JP2023004699A - Ａｂｏ血液型不適合腎移植を行う被験動物における抗体関連型拒絶反応の可能性を試験する方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】従来法よりも正確なＡＢＯ血液型不適合腎移植を行う被験動物における抗体関連型拒絶反応の可能性を試験する方法を提供する。【解決手段】ＡＢＯ血液型不適合腎移植を行う被験動物における抗体関連型拒絶反応の可能性を試験する方法は、被験動物由来の体液試料を、ＡＢＯ血液型抗原のうちいずれか一つの抗原が付加したＣＤ３１からなる３種類の糖タンパク質と接触させる接触工程と、体液試料に含まれる、糖タンパク質のうちＡ抗原が付加したＣＤ３１及びＢ抗原が付加したＣＤ３１それぞれに結合した抗Ａ抗体及び抗Ｂ抗体を検出する検出工程と、を含む。【選択図】なし
Description
本発明は、ＡＢＯ血液型不適合腎移植を行う被験動物における抗体関連型拒絶反応の可能性を試験する方法に関する。
１９８９年にＡＢＯ血液型不適合腎移植が本邦で初めて成功して以来、その成績向上のために様々な工夫が重ねられている。現在では、ＡＢＯ血液型不適合腎移植は高い成功率と長期移植腎生着が可能となり、生体腎移植の２５％を占めており、慢性腎不全の治療に多大な貢献をしている。しかしながら、少数ながら、未だに制御不能の抗体関連型拒絶反応により、移植後早期に移植腎を摘出せざるを得ない症例が存在し、この問題を解決することが急務である。
ＡＢＯ血液型不適合腎移植においてドナー血液型抗原に対する抗体価測定は、抗体関連型拒絶反応を予測する唯一の手段である。従来より、赤血球を用いた抗体価測定が行われている。
一方で、発明者らは、これまでに赤血球と腎血管内皮細胞上の血液型抗原は構造上異なることを、質量分析計を駆使した基礎研究で報告している（例えば、非特許文献１等参照）。
Tasaki M et al., "Identification and characterization of major proteins carrying ABO blood group antigens in the human kidney.", Transplantation, Vol. 87, Issue 8, pp. 1125-1133, 2009.
従来法である赤血球を用いて測定した抗体価と臨床の経過には相関性がない症例も存在する。すなわち、抗体価が高いにも関わらず経過良好の症例がある一方で、抗体価上昇が軽微であっても激しい抗体関連型拒絶反応のために移植腎を摘出しなければならない症例が存在する。そのため、ＡＢＯ血液型不適合腎移植においてドナー血液型抗原に対する被験動物由来の体液試料中の抗体価をより正しく測定し、抗体関連型拒絶反応の可能性を予測できる方法が求められている。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、従来法よりも正確なＡＢＯ血液型不適合腎移植を行う被験動物における抗体関連型拒絶反応の可能性を試験する方法を提供する。
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
（１） ＡＢＯ血液型不適合腎移植を行う被験動物における抗体関連型拒絶反応の可能性を試験する方法であって、
前記被験動物由来の体液試料を、ＡＢＯ血液型抗原のうちいずれか一つの抗原が付加したＣＤ３１タンパク質からなる３種類の糖タンパク質と接触させる接触工程と、
前記体液試料に含まれる、前記糖タンパク質のうちＡ抗原が付加したＣＤ３１タンパク質及びＢ抗原が付加したＣＤ３１タンパク質それぞれに結合した抗Ａ抗体及び抗Ｂ抗体を検出する検出工程と、
を含み、
前記検出工程において、前記抗Ａ抗体又は前記抗Ｂ抗体の、前記Ａ抗原が付加したＣＤ３１タンパク質又は前記Ｂ抗原が付加したＣＤ３１タンパク質に対する結合量が所定の基準値超である場合には、抗体関連型拒絶反応が起こる可能性が高く、前記結合量が所定の基準値以下である場合には、抗体関連型拒絶反応が起こる可能性が低いという基準と比較することにより、前記被験動物における抗体関連型拒絶反応の可能性を試験する、方法。
（２） 前記体液試料が血液、血清、又は血漿である、（１）に記載の方法。
（１） ＡＢＯ血液型不適合腎移植を行う被験動物における抗体関連型拒絶反応の可能性を試験する方法であって、
前記被験動物由来の体液試料を、ＡＢＯ血液型抗原のうちいずれか一つの抗原が付加したＣＤ３１タンパク質からなる３種類の糖タンパク質と接触させる接触工程と、
前記体液試料に含まれる、前記糖タンパク質のうちＡ抗原が付加したＣＤ３１タンパク質及びＢ抗原が付加したＣＤ３１タンパク質それぞれに結合した抗Ａ抗体及び抗Ｂ抗体を検出する検出工程と、
を含み、
前記検出工程において、前記抗Ａ抗体又は前記抗Ｂ抗体の、前記Ａ抗原が付加したＣＤ３１タンパク質又は前記Ｂ抗原が付加したＣＤ３１タンパク質に対する結合量が所定の基準値超である場合には、抗体関連型拒絶反応が起こる可能性が高く、前記結合量が所定の基準値以下である場合には、抗体関連型拒絶反応が起こる可能性が低いという基準と比較することにより、前記被験動物における抗体関連型拒絶反応の可能性を試験する、方法。
（２） 前記体液試料が血液、血清、又は血漿である、（１）に記載の方法。
上記態様の方法によれば、従来法よりも正確に、ＡＢＯ血液型不適合腎移植を行う被験動物における抗体関連型拒絶反応の可能性を試験することができる。
＜ＡＢＯ血液型不適合腎移植を行う被験動物における抗体関連型拒絶反応の可能性を試験する方法＞
本実施形態のＡＢＯ血液型不適合腎移植を行う被験動物における抗体関連型拒絶反応の可能性を試験する方法（以下、単に「本実施形態の方法」と称する）は、以下の工程を含む。
前記被験動物由来の体液試料を、ＡＢＯ血液型抗原のうちいずれか一つの抗原が付加したＣＤ３１タンパク質からなる３種類の糖タンパク質と接触させる接触工程；
前記体液試料に含まれる、前記糖タンパク質のうちＡ抗原が付加したＣＤ３１タンパク質及びＢ抗原が付加したＣＤ３１タンパク質それぞれに結合した抗Ａ抗体及び抗Ｂ抗体を検出する検出工程。
本実施形態のＡＢＯ血液型不適合腎移植を行う被験動物における抗体関連型拒絶反応の可能性を試験する方法（以下、単に「本実施形態の方法」と称する）は、以下の工程を含む。
前記被験動物由来の体液試料を、ＡＢＯ血液型抗原のうちいずれか一つの抗原が付加したＣＤ３１タンパク質からなる３種類の糖タンパク質と接触させる接触工程；
前記体液試料に含まれる、前記糖タンパク質のうちＡ抗原が付加したＣＤ３１タンパク質及びＢ抗原が付加したＣＤ３１タンパク質それぞれに結合した抗Ａ抗体及び抗Ｂ抗体を検出する検出工程。
前記検出工程において、前記抗Ａ抗体又は前記抗Ｂ抗体の、前記Ａ抗原が付加したＣＤ３１タンパク質又は前記Ｂ抗原が付加したＣＤ３１タンパク質に対する結合量が所定の基準値超である場合には、抗体関連型拒絶反応が起こる可能性が高く、前記結合量が所定の基準値以下である場合には、抗体関連型拒絶反応が起こる可能性が低いという基準と比較することにより、前記被験動物における抗体関連型拒絶反応の可能性を試験する。
発明者らは、これまでに、腎血管内皮細胞上では、ＰＥＣＡＭ１（ＣＤ３１）がＡＢＯ血液型抗原を保有する主たるタンパク質であり、赤血球におけるＢａｎｄ３等とは異なることを明らかにしていた。当該構造上の特徴に着目し、ＣＤ３１にＡＢＯ血液型抗原を付加した糖タンパク質を用いた新しい抗体価測定方法を開発することで、血球ではなく腎血管内皮細胞に特有な血液型抗原に対する免疫応答を解析することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
本実施形態の方法によれば、ＡＢＯ血液型不適合腎移植の前に、ＡＢＯ血液型不適合腎移植後の抗体関連型反応の発症を正確に予測することができ、より安全にＡＢＯ血液型不適合腎移植を行うことができる。すなわち、本実施形態の方法を行うタイミングとしては、被験動物がＡＢＯ血液型不適合腎移植を行う前であることが好ましい。
次いで、本実施形態の方法を構成する各工程について以下に詳細を説明する。
＜接触工程＞
接触工程では、被験動物由来の体液試料を、ＡＢＯ血液型抗原のうちいずれか一つの抗原が付加したＣＤ３１タンパク質からなる３種類の糖タンパク質と接触させる。
接触工程では、被験動物由来の体液試料を、ＡＢＯ血液型抗原のうちいずれか一つの抗原が付加したＣＤ３１タンパク質からなる３種類の糖タンパク質と接触させる。
被験動物由来の体液試料としては、被検体の生体から採取されたものであれば特別な限定はないが、例えば、血液、血清、血漿、尿、バフィーコート、唾液、精液、胸部滲出液、脳脊髄液、涙液、痰、粘液、リンパ液、腹水、胸水、羊水、膀胱洗浄液、気管支肺胞洗浄液、毛髪、便、生体から直接採取された細胞又は組織等が挙げられ、これらに限定されない。中でも、血液、血清、又は血漿が好ましい。
なお、本明細書において、「被験動物」としては、検査に供される動物、すなわち被験試料を提供する動物を指す。被験動物は、腎臓関連疾患を有する患者又は健常者のいずれであってもよい。中でも、腎臓関連疾患の疑いのある者、腎臓関連疾患の罹患経験のある者、又は腎臓関連疾患患者が好ましく、腎臓関連疾患患者がより好ましい。腎臓関連疾患患者としては、特に限定されないが、末期腎不全のため腎臓移植を必要とする患者が好ましい。
また、被験動物としては、ＡＢＯ血液型の分布や存在様式は動物により異なる可能性が高いことから、ヒトが好ましい。
上記３種類の糖タンパク質とは、すなわち、Ａ型抗原が付加したＣＤ３１タンパク質、Ｂ型抗原が付加したＣＤ３１タンパク質、及びＨ（Ｏ）型抗原が付加したＣＤ３１タンパク質である。
