JP2007163151A - 対象生物の生理状態を判定する方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】腎生検と比較して被験者への負荷の格段に少ない非侵襲的なＩｇＡ腎症判定方法であって、かつ、特異度・感度に優れた判定方法、特にＩｇＡ腎症の判定方法の提供。
【解決手段】対象生物から得たタンパク質を含む試料を複数の倍率で希釈し、それぞれについてＥＬＩＳＡ（酵素免疫定量）法を行なって、希釈による検出値の変化を求め、参照タンパク質を含む対照試料について同様に求めた希釈による検出値の変化と比較して、対象生物の生理状態を判定する方法及びそのために用いるキット。
【選択図】なし
【解決手段】対象生物から得たタンパク質を含む試料を複数の倍率で希釈し、それぞれについてＥＬＩＳＡ（酵素免疫定量）法を行なって、希釈による検出値の変化を求め、参照タンパク質を含む対照試料について同様に求めた希釈による検出値の変化と比較して、対象生物の生理状態を判定する方法及びそのために用いるキット。
【選択図】なし
Description
本発明は、対象生物の生理状態を判定する方法、特にＩｇＡ腎症または紫斑病の病態を判定する及びその方法に用いる診断キットに関する。
ＩｇＡ腎症とは、慢性糸球体腎炎のうち、糸球体メサンギウム細胞と基質の拡大（増生）とメサンギウム領域への ＩｇＡを主体とする沈着物とを認めるものをいう（ＩｇＡ腎症診療指針第２版（日腎会誌、2002,44(7),487-493））。
ＩｇＡ腎症は、慢性糸球体腎炎のうち成人では３０％以上、小児でも２０％以上を占め、慢性糸球体腎炎のうち頻度の最も大きな疾病である。また、長期的には末期腎不全へ至る症例が少なくなく、末期腎不全から透析療法に導入されるケースが少なくない。
ＩｇＡ腎症は、慢性糸球体腎炎のうち成人では３０％以上、小児でも２０％以上を占め、慢性糸球体腎炎のうち頻度の最も大きな疾病である。また、長期的には末期腎不全へ至る症例が少なくなく、末期腎不全から透析療法に導入されるケースが少なくない。
このため、早期に的確な診断と予後判定を行ない、個々の症例に適した治療を実施することが望ましい。しかし、初期の段階では顕著な症状が見出し難く、現実には偶然の機会に蛋白尿・血尿から発見に至る例が大多数を占める。また、ＩｇＡ腎症の確定診断には腎生検が不可欠であるとされているが、腎生検は出血などのリスクも高く、診断を受ける患者には肉体的にも経済的にも負担が大きい。
ＩｇＡ腎症の発症機序は未だ十分には解明されていないが、最近、ＩｇＡ１ヒンジ部の糖鎖異常が報告され、その糖鎖異常をもつ凝集ＩｇＡが抗原抗体複合物非依存性にメサンギウムに結合して炎症を惹起する可能性が示唆されている。そこで、ＩｇＡ腎症患者の血清ＩｇＡ１は、健常者等の非ＩｇＡ腎症患者の血清ＩｇＡ１よりも、ＩｇＡ１分子ヒンジ部を介したＩｇＡ１分子間の結合能が有意に増加しているとして、ＩｇＡ１分子間の結合能の差異を検出するＩｇＡ腎症の診断法が提案されている（特許文献１：特開平０９−３１１１３２）。また、ＩｇＡ１の糖鎖異常からヒンジ部が露出していることに着目し、抗合成ヒンジペプチド抗体によってその定量を図る方法も提案されている（非特許文献１：Nephrol. Dial. Transplant, 14:81-85, 1999）。
しかし、上記いずれの文献にも記載されているように、これらの方法ではＩｇＡ腎症患者群と非罹患者群とで定量結果に重複域が存在し、このため、判定のためのカットオフ値を高く設定すれば偽陰性のケースが増え、他方、カットオフ値を低く設定すると偽陽性のケースが増大し、ＩｇＡ腎症患者を確定的に非罹患者群から識別する方法としてはより明確な判定法が望まれていた。
従って、本発明は、腎生検と比較して被験者への負荷の格段に少ない非侵襲的なＩｇＡ腎症判定方法であって、かつ、特異度・感度に優れた判定方法を提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、ＥＬＩＳＡ法による判定の際に、検出された値そのものを比較するのではなく、複数の濃度、例えば倍々希釈した一連の試料を用いて濃度による検出値変化を求め、そのプロファイルを検体と対照とで比較することにより、ＩｇＡ腎症が判定し得ること、特にこの際の検体試料としては被験者から得た血清試料を用い得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
なお、上述のように、本発明はＩｇＡ腎症の判定方法の探求を契機とするが、上記手法は他の疾病にも適用し得るものである。従って、本発明は、一般的に以下の生理状態判定方法、ＩｇＡ腎症または紫斑病の判定方法、ＩｇＡ腎症または紫斑病の病態判定方法並びにＩｇＡ腎症または紫斑病の診断キットを提供する。
１．対象生物から得たタンパク質を含む試料を複数の倍率で希釈し、それぞれについてＥＬＩＳＡ（酵素免疫定量）法を行なって、希釈による検出値の変化を求め、参照タンパク質を含む対照試料について同様に求めた希釈による検出値の変化と比較して、対象生物の生理状態を判定する方法。
