WO2009090880A1 - 糖尿病の診断方法 - Google Patents

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WO2009090880A1
WO2009090880A1 PCT/JP2009/000143 JP2009000143W WO2009090880A1 WO 2009090880 A1 WO2009090880 A1 WO 2009090880A1 JP 2009000143 W JP2009000143 W JP 2009000143W WO 2009090880 A1 WO2009090880 A1 WO 2009090880A1
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chemerin
diabetes
antibodies
sample
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PCT/JP2009/000143
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Yutaka Takahashi
Kazuo Chihara
Daisuke Koga
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National University Corporation Kobe University
Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.
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    • G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
    • G01N2800/042—Disorders of carbohydrate metabolism, e.g. diabetes, glucose metabolism

Definitions

  • the present invention relates to a new diagnostic method for diabetes.
  • Type 1 diabetes also known as insulin-dependent diabetes, is a disease in which sugar in the blood increases abnormally because insulin secretion declines because the ⁇ -cells that secrete insulin in the pancreatic islets of Langerhans die. . Treatment of type 1 diabetes is by insulin supplementation.
  • type 2 diabetes is non-insulin dependent and is caused by decreased insulin secretion and decreased insulin sensitivity. It is said that obesity, overeating, lack of exercise, stress, etc. are greatly involved in the onset of type 2 diabetes, and basic diet therapy and exercise therapy are fundamental. However, the cause of the onset of type 2 diabetes has not yet been fully elucidated, so early detection and early treatment are important, but the current situation is that early detection is not possible.
  • Chemerin was reported as a gene induced by retinoic acid in fibroblasts as TIG2 (Tazarotene-induced gene2) in 1997, but the details of its function and structure were unknown. . Thereafter, it was reported that ChemR23, which had been cloned as an Orphan G protein coupled receptor, had TIG2 as a ligand. TIG2 has activity at 21 to 157 amino acid residues, and this active part was named chemarin (Non-patent Documents 1 to 3). However, there is no report about the relationship between this chemerin and diabetes. J. et al. Invest. Dermatol. 1997; 109 (1): 91-95. J. et al. Exp. Med. 2003; 198 (7): 977-985 FEBS Lett. 2003; 555 (3): 495-499.
  • An object of the present invention is to provide a new means for diagnosing diabetes, particularly a means for diagnosing type 2 diabetes.
  • the present inventors measured the blood concentration of chemerin whose function is not clear, and examined the relationship with various diseases. As a result, the chemerin concentration and type 2 diabetes have a significant correlation, It was found that diabetes can be diagnosed by measuring the chemerin concentration, and the present invention was completed.
  • the present invention provides a method for diagnosing diabetes characterized by measuring a chemerin concentration in a sample.
  • the present invention also provides a diagnostic agent for diabetes containing a chemerin concentration measuring reagent.
  • the present invention it is possible to diagnose or determine diabetes, particularly type 2 diabetes. Accordingly, early detection of type 2 diabetes enables early treatment.
  • chemerin Northern blotting
  • AC chemerin.
  • mouth tissue is shown.
  • AC is chemerin.
  • the immunoblotting result by the anti-chemarine antibody in 3T3L1 adipocyte culture supernatant is shown.
  • mAC1 mouse chemerin
  • rhAC1 is recombinant human chemerin.
  • the result of having measured serum in the ELISA system which used D0101 as a solid-phase antibody and PoAb and D0102 as a labeled antibody, respectively is shown.
  • chemerin as a gene encoding a secreted protein whose expression is enhanced with adipogenesis using adipocytes. Chemamarin was found to be strongly expressed with adipose differentiation by Northern blotting. In addition, chemerin is strongly expressed in the liver and adipose tissue, and is secreted into the culture supernatant of adipocytes, so it has been clarified that it is one of the adipokines secreted from adipocytes.
  • the measurement includes quantitative or non-quantitative measurement.
  • non-quantitative measurement it is simply measured whether or not chemerin is present, whether or not chemerin is present in a certain amount or more. Measurement of comparing the amount of chemerin with other samples (for example, control samples, etc.). Examples of quantitative measurement include measurement of the concentration of chemerin, measurement of the amount of chemerin, and the like.
  • the sample is not particularly limited as long as it may contain chemerin, but is preferably a sample collected from the body of a living organism such as a mammal, more preferably a sample collected from a human.
  • Specific examples of the sample include blood, interstitial fluid, plasma, extravascular fluid, cerebrospinal fluid, synovial fluid, pleural fluid, serum, lymph fluid, saliva, urine, intestinal tissue and the like. Preferred are blood, serum and plasma.
  • a sample is taken from a patient, the chemerin concentration of the sample is measured, and diabetes can be diagnosed if the value is higher than the reference value obtained from the distribution of the chemerin concentration of a healthy person.
  • the chemerin concentration is preferably measured by an immunological measurement method using an anti-chemalin antibody.
  • an anti-chemalin antibody will be described in detail.
  • the anti-chemalin antibody used in the present invention may specifically bind to chemerin.
  • the origin, type (monoclonal, polyclonal) and shape of the antibody are not limited. Specifically, known antibodies such as mouse antibodies, rat antibodies, human antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies can be used.
  • the antibody may be a polyclonal antibody, but is preferably a monoclonal antibody.
  • the anti-chemalin antibody immobilized on the support and the anti-chemalin antibody labeled with the labeling substance in the immunoassay may recognize the same or different epitopes of the chemerin molecule.
  • the anti-chemarine antibody used in the present invention can be obtained as a polyclonal or monoclonal antibody using known means.
  • a mammal-derived monoclonal antibody is particularly preferable.
  • Mammal-derived monoclonal antibodies include those produced by hybridomas and those produced by hosts transformed with expression vectors containing antibody genes by genetic engineering techniques.
  • Monoclonal antibody-producing hybridomas can be basically produced using known techniques as follows. That is, chemerin is used as a sensitizing antigen and immunized according to a normal immunization method. The obtained immune cells are fused with a known parent cell by a normal cell fusion method, and monoclonal antibodies are obtained by a normal screening method. It can be produced by screening antibody-producing cells.
  • the monoclonal antibody can be produced as follows. First, chemerin used as a sensitizing antigen for antibody acquisition is obtained by purifying from available cell culture supernatants. Next, this purified chemerin is used as a sensitizing antigen.
