JP7307479B2 - IgA腎症診断用キット - Google Patents
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Description
本願は、2017年11月17日に、日本に出願された特願2017-222216号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
IgA腎症に対する治療法の一つとして、扁桃摘出とステロイド(パルス及び経口)療法とを組み合わせた治療法が近年普及している。扁桃摘出により、病態が軽減することが知られているが、その機序についてはほとんど解明されていない。
[1]ビメンチン又はその部分ペプチドを含む、IgA腎症診断用キット。
[2]前記部分ペプチドが、配列番号3で表されるアミノ酸配列を含む、[1]に記載のIgA腎症診断用キット。
[3]さらに、免疫グロブリンに対する特異的結合物質を含む、[1]又は[2]に記載のIgA腎症診断用キット。
[4]前記免疫グロブリンがIgAである、[3]に記載のIgA腎症診断用キット。
[5]ビメンチン又はその部分ペプチドを含む、IgA腎症診断薬。
[6]前記部分ペプチドが、配列番号3で表されるアミノ酸配列を含む、[5]に記載のIgA腎症診断薬。
[7]対象がIgA腎症に罹患している可能性を評価するためのデータを収集する方法であって、前記対象の血液試料中の抗ビメンチン抗体の抗体価を測定する工程(a1)を含む、方法。
[8]前記抗ビメンチン抗体がIgAである、[7]に記載の方法。
[9]前記工程(a1)が、(i-1)対象の血液試料を、ビメンチン又はその部分ペプチドと接触させること;及び(ii-1)前記ビメンチン又はその部分ペプチドに結合した前記抗ビメンチン抗体の量を測定すること、を含む、[7]又は[8]に記載の方法。
[10]前記部分ペプチドが、配列番号3で表されるアミノ酸配列を含む、[9]に記載の方法。
[11]前記抗ビメンチン抗体の前記抗体価の測定をELISA法により行う、請求項[7]~[10]のいずれか一項に記載の方法。
[12]IgA腎症に罹患している対象におけるIgA腎症治療法の効果を評価するためのデータを収集する方法であって、任意のIgA腎症治療法を開始する前の前記対象の血液試料中の抗ビメンチン抗体の抗体価を測定する工程(a2)と、前記任意のIgA腎症治療法を開始した後の前記対象の血液試料中の抗ビメンチン抗体の抗体価を測定する工程(b2)と、を含む、方法。
[13]前記抗ビメンチン抗体がIgAである、[12]に記載の方法。
[14]前記工程(a2)が、(i-2)前記任意のIgA腎症治療法を開始する前の前記対象の血液試料を、ビメンチン又はその部分ペプチドと接触させること;及び(ii-2)前記ビメンチン又はその部分ペプチドに結合した前記抗ビメンチン抗体の量を測定すること、を含み、前記工程(b2)が、(iii-2)前記任意のIgA腎症治療法を開始した後の前記対象の血液試料を、ビメンチン又はその部分ペプチドと接触させること;及び(iv-2)前記ビメンチン又はその部分ペプチドに結合した前記抗ビメンチン抗体の量を測定すること、を含む、[12]又は[13]に記載の方法。
[15]前記部分ペプチドが、配列番号3で表されるアミノ酸配列を含む、[14]に記載の方法。
[16]前記抗ビメンチン抗体の前記抗体価の測定を、ELISA法により行う、[12]~[15]のいずれか一項に記載の方法。
[17]腎症の疑いのある対象の血液試料から、IgA腎症を有する対象の血液試料を特定する方法であって、前記腎症の疑いのある対象の血液試料中の抗ビメンチン抗体の抗体価を測定する工程(a3)を含む、方法。
[18]前記抗ビメンチン抗体がIgAである、[17]に記載の方法。
[19]前記工程(a3)が、(i-3)前記腎症の疑いのある対象の血液試料を、ビメンチン又はその部分ペプチドと接触させること;及び(ii-3)前記ビメンチン又はその部分ペプチドに結合した前記抗ビメンチン抗体の量を測定すること、を含む、[17]又は[18]に記載の方法。
[20]前記部分ペプチドが、配列番号3で表されるアミノ酸配列を含む、[19]に記載の方法。
[21]前記抗ビメンチン抗体の前記抗体価の測定を、ELISA法により行う、[17]~[20]のいずれか一項に記載の方法。
1実施形態において、本発明は、対象がIgA腎症に罹患している可能性を評価するためのデータを収集する方法を提供する。本実施形態の方法は、対象の血液試料中の抗ビメンチン抗体の抗体価を測定する工程(a1)(以下、「工程(a1)」という。)を含む。
したがって、本発明は、IgA腎症診断用マーカーとしての抗ビメンチン抗体、もまた提供する。また、本発明は、IgA腎症診断用マーカーとして使用するための抗ビメンチン抗体、もまた提供する。
本実施形態の方法は、対象の血液試料中の抗ビメンチン抗体の抗体価を測定する工程(a1)(以下、「工程(a1)」ともいう。)を含む。
(i-1)対象の血液試料を、ビメンチン又はその部分ペプチドと接触させる工程;及び
(ii-1)前記ビメンチン又はその部分ペプチドに結合した抗ビメンチン抗体の量を測定する工程。
