BRPI0619503A2 - detecção de peptìdeos solúveis do receptor de adiponectina e uso em diagnóstico e terapêutico - Google Patents

Abstract

DETECçãO DE PEPTìDEOS SOLúVEIS DO RECEPTOR DE ADIPONECTINA E USO EM DIAGNóSTICO E TERAPêUTICO. A presente invenção refere-se a fragmentos O-terminais solúveis do receptor da adiponectina e o seu uso no diagnóstico e tratamento de distúrbios.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "DETECÇÃO DE PEPTÍDEOS SOLÚVEIS DO RECEPTOR DE ADIPONECTINA E USO EM DIAGNÓSTICO E TERAPÊUTICO".

Referência cruzada a pedido correlato

Este pedido de patente reivindica os benefícios do pedido U.S. Provisional N0 60/748 305, depositado em 07 de dezembro de 2005. Campo

A presente invenção refere-se a fragmentos solúveis C-terminais do receptor de adiponectina e o seu uso no diagnóstico e tratamento de dis- túrbios.

Antecedentes da Invenção

A obesidade acompanhada de inflamação crônica está presente em uma grande e crescente população. Esta população possui alto risco cardiovascular e de diabetes e desenvolve freqüentemente síndrome meta- bólica com resistência à insulina. Recentemente, foi descoberto que a adi- ponectina e outras adipocinas atuam como hormônios de células adiposas que controlam o metabolismo de glicose. Tanto o tipo como localização de células adiposas são importantes. A obesidade produz adipócitos adicionais que secretam adiponectina no sangue, auxiliando o metabolismo, em célula muscular, de gorduras e glicose. Alguns pacientes acima do peso tornam-se resistentes à insulina. Nesse caso, adipócitos interrompem a produção de adiponectina. Os níveis no sangue de adiponectina estão diminuídos sob condições de obesidade, resistência à insulina e diabetes tipo 2. Existem métodos para medição de níveis de adiponectina em indivíduos para o prog- nóstico destas e de outros estados de doença. A medição de níveis de adi- ponectina, no entanto, provou ser um indicador deficiente de doença. Há necessidade de métodos melhores para monitoramento de estados de do- ença, associados à atividade anormal de adipócitos. A presente invenção provê o mesmo e as outras necessidades.

Sumário

Os presentes inventores descobriram que fragmentos C- terminais do receptor de adiponectina são solúveis e que podem ser detec- tados em líquidos do corpo. De acordo com o mesmo, a presente invenção provê, entre outros, os fragmentos, métodos para sua detecção, métodos para seu uso e anticorpos capazes de se ligar a estes fragmentos.

Métodos de detecção de fragmento de um receptor de adiponec- tina, em uma amostra de líquido do corpo obtida de um indivíduo, pode compreender as etapas de análise quanto à presença ou ausência de, pelo menos, um fragmento solúvel C-terminal do receptor de adiponectina. Em certas modalidades, é determinada a concentração total de fragmentos C- terminais em uma amostra biológica.

Neste pedido, são providos métodos de detecção do nível de expressão de um receptor de adiponectina em um indivíduo. Estes métodos podem compreender as etapas de determinação do nível de, pelo menos, um fragmento C-terminal do receptor de adiponectina em uma amostra de líquido biológico e de correlação do nível do fragmento C-terminal com o ní- vel de expressão do receptor de adiponectina. Em certas modalidades, é determinada a concentração total de fragmentos C-terminais em uma amos- tra biológica.

Neste pedido, são providos métodos de detecção do nível de expressão de adiponectina em um indivíduo. Estes métodos podem compre- ender as etapas de determinação do nível de, pelo menos, um fragmento C- terminal do receptor de adiponectina em uma amostra de líquido biológico e de correlação do nível do fragmento C-terminal com o nível de expressão de adiponectina. Em certas modalidades, é determinada a concentração total de fragmentos C-terminais em uma amostra biológica.

A presente invenção abrange métodos de determinação de pro- gressão de uma condição, aparecimento de uma condição, ou seja, diagnós- tico ou eficácia de tratamento, ou seja, a responsividade à terapia, além de a individual, com um fármaco em particular. De preferência, esta condição es- tará associada a padrões anormais de fragmentação de um receptor de adi- ponectina. Estes métodos podem compreender as etapas de determinação do nível de, pelo menos, um fragmento C-terminal do receptor de adiponec- tina em uma amostra de líquido biológico, e de correlação a condição do ní- vel de, pelo menos, um fragmento C-terminal com progressão da condição, aparecimento da condição ou eficácia do tratamento. Em certas modalida- des, é determinada a concentração total de fragmentos C-terminais em uma amostra biológica.

Nos métodos da presente invenção, um ou mais (ou seja, pelo menos um) fragmentos solúveis C-terminais do receptor de adiponectina podem ser detectados. Por exemplo, qualquer combinação de fragmentos 1 a 22 de AdipoRI e/ou AdipoR2 pode ser detectada. Em certas modalidades, fragmentos 1 a 22 de AdipoRI e/ou AdipoR2 podem ser detectados e dife- renciados por suas massas. De acordo com o mesmo, a presente invenção provê métodos de determinação do nível de fragmentos com, por exemplo, massas próximas de IkDa a próximas de 3 kDa, incluindo, por exemplo, massa próxima de 2 kDa (por exemplo, fragmentos representados pelas SEQ ID NOS. 3, 12-22, 25 e 34-44), ou fragmentos com massas próximas 115 de 3,5 a próximas de 4,2 kDa, incluindo, por exemplo, massa próxima de 3,9 I kDa (por exemplo, fragmentos representados pelas SEQ ID NOS. 1,2,4-11, 23, 24 e 26-33). Fragmentos desses tamanhos estão tipicamente presentes sob a forma de monômeros. A presente invenção provê também métodos de determinação do nível de fragmentos com massas, por exemplo, próximas de 2 kDa a próximas de 6 kDa, incluindo, por exemplo, massa próxima de 4 kDa ou massas próximas de 7 kDa a próximas de 8,4 kDa, incluindo, por exemplo, massa próxima de 7,8 kDa. Fragmentos desses tamanhos estão tipicamente presentes sob a forma de dímeros.

Nos métodos da presente invenção, um ou mais fragmentos so- lúveis C-terminais do receptor de adiponectina (por exemplo, SEQ ID NOS. 1-44) podem ser detectados quando delimitados por uma proteína transpor- tadora. Por exemplo, qualquer combinação de fragmentos 1 a 22 de Adi- poR1 e/ou AdipoR2 pode ser detectada quando acoplada a uma proteína transportadora. De acordo com o mesmo, em certas modalidades, a presen- te invenção provê métodos de determinação do nível de fragmentos com massas próximas a 4,5-6,9, 7-8,2, 9-11, 13-15, 17-19, 27-29 ou 30-34. Em certas modalidades, a proteína transportadora é a adiponectina, incluindo fragmentos de adiponectina. Em certas modalidades, a massa do fragmento combinado do receptor de adiponectina acoplado à adiponectina é próxima de 3-5, 4-8, 7-11, 13-17, 22-26 ou 28-32 kDa. A presente invenção provê métodos de detecção destes fragmentos.

A presente invenção provê também polipeptídeos substancial- mente idênticos a fragmentos com as seqüências das SEQ ID NOS: 1 a 44, e as seqüências de ácido nucleico que correspondem a estes fragmentos. Anticorpos que se ligam especificamente a, pelo menos, um dos fragmentos C-terminais do receptor de adiponectina providos neste pedido, estão incluí- dos também.

A presente invenção provê um kit para uso na determinação de estratégia de tratamento de um indivíduo com quaisquer dos distúrbios des- critos no presente, compreendendo um meio para detecção de, pelo menos, um dos fragmentos aqui descritos e, opcionalmente, instruções de uso e in- terpretação dos resultados do kit. O kit pode compreender também, por e- xemplo, meios para se obter uma amostra biológica de um indivíduo.

