KR101544085B1

KR101544085B1 - 공복 혈당 장애 진단용 마커로서 ｇｄｆ15 및 이를 포함하는 공복 혈당 장애 진단키트

Info

Publication number: KR101544085B1
Application number: KR1020130077393A
Authority: KR
Inventors: 송민호; 구본정; 김현진; 홍준화; 이주희; 정효균; 김성중; 이성은; 최민정
Original assignee: 충남대학교산학협력단
Priority date: 2013-07-02
Filing date: 2013-07-02
Publication date: 2015-08-12
Also published as: KR20150004206A

Abstract

본 발명은 공복 혈당 장애(impaired fasting glucose; IFG)의 진단용 마커로 성장 분화 인자 15(growth differentiation factor 15; GDF15) 및 상기 진단용 마커를 포함하는 공복 혈당 장애의 진단 키트에 관한 것으로, 구체적으로 정상 혈당군, 공복 혈당 장애군 및 당뇨군을 선별하여, 상기 세 군의 대사관련 인자 및 혈중 GDF15 농도를 측정한 후, 공복 혈당 장애 발생과의 연관성을 분석한 결과, GDF15는 공복 혈당 장애 발생과 유의적인 연관성을 가지는 것을 확인함으로써, 상기 GDF15를 공복 혈당 장애의 진단에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

공복 혈당 장애 진단용 마커로서 ＧＤＦ15 및 이를 포함하는 공복 혈당 장애 진단키트{Growth differentiation factor 15 as marker for impaired fasting glucose and Diagnosis kit for impaired fasting glucose including the same}

본 발명은 공복 혈당 장애(impaired fasting glucose; IFG)의 진단용 마커로서 성장 분화 인자 15(growth differentiation factor 15; GDF15) 및 상기 진단용 마커를 포함하는 공복 혈당 장애의 진단 키트에 관한 것이다.

최근 생활 양식 및 식생활의 변화로 당뇨 환자가 증가하는 추세에 있다. 한국인의 당뇨병 발병률은 1970 년도에 1.5 % 에 불과하였으나, 1995 년에는 10.1 %로 현저히 증가하였고, 이러한 증가 추세는 노인 인구가 증가하는 노령화 현상과 함께 계속 될 것으로 전망되고 있다(Lee KY et. al, Diabetes 8(1): 5-14, 1984; Cho NH et. al, Diabetes 20(1): 10-13, 1996; 당뇨병 교육 지침서, 대한당뇨학회, 1999).

당뇨병은 인슐린 호르몬의 부족으로 혈액 내 포도당의 농도가 증가되어 눈, 신장 및 신경조직의 손상뿐만 아니라 중풍, 협심증, 심근경색증 및 말초혈관질환 등의 합병증을 초래하여 이로 인한 사망률을 증가시키고, 삶의 질을 저하하는 만성질환이다. 당뇨병 환자의 혈당 관리를 위하여 식사요법, 운동요법, 경구 혈당강하제 및 인슐린 요법 등이 사용되고 있으나 아직 당뇨병을 완치하는 치료방법이 개발되지 않았다. 따라서 당뇨병 전단계 및 당뇨병을 조기에 진단하여 체계적인 치료 및 관리로 병의 진행을 차단하는 것이 강조되고 있다(당뇨병의 진료지침, 대한당뇨학회, 1990; NIH Consensus development conference on diet and exercise in NIDDM, Diabetes Care 10(5): 639-644, 1987).

당뇨병의 전단계는 내당능 장애(impaired glucose telerance; IGT) 및 공복 혈당 장애(impaired fasting glucose; IGF)로 구분되며, 서로 겹치는 부분이 있으나 다른 발생 기전에서 비롯된다. 75 g 경구 당부하 검사(75g Oral Glucose Tolerance Test)시 공복 혈당은 100 ㎎/㎗ 이하이고, 경구 당부하 2 시간 후 혈당이 140 내지 200 ㎎/㎗일 때 내당능 장애로 진단하며, 공복 혈당은 100 내지 126 ㎎/㎗이고, 경구 당부하 2 시간 후 혈당이 140 ㎎/㎗ 미만일 때 공복 혈당 장애로 진단할 수 있다.

내당능 장애는 중등도 이상의 인슐린 저항성을 보여 인슐린 분비의 1기 및 2기 분비 장애가 동반되며 후향적 관찰시 1 년에 10% 이상의 환자들이 제 2형 당뇨병으로 진행될 뿐만 아니라, 내당능 장애 시기에 이미 심혈관의 위험도가 높은 것으로 알려져 있다. 이에 비해, 공복 혈당 장애는 간에서 중등도의 인슐린 저항성이 관찰되며, 인슐린 분비 1기의 장애를 보이나, 근육의 인슐린 감수성은 정상적인 경향을 보이는 것으로 나타난다. 공복 혈당 장애에서 당뇨병으로의 진행률에 대한 자료는 충분히 보고되어 있지 않아 연구에 따라 다양하지만, 일반적으로 정상 혈당군보다는 높고 내당능 장애군보다는 낮은 진행률을 나타내며, 심혈관 위험도와의 관련성 역시 다양하게 보고되고 있다.