２．希釈倍率に対し検出値をプロットして得られる濃度−検出値曲線の対比により判定を行なう前記１に記載の判定方法。
３．希釈倍率の対数値に対し検出値をプロットして得られる濃度−検出値曲線について最小二乗法によって近似直線の傾きを求めて対比して判定を行なう前記２に記載の判定方法。
４．前記試料が対象生物から得た血清である前記１〜３のいずれかに記載の判定方法。
５．ＥＬＩＳＡ法で用いる１次抗体が抗免疫グロブリン抗体である前記１〜４のいずれかに記載の判定方法。
６．抗免疫グロブリン抗体が抗ＩｇＡ抗体である前記５に記載の判定方法。
７．生理状態の判定が疾病の罹患の有無及び／または病態の判定である前記１〜６のいずれかに記載の判定方法。
８．対象生物がヒトである前記１〜７のいずれかに記載の判定方法。
９．ＥＬＩＳＡ法で用いる１次抗体が抗ＩｇＡ抗体であり、２次抗体が、糖鎖異常ＩｇＡと結合するタンパク質の抗体である前記６〜８のいずれかに記載の判定方法。
１０．２次抗体が標識抗ＩｇＧ Ｆｃ抗体である前記９に記載の判定方法。
１１．疾病がＩｇＡ腎症または紫斑病である前記９または１０に記載の判定方法。
１２．ヒト抗ＩｇＡ抗体で被覆したプレートに、被検者から採取した血清を倍々希釈して接触させた後、各プレートに標識抗ＩｇＧ Ｆｃ抗体を接触させ、前記血清中の糖鎖異常ＩｇＡを介して標識抗ＩｇＧ Ｆｃ抗体を固定する工程１、標識を検出して希釈倍率の対数値に対し検出値をプロットし、得られる濃度−検出値曲線について最小二乗法によって近似直線の傾きを求める工程２、及び非罹患者から採取した血清についても同様の処理を行なって近似直線の傾きと対比する工程３を含み、工程２で求めた傾きが工程３により決定される閾値未満である場合には被験者がＩｇＡ腎症または紫斑病に罹患していると判定する前記１１に記載の判定方法。
１３．工程２で求めた傾きによりＩｇＡ腎症または紫斑病の病態を判定する前記１２に記載の判定方法。
１４．抗ＩｇＡ抗体を含むＥＬＩＳＡ法の基材と標識された抗ＩｇＧ Ｆｃ抗体を含むＩｇＡ腎症または紫斑病の診断キット。
１．対象生物から得たタンパク質を含む試料を複数の倍率で希釈し、それぞれについてＥＬＩＳＡ（酵素免疫定量）法を行なって、希釈による検出値の変化を求め、参照タンパク質を含む対照試料について同様に求めた希釈による検出値の変化と比較して、対象生物の生理状態を判定する方法。
２．希釈倍率に対し検出値をプロットして得られる濃度−検出値曲線の対比により判定を行なう前記１に記載の判定方法。
３．希釈倍率の対数値に対し検出値をプロットして得られる濃度−検出値曲線について最小二乗法によって近似直線の傾きを求めて対比して判定を行なう前記２に記載の判定方法。
４．前記試料が対象生物から得た血清である前記１〜３のいずれかに記載の判定方法。
５．ＥＬＩＳＡ法で用いる１次抗体が抗免疫グロブリン抗体である前記１〜４のいずれかに記載の判定方法。
６．抗免疫グロブリン抗体が抗ＩｇＡ抗体である前記５に記載の判定方法。
７．生理状態の判定が疾病の罹患の有無及び／または病態の判定である前記１〜６のいずれかに記載の判定方法。
８．対象生物がヒトである前記１〜７のいずれかに記載の判定方法。
９．ＥＬＩＳＡ法で用いる１次抗体が抗ＩｇＡ抗体であり、２次抗体が、糖鎖異常ＩｇＡと結合するタンパク質の抗体である前記６〜８のいずれかに記載の判定方法。
１０．２次抗体が標識抗ＩｇＧ Ｆｃ抗体である前記９に記載の判定方法。
１１．疾病がＩｇＡ腎症または紫斑病である前記９または１０に記載の判定方法。
１２．ヒト抗ＩｇＡ抗体で被覆したプレートに、被検者から採取した血清を倍々希釈して接触させた後、各プレートに標識抗ＩｇＧ Ｆｃ抗体を接触させ、前記血清中の糖鎖異常ＩｇＡを介して標識抗ＩｇＧ Ｆｃ抗体を固定する工程１、標識を検出して希釈倍率の対数値に対し検出値をプロットし、得られる濃度−検出値曲線について最小二乗法によって近似直線の傾きを求める工程２、及び非罹患者から採取した血清についても同様の処理を行なって近似直線の傾きと対比する工程３を含み、工程２で求めた傾きが工程３により決定される閾値未満である場合には被験者がＩｇＡ腎症または紫斑病に罹患していると判定する前記１１に記載の判定方法。
１３．工程２で求めた傾きによりＩｇＡ腎症または紫斑病の病態を判定する前記１２に記載の判定方法。
１４．抗ＩｇＡ抗体を含むＥＬＩＳＡ法の基材と標識された抗ＩｇＧ Ｆｃ抗体を含むＩｇＡ腎症または紫斑病の診断キット。
本発明の方法によれば、従来の検定法では明確な識別が困難であった対象生物の生理状態の判定を明確に行なうことができる。また、患者群内での病態の比較や個体における病態の推移についても知見を得ることが期待される。
本発明は、対象生物から得たタンパク質を含む試料を複数の倍率で希釈し、それぞれについてＥＬＩＳＡ（酵素免疫定量）法、特にサンドイッチＥＬＩＳＡ法（２抗体酵素抗体法）を行なって、希釈による検出値の変化を求め、参照タンパク質を含む対照試料について同様に求めた希釈による検出値の変化と比較して、対象生物の生理状態を判定することを特徴とする。