上述した各抗原が付加したＣＤ３１タンパク質は、例えば、後述する実施例に示す方法を用いて調製することができる。具体的には、ＨＥＫ２９３細胞等の腎臓由来の細胞に、α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ１）のみ、α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ１）及びα－１，３－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（ＧＴ－Ａ）、又はα－１，２－フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ１）及びα－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧＴ－Ｂ）をそれぞれ過剰発現させて各糖鎖を発現する細胞を調製する。次に、ＰＥＣＡＭ１（ＣＤ３１）の糖鎖結合領域を含む発現ベクターを、調製した各糖鎖を発現する細胞にトランスフェクションすることで、各抗原が付加したＣＤ３１タンパク質が当該細胞から培養培地中に産生される。産生された各抗原が付加したＣＤ３１タンパク質は、それぞれ公知のタンパク質の精製方法を用いて精製することで単離することができる。
各抗原が付加したＣＤ３１タンパク質は、それぞれ固相担体に固定されていることが好ましい。
固相担体の材質としては、例えば、ポリスチレン類、ポリエチレン類、ポリプロピレン類、ポリエステル類、ポリ（メタ）アクリロニトリル類、スチレン－ブタジエン共重合体、ポリ（メタ）アクリル酸エステル類、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライド等の高分子化合物；ガラス；金属；磁性体；磁性体を含む樹脂組成物；これらの組み合わせ等が挙げられる。
また、固相担体の形状は特に限定されるものではなく、例えば、トレイ状、球状、粒子状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、マイクロプレート、マイクロ流体デバイス、試験管等が挙げられる。
中でも、本実施形態の方法においては、後述する検出工程において、一度に各抗原が付加したＣＤ３１タンパク質に対する抗Ａ抗体又は抗Ｂ抗体の有無を検出できることから、マイクロプレートが好ましい。
中でも、本実施形態の方法においては、後述する検出工程において、一度に各抗原が付加したＣＤ３１タンパク質に対する抗Ａ抗体又は抗Ｂ抗体の有無を検出できることから、マイクロプレートが好ましい。
各抗原が付加したＣＤ３１タンパク質を固相担体に結合する方法としては、物理的吸着法や、共有結合法、イオン結合法といった化学的に結合する方法等が用いられる。物理的吸着法としては、固相担体に各抗原が付加したＣＤ３１タンパク質を直接固定する方法、アルブミン等の他のタンパク質に化学的に結合させてから吸着させて固定する方法等が挙げられる。化学的に結合させる方法としては、固相担体表面に導入した、各抗原が付加したＣＤ３１タンパク質と反応可能な官能基を利用して、固相担体上に直接結合する方法、固相担体と各抗原が付加したＣＤ３１タンパク質との間にスペーサー分子（エポキシ系シランカップリング剤等）を化学結合で導入してから結合する方法、アルブミン等の他のタンパク質に各抗原が付加したＣＤ３１タンパク質を結合させた後、そのタンパク質を固相担体に化学結合する方法等が挙げられる。
また、固相担体がマイクロプレートである場合に、各抗原が付加したＣＤ３１タンパク質が固定化されたマイクロプレートの作製方法としては、例えば、国際公開第２００９／０５７７５５号（参考文献１）に記載の方法等が挙げられる。
接触工程は、上記各成分の他に、必要に応じて、塩類や、アルブミン等のタンパク質、界面活性剤等を用いて行ってもよい。
接触工程における温度は、通常２℃以上４２℃以下の範囲内であり、接触時間は、通常５分間以上２４時間以下である。
接触工程において、系中のｐＨは特に限定されないが、好ましくはｐＨ５以上１０以下の範囲、より好ましくはｐＨ６以上８以下の範囲である。目的のｐＨを維持するために、通常、緩衝液が用いられ、例えば、リン酸緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液等が挙げられる。
＜検出工程＞
検出工程では、上記体液試料に含まれる、糖タンパク質のうちＡ抗原が付加したＣＤ３１タンパク質及びＢ抗原が付加したＣＤ３１タンパク質それぞれに結合した抗Ａ抗体及び抗Ｂ抗体を検出する。
検出工程では、上記体液試料に含まれる、糖タンパク質のうちＡ抗原が付加したＣＤ３１タンパク質及びＢ抗原が付加したＣＤ３１タンパク質それぞれに結合した抗Ａ抗体及び抗Ｂ抗体を検出する。
検出工程における検出方法としては、免疫測定法により行えばよく、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、放射線免疫測定法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法、イムノブロット法、ウェスタンブロット法等が挙げられる。中でも、簡便に感度よく抗体を検出できる点から、ＣＬＥＩＡ法又はＥＬＩＳＡ法が好ましい。ＥＬＩＳＡ法としては、間接法、競合法、サンドイッチ法等が挙げられる。
例えば、ＣＬＥＩＡ法又はＥＬＩＳＡ法を使用する場合の本実施形態の方法の一例を示す。まず、各抗原が付加したＣＤ３１タンパク質を固相担体に結合して固定させた後、被験動物由来の体液試料を接触させて、各糖タンパク質と該糖タンパク質に結合した抗体からなる複合体を形成させる。そこに、標識物質を結合させた２次抗体を添加して、さらなる複合体を形成させる。そして、形成された複合体中の標識量を検出することにより、体液試料に含まれる抗Ａ抗体及び抗Ｂ抗体の存在量を、標識物質から発生するシグナルを検出することで間接的に測定することができる。
標識物質としては、例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、蛍光物質、メリト酸等の電荷分子等が挙げられる。
蛍光物質としては、例えば、公知の量子ドット、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｃｙ７．５、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒｏ、ローダミン、ＧＦＰ、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、ＴＡＭＲＡ等が挙げられる。
標識物質がＡＬＰである場合には、ＡＬＰ発光基質を添加することで、結合している抗Ａ抗体及び抗Ｂ抗体を検出することができる。ＡＬＰ発光基質としては、例えば、ｐ－ニトロフェニルリン酸（ＰＮＰ）、４－メチルウンベリフェリルリン酸（４ＭＵＰ）、３－（２'－ｓｐｉｒｏａｄａｍａｎｔａｎｅ）４－ｍｅｔｈｏｘｙ－４－（３’’－ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ－１，２－ｄｉｏｘｅｔａｎｅ（ＡＭＰＰＤ）、Ｄｉｓｏｄｉｕｍ ３－（４－ｍｅｔｈｏｘｙｓｐｉｒｏ｛１，２－ｄｉｏｘｅｔａｎｅ－３，２’－（５’－ｃｈｌｏｒｏ）ｔｒｉｃｙｃｌｏ［３．３．１．１３，７］ｄｅｃａｎ｝－４－ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＣＳＰＤ）、２－クロロ－５－（４－メトキシスピロ｛１，２－ジオキセタン－３，２’－（５’－クロロ）－トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン｝－４－イル）－１－フェニルホスフェート・二ナトリウム（ＣＤＰ－Ｓｔａｒ）等が挙げられる。
蛍光物質としては、例えば、公知の量子ドット、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｃｙ７．５、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒｏ、ローダミン、ＧＦＰ、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、ＴＡＭＲＡ等が挙げられる。
標識物質がＡＬＰである場合には、ＡＬＰ発光基質を添加することで、結合している抗Ａ抗体及び抗Ｂ抗体を検出することができる。ＡＬＰ発光基質としては、例えば、ｐ－ニトロフェニルリン酸（ＰＮＰ）、４－メチルウンベリフェリルリン酸（４ＭＵＰ）、３－（２'－ｓｐｉｒｏａｄａｍａｎｔａｎｅ）４－ｍｅｔｈｏｘｙ－４－（３’’－ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ－１，２－ｄｉｏｘｅｔａｎｅ（ＡＭＰＰＤ）、Ｄｉｓｏｄｉｕｍ ３－（４－ｍｅｔｈｏｘｙｓｐｉｒｏ｛１，２－ｄｉｏｘｅｔａｎｅ－３，２’－（５’－ｃｈｌｏｒｏ）ｔｒｉｃｙｃｌｏ［３．３．１．１３，７］ｄｅｃａｎ｝－４－ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＣＳＰＤ）、２－クロロ－５－（４－メトキシスピロ｛１，２－ジオキセタン－３，２’－（５’－クロロ）－トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン｝－４－イル）－１－フェニルホスフェート・二ナトリウム（ＣＤＰ－Ｓｔａｒ）等が挙げられる。
検出工程において、抗Ａ抗体又は抗Ｂ抗体の、Ａ抗原が付加したＣＤ３１タンパク質又はＢ抗原が付加したＣＤ３１タンパク質に対する結合量が所定の基準値超である場合には、抗体関連型拒絶反応が起こる可能性が高く、前記結合量が所定の基準値以下である場合には、抗体関連型拒絶反応が起こる可能性が低いという基準と比較することにより、前記被験動物における抗体関連型拒絶反応の可能性を評価する。
具体的には、体液試料中の抗Ａ抗体又は抗Ｂ抗体の、Ａ抗原が付加したＣＤ３１タンパク質又はＢ抗原が付加したＣＤ３１タンパク質に対する結合量が所定の基準値超である場合には、当該体液試料が採取された被験動物は、抗体関連型拒絶反応が起こる可能性が高いと評価する。一方、体液試料中の抗Ａ抗体及び抗Ｂ抗体それぞれの、Ａ抗原が付加したＣＤ３１タンパク質及びＢ抗原が付加したＣＤ３１タンパク質に対する結合量がいずれも所定の基準値以下である場合には、当該体液試料が採取された被験動物は、抗体関連型拒絶反応が起こる可能性が低いと評価する。
より具体的には、例えば、腎臓ドナーの血液型がＡ型であり、レシピエントの血液型がＢ型又はＯ型であり、レシピエントにおけるＡＢＯ血液型不適合腎移植後の抗体関連型反応の可能性を評価する場合に、レシピエント由来の体液試料中の抗Ａ抗体のＡ抗原が付加したＣＤ３１タンパク質に対する結合量が所定の基準値超である場合には、レシピエントは、抗体関連型拒絶反応が起こる可能性が高いと評価する。一方、レシピエント由来の体液試料中の抗Ａ抗体のＡ抗原が付加したＣＤ３１タンパク質に対する結合量が所定の基準値以下である場合には、レシピエントは、抗体関連型拒絶反応が起こる可能性が低いと評価する。