  • the mammal to be immunized with the sensitizing antigen is not particularly limited, but is preferably selected in consideration of compatibility with the parent cell used for cell fusion. Animals such as mice, rats, hamsters, others, rabbits, monkeys and the like are used.
  • Immunization of animals with a sensitizing antigen can be performed according to a known method.
  • a sensitizing antigen is injected into a mammal intraperitoneally or subcutaneously.
  • the sensitizing antigen is diluted to an appropriate amount with PBS (Phosphate-Buffered Saline), physiological saline, or the like, and mixed with an appropriate amount of an ordinary adjuvant, for example, Freund's complete adjuvant, if necessary, and emulsified.
  • PBS Phosphate-Buffered Saline
  • physiological saline or the like
  • an ordinary adjuvant for example, Freund's complete adjuvant, if necessary, and emulsified.
  • an appropriate carrier can be used during immunization with the sensitizing antigen.
  • a carrier protein such as albumin or keyhole limpet hemocyanin.
  • immune cells are collected from the mammal and subjected to cell fusion.
  • Mammalian myeloma cells are used as the other parent cell to be fused with the immune cells.
  • This myeloma cell is known in various known cell lines such as P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550), P3x63Ag8U. 1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519), MPC-11 (Margulies. DH et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP2 / 0 (Shulman, M.
  • the cell fusion between the immune cells and myeloma cells is basically performed by a known method such as the method of Kohler and Milstein et al. (Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3- 46) and the like.
  • the cell fusion is performed, for example, in a normal nutrient culture medium in the presence of a cell fusion promoter.
  • a cell fusion promoter for example, polyethylene glycol (PEG), Sendai virus (HVJ) or the like is used, and an auxiliary agent such as dimethyl sulfoxide can be added and used to increase the fusion efficiency if desired.
  • the usage ratio of immune cells and myeloma cells can be arbitrarily set.
  • the number of immune cells is preferably 1 to 10 times that of myeloma cells.
  • the culture solution used for the cell fusion for example, RPMI1640 culture solution suitable for growth of the myeloma cell line, MEM culture solution, and other normal culture solutions used for this kind of cell culture can be used.
  • Serum replacement fluid such as fetal calf serum (FCS) can be used in combination.
  • a predetermined amount of the immune cells and myeloma cells are mixed well in the culture solution, and a polyethylene glycol (PEG) (for example, an average molecular weight of about 1000 to 6000) solution preheated to about 37 ° C. is usually 30.
  • PEG polyethylene glycol
  • the target fused cell (hybridoma) is formed by adding and mixing at a concentration of ⁇ 60% (w / v). Subsequently, cell fusion agents and the like that are undesirable for the growth of the hybridoma are removed by sequentially adding an appropriate culture medium and centrifuging to remove the supernatant.
  • the hybridoma thus obtained is selected by culturing in a normal selective culture solution, for example, a HAT culture solution (a culture solution containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine). Culturing with the HAT culture solution is continued for a sufficient time (usually several days to several weeks) for cells other than the target hybridoma (non-fusion cells) to die. Subsequently, the usual limiting dilution method is performed, and the hybridoma producing the target antibody is screened and single-cloned.
  • a normal selective culture solution for example, a HAT culture solution (a culture solution containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine). Culturing with the HAT culture solution is continued for a sufficient time (usually several days to several weeks) for cells other than the target hybridoma (non-fusion cells) to die. Subsequently, the usual limiting dilution method is performed, and the hybridoma producing the target antibody is screened
  • Screening and single cloning of the target antibody may be performed by a screening method based on a known antigen-antibody reaction.
  • an antigen is bound to a carrier such as beads made of polystyrene or a commercially available 96-well microtiter plate, reacted with the culture supernatant of the hybridoma, washed with the carrier, and then reacted with an enzyme-labeled secondary antibody or the like.
  • a hybridoma producing the target antibody can be cloned by limiting dilution or the like. In this case, the antigen used for immunization may be used.
  • the hybridoma producing the monoclonal antibody thus produced can be subcultured in a normal culture solution and can be stored for a long time in liquid nitrogen.
  • Examples of the hybridoma include D0101 and D0102. These hybridomas were founded on December 9, 2008 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Biological Depositary Center (Japan, 305-8566, Ibaraki Pref., 1st East, 1st Street, 1st Street, 1st, 6th). D0102 was deposited as FERM ABP-11070 as -11069.
  • the hybridoma is cultured according to a usual method and obtained as a culture supernatant thereof, or the hybridoma is administered to a mammal compatible therewith to proliferate, and as ascites is obtained.
  • the method of obtaining is adopted.
  • the former method is suitable for obtaining highly pure antibodies, while the latter method is suitable for mass production of antibodies.
  • these antibodies may be low molecular weight antibodies such as antibody fragments (fragments), modified antibodies, etc., as long as they do not lose the property of recognizing the full length or part of the protein encoded by the chemerin gene.
  • Specific examples of the antibody fragment include Fab, Fab ', F (ab') 2, Fv, Diabody, and the like.
  • Such antibody fragments can be obtained by digesting the Fc part of IgG with pepsin or papain, constructing genes encoding these antibody fragments, introducing them into expression vectors, and expressing them in appropriate host cells. (For example, Co, MS et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M.
  • the antibody produced as described above can be isolated from cells and host animals and purified to homogeneity. Separation and purification of the antibody used in the present invention can be performed using an affinity column. For example, as a column using a protein A column, Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (Manufactured by GE Healthcare). In addition, it is only necessary to use a separation and purification method used in ordinary proteins, and the method is not limited at all. For example, antibodies can be separated and purified by appropriately selecting and combining chromatography columns other than the affinity column, filters, ultrafiltration, salting out, dialysis, etc. (Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane) , Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).
  • the detection method of chemerin contained in the sample is not particularly limited, it is preferably detected by an immunological method using an anti-chemalin antibody.
  • the immunological method include radioimmunoassay, enzyme immunoassay, fluorescent immunoassay, luminescence immunoassay, immunoprecipitation method, immunoturbidimetric method, Western blot, immunostaining, immunodiffusion method, etc.
  • An immunoassay is particularly preferred, which is an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (for example, a sandwich ELISA).
