタンパク質の発現量を測定し、平均値又は中央値等からレスポンダー群と非レスポンダー群の生体試料中のエクソソームに存在する特定のタンパク質の発現量とそのばらつきをそれぞれ算出した後、ばらつきも考慮して両数値が区別されるような閾値を求めて、これを基準値とすることができる。
＜他の実施形態＞
　一実施形態において、本発明は、上記表１－１～表１－６に示されるタンパク質群から選択される１種以上のタンパク質からなる、肺がん患者に対する免疫チェックポイント阻害剤による治療の有効性を予測又は診断するためのバイオマーカーを提供する。
　一実施形態において、本発明は、上記表２に示されるタンパク質群から選択される１種以上の膜タンパク質からなる、肺がん患者に対する免疫チェックポイント阻害剤による治療の有効性を予測又は診断するためのバイオマーカーを提供する。
　一実施形態において、本発明は、上記表３に示されるタンパク質群から選択される１種以上のタンパク質からなる、肺がん患者に対する免疫チェックポイント阻害剤による治療の有効性を予測又は診断するためのバイオマーカーを提供する。
　一実施形態において、本発明は、肺がん患者に対する免疫チェックポイント阻害剤による治療の有効性を診断する方法、すなわち、肺がん患者に対する免疫チェックポイント阻害剤のコンパニオン診断方法であって、
　前記肺がん患者由来の生体試料からエクソソームを単離し、質量分析法により前記エクソソームに存在するタンパク質の発現量を決定することを含み、
　前記タンパク質は、上記表１－１～表１－６に示されるタンパク質群から選択される１種以上のタンパク質である、方法を提供する。
　一実施形態において、本発明は、肺がん患者に対する免疫チェックポイント阻害剤による治療の有効性を診断する方法、すなわち、肺がん患者に対する免疫チェックポイント阻害剤のコンパニオン診断方法であって、
　前記肺がん患者由来の生体試料からエクソソームを単離し、質量分析法により前記エクソソームに存在するタンパク質の発現量を決定することを含み、
　前記タンパク質は、上記表２に示されるタンパク質群から選択される１種以上のタンパク質である、方法を提供する。
　一実施形態において、本発明は、肺がん患者に対する免疫チェックポイント阻害剤による治療の有効性を診断する方法、すなわち、肺がん患者に対する免疫チェックポイント阻害剤のコンパニオン診断方法であって、
　前記肺がん患者由来の生体試料からエクソソームを単離し、質量分析法により前記エクソソームに存在するタンパク質の発現量を決定することを含み、
　前記タンパク質は、上記表３に示されるタンパク質群から選択される１種以上のタンパク質である、方法を提供する。
　以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
１．エクソソームのＬＣ－ＭＳ解析
（１）生体試料の調製
　日本人の肺がん患者２０例のＥＤＴＡ血漿（ニボルマブ、ペムブロリズマブ、又はアテゾリズマブ投与前）を以下の試験に用いた。肺がん患者群については、ＲＥＣＩＳＴガイドラインに従い、ニボルマブ（１２例）、ペムブロリズマブ（６例）、又はアテゾリズマブ（２例）投与後に、ＰＲ（部分奏効）と判定された患者１０例（ニボルマブ投与患者５例、ペムブロリズマブ投与患者４例、及びアテゾリズマブ投与患者１例）をレスポンダー群とし、ＳＤ（安定）と判定された３例（ニボルマブ投与患者３例）とＰＤ（進行）と判定された患者７例（ニボルマブ投与患者４例、ペムブロリズマブ投与患者２例、及びアテゾリズマブ投与患者１例）を非レスポンダー群とした。
（２）エクソソーム捕捉用抗体結合粒子
　磁性粒子（ＪＳＲライフサイエンス株式会社製、ＭａｇｎｏｓｐｈｅｒｅＴＭ　ＭＳ３００／Ｃａｒｂｏｘｙｌ）にエクソソーム捕捉抗体（Ａｎｔｉ－ＣＤ９ｍＡｂ（ＭＢＬ社製、ＭＥＸ００１－３）、Ａｎｔｉ－ＣＤ６３（ＬＡＭＰ－３）ｍＡｂ（ＭＢＬ社製、ＭＥＸ００２－３）又はＡｎｔｉ－ＣＤ８１（ＴＡＰＡ１）ｍＡｂ（ＭＢＬ社製、ＭＥＸ００３－３））を結合させ、３種類の抗体結合粒子を作製した。次いで、３種類の抗体結合粒子を等量ずつ混合し、粒子終濃度０．０６質量％の溶液を抗体結合粒子液として、以下の試験に用いた。
（３）エクソソームの単離
　凍結融解したＥＤＴＡ血漿を孔径０．２２μｍのメンブレンフィルター（Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、ＳＬＧＶ０３３ＲＳ）でろ過し、１５ｍＬ低吸着チューブ（住友ベークライト株式会社製、ＭＳ－５２１５０）に０．５ｍＬ添加した。次いで、ＴＢＳ４．５ｍＬを加えて１０倍希釈し、さらに抗体結合粒子液５ｍＬを添加後、室温で一晩撹拌した。