현재까지 당뇨병에 대한 가장 근본적인 치료는 당뇨병 전단계의 환자를 조기 진단하여 당뇨병으로의 진행을 예방하는 것이며, 내당능 장애보다 위험도가 낮은 공복 혈당 장애 환자를 조기에 선별하여 조절하는 것이 중요하게 여겨지고 있다. 당뇨병으로 진행된 후에 병의 중증도를 판별하기 위한 지표들은 다양하게 보고되고 있으나, 당뇨병 전단계의 진행을 판별하기 위한 지표로는 명확하게 보고된 바가 없으며, 공복 혈당(Fasting Blood Glucose) 또는 당화혈색소(Hemoglobin A1c; HbA1c) 등 기존에 사용되어오는 지표들의 임계점을 낮추는 방법이 대부분으로, 현재까지 그 효용성에 대한 많은 논란이 제기되고 있다. 공복 혈당 측정은 측정 방법이 쉽다는 장점이 있으나, 8 시간 이상 금식 상태 이후 측정하여야 효용성이 있으며, 식후 2 시간 후의 혈당 측정치보다 심혈관 질환에 대한 연관성이 적어 단독으로 임상적인 의미를 부여하는데 제한이 된다는 단점을 가진다. 당화혈색소 측정은 측정 시기에 영향을 받지 않고, 2 내지 3 달 동안의 평균 혈당을 반영하므로, 당뇨병 및 당뇨병 전단계로의 진행을 예측하는 생물학적 지표로서 효용성이 입증되어있다. 그러나, 혈색소 수치에 따라 측정값의 변동이 가능하며, 변동된 값을 보정할 수 있는 기준이 정립되어 있지 않으므로, 표준화된 값을 적용하는데에 제한된다는 단점을 가진다. 이 외에도, 75g 경구 당부하 검사는 당뇨를 진단할 수 있는 지표로서 현재까지 당뇨병 및 당뇨병 전단계 환자를 진단 및 구분하는데 유용하게 사용되고 있는 방법이다. 그러나, 검사를 시행하는 데에 2 시간 이상이 소요된다는 단점이 있어, 외래에서 쉽게 측정하는데에 제한을 가진다. 따라서, 기존에 사용하는 방법 외에 당뇨병 전단계의 환자를 조기에 진단할 수 있는 새로운 생물학적 지표의 필요성이 요구되고 있다.

성장 분화 인자 15(growth differentiation factor 15; GDF15)는 베타-형질전환 성장 인자(transforming growth factor-β)군에 속하는 단백질로, 대식세포-억제 사이토카인-1(MIC-1)로서 처음 밝혀졌으며, 후에 태반 형질전환 성장인자-β로서도 명명되었다(Bootcov 1997, Proc Natl Acad Sci 94:11514-11519; Tan 2000, Proc Natl Acad Sci 97:109-114). 현재까지 생체 내 명확한 역할이 밝혀진 바는 없으나, 스트레스 상황 또는 염증성 반응에 작용하는 것으로 여겨지고 있으며, 당뇨병 모델에서도 GDF15가 증가하는 것으로 보고되어있다. 그러나, 당뇨병 전단계에 속하는 공복 혈당 장애 환자에서의 변화는 보고된 바가 없으며, 병리 생리적인 면에서 인슐린 저항성을 일으키는 소포체 스트레스 또는 염증성 반응의 정도가 심해지면서 당뇨병이 진행되므로, 당뇨병 전단계에서도 상기 반응들이 나타나며 따라서 이를 측정할 수 있는 생물학적인 지표로 GDF15의 가능성이 제기되고 있다.

따라서, 본 발명자들은 공복 혈당 장애를 진단할 수 있는 새로운 생물학적인 지표를 규명하기 위해 노력한 결과, 공복 혈당 장애 환자의 혈중 GDF15 농도는 정상 혈당군의 혈중 GDF15 농도보다 2 배 상승하여 당뇨 환자와 비슷한 수준을 나타내며 통계적인 연관성을 가지므로, 상기 GDF15는 공복 혈당 장애를 진단할 수 있는 진단용 마커에 유용하게 이용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 공복 혈당 장애(impaired fasting glucose; IFG)의 진단용 마커로 성장 분화 인자 15(growth differentiation factor 15; GDF15) 및 상기 진단용 마커를 포함하는 공복 혈당 장애의 진단 키트를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

1) 실험군 및 정상 대조군으로부터 각각 시료를 분리하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 시료로부터 성장 분화 인자 15(growth differentiation factor 15; GDF15)의 농도를 측정하는 단계; 및

3) 상기 단계 2)의 GDF15 농도가 정상 대조군보다 높은 경우, 공복 혈당 장애(Impaired Fasting Glucose; IFG)로 판정하는 단계를 포함하는 공복 혈당 장애의 정보를 제공하기 위한 시료 내 GDF15 농도 측정 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 GDF15 또는 이의 단편에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 포함하는 공복 혈당 장애 진단용 키트를 제공한다.