また、例えば、腎臓ドナーの血液型がＢ型であり、レシピエントの血液型がＡ型又はＯ型であり、レシピエントにおけるＡＢＯ血液型不適合腎移植後の抗体関連型反応の可能性を評価する場合に、レシピエント由来の体液試料中の抗Ｂ抗体のＢ抗原が付加したＣＤ３１タンパク質に対する結合量が所定の基準値超である場合には、レシピエントは、抗体関連型拒絶反応が起こる可能性が高いと評価する。一方、レシピエント由来の体液試料中の抗Ｂ抗体のＢ抗原が付加したＣＤ３１タンパク質に対する結合量が所定の基準値以下である場合には、レシピエントは、抗体関連型拒絶反応が起こる可能性が低いと評価する。
また、例えば、腎臓ドナーの血液型がＡＢ型であり、レシピエントの血液型がＡ型、Ｂ型又はＯ型であり、レシピエントにおけるＡＢＯ血液型不適合腎移植後の抗体関連型反応の可能性を評価する場合に、レシピエント由来の体液試料中の抗Ａ抗体のＡ抗原が付加したＣＤ３１タンパク質に対する結合量及びレシピエント由来の体液試料中の抗Ｂ抗体のＢ抗原が付加したＣＤ３１タンパク質に対する結合量のうち少なくともいずれか一方の結合量が所定の基準値超である場合には、レシピエントは、抗体関連型拒絶反応が起こる可能性が高いと評価する。一方、レシピエント由来の体液試料中の抗Ａ抗体のＡ抗原が付加したＣＤ３１タンパク質に対する結合量及びレシピエント由来の体液試料中の抗Ｂ抗体のＢ抗原が付加したＣＤ３１タンパク質に対する結合量がいずれも所定の基準値以下である場合には、レシピエントは、抗体関連型拒絶反応が起こる可能性が低いと評価する。
或いは、レシピエント由来の体液試料中の抗Ａ抗体のＡ抗原が付加したＣＤ３１タンパク質に対する結合量及びレシピエント由来の体液試料中の抗Ｂ抗体のＢ抗原が付加したＣＤ３１タンパク質に対する結合量が所定の基準値超であるか、或いは、所定の基準値以下であるかを、予め、例えば、ドナー選定の際等に評価しておくことで、当該レシピエントに適した血液型のドナー由来の腎臓を選択して移植することができる。
上記基準値は、抗体関連型拒絶反応を発症する群と、抗体関連型拒絶反応を発症しない群を識別するための基準値である。
上記基準値は、例えば、ＡＢＯ血液型不適合腎移植後に抗体関連型反応を発症した患者群とＡＢＯ血液型不適合腎移植後に抗体関連型反応を発症しなかった患者群の体液試料中の抗Ａ抗体及び抗Ｂ抗体の存在量を測定し、両群を区別することができる閾値として実験的に求めることができる。本実施形態の方法における体液試料中の抗Ａ抗体及び抗Ｂ抗体の存在量の基準値の決定方法としては特に限定されず、例えば、一般的な統計学的手法を用いて決定することができる。
基準値の決定方法として具体的には、例えば、ＡＢＯ血液型不適合腎移植後に抗体関連型反応を発症した患者について、予めＡＢＯ血液型不適合腎移植前（例えば、入院時等）に採取しておいた体液試料中の抗Ａ抗体及び抗Ｂ抗体の存在量を測定する。複数の患者について測定した後に、その平均値又は中央値等からこれらの体液試料中の抗Ａ抗体及び抗Ｂ抗体の存在量を算出し、これが含まれる数値を基準値とすることができる。
また、複数のＡＢＯ血液型不適合腎移植後に抗体関連型反応を発症した患者と複数のＡＢＯ血液型不適合腎移植後に抗体関連型反応を発症しなかった患者に対して、それぞれ予めＡＢＯ血液型不適合腎移植前（例えば、入院時等）に採取しておいた体液試料中の抗Ａ抗体及び抗Ｂ抗体の存在量を測定し、平均値又は中央値等から複数のＡＢＯ血液型不適合腎移植後に抗体関連型反応を発症した患者群及びＡＢＯ血液型不適合腎移植後に抗体関連型反応を発症しなかった患者群の体液試料中の抗Ａ抗体及び抗Ｂ抗体の存在量とそれらのばらつきをそれぞれ算出した後、ばらつきも考慮して両数値が区別されるような閾値を求めて、これを基準値とすることができる。
また、抗Ａ抗体及び抗Ｂ抗体を検出したい被験動物由来の血液試料の他に、コントロール試料を設置してもよい。コントロール試料としては、抗Ａ抗体及び抗Ｂ抗体を含まない陰性コントロール試料や抗Ａ抗体及び抗Ｂ抗体を含む陽性コントロール試料等が挙げられる。この場合、抗Ａ抗体及び抗Ｂ抗体を含まない陰性コントロール試料で得られた結果や、抗Ａ抗体及び抗Ｂ抗体を含む陽性コントロール試料で得られた結果と比較することにより、被験動物由来の体液試料中の抗Ａ抗体及び抗Ｂ抗体の存在量をより正確に検出することが可能である。
また、抗Ａ抗体及び抗Ｂ抗体それぞれの存在量を段階的に変化させた一連のコントロール試料を調製し、各コントロール試料に対する検出結果を数値として得て、標準曲線を作成し、被験動物由来の体液試料の数値から標準曲線に基づいて、被験動物由来の体液試料中の抗Ａ抗体及び抗Ｂ抗体の存在量を定量的に検出することも可能である。
また、抗Ａ抗体及び抗Ｂ抗体それぞれの存在量を段階的に変化させた一連のコントロール試料を調製し、各コントロール試料に対する検出結果を数値として得て、標準曲線を作成し、被験動物由来の体液試料の数値から標準曲線に基づいて、被験動物由来の体液試料中の抗Ａ抗体及び抗Ｂ抗体の存在量を定量的に検出することも可能である。
好ましい態様として具体的には、例えば、被験動物がヒトであり、抗Ａ抗体及び抗Ｂ抗体それぞれの、Ａ抗原が付加したＣＤ３１タンパク質及びＢ抗原が付加したＣＤ３１タンパク質に対する結合量の検出を、標準物質を使用し、且つ、蛍光標識（好ましくは、Ｃｙ３標識）された抗ヒトＩｇＧ又はＩｇＭ抗体を２次抗体として用いて、蛍光強度を測定することで行う場合に、標準物質の蛍光強度で除することで標準化された蛍光強度で表される抗Ａ抗体及び抗Ｂ抗体の結合量が所定の基準値超である場合には、抗体関連型拒絶反応が起こる可能性が高いと評価する。一方、前記結合量が所定の基準値以下である場合には、抗体関連型拒絶反応が起こる可能性が低いと評価する。
＜その他の工程＞
本実施形態の方法は、上記接触工程及び上記検出工程に加えて、その他の工程を更に含むことができる。
本実施形態の方法は、上記接触工程及び上記検出工程に加えて、その他の工程を更に含むことができる。
例えば、上記接触工程の後であって、上記検出工程の前に、洗浄工程を備えてもよい。
洗浄工程では、上記接触工程で各糖タンパク質と該糖タンパク質に結合した抗体からなる複合体を洗浄する。これによって、未反応の成分等の夾雑物が除去される。接触工程における複合体を含む系をそのまま洗浄してもよい。
洗浄工程では、上記接触工程で各糖タンパク質と該糖タンパク質に結合した抗体からなる複合体を洗浄する。これによって、未反応の成分等の夾雑物が除去される。接触工程における複合体を含む系をそのまま洗浄してもよい。
上記洗浄工程は、通常、糖タンパク質が結合している固相担体の形状により異なる方法がある。固相担体が粒子状である場合には、例えば洗浄液中に固相担体を分散させて洗浄する方法、又は集磁したまま浸漬により洗浄する方法が挙げられる。一方、固相担体がマイクロプレートのような形態である場合には、その表面に洗浄液を接触させて洗浄する方法が挙げられる。
洗浄液としては、界面活性剤と上記接触工程で挙げた緩衝液を含む洗浄液が好ましい。洗浄液のｐＨは、好ましくはｐＨ５以上１０以下の範囲、より好ましくはｐＨ６以上８以下の範囲である。具体的には、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｎＣｌ２、及び１ｖ／ｖ％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むトリス緩衝生理食塩水（ｐＨ ７．５）等が挙げられる。
また、上記検出工程において、各糖タンパク質と該糖タンパク質に結合した抗体からなる複合体と、２次抗体とを接触させた後、洗浄液を添加して、前記２次抗体が結合した前記複合体を洗浄することもできる。これにより、未反応の物質や試料中の夾雑物を除去することができ、前記複合体を前記２次抗体でより高感度で検出することができる。
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［材料及び測定方法］
（サンプル及びデータの収集）
合計２５２の血漿サンプルを収集した。ボランティア（ｎ＝１２０）は、日本赤十字血液センターに寄付された血液サンプルである。本試験の承認は、日本赤十字社の審査委員会（承認番号２８Ｊ０００１）から得た。サンプルは個人識別子なしで寄付された。利用可能な唯一の人口統計学的要因はこれらサンプルのＡＢＯ血液型であった。その他の血漿サンプルは、新潟大学医歯学病院、名古屋第二赤十字病院、及び北海道大学病院において血液透析を受けている患者（ｎ＝８０）及びＡＢＯ血液型不適合腎移植（以下、「ＡＢＯｉ ＫＴｘ」と称する場合がある）を受けた患者（ｎ＝５２）から収集した。全ての移植は、生体ドナーからの腎臓移植であった。臨床及び検査情報は、電子データベース及び患者の医療記録から抽出した。移植患者は２つのグループに分けられた；急性抗体関連型拒絶反応（ＡＢＭＲ）のない患者（ＡＢＭＲ（－））、及び、ＡＢＯ血液型不適合腎移植後に抗Ａ抗体又は抗Ｂ抗体による急性ＡＢＭＲのある患者（ＡＢＭＲ（＋））。急性ＡＢＭＲのない患者では、ＡＢＯ血液型不適合腎移植後に抗Ａ抗体又は抗Ｂ抗体による急性ＡＢＭＲを決して経験することはなかった。本試験は、病院の組織倫理委員会（承認番号２０１８－０３１１）の承認を受けて、ヘルシンキ宣言のガイドラインに沿って実施した。インフォームドコンセントは、本試験に含まれる全ての参加者から個別に得た。
（サンプル及びデータの収集）
合計２５２の血漿サンプルを収集した。ボランティア（ｎ＝１２０）は、日本赤十字血液センターに寄付された血液サンプルである。本試験の承認は、日本赤十字社の審査委員会（承認番号２８Ｊ０００１）から得た。サンプルは個人識別子なしで寄付された。利用可能な唯一の人口統計学的要因はこれらサンプルのＡＢＯ血液型であった。その他の血漿サンプルは、新潟大学医歯学病院、名古屋第二赤十字病院、及び北海道大学病院において血液透析を受けている患者（ｎ＝８０）及びＡＢＯ血液型不適合腎移植（以下、「ＡＢＯｉ ＫＴｘ」と称する場合がある）を受けた患者（ｎ＝５２）から収集した。全ての移植は、生体ドナーからの腎臓移植であった。臨床及び検査情報は、電子データベース及び患者の医療記録から抽出した。移植患者は２つのグループに分けられた；急性抗体関連型拒絶反応（ＡＢＭＲ）のない患者（ＡＢＭＲ（－））、及び、ＡＢＯ血液型不適合腎移植後に抗Ａ抗体又は抗Ｂ抗体による急性ＡＢＭＲのある患者（ＡＢＭＲ（＋））。急性ＡＢＭＲのない患者では、ＡＢＯ血液型不適合腎移植後に抗Ａ抗体又は抗Ｂ抗体による急性ＡＢＭＲを決して経験することはなかった。本試験は、病院の組織倫理委員会（承認番号２０１８－０３１１）の承認を受けて、ヘルシンキ宣言のガイドラインに沿って実施した。インフォームドコンセントは、本試験に含まれる全ての参加者から個別に得た。