すなわち、一般的なサンドイッチＥＬＩＳＡ法では、１次抗体を含む溶液を基材表面に接触させ、溶液中の１次抗体を吸着させる。しかる後、液相を除いて固相上に吸着した１次抗体だけを残し、ここに試料溶液を加える。試料中に１次抗体に結合する物質が含まれていた場合、前記物質は１次抗体に結合し固定される。次いで、洗浄を行なって未結合物質を除き、さらに、前記物質に（１次抗体との結合部位以外の部位で）結合する２次抗体を加え、洗浄を行なって未結合物質を除き、２次抗体の定量を行なうことにより試料溶液中の１次抗体及び２次抗体に結合する物質（以下、単に「検定物質」ともいう。）の存在の有無の確認や定量を行なう。通常は２次抗体に標識を付与し、標識自体または標識に基づく反応に基づいて検定物質の定量を行なう。
しかし、従来法で検定物質が対象生物の生理状態に関するマーカーとして用い得るのは、当該物質の濃度が生理状態によって大きく異なる場合のみである。例えば、特定の疾病の患者群と対照群とで検定物質の検出値が図１に示すように重複している場合、重複領域ｂの範囲内の結果を示す被験者については、患者であるか非罹患者であるかの判定ができない。従って、検出値が特に高い（図中ａ）か低い（図中ｃ）被験者以外については罹患の有無は識別できず、図に示すように前記重複領域が広い場合には、前記検定物質を疾病状態のマーカーとしては使用できない。
ところが、本発明者らの検討によれば、ＥＬＩＳＡ法において、試料溶液の濃度を変化させ、濃度−検出値曲線を作成した場合、患者群と対照群とでその挙動（例えば、傾き）が異なる場合があり得ることが判明した。
具体的には、図２の例のように患者Ｐｘと非罹患者Ｃｘから得た検体濃度と前述の結合物質の検出値との間に統計的に有意な相関が認められ、かつ、患者群と対照（非罹患者）群のそれぞれについて同様の測定を行なった場合、両者が相関係数（ここでは傾き）において明確に分離され得る場合（図３参照）があり得ることが見出された。この場合、１つの濃度での検出値の比較だけでは対照群と患者群は分離識別できないが、複数の濃度での検出値の変化を求めることにより、対照群と患者群とが分離識別できることになる。
具体的には、図２の例のように患者Ｐｘと非罹患者Ｃｘから得た検体濃度と前述の結合物質の検出値との間に統計的に有意な相関が認められ、かつ、患者群と対照（非罹患者）群のそれぞれについて同様の測定を行なった場合、両者が相関係数（ここでは傾き）において明確に分離され得る場合（図３参照）があり得ることが見出された。この場合、１つの濃度での検出値の比較だけでは対照群と患者群は分離識別できないが、複数の濃度での検出値の変化を求めることにより、対照群と患者群とが分離識別できることになる。
このように、本発明は対象生物から得たタンパク質を含む試料を複数の倍率で希釈し、それぞれについてＥＬＩＳＡ（酵素免疫定量）法を行なって、希釈による検出値の変化を求め、参照タンパク質を含む対照試料について同様に求めた希釈による検出値の変化と比較して、対象生物の生理状態を判定する。
ＥＬＩＳＡ（酵素免疫定量）法は、いわゆる直接法でもサンドイッチ法でもよい。あるいはその他の変法でもよい。検出対象とする物質は、対象生物において、観察しようとする生理状態との関連が考えられる物質であり、ＥＬＩＳＡ法で検出可能な物質であればよい。
ＥＬＩＳＡ（酵素免疫定量）法は、いわゆる直接法でもサンドイッチ法でもよい。あるいはその他の変法でもよい。検出対象とする物質は、対象生物において、観察しようとする生理状態との関連が考えられる物質であり、ＥＬＩＳＡ法で検出可能な物質であればよい。
本発明を適用する場合、対象生物から検定物質を含む試料を取り出し、必要に応じて前処理を行なった後、検定物質との結合が期待される抗体を予め固定したＥＬＩＳＡ法用基材に接触させ、ＥＬＩＳＡ法の常法に従って検出値を求める。サンドイッチ法の場合は、上記のように標識２次抗体を用いてもよい。
検出は、慣用の方法により行なえばよく、例えば、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）、７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸（ＡＭＣＡ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、アロフィコシアニン−シアニン７（ＡＰＣ−Ｃｙ７）、ウシ血清アルブミン（ＢＡＳ）、化学発光物質、シアニン（Ｃｙ）、シアニン２（Ｃｙ２）、シアニン３（Ｃｙ３）、シアニン３．５（Ｃｙ３．５）、シアニン５（Ｃｙ５）、シアニン５．５（Ｃｙ５．