上記工程(i-1)において、対象の血液試料と接触させるビメンチン又はその部分ペプチドは、前記対象と同種の生物由来のビメンチン又はその部分ペプチドが好ましい。例えば、対象がヒトであれば、ヒトのビメンチン又はその部分ペプチドを用いることが好ましい。ビメンチンは、必ずしも全長タンパク質でなくてもよく、部分ペプチドであってもよい。ビメンチンの部分ペプチドは、例えば、ビメンチンの全長タンパク質の30%以上のアミノ酸配列を有する。ビメンチンの部分ペプチドは、ビメンチンの全長タンパク質の40%以上、50%以上、60%以上、又は70%以上のアミノ酸配列を有するペプチドであってもよい。また、ビメンチンの部分ペプチドは、ビメンチンの全長タンパク質の50アミノ酸以上、100アミノ酸以上、200アミノ酸以上、300アミノ酸以上、又は400アミノ酸以上のアミノ酸配列を有する部分ペプチドであってよい。ビメンチンの部分ペプチドの好ましい例としては、配列番号3を含むペプチドが挙げられる。ビメンチン又はその部分ペプチドは、上記例示した方法に応じて、マイクロウェルプレートやスライドガラス等の担体に固定してもよく、固定しなくてもよい。
上記工程(ii-1)では、公知の方法により、ビメンチン又はその部分ペプチド(例えば、配列番号3を含むペプチド)に結合した抗ビメンチン抗体の量を測定すればよい。測定方法としては、上記例示した方法において常用される方法等が挙げられる。
(1)対象の血液試料として血清を準備する工程;
(2)ビメンチン又はその部分ペプチド(例えば、配列番号3を含むペプチド)を固定化したウェル(例、96ウェルマイクロプレートのウェル)に、前記工程(1)で準備した血清又はその希釈物を添加する工程;(3)前記工程(2)のウェルを洗浄する工程;
(4)前記工程(3)で洗浄したウェルに、酵素標識した抗免疫グロブリン抗体を添加する工程;
(5)前記工程(4)のウェルを洗浄する工程;
(6)前記工程(5)で洗浄したウェルに、前記酵素標識の検出試薬を添加して発色反応を行う工程;及び
(7)前記発色反応後のウェルの吸光度を測定する工程。
また、前記工程(2)において、ビメンチン又はその部分ペプチドのウェルへの固定化は、公知の方法により行うことができる。例えば、疎水的相互作用によりタンパク質が物理吸着されるように表面加工されたウェルプレートや、アミノ基若しくはカルボキシル基等を有するように表面加工されたウェルプレートを用いればよい。また、市販のELISA用ウェルプレートを用いてもよい。例えば、上記のように表面加工されたウェルプレートのウェルに、ビメンチン又はその部分ペプチドを含む溶液を添加して、静置することにより、ウェルへのビメンチン又はその部分ペプチドの固定化を行うことができる。
また、前記工程(2)において、ウェルに血清の希釈物を添加する場合、その希釈率は特に限定されない。例えば、希釈率は、50~200倍とすることができる。また、希釈に用いる希釈液としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液等が例示される。工程(2)において、血清又はその希釈液中に抗ビメンチン抗体が存在する場合には、当該抗ビメンチン抗体は、ウェルに固定化されたビメンチン又はその部分ペプチドに結合する。なお、ウェルに血清又はその希釈物を添加する前に、ウェルのブロッキングを行ってもよい。ブロッキングは、ELISA法に一般的に用いられるブロッキングバッファーを用いればよい。例えば、ブロッキングバッファーとしては、1~5%程度のスキムミルク又は牛血清アルブミン(BSA)を含む緩衝液等が挙げられる。前記ブロッキングバッファー用の緩衝液は、特に限定されないが、0.05~0.3%程度のTween20を含むリン酸緩衝液等が挙げられる。
前記工程(3)及び工程(5)において、ウェルの洗浄には、ELISA法で一般的に用いられる洗浄バッファーを用いればよい。洗浄バッファーとしては、例えば、0.05~0.3%程度のTween20を含むリン酸緩衝液等が挙げられる。
前記工程(4)において、酵素標識した抗免疫グロブリン抗体としては、前記対象と同種の生物の免疫グロブリンに対して結合性を有する抗体を用いる。例えば、対象がヒトであれば、ヒト免疫グロブリンに対して結合性を有する抗体を用いる。また、抗免疫グロブリン抗体は、抗IgA抗体又は抗IgG抗体を用いることが好ましく、抗IgA抗体を用いることがより好ましい。抗IgA抗体を用いた場合には、抗ビメンチン抗体のうちIgA抗体の抗体価を測定することができる。また、抗IgG抗体を用いた場合には、抗ビメンチン抗体のうちIgG抗体の抗体価を測定することができる。
前記工程(4)において、抗免疫グロブリン抗体が有する酵素標識は、特に限定されず、ELISA法において一般的に用いられるものを用いることができる。例えば、酵素標識としては、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等が挙げられる。
前記工程(6)において、検出試薬は、前記酵素標識に用いた酵素の基質を含み得る。例えば、酵素標識がペルオキシダーゼである場合、検出試薬としては、TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)、OPD(o-phenylenediamine dihydrochloride)、ABTS(2,2'-azino-di-[3-ethyl-benzothiazoline-6 sulfonic acid] diammonium salt)等が挙げられる。また、アルカリホスファターゼの検出試薬としては、pNPP(p-Nitrophenyl-phosphate;ニトロフェニルリン酸)等が挙げられる。