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • the above-described immunological methods such as ELISA can be performed by methods known to those skilled in the art.
  • a monoclonal antibody for either or both of the immobilized antibody and the labeled antibody.
  • monoclonal antibodies for both, it is desirable to use a combination of monoclonal antibodies that recognize different sites.
  • Monoclonal antibodies can be used on one side and polyclonal antibodies on the other side.
  • the monoclonal antibody produced by the hybridoma D0101 or D0102 is particularly preferable.
  • a measurement system using D0101 or a polyclonal antibody as a solid-phased antibody and D0102 as a labeled antibody is particularly preferable because of high detection sensitivity.
  • an anti-chemalin antibody is immobilized on a support, a sample is added thereto, incubation is performed, the anti-chemalin antibody and the chemerin are bound, washed, A method of detecting chemerin in a sample by detecting chemerin bound to a support via a chemerin antibody can be mentioned.
  • Examples of the support used in the present invention include insoluble polysaccharides such as agarose and cellulose, synthetic resins such as silicone resins, polystyrene resins, polyacrylamide resins, nylon resins, and polycarbonate resins, and insoluble supports such as glass. Can be mentioned. These supports can be used in the form of beads or plates. In the case of beads, a column packed with these can be used. In the case of a plate, a multiwell plate (96-well multiwell plate or the like), a biosensor chip, or the like can be used. The anti-chemalin antibody and the support can be bound by a commonly used method such as chemical bonding or physical adsorption. All of these supports can be commercially available.
  • the binding between the anti-chemalin antibody and chemerin is usually performed in a buffer solution.
  • a buffer solution for example, phosphate buffer solution, Tris buffer solution, citrate buffer solution, borate buffer solution, carbonate buffer solution and the like are used.
  • Incubation is performed under conditions often used, for example, incubation at 4 ° C. to room temperature for 1 to 24 hours. Washing after incubation is not particularly limited as long as it does not interfere with the binding between the chemerin and the anti-chemalin antibody.
  • a buffer containing a surfactant such as Tween 20 is used.
  • a control sample may be installed in addition to the sample for detecting chemerin.
  • the control sample include a negative control sample not containing chemerin and a positive control sample containing chemerin.
  • it is possible to detect the chemerin in the sample by comparing the result obtained with the negative control sample not containing chemerin and the result obtained with the positive control sample containing chemerin.
  • a series of control samples with varying concentrations are prepared, detection results for each control sample are obtained as numerical values, a standard curve is created, and samples are included based on the standard curve from the sample values. It is also possible to detect chemerin quantitatively.
  • the sample is brought into contact with an anti-chemalin antibody immobilized on a support, and after washing, detection is performed using a labeled antibody that specifically recognizes chemerin.
  • the anti-chemalin antibody can be labeled by a generally known method.
  • labeling substances known to those skilled in the art such as fluorescent dyes, enzymes, coenzymes, chemiluminescent substances, radioactive substances and the like can be used.
  • radioisotopes 32 P, 14 C, 125 I, 3 H, 131 I, etc.
  • fluorescein rhodamine
  • dansyl chloride umbelliferone
  • luciferase peroxidase
  • alkaline phosphatase ⁇ -galactosidase
  • ⁇ -glucosidase horseradish peroxidase
  • lysozyme saccharide Examples include oxidase, microperoxidase, and biotin.
  • biotin When biotin is used as the labeling substance, it is preferable to further add avidin to which an enzyme such as alkaline phosphatase is bound after adding the biotin-labeled antibody.
  • avidin to which an enzyme such as alkaline phosphatase is bound after adding the biotin-labeled antibody.
  • a known method such as glutaraldehyde method, maleimide method, pyridyl disulfide method, and periodic acid method can be used for the binding of the labeling substance and the anti-chemarine antibody.
  • the enzyme enzyme labeling method includes, but is not limited to, a hinge method and a non-hinge method.
  • Fab ′ and an enzyme molecule are separated from each other by using a thiol group generated by reducing a disulfide bond in a portion called a hinge portion between an F (ab ′) 2 portion having an antigen-binding ability of antibody IgG. It is a way to combine.
  • the non-hinge method does not specify which reactive group of the antibody is used, but in many cases, it is a method of binding the antibody molecule and the enzyme molecule using the amino group of the antibody.
  • a solution containing an anti-chemalin antibody is added to a support such as a plate, and the anti-chemalin antibody is fixed to the support. After washing the plate, it is blocked with, for example, BSA, gelatin, albumin or the like in order to prevent nonspecific binding of proteins. Wash again and add sample to plate. After incubation, wash and add labeled anti-chemalin antibody. After moderate incubation, the plate is washed and the labeled anti-chemalin antibody remaining on the plate is detected. Detection can be performed by methods known to those skilled in the art. For example, in the case of labeling with a radioactive substance, it can be detected by liquid scintillation or RIA.
  • a substrate is added, and an enzymatic change of the substrate, such as color development, can be detected with an absorptiometer.
  • the substrate include 2,2-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS), 1,2-phenylenediamine (ortho-phenylenediamine), 3,3 ′ , 5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) and the like.
  • ABTS 2,2-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt
  • TMB 5,5′-tetramethylbenzidine
  • a fluorescent substance it can be detected by a fluorometer.
  • chemerin measurement method of the present invention there is a method using an antibody labeled with a method described in a general enzyme labeling method after removing an Fc portion unrelated to the antigen-binding ability of antibody IgG. it can.
  • a solution containing an anti-chemalin antibody is added to a support such as a plate to immobilize the anti-chemalin antibody. After washing the plate, it is blocked with, for example, BSA in order to prevent non-specific protein binding. Wash again and add sample to plate. After incubation, wash and add peroxidase directly labeled anti-chemalin antibody. After moderate incubation, the plate is washed, a substrate corresponding to the enzyme is added, and chemerin is detected using an enzymatic change of the substrate as an indicator.
  • chemerin measurement method of the present invention there can be mentioned a method using one or more primary antibodies specifically recognizing chemerin and one or more secondary antibodies specifically recognizing the primary antibody. .
  • the measurement method of the present invention can be automated using various automatic inspection devices, and a large number of samples can be inspected at a time.
  • the diagnostic agent of the present invention contains a chemerin measuring reagent.