［抗ＡＢＯ抗体のイソヘマグルチニン力価］
抗Ａ抗体及び抗Ｂ抗体の滴定を従来の試験管法を使用して実施した。
具体的には、移植患者の血漿を生理食塩水で段階希釈し、ＲＢＣ懸濁液の３ｖ／ｖ％（５０μＬ）を試験管内で移植患者の血漿（１００μＬ）と混合した。ボルテックスミキサーを使用して攪拌した後、室温で１５分静置し凝集反応を目視で確認することでＩｇＭ抗体価を決定した。ＩｇＧ抗体の力価を測定するために、７．４ｖ／ｖ％リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈した等容量の０．０１Ｍのジチオスレイトール（ＤＴＴ、和光純薬工業製）を３７℃で３０分間以上６０分間以下、移植患者の血漿と反応させて、ＩｇＭ抗体を不活性化した。生理食塩水で３回洗浄した後、ＲＢＣ懸濁液を、ＤＴＴ処理した移植患者の血漿とともにインキュベートした。生理食塩水で再度３回洗浄した後、抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製、ＵＳＡボランティア用；Ｏｒｔｈｏ Ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ、Ｏｒｔｈｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ製、日本の移植患者用）は、ＩｇＧ抗体価を決定するために添加された。それぞれの抗体価を決定する直前に、混合物を、Ｈｉｍａｃ遠心分離機ＭＣ－４５０を使用して９００×ｇ以上１，０００×ｇ以下で１５秒間遠心分離した。
抗Ａ抗体及び抗Ｂ抗体の滴定を従来の試験管法を使用して実施した。
具体的には、移植患者の血漿を生理食塩水で段階希釈し、ＲＢＣ懸濁液の３ｖ／ｖ％（５０μＬ）を試験管内で移植患者の血漿（１００μＬ）と混合した。ボルテックスミキサーを使用して攪拌した後、室温で１５分静置し凝集反応を目視で確認することでＩｇＭ抗体価を決定した。ＩｇＧ抗体の力価を測定するために、７．４ｖ／ｖ％リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈した等容量の０．０１Ｍのジチオスレイトール（ＤＴＴ、和光純薬工業製）を３７℃で３０分間以上６０分間以下、移植患者の血漿と反応させて、ＩｇＭ抗体を不活性化した。生理食塩水で３回洗浄した後、ＲＢＣ懸濁液を、ＤＴＴ処理した移植患者の血漿とともにインキュベートした。生理食塩水で再度３回洗浄した後、抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製、ＵＳＡボランティア用；Ｏｒｔｈｏ Ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ、Ｏｒｔｈｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ製、日本の移植患者用）は、ＩｇＧ抗体価を決定するために添加された。それぞれの抗体価を決定する直前に、混合物を、Ｈｉｍａｃ遠心分離機ＭＣ－４５０を使用して９００×ｇ以上１，０００×ｇ以下で１５秒間遠心分離した。
［ＡＢＯ血液型不適合腎移植における免疫抑制］
免疫抑制療法は、各施設のプロトコルに従って実施した。血漿交換又は二重濾過血漿交換は、抗体価を低下させるためにＡＢＯ血液型不適合腎移植の前に実施した。２００３年以前は、ＡＢＯ血液型不適合腎移植の日に脾臓摘出術が行われ、２００４年以降は、脾臓摘出術の代わりにリツキシマブを使用した。カルシニューリン阻害剤、メチルプレドニゾロン、ミコフェノール酸モフェチル、及びバシリキシマブは、いくつかの症例を除いて、導入療法のために投与した。
免疫抑制療法は、各施設のプロトコルに従って実施した。血漿交換又は二重濾過血漿交換は、抗体価を低下させるためにＡＢＯ血液型不適合腎移植の前に実施した。２００３年以前は、ＡＢＯ血液型不適合腎移植の日に脾臓摘出術が行われ、２００４年以降は、脾臓摘出術の代わりにリツキシマブを使用した。カルシニューリン阻害剤、メチルプレドニゾロン、ミコフェノール酸モフェチル、及びバシリキシマブは、いくつかの症例を除いて、導入療法のために投与した。
［ＡＢＭＲ診断］
拒絶反応が臨床的に疑われた場合には、Ｅｐｉｓｏｄｅ ｂｉｏｐｓｙを行った。２つ又は３つのコア生検サンプルは、超音波誘導下でバネ式の１６ゲージ生検ガンを使用して採取した。拒絶反応の診断には、Ｂａｎｆｆ分類を使用し、各施設の病理医が行った。抗Ａ抗体又は抗Ｂ抗体によるＡＢＭＲは、抗ドナーヒト白血球抗原（ＨＬＡ）抗体が検出されなかった場合に、病理学的所見を使用して診断した。
拒絶反応が臨床的に疑われた場合には、Ｅｐｉｓｏｄｅ ｂｉｏｐｓｙを行った。２つ又は３つのコア生検サンプルは、超音波誘導下でバネ式の１６ゲージ生検ガンを使用して採取した。拒絶反応の診断には、Ｂａｎｆｆ分類を使用し、各施設の病理医が行った。抗Ａ抗体又は抗Ｂ抗体によるＡＢＭＲは、抗ドナーヒト白血球抗原（ＨＬＡ）抗体が検出されなかった場合に、病理学的所見を使用して診断した。
［ＡＢＯ血液型糖鎖抗原を付加した組換えＣＤ３１の調製］
図１Ａに、ＡＢＯ血液型糖鎖抗原を付加した組換えＣＤ３１の調製のプロトコルを示す。
ＡＢＯ血液型糖鎖抗原を付加した組換えＣＤ３１タンパク質（ｒＣＤ３１）は、糖鎖改変ヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ２９３細胞）を用いて産生した。Ｈ型糖鎖発現細胞は、ＨＥＫ２９３細胞におけるα－１，２－フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ１）遺伝子の過剰発現によって確立した。得られた細胞をＨＥＫ２９３Ｈと名付けた。
Ａ型糖鎖及びＢ型糖鎖発現細胞は、α－１，３－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（ＧＴ－Ａ）及びα－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧＴ－Ｂ）をそれぞれＨＥＫ２９３Ｈ細胞に過剰発現させることで確立した。得られた細胞をＨＥＫ２９３Ａ及びＨＥＫ２９３Ｂと名付けた。
図１Ａに、ＡＢＯ血液型糖鎖抗原を付加した組換えＣＤ３１の調製のプロトコルを示す。
ＡＢＯ血液型糖鎖抗原を付加した組換えＣＤ３１タンパク質（ｒＣＤ３１）は、糖鎖改変ヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ２９３細胞）を用いて産生した。Ｈ型糖鎖発現細胞は、ＨＥＫ２９３細胞におけるα－１，２－フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ１）遺伝子の過剰発現によって確立した。得られた細胞をＨＥＫ２９３Ｈと名付けた。
Ａ型糖鎖及びＢ型糖鎖発現細胞は、α－１，３－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（ＧＴ－Ａ）及びα－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧＴ－Ｂ）をそれぞれＨＥＫ２９３Ｈ細胞に過剰発現させることで確立した。得られた細胞をＨＥＫ２９３Ａ及びＨＥＫ２９３Ｂと名付けた。
ＣＤ３１の細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡは、以下に示すプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。鋳型としてヒト臍帯静脈内皮細胞に由来するｃＤＮＡを用いた。
フォワードプライマー：5'-aagcttcaggATGCAGCCGAGGTGGGCCCA-3'（配列番号１、ＨｉｎｄＩＩＩサイトを含む）
リバースプライマー：5'-gcggccgcTTCTTCCATGGGGCAAGAATGA-3'（配列番号２、ＮｏｔＩサイトを含む）
フォワードプライマー：5'-aagcttcaggATGCAGCCGAGGTGGGCCCA-3'（配列番号１、ＨｉｎｄＩＩＩサイトを含む）
リバースプライマー：5'-gcggccgcTTCTTCCATGGGGCAAGAATGA-3'（配列番号２、ＮｏｔＩサイトを含む）
約１．８ｋｂのＤＮＡ断片を増幅し、ｐＣＲＩＩ－ｂｌｕｎｔベクター（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）にサブクローニングした。Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ ３１３０×ｌ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を使用して正しい配列を確認した後、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｏｔＩで切り出したフラグメント、ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号３）及び終止コドンをエンコードする配列を導入することでｐｃＤＮＡ３．１Ｎ（＋）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）から改変したｐｃＤＮＡ３．１Ｎ－Ｆ発現ベクターに挿入した。得られたプラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１Ｎ－ＣＤ３１－Ｆ）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を使用して、手順書のとおりに、培養培地中でＨＥＫ２９３Ｈ細胞、ＨＥＫ２９３Ａ細胞、及びＨＥＫ２９３Ｂ細胞にトランスフェクトし、Ｃ末端にＦＬＡＧタグが付いたｒＣＤ３１を作製した。３７℃で４８時間以上７２時間以下培養した後、各培地を回収し、抗ＦＬＡＧ Ｍ２アガロースアフィニティーゲル（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製）を使用してｒＣＤ３１を精製した。簡単に説明すると、３００ｍＬの培地を５００μＬの抗ＦＬＡＧＭ２アガロースアフィニティーゲル懸濁液と混合し、４℃で数時間ゆっくりと攪拌した。遠心分離後、ゲルを０．０１ｖ／ｖ％Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳで２回以上５回以下洗浄し、ＦＬＡＧペプチド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製）を使用してｒＣＤ３１をアフィニティーゲルから溶出した。精製されたｒＣＤ３１のタンパク質濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ ＬＩＴＥ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を使用して決定し、それぞれＨ－ＣＤ３１、Ａ－ＣＤ３１、及びＢ－ＣＤ３１と名付けた。