５）、シアニン７（Ｃｙ７）、フルオレッセインジクロロトリアジン（ＤＴＡＦ）、フルオロブルー（ＦＢ）、磁性粒子、フルオレッセインイソチオシアネート（ＦｌＴＣ）、蛍光粒子、金コロイド、グルコースオキシターゼ（ＧｌｕＯｘ）、ペルオキシターゼ（ＨＲＰ）、ヘモシアニン（ＫＬＨ）、フィコシアニン（ＰＣ）、フィコエリスリン（ＰＥ）、Ｂ−フィコエリスリン（ＰＢ−Ｂ）、フィコエリスリン−Ｃｙ５（ＰＥ−Ｃｙ５）、フィコエリスリン−Ｃｙ７（ＰＥ−Ｃｙ７）、Ｒ−フィコエリスリン（ＰＥ−Ｒ）、Ｒ−フィコエリスリン−Ｃｙ５（ＰＥ−Ｒ−Ｃｙ５）、Ｒ−フィコエリスリン−ＴＸＲＤ（ＰＥ−ＴＲ）、ポリスチレンビーズ（ＰＳ）、ローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）、サポリン（ＳＡＰ）、スペクトラルレッド（ＳＰＲＤ）、テキサスレッド（ＴＸＲＤ）、β−ガラクトシターゼ（β−Ｇａｌ）等の標識を用い、各標識について公知の検出方法を用いればよい。
検出は、慣用の方法により行なえばよく、例えば、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）、７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸（ＡＭＣＡ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、アロフィコシアニン−シアニン７（ＡＰＣ−Ｃｙ７）、ウシ血清アルブミン（ＢＡＳ）、化学発光物質、シアニン（Ｃｙ）、シアニン２（Ｃｙ２）、シアニン３（Ｃｙ３）、シアニン３．５（Ｃｙ３．５）、シアニン５（Ｃｙ５）、シアニン５．５（Ｃｙ５．５）、シアニン７（Ｃｙ７）、フルオレッセインジクロロトリアジン（ＤＴＡＦ）、フルオロブルー（ＦＢ）、磁性粒子、フルオレッセインイソチオシアネート（ＦｌＴＣ）、蛍光粒子、金コロイド、グルコースオキシターゼ（ＧｌｕＯｘ）、ペルオキシターゼ（ＨＲＰ）、ヘモシアニン（ＫＬＨ）、フィコシアニン（ＰＣ）、フィコエリスリン（ＰＥ）、Ｂ−フィコエリスリン（ＰＢ−Ｂ）、フィコエリスリン−Ｃｙ５（ＰＥ−Ｃｙ５）、フィコエリスリン−Ｃｙ７（ＰＥ−Ｃｙ７）、Ｒ−フィコエリスリン（ＰＥ−Ｒ）、Ｒ−フィコエリスリン−Ｃｙ５（ＰＥ−Ｒ−Ｃｙ５）、Ｒ−フィコエリスリン−ＴＸＲＤ（ＰＥ−ＴＲ）、ポリスチレンビーズ（ＰＳ）、ローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）、サポリン（ＳＡＰ）、スペクトラルレッド（ＳＰＲＤ）、テキサスレッド（ＴＸＲＤ）、β−ガラクトシターゼ（β−Ｇａｌ）等の標識を用い、各標識について公知の検出方法を用いればよい。
本発明では、試料を希釈して第２の濃度でＥＬＩＳＡ法の操作を行なう。以後、同様の操作を繰り返し、（濃度，検出値）の組からなるデータを求める。例えば、判定しようとする生理状態が疾病への罹患である場合には、患者と非罹患者のそれぞれにおいて（濃度，検出値）の組からなるデータを収集し、患者群と非罹患者群とで濃度−検出値間の相関係数を求め、両群で統計的に有意な差がある場合、新たな被験者については、同様な操作により濃度−検出値間の相関係数から患者群に属するか非罹患者群に属するかの判定が可能となる。希釈は、試料に応じて決定される初濃度に応じ任意の倍率で行ない得るが典型的には倍々希釈すればよい。また、測定は複数の希釈倍率であれば可能であるが、通常は３〜２０回の希釈、好ましくは５〜１０回の希釈で測定を行なえばよい。
相関係数は統計的に慣用されているいずれの方法により求めてもよいが、典型的には回帰分析、特に単回帰分析（最小二乗法）により傾きを求める。最小二乗法は周知の方法であり、当業者には公知の公式から傾きを求めることができる。
本発明では、濃度−検出値間の相関係数、例えば、その傾きを判定に用いるため、濃度や検出値は絶対的な値ではなく対比が可能である限りにおいて相対的な値でよい。例えば、濃度としては、試料中の検体の濃度を求める必要はなく、試料の希釈率を用いることができる。
本発明では、濃度−検出値間の相関係数、例えば、その傾きを判定に用いるため、濃度や検出値は絶対的な値ではなく対比が可能である限りにおいて相対的な値でよい。例えば、濃度としては、試料中の検体の濃度を求める必要はなく、試料の希釈率を用いることができる。
従って、本発明の好適実施態様には、希釈倍率に対し検出値をプロットして得られる濃度−検出値曲線の対比により判定を行なう判定方法が含まれ、特に、希釈倍率の対数値に対し検出値をプロットして得られる濃度−検出値曲線について最小二乗法によって近似直線の傾きを求めて対比して判定を行なう判定方法が含まれる。
試料は、対象生物から得た血液、血清、組織液、分泌液、浸出液、唾液、尿等の液体試料でもよいし、対象生物の組織や排出物、排泄物、分離片、粘膜やこれらから採取した試料等を処理したものでもよい。
対象生物は、種々の動物、植物、微生物等が含まれるが、動物、特に哺乳類、特にヒトが含まれる。
試料は、対象生物から得た血液、血清、組織液、分泌液、浸出液、唾液、尿等の液体試料でもよいし、対象生物の組織や排出物、排泄物、分離片、粘膜やこれらから採取した試料等を処理したものでもよい。
