WO2009147999A1 - ＩｇＡ腎症の検査方法及び検査キット - Google Patents

ＩｇＡ腎症の検査方法及び検査キット Download PDF

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WO2009147999A1
WO2009147999A1 PCT/JP2009/059873 JP2009059873W WO2009147999A1 WO 2009147999 A1 WO2009147999 A1 WO 2009147999A1 JP 2009059873 W JP2009059873 W JP 2009059873W WO 2009147999 A1 WO2009147999 A1 WO 2009147999A1
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complex
human
iga
urine
renal disease
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PCT/JP2009/059873
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隆 小原
貞明 溝口
修 堀田
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エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/34—Genitourinary disorders
    • G01N2800/347—Renal failures; Glomerular diseases; Tubulointerstitial diseases, e.g. nephritic syndrome, glomerulonephritis; Renovascular diseases, e.g. renal artery occlusion, nephropathy

Definitions

  • the present invention relates to a test method and test kit for IgA nephropathy.
  • IgA nephropathy is a disease described by Berger et al. In 1968, and is the most common renal disease in chronic glomerulonephritis excluding diabetic nephropathy (for example, see Non-patent Document 1). IgA nephropathy is a disease with a poor long-term prognosis, and it is estimated that about 25% of end-stage renal failure patients requiring dialysis treatment are caused by IgA nephropathy. Conventionally, there is no treatment that can cure even though there is a treatment that delays the progression of IgA nephropathy. However, in recent years, a treatment method has been established by Horita et al. In which complete remission can be obtained if treatment is started early.
  • the diagnostic method for IgA nephropathy according to the “Joint Committee of the Ministry of Health and Welfare Specific Disease Progressive Nephropathy Research and Study Group and the Japanese Society of Nephrology,” urinalysis (continuous microscopic hematuria, continuous or intermittent proteinuria, Hematuria) and blood tests (serum IgA level of 350 mg / dl or more) are the auxiliary diagnostic criteria, and the definitive diagnosis is to prove the deposition of IgA in the glomerular mesangial region by renal biopsy .
  • a renal biopsy requires hospitalization for about one week and is a dangerous examination method with a lot of bleeding, so the consultation rate is not necessarily high.
  • An object of the present invention is to provide an IgA nephropathy test method and test kit that have good detection sensitivity and specificity, and that can be easily and safely determined as IgA nephropathy.
  • the present inventors prepared an antibody specific for an antigen derived from human kidney mesangial cells, and used the antibody to determine the amount of a complex of an antigen derived from human kidney mesangial cells and IgA in human urine. As a result of the measurement, the present inventors found that the complex is present at a higher concentration in IgA nephropathy patients than in healthy people and patients with kidney diseases other than IgA nephropathy, and completed the present invention.
  • a first aspect of the present invention is an IgA nephropathy test method including a complex detection step of detecting a complex of an antigen derived from human kidney mesangial cells and human IgA from a sample derived from urine of a subject.
  • the complex detection step preferably includes contacting the sample with an antibody against an antigen derived from human kidney mesangial cells and an antibody against human IgA.
  • the method further includes a step of obtaining a ratio of the detected amount of the complex detected in the complex detection step to a urine protein amount in a sample derived from the urine of the subject, and based on the ratio, IgA nephropathy It is more preferable to further include a determination step for determining that.
  • the second aspect of the present invention is a renal disease test method including a complex detection step of detecting a complex of an antigen derived from human kidney mesangial cells and human IgA from a sample derived from urine of a subject.
  • the complex detection step includes contacting the sample with an antibody against an antigen derived from human kidney mesangial cells and an antibody against human IgA. Based on the detected amount of the complex, More preferably, the method further includes a step of determining.
  • a complex detection step of detecting a complex of an antigen derived from human renal mesangial cells and human IgA from a sample derived from urine of a subject detects the complex.
  • a first determination step of determining a renal disease based on the detected amount of the complex or the amount of urine protein in the sample, and the complex detected in the complex detection step with respect to the amount of urine protein in the sample And a second determination step of determining the renal disease as IgA nephropathy based on a ratio of the detected amount of the body.
  • the complex detection step in the test method of the present invention is preferably an immunochemical method using an antibody against an antigen derived from human kidney mesangial cells and an antibody against human IgA, more preferably a sandwich method. .
  • an antigen derived from human kidney mesangial cells comprising a step of contacting a sample derived from urine of a subject with an antibody against an antigen derived from human kidney mesangial cells and an antibody against human IgA.
  • This is a method for detecting a complex with human IgA.
  • the complex is preferably detected by an immunochemical method using an antibody against an antigen derived from the human kidney mesangial cells and an antibody against human IgA, and more preferably detected by a sandwich method.
  • the subject is preferably a human who has developed renal disease, a human who is suspected of developing renal disease, or a human who has the possibility of developing renal disease. Is more preferably IgA nephropathy.
  • the fifth aspect of the present invention is a renal disease test kit comprising at least an antibody against an antigen derived from human kidney mesangial cells and an antibody against human IgA.
  • the renal disease is preferably IgA nephropathy.
  • an IgA nephropathy test method and test kit that have good detection sensitivity and specificity, and that can be easily and safely determined as IgA nephropathy.
  • FIG. 3 is a distribution diagram of measured values obtained by detecting an IgA-6C4 recognition antigen complex in urine by an ELISA method. It is a figure which shows the result of the ROC analysis about the measured value which detected the IgA-6C4 recognition antigen complex in urine by ELISA method.
  • FIG. 6 is a distribution diagram of values obtained by correcting measured values obtained by detecting an IgA-6C4 recognition antigen complex in urine by an ELISA method per urine protein concentration. It is a figure which shows the result of having performed the ROC analysis about the value which correct
  • FIG. 6 is a distribution diagram of measured values obtained by detecting an IgA-4H3 recognition antigen complex in urine by an ELISA method. It is a figure which shows the result of the ROC analysis about the measured value which detected the IgA-4H3 recognition antigen complex in urine by ELISA method.
  • FIG. 5 is a distribution diagram of values obtained by correcting measured values obtained by detecting an IgA-4H3-recognizing antigen complex in urine by an ELISA method per urine protein concentration. It is a figure which shows the result of the ROC analysis about the value which correct
  • the test method for renal disease of the present invention includes a complex detection step of detecting a complex of an antigen derived from human kidney mesangial cells and human IgA from a sample derived from urine of a subject. By detecting the complex from a sample derived from urine, it is possible to detect renal disease in a subject with good detection sensitivity and good specificity.
  • the renal diseases include IgA nephropathy and kidney diseases other than IgA nephropathy.
  • the sample may be urine itself collected from a subject, or may be one obtained by subjecting the collected urine to a treatment such as dilution or concentration that is usually performed.
  • a urine sample obtained by diluting urine collected from a human by a conventional method is preferable.
  • the sample derived from the urine of the subject may be obtained by contacting the urine sample with an antibody against an antigen derived from human kidney mesangial cells or an antibody against human IgA.
  • the antigen derived from human renal mesangial cells in the present invention is an antigen present in human renal mesangial cultured cells, mesangial cells isolated from human kidneys, and cell extracts extracted from these, and is complexed with IgA.
  • the antigen is not particularly limited as long as it is an antigen that can be formed in the urine of a subject having kidney disease. Among them, from the viewpoint of detection specificity of kidney disease and IgA nephropathy, it is preferable that the antigen is distinguishable from antigens derived from cells constituting the glomerulus other than human kidney mesangial cells. It is more preferable that the antigen is distinguishable from the antigen derived from.
  • the cell extract is not particularly limited as long as it is extracted from human kidney mesangial cultured cells or mesangial cells isolated from human kidney, but from the viewpoint of detection specificity of kidney disease and IgA nephropathy, It is preferable that it is a skeleton component extract.
  • the cell extract can be prepared by a usual method. Examples thereof include a method using a ProteoExtract Subcellular Proteome Extraction Kit (manufactured by Calbiochem).
  • the method for detecting the complex is not particularly limited, and a commonly used protein detection method can be applied. However, a method capable of quantifying or semi-quantifying the complex detected is preferable.
  • the apparatus used for detecting the complex is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the complex detection method.
  • HPLC equipment mass spectrometry equipment (mass spectrometry), electrophoresis equipment (capillary electrophoresis apparatus, etc.), fully automatic or semiautomatic enzyme immunoassay equipment, cell washer, fully automatic or semiautomatic chemiluminescence immunoassay equipment
  • Luminescence measuring device fully automatic or semi-automatic electrochemiluminescence immunoassay device, optical measuring device, plate reader, CCD camera, fully automatic or semi-automatic fluorescence immunoassay device, fluorescence measuring device, fully automatic or semi-automatic radioimmunoassay device, liquid scintillation A counter, a coulter counter, a surface plasmon measuring device, a blotting device, a densitometer, etc.
  • Luminescence measuring device fully automatic or semi-automatic electrochemiluminescence immunoassay device
  • optical measuring device plate reader, CCD camera
  • an immunochemical method using an antibody that binds to the complex is preferable from the viewpoints of detection sensitivity, specificity, and convenience.
  • the “antibody against the complex” is used in the meaning normally used in antibodies such as “an antibody recognizing the complex” and “an antibody that binds to the complex”. That is, the “antibody against the complex” binds to at least a part of a complex composed of an antigen derived from human kidney mesangial cells and human IgA to form a new complex.
  • an antibody against an antigen derived from human kidney mesangial cells “an antibody against human IgA”, and the like.
  • a conventionally performed method can be used without particular limitation.
  • enzyme immunoassay ELISA
  • chemiluminescence immunoassay chemiluminescence immunoassay
  • electrochemiluminescence immunoassay absorbance measurement
  • fluorescent antibody method e.g., FITC
  • RIA radioimmunoassay
  • surface plasmon resonance e.g., western blotting
  • western blotting e.g., western blotting
  • ELISA enzyme immunoassay
  • an antibody that recognizes and binds to an antigen derived from human renal mesangial cells in the complex and IgA in the complex are recognized.
  • a sandwich method using a binding antibody is preferable.
  • the sandwich method can be performed, for example, as follows.
  • An antibody (primary antibody) that binds to the complex is immobilized on a carrier such as a plate.
  • a blocking operation is performed with a protein such as casein or a surfactant to block non-specific binding sites such as plates.