　反応後の抗体結合粒子を２ｍＬ低吸着チューブ（住友ベークライト株式会社製、ＭＳ－４２２０Ｍ）に移し、洗浄液（ＥｘｏＣａｐＴＭ Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ／Ｓｔｏｒａｇｅ　Ｂｏｏｓｔｅｒ（ＭＢＬ社製、ＭＥＸ－ＵＳＢ））で４回洗浄した。抗体結合粒子を新しい２ｍＬ低吸着チューブに移し、ＴＢＳで２回洗浄した。その後２質量％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶液５０μＬを添加し、２５℃で１０分間振とうした。反応後の上清を１００Ｋの限外濾過スピンカラム（ＰＡＬＬ社製、ＯＤ１００Ｃ３４）に添加し、１０，０００×ｇで５分間遠心後、濾液を２ｍＬ低吸着チューブに回収し、エクソソーム抽出液とした。
（４）エクソソームタンパク質のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ解析
　エクソソーム抽出液２５μＬを１．５ｍＬチューブ（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製、００３０１２３３２８）に移し、８倍量の冷アセトンを加え、－２０℃で２時間静置した。次いで、４℃、１５，０００×ｇで１５分間遠心後、沈殿物に０．５質量％ドデカン酸ナトリウム含有１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）溶液２０μＬを加え、密閉式超音波破砕機によってタンパク質を溶解した。タンパク質のＳ－Ｓ結合を切断するために、終濃度１０ｍＭになるようにジチオスレイトール（ＤＴＴ）を添加して５０℃で３０分間反応させた。システイン残基をアルキル化処理するために、終濃度３０ｍＭになるようにヨードアセトアミドを添加して遮光条件下において室温で３０分間反応させた。反応を停止するために、終濃度６０ｍＭになるようにシステインを添加し、室温で１０分間静置した。その後、５０ｍＭ　重炭酸アンモニウム１５０μＬを添加後、Ｌｙｓ－Ｃ（富士フィルム和光純薬社製、１２５－０５０６１）２５０ｎｇとトリプシン（プロメガ社製、Ｖ５１１３）２５０ｎｇを添加して、３７℃で一晩反応させ、タンパク質をペプチドに分解した。ドデカン酸ナトリウムを除去するために５質量％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加えて溶液を酸性にした後、１５，０００×ｇ、室温で１０分間遠心し、上清を回収した。Ｃ１８カラムを用いて脱塩後、遠心エバポレーターで乾固し、３質量％アセトニトリル－０．１質量％ギ酸含有溶液を加え、サンプル密閉式超音波破砕機でペプチドを溶解し、ＬＣ－ＭＳ分析を行った。ＬＣ－ＭＳ分析はＴｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製のＱ　ＥｘａｃｔｉｖｅＴＭ　ＨＦ－Ｘ、及び、Ｓｃａｆｆｏｌｄ　ＤＩＡソフトウェアを用いて、タンパク質の同定と相対定量値の算出を行った。
２．受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線下面積（ＡＵＣ）の算出
　「１．（４）」のＳｃａｆｆｏｌｄ　ＤＩＡソフトウェアで解析したタンパク質について、ＰｒｏｔｅｉｎＦＤＲが１％以下になるタンパク質を抽出し、コンタミネーションと考えられるイムノグロブリン群とケラチン群を除外後、相対定量値のノーマライゼーションを行った。肺がん患者よりタンパク質２４０６種を同定した。これらのタンパク質について、プログラミング言語ＰｙｔｈｏｎのオープンソースライブラリーであるＳｃｉｋｉｔ－ｌｅａｒｎを用いて判別能の指標となるＡＵＣを算出し、Ｙｏｕｄｅｎ　ｉｎｄｅｘを用いた方法により、２群を判別する閾値を算出した。ＡＵＣの値が０．７以上のタンパク質８２５種とＡＵＣの値を表５－１～表５－５４に示す。なお、表５－１９の「Ｐｕｔａｔｉｖｅ　ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ　ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｋｉｎａｓｅ」のアミノ酸配列を配列番号１に示す。