아울러, 본 발명은 GDF15 또는 이의 단편에 특이적으로 결합할 수 있는 생물 분자가 고형 기질에 집적된 공복 혈당 장애 진단용 바이오칩을 제공한다.

본 발명의 성장 분화 인자 15(growth differentiation factor 15; GDF15) 농도는 정상 대조군에 비해 공복 혈당 장애(Impaired Fasting Glucose; IFG) 환자에서 당뇨 환자와 비슷하게 높은 수준으로 증가되므로, 상기 GDF15를 공복 혈당 장애의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 정상 혈당군, 공복 혈당 장애(Impaired Fasting Glucose; IFG)군 및 당뇨군의 기초적인 특성을 비교한 표를 나타내는 도이다.
도 2는 정상 혈당군, 공복 혈당 장애군 및 당뇨군의 혈중 성장 분화 인자 15(growth differentiation factor 15; GDF15)의 농도를 비교한 그래프를 나타내는 도이다.
도 3은 연령, 체질량 지수, HOMA-IR 및 혈중 GDF15 농도가 가지는 공복 혈당 장애군과의 관련성을 분석하기 위한 로지스틱 회귀분석(logistic regression)을 나타내는 도이다.
도 4는 GDF15에 따른 공복 혈당 장애군 발생 예측에 대한 ROC 곡선(receiver operating characteristic curve)을 나타내는 도이다. 도 4A는 전체 실험군을 대상으로 한 ROC 분석을 나타내며, 도 4B는 남성 실험군을 대상으로 한 ROC 분석을 나타내고, 도 4C는 여성 실험군을 대상으로 한 ROC 분석을 나타낸다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은

상기 단계 1)의 시료는 혈액, 혈청 및 혈장으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 단계 2)의 GDF15는 서열 번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 단계 2)의 측정은 GDF15에 특이적인 항체 및 시료 내 GDF15의 항원-항체 반응을 측정하는 방법 또는 항원-항체 복합체에 검출제를 처리한 후 검출체의 양을 측정하는 방법으로 이루어지는 것이 바람직하고, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 비색법(colorimetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment), 섬광계수법(scintillation counting method) 및 조직면역염색법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 정상 혈당군, 공복 혈당 장애군 및 당뇨군을 선별하였고, 상기 세 군의 대사관련 인자를 측정하여 비교한 결과, 공복 혈당 장애군의 인슐린 저항성의 지표로 사용되는 인슐린 내성 검사를 위한 항상성 모델(Homeostasis model for assessment of insulin resistance; HOMA-IR) 측정값이 정상 혈당군에 비해 2 배 이상 증가하였으나, 당뇨군에서 공복 혈당 장애군에 비해 2 배 이상 증가한 것을 확인하였다(도 1 참조).

또한, 본 발명자들은 상기 세 군의 혈중 GDF15 농도를 측정하여 비교한 결과, 공복 혈당 장애군의 GDF15 농도는 당뇨군과 비슷한 수준을 보이면서 정상 혈당군에 비해 약 2 배 증가하는 것을 확인하였다(도 1 및 도 2 참조).

또한, 본 발명자들은 상기 HOMA-IR 측정값 및 혈중 GDF15 농도가 가지는 공복 혈당 장애 발생과의 연관성 및 기준점을 분석하기 위해, 로지스틱 회귀분석(logistic regression) 및 ROC 곡선(receiver operating characteristic curve)를 수행한 결과, HOMA-IR에 비해 GDF15 농도가 공복 혈당 장애 발생과 유의한 연관성을 가지며, 전체 실험군을 대상으로 하였을 때 420 pg/㎖의 기준점(cut-off value), 76 %의 민감도(sensitivity) 및 60.2 %의 특이도(specitivity)를 나타내는 것을 확인하였다(도 3 및 도 4).

따라서, 본 발명의 GDF15는 공복 혈당 장애 발생과 유의적인 연관성을 가지는 진단용 마커로 사용할 수 있으므로, 상기 GDF15를 공복 혈당 장애의 판정에 유용하게 사용될 수 있다.

상기 GDF15는 서열 번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 GDF15는 공복 혈당 장애 발생과 유의적인 연관성을 가지는 진단용 마커로 사용할 수 있으므로, GDF15 또는 이의 단편에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 포함하는 공복 혈당 장애 진단용 키트는 공복 혈당 장애의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

상기 항체는 GDF15의 다클론 항체 및 단클론 항체를 모두 포함할 수 있으나, 항원과 보다 특이적으로 결합할 수 있는 단클론 항체가 바람직하다.