  • a sample derived from urine or a test sample is added and incubated.
  • a secondary antibody labeled with an antibody that binds to the complex can be added, and after incubation, the plate or the like can be washed to detect the label.
  • an antibody against an antigen derived from human kidney mesangial cells is used as one of the secondary antibodies, and an antibody against human IgA is used as the other antibody, and the antigen derived from human renal mesangial cells is preferred as the primary antibody. More preferably, an antibody against human IgA is used as the secondary antibody.
  • the antibody that binds to the complex may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, but is preferably a monoclonal antibody from the viewpoint of renal disease detection specificity.
  • the antibody that binds to the complex can be prepared by a conventional method.
  • a polyclonal antibody against an antigen derived from human renal mesangial cells can be obtained by a normal production method, for example, as follows. Serum is obtained by immunizing animals such as rabbits and goats with cultured human mesangial cells, mesangial cells isolated from human kidneys, or extracts thereof. This can be prepared, for example, by purifying with ammonium sulfate precipitation, protein A, protein G column, DEAE ion exchange chromatography, affinity column coupled with human kidney mesangial cell extract, and the like.
  • an antibody having a higher specificity for an antigen derived from human kidney mesangial cells that has been removed by an antibody that binds to an antigen other than an antigen derived from human kidney mesangial cells, for example, by an absorption operation or the like. It is preferable.
  • human kidney mesangial cultured cells, mesangial cells isolated from human kidney, or an extract thereof are immunized to a small animal such as a mouse, The spleen is removed, and the cells are separated by grinding and fused with mouse myeloma cells using a reagent such as polyethylene glycol. From the fusion cells (hybridomas) formed thereby, antigens derived from human kidney mesangial cells and A clone producing an antibody that binds is selected.
  • the selected hybridoma is transplanted into the abdominal cavity of the mouse, and ascites is collected from the mouse, and the obtained monoclonal antibody is obtained by, for example, ammonium sulfate precipitation, protein A, protein G column, DEAE ion exchange chromatography, human kidney mesangial cell
  • the extract can be prepared by purification using an affinity column coupled with the extract.
  • a clone that produces a monoclonal antibody that binds to an antigen derived from human kidney mesangial cells it is preferable to select a clone that is highly reactive to an antigen derived from human kidney mesangial cells. In addition to this, it is preferable to exclude clones that produce antibodies that bind to antigens other than those derived from human kidney mesangial cells.
  • antigens other than antigens derived from human kidney mesangial cells include, for example, antigens derived from cells other than human kidney mesangial cells, which are highly likely to be mixed in urine.
  • the antigen is derived from a lateral tubular epithelial cell.
  • an antibody against an antigen derived from human kidney mesangial cells in the present invention can bind to an antigen derived from human kidney mesangial cells and be mixed in urine from the viewpoint of detection specificity of renal diseases and IgA nephropathy. It is preferably an antibody that does not bind to an antigen derived from cells other than human kidney mesangial cells, and binds to an antigen derived from human kidney mesangial cells, and is a human proximal tubular epithelial cell More preferably, the antibody does not bind to an antigen derived from.
  • the antibody against the antigen derived from human kidney mesangial cells may be any of an antibody derived from a small animal such as a mouse, a chimeric antibody, a humanized antibody and a fully human antibody obtained as described above.
  • the antibody against human IgA is not particularly limited as long as it is an antibody capable of binding to IgA in the complex, and recognizes any of human IgA such as H chain, J chain, and secretory component. May be.
  • the antibody against human IgA may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, but from the viewpoint of detection specificity of the complex, it is preferably a monoclonal antibody against human IgA.
  • the monoclonal antibody against human IgA can be prepared in the same manner as the antibody against the antigen derived from human kidney mesangial cells, using human IgA as an antigen.
  • a commercially available anti-human IgA antibody can also be used as an antibody against human IgA.
  • the antibody against human IgA may be any of an antibody derived from a small animal such as a mouse obtained as described above, a chimeric antibody, a humanized antibody, and a fully human antibody.
  • a known label can be used without particular limitation.
  • an enzyme a chemiluminescent substance, an electrochemiluminescent substance, a radioactive substance, etc.
  • an enzyme it is preferable to use an enzyme as the label from the viewpoint of detection sensitivity and simplicity.
  • the enzyme is not particularly limited as long as it is an enzyme that can be quantified by a physical or chemical method. Examples thereof include enzymes such as alkaline phosphatase, horseradish peroxidase (HRP), and luciferase.
  • the label detection method is not particularly limited as long as the label can be quantified or semi-quantified, and can be appropriately selected depending on the label. For example, absorbance, emission intensity, fluorescence intensity, radiation count and the like can be mentioned. By quantifying or semi-quantifying the label, the complex can be quantified or semi-quantified.
  • the measurement apparatus for detecting the complex preferably used in the present invention is bound to the complex.
  • An absorbance measurement apparatus including a light amount measuring unit that receives at least one of reflected light and transmitted light from a sample and measures the received light amount can be given.
  • the light irradiation unit applies light to a dye produced by a label that is bound to a complex of an antigen derived from human renal mesangial cells and a human IgA contained in a specimen (sample derived from the urine of a subject). Irradiation is performed, and the absorbance of the dye is quantified by the light quantity measurement unit, whereby the abundance of the complex of the antigen derived from human kidney mesangial cells and human IgA in the sample can be measured.
  • the detection of the label can be performed by detecting light emission from the specimen instead of the absorbance.
  • a measurement device capable of measuring light emitted from the label itself bound to the complex or the substrate of the label in the reaction solution, on which the sample containing the label is placed
  • a measuring device including a mounting part and a light quantity measuring part that receives light emitted from the sample and measures the received light quantity.
  • light emitted from a sample containing a label bound to a complex of an antigen derived from human renal mesangial cells and a human IgA contained in a specimen is used as the light amount measuring unit.
  • the renal disease test method of the present invention preferably includes a determination step of determining a renal disease based on the detected amount of the complex contained in the sample derived from urine.
  • the detected amount of the complex in the present invention can be used without particular limitation as long as it is a concentration of the complex contained in the sample derived from the urine or a quantitative value or a semi-quantitative value corresponding thereto.
  • a measurement value obtained by directly measuring the detection amount of the complex a measurement value obtained by indirectly measuring the detection amount of the complex through detection of a label, and the like can be given.
  • the amount of the complex used for determining IgA nephropathy is a complex with respect to the total urine protein amount in the sample derived from the urine of the subject. It is preferable that the ratio is the ratio of the detected amounts. The ratio is obtained as a relative value to the total urinary protein amount, even if it is obtained by dividing the measured value of the detected amount of the complex by the measured value of the total urinary protein amount in the sample derived from the urine of the subject. It may be the detected amount of the complex. By determining based on such a ratio, IgA nephropathy can be determined with higher sensitivity and specificity. Note that the sample derived from the urine of the subject for measuring the total urinary protein amount may be a sample different from the sample derived from the urine used for the detection of the complex as long as it is obtained from the same subject. .
  • the determination step in the method for examining renal disease of the present invention comprises the detection amount of a complex of an antigen derived from human kidney mesangial cells and human IgA from a sample derived from urine of a subject, and the urine of a healthy person as a control. Comparing the detected amount of the complex from the sample derived from the complex in the sample derived from the urine of a healthy person whose control is the detected amount of the complex in the sample derived from the urine of the subject It is preferable to include a step of associating a case where the amount is larger than the detected amount of the body with a renal disease.
  • a healthy person as a control means an individual who has been previously known not to develop kidney disease.
  • the detection amount is large because the detection amount of the complex derived from the subject is larger than the normal detection amount (cut-off value) set to distinguish a healthy person from a renal disease patient. is there.
  • the cut-off value is calculated by, for example, calculating the amount of detection of the complex in a sample group derived from urine of a renal disease patient and the amount of detection of the complex in a sample group derived from urine of a healthy body group as a control. It can be set by attaching to analysis or the like.
  • the ROC analysis is, for example, an analysis method capable of evaluating the detection ability and diagnostic ability of a disease inspection method. For example, the Journal of the Japan Society for Clinical Laboratory Automation “Diagnostic Evaluation Utility Manual for Clinical Tests” Ver.1.3 (2004.9 .1), Vol.29 Suppl.1 (Vol. 154) (issued on September 1, 2004).
  • the cut-off value can also be determined as, for example, a value obtained by adding a value obtained by doubling or tripled the standard deviation to the average value of the detection level of a healthy person, and further, sensitivity (detection rate) / specificity ( It is possible to appropriately determine a value that satisfies a low false positive rate) in a well-balanced manner.
  • renal diseases in the present invention include IgA nephropathy (IgAN), membranous nephropathy (MN), lupus nephritis (SLE), focal glomerulosclerosis (FGS), minimal change group nephrotic syndrome (MCNS), Diabetic nephropathy (DMN), amyloidosis, hereditary nephropathy (Alport), burnout IgA nephropathy (natural remission of IgA nephropathy), membranoproliferative glomerulonephritis (MPGN), anti-neutrophil cytoplasmic antibody (ANCA) related nephritis, thin basement membrane syndrome (TBMD), nephrosclerosis and the like.
  • the renal disease test method of the present invention can detect various renal diseases including IgA nephropathy by detecting the complex in urine.
  • the method for examining IgA nephropathy of the present invention includes a complex detection step of detecting a complex of an antigen derived from human kidney mesangial cells and human IgA from a sample derived from urine of a subject, and the complex detection step.
  • a first determination step for determining renal disease based on the detected amount of the detected complex or the amount of urine protein in the sample derived from the urine of the subject; and the amount of urine protein in the sample derived from the urine of the subject And a second determination step of determining the renal disease as IgA nephropathy based on the ratio of the detected amount of the complex detected in the complex detection step.
  • IgA nephropathy Determination of IgA nephropathy based on the ratio of the detected amount of the complex to the total protein amount in a sample derived from urine is highly sensitive and specific, and complete remission can be obtained by therapeutic intervention. Even in the initial stage, IgA nephropathy can be easily and safely determined.
  • the complex detection step in the present invention is the same as the complex detection step in the renal disease test method.
  • a method for detecting the urine protein mass there is no particular limitation as long as the total protein mass in the sample derived from urine can be measured, and the protein detection method in a sample derived from urine that is usually performed can be applied.