対象生物は、種々の動物、植物、微生物等が含まれるが、動物、特に哺乳類、特にヒトが含まれる。
ＥＬＩＳＡ法で基材に固定して用いる物質は検定物質と結合する物質であれば特に限定されない。典型的にはこのような物質は検定物質を抗原とする抗体であり、種々の物質が含まれる。このような物質の一例としては、抗免疫グロブリン抗体が挙げられる。
本発明は、特にＩｇＡ腎症または紫斑病の判定方法として有用である。
ＩｇＡ腎症または紫斑病の罹患の有無及び／または病態を判定する場合、抗ＩｇＡ抗体を固定した基材を用いてＥＬＩＳＡ法を行なう。検体試料としては血清を用いる。また、２次抗体として標識抗ＩｇＧ Ｆｃ抗体を用いる。本発明者らの知見によれば、血清中においてＩｇＡ腎症または紫斑病の患者のＩｇＡの一部はＩｇＧ Ｆｃとの複合体を形成しており、抗ＩｇＡ抗体に結合した血清中のＩｇＡ−ＩｇＧ Ｆｃ複合体に標識抗ＩｇＧ Ｆｃ抗体を結合させることが可能である。もっとも、後述の実施例に示すように、この場合、単純な検出値の比較だけでは感度と特異度の両者に優れた判定は不可能である。しかるに、本発明の方法に従って、試料を複数の濃度で用いて濃度−検出値曲線を作成し、患者と非罹患者との間で比較することにより、両者を明瞭に区別することが可能である。具体的には、最小二乗法によって近似直線の傾きを求める方法が有効である。すなわち、本発明は、ヒト抗ＩｇＡ抗体で被覆したプレートに、被検者から採取した血清を倍々希釈して接触させた後、各プレートに標識抗ＩｇＧ Ｆｃ抗体を接触させ、前記血清中の糖鎖異常ＩｇＡを介して標識抗ＩｇＧ Ｆｃ抗体を固定する工程１、標識を検出して希釈倍率の対数値に対し検出値をプロットし、得られる濃度−検出値曲線について最小二乗法によって近似直線の傾きを求める工程２、及び非罹患者から採取した血清についても同様の処理を行なって近似直線の傾きと対比する工程３を含み、工程２で求めた傾きが工程３により決定される閾値未満である場合には被験者がＩｇＡ腎症または紫斑病に罹患していると判定する方法を提供する。
ＩｇＡ腎症または紫斑病の罹患の有無及び／または病態を判定する場合、抗ＩｇＡ抗体を固定した基材を用いてＥＬＩＳＡ法を行なう。検体試料としては血清を用いる。また、２次抗体として標識抗ＩｇＧ Ｆｃ抗体を用いる。本発明者らの知見によれば、血清中においてＩｇＡ腎症または紫斑病の患者のＩｇＡの一部はＩｇＧ Ｆｃとの複合体を形成しており、抗ＩｇＡ抗体に結合した血清中のＩｇＡ−ＩｇＧ Ｆｃ複合体に標識抗ＩｇＧ Ｆｃ抗体を結合させることが可能である。もっとも、後述の実施例に示すように、この場合、単純な検出値の比較だけでは感度と特異度の両者に優れた判定は不可能である。しかるに、本発明の方法に従って、試料を複数の濃度で用いて濃度−検出値曲線を作成し、患者と非罹患者との間で比較することにより、両者を明瞭に区別することが可能である。具体的には、最小二乗法によって近似直線の傾きを求める方法が有効である。すなわち、本発明は、ヒト抗ＩｇＡ抗体で被覆したプレートに、被検者から採取した血清を倍々希釈して接触させた後、各プレートに標識抗ＩｇＧ Ｆｃ抗体を接触させ、前記血清中の糖鎖異常ＩｇＡを介して標識抗ＩｇＧ Ｆｃ抗体を固定する工程１、標識を検出して希釈倍率の対数値に対し検出値をプロットし、得られる濃度−検出値曲線について最小二乗法によって近似直線の傾きを求める工程２、及び非罹患者から採取した血清についても同様の処理を行なって近似直線の傾きと対比する工程３を含み、工程２で求めた傾きが工程３により決定される閾値未満である場合には被験者がＩｇＡ腎症または紫斑病に罹患していると判定する方法を提供する。
希釈は、初濃度を１０〜２００倍希釈程度に設定すれば、任意の倍率で行ない得るが典型的には倍々希釈すればよい。また、上述したように、測定は複数の希釈倍率であればよいが、通常は３〜２０回の希釈、好ましくは５〜１０回の希釈を行なえばよい。
本発明の方法により、ＩｇＡ腎症または紫斑病患者が判定される機構の詳細は不明であるが、患者と非罹患者ではＩｇＡ−ＩｇＧ Ｆｃ複合体の構成が異なっていることが考えられる。具体的にはＩｇＡ−ＩｇＧ Ｆｃ複合体のＩｇＧ Ｆｃが患者と非罹患者で異なっていること、あるいはＩｇＡ−ＩｇＧ Ｆｃ複合体中のそれぞれの構成成分の和（すなわち、両者の比）が異なっていることなどが考えられ、これにより患者と非罹患者とで試料希釈時の濃度−検出値曲線のプロファイルが相違する結果となるものと考えられる。もっとも、本発明以前にこれらの予想がなされていたことはなく、また、これらの機構は推定にすぎず、本発明の作用機構はこれらに限定されるものではない。