다클론 항체는 당업자에 알려진 종래 방법에 따라 면역원(antigen)으로 GDF15 단백질 또는 그의 단편을 외부 숙주에 주사함으로써 제조될 수 있다. 이러한 외부 숙주로는 마우스, 랫트, 양, 토끼와 같은 포유동물을 예로 들 수 있으며, 면역원은 일반적으로 항원성을 증가시키기 위한 보조제(adjuvant)와 함께 근육내, 복강내 또는 피하주사 등의 방법으로 투여되어 외부 숙주를 면역화시킨다. 면역화된 외부 숙주로부터 정기적으로 혈청을 채취하여 향상된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수거하거나 이로부터 항체를 분리, 정제하여 GDF15에 특이적인 다클론 항체를 제조할 수 있다.

단클론 항체는 당업자에 알려진 융합(fusion)에 의한 불멸화된 세포주 생성방법(Kohler G et al ., Nature, 256:495-497, 1975)을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법을 간략히 설명하면, 먼저 순수한 GDF15 단백질 또는 그의 단편으로 마우스를 면역시키거나, 이의 펩티드를 합성하여 소혈청 알부민과 결합시켜 마우스에 면역시킨다. 면역이 된 마우스로부터 분리한 항체-생산 B 임파구를 인간 또는 마우스의 골수종세포와 융합하여 불멸화된 하이브리도마 세포를 생성한다. 이어, 효소면역분석법(ELISA; Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)으로 하이브리도마 세포의 단클론 항체의 생성 여부를 조사하여 양성 클론을 선발하고 이를 배양한 후 항체를 분리, 정제하거나 쥐의 복강에 주입한 후 복수를 채취하여 GDF15에 특이적인 단클론 항체를 제조할 수 있다.

또한, 본 발명의 GDF15 단백질의 검출에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')₂ 및 Fv 등이 있다.

상기 GDF15 또는 이의 단편에 특이적으로 결합할 수 있는 항체는 세척이나 복합체의 분리 등 그 이후의 단계를 용이하게 하기 위해 고형 기질(solid substrate)에 결합될 수 있다. 고형 기질은 예를 들어 합성수지로 제작된 웰플레이트, 니트로셀룰로오스, 유리기판, 금속기판, 유리섬유, 미세구체 및 미세비드 등이 있다. 또한, 상기 합성수지에는 폴리에스터, 폴리비닐, 폴리염화비닐, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, PVDF 및 나일론 등이 있다. 또한, 개체로부터 수득된 시료를 고형 기질에 결합된 GDF15 또는 이의 단편에 특이적으로 결합할 수 있는 항체와 접촉시키는 경우, 시료는 항체와 접촉 전에 알맞은 정도로 희석될 수 있다.

본 발명의 키트는 추가로 상기 GDF15 또는 이의 단편에 특이적으로 결합할 수 있는 항체에 특이적으로 결합하는 검출체를 포함할 수 있다. 상기 검출체는 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드 등으로 표지한 접합체(conjugate)일 수 있고, 바람직하게는 상기 GDF15 또는 이의 단편에 특이적으로 결합할 수 있는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 2차 항체일 것이다. 예를 들어, 상기 발색효소는 퍼록시다제(peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase) 또는 산성 포스파타제(acid phosphatase)[예: 양고추냉이 퍼록시다제(horseradish peroxidase)]일 수 있고; 형광물질인 경우, 콜로이드 골드(Coloid gold), 플루오레신카복실산(FCA), 플루오레신 이소티오시아네이트(FITC), RITC(Rhodamine-B-isothiocyanate), 플루오레신 티오우레아(FTH), 7-아세톡시쿠마린-3-일, 플루오레신-5-일, 플루오레신-6-일, 2',7'-디클로로플루오레신-5-일, 2',7'-디클로로플루오레신-6-일, 디하이드로테트라메틸로사민-4-일, 테트라메틸로다민-5-일, 테트라메틸로다민-6-일, 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸 또는 4,4-디플루오로-5,7-디페닐-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸 등을 사용하는 것이 가능하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 키트는 상기 항원항체 복합체의 항원항체 반응을 측정하는 방법 또는 상기 항원항체 복합체에 검출체를 처리한 후 검출체의 양을 측정함으로써 유방암을 진단할 수 있다. 상기 항원항체 반응으로서 효소면역측정법 (ELISA), 면역침강법, 형광면역법, 효소기질발색법, 항원항체응집법 등을 들 수 있고, 검출체의 양 측정이나 존재 검출은 발색, 형광, 발광, 화학발광(chemiluminescence), 흡광도, 반사 또는 투과를 통해 이루어질 수 있다.