  • the method described in Mitsumasa Kanai et al., “Revised Clinical Laboratory Method Summary Version 32nd Edition”, pages 173 to 174, 2005 can be applied.
  • the step of determining a renal disease based on the detected amount of the complex detected in the complex detection step is the same as the determination step in the renal disease test method.
  • the step of determining a renal disease based on the amount of urine protein in the sample derived from urine is more than the normal detection amount (cutoff value) set in order to distinguish a healthy person from a renal disease patient, It is preferable to include a step of associating a case where the amount of urine protein in the sample derived from the urine of the subject is larger with a renal disease.
  • the normal detection amount of the urine protein amount can be set by a normal method.
  • the ratio of the detected amount of the complex in the sample derived from the urine of the subject to the total protein amount in the sample (complex / total protein) and IgA nephropathy as a control Comparing the ratio of the detected amount of the complex in the sample derived from urine of a patient with renal disease other than the total protein amount in the sample with the complex in the sample derived from the urine of the subject
  • the ratio of the detected amount to the total protein amount in the sample is higher than the ratio of the detected amount of the complex in the sample derived from the urine of a renal disease patient other than IgA nephropathy as a control to the total protein amount in the sample.
  • the step of associating the large case with IgA nephropathy is provided.
  • the ratio is large because the detected amount ratio of the complex derived from the subject is larger than the cut-off value set to distinguish IgA nephropathy and kidney diseases other than IgA nephropathy. is there.
  • the cut-off value can be set in the same manner as the cut-off value in the above-described renal disease testing method, but it is preferable to set the cut-off value based on the result of ROC analysis from the viewpoint of detection specificity. .
  • the method for testing IgA nephropathy of the present invention measures the detected amount of the complex and the total protein amount in urine, and determines IgA nephropathy based on the ratio of the detected amount of the complex to the total protein amount. Since it can be detected, it is a simple and safe method for testing IgA nephropathy.
  • the method for detecting a complex of an antigen derived from human kidney mesangial cells and human IgA comprises contacting a sample derived from urine of a subject with an antibody against an antigen derived from human kidney mesangial cells and an antibody against human IgA. Including the step of As a result, a complex of an antigen derived from human kidney mesangial cells and human IgA can be detected with high sensitivity and high specificity.
  • the matters described in the complex detection step in the renal disease test method can be similarly applied to the complex detection method of the present invention.
  • the subject is preferably a human who has developed a renal disease, a human who is suspected of developing a renal disease, or a human who has a possibility of developing a renal disease.
  • the human having the possibility of developing a kidney disease as used herein refers to any human who is neither a human who has developed a renal disease nor a human who is suspected of having a renal disease. More preferably, the renal disease is IgA nephropathy.
  • the renal disease test kit of the present invention comprises at least one antibody against an antigen derived from human kidney mesangial cells and at least one antibody against human IgA.
  • the renal disease test kit of the present invention comprises, in addition to the above-mentioned antibody, a sample derived from urine of a subject, an antibody against an antigen derived from human kidney mesangial cells, and an antibody against human IgA, thereby contacting human kidney mesangial cells It is preferable to further include an instruction manual describing that a complex of an antigen derived from the above and human IgA is detected and associated with the detected amount and renal disease.
  • the test kit for renal disease of the present invention can be preferably used for testing for IgA nephropathy.
  • Example 1 ⁇ Acquisition of monoclonal antibody that recognizes human kidney mesangial cell antigen> Normal human renal mesangial cells (Cryo NHMC: Cambrex) were cultured, and BALB / c mice (female) were immunized using the extracted cells or their cytoskeletal component extraction fraction as an immunogen. After confirming that the antibody titer against the immunogen increased, the spleen cells were fused with P3U-1 cells to prepare hybridomas.
  • the first screening of hybridoma is performed by EIA method in which two kinds of immune antigens (normal human kidney mesangial cells or their cytoskeletal component extraction fraction) are immobilized on a cup of myloplate, and both or any one of the antigens is screened. Hybridomas that exhibited high color values were selected.
  • the cytoskeletal component extraction fraction was prepared using ProteoExtract Subcellular Proteome Extraction Kit (Calbiochem). The selected hybridomas were monocloned by the limiting dilution method, and then 2nd screening was performed to select hybridomas specific for human kidney mesangial cells using these.
  • the ELISA method described later was used, and the reaction was performed using normal human kidney mesangial cells or their cytoskeletal component extraction fraction as a solid phase, and normal human proximal tubular epithelial cells cultured for control ( Cryo RPTEC: Cambrex) or clones that do not react with the solid fraction of the cytoskeletal component extraction fraction were selected.
  • the ELISA method was performed as follows. 4000 cells / 200 ⁇ l of normal human renal mesangial cells and normal human proximal tubular epithelial cells were each injected into a polysoap cup (manufactured by NUNC) and cultured at 37 ° C. overnight. The cup was washed 5 times with PBS (pH 7.2), and then a 0.05% glutaraldehyde solution 100 ⁇ l / well was injected and allowed to react at room temperature for 30 minutes.
  • PBS pH 7.2
  • the cup was washed 5 times with a washing solution (50 mM Tris / HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.01% Tween 20), and then a blocking solution (10% normal rabbit serum (Pel-Freeze), 50 mM Tris / HCl (pH 7. 5), 0.15M NaCl, 10 mM-EDTA-2Na, 0.01% Tween 20, 0.1% NaN 3 ) was injected at 150 ⁇ l / well, and then blocked for 2 hours at room temperature or 1 day at 4 ° C. "Antibody screening cup").
  • a washing solution 50 mM Tris / HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.01% Tween 20
  • a blocking solution 10% normal rabbit serum (Pel-Freeze)
  • 50 mM Tris / HCl pH 7. 5
  • 0.15M NaCl 10 mM-EDTA-2Na
  • Tween 20 0.1% NaN 3
  • the skeletal component extraction fractions of normal human renal mesangial cells and normal human proximal tubular epithelial cells were diluted with 50 mM Tris / HCl (pH 7.5) and 0.15 M NaCl to a concentration of 10 ⁇ g / ml, respectively.
  • 50 ⁇ l / well was injected into a cup (manufactured by NUNC). The cup was placed in a wet box and coated overnight at 4 ° C. The operation after coating was performed in the same manner as the antibody screening cup described above.
  • Each of the four types of antibody screening cups was washed three times with washing solutions (50 mM Tris / HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.01% Tween 20), and 50 ⁇ l / well of hybridoma culture supernatant was injected at room temperature. Reacted for 1 hour.
  • Anti-Mouse IgG1 normal human kidney A clone showing a high color value in either or both of the sangium cells and their cytoskeletal component extraction fraction, and a low color value in both normal human proximal tubular epithelial cells and their cytoskeletal component extraction fraction Selected.
  • All five purified monoclonal antibodies (4H3-1D12-1D2, 4H3-2E7-1D2, 6C4-6A8-1B4, 14E11-2G7-1B2, 11A11-2F9-1G3) are normal human mesangial cells or cytoskeletal components on the solid phase High chromogenic value for the extracted fraction, and low chromogenic value for normal human proximal tubule epithelial cells for control (CryoTECRPTEC: Cambrex) or its cytoskeletal component extract fraction in solid phase It was.
  • the skeletal component extraction fraction of normal human kidney mesangial cells was subjected to SDS-PAGE and blotted on a nitrocellulose filter (Schleicher & Schuell, BA85).
  • the filter is immersed in a blocking solution (50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5% skim milk, 0.01% Tween 20, 0.1% NaN 3 ), shaken at 4 ° C. overnight, and then the blocking solution is added.
  • the culture supernatant of each obtained monoclonal antibody clone was added, shaken at room temperature for 2 hours, and washed 3 times with a washing solution.
  • the secondary antibody HRP-labeled anti-mouse IgG (Zymed Laboratories, Inc.) was added to the washing solution at a 1/1000 concentration, shaken at room temperature for 1 hour, washed 3 times with the washing solution, and then the coloring solution (8.3 mM). Color was developed by adding Tris-HCl (pH 6.5), 125 mM NaCl, 0.05% 4-Chloro-1-Naphtol, 0.01% H 2 O 2 ).
  • Clones 4H3 and 6C4 reacted with components of different molecular weights in the skeletal component extraction fraction of human kidney mesangial cells. Clones 4H3 and 6C4 are thought to recognize different antigens of human kidney mesangial cells.
  • 6C4 Purified antibody purified by purifying 6C4-6A8-1B4 antibody
  • PROSEP-A MILLIPORE
  • the cup was placed in a wet box and coated overnight at 4 ° C. After coating, it was washed 3 times with a washing solution (50 mM Tris / HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.01% Tween 20), and a blocking solution (50% N102 (manufactured by NOF Corporation), 25 mM Tris / HCl (pH 7. 5), 75 mM NaCl, 2% Block Ace (manufactured by Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) was injected at 150 ⁇ l / well, and then blocked for 2 hours at room temperature or 1 day at 4 ° C. (hereinafter referred to as “6C4 coat cup”).
  • a washing solution 50 mM Tris / HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.01% Tween 20
  • a blocking solution 50% N102 (manufactured by NOF Corporation), 25 mM Tris / HCl
  • the 6C4 coat cup was washed three times with a washing solution (50 mM Tris / HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.01% Tween 20), and a sample diluent (50% N102 (manufactured by NOF Corporation), 50 mM Tris / HCl ( A urine sample diluted 50-fold with pH 7.5), 150 mM NaCl, 2% Block Ace (Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.)) was injected at 50 ⁇ l / well and reacted at room temperature for 1 hour.
  • a washing solution 50 mM Tris / HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.01% Tween 20
  • a sample diluent 50% N102 (manufactured by NOF Corporation)
  • 50 mM Tris / HCl A urine sample diluted 50-fold with pH 7.5
  • 150 mM NaCl, 2% Block Ace
  • HRP-GOAT Anti-Human IgA (Zymed) diluted 3 times with washing solution (50 mM Tris / HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.01% Tween 20) and diluted 3000 times with Can Get Signal 2 (manufactured by TOYOBO) 50 ⁇ l / well was injected and reacted at room temperature for 1 hour. After washing with the washing solution three times, 100 ⁇ l / well of 3,3 ′, 5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for ELISA (manufactured by SIGMA) was injected and reacted at room temperature for 30 minutes.