Descrição detalhada de modalidades ilustativas

I. Introdução

Os presentes inventores descobriram que fragmentos C- terminais do receptor de adiponectina são solúveis e que podem ser detec- tados em líquidos do corpo. Ademais, os presentes inventores observaram que a presença ou ausência de certos fragmentos solúveis do receptor de adiponectina, em líquidos do corpo, é preditivo de doença e que o nível, ou seja, concentração, total de fragmentos solúveis do receptor de adiponecti- na, no líquido do corpo, é preditivo de doença.

Deve ser entendido que a invenção aqui exposta não está limi- tada a métodos, reagentes, compostos, composições ou sistemas biológicos específicos, os quais podem, evidentemente, variar. Deve ser também en- tendido que a terminologia utilizada neste pedido tem como finalidade so- mente descrever modalidades em particular e não pretende ser restritiva. Conforme utilizadas nesta exposição e reivindicações anexadas, as formas de singular "um", "uma" e "o" e "a" incluem referências no plural, exceto se o conteúdo ditar claramente de outra forma. Por conseguinte, por exemplo, referência a "uma célula" inclui combinação de duas ou mais células e simi- lar.

O termo "próximo", conforme utilizado no presente, quando se referir a valor mensurável, como quantidade, duração temporal e similar, pre- tende incluir variações de ±20% ou ±10%, mais preferencialmente de ±5%, até mais preferencialmente de ±1% e, ainda mais preferencialmente, de ±0,1% do valor especificado, conforme estas variações forem apropriadas para condução dos métodos expostos.

II. Receptor de adiponectina e fragmentos deste

O receptor de adiponectina é um receptor transmembrana que foi descrito pela primeira vez por Yamauchi et al. (Nature, 2003, 423 (6941), 762~9) e possui diversos tipos. Foram identificados três tipos de receptor, o receptor 1 de adiponectina (também referido como AdipoRI), o receptor 2 de adiponectina (também referido como AdipoR2) e o receptor 3 de adiponecti- na (também referido como AdipoR3). Os receptores de adiponectina ligam- se especificamente a e são modulados por adiponectina, um fator derivado de adipócitos que desempenha um papel importante no metabolismo de lipí- deos e de glicose no músculo e fígado.

O ácido nucleico e seqüência de aminoácidos de receptores humanos 1 e 2 de adiponectina são acessíveis em bancos de dados públi- cos (por exemplo, consultar números de acesso do Genbank NM_015999, AK222503, AK025085, AK222503, NM_024551, Q96A54 e Q86V24) e são fornecidos neste pedido. O ácido nucleico e seqüências de aminoácidos do receptor humano 3 de adiponectina são fornecidos na Publicação U.S. N0 20050032166, aqui incorporada, em sua totalidade, por referência neste pe- dido. Será entendido que o termo receptor de adiponectina, conforme utiliza- do neste pedido, não inclui receptores de adiponectina com as seqüências descritas no presente, como inclui também, por exemplo, formas truncadas que ocorrem naturalmente de um receptor de adiponectina, formas de vari- antes que ocorrem naturalmente (por exemplo, formas alternativas de spli- cing (processamento)), variantes modificadas conservativamentes e varian- tes alélicas que ocorrem naturalmente.

"Variantes modificadas conservativamentes" aplica-se tanto a seqüências de aminoácidos como de ácidos nucleicos. Com respeito a se- qüências de ácidos nucleicos especificados, variantes modificadas conserva- tivamentes referem-se àqueles ácidos nucleicos que codificam seqüências idênticas ou essencialmente idênticas de aminoácidos, ou se o ácido nuclei- co não codificar uma seqüência de aminoácidos, a seqüências essencial- mente idênticas. Por causa da degeneração do código genético, um grande número de ácidos nucleicos funcionalmente idênticos codifica qualquer pro- teína especificada. Por exemplo, os códons GCA1 GCC, GCG e GCU, codifi- cam, todos eles, o aminoácido alanina. Dessa forma, em cada posição em que um códon especificar alanina, o códon pode ser alterado por qualquer um dos códons correspondentes descritos, sem que ocorra alteração do po- lipeptídeo codificado. Estas variações de ácido nucleico são "variações si- lenciosas", sendo exemplos de variações modificadas conservativamente.

Toda seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo descreve também cada possível variação silenciosa do ácido nucleico. Técnicos no assunto reconhecerão"quê" cada códon em um ácido nucleico (exceto AU-G1 que é ordinariamente o único códon para metionina, e TGG, que é ordinari- amente o único códon para triptofano) pode ser modificado de forma a pro- duzir uma molécula funcionalmente idêntica. De acordo com o mesmo, cada variação silenciosa de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo está implícita em cada seqüência descrita, em relação ao produto da expressão, porém não em relação a seqüências reais de sondas.

Em relação a seqüências de aminoácidos, um técnico no assun- to reconhecerá que substituições, exclusões ou adições individuais a uma seqüência de ácido nucleico, peptídeo, polipeptídeo ou proteína que altere, acrescente ou exclua um único aminoácido ou um pequeno percentual de aminoácidos, na seqüência codificada, é uma "variante modificada conserva- tivamente", em que a alteração resulta na substituição de um aminoácido por um aminoácido quimicamente semelhante. Tabelas de substituição conser- vadora, fornecendo aminoácidos funcionalmente semelhantes, são bem- conhecidas na técnica. Estes variantes modificados conservativamente a- crescem-se e não excluem variantes polimórficos, homólogos entre espécies e alelos da invenção.

Os oito grupos seguintes contêm cada um aminoácidos que são substituições conservadoras de outros: 1) Alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D) Ácido glutâmico (E); 3) Asparagina (N)1 Glutamina (Q); 4) Argi- nina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W); 7) Serina (S), Treonina (T) e 8) Cisteína (C), Metionina (M) (consultar, por exemplo, Creighton, Proteins (1984)).

Uma seqüência de ácido nucleico em particular abrange, implici- tamente, também "variantes de splicinçf' (processamento). Da mesma forma, uma proteína em particular codificada por um ácido nucleico abrange implici- tamente qualquer proteína codificada por um variante de splicing daquele ácido nucleico. "Variantes de splicinçj", conforme sugerido pelo nome, são produtos de processamentos alternativos de um gene. Após a transcrição, um transcrito inicial de ácido nucleico pode ser processado de forma que produtos diferentes (alternados)do processamento do ácido, nucleico codifi- cam polipeptídeos diferentes. Mecanismos para a produção de variantes de splicing variam, porém incluem processamento alternado de exons. Polipep- tídeos alternados derivados do mesmo ácido nucleico, por transcrição de leitura completa são abrangidos também por essa definição. Quaisquer pro- dutos de reação de splicing, incluindo formas recombinantes de produtos do splicing, estão incluídos nesta definição.

A frase "fragmentos solúveis C-terminais do receptor de adipo- nectina" refere-se a fragmentos do C-terminal do receptor de adiponectina que se destacam do receptor de adiponectina e são solúveis em líquidos do corpo. Uma variedade de líquidos do corpo pode ser utilizada na prática dos métodos da invenção, incluindo, por exemplo, sangue, soro, plasma, urina, saliva, líquido ascítico e similar.