상기 검출체의 양을 탐색하는 방법으로는 초고속 스크리닝(high throughput screening, HTS) 시스템을 이용하는 것이 바람직하고, 여기에는 검출체에 결합된 발색효소의 발색을 유도하는 기질을 처리하여 발색반응을 측정하는 방법; 검출체로 형광물질이 부착되어 형광을 검출함으로써 수행되는 형광법 또는 검출체로 방사선 동위원소가 부착되어 방사선을 검출함으로써 수행되는 방사선법; 검출체의 표지 없이 표면의 플라즈몬 공명 변화를 실시간으로 측정하는 SPR(surface plasmon resonance) 방법 또는 SPR 시스템을 영상화하여 확인하는 SPRI(surface plasmon resonance imaging) 방법을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

예를 들어 발색을 유도하는 기질은 발색효소에 따라 선택하여 사용하는 것이 바람직하며, TMB (3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS [2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)], OPD (o-phenylenediamine) 등을 사용할 수 있다. 이때, 발색제 기질은 완충용액(0.1 M NaAc, pH 5.5)에 용해된 상태로 제공되는 것이 더욱 바람직하다. TMB와 같은 발색기질은 검출체에 결합된 발색효소에 의해 분해되어 발색 침적체를 생성하고 그 발색 침적체의 침적 정도를 육안으로 확인함으로써 GDF15 단백질의 존재 유무를 검출한다. 또한, 상기 형광법은 형광 스캐너 프로그램을 이용하여 상기 형광물질로 라벨링된 검출체를 스포팅하여 신호를 확인하는 방법으로, 이 방법을 적용하여 결합 정도를 확인할 수 있다. 상기 SPR 시스템은 형광법과는 달리 시료를 형광물질로 표지할 필요가 없이 항체의 결합 정도를 실시간으로 분석하는 것이 가능하나 동시다발적인 시료 분석이 불가능하다는 단점이 있다. SPRI의 경우에는 미세정렬 방법을 이용하여 동시다발적인 시료 분석이 가능하지만 탐지 강도가 낮은 단점이 있다.

본 발명의 키트는 상기 항원항체 결합 반응 및 검출체의 결합반응 후, 남은 물질들을 제거하기 위한 세척액을 추가로 포함할 수 있다. 상기 세척액은 인산염 완충용액, NaCl 및 트윈 20(Tween 20)을 포함하는 것이 바람직하며, 0.02 M 인산염 완충용액, 0.13 M NaCl, 및 0.05% 트윈 20(Tween 20)으로 구성된 완충용액(PBST)이 더욱 바람직하나, 이에 제한되지 않는다. 세척액은 항원항체 결합반응 후 항원항체 결합체에 검출체를 반응시킨 다음 적당량을 고정체에 가하여 3 내지 6회 세척한다. 반응 정지용액은 바람직하게는 황산 용액(H₂SO₄)이 사용될 수 있으나, 이이 제한되지는 않는다.

본 발명의 키트는 GDF15 표준 항원을 포함하는 양성 대조군과 상기 항원이 주입되지 않은 동물의 항혈청을 포함하는 음성 대조군을 추가적으로 포함할 수 있다.

상기 바이오칩은 단백질칩 또는 핵산 어레이인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 생물 분자는 저분자 화합물, 리간드(ligand), 앱타머(aptamer), 펩티드(peptide), 폴리펩티드(polypeptide), 특이적 결합 단백질, 고분자 물질 및 항체 등으로 이루어진 군으로부터 선택되며 상기 GDF15에 특이적으로 결합할 수 있는 물질이면 무엇이든 사용 가능하며, 항체 또는 앱타머를 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 고형 기질은 플라스틱, 유리, 금속 및 실리콘으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 그 표면에 상기 항체를 부착시키기 위해 화학 처리되거나 링커 분자가 결합하여 있을 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 GDF15는 공복 혈당 장애 발생과 유의적인 연관성을 가지는 진단용 마커로 사용할 수 있으므로, GDF15 또는 이의 단편에 특이적으로 결합할 수 있는 생물 분자가 고형 기질에 집적된 공복 혈당 장애 진단용 바이오칩은 공복 혈당 장애의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

상기 바이오칩의 기판에 코팅된 활성기는 상기 생물 분자에 결합하는 역할을 하며, 아민기(amine group), 알데하이드기(aldehyde group), 카르복실기(carboxyl group) 및 티올기(thiol group)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 당업자에게 단백질 분자를 기판에 결합할 수 있는 활성기로 알려진 모든 활성기가 사용 가능하며, 이제 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 정상 혈당군 , 공복 혈당 장애( Impaired Fasting Glucose ; IFG )군 및 당뇨군의 선별

본 발명의 대상이 되는 실험군를 선별하기 위하여, 건강 검진 대상자로부터 정상 혈당군, 공복 혈당 장애군, 및 당뇨군을 선별하여 구분하였다.