  • washing solution 50 mM Tris / HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.01% Tween 20
  • Can Get Signal 2 (manufactured by TOYOBO) 50 ⁇ l / well was injected and reacted at room temperature for 1 hour. After washing with the
  • FIG. 1 shows the results of measurement on 146 renal disease patients including 95 IgA nephropathy patients and 28 healthy persons (healthy persons).
  • ROC analysis was performed on 83 IgA nephropathy patients and 48 renal disease patients other than IgA nephropathy, and the ROC curve shown in FIG. 4 was obtained.
  • the cut-off value obtained from the ROC curve was 4509.
  • Table 2 shows the results of determining the positive rates of 83 IgA nephropathy patients and 48 patients with kidney diseases other than IgA nephropathy from the cut-off values. From Table 2, 61 cases (73.5%) positive among 83 patients with IgA nephropathy and 10 cases (20.8%) positive among 48 patients with kidney diseases other than IgA nephropathy, both of which can be distinguished significantly I understand. The sensitivity at that time was 73.5%, the specificity was 79.2%, and the diagnostic efficiency was 75.6%.
  • Example 2 ⁇ Detection of kidney disease> -Detection of IgA-4H3-recognizing antigen complex by ELISA method- After purifying 4H3-1D12-1D2 antibody (hereinafter referred to as “4H3”) with PROSEP-A (MILLIPORE), dialyzed with 50 mM Tris / HCl (pH 7.5) and 0.15 M NaCl, 5 ⁇ g / ml After dilution with 50 mM Tris / HCl (pH 7.5) and 0.15 M NaCl to a concentration of ⁇ 10 ⁇ g / ml, 50 ⁇ l / well was injected into a polysoap cup (manufactured by NUNC).
  • 4H3 4H3-1D12-1D2 antibody
  • MILLIPORE PROSEP-A
  • the cup was placed in a wet box and coated overnight at 4 ° C. After coating, it was washed three times with a washing solution (50 mM Tris / HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.01% Tween 20), and a blocking solution (50% N102 (manufactured by NOF Corporation), 25 mM Tris / HCl (pH 7. 5), 75 mM NaCl, 2% Block Ace (manufactured by Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) was injected at 150 ⁇ l / well, and then blocked for 2 hours at room temperature or 1 day at 4 ° C. (hereinafter referred to as “4H3 coat cup”).
  • a washing solution 50 mM Tris / HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.01% Tween 20
  • a blocking solution 50% N102 (manufactured by NOF Corporation), 25 mM Tris / HCl
  • the 4H3 coated cup was washed 3 times with a washing solution (50 mM Tris / HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.01% Tween 20), and a sample dilution solution (50% N102 (manufactured by NOF Corporation), 50 mM Tris / HCl ( 50 ⁇ l / well of a urine specimen diluted 50-fold with pH 7.5), 150 mM NaCl, 2% Block Ace (manufactured by Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) was reacted at room temperature for 1 hour.
  • a washing solution 50 mM Tris / HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.01% Tween 20
  • a sample dilution solution 50% N102 (manufactured by NOF Corporation)
  • 50 mM Tris / HCl 50 ⁇ l / well of a urine specimen diluted 50-fold with pH 7.5
  • HRP-GOAT Anti-Human IgA (Zymed) diluted 3 times with washing solution (50 mM Tris / HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.01% Tween 20) and diluted 3000 times with Can Get Signal 2 (manufactured by TOYOBO) 50 ⁇ l / well was injected and reacted at room temperature for 1 hour. After washing with the washing solution three times, 100 ⁇ l / well of 3,3 ′, 5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for ELISA (manufactured by SIGMA) was injected and reacted at room temperature for 30 minutes.
  • washing solution 50 mM Tris / HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.01% Tween 20
  • Can Get Signal 2 (manufactured by TOYOBO) 50 ⁇ l / well was injected and reacted at room temperature for 1 hour. After washing with the
  • FIG. 5 shows the results of measurements on 149 patients with renal disease including 95 patients with IgA nephropathy and 28 patients with healthy subjects.
  • FIG. 7 shows the result of calculating the complex detection amount per protein amount in urine by dividing the detected amount of IgA-4H3 recognition antigen complex detected above (value shown in FIG. 5) by the protein concentration in urine. It was shown to. From FIG. 7, it can be seen that 92 patients with IgA nephropathy and 54 patients with kidney disease other than IgA nephropathy can be significantly distinguished.
  • ROC analysis was performed on 92 IgA nephropathy patients and 54 renal disease patients other than IgA nephropathy, and the ROC curve shown in FIG. 8 was obtained.
  • the cut-off value obtained from the ROC curve was 15.07.
  • Table 4 shows the results of determining the positive rates of 92 IgA nephropathy patients and 54 patients with renal diseases other than IgA nephropathy from the cut-off values.
  • Table 4 shows that 71 out of 92 patients with IgA nephropathy (77.2%) and 14 out of 48 patients with kidney disease other than IgA nephropathy (25.9%) can be distinguished significantly. It was.
  • the sensitivity at that time was 77.2%, the specificity was 74.1%, and the diagnostic efficiency was 76.0%.
  • a healthy person and a nephropathy patient can be distinguished by detecting a complex of human IgA present in urine and an antigen derived from human renal mesangial cells. It can also be seen that IgA nephropathy and other renal diseases can be distinguished by measuring the detection amount per urine protein concentration of a complex of human IgA present in urine and an antigen derived from human kidney mesangial cells.

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Abstract

　被験者の尿に由来する試料から、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原とヒトＩｇＡとの複合体を検出する複合体検出工程を含む腎疾患の検査方法である。本発明の腎疾患の検査方法は、前記試料中の尿蛋白質量に対する前記複合体検出工程で検出された前記複合体の検出量の比率に基づいて、前記腎疾患をＩｇＡ腎症と判定する判定工程をさらに含むことが好ましい。本発明の腎疾患の検査方法は、検出感度及び特異性が良好で、簡便かつ安全に腎疾患（好ましくは、ＩｇＡ腎症）と判定することができる。

