JP6315832B2 - 非特異的間質性肺炎の診断のためのバイオマーカー - Google Patents
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Description
項2. 前記抗体が、抗Mx1抗体及び抗NINJ2抗体からなる群より選択される少なくとも1種である、項1に記載のバイオマーカー。
項3. 前記抗体が、抗Mx1抗体及び抗NINJ2抗体の組み合わせである、項1又は2に記載のバイオマーカー。
項4. 被検動物から採取された血液試料中の、抗Mx1抗体、抗NINJ2抗体、抗DCX抗体、抗C10orf49抗体、抗ZMAT4抗体、抗CDC42SE1抗体及び抗GPT2抗体からなる群より選択される少なくとも1種の抗体を検出する工程、
を含む非特異性間質性肺炎(NSIP)の検査方法。
項5. 前記抗体が、抗Mx1抗体及び抗NINJ2抗体からなる群より選択される少なくとも1種である、項4に記載の検査方法。
項6. 前記抗体が、抗Mx1抗体及び抗NINJ2抗体の組み合わせである、項4又は5に記載の検査方法。
項7. 前記血液試料が血清である、項4〜6のいずれかに記載の検査方法。
項8. 前記抗体の検出が、Mx1、NINJ2、DCX、C10orf49、ZMAT4、CDC42SE1及びGPT2からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質又はその部分ペプチドからなる抗原を用いて行われる、項4〜7のいずれかに記載の検査方法。
項9. 前記検出工程がELISA法により行われる、項4〜8のいずれかに記載の検査方法。
項10. 前記抗原が、MHCクラスII分子により提示された抗原である、項4〜9のいずれかに記載の検査方法。
項11. 被検動物から採取された血液試料中の、抗Mx1抗体、抗NINJ2抗体、抗DCX抗体、抗C10orf49抗体、抗ZMAT4抗体、抗CDC42SE1抗体及び抗GPT2抗体からなる群より選択される少なくとも1種の抗体を検出する工程、及び
前記工程で得られた検出結果に基づいてNSIPを診断するする工程、
を含む非特異性間質性肺炎(NSIP)の診断方法。
項12. Mx1、NINJ2、DCX、C10orf49、ZMAT4、CDC42SE1及びGPT2からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質又はこれらの部分ペプチドからなる抗原を含む、非特異性間質性肺炎(NSIP)の検査用試薬。
項13. 項12に記載の検査用試薬を含む、非特異性間質性肺炎(NSIP)の診断キット。
項14. Mx1、NINJ2、DCX、C10orf49、ZMAT4、CDC42SE1及びGPT2からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質又はその部分ペプチドからなる抗原の、非特異性間質性肺炎(NSIP)の検査用試薬の製造のための使用。
本発明の非特異性間質性肺炎(NSIP)のバイオマーカーは、抗Mx1抗体、抗NINJ2抗体、抗DCX抗体、抗C10orf49抗体、抗ZMAT4抗体、抗CDC42SE1抗体及び抗GPT2抗体からなる群より選択される少なくとも1種の抗体からなることを特徴とする。以下、本発明のバイオマーカーについて詳述する。
(a)抗Mx1抗体
抗Mx1抗体は、Mx1を特異的に認識する抗体である。Mx1(myxovirus (influenza virus) resistance 1)は、タイプ1−インターフェロンにより誘導される一群の抗ウイルスタンパク質に属し、広範囲のウイルス(インフルエンザ、麻疹、コクサッキー、HBV、トゴト等)に対して抗ウイルス活性を示す。Mx1の具体的なアミノ酸配列及び塩基配列については、アクセッション番号NM_002462.2によりNCBIデータベースに登録されている。
抗NINJ2抗体は、NINJ2を特異的に認識する抗体である。NINJ2(ninjurin 2)は接着分子の1種であり、末梢神経損傷後の末端側神経におけるシュワン細胞で発現が増強され、神経突起伸長を促進する可能性があるとされている。NINJ2の具体的なアミノ酸配列及び塩基配列については、アクセッション番号NM_016533.4によりNCBIデータベースに登録されている。