本発明の方法により、ＩｇＡ腎症または紫斑病患者が判定される機構の詳細は不明であるが、患者と非罹患者ではＩｇＡ−ＩｇＧ Ｆｃ複合体の構成が異なっていることが考えられる。具体的にはＩｇＡ−ＩｇＧ Ｆｃ複合体のＩｇＧ Ｆｃが患者と非罹患者で異なっていること、あるいはＩｇＡ−ＩｇＧ Ｆｃ複合体中のそれぞれの構成成分の和（すなわち、両者の比）が異なっていることなどが考えられ、これにより患者と非罹患者とで試料希釈時の濃度−検出値曲線のプロファイルが相違する結果となるものと考えられる。もっとも、本発明以前にこれらの予想がなされていたことはなく、また、これらの機構は推定にすぎず、本発明の作用機構はこれらに限定されるものではない。
本発明の方法によればＩｇＡ腎症または紫斑病への罹患の有無が判定されるが、紫斑病患者は紫斑の有無などによりＩｇＡ腎症患者から容易に識別できるので、その点をも考慮すれば本発明の方法によればＩｇＡ腎症の罹患の有無が判定できる。
また、本発明の方法によれば、ＩｇＡ腎症または紫斑病患者の病態の判定も可能となる。
また、本発明の方法によれば、ＩｇＡ腎症または紫斑病患者の病態の判定も可能となる。
さらに、本発明によれば、抗ＩｇＡ抗体を含むＥＬＩＳＡ法の基材と標識された抗ＩｇＧ Ｆｃ抗体を含むＩｇＡ腎症または紫斑病の診断キットが提供される。このようなキットは、例えば、後述するようにして抗ＩｇＡ抗体をコーティングしたＥＬＩＳＡ用プレートと前述する標識のいずれかで標識された抗ＩｇＧ Ｆｃ抗体とを含み、さらに発色操作等に必要な試薬や溶液を含んでもよい。また、濃度−検出値曲線のプロファイルの判定に必要なデータや判定プログラムを含んでもよい。
以下、本発明を実施例、比較例によって、より詳細に説明する。
実施例１
（ａ）ＥＬＩＳＡ用プレートの作製
ヒト抗ＩｇＡ抗体（ＩＣＮ／ＣＡＰＰＥＬ社（ＭＢ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，ＬＬＣ，Ｓｏｌｏｎ，Ｏｈｉｏ，ＵＳＡ））を下記コーティング用緩衝液中に４μｇ／ｍｌ濃度になるように溶解し（上記抗体を５００倍希釈で使用）、９６穴プレート（ＥＩＡ／ＲＩＡプレート，Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．）の各ウエルに１００μlずつ加え、４℃で一晩放置した後、各ウエルをウエル当たり下記洗浄用緩衝液各２００μｌで３回洗浄して未固定の抗体を除いた。次いで、ブロッキング用緩衝液を各ウエルに１００μｌの割合で加え４℃で一晩放置した。プレートは、この段階でブロッキング用緩衝液を除きそのまま−２０℃で保存することが可能である。
実施例１
（ａ）ＥＬＩＳＡ用プレートの作製
ヒト抗ＩｇＡ抗体（ＩＣＮ／ＣＡＰＰＥＬ社（ＭＢ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，ＬＬＣ，Ｓｏｌｏｎ，Ｏｈｉｏ，ＵＳＡ））を下記コーティング用緩衝液中に４μｇ／ｍｌ濃度になるように溶解し（上記抗体を５００倍希釈で使用）、９６穴プレート（ＥＩＡ／ＲＩＡプレート，Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．）の各ウエルに１００μlずつ加え、４℃で一晩放置した後、各ウエルをウエル当たり下記洗浄用緩衝液各２００μｌで３回洗浄して未固定の抗体を除いた。次いで、ブロッキング用緩衝液を各ウエルに１００μｌの割合で加え４℃で一晩放置した。プレートは、この段階でブロッキング用緩衝液を除きそのまま−２０℃で保存することが可能である。
・コーティング用緩衝液：０．０１５Ｍ炭酸ナトリウム（０．３１８ｇ／２００ｍｌ ＤＤＷ）溶液（ただしＤＤＷは二回蒸留水を表わす。以下、同じ。）
・洗浄用緩衝液：４ｇ Ｎａ2ＨＰＯ4，３ｇ ＫＨ2ＰＯ4，９ｇ ＮａＣｌ，１ｇ 牛血清アルブミン（ＢＳＡ），５００μｌ Ｔｗｅｅｎ２０を１リットルのＤＤＷに溶解した溶液（以下、ＰＢＳ−Ｔ）。
・ブロッキング用緩衝液：１ｇのＢＳＡをＰＢＳ２００ｍｌに溶解した溶液（ＰＢＳは市販のＰＢＳタブレット“ＡＭＲＥＳＣＯ社 Ｓｏｌｏｎ，Ｏｈｉｏ，ＵＳＡ”を使用して作成した）。
・洗浄用緩衝液：４ｇ Ｎａ2ＨＰＯ4，３ｇ ＫＨ2ＰＯ4，９ｇ ＮａＣｌ，１ｇ 牛血清アルブミン（ＢＳＡ），５００μｌ Ｔｗｅｅｎ２０を１リットルのＤＤＷに溶解した溶液（以下、ＰＢＳ−Ｔ）。
・ブロッキング用緩衝液：１ｇのＢＳＡをＰＢＳ２００ｍｌに溶解した溶液（ＰＢＳは市販のＰＢＳタブレット“ＡＭＲＥＳＣＯ社 Ｓｏｌｏｎ，Ｏｈｉｏ，ＵＳＡ”を使用して作成した）。
（ｂ）ＥＬＩＳＡ法
ＩｇＡ腎症（ＩｇＡＮ）については腎生検で、紫斑病（ＨＳＰ）については臨床症状の症状診断で各疾病に罹患していることが確認されている患者（ＩｇＡＮ：２２名、ＨＳＰ：１０名）並びに健常者及び腎疾患患者のうち上記疾患のいずれにも罹患していないことが確認されている者（Ｃｏｎｔ：１９名）それぞれから血清試料１０μｌを採取し９９０μｌのＰＢＳで希釈し１００倍希釈血清１ｍｌを作成した。
１００倍希釈血清より５００μｌの試料を採取し、５００μｌのＰＢＳに加え２００倍に希釈する。同じ操作を繰り返し一つの試料につき次のような血清の希釈系列１０検体：（１）100倍、（２）200倍、（３）400倍、（４）800倍、（５）1600倍、（６）3200倍、（７）6400倍、（８）12800倍、（９）25600倍、（１０）51200倍を作成した。