  • the chemerin measuring reagent includes components necessary for the chemerin measuring method, for example, an anti-chemalin antibody.
  • the diagnostic agent includes a kit.
  • the diagnostic agent may contain a carrier for immobilizing the antibody, and the antibody may be bound to the carrier in advance.
  • the diagnostic agent is based on an agglutination method using a carrier such as latex, it may contain a carrier to which an antibody is adsorbed.
  • the diagnostic agent may appropriately contain a blocking solution, a reaction solution, a reaction stop solution, a reagent for treating the sample, and the like.
  • Reference example 1 A 3T3L1 adipocyte was used as a gene encoding a secreted protein whose expression increases with adipogenesis, and a chemerin was identified by searching using a differential display method.
  • Example 1 Recombinant human chemerin preparation method
  • the human chemerin gene was amplified by PCR from human adipose tissue cDNA (Clontech) and cloned into the expression vector pET14b vector (Novagen).
  • the pET14b vector into which the human chemerin gene was cloned was transformed into Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS strain (manufactured by Takara Bio Inc.) to obtain Escherichia coli expressing recombinant human chemerin.
  • This Escherichia coli was cultured, and the extract was purified using a HisTrap HP column (manufactured by GE Healthcare Life Sciences) to obtain a recombinant human chemerin.
  • the target fusion cell (hybridoma) was formed by adding at a concentration of w / v) and mixing.
  • the cells were cultured in an RPMI 1640 medium containing HAT (hypoxanthine, aminopterin and thymidine) for 1 week. Subsequently, a normal limiting dilution method was performed, and screening and single cloning of hybridomas producing the target antibody were performed. Screening and single cloning of the target antibody were carried out by the methods shown below.
  • Recombinant human chemerin used as an immunizing antigen was bound to a 96-well microtiter plate, reacted with the culture supernatant of the hybridoma, washed with the carrier, and then reacted with horseradish peroxidase-labeled anti-mouse IgG antibody. It was determined whether any antibodies that react with human chemarin were included.
  • the hybridoma producing the target antibody was cloned by the limiting dilution method. This hybridoma was cultured using a hybridoma-SFM medium (manufactured by Invitrogen) at 37 ° C. under 5% carbon dioxide, and the culture supernatant was collected.
  • the culture supernatant was concentrated by salting out with ammonium sulfate. After exchanging the concentrated solution with phosphate buffered saline, the mouse was used with a protein A column (GE Healthcare Bioscience) and Sephacryl S-300 gel filtration column (GE Healthcare Bioscience). Anti-human chemerin monoclonal antibody was purified.
  • the hybridoma obtained here was designated as D0101 or D0102, and on December 9, 2008, the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center (Japan, 1-1-1 Higashi 1-chome Tsukuba, Ibaraki 305-8586, Japan) In the middle 6), D0101 was deposited as FERM ABP-11069 and D0102 was deposited as FERM ABP-11070.
  • rabbit serum was collected and a Protein A column (GE Healthcare Bioscience) and Sephacryl S-300 gel filtration column (GE Healthcare Bioscience) were collected.
  • Rabbit anti-human chemerin polyclonal antibody (PoAb) was purified.
  • Table 1 shows the measurement results of blood chemerin concentration for 172 healthy subjects and 170 patients with type 2 diabetes.
  • the blood chemerin concentration of diabetic patients was statistically significantly lower than that of healthy subjects. Therefore, measuring the blood chemerin concentration is useful as an index for diabetes diagnosis.
  • Example 2 A sandwich ELISA assay system was constructed by combining two types of antibodies from the three types of antibodies, rabbit anti-human chemerin polyclonal antibody (PoAb) and mouse anti-human chemerin monoclonal antibody (D0101 or D0102). Recombinant human chemerin was used as a standard. The detection sensitivity was compared. That is, as a primary reaction, recombinant human chemerin was diluted 2-fold from 5000 pg / mL, and allowed to react on a plate on which an antibody had been solid-phased at 25 ° C. for 2 hours.
  • PoAb rabbit anti-human chemerin polyclonal antibody
  • D0101 or D0102 mouse anti-human chemerin monoclonal antibody
  • Example 3 Twenty cases of human plasma or serum were measured in an ELISA measurement system using D0101 as a solid phase antibody and PoAb and D0102 as labeled antibodies, respectively. As a result, a good correlation of R ⁇ 0.6 was shown (FIGS. 4 and 5). The slope of the regression line of the monoclonal antibody measurement system / evaluation kit was 1.77 to 2.04, indicating a tendency for the monoclonal antibody measurement system to be high.