抗DCX抗体は、DCXを特異的に認識する抗体である。DCX(Neuronal migration protein doublecortin)は、細胞質タンパク質である。発生過程において神経細胞は、皮質から最終的に分化する部位に達するため長距離の移動をしなければならない。DCXタンパク質は、微小管の組織化と安定を調節することによって神経細胞の移動を指示すると考えられている。DCXの具体的なアミノ酸配列及び塩基配列については、アクセッション番号NM_178152.1によりNCBIデータベースに登録されている。
抗C10orf49抗体は、C10orf49を特異的に認識する抗体である。C10orf49(chromosome 10 open reading frame 49)は、胎児軟骨の末梢領域及び軟骨界面における骨軟骨形成前駆細胞の骨形成分化を、ネガティブに制御する可能性が示唆されている。C10orf49の具体的なアミノ酸配列及び塩基配列については、アクセッション番号NM_145314.1によりNCBIデータベースに登録されている。
抗ZMAT4抗体は、ZMAT4を特異的に認識する抗体である。ZMAT4(Zinc finger matrin−type protein 4)のタンパク質としての機能は未知である。ZMAT4の具体的なアミノ酸配列及び塩基配列については、アクセッション番号BC019598.1によりNCBIデータベースに登録されている。
抗CDC42SE1抗体は、CDC42SE1を特異的に認識する抗体である。CDC42SE1(CDC42 small effector 1)はTリンパ球において重合糸状アクチンの集積に関与するタンパク質である。CDC42SE1の具体的なアミノ酸配列及び塩基配列については、アクセッション番号NM_020239.2によりNCBIデータベースに登録されている。
抗GPT2抗体は、GPT2を特異的に認識する抗体である。GPT2(gluramic pyruvate transaminase(alanine aminotransferase)2)は、アラニンと2−オキソグルタル酸からピルビン酸とグルタミン酸を産生するアミノ基転移反応を触媒する酵素である。GPT2の具体的なアミノ酸配列及び塩基配列については、アクセッション番号NM_133443.1によりNCBIデータベースに登録されている。
本発明は、NSIPの検査方法を提供する。本発明の検査方法は、被験動物から採取された血液試料中の、抗Mx1抗体、抗NINJ2抗体、抗DCX抗体、抗C10orf49抗体、抗ZMAT4抗体、抗CDC42SE1抗体及び抗GPT2抗体からなる群より選択される少なくとも1種の抗体を検出する工程を含むことを特徴とする。
本発明の検査方法では、前記バイオマーカー(即ち、前記抗体)が検出対象である。
本発明において血液試料の由来は特に限定されず、任意の動物とすることができる。より具体的には、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物;ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の家畜;イヌ、ネコ等のペット;ヒト、サル、オランウータン、チンパンジー等の霊長類が挙げられる。本発明において血液試料の由来として、好ましくは霊長類、更に好ましくはヒトである。
本発明の検査方法において前記各抗体の検出は、Mx1、NINJ2、DCX、C10orf49、ZMAT4、CDC42SE1及びGPT2からなる群より選択される少なくとも1種又はその部分ペプチドを抗原として使用し、血液試料中の前記バイオマーカー(抗体)を検出することにより行われる。
前記MHCクラスII分子の由来は、特に制限されず、例えば、ヒト、マウス、ラット、イヌ、サル、ウサギ、ヒツジ、ウマ等が挙げられる。前記MHCクラスII分子の由来は、検査対象となる被検動物の由来と同じでもよいし、異なっていてもよい。
本発明の検査方法は、被験動物から採取された血液試料中の前記バイオマーカーの存在の有無を検出することにより行われる。また、本発明の検査方法においては、前記バイオマーカーの検出を、血液試料中の前記バイオマーカーの量を測定することにより行ってもよい。前記バイオマーカーの量を測定することによって、正常対照群やIPF/UIPに罹患した被験者における前記バイオマーカーと量的な比較ができ、より精度の高い検査が可能となることから、本発明の検査方法は、好ましくは、血液試料中の前記バイオマーカーの量を測定することによって行われる。