ＩｇＡ腎症（ＩｇＡＮ）については腎生検で、紫斑病（ＨＳＰ）については臨床症状の症状診断で各疾病に罹患していることが確認されている患者（ＩｇＡＮ：２２名、ＨＳＰ：１０名）並びに健常者及び腎疾患患者のうち上記疾患のいずれにも罹患していないことが確認されている者（Ｃｏｎｔ：１９名）それぞれから血清試料１０μｌを採取し９９０μｌのＰＢＳで希釈し１００倍希釈血清１ｍｌを作成した。
１００倍希釈血清より５００μｌの試料を採取し、５００μｌのＰＢＳに加え２００倍に希釈する。同じ操作を繰り返し一つの試料につき次のような血清の希釈系列１０検体：（１）100倍、（２）200倍、（３）400倍、（４）800倍、（５）1600倍、（６）3200倍、（７）6400倍、（８）12800倍、（９）25600倍、（１０）51200倍を作成した。
一方、上記（ａ）で作製したＥＬＩＳＡ用プレートを上記ＰＢＳ−Ｔで６回洗浄した後、上記希釈系列の検体試料を１００μｌ／ウエルで加え、室温で１時間半反応させた。
次いで、ＰＢＳ−Ｔで６回洗浄し結合しなかった試料を洗い流し、ＰＢＳで５００倍に希釈したＨＲＰ標識抗ＩｇＧ Ｆｃ抗体（ＩＣＮ／ＣＡＰＰＥＬ社）を１００μｌ／ウエルの割合で加え、室温で１時間反応させることにより標識抗体処理を行なった。
ＰＢＳ−Ｔで１２回洗浄し、結合しないで残ったＨＲＰ標識抗体を洗い流した後、下記基質溶液を１００μｌ／ウエルで加え、１３分間反応した後、２Ｎ硫酸を１００μｌ／ウエルの割合で加え反応を停止し、４９０ｎｍの吸収を測定して定量した。
・基質溶液：３．５９ｇのＮａ2ＨＰＯ4，１．０５ｇのクエン酸，４０ｍｇのｏ−フェニレンジアミン，３０μｌの過酸化水素（過酸化水素３１％含有）を１００ｍｌのＤＤＷに溶解した溶液（使用直前に調製する）。
次いで、ＰＢＳ−Ｔで６回洗浄し結合しなかった試料を洗い流し、ＰＢＳで５００倍に希釈したＨＲＰ標識抗ＩｇＧ Ｆｃ抗体（ＩＣＮ／ＣＡＰＰＥＬ社）を１００μｌ／ウエルの割合で加え、室温で１時間反応させることにより標識抗体処理を行なった。
ＰＢＳ−Ｔで１２回洗浄し、結合しないで残ったＨＲＰ標識抗体を洗い流した後、下記基質溶液を１００μｌ／ウエルで加え、１３分間反応した後、２Ｎ硫酸を１００μｌ／ウエルの割合で加え反応を停止し、４９０ｎｍの吸収を測定して定量した。
・基質溶液：３．５９ｇのＮａ2ＨＰＯ4，１．０５ｇのクエン酸，４０ｍｇのｏ−フェニレンジアミン，３０μｌの過酸化水素（過酸化水素３１％含有）を１００ｍｌのＤＤＷに溶解した溶液（使用直前に調製する）。
（ｃ）ＥＬＩＳＡ法による判定
各検体試料について得られた１０個の吸光度データから、濃度（希釈率の対数値）−検出値曲線を得た。結果を図４に示す（このグラフでは便宜上、各群から２名ずつのデータのみ示す）。図中、白丸（ＩｇＡ−ＩｇＧ Ｆｃ／Ｃｏｎｔｒｏｌ）は対照群からのデータを示し、黒丸はＩｇＡ腎症患者（ＩｇＡ−ＩｇＧ Ｆｃ／ＩｇＡＮ）及び紫斑病患者（ＩｇＡ−ＩｇＧ Ｆｃ／ＨＳＰ）からのデータを示す。
図４に示していないデータを含め、試験群、対照群の全員について最小二乗法を用い近似される直線の傾きを求めた。結果を図５に示す。この例での判定は破線（図中、矢印で指し示す）で示す検出値対濃度の傾き（絶対値）０．０１２をカットオフ値とした。検定は対応のないｔ検定（スチューデント法）によった。なお、Ｃｏｎｔは対照、ＩｇＡＮはＩｇＡ腎症患者、ＨＳＰは紫斑病患者を示す。
この図に示すように、本発明によれば、高い確度及び特異度をもってＩｇＡ腎症または紫斑病を判定することが可能である。
各検体試料について得られた１０個の吸光度データから、濃度（希釈率の対数値）−検出値曲線を得た。結果を図４に示す（このグラフでは便宜上、各群から２名ずつのデータのみ示す）。図中、白丸（ＩｇＡ−ＩｇＧ Ｆｃ／Ｃｏｎｔｒｏｌ）は対照群からのデータを示し、黒丸はＩｇＡ腎症患者（ＩｇＡ−ＩｇＧ Ｆｃ／ＩｇＡＮ）及び紫斑病患者（ＩｇＡ−ＩｇＧ Ｆｃ／ＨＳＰ）からのデータを示す。
図４に示していないデータを含め、試験群、対照群の全員について最小二乗法を用い近似される直線の傾きを求めた。結果を図５に示す。この例での判定は破線（図中、矢印で指し示す）で示す検出値対濃度の傾き（絶対値）０．０１２をカットオフ値とした。検定は対応のないｔ検定（スチューデント法）によった。なお、Ｃｏｎｔは対照、ＩｇＡＮはＩｇＡ腎症患者、ＨＳＰは紫斑病患者を示す。
この図に示すように、本発明によれば、高い確度及び特異度をもってＩｇＡ腎症または紫斑病を判定することが可能である。
比較例１
実施例１の１００倍希釈の検出値のみを対比したグラフを図６に示す。
この図に示すように、特定濃度の検出値の比較ではＩｇＡ腎症または紫斑病の患者と非罹患者の血清成分は個体差により大きな重なりが見られる。図中、検出値（吸光度）のいずれの値（特に０．１１〜０．１８の範囲内）をカットオフ値としても十分な判定が行ない得ないことが理解される。