［ヒト腎臓からのＣＤ３１タンパク質の調製］
新潟大学医歯学病院で腎がんによる腎摘出を受けた患者から、インフォームドコンセントを得て腎組織を採取した。タンパク質は、異なるＡＢＯ血液型の患者の正常な腎皮質から抽出し、ＣＤ３１タンパク質を精製した。簡単に説明すると、タンパク質抽出物を抗ＣＤ３１抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製）に事前に結合したＤｙｎａｂｅａｄｓプロテインＧ（ＶＥＲＩＴＡＳ製）と共にインキュベートした。ダイナビーズを溶解液で十分に洗浄し、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）サンプルバッファーで溶出した。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）サンプルバッファーを含む溶出液をＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で分離した。分子量約１３０ｋＤａのＣＤ３１タンパク質を含むＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル片を質量分析（ＭＳ）用に切り出した。
新潟大学医歯学病院で腎がんによる腎摘出を受けた患者から、インフォームドコンセントを得て腎組織を採取した。タンパク質は、異なるＡＢＯ血液型の患者の正常な腎皮質から抽出し、ＣＤ３１タンパク質を精製した。簡単に説明すると、タンパク質抽出物を抗ＣＤ３１抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製）に事前に結合したＤｙｎａｂｅａｄｓプロテインＧ（ＶＥＲＩＴＡＳ製）と共にインキュベートした。ダイナビーズを溶解液で十分に洗浄し、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）サンプルバッファーで溶出した。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）サンプルバッファーを含む溶出液をＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で分離した。分子量約１３０ｋＤａのＣＤ３１タンパク質を含むＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル片を質量分析（ＭＳ）用に切り出した。
［ＣＤ３１糖ペプチドのＭＳ分析］
Ｎ－グリコシル化Ａｓｎ部位の同定、及び、ｒＣＤ３１及びヒト腎臓からのＣＤ３１タンパク質両方の糖鎖組成及び構造の部位特異的分析は、それぞれＩＧＯＴ及びＧｌｙｃｏ－ＲＩＤＧＥを使用した実施した。簡単に説明すると、ＣＤ３１タンパク質をＳ－カルバモイルメチル化し、リシルエンドペプチダーゼとトリプシンで連続消化した。親水性相互作用クロマトグラフィーを使用して消化物を分離し、糖ペプチドを収集した。糖ペプチドのアリコートをＨ２ １８Ｏ中のペプチド－Ｎ－グリカナーゼで加水分解してＮ－グリカンを除去し、グリコシル化されたＡｓｎ残基を１８Ｏで標識して、Ｎ－グリコシル化されたＡｓｎ残基を同定した（ＩＧＯＴ法）。糖ペプチドの別のアリコートを０．１ｖ／ｖ％トリフルオロ酢酸中で加熱して、シアル酸を除去した。脱グリコシル化又は脱シアル化された糖ペプチドは、ナノフロー液体クロマトグラフィーと結合したＴｒｉｂｒｉｄ質量分析計を使用して分析した。脱グリコシル化ペプチドは、Ｍａｓｃｏｔ検索エンジンを使用して識別し、ＣＤ３１グリコシル化ペプチドのリストを生成した。脱アシル化糖ペプチドは、Ｇｌｙｃｏ－ＲＩＤＧＥ法を使用して、糖鎖の組成と構造を分析した。
Ｎ－グリコシル化Ａｓｎ部位の同定、及び、ｒＣＤ３１及びヒト腎臓からのＣＤ３１タンパク質両方の糖鎖組成及び構造の部位特異的分析は、それぞれＩＧＯＴ及びＧｌｙｃｏ－ＲＩＤＧＥを使用した実施した。簡単に説明すると、ＣＤ３１タンパク質をＳ－カルバモイルメチル化し、リシルエンドペプチダーゼとトリプシンで連続消化した。親水性相互作用クロマトグラフィーを使用して消化物を分離し、糖ペプチドを収集した。糖ペプチドのアリコートをＨ２ １８Ｏ中のペプチド－Ｎ－グリカナーゼで加水分解してＮ－グリカンを除去し、グリコシル化されたＡｓｎ残基を１８Ｏで標識して、Ｎ－グリコシル化されたＡｓｎ残基を同定した（ＩＧＯＴ法）。糖ペプチドの別のアリコートを０．１ｖ／ｖ％トリフルオロ酢酸中で加熱して、シアル酸を除去した。脱グリコシル化又は脱シアル化された糖ペプチドは、ナノフロー液体クロマトグラフィーと結合したＴｒｉｂｒｉｄ質量分析計を使用して分析した。脱グリコシル化ペプチドは、Ｍａｓｃｏｔ検索エンジンを使用して識別し、ＣＤ３１グリコシル化ペプチドのリストを生成した。脱アシル化糖ペプチドは、Ｇｌｙｃｏ－ＲＩＤＧＥ法を使用して、糖鎖の組成と構造を分析した。
［ＡＢＯ血液型糖鎖抗原が付加したＣＤ３１のマイクロアレイ（ＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイ）の作製及び使用］
ＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイは以下のとおり作製した。まず、ＡＢＯ血液型糖鎖抗原が付加したｒＣＤ３１（Ｈ－ＣＤ３１、Ａ－ＣＤ３１、及びＢ－ＣＤ３１）をスポッティング溶液（Ｍａｔｓｕｎａｍｉ Ｇｌａｓｓ製）に０．１ｍｇ／ｍＬの濃度となるように溶解し、エポキシシランでコーティングされたスライドグラス（Ｓｃｈｏｔｔ製）に、非接触マイクロアレイプリンティングロボット（Ｍｉｃｒｏｓｙｓ４０００、Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）を使用して３回スポッティングした。スライドグラスを２５℃で一晩インキュベートして固定化し、プロービングバッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｎＣｌ２、及び１ｖ／ｖ％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むトリス緩衝生理食塩水（ｐＨ ７．５）で洗浄し、ブロッキング試薬Ｎ１０２（ＮＯＦ Ｃｏ．製）と共に２０℃で１時間インキュベートした。最後に、スライドガラスを０．０２ｗ／ｖ％のＮａＮ３を含むＴＢＳで洗浄し、使用するまで４℃で保存した。
ＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイは以下のとおり作製した。まず、ＡＢＯ血液型糖鎖抗原が付加したｒＣＤ３１（Ｈ－ＣＤ３１、Ａ－ＣＤ３１、及びＢ－ＣＤ３１）をスポッティング溶液（Ｍａｔｓｕｎａｍｉ Ｇｌａｓｓ製）に０．１ｍｇ／ｍＬの濃度となるように溶解し、エポキシシランでコーティングされたスライドグラス（Ｓｃｈｏｔｔ製）に、非接触マイクロアレイプリンティングロボット（Ｍｉｃｒｏｓｙｓ４０００、Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）を使用して３回スポッティングした。スライドグラスを２５℃で一晩インキュベートして固定化し、プロービングバッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｎＣｌ２、及び１ｖ／ｖ％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むトリス緩衝生理食塩水（ｐＨ ７．５）で洗浄し、ブロッキング試薬Ｎ１０２（ＮＯＦ Ｃｏ．製）と共に２０℃で１時間インキュベートした。最後に、スライドガラスを０．０２ｗ／ｖ％のＮａＮ３を含むＴＢＳで洗浄し、使用するまで４℃で保存した。
ヒト血漿（８０μＬ／ウェル）をプロービングバッファーで１００倍に希釈し、ＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイとともに２０℃で一晩インキュベートした。１００μＬ／ウェルのプロービングバッファーで２回洗浄した後、１μｇ／ｍＬのＣｙ３結合ヤギ抗ヒトＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ製、１０９－１６５－０９８）又はＣｙ３結合ヤギ抗ヒトＩｇＭ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ製、１０９－１６５－０４３）を添加し、２０℃で１時間インキュベートした。蛍光画像は、エバネッセントフィールド活性化蛍光スキャナーＢｉｏ－ＲＥＸ Ｓｃａｎ２００（Ｒｅｘｘａｍ製）を使用して取得した。各スポットの蛍光シグナルは、Ａｒｒａｙ Ｐｒｏ Ａｎａｌｙｚｅｒバージョン４．５（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ製）を使用して定量化し、バックグラウンド値を差し引いた。バックグラウンド値は、固定化されたサンプルのない領域から取得した（図１Ｂ参照）。抗Ａ抗体及び抗Ｂ抗体レベル（相対強度）は、各サンプルのＡ－ＣＤ３１又はＢ－ＣＤ３１との反応からＨ－ＣＤ３１の反応を差し引いて計算した。