A adiponectina é bem-conhecida na técnica como um hormônio secretado por adipócitos com propriedades de sensibilização à insulina, an- tiaterogênicas e anti-inflamatórias. Os níveis de adiponectina estão reduzi- dos em certas condições, incluindo obesidade, resistência à insulina e diabe- tes. A atividade da adiponectina é mediada por seus receptores. A adiponec- tina pode estar presente em toda a sua extensão ou sob a forma de frag- mento globular menor. A adiponectina possui quatro regiões distintas. A pri- meira é uma seqüência curta de sinalização que direciona a secreção de hormônio fora da célula, a seguinte é uma região curta que varia entre espé- cies; a terceira é uma região que apresenta semelhanças com proteínas de colágeno e a última é um domínio globular. A massa monomérica prevista da adiponectina é de 26 kDa com variação de aproximadamente 17 a aproxi- madamente 33 kDa. A formação de oligômeros de adiponectina depende da formação de pontes dissulfeto, mediada por um resíduo interno de cisteína. A adiponectina está presente em uma ampla gama de complexos multíme- ros no plasma e combina-se por meio de seu domínio de colágeno para criar 3 formas principais de oligômeros: uma forma de baixo, médio e alto peso molecular. Serina proteases, como elastase e tripsina, possuem diversos sítios para clivagem de adiponectina. Uma liberação de adiponectina globu- lar, com peso molecular médio próximo de 16 kDa, é fato que ocorre sabi- damente em pacientes. A adiponectina restante não globular possui peso molecular médio de 10 kDa. A clivagem de adiponectina por uma serina pro- tease do tipo tripsina pode ocorrer, por exemplo, no aminoácido 101, dando origem a uma adiponectina globular de 16,5 kDa, ou por uma serina protea- se do tipo elastase no aminoácido 108, dando origem a uma adiponectina globular de 15,8 kDa. Há múltiplos sítios de possível clivagem, no aminoáci- do 88 a 108, dando origem à adiponectina com massa que varia de aproxi- madamente 17,8 kDa a aproximadamente 9,7 kDa. Clivagem adicional por protease de adiponectina não globular pode produzir fragmentos pequenos de até 3 kDa.

Sem desejar estar preso por teoria, acredita-se que a cauda c- terminal do receptor de adiponectina atue de forma a capturar adiponectina em extensão completa. Acredita-se que a ligação ocorra entre a parte não globular da proteína adiponectina e o domínio de ligação da cauda da adipo- nectina do receptor de adiponectina. Após clivagem pela protease, acredita- se que a adiponectina não globular permaneça ligada à região c-terminal do receptor de adiponectina. Acredita-se que a parte globular liberada da adi- ponectina interaja com outra região no receptor de forma a causar ativação posterior. Na ausência de adiponectina não globular, não se acredita que a ligação ao c-terminal ocorra.

Os presentes inventores descobriram que a porção C-terminal do receptor de adiponectina fragmenta-se e separa-se do receptor, estando presente em líquido corporal. A presença ou nível de adiponectina não glo- bular pode afetar o padrão de fragmentação do c-terminal do receptor de adiponectina. Os presentes inventores detectaram fragmentos do receptor 1 e 2 de adiponectina em líquido corporal. A observação e conclusão de que o receptor de adiponectina pode ser detectado em líquido biológico e fornecer um indicador confiável e prático de estados de doença é particularmente surpreendente, dado o fato de que o receptor de adiponectina é uma proteí- na integrante de membrana. Foi também surpreendente o fato de que certos fragmentos tendem a estarem ausentes em doença e que o aumento no número ou concentração total de fragmentos do receptor ocorre em estados de doença, dado que níveis de adiponectina diminuem com doença.

A presente invenção provê, inter alia, fragmentos 1 a 22 de re- ceptor de adiponectina (SEQ ID NOS: 1-22) do AdipoRI. O fragmento 1 do AdipoRI possui 34 aminoácidos, correspondentes aos aminoácidos 361 a 375 no AdipoRI. Os aminoácidos 1-14 é o domínio de clivagem da serina protease; os aminoácidos 15-22 é o domínio semelhante ao AdipoR2 e os aminoácidos 23-34 são o domínio de ligação da adiponectina. A seqüência do fragmento 1 do AdipoRI é vlvvaaafvh fygvsnlqef rygleggctd dtll (SEQ ID N0:1). Este fragmento pode ser fragmentado ainda em qualquer aminoácido e, especialmente, em qualquer aminoácido incluído no domínio de clivagem pela serina protease, no domínio semelhante ao adipoRI ou o domínio de ligação da adiponectina. Alguns dos principais fragmentos, presentes em líquido corporal, são o fragmento 2 de seqüência Ivvaaafvh fygvsnlqef ry- gleggctd dtll (SEQ ID N0:2) e o fragmento 3 de seqüência snlqef rygleggctd dtll (SEQ ID NO:3), porém, pelo menos os seguintes fragmentos podem ser encontrados: vvaaafvh fygvsnlqef rygleggctd dtII (SEQ ID NO:4), vaaafvh fygvsnlqef rygleggctd dtll (SEQ ID NO:5), aaafvh fygvsnlqef rygleggctd dtII (SEQ ID NO:6), aafvh fygvsnlqef rygleggctd dtll (SEQ ID NO:7), afvh fygvsnl- 5 qef rygleggctd dtII (SEQ ID NO:8), fvh fygvsnlqef rygleggctd dtll (SEQ ID NO:9), vh fygvsnlqef rygleggctd dtll (SEQ ID NO: 10), h fygvsnlqef rygleggctd dtII (SEQ ID NO:11), fygvsnlqef rygleggctd dtI (SEQ ID NO:12), ygvsnlqef rygleggctd dtll (SEQ ID NO: 13), gvsnlqef rygleggctd dtll (SEQ ID NO: 14), vsnlqef rygleggctd dtII (SEQ ID NO:15), nlqef rygleggctd dtll (SEQ ID NO:16), 10 Iqef rygleggctd dtII (SEQ ID NO: 17), qef rygleggctd dtll (SEQ ID NO: 18), ef rygleggctd dtll (SEQ ID NO: 19), f rygleggctd dtII (SEQ ID N0:20), rygleggctd dtII (SEQ ID NO:21), e ygleggctd dtll (SEQ ID NO:22)

A presente invenção provê, inter alia, os fragmentos 1 a 22 do receptor de adiponectina (SEQ ID NOS:23-44) dp AdipoR2. O fragmento 1 do AdipoR2 possui 34 aminoácidos que correspondem aos aminoácidos 353 a 386 no AdipoR2. Os aminoácidos 1-14 são o domínio de clivagem da seri- na protease; os aminoácidos 15-22 são domínio semelhante ao adipoR2 e os aminoácidos 23-34 são o domínio de ligação da adiponectina. A sequên- cia do fragmento 1 do AdipoR2 é ifwagafvh fhgvsnlqef rfmigggcse edal (SEQ ID NO:23). Este fragmento pode ser ainda fragmentado em qualquer aminoácido e, especialmente, em qualquer aminoácido incluído no domínio de clivagem da serina protease, no domínio semelhante ao adipoR2 ou no domínio de ligação da adiponectina. Alguns dos principais fragmentos, pre- sentes em líquido corporal, são o fragmento 2 de seqüência vagafvh fhgvsn- Iqef rfmigggcse edal (SEQ ID NO:24) e o fragmento 3 de seqüência snlqef rfmigggcse edal (SEQ ID NO:25), porém, pelo menos, os seguintes fragmen- tos podem ser também encontrados: fwagafvh fhgvsnlqef rfmigggcse edal (SEQ ID NO:26), vvagafvh fhgvsnlqef rfmigggcse edal (SEQ ID NO:27), a- gafvh fhgvsnlqef rfmigggcse edal (SEQ ID NO:28), gafvh fhgvsnlqef rf- migggcse edal (SEQ ID NO:29), afvh fhgvsnlqef rfmigggcse edal (SEQ ID N0:30), fvh fhgvsnlqef rfmigggcse edal (SEQ ID NO:31), vh fhgvsnlqef rf- migggcse edal (SEQ ID NO:32), h fhgvsnlqef rfmigggcse edal (SEQ ID NO:33), fhgvsnlqef rfmigggcse edal (SEQ ID NO:34), hgvsnlqef rfmigggcse edal (SEQ ID NO:35), gvsnlqef rfmigggcse edal (SEQ ID NO:36), vsnlqef rfmigggcse edal (SEQ ID NO:37), nlqef rfmigggcse edal (SEQ ID NO:38), lqef rfmigggcse edal (SEQ ID NO:39), qef rfmigggcse edal (SEQ ID N0:40), ef rfmigggcse edal (SEQ ID N0:41), f rfmigggcse edal (SEQ ID NO:42), rf- migggcse edal (SEQ ID NO:43) e fmigggcse edal (SEQ ID NO:44)

Em certas circunstâncias, o receptor de adiponectina presente no corpo não possui a seqüência exata conforme descrita no presente, po- rém está presente sob uma forma de variante que ocorre naturalmente. Por exemplo, os receptores de adiponectina podem substituir, pelo menos, até 5% ou até mesmo até 10% de seus aminoácidos sem sofrerem perda de função. De acordo com o mesmo, pelo menos alguns aminoácidos, em SEQ ID NOS. de 1 a 44, podem ser substituídos por outros aminoácidos. De a- cordo com o mesmo, a presente invenção abrange não só fragmentos 1-22 do AdipoRI e AdipoR2, mas também fragmentos com identidade substancial em relação aos fragmentos aqui descritos. Identidade substancial é descrita, neste pedido, como tendo identidade próxima de 75% ou 80% ou mais alta com os fragmentos. Dessa forma, os fragmentos podem ter identificação próxima de 80%, próxima de 81%, próxima de 82%, próxima de 83%, próxi- ma de 84%, próxima de 85%, próxima de 86%, próxima de 87%, próxima de 88%, próxima de 89%, próxima de 90%, próxima de 91%, próxima de 92%, próxima de 93%, próxima de 94%, próxima de 95%, próxima de 96%, próxi- ma de 97% ou próxima de 98% em relação às SEQ ID NOS 1 a 44.