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Abstract

　新たな糖尿病診断剤の提供。 　試料中のケマリン濃度を測定することを特徴とする糖尿病の判定方法。

Description

糖尿病の診断方法
　本発明は、糖尿病の新たな診断方法に関する。
　糖尿病は、糖代謝異常疾患であり、その患者数は全世界で２億人に達すると予想されている。糖尿病は、大きく１型と２型に分類されている。１型糖尿病はインスリン依存型糖尿病ともいい、膵臓のランゲルハンス島でインスリンを分泌しているβ細胞が死滅するために、インスリンの分泌が低下するために血中の糖が異常に増加する疾患である。１型糖尿病の治療は、インスリンの補充により行われる。
　一方２型糖尿病は、インスリン非依存型であり、インスリン分泌低下とインスリン感受性低下を原因とする。２型糖尿病の発症には、肥満、過食、運動不足、ストレス等が大きく関与するといわれており、一般食事療法と運動療法が基本となる。しかし、２型糖尿病の発症原因は未だ完全に解明されているとはいえないため、早期発見、早期治療が重要であるが、早期発見ができないのが現状である。
　このような現状から、糖尿病、特に２型糖尿病の診断は重要であり、新たな診断手段の開発が望まれている。
　一方、ケマリン（Ｃｈｅｍｅｒｉｎ）は、１９９７年にＴＩＧ２（Ｔａｚａｒｏｔｅｎｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｇｅｎｅ２）として線維芽細胞において、レチノイン酸によって誘導されてくる遺伝子として報告されたが、その機能や構造の詳細については不明であった。その後、Ｏｒｐｈａｎ　Ｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｕｐｌｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒとしてクローニングされていたＣｈｅｍＲ２３がＴＩＧ２をリガンドとしていることが報告された。ＴＩＧ２は２１～１５７アミノ酸残基に活性を持ち、この活性部分がケマリンと命名された（非特許文献１～３）。
　しかし、このケマリンと糖尿病との関連性についての報告はない。
Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１９９７；１０９（１）：９１－９５ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００３；１９８（７）：９７７－９８５ ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．２００３；５５５（３）：４９５－４９９
　本発明の目的は、新たな糖尿病診断手段、特に２型糖尿病の診断手段を提供することにある。
　そこで本発明者等は、機能が明確になっていないケマリンの血中濃度を測定し、種々の疾患との関係について検討したところ、ケマリン濃度と２型糖尿病とが有意な相関関係を有し、ケマリン濃度を測定すれば、糖尿病が診断できることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、試料中のケマリン濃度を測定することを特徴とする糖尿病の診断方法を提供するものである。
　また本発明は、ケマリン濃度測定試薬を含有する糖尿病診断剤を提供するものである。
　本発明によれば、糖尿病、特に２型糖尿病の診断又は判定が可能になる。従って、２型糖尿病の早期発見により、早期治療が可能になる。
３Ｔ３Ｌ１細胞におけるケマリンの発現（ノザンブロッティング）を示す。ＡＣがケマリンである。 マウス組織におけるノザンブロッティング結果を示す。ＡＣがケマリンである。 ３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞培養上清中の抗ケマリン抗体によるイムノブロッティング結果を示す。図３中、ｍＡＣ１はマウスケマリンであり、ｒｈＡＣ１はリコンビナントヒトケマリンである。 固相抗体としてＤ０１０１を用い、標識抗体としてＰｏＡｂ及びＤ０１０２をそれぞれ用いたＥＬＩＳＡ系にて、血清を測定した結果を示す。 固相抗体としてＤ０１０１を用い、標識抗体としてＰｏＡｂ及びＤ０１０２をそれぞれ用いたＥＬＩＳＡ系にて、血漿を測定した結果を示す。 ゲル濾過精製した血清におけるＥＬＩＳＡ結果（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００　Φ１．０ｃｍ×６０ｃｍ）を示す図である。
発明を実施するための形態
　本発明者らは、脂肪細胞を用いて脂肪分化とともに発現が増強する分泌蛋白をコードする遺伝子としてケマリンを同定した。ケマリンは、ノザンブロッティングにより脂肪分化とともに強く発現することを見出した。また、ケマリンは肝臓及び脂肪組織で強く発現しており、脂肪細胞の培養上清中に分泌されていることから、脂肪細胞から分泌されるアディポカインのひとつであることを明らかにした。
　本発明において測定とは、定量的又は非定量的な測定を含み、例えば、非定量的な測定としては、単にケマリンが存在するか否かの測定、ケマリンが一定の量以上存在するか否かの測定、ケマリンの量を他の試料（例えば、コントロール試料など）と比較する測定などを挙げることができる。定量的な測定としては、ケマリンの濃度の測定、ケマリンの量の測定などを挙げることができる。
　試料とは、ケマリンが含まれる可能性のある試料であれば特に制限されないが、哺乳類などの生物の体から採取された試料が好ましく、さらに好ましくはヒトから採取された試料である。試料の具体的な例としては、例えば、血液、間質液、血漿、血管外液、脳脊髄液、滑液、胸膜液、血清、リンパ液、唾液、尿、腸組織などを挙げることができるが、好ましいのは血液、血清、血漿である。
　患者より試料を採取し、試料のケマリン濃度を測定し、健常人のケマリン濃度の分布より求められた基準値と比較して高値であれば糖尿病と診断できる。
　本発明方法においては、ケマリン濃度の測定は、抗ケマリン抗体を用いる免疫学的測定法が好ましい。以下、抗ケマリン抗体を用いた測定法について詳細に説明する。
　本発明で用いられる抗ケマリン抗体はケマリンに特異的に結合すればよい。抗体の由来、種類（モノクローナル、ポリクローナル）及び形状を問わない。具体的には、マウス抗体、ラット抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト型化抗体などの公知の抗体を用いることができる。抗体はポリクローナル抗体でもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましい。
　また、免疫学的測定法において支持体に固定される抗ケマリン抗体と標識物質で標識される抗ケマリン抗体はケマリン分子の同じエピトープを認識してもよいし、異なるエピトープを認識してもよい。
　本発明で使用される抗ケマリン抗体は、公知の手段を用いてポリクローナル又はモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗ケマリン抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマにより産生されるもの、及び遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものを含む。
　モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、ケマリンを感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
　具体的には、モノクローナル抗体を作製するには次のようにすればよい。
　まず、抗体取得の感作抗原として使用されるケマリンを、入手可能な細胞の培養上清から精製して得る。
　次に、この精製ケマリンを感作抗原として用いる。
　感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、その他、ウサギ、サル等が使用される。
　感作抗原の動物への免疫は公知の方法に従って行うことができる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４～２１日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。特に分子量の小さい部分ペプチドを感作抗原として用いる場合には、アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン等の担体タンパク質と結合させて免疫することが望ましい。
　このように哺乳動物を免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付されるが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