前記工程(7)において、ウェルの吸光度の測定は、前記工程(4)で用いた酵素標識の種類に応じた波長の吸光度を測定すればよい。例えば、酵素標識としてペルオキシダーゼを用いた場合には、450nmの吸光度を測定する。また、酵素標識としてアルカリホスファターゼを用いた場合には、405nmの吸光度を測定する。
上記工程(a1)で得られた抗体価は、血液試料の由来する対象が、IgA腎症に罹患している可能性を評価するためのデータとして用いられる。具体的には、上記工程(a1)において測定された抗体価を、IgA腎症を有さない対象の血液試料中の抗ビメンチン抗体の抗体価と比較して、前記工程(a1)で測定された抗体価の方が高い場合に、前記工程(a1)で用いた血液試料の由来する対象(以下、「評価対象」という場合がある。)が、IgA腎症に罹患している可能性が高いと評価される。
したがって、本実施形態の方法は、上記工程(a1)に加えて、上記工程(a1)において測定された抗体価を、IgA腎症を有さない対象の血液試料中の抗ビメンチン抗体の抗体価と比較して、前記工程(a1)において測定された抗体価が高い場合に、評価対象がIgA腎症に罹患している可能性が高いと評価する工程を含んでいてもよい。
陰性対照血液試料中の抗ビメンチン抗体の抗体価は、1個体のものであってもよく、複数個体の抗体価の平均値であってもよい。あるいは、陰性対照血液試料中の抗ビメンチン抗体の抗体価は、複数個体の抗体価を統計処理して算出された基準値であってもよい。そのような基準値は、IgA腎症陰性基準値ということもできる。好ましくは、陰性対照血液試料中の抗ビメンチン抗体の抗体価は、複数個体の抗体価の平均値又は複数個体の抗体価を統計処理して算出された基準値(IgA腎症陰性基準値)である。
また、本実施形態の方法により測定される抗体価のデータは、他の血液検査データ(例、血清IgA値)、尿検査データ(例、尿潜血、尿蛋白)等と組み合わせて、評価対象がIgA腎症に罹患している可能性を評価してもよい。他の検査データと組み合わせることにより、より精度の高い評価が可能となる。
他の態様において、本発明は、対象の血液試料中の抗ビメンチン抗体の抗体価をin vitroで測定する工程を含む、IgA腎症の診断方法を提供する。
他の態様において、本発明は、対象の血液試料中の抗ビメンチン抗体の抗体価をin vitroで測定する工程を含み、IgA腎症を有さない対象の血液試料中の抗ビメンチン抗体の抗体価と比較して、前記対象の前記抗体価が高い場合に、前記対象がIgA腎症に罹患している可能性が高いと診断する、IgA腎症の診断方法を提供する。
他の態様において、本発明は、対象の血液試料中の抗ビメンチン抗体の抗体価をin vitroで測定する工程を含む、対象におけるIgA腎症の検出方法を提供する。
他の態様において、本発明は、IgA腎症の診断マーカーとしての抗ビメンチン抗体の抗体価の使用を提供する。
他の態様において、本発明は、対象におけるIgA腎症の診断方法であって、前記対象から血液試料を得ること;前記血液試料を、ビメンチン又はその部分ペプチド(例えば、配列番号3を含むペプチド)と接触させて、前記ビメンチン又は配列番号3を含むペプチドに結合した抗ビメンチン抗体の量を測定すること;及び前記ビメンチン又はそのペプチドに結合した抗ビメンチン抗体の量が、IgA腎症を有さない対象の血液試料におけるものと比較して、多い場合に、前記対象がIgA腎症を有すると診断すること、含む方法を提供する。前記方法は、さらに、前記IgA腎症を有すると診断された対象に対して、IgA腎症の治療を行うことを含んでいてもよい。IgA腎症の治療方法としては、例えば、食事療法(塩分摂取制限、タンパク質摂取制限等)、薬物療法(ステロイド療法等)、扁桃摘出等が例示される。これらの治療法は、単独で実施されてもよく、複数の治療法を組み合わせて実施してもよい。
1実施形態において、本発明は、IgA腎症に罹患している対象におけるIgA腎症治療法の効果を評価するためのデータを収集する方法を提供する。本実施形態の方法は、任意のIgA腎症治療法を開始する前の前記対象の血液試料中の抗ビメンチン抗体の抗体価を測定する工程(以下、「工程(a2)」ともいう。)と、前記任意のIgA腎症治療法を開始した後の前記対象の血液試料中の抗ビメンチン抗体の抗体価を測定する工程(以下、「工程(b2)」ともいう。)と、を含む。
IgA腎症に罹患している対象は、好ましくは、IgA腎症であると確定診断された対象である。IgA腎症であるとの確定診断は、通常、腎生検により行われる(IgA腎症診療指針-第3版- 参照)。
本実施例の方法において、IgA腎症に罹患している対象に実施されるIgA腎症治療法は、特に限定されず、IgA腎症の治療を目的として実施されるものであればよい。IgA腎症の治療方法としては、例えば、食事療法(塩分摂取制限、タンパク質摂取制限等)、薬物療法(ステロイド療法等)、扁桃摘出等が例示される。これらの治療法は、単独で実施されてもよく、複数の治療法を組み合わせて実施してもよい。複数の治療法を組み合わせて実施する場合には、それらの組合せの治療効果が評価対象となる。