O percentual de identidade pode ser determinado pela compara- ção de duas seqüências mais adequadamente alinhadas, sobre um intervalo de comparação, em que a porção da seqüência de polipeptídeos, no interva- lo de comparação, pode compreender acréscimos ou exclusões (por exem- plo, lacunas), comparada à seqüência de referência (que não compreende acréscimos ou exclusões), quanto ao alinhamento mais adequado das duas seqüências. O percentual é calculado pela determinação do número de posi- ções em que ocorre o mesmo resíduo em ambas as seqüências, de forma a produzir o número de posições que se combinam, a divisão do número de posições que se combinam pelo número total de posições no intervalo de comparação e multiplicação do resultado por 100, produzindo o percentual de identidade de seqüência. A identidade é avaliada empregando qualquer um entre a variedade de algoritmos e programas de comparação de seqüên- cias, conhecidos na técnica. Estes algoritmos e programas incluem, entre outros, TBLASTN, BLASTP, FASTA, TFASTA, CLUSTALW, FASTDB, as exposições dos quais são aqui incorporadas, em sua totalidade, por referên- cia neste pedido. Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 85: 2444- 2448, 1988; Altschul et ai, J. Moi Biol., 215: 403410, 1990; Thompson et ai., Nucleic Acids Res., 22: 4673-4680, 1994; Higgins et al., Meth. Enzymol., 266: 383402, 1996; Altschul et al., Nature Genetics, 3: 266-272, 1993; Bru- tlag et al., Comp. App. Biosei., 6: 237-24, 1990.

Os termos "polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína" são utilizados alternativamente, neste pedido, para referir-se a um polímero de resíduos de aminoácidos. Os termos aplicam-se a polímeros de aminoácidos, em que um ou mais resíduos de aminoácidos são uma reprodução artificial química de um aminoácido que ocorre naturalmente, bem como polímeros de aminoáci- dos que ocorrem naturalmente e polímero de aminoácido que não ocorre naturalmente.

Conforme utilizado no presente, o termo "polinucleotídeo" signifi- ca uma forma polimérica de nucleotídeos de, pelo menos, 10 bases ou pares de base em extensão, quer de ribonucleotídeos ou desoxinucleotídeos, ou uma forma modificada de qualquer tipo destes nucleotídeos, pretendendo incluir formas de fita simples e dupla de DNA.

Os fragmentos do receptor de adiponectina aqui descritos po- dem transformar-se em dímeros por meio do aminoácido cisteína, presente próximo do c-terminal do fragmento (posição 28 nas SEQ ID NOs:1 e 16). De acordo com o mesmo, estes fragmentos podem estar presentes no líqui- do corporal sob a forma de dímeros.

Vários dos aminoácidos presentes nas SEQ ID NOS: 1-44 são possíveis sítios de modificação pós-tradução. Por exemplo, a glicina presen- te nos fragmentos (posição 26 nas SEQ ID NOs:1 e 23) é um possível sítio de N-miristoilação, a arginina (posição 21 nas SEQ ID NOs:1 e 23) é um possível sítio de N-glicano e a serina (posição 15 nas SEQ ID NOs:1 e 23) é um possível sítio de O-glicano. Dessa forma, a massa dos fragmentos pode aumentar, em decorrência de modificações pós-tradução.

Uma característica da presente invenção é o fornecimento dos fragmentos descritos no presente. De acordo com o mesmo, a presente in- venção provê fragmentos isolados com identidade substancial em relação às SEQ ID NOS: 1-44. Fragmentos isolados são aqueles que foram purificados de origem biológica ou preparados por métodos de recombinação ou sintéti- cos. Estes métodos são bem-conhecidos na técnica e, por conseguinte, não estão descritos neste pedido.

Outra característica da presente invenção é a detecção dos fragmentos aqui descritos em amostra de líquido biológico.

Os presentes inventores descobriram que fragmentos do recep- tor de adiponectina, um receptor transmembrana, podem ser detectados em amostra de líquido biológico por análise quanto à presença de uma região c- terminal do receptor no líquido biológico.

Foi também constatado que o nível de expressão, em tecido, do receptor de adiponectina pode ser determinado por determinação do nível de, pelo menos, um fragmento C-terminal do receptor de adiponectina em uma amostra de líquido biológico, e comparação do nível do, pelo menos, um fragmento C-terminal com o nível do mesmo fragmento em uma amostra de controle.

Foi também constatado que o nível de expressão de adiponecti- na em um indivíduo pode ser determinado por determinação do nível de, pelo menos, um fragmento C-terminal do receptor de adiponectina em uma amostra de líquido biológico, e comparação do nível do, pelo menos, um fragmento C-terminal com o nível do mesmo fragmento em uma amostra de controle.

Fragmentos do receptor de adiponectina podem ser encontrados nos líquidos corporais de indivíduos doentes e sem doenças. A presença ou nível de adiponectina, no entanto, pode exercer impacto sobre o padrão de fragmentação do c-terminal do receptor de adiponectina. Os níveis e tipo de adiponectina em um indivíduo podem exercer impacto também sobre os ní- veis de receptor de adiponectina, presentes no indivíduo.

Os presentes inventores constataram também que em indivíduos normais (ou seja, sem doenças) com níveis normais de adiponectina em ex- tensão completa, são encontrados fragmentos maiores do receptor de adi- ponectina nos líquidos biológicos, ou seja, fragmentos com 25 a 34 aminoá- cidos em extensão (ou seja, SEQ ID NOS: 1, 2, 4-11, 23, 24 e/ou 26-33). Estes fragmentos encontram-se tipicamente não ligados. Muitos destes fragmentos maiores estão ausentes ou presentes em níveis significativamen- te mais baixos em pacientes que sofrem de doenças relacionadas com adi- ponectina (ou seja, os fragmentos estão presentes em pacientes doentes em níveis 2x, 5x, 10x, 20x, 50x, 100x menores ou mais de 100x menores do que em pacientes sem doenças). Por fragmentos não ligados, pretende-se signi- ficar fragmentos que não estão ligados à proteína transportadora, ou seja, adiponectina.

Os presentes inventores constataram que em pacientes doentes, fragmentos menores de adiponectina são encontrados nos líquidos biológi- cos, ou seja, fragmentos com aproximadamente de 13 a 24 aminoácidos em extensão (ou seja, SEQ ID NOS: 3, 12-22, 25 e/ou 34-44). Estes fragmentos podem estar ligados ou não ligados. Estes fragmentos são encontrados também em indivíduos normais, porém, geralmente não nos mesmos níveis conforme em indivíduos doentes (ou seja, os fragmentos estão presentes, em pacientes doentes, em níveis 1,5x, 2x, 2,5x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x ou 10x mais do que em pacientes sem doenças).