Description

ＩｇＡ腎症の検査方法及び検査キット
　本発明は、ＩｇＡ腎症の検査方法及び検査キットに関する。
　ＩｇＡ腎症は１９６８年Bergerらによって記載された疾患であり、糖尿病性腎症を除く慢性糸球体腎炎の中で最も頻度の高い腎疾患である（例えば、非特許文献１参照）。ＩｇＡ腎症は長期予後不良の疾患であり、透析治療を必要とする末期腎不全患者の約２５％がＩｇＡ腎症を起因疾患とするものと推定されている。従来、ＩｇＡ腎症の進行を遅延させる治療法はあっても治癒させる治療法はなかった。しかし、近年堀田らにより早期に治療を開始すれば完全寛解が得られる治療法が確立されてきた。
　一方、ＩｇＡ腎症の診断方法は「厚生省特定疾患進行性腎障害調査研究班と日本腎臓学会の共同委員会」によると、尿検査（持続的顕微鏡的血尿、持続的または間欠的蛋白尿、肉眼的血尿）、血液検査（血清ＩｇＡ値が３５０ｍｇ/ｄｌ以上）を補助的診断基準とし、確定診断は腎生検によって腎糸球体メサンギウム領域へのＩｇＡの沈着を証明することを唯一の方法としている。しかし、腎生検は１週間程度の入院を必要とし、出血の多い危険な検査方法であるため、受診率は必ずしも高いとは言えない。早期のＩｇＡ腎症を簡便かつ安全な方法で診断できる検査方法が求められているのが現状である。
　また、ＩｇＡ腎症の診断方法としてＩｇＡ－フィブロネクチン複合体を用いる方法等が知られているが（例えば、特開２０００－２４１４３１号公報、特許２５９２１２１号公報、Cederholm et al., Proc.Natl.Acad.Sci., 85:4865-8, 1988参照）、これまで実用化された方法は無かった。
　本発明の課題は、検出感度と特異性とが良好で、簡便かつ安全にＩｇＡ腎症と判定することができるＩｇＡ腎症の検査方法及び検査キットを提供することである。
　本発明者らは、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に特異的な抗体を作製し、その抗体を用いてヒト尿中のヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原とＩｇＡとの複合体の検出量を測定したところ、健康人やＩｇＡ腎症以外の腎疾患患者に比べＩｇＡ腎症患者において、前記複合体がより高い濃度で存在することを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、前記課題を解決するための具体的手段は以下の通りである。
　本発明の第１の態様は、被験者の尿に由来する試料から、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原とヒトＩｇＡとの複合体を検出する複合体検出工程を含むＩｇＡ腎症の検査方法である。前記複合体検出工程は、前記試料と、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に対する抗体及びヒトＩｇＡに対する抗体とを接触させることを含むことが好ましい。また前記複合体検出工程で検出された複合体の検出量の、被験者の尿に由来する試料中の尿蛋白質量に対する比率を得る工程をさらに含むことが好ましく、前記比率に基づいて、ＩｇＡ腎症と判定する判定工程をさらに含むことがより好ましい。
　本発明の第２の態様は、被験者の尿に由来する試料から、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原とヒトＩｇＡとの複合体を検出する複合体検出工程を含む腎疾患の検査方法である。前記複合体検出工程は、前記試料と、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に対する抗体及びヒトＩｇＡに対する抗体とを接触させることを含むことが好ましく、前記複合体の検出量に基づいて、腎疾患と判定する工程をさらに含むことがより好ましい。
　本発明の第３の態様は、被験者の尿に由来する試料から、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原とヒトＩｇＡとの複合体を検出する複合体検出工程と、前記複合体検出工程で検出された前記複合体の検出量、あるいは前記試料中の尿蛋白質量に基づいて腎疾患と判定する第１の判定工程と、前記試料中の尿蛋白質量に対する前記複合体検出工程で検出された前記複合体の検出量の比率に基づいて、前記腎疾患をＩｇＡ腎症と判定する第２の判定工程と、を含むＩｇＡ腎症の検査方法である。
　本発明の検査方法における前記複合体検出工程は、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に対する抗体と、ヒトＩｇＡに対する抗体とを用いる免疫化学的方法であることが好ましく、サンドイッチ法であることがより好ましい。
　本発明の第４の態様は、被験者の尿に由来する試料と、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に対する抗体及びヒトＩｇＡに対する抗体とを接触させる工程を含む、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原とヒトＩｇＡとの複合体の検出方法である。前記複合体は、前記ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に対する抗体と、ヒトＩｇＡに対する抗体とを用いて免疫化学的方法で検出されることが好ましく、サンドイッチ法で検出されることがより好ましい。
　また前記被験者は、腎疾患を発症しているヒト、腎疾患を発症していると疑われるヒト、または、腎疾患を発症する可能性を有しているヒトであることが好ましく、前記腎疾患は、ＩｇＡ腎症であることがより好ましい。
　本発明の第５の態様は、少なくとも、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に対する抗体と、ヒトＩｇＡに対する抗体とを含む腎疾患の検査キットである。前記腎疾患は、ＩｇＡ腎症であることが好ましい。
　本発明によれば、検出感度と特異性とが良好で、簡便かつ安全にＩｇＡ腎症と判定することができるＩｇＡ腎症の検査方法及び検査キットを提供することができる。
尿中のＩｇＡ－６Ｃ４認識抗原複合体をＥＬＩＳＡ法で検出した測定値の分布図である。 尿中のＩｇＡ－６Ｃ４認識抗原複合体をＥＬＩＳＡ法で検出した測定値についてのＲＯＣ解析の結果を示す図である。 尿中のＩｇＡ－６Ｃ４認識抗原複合体をＥＬＩＳＡ法で検出した測定値を尿蛋白濃度当りに補正した値の分布図である。 尿中のＩｇＡ－６Ｃ４認識抗原複合体をＥＬＩＳＡ法で検出した測定値を尿蛋白濃度当りに補正した値についてのＲＯＣ解析をした結果を示す図である。 尿中のＩｇＡ－４Ｈ３認識抗原複合体をＥＬＩＳＡ法で検出した測定値の分布図である。 尿中のＩｇＡ－４Ｈ３認識抗原複合体をＥＬＩＳＡ法で検出した測定値についてのＲＯＣ解析の結果を示す図である。 尿中のＩｇＡ－４Ｈ３認識抗原複合体をＥＬＩＳＡ法で検出した測定値を尿蛋白濃度当りに補正した値の分布図である。 尿中のＩｇＡ－４Ｈ３認識抗原複合体をＥＬＩＳＡ法で検出した測定値を尿蛋白濃度当りに補正した値についてのＲＯＣ解析の結果を示す図である。
　以下、本発明の実施の形態を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
　本発明の腎疾患の検査方法は、被験者の尿に由来する試料から、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原とヒトＩｇＡとの複合体を検出する複合体検出工程を含むものである。前記複合体を尿に由来する試料から検出することによって、被験者における腎疾患を良好な検出感度と良好な特異性で検出することができる。尚、前記腎疾患は、ＩｇＡ腎症とＩｇＡ腎症以外の腎疾患とを含むものである。
　本発明において、前記試料とは、被験者から採取した尿自体であっても、採取した尿に通常行われる稀釈、濃縮等の処理を行ったものであってもよい。本発明においては、ヒトから採取した尿を常法により稀釈した尿試料であることが好ましい。
　さらに前記被験者の尿に由来する試料は、前記尿試料をヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に対する抗体、またはヒトＩｇＡに対する抗体と接触させて得られるものであってもよい。
　また、本発明におけるヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原とは、ヒト腎メサンギウム培養細胞、ヒト腎から分離したメサンギウム細胞及びこれらから抽出された細胞抽出物に存在する抗原であって、ＩｇＡと複合体を形成可能であり、腎疾患を有する被験者の尿中に存在する抗原であれば特に制限はない。中でも、腎疾患及びＩｇＡ腎症の検出特異性の観点から、ヒト腎メサンギウム細胞以外の糸球体を構成する細胞に由来する抗原と識別可能な抗原であることが好ましく、ヒト近位尿細管上皮細胞に由来する抗原と識別可能な抗原であることがより好ましい。
　また前記細胞抽出物は、ヒト腎メサンギウム培養細胞、又はヒト腎から分離したメサンギウム細胞から抽出されたものであれば特に制限はないが、腎疾患及びＩｇＡ腎症の検出特異性の観点から、細胞の骨格成分抽出物であることが好ましい。
　前記細胞抽出物は、通常の方法で調製することができる。例えば、ProteoExtract Subcellular Proteome Extraction Kit(Calbiochem社製)を用いる方法等を挙げることができる。
　前記複合体の検出方法については特に制限はなく、通常用いられる蛋白質の検出方法を適用することができるが、検出される複合体を定量又は半定量可能な方法であることが好ましい。
　本発明において複合体の検出に用いる装置には特に制限はなく、複合体の検出方法に応じて適宜選択することができる。具体的には例えば、ＨＰＬＣ機器、質量分析機器（マススペクトロメトリー）、電気泳動機器（キャピラリー電気泳動装置等）、全自動あるいは半自動酵素免疫測定機器、セルウォッシャー、全自動あるいは半自動化学発光免疫測定機器、発光測定装置、全自動あるいは半自動電気化学発光免疫測定機器、光学測定装置、プレートリーダー、ＣＣＤカメラ、全自動あるいは半自動蛍光免疫測定機器、蛍光測定装置、全自動あるいは半自動放射免疫測定機器、液体シンチレーションカウンター、クールターカウンター、表面プラズモン測定装置、ブロッティング装置、デンシトメーター等を挙げることができる。
　本発明においては、検出感度、特異性及び簡便性の観点から、前記複合体に対する結合する抗体を用いる免疫化学的方法であることが好ましい。本明細書において「複合体に対する抗体」とは、「複合体を認識する抗体」、「複合体に結合する抗体」等の抗体において通常用いられる意味で用いられるものである。すなわち、前記「複合体に対する抗体」は、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原及びヒトＩｇＡからなる複合体の少なくとも一部と結合し、新たな複合体を形成する。以下、「ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に対する抗体」、「ヒトＩｇＡに対する抗体」等についても同様である。
　本発明における免疫化学的方法としては、通常行われる方法を特に制限なく用いることができる。具体的には例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、化学発光免疫測定法、電気化学発光免疫測定法、吸光度測定、蛍光抗体法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、表面プラズモン共鳴、ウェスタンブロット法、ドットブロット法等を挙げることができる。本発明においては、検出感度、特異性及び簡便性の観点から、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いることが好ましい。
　本発明における免疫化学的方法としては、特異性と簡便性の観点から、前記複合体中のヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原を認識して結合する抗体と前記複合体中のＩｇＡを認識して結合する抗体とを用いるサンドイッチ法であることが好ましい。
　前記サンドイッチ法は、例えば、以下のようにして行うことができる。前記複合体と結合する抗体（一次抗体）を、プレート等の担体に固相化する。通常プレート等の非特異的な結合部位をふさぐため、カゼイン等蛋白質あるいは界面活性剤でブロッキング操作を行なう。次いで尿に由来する試料または被検試料を添加してインキュベーションする。プレート等を洗浄した後、前記複合体と結合する抗体であって標識された二次抗体を添加し、インキュベーション後、プレート等を洗浄し、標識を検出する方法で行うことができる。