工程(a2)及び工程(b2)で抗体価の測定に用いる血液試料は、同種の試料を使用する。例えば、工程(a2)における治療法開始前の血液試料が血清である場合には、工程(b2)における治療法開始後の血液試料も血清を使用する。また、工程(a2)における治療法開始前の血液試料と、工程(b2)における治療法開始後の血液試料とは、同じ方法で、抗ビメンチン抗体の抗体価を測定することが好ましい。例えば、工程(a2)における治療開始前の血液試料中の抗ビメンチン抗体の抗体価をELISA法により測定した場合には、工程(b2)における治療開始後の血液試料中の抗ビメンチン抗体の抗体価も、ELISA法で測定することが好ましい。また、抗体価を測定する抗体のクラスは、工程(a2)における治療法開始前の血液試料と、工程(b2)における治療法実施後の血液試料とで同じである必要がある。例えば、工程(a2)における治療法開始前の血液試料中の抗体価として、抗ビメンチンIgAの抗体価を測定した場合には、工程(b2)における治療法開始後の血液試料中の抗体価も抗ビメンチンIgAの抗体価を使用する。なお、本実施形態の方法においては、抗ビメンチン抗体の抗体価として、抗ビメンチンIgAの抗体価を測定することが好ましい。
工程(b2)は、(iii-2)前記任意のIgA腎症治療法を開始した後の前記対象の血液試料を、ビメンチン又はその部分ペプチドと接触させること;及び(iv-2)前記ビメンチン又はその部分ペプチドに結合した抗ビメンチン抗体の量を測定することを含んでいてもよい。
前記(i-2)及び(iii-2)において、ビメンチンの部分ペプチドとしては、配列番号3を含むペプチドを用いることが好ましい。
工程(b2)における治療法開始後の血液試料は、当該治療法の開始後に対象から血液を採取し、当該血液から任意の血液試料を調製することにより得ることができる。採血の時期は、当該治療の開始後であれば特に限定されない。採血の時期は、例えば、治療法開始の直後であってもよく、治療開始から1~5日後、1~3週間後、又は1~3カ月後であってもよい。また、治療法開始後の血液試料は、治療法開始後の複数の時期に採取された血液から調製された複数の血液試料であってもよい。例えば、治療法開始後に、対象から経時的に血液を採取し、それらの血液から調製された複数の血液試料中の抗ビメンチン抗体の抗体価を測定して、抗体価の経時変化を観察してもよい。
なお、本明細書において、「治療法の開始」した時点は、対象に対して、当該治療方法による治療行為を最初に実施した時点をいう。したがって、当該治療法を実施している期間中は、当該治療法を開始した後の期間となる。
工程(a2)及び工程(b2)で測定された抗ビメンチン抗体の抗体価は、当該治療法が実施された対象における当該治療法の効果を評価するためのデータとして用いられる。具体的には、工程(a2)で測定された治療法開始前の血液試料中の抗体価と、工程(b2)で測定された治療法開始後の血液試料中の抗体価とを比較して、工程(b2)で測定された治療法開始後の血液試料中の抗体価の方が低い場合に、当該治療法の治療効果があると評価される。
したがって、本実施形態の方法は、上記抗体価測定工程に加えて、工程(a2)で測定された治療法開始前の血液試料中の抗体価と、工程(b2)で測定された治療法開始後の血液試料中の抗体価とを比較して、工程(b2)で測定された治療法開始後の血液試料中の抗体価の方が低い場合に、当該治療法の治療効果があると評価する工程を含んでいてもよい。
例えば、工程(b2)で測定された治療法開始後の血液試料中の抗ビメンチン抗体の抗体価が、工程(a2)で測定された治療法開始前の血液試料中の抗ビメンチン抗体の抗体価の0.9倍以下、好ましくは0.8倍以下、より好ましくは0.7倍以下である場合、当該治療法の治療効果があると評価される。一方、工程(b2)で測定された治療法開始後の血液試料中の抗ビメンチン抗体の抗体価が、工程(a2)で測定された治療法開始前の血液試料中の抗ビメンチン抗体の抗体価と同程度かより高い場合には、当該治療法の効果が低い又は効果がないと評価される。例えば、工程(b2)で測定された治療開始後の血液試料中の抗ビメンチン抗体の抗体価が、工程(a2)で測定された治療開始前の血液試料中の抗ビメンチン抗体の抗体価の1倍以上である場合、当該治療法の効果が低い又は効果がないと評価される。
また、本実施形態の方法により測定される抗体価のデータは、他の血液検査データ(例、血清IgA値)、尿検査データ(例、尿潜血、尿蛋白)等と組み合わせて、治療効果を評価してもよい。他の検査データと組み合わせることにより、より精度の高い評価が可能となる。
他の態様において、本発明は、IgA腎症に罹患している対象におけるIgA腎症治療法の効果を評価する方法であって、(a2’)任意のIgA腎症治療法を開始する前の前記対象の血液試料中の抗ビメンチン抗体の抗体価をin vitroで測定する工程と、(b2’)前記任意のIgA腎症治療法を開始した後の前記対象の血液試料中の抗ビメンチン抗体の抗体価をin vitroで測定する工程とを含む、方法、を提供する。