Os presentes inventores constataram que, em indivíduos nor- mais e doentes, são observados fragmentos c-terminal do receptor de adi- ponectina ligados à adiponectina. Estes fragmentos de receptor ligados po- dem ser os fragmentos maiores ou menores. Em muitos casos, estes frag- mentos estavam ligados à parte não globular da adiponectina, quer parcial- mente fragmentada ou em extensão completa. O nível de fragmentos de re- ceptor de adiponectina ligados é aumentado em pacientes com doença. A presença e/ou níveis dos fragmentos ligados e não ligados e de fragmentos maiores e menores podem, de acordo com o mesmo, ser uti- lizados para determinar o nível de expressão de adiponectina e do receptor de adiponectina em um indivíduo, bem como estados de doença em indiví- duos.

III. Detecção de fragmentos C-terminais solúveis do receptor de adiponectina

A presente invenção provê métodos para análise quanto à pre- sença ou ausência e/ou de determinação do nível de, pelo menos, um frag- mento C terminal solúvel do receptor de adiponectina em líquido corporal. A frase "determinação do nível" significa detecção da presença ou ausência de um analito em uma amostra ou quantificação da quantidade em termos rela- tivos ou absolutos. Uma quantidade relativa poderia ser, por exemplo, alta, média ou baixa. Uma quantidade absoluta refletiria a força medida de um sinal ou a tradução da força deste sinal em qualquer outro formato quantita- tivo, como microgramas/ml.

Os fragmentos C terminais podem ser detectados por qualquer método adequado. Paradigmas de detecção que podem ser empregados incluem, por exemplo, métodos ópticos, métodos eletroquímicos (técnicas de voltametria e amperometria), microscopia de força atômica e métodos em- pregando freqüência de rádio, por exemplo, espectroscopia de ressonância multipolar. Métodos ópticos incluem, por exemplo, análises colorimétricas, espectroscopia de impedância eletrônica, microscopia confocal e não confo- cal, detecção de fluorescência, luminescência, quimioluminescência, absor- vência, refletância, transmitância e índice de birrefringência ou refração (por exemplo, ressonância plasmônica de superfície, elipsometria, um método de espelho ressonante, um método de acoplamento de rede de ondas guiadas ou interferometria).

Em certas modalidades, o nível de expressão, incluindo presen- ça ou ausência de pelo menos um fragmento C-terminal solúvel do receptor de adiponectina é analisado por imunoensaio. Especialistas na técnica estão cientes de que, em seu mais amplo contexto, "imunoensaio" compreende a incubação de uma amostra em teste com uma ou mais moléculas com inte- ração imunológica específica para um alvo, por um tempo e sob condições suficientes para ligação entre as mesmas, e detecção da referida ligação. Conforme utilizado no presente, o termo "alvo" refere-se ao analito ao qual uma sonda é criada para ligar-se. Em certas modalidades preferidas, a mo- lécula com interação imunológica será um anticorpo. Condições para incu- bação de um anticorpo com uma amostra em teste variam, dependendo do formato empregado no ensaio, os métodos de detecção empregados e o tipo e natureza da molécula do anticorpo, utilizado no ensaio. Especialistas na técnica reconhecerão que quaisquer dos formatos de ensaio imunológico comumente disponível, por exemplo, radioimunoensaio, ensaios enzimáticos de imunoabsorção (ELISA), imuno-tubimétrico, imunonefrométrico, imunos- separação magnética de partículas, imunocromatografia, sistemas de imu- nomicrofluidos, imunocentrifugação, técnica de Ouchterlony baseada em difusão, imunoeletroforese radial em gel ou imunoensaios in situ podem ser prontamente adaptados para a presente finalidade.

Imunoensaios são úteis na quantificação de, pelo menos, um fragmento C terminal solúvel do receptor de adiponectina em uma amostra em teste, especialmente para determinar se o nível do, pelo menos, um fragmento C terminal solúvel está alterado, comparado a níveis normais de- tectáveis em indivíduos sem doença. Consequentemente, imunoensaios desse tipo são especialmente utilizados para determinar se um paciente po- de ser portador de uma doença ou apresentar predisposição para doença. O imunoensaio pode ter outros usos também, como, por exemplo, no monito- ramento de progressão de doenças ou monitoramento de resposta a inter- venções terapêuticas. A invenção exposta neste pedido estende-se a todos estes usos de moléculas com interação imunológica e ensaios diagnósticos que requerem a execução dos referidos imunoensaios.

A título de exemplo somente, em certas modalidades, um anti- corpo cultivado contra o fragmento é imobilizado em um substrato sólido pa- ra formar um primeiro complexo, e a amostra biológica em teste de um paci- ente é posta em contato com a molécula ligada. Após um período adequado de incubação, por tempo suficiente que permita a formação de um complexo secundário com o anticorpo, um segundo anticorpo marcado com uma molé- cula repórter, capaz de produzir um sinal detectável, é acrescentado em se- guida e incubado, permitindo tempo suficiente para a formação de um com- plexo terciário. Qualquer material que não tenha reagido é lavado e a pre- sença do complexo terciário por observação de um sinal produzido pela mo- lécula repórter. Os resultados podem ser qualitativos, por observação sim- ples do sinal visível, ou podem ser quantificados por comparação com uma amostra de controle, contendo quantidade conhecida de hapteno. Variações deste ensaio incluem um ensaio simultâneo, em que a amostra e o anticorpo marcado são acrescentados simultaneamente ao anticorpo ligado. Estas técnicas são bem-conhecidas de especialistas na técnica, e a possibilidade de variações se tornarão evidentes de imediato.

Por "molécula repórter", conforme utilizada na presente exposi- ção, pretende-se significar uma molécula que, em decorrência de sua natu- reza química, produz um sinal analiticamente identificável que permite a de- tecção de antígeno-anticorpo ligado. A detecção pode ser qualitativa ou quantitativa. As moléculas repórteres mais comumente utilizadas neste tipo de ensaio são partículas coloridas de látex, partículas de metal, enzimas, fluoróforos ou moléculas contendo radionuclídeos (ou seja, radioisótopos).

O substrato sólido é tipicamente vidro ou polímero, sendo os po- límeros mais comumente empregados celulose, poliacrilamida, nylon, nitro- celulose, poliestireno, cloreto de polivinila ou polipropileno. Os suportes sóli- dos podem ser na forma de tiras, cassetes, contas, discos ou microplacas ou qualquer outra superfície adequada para condução de imunoensaios. Os processos de ligação são bem-conhecidos na técnica e consiste geralmente em junção por ligação covalente cruzada ou adsorção física da molécula ao veículo insolúvel.

Uma variedade de formatos de imunoensaio, incluindo, por e- xemplo, formatos competitivos e não competitivos de imunoensaio, ensaios de captura de antígeno e ensaios tipo "sanduíche" com dois anticorpos, po- de ser utilizada nos métodos da invenção (Self e Cook, Curr. Opin. Biotech- nol. 7:60-65 (1996)). Em um ensaio de captura de antígeno, o anticorpo liga- se a uma fase sólida e a amostra é acrescentada de forma que um antígeno do fragmento C-terminal solúvel do receptor de adiponectina liga-se ao anti- corpo. O anticorpo pode ser específico para um ou dois ou mais fragmentos C-terminais solúveis. Depois que proteínas não ligadas são removidas por lavagem, a quantidade de antígeno pode ser quantificada, se desejado, em- pregando, por exemplo, um radioensaio (Harlow e Lane, Antibodies A Labo- ratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory: New York, 1988). Imunoen- saios podem ser conduzidos sob condições em que há excesso de anticor- pos ou em que há competições de antígenos, para quantificar a quantidade de antígeno e, dessa forma, determinar um nível de fragmentos C-terminais solúveis do receptor de adiponectina.