本発明の検査方法によって、被験動物から採取された血液試料中に前記バイオマーカーが検出された場合、被検動物がNSIPに罹患していると判断することができる。本発明の検査方法において、「NSIP」と表記する場合、特段の規定がない限り、臨床診断名と病理組織診断名の両方を意図する。即ち、被検動物から採取された血液試料中にバイオマーカーが検出された場合には、被験動物がNSIPに罹患している、又はNSIPパターンの組織病変を有していることを意味する。
本発明は、Mx1、NINJ2、DCX、C10orf49、ZMAT4、CDC42SE1及びGPT2からなる群より選択される少なくとも1種又はその部分ペプチドからなる抗原を含む、非特異性間質性肺炎(NSIP)の検査用試薬を提供する。
本発明は、前記非特異性間質性肺炎(NSIP)の検査用試薬を含む、非特異性間質性肺炎(NSIP)の診断キットを提供する。
本発明は、NSIPの診断方法を提供する。当該診断方法は、被検動物から採取された血液試料における、抗Mx1抗体、抗NINJ2抗体、抗DCX抗体、抗C10orf49抗体、抗ZMAT4抗体、抗CDC42SE1抗体及び抗GPT2抗体からなる群より選択される少なくとも1種の抗体を検出する工程、ならびに前記工程で得られた結果に基づいてNSIPを診断するする工程、を含むことを特徴とする。
血清は独立行政法人国立病院機構近畿中央胸部疾患センターに通院中の患者より文書による同意を得て採取した。IPF 10例、NSIP 8例、対象疾患として自己免疫性肺胞タンパク質症(PAP)10例、サルコイドーシス(SAR)10例及び健常人(コントロール(control)と表記する場合がある)10例より採血後、2,500rpm、10分間遠心、上清を回収し、実験に使用するまで−80℃にて保存した(表1)。本試験は厚生労働省の臨床研究に関する倫理指針に則り、大阪大学医学部附属病院及び国立病院機構近畿中央胸部疾患センターの臨床研究倫理審査委員会の承認を経て施行した。
各患者から採取した血清を下記に示すタンパク質アレイ法に供し、NSIP患者において特異的に抗体価が上昇している自己抗体の検索を行った。
ProtoArray(登録商標) Human Protein Microarray v5.0(Invitrogen)を購入し、取り扱い説明書に従って使用した。同アレイには昆虫細胞(Sf9)にて作成した約8,000種のグルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)融合全長タンパク質が、それぞれ2点ずつスポットされている。アレイをquadriPERM培養皿(Greiner Bio One)に入れ、ブロッキング緩衝液と4℃で60分間反応させた後、1:500希釈した血清と4℃で90分間、水平振盪機上(50rpm)で反応させた。洗浄後、Alexa Fluor 647 goat anti−human IgG(Invitrogen)を1:2,000希釈し、4℃で90分間反応させた。洗浄後、遠心して乾燥させたアレイ上の各スポットの蛍光強度median値(relative fluorescence units, rfu)をGenePix Pro Software(Molecular Devices)を搭載したマイクロアレイスキャナー(Axon 4200AL)で読み取った。
タンパク質アレイ法によって得たデータはGnjatic S,et al.Proc Natl Acad Sci USA 2010;107:5088−5093、及びGnjatic S,et al.J Immunol Methods 2009;341:50−58に報告されている方法に従って補正、標準化を行った。偽陽性を防ぐため、各抗原タンパク質について2点のスポットの平均値ではなく、2点のうち低い値をその抗原タンパク質の蛍光強度として採用した。
Xは各抗原タンパク質の蛍光強度、
Q1arrayはアレイ内全抗原タンパク質の蛍光強度のうち低い方から25パーセンタイル値、
Q3arrayはアレイ内全抗原タンパク質の蛍光強度のうち低い方から75パーセンタイル値を表す)
Q1Agは、それぞれの自己抗体の全抗体価(本研究では48個)の25パーセンタイル値、