他の態様において、本発明は、IgA腎症に罹患している対象におけるIgA腎症治療法の効果を評価する方法であって、(a2’)任意のIgA腎症治療法を開始する前の前記対象の血液試料中の抗ビメンチン抗体の抗体価をin vitroで測定する工程と、(b2’)前記任意のIgA腎症治療法を開始した後の前記対象の血液試料中の抗ビメンチン抗体の抗体価をin vitroで測定する工程と、を含み、治療法開始前の血液試料中の抗体価と治療法開始後の血液試料中の抗体価とを比較して、治療法開始後の血液試料中の抗体価の方が低い場合に、当該治療法の治療効果があると評価する、方法、を提供する。
前記工程(a2’)は、(i-2’)前記任意のIgA腎症治療法を開始する前の前記対象の血液試料を、in vitroでビメンチン又はその部分ペプチドと接触させること;及び(ii-2’)前記ビメンチン又はその部分ペプチドに結合した抗ビメンチン抗体の量を測定すること、を含んでいてもよい。
工程(b2’)は、(iii-2’)前記任意のIgA腎症治療法を開始した後の前記対象の血液試料を、in vitroでビメンチン又はその部分ペプチドと接触させること;及び(iv-2’)前記ビメンチン又はその部分ペプチドに結合した抗ビメンチン抗体の量を測定することを含んでいてもよい。
前記(i-2’)及び(iii-2’)において、ビメンチンの部分ペプチドとしては、配列番号3を含むペプチドを用いることが好ましい。
1実施形態において、本発明は、腎症の疑いのある対象の血液試料から、IgA腎症を有する対象の血液試料を特定する方法であって、前記腎症の疑いのある対象の血液試料中の抗ビメンチン抗体の抗体価を測定する工程(a3)(以下、「工程(a3)」ともいう。)を含む、方法を提供する。
したがって、本発明は、他の腎症からIgA腎症を識別するマーカーとしての抗ビメンチン抗体、もまた提供する。また、本発明は、他の腎症からIgA腎症を識別するマーカーとして使用するための抗ビメンチン抗体、もまた提供する。
血液試料中の抗ビメンチン抗体の抗体価を測定する方法は、上記「[対象がIgA腎症に罹患している可能性を評価するためのデータを収集する方法]」の「(抗体価測定工程:工程(a1))」で記載した方法と同様に行うことができる。ただし、本実施形態の方法では、血液試料として、腎症の疑いのある対象の血液試料を用いる。血液試料は、好ましくは血清又は血漿であり、より好ましくは血清である。抗ビメンチン抗体の抗体価として、抗ビメンチンIgAの抗体価を測定することが好ましい。
(i-3)腎症の疑いのある対象の血液試料を、ビメンチン又はその部分ペプチドと接触させること;及び
(ii-3)前記ビメンチン又はその部分ペプチドに結合した抗ビメンチン抗体の量を測定すること、を含んでいてもよい。
血液試料がIgA腎症を有する対象の血液試料であることを特定するためには、上記工程(a3)において測定された血液試料中の抗体価を、陰性対照血液試料中の抗体価と比較する。その結果、工程(a3)で測定された抗ビメンチン抗体の抗体価が、陰性対照血液試料中の抗ビメンチン抗体の抗体価よりも高い場合には、前記血液試料がIgA腎症を有する対象のものであると特定する。あるいは、前記血液試料がIgA腎症を有する可能性が高い対象のものである特定する。例えば、前記血液試料中の抗ビメンチン抗体の抗体価が、陰性対照血液試料中の抗ビメンチン抗体の抗体価の1.2倍以上、好ましくは1.5倍以上、より好ましくは2倍以上である場合、前記血液試料がIgA腎症を有する対象(又はIgA腎症を有する可能性が高い対象)のものである特定する。一方、前記血液試料中の抗ビメンチン抗体の抗体価が、陰性対照血液試料中の抗ビメンチン抗体の抗体価と同程度かより低い場合には、前記血液試料がIgA腎症を有する対象のものではないと特定する。例えば、前記血液試料中の抗ビメンチン抗体の抗体価が、陰性対照血液試料中の抗ビメンチン抗体の抗体価の1.2倍未満、好ましくは1.1倍以下、より好ましくは1倍以下である場合、前記血液試料がIgA腎症を有する対象のものではないと特定する。
本実施形態の方法は、さらに、前記IgA腎症を有する対象のものであると特定された血液試料の対象に対して、IgA腎症の治療を行うことを含んでいてもよい。IgA腎症の治療方法としては、例えば、食事療法(塩分摂取制限、タンパク質摂取制限等)、薬物療法(ステロイド療法等)、扁桃摘出等が例示される。これらの治療法は、単独で実施されてもよく、複数の治療法を組み合わせて実施してもよい。
1実施形態において、本発明は、IgA腎症診断用キットを提供する。本実施形態のキットは、ビメンチン又はその部分ペプチドを含む。
ビメンチンは、本実施形態のキットを適用する対象に応じて、当該適用対象と同じ生物種のビメンチンを用いることが好ましい。例えば、適用対象がヒトであれば、ヒトのビメンチンを用いることが好ましい。また、ビメンチンは、全長タンパク質である必要はなく、ビメンチンの部分ペプチドであってもよい。ビメンチンの部分ペプチドとしては、上記「[対象がIgA腎症に罹患している可能性を評価するためのデータを収集する方]」の「(抗体価測定工程)」で例示したものと同様のものが例示される。好ましくは、ビメンチンの部分ペプチドは、配列番号3を含むペプチドである。
ビメンチン又はその部分ペプチドが、支持体に固定化されている場合、B/F分離により、ビメンチン又はその部分ペプチドに結合した抗ビメンチン抗体を、血液試料中から分離することができる。