　前記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３）（Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．（１９７９）１２３，１５４８－１５５０）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９７８）８１，１－７）、ＮＳ－１（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７６）６，５１１－５１９）、ＭＰＣ－１１（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ．Ｄ．Ｈ．ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９７６）８，４０５－４１５）、ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）２７６，２６９－２７０）、ＦＯ（ｄｅ　Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８０）３５，１－２１）、Ｓ１９４（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，Ｉ．Ｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９７８）１４８，３１３－３２３）、Ｒ２１０（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１３１－１３３）等が好適に使用される。
　前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３，３－４６）等に準じて行うことができる。
　より具体的には、前記細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等が使用され、さらに所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
　免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１～１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
　細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め３７℃程度に加温したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば平均分子量１０００～６０００程度）溶液を通常３０～６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）を形成する。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。
　このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。上記ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日～数週間）継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニング及び単一クローニングを行う。
　目的とする抗体のスクリーニング及び単一クローニングは、公知の抗原抗体反応に基づくスクリーニング方法で行えばよい。例えば、ポリスチレン等でできたビーズや市販の９６ウェルのマイクロタイタープレート等の担体に抗原を結合させ、ハイブリドーマの培養上清と反応させ、担体を洗浄した後に酵素標識第２次抗体等を反応させることにより、培養上清中に感作抗原と反応する目的とする抗体が含まれるかどうか決定できる。目的とする抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法等によりクローニングすることができる。この際、抗原としては免疫に用いたものを用いればよい。
　このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。当該ハイブリドーマの例としては、Ｄ０１０１及びＤ０１０２が挙げられる。これらのハイブリドーマは、２００８年１２月９日に（独）産業技術総合研究所　特許生物寄託センター（日本国　〒３０５－８５６６　茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６）に、Ｄ０１０１をＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１０６９として、Ｄ０１０２をＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１０７０としてそれぞれ寄託した。
　当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法に従い培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。
　また、これらの抗体は、ケマリン遺伝子によってコードされる蛋白質の全長又は一部を認識する特性を失わない限り、抗体断片（フラグメント）等の低分子化抗体や抗体の修飾物などであってもよい。抗体断片の具体例としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｄｉａｂｏｄｙなどを挙げることができる。このような抗体断片を得るには、ペプシンやパパインによりＩｇＧのＦｃ部分を消化する方法や、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８－２９７６；Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．ａｎｄ　Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４７６－４９６；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．ａｎｄ　Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４９７－５１５；Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６５２－６６３；Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，Ｊ．ｅｔ　ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６６３－６６９；Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ａｎｄ　Ｗａｌｋｅｒ，Ｂ．Ｗ．，Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９１）９，１３２－１３７参照）。
　前記のように産生された抗体は、細胞、宿主動物から分離し均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製はアフィニティーカラムを用いて行うことができる。例えば、プロテインＡカラムを用いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ　Ｄ、ＰＯＲＯＳ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆ．Ｆ．（ＧＥヘルスケア社製）等が挙げられる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、上記アフィニティーカラム以外のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ　Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ　Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）。
　試料に含まれるケマリンの検出方法は特に限定されないが、抗ケマリン抗体を用いた免疫学的方法により検出することが好ましい。免疫学的方法としては、例えば、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、発光イムノアッセイ、免疫沈降法、免疫比濁法、ウエスタンブロット、免疫染色、免疫拡散法などを挙げることができるが、好ましくはエンザイムイムノアッセイであり、特に好ましいのは酵素結合免疫吸着定量法（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）（例えば、ｓａｎｄｗｉｃｈ　ＥＬＩＳＡ）である。ＥＬＩＳＡなどの上述した免疫学的方法は当業者に公知の方法により行うことが可能である。
　これらの免疫学的測定にあたっては、固相化抗体及び標識抗体の両方又はいずれか一方にモノクローナル抗体を用いるのが好ましい。両方にモノクローナル抗体を用いる場合は、それぞれ異なる部位を認識するモノクローナル抗体を組み合せて用いるのが望ましい。一方にモノクローナル抗体を使用し、他方にポリクローナル抗体を使用することもできる。このような測定系に用いられるモノクローナル抗体としては、前記ハイブリドーマＤ０１０１又はＤ０１０２が産生するモノクローナル抗体が特に好ましい。さらに固相化抗体としてＤ０１０１又はポリクローナル抗体を用い、標識抗体としてＤ０１０２を用いた測定系は、検出感度が高く特に好ましい。