구체적으로, 2012 년 8 월부터 12 월 까지 충남대학병원에서 건강 검진을 시행한 환자들을 중에서 이미 당뇨 진단을 받은 환자를 제외한 151 명 대상군에게서 연구 참여의 동의를 받았다. 대상군의 공복 혈당 수치 및 경구 당부하 검사를 통해 25 명의 환자를 공복혈당 장애군으로 분류하였고, 당뇨군으로는 상기 대상군에서 새로이 당뇨 진단을 받은 2 명의 환자 및 제 2형 당뇨병으로 진단을 받아 외래에서 진료를 받는 71 명의 환자를 대상으로 하였다. 상기 대상군에서 내당능 장애로 진단을 받은 8 명의 환자는 통계적인 의미가 부족하므로 본 발명에서 제외하였다.

그 결과, 본 발명에서 대상으로 하는 정상 혈당군 116 명, 공복 혈당 장애군 25 명, 및 당뇨군 73 명을 선별하였다.

< 실시예 2> 정상 혈당군 , 공복 혈당 장애군 및 당뇨군의 대사관련 인자 비교

정상 혈당군, 공복 혈당 장애군 및 당뇨군의 기초적인 특성을 비교하기 위하여, 상기 세 군의 대사관련 인자를 측정하였다.

구체적으로, 상기 <실시예 1>에서 선별한 정상 혈당군, 공복 혈당 장애군 및 당뇨군에 대해 8 시간 이상 공복을 유지한 후, 혈액을 채취하였다. 혈당(glucose)은 에틸렌디아민사아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid; EDTA)를 포함하는 튜브에 혈장을 첨가한 후, TBA-200FR NEO (TOSHIIBA 사)를 이용하여 헥소키나아제(Hexokinase)법으로 측정하였고, 인슐린(insulin)은 SST 튜브에 저장된 혈장을 COAT-A-COUNT 인슐린 키트(DPC사)를 이용하여 방사면역측정법(radioimmunoassay; RIA)으로 측정하였다. 지질 성분에 대해 측정하기 위하여, EDTA 튜브에 저장된 혈장을 TBA-200FR NEO(TOSHIBA 사)를 이용하여, 총 콜레스테롤(cholesterol)은 효소발색법(Enzymatic colorimetry)으로, 저비중리포단백질(low density lipoprotein; LDL)은 선택적 가용화(selective solubilization)법으로, 고비중리포단백질(high density lipoprotein; HDL)은 화학적 변형 효소(chemically modified enzyme)법으로, 중성 지방(triglyceride)은 글리세롤 영점(glycerol blank)을 사용한 인산글리세롤산화효소(glycerol phosphate oxidase;GPO)법으로 측정하였다. 백혈구(White Blood Cell; WBC) 및 혈색소(hemoglobin)는 EDTA를 포함하는 튜브에 저장된 혈장을 ADVIA 2120 헤마톨로직 시스템(Hematologic System)을 이용하여 백혈구 수는 유동세포계수법(flowcytometry)으로, 혈색소는 시안화물이 없는 헤모글로빈(cyanide free hemoglobin)법으로 측정하였다. 아스파테이트 아미노기전달효소(aspartate aminotransferase; AST) 및 알라닌 아미노기전달효소(alanine aminotransferase; ALT)는 EDTA 튜브에 저장된 혈장을 TBA-200FR NEO (TOSHIBA 사)를 이용하여 IFCC UV 법으로 측정하였다. C 반응성 단백 시험(c-reactive protein; CRP)은 TBA-200FR NEO (TOXHIBA 사)를 이용하여 광도 라텍스 응집반응법(photometric latex agglutination)으로 측정하였다. 체질량 지수(Body Mass Index; BMI)는 하기 [수학식 1]을 사용하여 계산하였고, 인슐린 내성 검사를 위한 항상성 모델(Homeostasis model for assessment of insulin resistance; HOMA-IR)은 하기 [수학식 2]를 사용하여 계산하였다.

그 결과, 도 1에서 나타난 바와 같이 정상 혈당군, 공복 혈당 장애군 및 당뇨군의 평균 연령은 각각 45.9 세, 48.8 세 및 55.9 세(p<0.001)이며, BMI도 24.5, 25.9 및 26.2 kg/m²(p=0.008)로 당뇨군에서 높게 나타난 것을 확인하였다. 인슐린 저항성의 지표인 HOMA-IR은 각각 0.73, 1.58 및 3.51(p<0.0001)로 공복 혈당 장애군에서 정상 혈당군에 비해 2 배 이상 증가하였으나, 정상 범위에서 나타났으며, 당뇨군에서 공복 혈당 장애군에 비해 2 배 이상 증가한 것을 확인하였다(도 1).

< 실시예 3> 정상 혈당군 , 공복 혈당 장애군 및 당뇨군의 성장 분화 인자( growth differentiation factor 15; GDF15 ) 비교

정상 혈당군, 공복 혈당 장애군 및 당뇨군의 GDF15 정도를 비교하기 위하여, 상기 세 군의 혈중 GDF15 농도를 ELISA를 통해 측정하였다.