Ensaios imunoenzimáticos de absorção (ELISAs) podem ser ú- teis em certos métodos da invenção. No caso de imunoensaio enzimático, uma enzima é conjugada ao segundo anticorpo, geralmente por meio de glu- taraldeído ou periodato. Conforme será reconhecido de imediato, no entanto, existe uma ampla variedade de técnicas diferentes de conjugação, disponí- veis prontamente para um versado na técnica. As enzimas comumente utili- zadas incluem, por exemplo, peroxidase de rábano, glicose oxidase, β- galactosidase e fosfatase alcalina, entre outras. Os substratos a serem utili- zados com as enzimas específicas são geralmente escolhidos para a produ- ção, mediante hidrólise pela enzima correspondente, de uma alteração de- tectável de cor. É possível também empregar substratos fluorogênicos, por exemplo, que dão origem a um produto fluorescente. Uma enzima como a peroxidase de rábano (HRP), fosfatase alcalina (AP), β-galactosidase ou urease pode ligar-se, por exemplo, a um fragmento C-terminal antirreceptor de adiponectina ou a um anticorpo secundário de uso em um método da in- venção. Um sistema de detecção por peroxidase de rábano pode ser utiliza- do, por exemplo, com o substrato cromogênico tetrametilbenzidina (TMB), que dá origem a um produto solúvel na presença de peróxido de hidrogênio, detectável em 450 nm. Outros sistemas convenientes de ligação enzimática incluem, por exemplo, o sistema de detecção por fosfatase alcalina, o qual pode ser utilizado, por exemplo, com o substrato cromogênico p-nitrofenil fosfato para dar origem a um produto solúvel que pode ser detectado de i- mediato em 405 nm. Da mesma forma, um sistema de detecção por β- galactosidase pode ser utilizado, por exemplo, com o substrato cromogênico o-nitrofenil-p-D-galactopiranosida (ONPG) para dar origem a um produto so- lúvel detectável em 410 nm, ou um sistema de detecção por urease, utiliza- do, por exemplo, com um substrato como ureia-púrpura de bromocresol (Sigma Immunochemicals, St. Louis, Mo.). Anticorpos primários e secundá- rios ligados a enzimas úteis podem ser obtidos de alguns fornecedores co- merciais como Jackson Immuno-Research (West Grove, Pa.).

Em certas modalidades, os fragmentos C-terminais solúveis po- dem ser detectados e medidos empregando detecção por quimiolumines- cência. Por exemplo, em certas modalidades, anticorpos específicos contra o fragmento C-terminal do receptor de adiponectina são utilizados para cap- turar os fragmentos presentes na amostra biológica, e um anticorpo específi- co para os anticorpos específicos, e marcado por quimioluminescência, é empregado para detectar os fragmentos presentes na amostra. Qualquer marcação quimioluminescente e sistema de detecção podem ser utilizados nos métodos presentes. Anticorpos secundários quimioluminescentes po- dem ser obtidos de vários fornecedores comerciais como Amersham. Méto- dos de detecção de anticorpos secundários quimioluminescentes são co- nhecidos na técnica e não são aqui discutidos em detalhes.

A detecção por fluorescência pode ser útil também na detecção dos fragmentos do receptor de adiponectina em certos métodos da inven- ção. Fluorocromos úteis incluem, por exemplo, DAPI, fluoresceína, metais de lantanídeo, Hoechst 33258, R-ficocianina, B-ficoeritrina, R-ficoeritrina, roda- mina, vermelho do Texas e lissamina. Agentes de ligação específicos de a2- MG, HA, TIMP-1 ou YKL-40-fluoresceína ou rodamina marcada , como os anticorpos anti-a2-MG, anti-HA, anti-TIMP-1 , ou anti-YKL-40 ou anticorpos secundários de fluoresceína ou rodamina marcada podem ser úteis na in- venção. Anticorpos fluorescentes úteis podem ser obtidos comercialmente, por exemplo, de Tago Immunologicals (Burlingame, Calif.), conforme ainda descrito abaixo. Compostos fluorescentes podem ser acoplados quimica- mente a anticorpos sem alterarem a sua capacidade de ligação. Quando ativados por iluminação com luz de um comprimento especial de onda, o anticorpo marcado com o fluorocromo adsorve a energia luminosa, induzindo um estado de excitabilidade na molécula, seguido pela emissão de luz em uma cor característica, visualmente detectável com um microscópio de luz.

Radioimunoensaios (RIAs) podem ser úteis também em certos métodos da invenção. Estes ensaios são bem-conhecidos na técnica. Os radioimunoensaios podem ser conduzidos, por exemplo, com anticorpos pri- mários ou secundários marcados com 125I (Harlow e Lane, supra, 1988).

Um sinal emitido por um reagente detectável pode ser analisado, utilizando um espectrofotômetro para detectar a cor de um substrato cromo- gênico; um medidor de radiação para detectar radiação, como medidor de raios gama para detecção de 125I; ou um fluorômetro para detectar fluores- cência na presença de luz em um certo comprimento de onda. Quando um ensaio enzimático é utilizado, a análise quantitativa da quantidade de frag- mentos solúveis do receptor de adiponectina pode ser realizada empregando um espectrofotômetro como um Leitor de Microplacas EMAX (Molecular De- vices; Menlo Park, Calif.), de acordo com as instruções do fabricante. Os ensaios da invenção podem ser automatizados ou realizados roboticamente, se desejado, e o sinal de diversas amostras pode ser detectado simultanea- mente.

Os métodos da invenção abrangem também o uso de imunoen- saios com base em eletroforese capilar (CEIA), os quais podem ser automa- tizados, se desejado. Os imunoensaios podem ser utilizados também asso- ciados à fluorescência induzida por laser, conforme descrito, por exemplo em Schmalzing e Nashabeh, Electrophoresis 18:2184-93 (1997) e Bao1 J. Chromatogr. B. Biomed. Sei. 699:463-80 (1997). Imunoensaios com Iipos- somos, como imunoensaios com Iipossomo por injeção em fluxo e imunos- sensores com lipossomos, podem ser utilizados também para detectar a pre- sença de fragmento C-terminal solúvel de adiponectina ou para determinar um nível de fragmentos C-terminais de adiponectina, de acordo com certos métodos da invenção (Rongen et ai, J. Immunol. Methods 204:105-133 (1997)).

Imunoensaios enzimáticos do tipo "sanduíche" podem ser úteis em certos métodos da invenção. Em um ensaio tipo "sanduíche" com dois anticorpos, um primeiro anticorpo é ligado a um suporte sólido e é permitido que o antígeno ligue-se ao primeiro anticorpo. A quantidade de fragmentos C-terminais solúveis de adiponectina pode ser quantificada por medição da quantidade de um segundo anticorpo que se liga a este.

Em um método da invenção, a técnica quantitativa de Western Blotting pode ser utilizada também para determinar níveis de fragmento C- terminal solúvel de adiponectina. Os sinais obtidos pela análise de Western Blot podem ser quantificados por métodos bem-conhecidos, como densito- metria por varredura. A título de exemplo, amostras de proteína são subme- tidas à eletroforese em gel de Laemmli em SDS-PAGE a 10%. Anticorpos monoclonais murinos primários reagem com o gel e a ligação de anticorpos confirmada como sendo linear, empregando um método preliminar de expe- rimento "slot-blot". Anticorpos de cabra acoplados a anticorpo antiperoxidase de rábano de camundongo (BioRad) são utilizados como o anticorpo secun- dário, e a detecção do sinal executada empregando quimioluminescência, por exemplo, com o kit de quimioluminescência Renaissance (New England Nuclear; Boston, Mass.), de acordo com as instruções do fabricante. As au- torradiografias dos géis são analisadas, utilizando um densitômetro por var- redura (Molecular Dynamics; Sunnyvale, Calif.) e normalizadas em relação a um controle positivo. Os valores são relatados, por exemplo, sob a forma de relação entre o valor real e o valor positivo (índice densitométrico). Estes métodos são bem-conhecidos na técnica, conforme descritos, por exemplo, em Parra et ai, J. Vasc. Surg. 28:669-675 (1998).

Níveis de fragmentos de receptor de adiponectina podem ser determinados também utilizando microarranjos de proteínas. Métodos de produção de microarranjos de proteínas que podem ser adaptados para de- tecção de níveis proteicos em amostra clínica são descritos na técnica (con- sultar, por exemplo, Xiao et al. (2005), Mol Cell Endocrinol.; 230(1-2):95-10; Protein Microarrays (2004) Mark Schena (Ed) Jones & Bartlett Publishers, Inc.). A publicação da patente U.S. 2003/0153013 descreve métodos de de- tecção de proteínas, por exemplo, antígenos ou anticorpos, por imobilização de anticorpos em um microarranjo de proteínas sobre uma membrana e o contato do microarranjo com proteínas de detecção que podem ligar-se às proteínas para formar complexos proteicos. Semelhantemente, a Publicação da patente U.S. 2004/0038428 descreve métodos de construção de microar- ranjos de proteínas.