［統計分析］
連続変数は平均±標準偏差として表し、カテゴリ変数はＮとパーセンテージとして表した。マンホイットニーのＵ検定又はスチューデントのt検定を使用して、連続変数の２つのグループを比較し、カイ２乗検定を使用してカテゴリデータを比較した。ＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイの診断可能性は、ＡＢＯ血液型不適合腎移植後の急性ＡＢＭＲを予測するための感度と特異性を評価するために、プロットされた受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を計算することによって決定した。感度、特異度、正の予測値（ＰＰＶ）、及び負の予測値（ＮＰＶ）を使用して、ＡＢＯ血液型不適合腎移植後のＡＢＭＲの診断ツールとしての精度を調査した。
連続変数は平均±標準偏差として表し、カテゴリ変数はＮとパーセンテージとして表した。マンホイットニーのＵ検定又はスチューデントのt検定を使用して、連続変数の２つのグループを比較し、カイ２乗検定を使用してカテゴリデータを比較した。ＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイの診断可能性は、ＡＢＯ血液型不適合腎移植後の急性ＡＢＭＲを予測するための感度と特異性を評価するために、プロットされた受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を計算することによって決定した。感度、特異度、正の予測値（ＰＰＶ）、及び負の予測値（ＮＰＶ）を使用して、ＡＢＯ血液型不適合腎移植後のＡＢＭＲの診断ツールとしての精度を調査した。
［実施例１］
１．患者の特徴
男性の比率、年齢、及び末期腎疾患の原因は、血液透析又はＡＢＯ血液型不適合腎移植を受けている患者間で有意差はなかった。しかしながら、血液透析の期間は、血液透析を受けている患者よりもＡＢＯ血液型不適合腎移植を受けている患者の方が短かった。以下の表１に、ＡＢＯ血液型不適合腎移植後のＡＢＭＲの存在によって分割された２つのグループの患者特性を示す。なお、表１において、各略称は以下を意味する。
１．患者の特徴
男性の比率、年齢、及び末期腎疾患の原因は、血液透析又はＡＢＯ血液型不適合腎移植を受けている患者間で有意差はなかった。しかしながら、血液透析の期間は、血液透析を受けている患者よりもＡＢＯ血液型不適合腎移植を受けている患者の方が短かった。以下の表１に、ＡＢＯ血液型不適合腎移植後のＡＢＭＲの存在によって分割された２つのグループの患者特性を示す。なお、表１において、各略称は以下を意味する。
ＨＬＡ：ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ
ＷＩＴ：ｗｏｒｍ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｔｉｍｅ
ＴＩＴ：ｔｏｔａｌ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｔｉｍｅ
ＦＫ：ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ
ＣｙＡ：ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ Ａ
ＭＭＦ：ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌａｔｅ ｍｏｆｅｔｉｌ
ＡＺ：ａｚａｔｈｉｏｐｒｉｎｅ
ＣＰＡ：ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ
ＰＯＤ：ｐｏｓｔ－ｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｄａｙｓ
Ｎ／Ａ：ｎｏｔ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ
ＷＩＴ：ｗｏｒｍ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｔｉｍｅ
ＴＩＴ：ｔｏｔａｌ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｔｉｍｅ
ＦＫ：ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ
ＣｙＡ：ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ Ａ
ＭＭＦ：ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌａｔｅ ｍｏｆｅｔｉｌ
ＡＺ：ａｚａｔｈｉｏｐｒｉｎｅ
ＣＰＡ：ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ
ＰＯＤ：ｐｏｓｔ－ｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｄａｙｓ
Ｎ／Ａ：ｎｏｔ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ
また、表１において、＊は各移植患者のＨＬＡ不一致の平均数を示している。
＊＊は、腎移植の前に抗体除去を受けた患者の数を示している。
＊＊＊は、イソへマグルチニン法により測定された抗体価を示している。
＊＊は、腎移植の前に抗体除去を受けた患者の数を示している。
＊＊＊は、イソへマグルチニン法により測定された抗体価を示している。
ＡＢＯ血液型不適合腎移植前の抗体除去療法を除いて、２群間で有意差はなかった。脱感作療法前及びＡＢＯ血液型不適合腎移植当日のイソヘマグルチニン法を使用して測定されたドナー血液型に対する抗体価は、２群間で有意差はなかった。術後ＡＢＭＲの診断日中央値は５日であった（範囲：０～１９日）。
２．ＭＳによるｒＣＤ３１及びヒト腎臓ＣＤ３１のＡＢＯ糖鎖分析
Ｇｌｙｃｏ－ＲＩＤＧＥ法を使用して、ＨＥＫ１９３Ｈ細胞、ＨＥＫ２９３Ａ細胞、及びＨＥＫ２９３Ｂ細胞の培地から精製されたｒＣＤ３１タンパク質に由来する２つのコア糖ペプチド（Ａｓｎ－４５３を含むＶＬＥＮＳＴＫ（配列番号４）、及びＡｓｎ－５５１を含むＥＧＫＰＦＹＱＭＴＳＮＡＴＱＡＦＷＴＫ（配列番号５））のＭＳスペクトルのシグナルを比較し、予測される糖鎖組成を割り当てた。Ｈ型、Ａ型、及びＢ型の糖鎖に対応する糖鎖組成を持つ糖ペプチドの特徴的なピークがＭＳスペクトルで観察された。
血液型抗原Ｏ型、Ａ型、及びＢ型の患者のヒト腎組織から調製されたＣＤ３１タンパク質も同様に分析された。２つのコアペプチド（Ａｓｎ－４５３を含むＶＬＥＮＳＴＫ（配列番号４））の１つに由来するいくつかのターゲット糖ペプチドは、血液型抗原Ｏ型、Ａ型、及びＢ型を持つｒＣＤ３１及びヒト腎組織由来ＣＤ３１タンパク質で一般的に見られ、当該ターゲット糖ペプチドから得られたＭＳ／ＭＳスペクトルを比較し、広範囲で分析した。糖ペプチドの全てのＭＳ／ＭＳスペクトルは、Ａｓｎに結合したＮ－アセチルグルコサミンでのフコシル化を示した。さらに、血液型Ｈ型、Ａ型、及びＢ型に対応する糖鎖組成を示す糖鎖由来のシグナルの存在が示唆された。
以上のことから、血液型抗原タイプＯ型、Ａ型、及びＢ型を有するｒＣＤ３１又はヒト腎組織由来ＣＤ３１タンパク質から生成された全ての糖ペプチドのＭＳ分析は、対応する血液型糖鎖構造の存在を強く示唆した。
Ｇｌｙｃｏ－ＲＩＤＧＥ法を使用して、ＨＥＫ１９３Ｈ細胞、ＨＥＫ２９３Ａ細胞、及びＨＥＫ２９３Ｂ細胞の培地から精製されたｒＣＤ３１タンパク質に由来する２つのコア糖ペプチド（Ａｓｎ－４５３を含むＶＬＥＮＳＴＫ（配列番号４）、及びＡｓｎ－５５１を含むＥＧＫＰＦＹＱＭＴＳＮＡＴＱＡＦＷＴＫ（配列番号５））のＭＳスペクトルのシグナルを比較し、予測される糖鎖組成を割り当てた。Ｈ型、Ａ型、及びＢ型の糖鎖に対応する糖鎖組成を持つ糖ペプチドの特徴的なピークがＭＳスペクトルで観察された。
血液型抗原Ｏ型、Ａ型、及びＢ型の患者のヒト腎組織から調製されたＣＤ３１タンパク質も同様に分析された。２つのコアペプチド（Ａｓｎ－４５３を含むＶＬＥＮＳＴＫ（配列番号４））の１つに由来するいくつかのターゲット糖ペプチドは、血液型抗原Ｏ型、Ａ型、及びＢ型を持つｒＣＤ３１及びヒト腎組織由来ＣＤ３１タンパク質で一般的に見られ、当該ターゲット糖ペプチドから得られたＭＳ／ＭＳスペクトルを比較し、広範囲で分析した。糖ペプチドの全てのＭＳ／ＭＳスペクトルは、Ａｓｎに結合したＮ－アセチルグルコサミンでのフコシル化を示した。さらに、血液型Ｈ型、Ａ型、及びＢ型に対応する糖鎖組成を示す糖鎖由来のシグナルの存在が示唆された。
以上のことから、血液型抗原タイプＯ型、Ａ型、及びＢ型を有するｒＣＤ３１又はヒト腎組織由来ＣＤ３１タンパク質から生成された全ての糖ペプチドのＭＳ分析は、対応する血液型糖鎖構造の存在を強く示唆した。
３．ＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイの抗体レベル
ＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイを使用して測定された抗体レベルの結果を表２及び表３に示す。
ＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイを使用して測定された抗体レベルの結果を表２及び表３に示す。
ＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイは、抗Ａ抗体及び抗Ｂ抗体を特異的に検出した。抗Ａ抗体及び抗Ｂ抗体レベルは、ボランティアと血液透析集団の間で有意差はなかった。抗Ａ ＩｇＧ抗体及び抗Ｂ ＩｇＧ抗体レベルは、それぞれＢ型及びＡ型集団よりもＯ型集団で有意に高かった（ｐ＜０．０１）。しかしながら、抗Ａ ＩｇＭ抗体及び抗Ｂ ＩｇＭ抗体レベルは、Ｏ型とＢ型、及びＯ型とＡ型の集団間でそれぞれ有意差はなかった。
４．抗Ａ抗体及び抗Ｂ抗体を用いたＡＢＯ血液型不適合腎移植後のＡＢＭＲの予測