구체적으로, 상기 <실시예 1>에서 선별한 정상 혈당군, 공복 혈당 장애군 및 당뇨군에 대해 8 시간 이상 공복을 유지한 후, 상기 <실시예 2>와 동일한 방법으로 혈액을 수득하여 혈장을 분리한 후, 혈장 50 ㎕을 이용하여 인간 GDF-15 검출용Quantikine ELISA 키트(RnDSystems 사; Cat No. DGD150)를 사용하여 혈중 GDF15 농도를 측정하였다.

그 결과, 도 1 및 도 2에서 나타난 바와 같이 정상 혈당군, 공복 혈당 장애군 및 당뇨군의 혈중 GDF15의 농도는 414.35, 757.51 및 852.70 pg/㎖(p<0.001)로 당뇨군에서 가장 높았고, 공복 혈당 장애군에서 당뇨군과 비슷한 수준을 보이면서 정상 혈당군에 비해 약 2 배 증가하여, 혈당 조절 장애 정도의 지표로 HOMA-IR 보다 GDF15가 민감하게 사용될 수 있음을 확인하였다(도 1 및 도 2). 혈중 GDF15 농도는 성별에 따라 유의한 차이를 보였으며, 남성에서 702.87±519.42 pg/㎖이고 여성에서 505.15±398.35 pg/㎖으로(p<0.0006) 남성에서 높게 관찰되는 것을 확인하였다.

< 실시예 4> 대사관련 인자 및 GDF15 의 공복 혈당 장애와의 연관성 분석

상기 <실시예 2> 및 <실시예 3>에서 분석한 정상 혈당군, 공복 혈당 장애군 및 당뇨군의 대사관련 인자 및 GDF15 정도가 가지는 공복 혈당 장애 발생과의 연관성을 분석하기 위하여, 로지스틱 회귀분석(logistic regression)을 수행하였다.

구체적으로, 상기 <실시예 2>에서 측정한 정상 혈당군, 공복 혈당 장애군 및 당뇨군의 연령, 체질량지수 및 HOMA-IR 및 상기 <실시예 3>에서 측정한 혈중 GDF15의 농도를 SPSS, ver 20 프로그램(IBM 사)을 사용하여 공복 혈당 장애와의 연관성을 분석하였다. 당뇨군 및 공복 혈당 장애군을 종속 변수로, 연령, 공복 혈당, 인슐린, HOMA-IR, BMI, GDF15을 공변량으로 하여, 유의 확률(p-value)은 0.05 이하를 유의한 통계수준으로 하여 로지스틱 회귀분석을 시행하였다.

그 결과, 도 3에서 나타난 바와 같이 연령, 체질량 지수 및 HOMA-IR의 p-value는 각각 0.281, 0.164 및 0.195로 공복 혈당 장애와의 유의한 관련성을 가지지 않는 반면, 혈중 GDF15 농도는 1.005의 오즈비(odd ratio) 및 0.0001 미만의 p-value를 가져 공복 혈당 장애군에서 유의한 연관성을 가지는 것을 확인하였다(도 3).

< 실시예 4> 공복 혈당 장애 선별에 적용하기 위한 기준 혈중 GDF15 농도의 확인

혈중 GDF15 농도를 공복 혈당 장애군을 선별하는데 기준으로 적용하기 위하여 ROC 곡선(receiver operating characteristic curve)을 이용하여 민감도, 특이도 및 기준점을 확인하였다.

구체적으로, 상기 <실시예 3>에서 측정한 정상 혈당군, 공복 혈당 장애군 및 당뇨군의 혈중 GDF15의 농도를 SPSS, ver 20 프로그램(IBM 사)을 사용하여 ROC 곡선 분석을 수행하였다. 당뇨군 및 공복 혈당 장애군을 상태 변수로, GDF15을 검정 변수로 정의하여 ROC 곡선을 그린 다음, 유덴 인덱스(Youden Index; Y = 민감도 + 특이도 1)를 이용하여 궁극의 기준점을 선정하였다.

그 결과, 도 4에서 나타난 바와 같이 전체 실험군을 대상으로 한 ROC 곡선 분석에서 ROC 곡선 면적(area under curve)은 0.756이었고, 420 pg/㎖을 기준점(cut-off value)으로 하여 76.0%의 민감도(sensitivity) 및 60.2%의 특이도(specitivity)를 나타내는 것을 확인하였다(도 4A). 성별에 따라 ROC 곡선을 이용하여 분석하였을 때, 전체 실험군 중 남성을 대상으로 한 ROC 곡선 면적은 0.773이었고, 500 pg/㎖을 기준점으로 하여 76.5%의 민감도 및 70.0%의 특이도를 나타내는 것을 확인하였으며(도 4B), 전체 실험군 중 여성을 대상으로 한 ROC 곡선 면적은 0.738이었고, 385 pg/㎖을 기준점으로 하여 75.0%의 민감도 및 62.8%의 특이도를 나타내는 것을 확인하였다(도 4C).