Em certas modalidades preferidas, uma amostra é analisada por meio de um biochip. Biochips compreendem geralmente substratos sólidos e possuem, de modo geral, uma superfície plana à qual um reagente de captu- ra (denominado também adsorvente ou reagente de afinidade) é fixado. A superfície de um biochip compreende freqüentemente uma multiplicidade de locais de possíveis ligações, cada um contendo o reagente de captura aco- plado.

Biochips de proteínas são aqueles adaptados para a captura de peptídeos. Muitos biochips de proteínas são descritos na técnica. Estes in- cluem, por exemplo, biochips produzidos por Ciphergen Biosystems, Inc. (Fremont, CA), Packard BioScience Company (Meriden CT), Zyomyx (Hay- ward, CA), Phylos (Lexington, MA) e Biacore (Uppsala, Suécia). Exemplos destes biochips de proteínas são descritos nas seguintes patentes ou publi- cações de pedidos de patentes: Patente U.S. N0 6 225 047; Publicação In- ternacional PCT N0 WO 99/51773; Patente U.S. N0 6 329 209, Publicação Internacional PCT N0 WO 00/56934 e Patente U.S. N0 5 242 828, aqui incor- porados em sua totalidade por referência neste pedido e para todas as fina- lidades.

Para uso neste pedido, os métodos de ensaio podem envolver a captura de fragmentos C-terminais do receptor de adiponectina sobre um substrato sólido. Tipicamente, estes fragmentos serão capturados empre- gando um reagente bioespecífico de captura como um anticorpo e, especi- almente, um anticorpo utilizado em imunoensaio. Reagentes de captura bio- específicos incluem aquelas moléculas que se ligam a um analito-alvo com afinidade de, por exemplo, pelo menos 10"9 Μ, 10"10 Μ, 10"11 M ou 10"12 M. Estas moléculas podem ser capturadas também por métodos não específi- cos, como materiais cromatográficos.

Em certas modalidades da presente invenção, pelo menos um fragmento C terminal do receptor de adiponectina será detectado por espec- trometria de massa. Exemplos de espectrômetros de massa incluem anali- sadores de tempo de vôo, de setor magnético, filtro de massa quadrupolo, de captura de íons, ressonância ciclotron de íons e de setor eletrostático, ou híbridos destes.

Uma técnica preferida de espectrometria de massa para uso na invenção é "Dessorção e lonização a Laser Realçado de Superfície" ou "SELDI," conforme descrita, por exemplo, nas Patentes U.S. N0 5 719 060 e N0 6 225 047, ambas de Hutchens e Yip, cada uma das quais aqui incorpo- radas, em sua totalidade, por referência neste pedido e para todas as finali- dades. Esta técnica refere-se a um método de espectrometria de íons por dessorção/ionização de fase gasosa (por exemplo, espectrometria de massa por dessorção/ionização a laser), na qual um analito é capturado sobre a superfície de uma sonda de SELDI que acopla a interface da sonda do es- pectrômetro de massa.

Uma versão de SELDI é denominada "espectrometria de massa por afinidade". Esta versão envolve o uso de sondas compreendendo uma superfície absorvente (uma "sonda de espectrometria de massa por afinida- de"). Nesse contexto, "sonda" refere-se a um dispositivo adaptado para aco- plar uma interface da sonda e para apresentar um analito à energia ionizante para ionização e introdução em um espectrômetro de massa. Uma sonda inclui tipicamente um substrato sólido flexível ou rígido, contendo uma super- fície de apresentação de amostra, sobre a qual um analito é apresentado à fonte de energia ionizante.

Outra versão da técnica SELDI é a Dessorção Limpa Realçada de Superfície ("SEND") que envolve o uso de sondas compreendendo molé- culas absorventes de energia, presas à superfície da sonda ("sonda SEND"). A expressão "moléculas absorventes de energia" (EAM) denota moléculas que são capazes de absorver energia de uma fonte de dessorção/ionização a laser e, posteriormente, de contribuírem para dessorção e ionização de moléculas do analito em contato com as mesmas. A categoria EAM inclui moléculas utilizadas em MALDI1 freqüentemente referidas como "matriz" e são exemplificadas por derivados do ácido cinâmico, ácido sinapínico (SPA), ácido ciano-hidróxi-cinâmico (CHCA) e ácido di-hidroxibenzoico, ácido ferúli- co e derivados de hidroxiaceto-fenona. Em certas modalidades, a molécula absorvente de energia é incorporada em um polímero linear ou de ligação transversal, por exemplo, polimetacrilato. Por exemplo, a composição pode ser um co-polímero de ácido a-ciano-4-metacriloiloxicinâmico e acrilato. Em outra modalidade, a composição é um co-polímero de ácido a-ciano-4- metacriloiloxicinâmico, acrilato e 3-(tri-etoxi)silil propil metacrilato. Em outra modalidade, a composição é um co-polímero de ácido a-ciano-4- metacriloiloxicinâmico e octadecilmetacrilato ("C18 SEND"). SEND é descrita ainda na Patente U.S. N° 6 124 137, aqui incorporada em sua totalidade por referência neste pedido e para todas as finalidades.

Uma "superfície seletiva" pode ser utilizada para capturar os fragmentos para análise por SELDI. A superfície seletiva possui um "adsor- vente", também denominado "grupamento de ligação" ou "reagente de cap- tura", preso à superfície. Um "adsorvente" ou "reagente de captura" ou "gru- pamento de ligação" pode ser qualquer material capaz de se ligar a um ana- lito. O reagente de captura pode estar diretamente preso ao substrato da superfície seletiva ou o substrato pode ser uma "superfície reativa", portando um "grupamento de ligação" capaz de se ligar ao reagente de captura, por exemplo, por meio de reação formando uma ponte covalente ou ponte cova- lente coordenada. Epóxido e carbodiimidazol são grupamentos reativos úteis para ligarem-se covalentemente a reagentes de captura, como anticorpos ou receptores celulares. Ácido nitriloacético e ácido iminodiacético são grupa- mentos reativos que funcionam como agentes quelantes para ligação de í- ons de metal que interagem de modo não covalente com peptídeos conten- do histidina.

Em certas modalidades, o adsorvente utilizado para capturar fragmentos C-terminais do receptor de adiponectina compreende um rea- gente de captura bioespecífico. Um "adsorvente bioespecífico" refere-se a um adsorvente que se liga a um analito com afinidade de, pelo menos, 10-9 Μ, 10-10 M1 10~11 M ou 10-12 Μ. O reagente de captura bioespecífico preferido é um anticorpo ou um fragmento de ligação deste. Este inclui imunoglobuli- nas intactas e as variantes e porções das mesmas bem-conhecidas na téc- nica, como fragmentos Fab', fragmentos F(ab)'2 e proteínas scFv. Outros reagentes de captura bioespecíficos incluem affibodies (Affibody, Teknikrin- gen 30, 6o andar 6, Caixa 700 04, Estocolmo SE-10044, Suécia, Patente US N° 5 831 012; consultar também Surface Logix, Inc., 50 Soldiers Field Place, Brighton, MA 02135 e Hodneland1 C. D. et ai, 2002, Proc. Natl. Acad. Sei. 99: 5048-5052)

Os fragmentos da presente invenção podem ser capturados so- bre adsorventes cromatográficos. "Adsorvente cromatográfico" refere-se a um material adsorvente utilizado tipicamente em cromatografia. Adsorventes cromatográficos incluem, por exemplo, membranas de nitrocelulose, materi- ais de troca iônica, quelantes de metal (por exemplo, ácido nitriloacético ou ácido iminodiacético), quelatos imobilizados de metal, adsorventes de intera- ção hidrofóbica, adsorventes de interação hidrofílica, corante, biomoléculas simples (por exemplo, nucleotídeos, aminoácidos, açúcares simples e ácidos graxos) e adsorventes de modo de ação misto (por exemplo, adsorventes de atração hidrofóbica/ repulsão eletrostática).