図２に、ＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイで測定された初期の抗Ａ抗体及び抗Ｂ抗体レベルに基づいた抗体関連型拒絶反応（ＡＢＭＲ）の予測のための受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析結果を示す。
図２に示すように、ＲＯＣ曲線下の領域（ＡＵＣ）から、抗Ｂ ＩｇＧ抗体を除いて、脱感作療法前の抗体レベルをＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイで測定することで、ＡＢＯ血液型不適合腎移植後に発生する急性ＡＢＭＲを有意に予測できることが示唆された。
表４は、ＡＢＯ血液型不適合腎移植後のＡＢＭＲをＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイの結果で予測する感度、特異度、正の予測値（ＰＰＶ）、負の予測値（ＮＰＶ）の比較を示したものである。
図２に、ＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイで測定された初期の抗Ａ抗体及び抗Ｂ抗体レベルに基づいた抗体関連型拒絶反応（ＡＢＭＲ）の予測のための受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析結果を示す。
図２に示すように、ＲＯＣ曲線下の領域（ＡＵＣ）から、抗Ｂ ＩｇＧ抗体を除いて、脱感作療法前の抗体レベルをＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイで測定することで、ＡＢＯ血液型不適合腎移植後に発生する急性ＡＢＭＲを有意に予測できることが示唆された。
表４は、ＡＢＯ血液型不適合腎移植後のＡＢＭＲをＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイの結果で予測する感度、特異度、正の予測値（ＰＰＶ）、負の予測値（ＮＰＶ）の比較を示したものである。
表４に示すように、ＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイ法がイソヘマグルチニン法よりもＡＢＭＲを有意に予測できることが示唆された。具体的には、ＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイ法では、ドナー血液型に対して脱感作療法前のＩｇＧ抗体レベル又はＩｇＭ抗体レベルが３０，０００以上である場合には、抗Ａ抗体及び抗Ｂ抗体の両方で、高い感度、特異性、ＰＰＶ、及びＮＰＶであった。より具体的には、抗Ａ ＩｇＧ抗体レベル又は抗Ａ ＩｇＭ抗体レベルが３０，０００以上である場合には、Ａ型不適合腎移植後のＡＢＭＲの予測について感度８３．３％、特異度９４．１％、ＰＰＶ９０．９％、ＮＰＶ８８．９％であった。抗Ｂ ＩｇＧ抗体レベル又は抗Ｂ ＩｇＭ抗体レベルが３０，０００以上である場合には、Ｂ型不適合腎移植後のＡＢＭＲの予測について感度６０．０％、特異度１００％、ＰＰＶ１００％、ＮＰＶ８１．８％であった。
５．イソヘマグルチニン法での力価及びＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイ法での抗体レベルの比較
全ての血漿サンプル中の抗Ａ抗体及び抗Ｂ抗体は、ＲＢＣを使用したイソヘマグルチニン法及びＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイ法の両方で測定した。結果を図３（抗ＩｇＧ抗体の結果）及び図４（抗ＩｇＭ抗体の結果）に示す。
全ての血漿サンプル中の抗Ａ抗体及び抗Ｂ抗体は、ＲＢＣを使用したイソヘマグルチニン法及びＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイ法の両方で測定した。結果を図３（抗ＩｇＧ抗体の結果）及び図４（抗ＩｇＭ抗体の結果）に示す。
図３及び図４に示すように、イソヘマグルチニン法での抗体価とＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイ法での抗体レベルは、ボランティア群と血液透析群とで大まかに相関していた。しかしながら、ＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイ法での抗体レベルは、イソヘマグルチニン法での抗体価が同じサンプル間でも異なった。
次に、ＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイ法での抗体レベルが、従来のイソヘマグルチニン法での抗体価よりもＡＢＯ型不適合腎移植後の急性ＡＢＭＲをより正確に予測できる否かを調べるために、脱感作療法前に採取されたサンプルの初期抗Ａ抗体及び抗Ｂ抗体を比較した。結果を図５（抗Ａ抗体）及び図６（抗Ｂ抗体）に示す。
図５及び上記表１に示すように、Ａ型不適合腎移植の患者では、脱感作療法前に採取されたサンプルのイソヘマグルチニン法を用いた抗Ａ ＩｇＧ抗体価は、ＡＢＭＲ（－）群よりもＡＢＭＲ（＋）群の方が高い傾向があったが（中央値：１２８対３２、ｐ＝０．１８０）、有意差はみられなかった。これに対して、ＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイ法での抗Ａ ＩｇＧ抗体レベルは、ＡＢＭＲ（－）群よりもＡＢＭＲ（＋）群の方が有意に高かった（中央値：５４７２１対１０２１１、ｐ＜０．００１）。
図５のａに示すように、ＡＢＭＲの患者１２人中１０人（８３．３％）は、脱感作療法前に採取されたサンプルのＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイ法での抗Ａ ＩｇＧ抗体レベルが３０，０００を超えていた。対照的に、ＡＢＭＲのない１７人の患者中１人（５．９％）のみ３０，０００を超える抗Ａ ＩｇＧ抗体レベルを有していた。
図５のａに示すように、ＡＢＭＲの患者１２人中１０人（８３．３％）は、脱感作療法前に採取されたサンプルのＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイ法での抗Ａ ＩｇＧ抗体レベルが３０，０００を超えていた。対照的に、ＡＢＭＲのない１７人の患者中１人（５．９％）のみ３０，０００を超える抗Ａ ＩｇＧ抗体レベルを有していた。
また、上記表１に示すように、ＡＢＭＲ（－）群及びＡＢＭＲ（＋）群間で脱感作療法前に採取されたサンプルのイソヘマグルチニン法を用いた抗Ａ ＩｇＭ抗体価に有意差はなかった（中央値：３２対１６、ｐ＝０．３２４）。これに対して、ＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイ法での抗Ａ ＩｇＭ抗体レベルは、ＡＢＭＲ（－）群よりもＡＢＭＲ（＋）群の方が有意に高かった（中央値：１４２７７．５対５８８８７、ｐ＝０．０３）。
図５のｂに示すように、ＡＢＭＲ（－）群では、抗Ａ ＩｇＭ抗体レベルが３０，０００を超える患者はいなかった。対照的に、ＡＢＭＲの患者１２人中４人は、脱感作療法前に採取されたサンプルのＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイ法での抗Ａ ＩｇＭ抗体レベルが３０，０００を超えていた。ＡＢＭＲの患者１２人中８人は、脱感作療法前に採取されたサンプルのＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイ法での抗Ａ ＩｇＭ抗体レベルが３０，０００未満であった。しかしながら、これら８人のうち６人のサンプル全てで、ＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイ法での抗Ａ ＩｇＧ抗体レベルが３０，０００を超えていた（図５のｂのグラフ内の四角のサンプル、参照）。おそらく、抗Ａ ＩｇＭ抗体レベルが３０，０００未満であった８人のうち６人は、抗Ａ ＩｇＧ抗体によるＡＢＭＲを誘発したものと推察された。
以上のことから、ＡＢＭＲ患者１２人中１０人（８３．３％）は、ＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイ法での結果で示されたように、Ａ型不適合腎移植患者で初期抗Ａ ＩｇＧ抗体レベル又は抗Ａ ＩｇＭ抗体レベルが３０，０００を超えることが明らかとなった。
図５のｂに示すように、ＡＢＭＲ（－）群では、抗Ａ ＩｇＭ抗体レベルが３０，０００を超える患者はいなかった。対照的に、ＡＢＭＲの患者１２人中４人は、脱感作療法前に採取されたサンプルのＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイ法での抗Ａ ＩｇＭ抗体レベルが３０，０００を超えていた。ＡＢＭＲの患者１２人中８人は、脱感作療法前に採取されたサンプルのＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイ法での抗Ａ ＩｇＭ抗体レベルが３０，０００未満であった。しかしながら、これら８人のうち６人のサンプル全てで、ＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイ法での抗Ａ ＩｇＧ抗体レベルが３０，０００を超えていた（図５のｂのグラフ内の四角のサンプル、参照）。おそらく、抗Ａ ＩｇＭ抗体レベルが３０，０００未満であった８人のうち６人は、抗Ａ ＩｇＧ抗体によるＡＢＭＲを誘発したものと推察された。
以上のことから、ＡＢＭＲ患者１２人中１０人（８３．３％）は、ＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイ法での結果で示されたように、Ａ型不適合腎移植患者で初期抗Ａ ＩｇＧ抗体レベル又は抗Ａ ＩｇＭ抗体レベルが３０，０００を超えることが明らかとなった。
図６及び上記表１に示すように、ＡＢＭＲ（－）群及びＡＢＭＲ（＋）群間で脱感作療法前に採取されたサンプルのイソヘマグルチニン法を用いた抗Ｂ ＩｇＧ抗体価及び抗Ｂ ＩｇＭ抗体価に有意差はなかった。これに対して、ＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイ法での抗Ｂ ＩｇＧ抗体レベルは、有意差はみられなかったが、ＡＢＭＲ（－）群よりもＡＢＭＲ（＋）群の方が高かった（中央値：１６３７８対１９７０、ｐ＝０．２０８）。ＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイ法での抗Ｂ ＩｇＭ抗体レベルは、ＡＢＭＲ（－）群よりもＡＢＭＲ（＋）群の方が有意に高かった（中央値：１４４８０対３４８０、ｐ＝０．０４７）。