<110> The Industry & Academic Cooperation in Chungnam National University (IAC) <120> Growth differentiation factor 15 as marker for impaired fasting glucose and Diagnosis kit for impaired fasting glucose including the same <130> 13p-06-12 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 308 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Pro Gly Gln Glu Leu Arg Thr Val Asn Gly Ser Gln Met Leu Leu 1 5 10 15 Val Leu Leu Val Leu Ser Trp Leu Pro His Gly Gly Ala Leu Ser Leu 20 25 30 Ala Glu Ala Ser Arg Ala Ser Phe Pro Gly Pro Ser Glu Leu His Ser 35 40 45 Glu Asp Ser Arg Phe Arg Glu Leu Arg Lys Arg Tyr Glu Asp Leu Leu 50 55 60 Thr Arg Leu Arg Ala Asn Gln Ser Trp Glu Asp Ser Asn Thr Asp Leu 65 70 75 80 Val Pro Ala Pro Ala Val Arg Ile Leu Thr Pro Glu Val Arg Leu Gly 85 90 95 Ser Gly Gly His Leu His Leu Arg Ile Ser Arg Ala Ala Leu Pro Glu 100 105 110 Gly Leu Pro Glu Ala Ser Arg Leu His Arg Ala Leu Phe Arg Leu Ser 115 120 125 Pro Thr Ala Ser Arg Ser Trp Asp Val Thr Arg Pro Leu Arg Arg Gln 130 135 140 Leu Ser Leu Ala Arg Pro Gln Ala Pro Ala Leu His Leu Arg Leu Ser 145 150 155 160 Pro Pro Pro Ser Gln Ser Asp Gln Leu Leu Ala Glu Ser Ser Ser Ala 165 170 175 Arg Pro Gln Leu Glu Leu His Leu Arg Pro Gln Ala Ala Arg Gly Arg 180 185 190 Arg Arg Ala Arg Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly 195 200 205 Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly 210 215 220 Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys 225 230 235 240 Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln 245 250 255 Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro 260 265 270 Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr 275 280 285 Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp 290 295 300 Cys His Cys Ile 305

Claims

1) 실험군 및 정상 대조군으로부터 각각 시료를 분리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 시료로부터 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 성장 분화 인자 15(growth differentiation factor 15; GDF15)의 농도를 측정하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 GDF15 농도가 정상 대조군보다 높은 경우, 공복 혈당 장애(Impaired Fasting Glucose; IFG)로 판정하는 단계를 포함하는 공복 혈당 장애의 정보를 제공하기 위한 시료 내 GDF15 농도 측정 방법.

제 1항에 있어서, 상기 단계 1)의 시료는 혈액, 혈청 및 혈장으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 공복 혈당 장애의 정보를 제공하기 위한 시료 내 GDF15 농도 측정 방법.

삭제

제 1항에 있어서, 상기 단계 2)의 측정은 GDF15에 특이적인 항체 및 시료 내 GDF15의 항원-항체 반응을 측정하는 방법 또는 항원-항체 복합체에 검출제를 처리한 후 검출체의 양을 측정하는 방법으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 공복 혈당 장애의 정보를 제공하기 위한 시료 내 GDF15 농도 측정 방법.

제 4 항에 있어서, 상기 측정은 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 비색법(colorimetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment), 섬광계수법(scintillation counting method) 및 조직면역염색법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 공복 혈당 장애의 정보를 제공하기 위한 시료 내 GDF15 농도 측정 방법.

GDF15 또는 이의 단편에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 포함하는 공복 혈당 장애 진단용 키트.

제 6항에 있어서, 상기 GDF15는 서열 번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 공복 혈당 장애 진단용 키트.

GDF15 또는 이의 단편에 특이적으로 결합할 수 있는 생물 분자가 고형 기질에 집적된 공복 혈당 장애 진단용 바이오칩.

제 8항에 있어서, 상기 GDF15는 서열 번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 공복 혈당 장애 진단용 바이오칩.

제 8항에 있어서, 상기 바이오칩은 단백질칩 또는 핵산 어레이인 것을 특징으로 하는 공복 혈당 장애 진단용 바이오칩.

제 8항에 있어서, 상기 생물 분자는 저분자 화합물, 리간드, 앱타머, 펩티드, 폴리펩티드, 특이적 결합 단백질, 고분자 물질 및 항체 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 공복 혈당 장애 진단용 바이오칩.

제 8항에 있어서, 상기 고형 기질은 플라스틱, 유리, 금속 및 실리콘으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 공복 혈당 장애 진단용 바이오칩.