　本発明においては、検出感度と特異性の観点から、前記一次抗体及び前記二次抗体として、前記複合体に結合する抗体から選ばれる２種の抗体を用いることが好ましく、前記一次抗体及び前記二次抗体のうち一方の抗体としてヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に対する抗体を用い、他方の抗体としてヒトＩｇＡに対する抗体を用いることが、より好ましく、前記一次抗体として、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に対する抗体を用い、前記二次抗体としてヒトＩｇＡに対する抗体を用いることがさらに好ましい。
　本発明において、前記複合体に結合する抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいが、腎疾患の検出特異性の観点から、モノクローナル抗体であることが好ましい。
　前記複合体に結合する抗体は、通常行われる方法によって調製することができる。
　ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に対するポリクローナル抗体は、通常の作製方法に得ることができ、例えば、次のようにして得ることができる。ヒト腎メサンギウム培養細胞、ヒト腎から分離したメサンギウム細胞、又はその抽出物をウサギ、ヤギ等の動物に免疫して血清を得る。これを例えば、硫安沈殿、プロテインＡ、プロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、ヒト腎メサンギウム細胞の抽出物をカップリングしたアフィニティカラム等により精製することで調製できる。
　本発明においては、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原以外の抗原に結合する抗体を通常行われる方法、例えば吸収操作等によって除いたヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に対する特異性がより高い抗体であることが好ましい。
　また例えば、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に対するモノクローナル抗体であれば、ヒト腎メサンギウム培養細胞、ヒト腎から分離したメサンギウム細胞、又はその抽出物を、マウスなどの小動物に免疫を行い、同マウスより脾臓を摘出し、これをすりつぶして細胞を分離し、マウスミエローマ細胞とポリエチレングリコールなどの試薬により融合させ、これにより形成された融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原と結合する抗体を産生するクローンを選択する。次いで選択したハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインＡ、プロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、ヒト腎メサンギウム細胞の抽出物をカップリングしたアフィニティカラム等により精製することで調製できる。
　前記ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に結合するモノクローナル抗体を産生するクローンの選択においては、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に反応性の高いクローンを選択することが好ましい。またこれに加えて、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原以外の抗原にも結合する抗体を産生するクローンを除外することが好ましい。前記ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原以外の抗原としては、例えば、尿中に混入する可能性の高い細胞であって、ヒト腎メサンギウム細胞以外の細胞に由来する抗原を挙げることができ、ヒト近位尿細管上皮細胞に由来する抗原であることが好ましい。
　本発明におけるヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に対する抗体としては、腎疾患及びＩｇＡ腎症の検出特異性の観点から、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に結合し、かつ、尿中に混入する可能性の高い細胞であってヒト腎メサンギウム細胞以外の細胞に由来する抗原には結合しない抗体であることが好ましく、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に結合し、かつ、ヒト近位尿細管上皮細胞に由来する抗原には結合しない抗体であることがより好ましい。
　尚、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に対する抗体は、上記のようにして得られるマウス等の小動物に由来する抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、および完全ヒト抗体等のいずれであってもよい。
　ヒトＩｇＡに対する抗体としては、前記複合体中のＩｇＡと結合可能な抗体であれば特に制限はなく、ヒトＩｇＡのＨ鎖、Ｊ鎖、分泌片（secretory component）等のいずれを認識するものであってもよい。
　また、ヒトＩｇＡに対する抗体はポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよいが、複合体の検出特異性の観点から、ヒトＩｇＡに対するモノクローナル抗体であることが好ましい。
　前記ヒトＩｇＡに対するモノクローナル抗体は、抗原としてヒトＩｇＡを用いて、上記ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に対する抗体と同様にして調製することができる。またヒトＩｇＡに対する抗体としては、市販の抗ヒトＩｇＡ抗体を用いることもできる。
　尚、ヒトＩｇＡに対する抗体は、上記のようにして得られるマウス等の小動物に由来する抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、および完全ヒト抗体等のいずれであってもよい。
　前記標識としては特に制限なく公知の標識を用いることができる。例えば、酵素、化学発光物質、電気化学発光物質、放射性物質等を挙げることができる。
　本発明においては、検出感度と簡便性の観点から、前記標識として酵素を用いることが好ましい。
　前記酵素としては、物理的、化学的方法で定量可能な酵素であれば特に制限はない。例えば、アルカリフォスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ルシフェラーゼ等の酵素を挙げることができる。
　また標識の検出方法は、標識を定量又は半定量可能な検出方法であれば特に制限はなく、標識に応じて適宜選択することができる。例えば、吸光度、発光強度、蛍光強度、放射線計数等を挙げることができる。
　標識を定量又は半定量することで、前記複合体を定量又は半定量することができる。
　本発明における複合体検出工程を、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を用い、標識の検出を吸光度にて行なう場合、本発明に好ましく用いられる前記複合体を検出する測定装置としては、複合体に結合した標識によって生じた色素の吸光度を測定可能な吸光度測定装置であって、標識によって生じた色素を含む試料を載置する試料載置部と、前記試料に光を照射する光照射部と、前記試料からの反射光及び透過光の少なくともいずれかを受光し、受光した光量を測定する光量測定部と、を備える吸光度測定装置を挙げることができる。
　本発明においては、検体（被験者の尿に由来する試料）に含まれるヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原とヒトＩｇＡとの複合体と結合した標識によって生じた色素に、前記光照射部により光を照射し、前記色素の吸光度を光量測定部により定量化することにより、検体中におけるヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原とヒトＩｇＡとの複合体の存在量を測定することができる。
　また、前記標識の検出を吸光度に代えて、検体からの発光を検出することによって行うこともできる。その場合は、前記吸光度測定装置に代えて、複合体に結合した標識そのものまたは反応液中の標識の基質から発せられる光を測定可能な測定装置であって、標識を含む試料を載置する試料載置部と、前記試料からの発光を受光し、受光した光量を測定する光量測定部と、を備える測定装置を挙げることができる。
　本発明においては、検体（被験者の尿に由来する試料）に含まれるヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原とヒトＩｇＡとの複合体と結合した標識を含む試料から発せられた光を前記光量測定部により定量化することにより、検体中におけるヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原とヒトＩｇＡとの複合体の存在量を測定することができる。
　本発明の腎疾患の検査方法は、前記尿に由来する試料中に含まれる前記複合体の検出量に基づいて、腎疾患と判定する判定工程を含むことが好ましい。本発明における前記複合体の検出量としては、前記尿に由来する試料中に含まれる前記複合体の濃度又はそれに対応する定量値又は半定量値であれば特に制限なく用いることができる。例えば、前記複合体の検出量を直接的に測定した測定値、前記複合体の検出量を標識の検出を介して間接的に測定した測定値等を挙げることができる。
　また本発明の腎疾患の検査方法においてＩｇＡ腎症を検査する場合、ＩｇＡ腎症と判定することに用いる複合体の検出量は、被験者の尿に由来する試料中の総尿蛋白質量に対する複合体の検出量の比率であることが好ましい。前記比率は複合体の検出量の測定値を被験者の尿に由来する試料中の総尿蛋白質量の測定値で除して得られるものであっても、総尿蛋白質量に対する相対値として得られる複合体の検出量であってもよい。かかる比率に基づいて判定することで、より高い感度と特異性でＩｇＡ腎症と判定することができる。
　尚、総尿蛋白質量を測定する被験者の尿に由来する試料は、同一の被験者から得られるものであれば、前記複合体の検出に用いる尿に由来する試料とは異なる試料であってもよい。
　本発明の腎疾患の検査方法における判定工程は、被験者の尿に由来する試料からのヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原とヒトＩｇＡとの複合体の検出量と、対照となる健常人の尿に由来する試料からの前記複合体の検出量とを比較する工程と、前記被験者の尿に由来する試料中の前記複合体の検出量が対照となる健常人の尿に由来する試料中の前記複合体の検出量よりも大きい場合と腎疾患とを関連づける工程と、を含むことが好ましい。
　ここで対照となる健常人とは、腎疾患を発症していないことが予め判明している個体を意味する。また、検出量が大きいとは、健常人と腎疾患患者とを区別するために設定された正常検出量（カットオフ値）よりも、被験者に由来する前記複合体の検出量のほうが大きいことである。
　前記カットオフ値は、例えば、腎疾患患者の尿に由来する試料群における前記複合体の検出量と、対照となる健常体群の尿に由来する試料群における前記複合体の検出量とをＲＯＣ解析等に付することよって設定することができる。ＲＯＣ解析は、例えば、疾病の検査方法の検出能、診断能を評価可能な解析方法であって、例えば、日本臨床検査自動化学会会誌「臨床検査の診断的有用性評価マニュアル」Ver.1.3(2004.9.1)、Vol.29 Suppl.1(通巻第154号)(2004年9月1日発行)に記載された解析方法である。
　また、カットオフ値は、例えば、健常人の検出レベルの平均値に、標準偏差を２倍あるいは３倍した値を加算した値として定めることもでき、更に、感度（検出率）・特異性（偽陽性率の低さ）をバランスよく満たす値に適宜定めることができる。
　本発明における腎疾患としては、例えば、ＩｇＡ腎症（ＩｇＡＮ）、膜性腎症（ＭＮ）、ループス腎炎（ＳＬＥ）、巣状糸球体硬化症（ＦＧＳ）、微少変化群ネフローゼ症候群（ＭＣＮＳ）、糖尿病性腎症（ＤＭＮ）、アミロイドーシス、遺伝性腎症（Ａｌｐｏｒｔ）、燃え尽きＩｇＡ腎症（ＩｇＡ腎症の自然寛解状態）、膜性増殖性糸球体腎炎（ＭＰＧＮ）、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連腎炎、菲薄基底膜症候群（ＴＢＭＤ）、腎硬化症等を挙げることができる。
　本発明の腎疾患の検査方法は、尿中の前記複合体を検出することで、ＩｇＡ腎症をはじめとする種々の腎疾患を検出することができる。
　本発明のＩｇＡ腎症の検査方法は、被験者の尿に由来する試料から、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原とヒトＩｇＡとの複合体を検出する複合体検出工程と、前記複合体検出工程で検出された前記複合体の検出量、あるいは被験者の尿に由来する試料中の尿蛋白質量に基づいて腎疾患と判定する第１の判定工程と、被験者の尿に由来する試料中の尿蛋白質量に対する前記複合体検出工程で検出された前記複合体の検出量の比率に基づいて、前記腎疾患をＩｇＡ腎症と判定する第２の判定工程と、を含むことを特徴とする。