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　表５－１～表５－５４に示すように、肺がん患者血液中のエクソソームに存在するタンパク質の中から、薬剤感受性判定に用いることのできるタンパク質群を見出した。
３．膜タンパク質群の抽出
　Ｔｈｅ　Ｈｕｍａｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｔｌａｓ（https://www.proteinatlas.org/）のＰｒｅｄｉｃｔｅｄ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ情報をもとに、上記表５－１～表５－５４のタンパク質群から膜タンパク質群を抽出した。得られた膜タンパク質のリストを表６－１～表６－１５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000090
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　表６－１～表６－１５に示すように、ＡＵＣ０．８以上については３６種、０．７以上については１６８種の膜タンパク質が検出された。
４．薬剤感受性を有する患者（レスポンダー）について偽陰性が生じないタンパク質群の抽出
　レスポンダー１０例についてＹｏｕｄｅｎ　ｉｎｄｅｘで計算した閾値を基に偽陰性が生じないタンパク質群を抽出し、ＡＵＣの高い順にソートした結果を表７－１～表７－４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000105
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　表７－１～表７－４に示すように、ＡＵＣ０．８以上については１１種、０．７以上については４７種のタンパク質が存在した。これらマーカーを組み合わせることにより、エラーに強いマルチマーカーの構築が可能であると考えられた。
　本実施形態の方法によれば、肺がん患者に対する免疫チェックポイント阻害剤による治療の有効性を高精度に予測することができる。

Claims (6)

  1. 　肺がん患者に対する免疫チェックポイント阻害剤による治療の有効性を予測するための方法であって、
    　前記肺がん患者由来の生体試料からエクソソームを単離し、質量分析法により前記エクソソームに存在するタンパク質の発現量を決定することを含み、
    　前記タンパク質は、以下の表１－１～表１－６に示されるタンパク質群から選択される１種以上のタンパク質である、方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
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    Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
  2. 　前記タンパク質は、以下の表２に示されるタンパク質群から選択される１種以上の膜タンパク質である、請求項１に記載の方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
  3. 　前記タンパク質は、以下の表３に示されるタンパク質群から選択される１種以上のタンパク質である、請求項１に記載の方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
  4. 　前記免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　前記免疫チェックポイント阻害剤が、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、及びアテゾリズマブからなる群より選ばれる１種以上である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　前記肺がん患者由来の生体試料からエクソソームを単離する方法として、抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ８１抗体、又は抗ＣＤ６３抗体を結合した磁性粒子の混合物を用いる、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
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