図６に示すように、ＡＢＭＲ（－）群では、抗Ｂ ＩｇＧ抗体レベル及び抗Ｂ ＩｇＭ抗体レベルが３０，０００を超える患者はいなかった。対照的に、ＡＢＭＲの患者５人中３人（６０．０％）は、脱感作療法前に採取されたサンプルのＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイ法での初期抗Ｂ ＩｇＧ抗体レベル及び抗Ｂ ＩｇＭ抗体レベルが３０，０００を超えていた。
図６に示すように、ＡＢＭＲ（－）群では、抗Ｂ ＩｇＧ抗体レベル及び抗Ｂ ＩｇＭ抗体レベルが３０，０００を超える患者はいなかった。対照的に、ＡＢＭＲの患者５人中３人（６０．０％）は、脱感作療法前に採取されたサンプルのＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイ法での初期抗Ｂ ＩｇＧ抗体レベル及び抗Ｂ ＩｇＭ抗体レベルが３０，０００を超えていた。
また、ＡＢＯ血液型不適合腎移植後に得られたサンプルについても同様に調べた。結果を図７（抗Ａ抗体）及び図８（抗Ｂ抗体）に示す。なお、血漿サンプルの採取のタイミングはそれぞれの場合で異なっていた。ＡＢＭＲのなかった患者では、血漿サンプルをＡＢＯ血液型不適合腎移植から１か月以内に採取したものを使用した。ＡＢＭＲ患者では、ＡＢＭＲが臨床的に疑われた際に、治療前に採取した血漿サンプルを使用した。
図７に示すように、５例のＡ型不適合腎移植後の患者で、抗Ａ ＩｇＧ抗体レベル又は抗Ａ ＩｇＭ抗体がＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイ法で３０，０００を超えていた。
図８に示すように、１例のＢ型不適合腎移植後の患者で、抗Ｂ ＩｇＧ抗体レベルがＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイ法で３０，０００を超えていた。
しかしながら、イソヘマグルチニン法及びＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイ法の両方で測定した抗Ａ抗体レベル及び抗Ｂ抗体レベルにおいて、ＡＢＭＲ（－）群及びＡＢＭＲ（＋）群間で有意差はみられなかった。
図８に示すように、１例のＢ型不適合腎移植後の患者で、抗Ｂ ＩｇＧ抗体レベルがＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイ法で３０，０００を超えていた。
しかしながら、イソヘマグルチニン法及びＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイ法の両方で測定した抗Ａ抗体レベル及び抗Ｂ抗体レベルにおいて、ＡＢＭＲ（－）群及びＡＢＭＲ（＋）群間で有意差はみられなかった。
［考察］
本試験では、腎血管内皮細胞で発現するＡＢＯ式血液型抗原に反応する抗Ａ抗体／抗Ｂ抗体を評価する方法を開発した。ＡＢＯ糖鎖を付加したｒＣＤ３１タンパク質を用いて、ＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイを作製した。ＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイに使用されたｒＣＤ３１及びヒト腎組織由来のＣＤ３１をＭＳ分析で比較することで、ＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイに使用されたＡＢＨ糖鎖が、ヒト腎血管内皮細胞上のＡＢＯ血液型抗原の模倣であることが確認された。
本試験では、腎血管内皮細胞で発現するＡＢＯ式血液型抗原に反応する抗Ａ抗体／抗Ｂ抗体を評価する方法を開発した。ＡＢＯ糖鎖を付加したｒＣＤ３１タンパク質を用いて、ＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイを作製した。ＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイに使用されたｒＣＤ３１及びヒト腎組織由来のＣＤ３１をＭＳ分析で比較することで、ＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイに使用されたＡＢＨ糖鎖が、ヒト腎血管内皮細胞上のＡＢＯ血液型抗原の模倣であることが確認された。
また、抗Ａ抗体価／抗Ｂ抗体価は、イソヘマグルチニン法及びＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイ法間で大まかに相関していた。しかしながら、イソヘマグルチニン法を用いて同じ抗体価を示した患者間で、ＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイ法の抗Ａ抗体レベル／抗Ｂ抗体レベルに大きなばらつきがあった。脱感作療法の内容は、ＡＢＭＲのある患者とない患者の２つの群間で有意差はなかった。さらに、ＡＢＯ血液型不適合腎移植当日のイソヘマグルチニン法による抗体価に有意差はなかった（上記表１参照）。２つの群間でイソヘマグルチニン法による抗体価に有意差はなかったのにも関わらず、Ａ型不適合腎移植後の急性ＡＢＭＲ患者では、ＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイ法での抗Ａ ＩｇＧ抗体レベル及び抗Ａ ＩｇＭ抗体レベルの両方が有意に高かった。ＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイ法における抗体レベルのカットオフ値が３０，０００超である場合に、Ａ型不適合腎移植における急性ＡＢＭＲ発生予測の感度、特異度、ＰＰＶ、ＮＰＶは最も高かった。Ｂ型不適合腎移植においては、Ｂ型不適合腎移植において、抗体レベルのカットオフ値が３０，０００超である場合に、急性ＡＢＭＲを予測する感度はＡ型不適合腎移植ほど高くなかった。しかしながら、Ｂ型不適合腎移植患者において、ＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイ法を用いた抗Ｂ抗体レベルが３０，０００を超えない場合は、ＡＢＭＲは起きていなかった（ＡＢＭＲ予測の特異度は１００％であった）。
また、ＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイ法で測定した抗体レベルは、急性ＡＢＭＲが臨床的に疑われた際に採取されたサンプルでは低かった。これは、ＡＢＯ血液型不適合腎移植後に、抗Ａ抗体／抗Ｂ抗体が移植した腎臓の血管内皮細胞上のＡＢＯ抗原に反応し、吸着された可能性が推察される。抗Ａ抗体／抗Ｂ抗体の吸着は、腎血管内皮細胞に特異的であるため、イソヘマグルチニン法よりもＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイ法で測定された血漿中の抗体レベルに大きな影響を与える可能性がある。従って、ＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイ法は、ＡＢＯ血液型不適合腎移植後に使用するのには適さない可能性がある。
ＡＢＯ血液型不適合腎移植におけるＡＢＭＲの予測についてＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイ法の有用性を評価するためには、より多くのサンプルを使用してさらに評価を行う必要がある（特に、本試験におけるＢ型不適合腎移植の患者から得られたサンプル数が少なかった）。また、ＡＢＯ血液型不適合腎移植当日の血漿サンプルは保存されておらず、本試験では検討することができなかった。ＡＢＯ血液型不適合腎移植の前に脱感作療法によって減少させるべき抗体レベルを知ることは、ＡＢＭＲの発症を抑える観点からも重要であるため、腎移植当日の抗体のレベルをＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイ法で解析することが今後の課題である。
以上の結果から、腎血管内皮細胞上のＡＢＯ式血液型抗原を模倣したＣＤ３１－ＡＢＯマイクロアレイを用いることで、ＡＢＯ血液型不適合腎移植の前に、ＡＢＯ血液型不適合腎移植後の急性ＡＢＭＲのリスクを正確に把握できることが明らかとなった。
本実施形態の方法によれば、ＡＢＯ血液型不適合腎移植の前に、ＡＢＯ血液型不適合腎移植後の抗体関連型反応の発症を正確に予測することができ、より安全にＡＢＯ血液型不適合腎移植を行うことができる。
Claims (2)
- ＡＢＯ血液型不適合腎移植を行う被験動物における抗体関連型拒絶反応の可能性を試験する方法であって、
前記被験動物由来の体液試料を、ＡＢＯ血液型抗原のうちいずれか一つの抗原が付加したＣＤ３１タンパク質からなる３種類の糖タンパク質と接触させる接触工程と、
前記体液試料に含まれる、前記糖タンパク質のうちＡ抗原が付加したＣＤ３１タンパク質及びＢ抗原が付加したＣＤ３１タンパク質それぞれに結合した抗Ａ抗体及び抗Ｂ抗体を検出する検出工程と、
を含み、
前記検出工程において、前記抗Ａ抗体又は前記抗Ｂ抗体の、前記Ａ抗原が付加したＣＤ３１タンパク質又は前記Ｂ抗原が付加したＣＤ３１タンパク質に対する結合量が所定の基準値超である場合には、抗体関連型拒絶反応が起こる可能性が高く、前記結合量が所定の基準値以下である場合には、抗体関連型拒絶反応が起こる可能性が低いという基準と比較することにより、前記被験動物における抗体関連型拒絶反応の可能性を試験する、方法。 - 前記体液試料が血液、血清、又は血漿である、請求項１に記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| JP2021106564A JP2023004699A (ja) | 2021-06-28 | 2021-06-28 | Ａｂｏ血液型不適合腎移植を行う被験動物における抗体関連型拒絶反応の可能性を試験する方法 |
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