　尿に由来する試料中の総蛋白質量に対する前記複合体の検出量の比率に基づいて、ＩｇＡ腎症と判定することで、高感度かつ高特異的であって、治療介入によって完全寛解が得られる初期段階においても、簡便かつ安全にＩｇＡ腎症を判定することができる。
　本発明における複合体検出工程は、前記腎疾患の検査方法における複合体検出工程と同様である。
　また、尿蛋白質量の検出方法としては、尿に由来する試料中の総蛋白質量を測定可能であれば特に制限なく、通常行われる尿に由来する試料中の蛋白質検出方法を適用することができる。例えば、金井光正ら著の「臨床検査法概要改訂版第３２版」、１７３～１７４頁、２００５年に記載の方法を適用することができる。
　本発明における第１の判定工程において、前記複合体検出工程で検出された前記複合体の検出量に基づいて腎疾患と判定する工程は、前記腎疾患の検査方法における判定工程と同様である。
　また、前記尿に由来する試料中の尿蛋白質量に基づいて腎疾患と判定する工程は、健常人と腎疾患患者とを区別するために設定された正常検出量（カットオフ値）よりも、被験者の尿に由来する試料中の尿蛋白質量のほうが大きい場合と腎疾患とを関連づける工程、を含むことが好ましい。
　ここで尿蛋白質量の正常検出量は、通常の方法で設定することができる。
　本発明における第２の判定工程は、被験者の尿に由来する試料中の前記複合体の検出量の前記試料中の総蛋白質量に対する比率（複合体／総蛋白質）と、対照となるＩｇＡ腎症以外の腎疾患患者の尿に由来する試料中の前記複合体の検出量の前記試料中の総蛋白質量に対する比率とを比較する工程と、前記被験者の尿に由来する試料中の前記複合体の検出量の前記試料中の総蛋白質量に対する比率が対照となるＩｇＡ腎症以外の腎疾患患者の尿に由来する試料中の前記複合体の検出量の前記試料中の総蛋白質量に対する比率よりも大きい場合とＩｇＡ腎症とを関連づける工程と、を含むことが好ましい。
　ここで、比率が大きいとは、ＩｇＡ腎症とＩｇＡ腎症以外の腎疾患を区別するために設定されたカットオフ値よりも、被験者に由来する前記複合体の検出量比率のほうが大きいことである。
　前記カットオフ値は上述した腎疾患の検査方法におけるカットオフ値と同様にして設定することができるが、検出特異性の観点から、ＲＯＣ解析の結果に基づいてカットオフ値を設定することが好ましい。
　本発明のＩｇＡ腎症の検査方法は、尿中の前記複合体の検出量と総蛋白質量とを測定し、前記総蛋白質量に対する前記複合体の検出量の比率に基づいて、ＩｇＡ腎症を検出することが可能であることから、簡便で安全なＩｇＡ腎症の検査方法である。
　本発明のヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原とヒトＩｇＡとの複合体の検出方法は、被験者の尿に由来する試料と、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に対する抗体及びヒトＩｇＡに対する抗体とを接触させる工程を含む。これによりヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原とヒトＩｇＡとの複合体を、高感度かつ高い特異性で検出することができる。
　本発明の複合体の検出方法には、前記腎疾患の検査方法における複合体検出工程において説明した事項を同様に適用することができる。
　また前記被験者は、腎疾患を発症しているヒト、腎疾患を発症していると疑われるヒト、または、腎疾患を発症する可能性を有しているヒトであることが好ましい。ここで言う腎疾患を発症する可能性を有しているヒトとは、腎疾患を発症しているヒトまたは腎疾患を発症していると疑われるヒトのいずれでもないあらゆるヒトをいう。また前記腎疾患はＩｇＡ腎症であることがより好ましい。
　本発明の腎疾患の検査キットは、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に対する抗体の少なくとも１種と、ヒトＩｇＡに対する抗体の少なくとも１種とを含むことを特徴とする。前記ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に対する抗体と、ヒトＩｇＡに対する抗体とを用いて、尿に由来する試料中のヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原とヒトＩｇＡとの複合体を検出することで、良好な検出感度と特異性で腎疾患と判定することが可能になる。
　本発明の腎疾患の検査キットは、前記抗体に加えて、被験者の尿に由来する試料と、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に対する抗体及びヒトＩｇＡに対する抗体とを接触させて、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原とヒトＩｇＡとの複合体を検出し、その検出量と腎疾患と関連付けることが記載された取扱い説明書をさらに含むことが好ましい。
　また、本発明の腎疾患の検査キットは、ＩｇＡ腎症の検査用として好ましく用いることができる。
　日本国出願番号第２００８－１４４８８３号の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。
　本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書に参照により取り込まれる。
　以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。尚、特に断りのない限り、「％」は質量基準である。
[実施例１]
＜ヒト腎メサンギウム細胞抗原認識モノクローナル抗体の取得＞
　正常ヒト腎メサンギウム細胞（Cryo NHMC:Cambrex社）を培養し、その細胞またはその細胞骨格成分抽出フラクションを免疫源としてＢＡＬＢ／ｃマウス（メス）に免疫した。免疫源に対する抗体価が上昇したことを確認し、その脾臓細胞をＰ３Ｕ－１細胞と細胞融合してハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマの１ｓｔスクリーニングは、２種類の免疫抗原（正常ヒト腎メサンギウム細胞またはその細胞骨格成分抽出フラクション）をマイロプレートのカップに固相化したＥＩＡ法により行い、両方あるいはいずれか一方の抗原に対して高い発色値を示したハイブリドーマを選択した。尚、細胞骨格成分抽出フラクションは、ProteoExtract Subcellular Proteome Extraction Kit(Calbiochem社製)を用いて調製した。
　選択したハイブリドーマは、限界希釈法でモノクローンにした後、これらを用いてヒト腎メサンギウム細胞に特異的なハイブリドーマを選択するために２ｎｄスクリーニングを行った。ハイブリドーマの２ｎｄスクリーニングは、後述するＥＬＩＳＡ法を用い、固相に正常ヒト腎メサンギウム細胞またはその細胞骨格成分抽出フラクションを用いたもので反応し、対照用に培養した正常ヒト近位尿細管上皮細胞（Cryo RPTEC:Cambrex社）またはその細胞骨格成分抽出フラクションを固相にしたものでは反応しないクローンを選択した。
　ＥＬＩＳＡ法は次の通り行った。正常ヒト腎メサンギウム細胞と正常ヒト近位尿細管上皮細胞の、それぞれ４０００ｃｅｌｌｓ／２００μｌをポリソープカップ（ＮＵＮＣ社製）に注入し３７℃、一夜培養した。カップをＰＢＳ（ｐＨ７．２）で５回洗浄した後、０．０５％グルタルアルデヒド溶液１００μｌ／ｗｅｌｌを注入し室温、３０分間反応させた。カップを洗浄液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）で５回洗浄後、ブロッキング液（１０％正常ウサギ血清(Pel-Freeze)、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ－ＥＤＴＡ－２Ｎａ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ＮａＮ３）を１５０μｌ／ｗｅｌｌ注入後、室温で２時間又は４℃で１日以上ブロッキングした（以下、「抗体スクリーニング用カップ」という）。
　一方、正常ヒト腎メサンギウム細胞と正常ヒト近位尿細管上皮細胞の骨格成分抽出フラクションは、それぞれ１０μｇ／ｍｌ濃度に５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、０．１５Ｍ　ＮａＣｌで希釈した後、ポリソープカップ（ＮＵＮＣ社製）に５０μｌ／ｗｅｌｌ注入した。カップを湿潤ボックスに入れ４℃で一夜コートした。コート後以降の操作は、前述の抗体スクリーニング用カップと同様に行った。
　４種類の抗体スクリーニング用カップを、それぞれ洗浄液(５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０)で３回洗浄し、ハイブリドーマ培養上清を５０μｌ／ｗｅｌｌ注入し、室温で１時間反応した。洗浄液(５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０)で３回洗浄後、０．２Ｍ　Ｎａ２ＨＰＯ４／０．１Ｍクエン酸で緩衝化(ｐＨ５．４)した２５％正常ウサギ血清（Pel-Freeze）で希釈した２種類の標識抗体（HRP-Rabbit Anti-Mouse ＩｇＧ(Zymed社製：１０００倍希釈)、HRP-Rabbit Anti-Mouse ＩｇＧ１(Zymed社製:４０００倍希釈）を、５０μｌ／ｗｅｌｌ注入し、室温で１時間反応した。洗浄液で３回洗浄後、3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine(TMB)Liquid Substrate System for ELISA（SIGMA社製）を１００μｌ／ｗｅｌｌ注入し、室温で３０分反応した。０．５Ｍ　Ｈ２ＳＯ４を１００μｌ／ｗｅｌｌ注入して反応を停止させた後、ＯＤ（４５０－６５０ｎｍ）を測定した。本測定結果において、特にHRP-Anti-Mouse ＩｇＧ１で正常ヒト腎メサンギウム細胞及びその細胞骨格成分抽出フラクションの両方あるいはそのいずれか一方で高い発色値を示し、かつ、正常ヒト近位尿細管上皮細胞及びその細胞骨格成分抽出フラクションのいずれでも低い発色値を示したクローンを選択した。
＜モノクローナル抗体の反応特性の確認＞
　上記で取得したハイブリドーマを培養し、その細胞をマウス腹腔に移植して得られた腹水からＰＲＯＳＥＰ－Ａ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）によってＩｇＧを精製した。精製モノクローナル抗体の特異性は、上記スクリーニングに用いたＥＬＩＳＡ法と同様の方法で特異性を確認した。
　精製モノクローナル抗体５種（４Ｈ３－１Ｄ１２－１Ｄ２、４Ｈ３－２Ｅ７－１Ｄ２、６Ｃ４－６Ａ８－１Ｂ４、１４Ｅ１１－２Ｇ７－１Ｂ２、１１Ａ１１－２Ｆ９－１Ｇ３）はすべて、固相に正常ヒトメサンギウム細胞または細胞骨格成分抽出フラクションに対しては高い発色値を示し、対照用の正常ヒト近位尿細管上皮細胞（Cryo RPTEC:Cambrex社）またはその細胞骨格成分抽出フラクションを固相にしたものでは低い発色値しか示さなかった。
　次に、正常ヒト腎メサンギウム細胞の骨格成分抽出フラクションをＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけ、ニトロセルロースフィルター（Schleicher&Schuell社製、ＢＡ８５）にブロッティングした。フィルターをブロッキング液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、５％スキムミルク、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ＮａＮ３）に浸し、４℃で一夜振とうした後、ブロッキング液を交換し、取得したモノクローナル抗体各クローンの培養上清を加え、室温で２時間振とうし、洗浄液で３回洗浄した。洗浄液に二次抗体のＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（Zymed Laboratories,Inc.社製）を１／１０００濃度で加え、室温で1時間振とうし、洗浄液で3回洗浄した後、発色液（８．３ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ(ｐＨ６．５)、１２５ｍＭ　ＮａＣｌ、０．０５％　4-Chloro-1-Naphtol、０．０１％　Ｈ２Ｏ２）を加えて発色させた。
　上記ウエスタンブロッティング解析実験の結果、クローン４Ｈ３と６Ｃ４はヒト腎メサンギウム細胞の骨格成分抽出フラクションの異なる分子量の成分と反応した。クローン４Ｈ３と６Ｃ４はヒト腎メサンギウム細胞の異なる抗原を認識していると考えられる。
＜腎疾患の検出＞
～ＥＬＩＳＡ法によるＩｇＡ－６Ｃ４認識抗原複合体の検出～