ビメンチン又はその部分ペプチドが標識化されている場合、当該標識化物質を検出することにより、ビメンチン又はその部分ペプチドに結合した抗ビメンチン抗体の抗体価を定量することができる。具体的には、血液試料中の抗体を支持体等に固定化し、標識化されたビメンチン又はその部分ペプチドを反応させて、当該標識化物質を検出する方法等が例示される。
本実施形態のキットは、ビメンチン又はその部分ペプチドに加えて、他の要素を含んでいてもよい。他の要素としては、免疫グロブリンに対する特異的結合物質、標識物質の検出試薬、希釈液、バッファー類、使用説明書等が挙げられる。
本実施形態のキットは、免疫グロブリンに対する特異的結合物質を含むことが好ましい。例えば、上記ビメンチン又はその部分ペプチドが標識化されていない場合、本実施形態のキットは、免疫グロブリンに対する特異的結合物質を含むことが好ましい。
免疫グロブリンに対する特異的結合物質は、免疫グロブリンに対する特異的結合性を有する物質である。免疫グロブリンに対する特異的結合性を有するとは、免疫グロブリンに対して高い結合親和性を有し、他の物質に対しては結合親和性が低いことを意味する。例えば、免疫グロブリンに対する結合親和性が、他の物質に対する結合親和性と比較して、10倍以上、好ましくは50倍以上、より好ましくは100倍上、さらに好ましくは500倍以上高い場合に、当該物質は免疫グロブリンに対する特異的結合性を有するといえる。免疫グロブリンに対する特異的結合物質が特異的結合性を有する免疫グロブリンは、本実施形態のキットを適用する対象と同種の生物の免疫グロブリンである。例えば、本実施形態のキットの適用対象がヒトであれば、免疫グロブリンに対する特異的結合物質は、ヒトの免疫グロブリンに特異的結合性を有する。免疫グロブリンに対する特異的結合物質が結合性を有する免疫グロブリンのクラスは、特に限定されず、任意のものであってよい。前記免疫グロブリンのクラスは、IgA又はIgGであることが好ましく、IgAであることがより好ましい。
抗免疫グロブリン抗体は、免疫グロブリンに対する特異的結合性を有する抗体である。抗免疫グロブリン抗体は、必ずしもインタクトな抗体である必要はない。抗体は、改変抗体(キメラ抗体等)であってもよく、抗体断片(scFv、Fab、F(ab')2、Fv等)であってもよい。本明細書において、「抗免疫グロブリン抗体」は、免疫グロブリンに対する特異的結合性を保持する限り、上記のような改変抗体及び抗体断片を包含する。抗免疫グロブリン抗体は、ポリクローナルであってもよく、モノクローナルであってもよい。抗免疫グロブリン抗体が由来する動物は、特に限定されず、抗体作製用に一般的に用いられる動物を用いることができる。例えば、ヤギ抗体、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、サル抗体、ヒト抗体等が利用可能である。
抗免疫グロブリン抗体は、所望の免疫グロブリン又はその断片を抗原として、公知の方法(ハイブリドーマ法、ファージディスプレイ法など)により作製することができる。
免疫グロブリンに対する特異的結合物質が標識化されている場合、当該標識化物質を検出することにより、抗ビメンチン抗体を間接的に定量することができる。具体的には、固定化したビメンチン又はその部分ペプチドに血液試料中の抗ビメンチン抗体を捕捉し、標識化した免疫グロブリンに対する特異的結合物質を反応させて、当該標識化物質を検出する方法等が例示される。
本実施形態のキットは、上記の他に、標識物質の検出試薬、血液試料調製試薬、バッファー類、抗ビメンチン抗体の標準試薬、支持体、使用説明書等を含んでいてもよい。
標識物質の検出試薬は、上記のビメンチン若しくはその部分ペプチド、又は免疫グロブリンに対する特異的結合物質の標識化に用いた標識物質を検出するための試薬である。例えば、標識物質が酵素標識である場合、検出試薬は当該酵素の基質を含む。例えば、酵素標識がペルオキシダーゼである場合、検出試薬としては、TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)、OPD(o-phenylenediamine dihydrochloride)、ABTS(2,2'-azino-di-[3-ethyl-benzothiazoline-6 sulfonic acid] diammonium salt)等が挙げられる。
また、酵素標識がアルカリホスファターゼである場合、検出試薬としては、pNPP(p-Nitrophenyl-phosphate;ニトロフェニルリン酸)等が挙げられる。
バッファー類としては、例えば、ブロッキングバッファー、洗浄バッファー等が挙げられる。これらのバッファー類は、イムノアッセイに一般的に用いられるものを特に制限なく用いることができる。
抗ビメンチン抗体の標準試薬は、本実施形態のキットの適用対象である生物種の抗ビメンチン抗体を含み得る。前記抗ビメンチン抗体は、本実施形態のキットの検出対象である免疫グロブリンと同じクラスのものである。抗ビメンチン抗体の標準試薬は、抗ビメンチン抗体の検量線を作製するために用いられる。
支持体は、血液試料中の抗体を固定化するため、又は上記ビメンチン若しくはその部分ペプチドを固定化するため等に用いられる。支持体としては、上記「(ビメンチン又はその部分ペプチド)」で例示したもの等が挙げられる。
支持体に固定化されたビメンチン又はその部分ペプチド;
酵素標識化された抗免疫グロブリン抗体;及び
前記酵素標識の基質。