Q3Agは、それぞれの自己抗体の全抗体価(本研究では48個)の75パーセンタイル値を表す)
血清自己抗体価がカットオフ値よりも大きい場合のみ、カットオフ値に対する自己抗体価比(s/c)を計算した。
Freqは、自己抗体価がカットオフ値より高い症例のパーセンテージ、
Internsityは、カットオフ値に対する自己抗体価比(s/c)の平均値を表す)
本発明者らは、抗Mx1抗体に着目し、解析を進めた。抗原タンパク質のMx1はInterferon−stimulated genes(ISGs)と呼ばれ、タイプ1−インターフェロンにより誘導される一群の抗ウイルスタンパク質に属する。インターフェロンシグナルと間質性肺炎の関わりについては、これまでにも報告されている。具体的な試験方法を以下に示す。
Sf9昆虫細胞にて発現させたMx1リコンビナントタンパク質(Invitrogen,Carlsbad,CAより入手)をELISAプレート(Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham,MA)に固相化した。固相化は、ELISAプレートとMx1リコンビナントタンパク質を4℃にて一晩インキュベートすることにより行った。また、固相化に用いたMx1リコンビナントタンパク質の濃度を1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml又は8μg/mlとした。
NSIP患者の血清中に抗Mx1抗体が確かに存在していることを証明するため、免疫沈降法による確認を行った。FLAGタグ融合Mx1タンパク質発現ベクターを作製し、293細胞にて過剰発現させ、細胞可溶化物を血清と反応させた。患者血清中にMx1に対する自己抗体が存在すれば、免疫複合体が形成され、プロテインGセファロースにて沈降させることができる。そして、この沈降物に対して抗FLAG抗体を用いたウェスタンブロッティング解析を行うことによって、NSIP患者血清中の抗Mx1抗体の存在を確認することができる。具体的には以下の手順に従って試験を行った。
5'-TTTAAGCTTATGGTTGTTTCCGAAGTG(配列番号1)
5'-TTTTCTAGATTAACCGGGGAACTGGGCAAG(配列番号2)
(1)Mx1提示MHCクラスII分子を細胞表面に提示する細胞の調製
まず、以下の方法で、Mx1提示MHCクラスII分子を細胞表面に提示する細胞を調製した。
ヒト末梢血単核細胞(3H Biomedical社)又はヒト細胞株のcDNAから、HLA-DRのα鎖(HLA−DRA*01:01)及びβ鎖(HLA−DRB1*03:04)をコードするポリヌクレオチドを、それぞれ、pME18Sベクターにクローニングした。なお、前記HLA−DRのcDNAの配列情報は、IMGT/HLA Database(http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/index/html)を参照した。
ヒト脾臓cDNAライブラリーから、下記プライマーを用いてMx1cをコードするポリヌクレオチドをPCR法で増幅させ、制限酵素処理(EcoRI、XhoI)後、pME18SFL3ベクターにクローニングした。
Sense primer: 5'-AATAATGAATTCATGGTTGTTTCCGAAGTG-3'(配列番号3)
Anti-sense primer: 5'- TAATAACTCGAGTTAACCGGGGAACTGGG-3' (配列番号4)
GFPをコードする配列番号5に示すポリヌクレオチドを、pME18Sベクターにクローニングした。
前記HLA−DRα発現ベクター、HLA−DRβ発現ベクター、Mx1発現ベクター、及びGFP発現ベクターを、トランスフェクション試薬として、PEI max(商品名、Polyscience社製)を使用し、293T細胞(理化学研究所 バイオリソースセンター)に導入した。293T細胞への前記発現ベクターの導入は、PEI max(コスモバイオ社)を2mg/mlとなるように精製水で溶かしたPEI max溶液を使用した。具体的には、293T細胞を24穴プレートに2×105個/500μL/穴で播き、24時間培養を行った。次いで、Lipofectamine(商標) 2000(Invitrogen社)の使用説明書に従い、Lipofectamine(商標) 2000に代えて、前記PEI max溶液を用いて、前記発現ベクターの導入を行い、24時間培養後に、細胞がGFPを発現していることを、蛍光顕微鏡で確認した。