　６Ｃ４－６Ａ８－１Ｂ４抗体（以下、「６Ｃ４」という）をＰＲＯＳＥＰ－Ａ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）で精製後、更に５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、０．１５Ｍ　ＮａＣｌで透析して精製した精製抗体を５μｇ／ｍｌ～１０μｇ／ｍｌ濃度に５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、０．１５Ｍ　ＮａＣｌで希釈した後、ポリソープカップ（ＮＵＮＣ社製）に５０μｌ／ｗｅｌｌ注入した。カップを湿潤ボックスに入れ４℃で一夜コートした。コート後、洗浄液(５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０)で３回洗浄し、ブロッキング液（５０％Ｎ１０２(日本油脂社製)、２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、７５ｍＭ　ＮａＣｌ、２％ブロックエース(大日本住友製薬社製)）を１５０μｌ／ｗｅｌｌ注入後、室温で２時間又は４℃で１日以上ブロッキングした（以下、「６Ｃ４コートカップ」という）。
　６Ｃ４コートカップを洗浄液(５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０)で３回洗浄し、検体希釈液（５０％Ｎ１０２(日本油脂社製)、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２％ブロックエース(大日本住友製薬社製)）で５０倍希釈した尿検体を５０μｌ／ｗｅｌｌ注入し、室温で1時間反応した。洗浄液(５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０)で３回洗浄後、Can Get Signal２（ＴＯＹＯＢＯ社製）で３０００倍希釈したHRP-GOAT Anti-Human ＩｇＡ(Zymed社製)を、５０μｌ／ｗｅｌｌ注入し、室温で１時間反応した。洗浄液で３回洗浄後、3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine(TMB)Liquid Substrate System for ELISA（SIGMA社製）を１００μｌ／ｗｅｌｌ注入し、室温で３０分反応した。０．５Ｍ　Ｈ２ＳＯ４を１００μｌ／ｗｅｌｌ注入して反応を停止させた後、ＯＤ(４５０－６５０ｎｍ)を測定した。ＩｇＡ腎症患者９５例を含む腎疾患患者１４６例と健康人（健常人）２８例について測定した結果を図１に示す。
　図１においてブランクを差し引いた値を比較することで、ＩｇＡ腎症患者９５例を含む腎疾患患者１４６例と健康人（健常人）２８例を有意に区別できる結果が得られた。
　また、腎疾患患者１４６例と健康人２８例についてＲＯＣ解析を行ったところ、図２に示すＲＯＣ曲線が得られた。ＲＯＣ曲線から求めたカットオフ値は０．１５５であった。そのカットオフ値から腎疾患患者１４６例と健康人２８例の陽性率を求めた結果を表１に示す。表１に示す通り、腎疾患患者１４６例中陽性１３２例（９０．４％）、健康人２８例中陽性２例（７．１％）であり、両者を有意に区別できた。その時の感度は９０．４％、特異度（特異性）は９２．９％、診断効率は９０．８%であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 
＜ＩｇＡ腎症の検出＞
　次に、複合体検出量が上記カットオフ値以上の発色値を示した検体についてピロガロールレッド法により尿中の蛋白濃度を定量した。上記で検出したＩｇＡ－６Ｃ４認識抗原複合体の検出量（図１に示した値）を尿中の蛋白濃度で除して、尿中の蛋白量あたりの複合体検出量を算出した結果を図３に示した。図３から、ＩｇＡ腎症患者８３例とＩｇＡ腎症以外の腎疾患患者４８例とを有意に区別できることが分かる。
　また、ＩｇＡ腎症患者８３例とＩｇＡ腎症以外の腎疾患患者４８例についてＲＯＣ解析を行ったところ、図４に示すＲＯＣ曲線が得られた。ＲＯＣ曲線から求めたカットオフ値は４５０９であった。そのカットオフ値からＩｇＡ腎症患者８３例とＩｇＡ腎症以外の腎疾患患者４８例の陽性率を求めた結果を表２に示した。表２から、ＩｇＡ腎症患者８３例中陽性６１例（７３．５％）、ＩｇＡ腎症以外の腎疾患患者４８例中陽性１０例（２０．８％）であり、両者を有意に区別できることが分かる。その時の感度は７３．５％、特異度は７９．２％、診断効率は７５．６%であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 
[実施例２]
＜腎疾患の検出＞
～ＥＬＩＳＡ法によるＩｇＡ－４Ｈ３認識抗原複合体の検出～
　４Ｈ３－１Ｄ１２－１Ｄ２抗体（以下、「４Ｈ３」という）をＰＲＯＳＥＰ－Ａ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）で精製後、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、０．１５Ｍ　ＮａＣｌで透析した精製抗体を５μｇ／ｍｌ～１０μｇ／ｍｌ濃度に５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、０．１５Ｍ　ＮａＣｌで希釈した後、ポリソープカップ（ＮＵＮＣ社製）に５０μｌ／ｗｅｌｌ注入した。カップを湿潤ボックスに入れ４℃一夜コートした。コート後、洗浄液(５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０)で３回洗浄し、ブロッキング液（５０％ Ｎ１０２(日本油脂社製)、２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、７５ｍＭ　ＮａＣｌ、２％ブロックエース(大日本住友製薬社製)）を１５０μｌ／ｗｅｌｌ注入後、室温で２時間又は４℃で1日以上ブロッキングした（以下、「４Ｈ３コートカップ」という）。
　４Ｈ３コートカップを洗浄液(５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０)で３回洗浄し、検体希釈液（５０％Ｎ１０２(日本油脂社製)、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、２％ブロックエース(大日本住友製薬社製)）で５０倍希釈した尿検体を５０μｌ／ｗｅｌｌ注入し、室温で１時間反応した。洗浄液(５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０)で３回洗浄後、Can Get Signal２（ＴＯＹＯＢＯ社製）で３０００倍希釈したHRP-GOAT Anti-Human ＩｇＡ(Zymed社製)を、５０μｌ／ｗｅｌｌ注入し、室温で１時間反応した。洗浄液で３回洗浄後、3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for ELISA（SIGMA社製）を１００μｌ／ｗｅｌｌ注入し、室温で３０分反応した。０．５Ｍ　Ｈ２ＳＯ４を１００μｌ／ｗｅｌｌ注入して反応を停止させた後、ＯＤ(４５０－６５０ｎｍ)を測定した。ＩｇＡ腎症患者９５例を含む腎疾患患者１４９例と健康人２８例について測定した結果を図５に示す。
　図５においてブランクを差し引いた値を比較することで、ＩｇＡ腎症患者９５例を含む腎疾患患者１４９例と健康人２８例を有意に区別できる結果が得られた。
　また、腎疾患患者１４９例と健康人２８例についてＲＯＣ解析を行ったところ、図６に示すＲＯＣ曲線が得られた。ＲＯＣ曲線から求めたカットオフ値は０．１９２であった。そのカットオフ値から腎疾患患者１４９例と健康人２８例の陽性率を求めた結果を表３に示す。表３から、腎疾患患者１４９例中陽性１４７例（９８．７％）、健康人２８例中陽性１例（３．６％）であり、両者を有意に区別できた。その時の感度は９８．７％、特異度は９６．４％、診断効率は９８．３%であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 
＜ＩｇＡ腎症の検出＞
　次に、カットオフ値以上の発色値を示した検体についてピロガロールレッド法により尿中のタンパク濃度を定量した。上記で検出したＩｇＡ－４Ｈ３認識抗原複合体の検出量（図５に示した値）を尿中タンパク濃度で除して、尿中の蛋白量あたりの複合体検出量を算出した結果を図７に示した。図７から、ＩｇＡ腎症患者９２例とＩｇＡ腎症以外の腎疾患患者５４例を有意に区別できることが分かる。
　また、ＩｇＡ腎症患者９２例とＩｇＡ腎症以外の腎疾患患者５４例についてＲＯＣ解析を行ったところ、図８に示すＲＯＣ曲線が得られた。ＲＯＣ曲線から求めたカットオフ値は１５．０７であった。そのカットオフ値からＩｇＡ腎症患者９２例とＩｇＡ腎症以外の腎疾患患者５４例の陽性率を求めた結果を表４に示す。表４から、ＩｇＡ腎症患者９２例中陽性７１例（７７．２％）、ＩｇＡ腎症以外の腎疾患患者４８例中陽性１４例（２５．９％）であり、両者を有意に区別できた。その時の感度は７７．２％、特異度は７４．１％、診断効率は７６．０％であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 
　上記から、尿中に存在するヒトＩｇＡとヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原の複合体を検出することで、健康人と腎症患者を識別できることが分かる。
　また、尿中に存在するヒトＩｇＡとヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原の複合体の尿蛋白濃度当りの検出量を測定することでＩｇＡ腎症とそれ以外の腎疾患を識別できることが分かる。

Claims (17)

  1. 　被験者の尿に由来する試料から、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原とヒトＩｇＡとの複合体を検出する複合体検出工程を含むＩｇＡ腎症の検査方法。
  2. 　前記複合体検出工程は、前記試料と、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に対する抗体及びヒトＩｇＡに対する抗体とを接触させることを含む請求項１に記載の検査方法。
  3. 　前記複合体検出工程で検出された複合体の検出量の、被験者の尿に由来する試料中の尿蛋白質量に対する比率を得る工程をさらに含む請求項１または請求項２に記載の検査方法。
  4. 　前記比率に基づいて、ＩｇＡ腎症と判定する判定工程をさらに含む請求項３に記載の検査方法。
  5. 　被験者の尿に由来する試料から、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原とヒトＩｇＡとの複合体を検出する複合体検出工程を含む腎疾患の検査方法。
  6. 　前記複合体検出工程は、前記試料と、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に対する抗体及びヒトＩｇＡに対する抗体とを接触させることを含む請求項５に記載の検査方法。
  7. 　前記複合体の検出量に基づいて、腎疾患と判定する判定工程をさらに含む請求項５または請求項６に記載の検査方法。
  8. 　被験者の尿に由来する試料から、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原とヒトＩｇＡとの複合体を検出する複合体検出工程と、
    　前記複合体検出工程で検出された前記複合体の検出量、あるいは前記試料中の尿蛋白質量に基づいて腎疾患と判定する第１の判定工程と、
    　前記試料中の尿蛋白質量に対する前記複合体検出工程で検出された前記複合体の検出量の比率に基づいて、前記腎疾患をＩｇＡ腎症と判定する第２の判定工程と、を含むＩｇＡ腎症の検査方法。
  9. 　前記複合体検出工程は、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に対する抗体と、ヒトＩｇＡに対する抗体とを用いる免疫化学的方法である請求項１～請求項８のいずれか１項に記載の検査方法。
  10. 　前記免疫化学的方法は、サンドイッチ法である請求項９に記載の検査方法。
  11. 　被験者の尿に由来する試料と、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に対する抗体及びヒトＩｇＡに対する抗体とを接触させる工程を含む、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原とヒトＩｇＡとの複合体の検出方法。
  12. 　前記複合体は、前記ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に対する抗体と、ヒトＩｇＡに対する抗体とを用いて免疫化学的方法で検出される請求項１１に記載の検出方法。
  13. 　前記免疫化学的方法は、サンドイッチ法である請求項１２に記載の検出方法。
  14. 　前記被験者は、腎疾患を発症しているヒト、腎疾患を発症していると疑われるヒト、または、腎疾患を発症する可能性を有しているヒトである請求項１１～請求項１３のいずれか１項に記載の検出方法。
  15. 　前記腎疾患は、ＩｇＡ腎症である請求項１４に記載の検出方法。
  16. 　少なくとも、ヒト腎メサンギウム細胞に由来する抗原に対する抗体と、ヒトＩｇＡに対する抗体とを含む腎疾患の検査キット。
  17. 　前記腎疾患は、ＩｇＡ腎症である請求項１６に記載の検査キット。
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