実施例１の１００倍希釈の検出値のみを対比したグラフを図６に示す。
この図に示すように、特定濃度の検出値の比較ではＩｇＡ腎症または紫斑病の患者と非罹患者の血清成分は個体差により大きな重なりが見られる。図中、検出値（吸光度）のいずれの値（特に０．１１〜０．１８の範囲内）をカットオフ値としても十分な判定が行ない得ないことが理解される。
Claims (14)
- 対象生物から得たタンパク質を含む試料を複数の倍率で希釈し、それぞれについてＥＬＩＳＡ（酵素免疫定量）法を行なって、希釈による検出値の変化を求め、参照タンパク質を含む対照試料について同様に求めた希釈による検出値の変化と比較して、対象生物の生理状態を判定する方法。
- 希釈倍率に対し検出値をプロットして得られる濃度−検出値曲線の対比により判定を行なう請求項１に記載の判定方法。
- 希釈倍率の対数値に対し検出値をプロットして得られる濃度−検出値曲線について最小二乗法によって近似直線の傾きを求めて対比して判定を行なう請求項２に記載の判定方法。
- 前記試料が対象生物から得た血清である請求項１〜３のいずれかに記載の判定方法。
- ＥＬＩＳＡ法で用いる１次抗体が抗免疫グロブリン抗体である請求項１〜４のいずれかに記載の判定方法。
- 抗免疫グロブリン抗体が抗ＩｇＡ抗体である請求項５に記載の判定方法。
- 生理状態の判定が疾病の罹患の有無及び／または疾病の病態の判定である請求項１〜６のいずれかに記載の判定方法。
- 対象生物がヒトである請求項１〜７のいずれかに記載の判定方法。
- ＥＬＩＳＡ法で用いる１次抗体が抗ＩｇＡ抗体であり、２次抗体が、糖鎖異常ＩｇＡと結合するタンパク質の抗体である請求項６〜８のいずれかに記載の判定方法。
- ２次抗体が標識抗ＩｇＧ Ｆｃ抗体である請求項９に記載の判定方法。
- 疾病がＩｇＡ腎症または紫斑病である請求項９または１０に記載の判定方法。
- ヒト抗ＩｇＡ抗体で被覆したプレートに、被検者から採取した血清を倍々希釈して接触させた後、各プレートに標識抗ＩｇＧ Ｆｃ抗体を接触させ、前記血清中の糖鎖異常ＩｇＡを介して標識抗ＩｇＧ Ｆｃ抗体を固定する工程１、標識を検出して希釈倍率の対数値に対し検出値をプロットし、得られる濃度−検出値曲線について最小二乗法によって近似直線の傾きを求める工程２、及び非罹患者から採取した血清についても同様の処理を行なって近似直線の傾きと対比する工程３を含み、工程２で求めた傾きが工程３により決定される閾値未満である場合には被験者がＩｇＡ腎症または紫斑病に罹患していると判定する請求項１１に記載の判定方法。
- 工程２で求めた傾きによりＩｇＡ腎症または紫斑病の病態を判定する請求項１２に記載の判定方法。
- 抗ＩｇＡ抗体を含むＥＬＩＳＡ法の基材と標識された抗ＩｇＧ Ｆｃ抗体を含むＩｇＡ腎症または紫斑病の診断キット。
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Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009147999A1 (ja) * | 2008-06-02 | 2009-12-10 | エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 | ＩｇＡ腎症の検査方法及び検査キット |
| JP2013513086A (ja) * | 2009-09-18 | 2013-04-18 | アスチュート メディカル，インコーポレイテッド | 腎損傷および腎不全の診断および予後診断のための方法ならびに組成物 |
| WO2013172347A1 (ja) * | 2012-05-14 | 2013-11-21 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | IgA凝集体の検出方法およびIgA腎症の検査方法 |
| JP2013246127A (ja) * | 2012-05-29 | 2013-12-09 | Juntendo | ＩｇＡ腎症診断法 |
| JP2017125720A (ja) * | 2016-01-13 | 2017-07-20 | 学校法人順天堂 | 腎炎の鑑別方法 |
| WO2019098328A1 (ja) * | 2017-11-17 | 2019-05-23 | 学校法人帝京大学 | ＩｇＡ腎症診断用キット |
| TWI829189B (zh) * | 2022-06-08 | 2024-01-11 | 國防醫學院 | 一種抗人源缺陷IgA1之自體抗體及其製備方法和用途 |
-
2005
- 2005-12-09 JP JP2005356082A patent/JP2007163151A/ja active Pending
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