前記で調整した細胞を、間質性肺炎患者3名(NSIP−1、−2及び9)の血清希釈液(100倍希釈)に再懸濁させ、37℃で20分間培養を行った。その後、細胞を洗浄し、Allophycocyanin(APC)で標識した抗ヒトIgG Fc抗体(Jackson ImmunoResearch)を用いて、Mx1−HLA−DR複合体に結合した自己抗体(抗Mx1抗体)を標識した。その後、HANKS緩衝液に再懸濁させた後に、fluorescence activated cell sorting (FACS) (FACSCalibur, BD)で、APC陽性細胞の分析を行った。
配列番号2は、Mx1cDNAのクローニングに使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号3は、Mx1cDNAのクローニングに使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号4は、Mx1cDNAのクローニングに使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号5は、GFPcDNAの塩基配列を示す。
Claims (13)
- 抗Mx1抗体、抗NINJ2抗体、抗DCX抗体、抗C10orf49抗体、抗ZMAT4抗体、抗CDC42SE1抗体及び抗GPT2抗体からなる群より選択される少なくとも1種の抗体からなる、非特異性間質性肺炎(NSIP)のバイオマーカー。
- 前記抗体が、抗Mx1抗体及び抗NINJ2抗体からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項1に記載のバイオマーカー。
- 前記抗体が、抗Mx1抗体及び抗NINJ2抗体の組み合わせである、請求項1又は2に記載のバイオマーカー。
- 被検動物から採取された血液試料中の、抗Mx1抗体、抗NINJ2抗体、抗DCX抗体、抗C10orf49抗体、抗ZMAT4抗体、抗CDC42SE1抗体及び抗GPT2抗体からなる群より選択される少なくとも1種の抗体を検出する工程、
を含む、非特異性間質性肺炎(NSIP)を検査するために、前記抗体を測定する方法。 - 前記抗体が、抗Mx1抗体及び抗NINJ2抗体からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項4に記載の測定方法。
- 前記抗体が、抗Mx1抗体及び抗NINJ2抗体の組み合わせである、請求項4又は5に記載の測定方法。
- 前記血液試料が血清である、請求項4〜6のいずれか1項に記載の測定方法。
- 前記抗体の検出が、Mx1、NINJ2、DCX、C10orf49、ZMAT4、CDC42SE1及びGPT2からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質又はその部分ペプチドからなる抗原を用いて行われる、請求項4〜7のいずれか1項に記載の測定方法。
- 前記検出工程がELISA法により行われる、請求項4〜8のいずれか1項に記載の測定方法。
- 前記抗原が、MHCクラスII分子により提示された抗原である、請求項4〜9のいずれか1項に記載の測定方法。
- Mx1、NINJ2、DCX、C10orf49、ZMAT4、CDC42SE1及びGPT2からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質又はこれらの部分ペプチドからなる抗原を含む、非特異性間質性肺炎(NSIP)の検査用試薬。
- 請求項11に記載の検査用試薬を含む、非特異性間質性肺炎(NSIP)の診断キット。
- Mx1、NINJ2、DCX、C10orf49、ZMAT4、CDC42SE1及びGPT2からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質又はその部分ペプチドからなる抗原の、非特異性間質性肺炎(NSIP)の検査用試薬の製造のための使用。
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