　抗ケマリン抗体を用いた一般的な検出方法としては、例えば、抗ケマリン抗体を支持体に固定し、ここに試料を加え、インキュベートを行い抗ケマリン抗体とケマリンを結合させた後に洗浄して、抗ケマリン抗体を介して支持体に結合したケマリンを検出することにより、試料中のケマリンの検出を行う方法を挙げることができる。
　本発明において用いられる支持体としては、例えば、アガロース、セルロースなどの不溶性の多糖類、シリコーン樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、ナイロン樹脂、ポリカーボネイト樹脂などの合成樹脂や、ガラスなどの不溶性の支持体を挙げることができる。これらの支持体は、ビーズやプレートなどの形状で用いることが可能である。ビーズの場合、これらが充填されたカラムなどを用いることができる。プレートの場合、マルチウェルプレート（９６穴マルチウェルプレート等）、やバイオセンサーチップなどを用いることができる。抗ケマリン抗体と支持体との結合は、化学結合や物理的な吸着などの通常用いられる方法により結合することができる。これらの支持体はすべて市販のものを用いることができる。
　抗ケマリン抗体とケマリンとの結合は、通常、緩衝液中で行われる。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、炭酸塩緩衝液、などが使用される。また、インキュベーションの条件としては、すでによく用いられている条件、例えば、４℃～室温にて１時間～２４時間のインキュベーションが行われる。インキュベート後の洗浄は、ケマリンと抗ケマリン抗体の結合を妨げないものであれば何でもよく、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０等の界面活性剤を含む緩衝液などが使用される。
　本発明のケマリン測定方法においては、ケマリンを検出したい試料の他に、コントロール試料を設置してもよい。コントロール試料としては、ケマリンを含まない陰性コントロール試料やケマリンを含む陽性コントロール試料などがある。この場合、ケマリンを含まない陰性コントロール試料で得られた結果、ケマリンを含む陽性コントロール試料で得られた結果と比較することにより、試料中のケマリンを検出することが可能である。また、濃度を段階的に変化させた一連のコントロール試料を調製し、各コントロール試料に対する検出結果を数値として得て、標準曲線を作成し、試料の数値から標準曲線に基づいて、試料に含まれるケマリンを定量的に検出することも可能である。
　抗ケマリン抗体を介して支持体に結合したケマリンの測定の好ましい態様として、標識物質で標識された抗ケマリン抗体を用いる方法を挙げることができる。
　例えば、支持体に固定された抗ケマリン抗体に試料を接触させ、洗浄後に、ケマリンを特異的に認識する標識抗体を用いて検出する。
　抗ケマリン抗体の標識は通常知られている方法により行うことが可能である。標識物質としては、蛍光色素、酵素、補酵素、化学発光物質、放射性物質などの当業者に公知の標識物質を用いることが可能であり、具体的な例としては、ラジオアイソトープ（３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、１３１Ｉなど）、フルオレセイン、ローダミン、ダンシルクロリド、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－グルコシダーゼ、ホースラディッシュパーオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ビオチンなどを挙げることができる。標識物質としてビオチンを用いる場合には、ビオチン標識抗体を添加後に、アルカリホスファターゼなどの酵素を結合させたアビジンをさらに添加することが好ましい。標識物質と抗ケマリン抗体との結合には、グルタルアルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法、過ヨウ素酸法、などの公知の方法を用いることができる。
　抗体の酵素標識法としては、ヒンジ法とノンヒンジ法の２つが挙げられるがこれに限定しない。ヒンジ法は、抗体ＩｇＧの抗原結合能を有するＦ（ａｂ’）２部分との間のヒンジ部と呼ばれる部分にあるジルスフィド結合を還元して生成するチオール基を利用してＦａｂ’と酵素分子を結合する方法である。一方、ノンヒンジ法は、抗体のいずれの反応基を利用するかは特定しないが、多くの場合、抗体のアミノ基を利用して抗体分子と酵素分子を結合する方法である。
　具体的には、抗ケマリン抗体を含む溶液をプレートなどの支持体に加え、抗ケマリン抗体を支持体に固定する。プレートを洗浄後、タンパク質の非特異的な結合を防ぐため、例えばＢＳＡ、ゼラチン、アルブミンなどでブロッキングする。再び洗浄し、試料をプレートに加える。インキュベートの後、洗浄し、標識抗ケマリン抗体を加える。適度なインキュベーションの後、プレートを洗浄し、プレートに残った標識抗ケマリン抗体を検出する。検出は当業者に公知の方法により行うことができ、例えば、放射性物質による標識の場合には液体シンチレーションやＲＩＡ法により検出することができる。酵素による標識の場合には基質を加え、基質の酵素的変化、例えば発色を吸光度計により検出することができる。基質の具体的な例としては、２，２－アジノビス（３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）、１，２－フェニレンジアミン（オルソ－フェニレンジアミン）、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）などを挙げることができる。蛍光物質の場合には蛍光光度計により検出することができる。
　本発明のケマリン測定方法の特に好ましい態様として、抗体ＩｇＧの抗原結合能とは関係のないＦｃ部分を除去し、一般的な酵素標識法記載の方法で標識をした抗体を用いる方法を挙げることができる。
　具体的には、抗ケマリン抗体を含む溶液をプレートなどの支持体に加え、抗ケマリン抗体を固定する。プレートを洗浄後、タンパク質の非特異的な結合を防ぐため、例えばＢＳＡなどでブロッキングする。再び洗浄し、試料をプレートに加える。インキュベートの後、洗浄し、ペルオキシダーゼ直接標識抗ケマリン抗体を加える。適度なインキュベーションの後、プレートを洗浄し、酵素に対応した基質を加え、基質の酵素的変化などを指標にケマリンを検出する。
　本発明のケマリン測定方法の他の態様として、ケマリンを特異的に認識する一次抗体を一種類以上、及び該一次抗体を特異的に認識する二次抗体を一種類以上用いる方法を挙げることができる。
　本発明の測定方法は、種々の自動検査装置を用いて自動化することもでき、一度に大量の試料について検査を行うことも可能である。
　本発明の診断剤は、ケマリン測定試薬を含む。ケマリン測定試薬は、前記ケマリン測定方法に必要な成分、例えば抗ケマリン抗体が含まれる。ここで診断剤には、キットも含まれる。該診断剤がＥＬＩＳＡ法に基づく場合は、抗体を固相化する担体を含んでいてもよく、抗体があらかじめ担体に結合していてもよい。該診断薬がラテックス等の担体を用いた凝集法に基づく場合は抗体が吸着した担体を含んでいてもよい。また、該診断薬は、適宜、ブロッキング溶液、反応溶液、反応停止液、試料を処理するための試薬等を含んでいてもよい。
　以下、実施例により、本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されるものでない。
参考例１
　３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞を用いて脂肪分化とともに発現が増強する分泌蛋白をコードする遺伝子としてディファレンシャルディスプレー法を用いて検索しケマリンを同定した。
　分化誘導開始時、誘導２日後、６日後、９日後の３Ｔ３－Ｌ１脂肪細胞よりＴｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出した。このＲＮＡ　１５μｇを電気泳動し、マウスケマリン特異的プローブを用いてノザンブロッティングを行ったところ、脂肪分化とともに強い発現増強を認めた（図１）。
　マウス組織より抽出したＴｏｔａｌ　ＲＮＡ　１５μｇを電気泳動し、マウスケマリン特異的プローブを用いてノザンブロッティングによって解析したところ、肝臓に加えて脂肪組織で強い発現を認めた（図２）。
　３Ｔ３－Ｌ１培養上清　１０μＬ及びリコンビナントヒトケマリン１５ｎｇを用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、ヒトケマリン特異的ポリクローナル抗体でイミュノブロッティングを行った。ケマリンは３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞培養上清中に分泌されており（図３）、脂肪細胞より分泌されるアディポカインのひとつであることが明らかになった。