ELISAキットは、さらに、血清希釈液、バッファー類(ブロッキングバッファー、洗浄バッファー等)、抗ビメンチン抗体の標準試薬等を含んでいてもよい。
他の態様において、本発明は、IgA腎症診断用キットを作製するための、ビメンチン又はその部分ペプチド(例えば、配列番号3を含むペプチド)の使用を提供する。
他の態様において、本発明は、IgA腎症診断用キットを作製するための、ビメンチン又はその部分ペプチド(例えば、配列番号3を含むペプチド)、及び免疫グロブリンに対する特異的結合物質(抗免疫グロブリン抗体等)の使用を提供する。
1実施形態において、本発明は、ビメンチン又はその部分ペプチドを含む、IgA腎症の診断薬を提供する。
ビメンチン又はその部分ペプチドは、支持体に固定化されたものであってもよい。支持体としては、上記「[IgA腎症診断用キット]」の「(ビメンチン又はその部分ペプチド)」で例示したものと同様のものが例示される。
また、ビメンチン又はその部分ペプチドは、標識化されたものであってもよい。標識物質としては、上記「[IgA腎症診断用キット]」の「(ビメンチン又はその部分ペプチド)」で例示したものと同様のものが例示される。
他の態様において、本発明は、IgA腎症の診断薬を作製するための、ビメンチン又はその部分ペプチドの使用を提供する。
他の態様において、本発明は、ビメンチン又はその部分ペプチドを支持体に固定化する工程を含む、IgA腎症診断薬の製造方法を提供する。
IgA腎症患者から摘出された口蓋扁桃から、組織タンパク質を抽出し、二次元電気泳動及びウエスタンブロッティングにて解析を行った。解析用サンプルの対象患者は、腎生検にてIgA腎症と確定診断され、厚生労働省IgA腎症診療指針に基づき、比較的予後不良又は予後不良と診断された患者である。このうち、口蓋扁桃腫大を認めるか、又は扁桃腫大はないが口蓋扁桃部の細菌培養にてヘモフフィルス・パラインフルエンゼ(Haemophilus parainfluenzae)や黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)の病巣感染を認める患者を対象とした。なお、ネフローゼ症候群や血清Cr2mg/dlの患者は対象外とした。
二次元電気泳動用サンプルの対象としたIgA腎症患者の基礎データを表1に示す。
二次元電気泳動は、クールフォレスターIPG-IEFタイプP(アナテック株式会社製)を用いて行った。
IgA腎症患者から摘出された口蓋扁桃から抽出したタンパク質と、同じ患者の血清から取得したIg画分との免疫沈降を行った。免疫沈降の結果得られた免疫沈降物について、二次元電気泳動を行った。
扁桃組織からのタンパク質の抽出は、扁桃に細胞溶解液(0.5%ノニデットP-40,10mMトリス(pH7.4),150mM塩化ナトリウム,0.5mMエチレンジアミン四酢酸に、プロテアーゼインヒビター(コンプリート;ロシュ製)及びホスファターゼインヒビター(シグマーアルドリッチ製)を添加)を加えて、セルデストロイヤー(プロセンス社製)を用いて、扁桃を破砕することにより行った。血清からのIg画分は、Igアデムキット(アデムテック社製,フランス)を用いて調製した。免疫沈降は、ダイナビーズプロテインAを用いてインビトロジェン社のマニュアルに従って行った。
扁桃タンパク質と患者血清Ig画分との免疫沈降物は、溶出緩衝液(150mMグリシン(pH2.5),500mM塩化ナトリウム)を加えて流出させた後、トリス緩衝液(pH7.4)で中和した。これにアセトンを加えてタンパク質を沈殿させた後、膨潤緩衝液に溶解させて、二次元電気泳動を行なった。
二次元電気泳動後のゲルからスポットを切出し、上記と同様に、質量分析計(MALDI-TOF-MS)を用いて、タンパク質の同定を行った。
健常人22名及びIgA腎症患者25名について、血清中のビメンチン抗体価をELISA法により測定した。ELISA法は、以下の通りに行った。
4μg/mLになるようにリコンビナントヒトビメンチン(プロジェン製,ドイツ)をリン酸緩衝液で希釈した溶液を、イムノプレート(ポリソープ;サーモフィッシャー社製,米国)の各ウェルに50μLずつ入れて、4℃で一晩インキュベートした。純水で洗浄後、ブロッキングバッファー(5%スキムミルク及び0.1%Tween20を加えたリン酸緩衝液)50μLを用いて30分間室温でブロッキングした。その後、各ウェルからブロッキングバッファーを抜き取り、リン酸緩衝液で1/100希釈した血清50μLを各ウェルに加えて、室温で1時間反応させた。次いで、各ウェルを洗浄バッファー(0.1%Tween20を加えたリン酸緩衝液)で5回洗浄した。その後、ヤギポリクローナル二次抗体ヒト免疫グロブリンA-西洋ワサビペルオキシダーゼ標識(アブカム製,イギリス)又はヤギポリクローナル二次抗体ヒト免疫グロブリンG-西洋ワサビペルオキシダーゼ標識(サンタクルズ社製)を1:1000にリン酸緩衝液で希釈して各ウェルに添加し、室温で1時間反応させた。次いで、各ウェルを洗浄バッファー(0.1%Tween20を加えたリン酸緩衝液)で5回洗浄した。その後、テトラメチルベンジジン反応液(0.2Mクエン酸緩衝液200mLに、250μLの41mMテトラメチルベンジジン、及び3.5μLの30%過酸化水素水を加えた溶液)50μLを各ウェルに添加して5分間反応させた後、反応停止液(1M硫酸)50μLを加えた。その後、450nmの波長で各ウェルの吸光度を測定した。