実施例１
（１）リコンビナントヒトケマリン作成方法
　ヒト脂肪組織ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）よりＰＣＲ法によりヒトケマリン遺伝子を増幅し、発現ベクターｐＥＴ１４ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にクローニングした。ヒトケマリン遺伝子をクローニングしたｐＥＴ１４ｂベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株（タカラバイオ社製）に、形質転換し、リコンビナントヒトケマリンを発現する大腸菌を得た。この大腸菌を培養し、その抽出液をＨｉｓＴｒａｐ　ＨＰカラム（ＧＥヘルスケアライフサイエンス社製）を用いて精製し、リコンビナントヒトケマリンを得た。
（２）マウス抗リコンビナントヒトケマリンモノクローナル抗体作成法
　このリコンビナントヒトケマリンをＴｉｔｅｒＭａｘ　Ｐｒｏ（ＴｉｔｅｒＭａｘ社）と混合し、乳化後、マウスに１４日毎に５回皮下投与した。
　このマウスから脾臓を取り出し脾臓中の免疫細胞とマウスミエローマ細胞　Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１と細胞融合した。
　細胞融合は、ミエローマ細胞に対して、前記免疫細胞を５倍量となるようにＲＰＭＩ１６４０培養液中でよく混合し、予め３７℃に加温した平均分子量１５００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を５０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）を形成した。
　ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン）を含むＲＰＭＩ１６４０培地で１週間培養した。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニング及び単一クローニングを行った。
　目的とする抗体のスクリーニング及び単一クローニングは、以下に示す方法で行った。９６ウェルのマイクロタイタープレートに免疫抗原として用いたリコンビナントヒトケマリンを結合させ、ハイブリドーマの培養上清と反応させ、担体を洗浄した後に西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体を反応させることにより、培養上清中にヒトケマリンと反応する抗体が含まれるかどうか決定した。目的とする抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法によりクローニングした。
　このハイブリドーマを、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、３７℃、５％二酸化炭素下で培養し、培養上清を回収した。この培養上清を硫酸アンモニウムによる塩析法により濃縮した。濃縮した溶液をリン酸緩衝生理食塩水で溶液交換した後、プロテインＡカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）及びＳｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ－３００ゲル濾過カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて、マウス抗ヒトケマリンモノクローナル抗体を精製した。
　ここで得られたハイブリドーマは、Ｄ０１０１又はＤ０１０２と命名し、２００８年１２月９日に（独）産業技術総合研究所　特許生物寄託センター（日本国　〒３０５－８５６６　茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６）に、Ｄ０１０１をＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１０６９として、Ｄ０１０２をＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１０７０としてそれぞれ寄託した。
（３）ウサギ抗ヒトケマリンポリクローナル抗体作成法
　リコンビナントヒトケマリンをフロイント完全アジュバントと混合し、乳化後、ウサギに１４日毎に５回皮下投与した。９６ウェルのマイクロタイタープレートに免疫抗原として用いたリコンビナントヒトケマリンを結合させ、免疫感作したウサギから採取した抗血清と反応させ、担体を洗浄した後に酵素標識抗ウサギＩｇＧ抗体を反応させることにより、抗血清中にヒトケマリンと反応する抗体が含まれることを確認した。このように血清中に抗ヒトケマリン抗体レベルが上昇するのを確認した後に、ウサギ血清を採取しプロテインＡカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）及びＳｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ－３００ゲル濾過カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いてウサギ抗ヒトケマリンポリクローナル抗体（ＰｏＡｂ）を精製した。
（４）ケマリン濃度の測定
　患者等から採取した血清を、緩衝液を用いて１００倍に希釈し、希釈検体溶液とした。マウス抗ヒトケマリンモノクローナル抗体Ｄ０１０２を固相した９６ウェルのマイクロタイタープレートに、この希釈検体溶液と予め濃度を定めたリコンビナントヒトケマリンを含む標準液を添加した後、２時間静置し溶液中のケマリンをウェル上のマウス抗ヒトケマリンモノクローナル抗体に結合させた。ウェルを洗浄後、ビオチン標識抗ヒトケマリンポリクローナル抗体液を添加した後、１時間静置した。ウェルを洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン溶液を添加した後、１時間静置した。３，３’，５，５’－テトラメチルベンシジン及び過酸化水素を含む基質液を加えて１０分間発色させ、その吸光度を４５０ｎｍで測定し、同時に測定した標準液の吸光度から検体中のヒトケマリン濃度を算出した。
　健常者１７２例、２型糖尿病患者１７０例についての血中ケマリン濃度の測定結果を表１に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示したように、糖尿病患者の血中ケマリン濃度は、健常者と比較して統計的に有意に低値を示した。このことから、血中ケマリン濃度を測定することは、糖尿病診断の指標として有用である。
実施例２
　ウサギ抗ヒトケマリンポリクローナル抗体（ＰｏＡｂ）及びマウス抗ヒトケマリンモノクローナル抗体（Ｄ０１０１又はＤ０１０２）の３種類の抗体から２種類をそれぞれ組み合せて、サンドイッチＥＬＩＳＡ測定系を構築し、リコンビナントヒトケマリンを標準品として、検出感度を比較した。
　すなわち、１次反応としてリコンビナントヒトケマリンを５０００ｐｇ／ｍＬから２倍段階希釈し、あらかじめ抗体を固相したプレートに２５℃、２時間静置にて反応させた。次いで、２次反応としてビオチン標識した各抗体１ｕｇ／ｍＬとなるように調製し、２５℃、２時間静置にて反応させた。次に３次反応として、ＨＲＰ標識ストレプトアビジンをブランクにおける吸光度が０．０５以下となるように調製し、２５℃、１時間静置にて反応させた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　その結果、表２に示すように、いずれの組み合せでもケマリンの測定が可能であった。このうち、標識抗体としてＤ０１０２を用いた測定系は、ポリクローナル抗体を標識抗体とした場合に比べて１００倍程度高感度であった。
実施例３
　固相抗体としてＤ０１０１を用い、標識抗体としてＰｏＡｂ及びＤ０１０２をそれぞれ用いたＥＬＩＳＡ測定系にて、ヒト血漿又は血清２０例をそれぞれ測定した。その結果、Ｒ≧０．６以上の良好な相関を示した（図４及び図５）。
　モノクローナル抗体測定系／評価キットの回帰直線の傾きが１．７７～２．０４となり、モノクローナル抗体測定系において高値になる傾向が見られた。
　固相抗体としてＤ０１０１を用い、標識抗体としてＰｏＡｂ及びＤ０１０２をそれぞれ用いたＥＬＩＳＡ測定系にて、ヒトＰｏｏｌ血清をゲル濾過したフラクションを測定した結果、両測定系は、ほぼ同一のフラクションを認識していることが判明した（図６）。

Claims (6)

  1. 　試料中のケマリン濃度を測定することを特徴とする糖尿病の診断方法。
  2. 　ケマリン濃度の測定が、免疫学的方法による測定である請求項１記載の診断方法。
  3. 　糖尿病が２型糖尿病である請求項１又は２記載の診断方法。
  4. 　糖尿病の診断が、糖尿病自体の診断及び／又は糖尿病治療経過の診断である請求項１～３のいずれか１項記載の診断方法。
  5. 　試料が、血液、血清又は血漿である請求項１～４のいずれか１項記載の診断方法。
  6. 　ケマリン濃度測定試薬を含有する糖尿病診断剤。
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