また、図4は、IgA腎症患者における抗ビメンチン抗体価の扁桃摘出前後の変化を示すグラフである。図4Aは抗ビメンチンIgG抗体価の変化を示し、図4Bは抗ビメンチンIgA抗体価の変化を示す。抗ビメンチンIgA抗体価は、扁桃摘出前と比較して、扁桃摘出後に有意に低下した。
血清としてIgA腎症以外の腎症患者の血清を用いたこと以外は、上記実施例2と同様の方法で、ELISA法を行い、抗ビメンチンIgA抗体価を測定した。患者血清として、膜性腎症患者2名、微小変化型ネフローゼ症候群1名、及び糖尿病性腎症1名の血清を用いた。
(ペプチドの合成)
IgA腎症患者の扁桃のタンパク質とIgA腎症患者血清とを免疫沈降し、得られた免疫沈降物を、質量分析計(MALDI-TOF-MS)を用いて解析した。その結果、IgA腎症患者血清が、配列番号3で表されるペプチドを認識していることが示唆された。図6は、ヒトビメンチンタンパク質の全長アミノ酸配列(配列番号2)と、IgA患者血清が認識するペプチド(図6中の太字下線部分;配列番号3)を示す。下記ELISA試験に供するために、前記配列番号3で表される22アミノ酸からなるペプチドを合成した。
前記ペプチドを10μg/mLとなるように希釈した溶液を抗原として、ELISA用プレートであるMAXISORP(Thermo scientific)に塗布した。次いで、1/100倍希釈した患者血清を抗体として、ELISA法を行った。ELISA法における各操作は、前記実施例2と同様に行った。患者血清として、IgA腎症患者32名、IgA腎症以外の腎症患者13名の血清を用いた。
以上の結果から、前記ペプチドは、血清中の抗ビメンチン抗体と結合することが確認され、血清中の抗ビメンチン抗体価の測定に使用できることが示された。
Claims (13)
- ヒトビメンチンの部分ペプチドを含むIgA腎症診断用キットであって、
前記部分ペプチドは、配列番号3で表されるアミノ酸配列を含み、且つ22~30アミノ酸長である、
IgA腎症診断用キット。 - さらに、免疫グロブリンに対する特異的結合物質を含む、請求項1に記載のIgA腎症診断用キット。
- 前記免疫グロブリンがIgAである、請求項2に記載のIgA腎症診断用キット。
- ヒトビメンチンの部分ペプチドを含むIgA腎症診断薬であって、
前記部分ペプチドは、配列番号3で表されるアミノ酸配列を含み、且つ22~30アミノ酸長である、
IgA腎症診断薬。 - 対象がIgA腎症に罹患している可能性を評価するためのデータを収集する方法であって、前記対象の血液試料中の抗ビメンチン抗体の抗体価を測定する工程(a1)を含み、
前記工程(a1)が、
(i-1)前記対象の血液試料を、ヒトビメンチンの部分ペプチドと接触させること;及び
(ii-1)前記部分ペプチドに結合した前記抗ビメンチン抗体の量を測定すること、
を含み、
前記部分ペプチドは、配列番号3で表されるアミノ酸配列を含み、且つ22~30アミノ酸長である、
方法。 - 前記抗ビメンチン抗体がIgAである、請求項5に記載の方法。
- 前記抗ビメンチン抗体の前記抗体価の測定をELISA法により行う、請求項5又は6に記載の方法。
- IgA腎症に罹患している対象におけるIgA腎症治療法としての扁桃摘出の効果を評価するためのデータを収集する方法であって、
扁桃摘出を行う前の前記対象の血液試料中の抗ビメンチン抗体の抗体価を測定する工程(a2)と、
前記扁桃摘出を行った後の前記対象の血液試料中の抗ビメンチン抗体の抗体価を測定する工程(b2)と、を含み、
前記工程(a2)が、
(i-2)前記扁桃摘出を行う前の前記対象の血液試料を、ヒトビメンチンの部分ペプチドと接触させること;及び(ii-2)前記(i-2)において前記部分ペプチドに結合した前記抗ビメンチン抗体の量を測定すること、を含み、
前記工程(b2)が、
(iii-2)前記扁桃摘出を行った後の前記対象の血液試料を、前記部分ペプチドと接触させること;及び(iv-2)前記(iii-2)において前記部分ペプチドに結合した前記抗ビメンチン抗体の量を測定すること、を含み、
前記部分ペプチドは、配列番号3で表されるアミノ酸配列を含み、且つ22~30アミノ酸長である、
方法。 - 前記抗ビメンチン抗体がIgAである、請求項8に記載の方法。
- 前記抗ビメンチン抗体の前記抗体価の測定を、ELISA法により行う、請求項8又は9に記載の方法。
- 腎症の疑いのある対象の血液試料から、IgA腎症を有する対象の血液試料を特定する方法であって、前記腎症の疑いのある対象の血液試料中の抗ビメンチン抗体の抗体価を測定する工程(a3)を含み、
前記工程(a3)が、
(i-3)前記腎症の疑いのある対象の血液試料を、ヒトビメンチンの部分ペプチドと接触させること;及び
(ii-3)前記部分ペプチドに結合した前記抗ビメンチン抗体の量を測定すること、
を含み、
前記部分ペプチドは、配列番号3で表されるアミノ酸配列を含み、且つ22~30アミノ酸長である、
方法。 - 前記抗ビメンチン抗体がIgAである、請求項11に記載の方法。
- 前記抗ビメンチン抗体の前記抗体価の測定を、ELISA法により行う、請求項11又は12に記載の方法。
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