Em certas modalidades, um substrato contendo um adsorvente é posto em contato com a amostra, por exemplo, soro de paciente, por um período de tempo suficiente que permita que analitos-alvo que possam estar presentes liguem-se ao adsorvente. Após um período de incubação, o subs- trato é lavado para remoção de material não ligado. Quaisquer soluções a- dequadas de lavagem podem ser utilizadas; de preferência, são empregadas soluções aquosas. A extensão a qual as moléculas permanecem ligadas pode ser manipulada por ajuste do rigor da lavagem. As características de eluição de uma solução de lavagem podem depender, por exemplo, de pH, força iônica, hidrofobicidade, grau de tropismo caótico, força detergente e temperatura. Exceto a sonda com propriedades de SEAC e de SEND, uma molécula absorvente de energia é aplicada em seguida ao substrato conten- do os analitos-alvo ligados.

As biomoléculas ligadas ao substrato podem ser detectadas em um espectrômetro iônico de fase gasosa, como um espectrômetro de massa de tempo de vôo. Os analitos-alvo podem ser ionizados por uma fonte de ionização, como um laser, os íons gerados são coletados por uma monta- gem óptica de íons e, em seguida, um analisador de massa dispersa e anali- sa os íons em passagem. O detector traduz, em seguida, informação dos íons detectados em relações de massa para carga. A detecção de um anali- to-alvo envolverá tipicamente a detecção de intensidade de sinal. Dessa forma, tanto a quantidade como a massa do analito-alvo pode ser determi- nada.

Em outro método de espectrometria de massa, os analitos-alvo podem ser inicialmente capturados em uma resina cromatográfica com pro- priedades cromatográficas que se liga aos analitos-alvo, por exemplo, um anticorpo ou anticorpos. Neste exemplo, pode ser incluída uma resina imu- nocromatográfica que compreenda anticorpos que se ligam a fragmentos C- terminais do receptor de adiponectina. Material não ligado pode ser lavado da resina. Em seguida, os analitos-alvo podem ser eluídos da resina. Final- mente, os analitos-alvo eluídos podem ser detectados por MALDI ou por SELDI.

Análises de analitos por espectrometria de massa por tempo de vôo geram espectro de tempo de vôo. O espectro de tempo de vôo, final- mente analisado, não representa o sinal de um único pulso de energia ioni- zante comparado a uma amostra, porém sim, o somatório de sinais de al- guns pulsos. Isso reduz o ruído e aumenta o intervalo dinâmico. Estes dados de tempo de vôo são, em seguida, submetidos a processamento.

Os dados gerados por dessorção e detecção de analitos-alvo podem ser analisados com um computador digital programável. O programa de computador analisa os dados, indicando o número de proteínas detecta- das e, opcionalmente, a força do sinal e a massa molecular determinada pa- ra cada analito-alvo detectado. A análise de dados pode incluir etapas de determinação de força de sinal de um analito-alvo e remoção de dados que se desviam de uma distribuição estatística predeterminada. Por exemplo, os picos observados podem ser normalizados pelo cálculo da altura de cada pico em relação a alguma referência. A referência pode ser o ruído de fundo gerado pelo equipamento e produtos químicos, como a molécula absorvente de energia, sendo definida como zero na escala.

A análise envolve geralmente a identificação de picos no espec- tro que representam sinal emitido por um analito. A seleção de picos pode ser efetuada visualmente, porém há disponível um programa de computador que pode automatizar a detecção de picos. De modo geral, este programa funciona pela identificação de sinais com relação de sinal para ruído acima de um patamar selecionado e identificação da massa do pico no centroide do sinal do pico. Em uma aplicação útil, muitos espectros são comparados para identificar picos idênticos presentes em alguns percentuais seleciona- dos dos espectros de massa. Uma versão deste programa de computador agrupa todos os picos que aparecerem nos vários espectros em um intervalo definido de massa, e designa uma massa (M/Z) a todos os picos que estive- rem próximos ao ponto médio do agrupamento de massa (M/Z).

O programa de computador utilizado para analisar os dados po- de incluir um código de aplicação de algoritmo para a análise do sinal, vi- sando determinar se o sinal representa um pico em um sinal que correspon- da a um analito-alvo de acordo com a presente invenção. O programa de computador pode também submeter os dados em relação a picos observa- dos de analitos-alvo para construção de árvore de classificação ou análise ANN, a fim de determinar se um pico de analito-alvo ou combinação de picos de analitos-alvo está presente, indicando estado de doença cardiovascular. A análise dos dados pode ser "marcada" quanto a uma variedade de parâ- metros obtidos direta ou indiretamente, a partir da análise de espectrometria de massa da amostra. Estes parâmetros incluem, entre outros, a presença ou ausência de um ou mais picos, o formato de um ou de mais picos, o for- mato de um pico ou grupo de picos, a altura de um ou mais picos, o registro da altura de um ou mais picos e outras manipulações aritméticas de dados de altura de picos. IV. Anticorpos

Esta invenção provê ainda anticorpos que se ligam especifica- mente aos fragmentos C-terminais do receptor de adiponectina. Métodos de produção de anticorpos com especificidade de ligação para selecionar peptí- deos são bem-conhecidos na técnica. Por exemplo, estes anticorpos podem ser selecionados por imunização de um animal com a molécula-alvo, geran- do anticorpos e testando-os para identificar se um anticorpo em particular liga-se à molécula-alvo. Anticorpos que se ligam à molécula-alvo podem ser selecionados. Por exemplo, um que possa gerar anticorpos monoclonais contra estas moléculas.

A expressão "liga-se especificamente a" refere-se a uma reação de ligação que é determinante da presença de um alvo na presença de uma população heterogênea de outros produtos biológicos. Por conseguinte, sob condições designadas do ensaio, a região de ligação especificada liga-se, de preferência, a um alvo em particular e não se liga, em quantidade significati- va, a outros componentes presentes em uma amostra em teste. A ligação específica a um alvo, sob estas condições, pode requerer um grupamento de ligação, selecionado por sua especificidade em relação a um alvo em parti- cular. Uma variedade de formatos de ensaio pode ser utilizada para selecio- nar regiões de ligação que são especificamente reativas a um analito em particular. Uma reação específica ou seletiva terá, tipicamente, pelo menos, o dobro do sinal ou ruído de fundo, e mais tipicamente, mais de dez vezes o do fundo.

O termo "anticorpo" é utilizado no sentido mais amplo e inclui, especificamente, anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, composi- ções de anticorpos com especificidade poliepitópica, anticorpos bioespecífi- cos, dianticorpos (diabodies), quiméricos, de cadeia simples e humanizados, bem como fragmentos de anticorpos (por exemplo, Fab, F(ab')2 e Fv), desde que exibam a atividade biológica desejada. Anticorpos podem ser marcados para uso em ensaios biológicos (por exemplo, marcações com radioisótopos, marcações fluorescentes) para auxiliar na detecção do anticorpo. Anticorpos podem ser marcados/conjugados a moléculas repór- teres para uso em ensaios biológicos, (por exemplo, marcações com radioi- sótopos, marcações fluorescentes) para auxiliar na detecção dos fragmentos descritos neste pedido.

O termo "anticorpo monoclonal", conforme utilizado neste pedi- do, refere-se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos subs- tancialmente homogêneos, ou seja, os anticorpos, compreendidos na popu- lação, são individualmente idênticos, exceto por possíveis mutações que ocorram naturalmente e que podem estar presentes em quantidades míni- mas. Anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo direcionados contra um único sítio antigênico. Ademais, ao contrário de preparados con- vencionais de anticorpos (policlonais), que incluem tipicamente anticorpos diferentes direcionados contra determinantes diferentes (epítopos), cada an- ticorpo monoclonal é direcionado contra um único determinante sobre o an- tígeno. Além de sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajo- sos em que estes são sintetizados pela cultura de hibridoma não contamina- da por outras imunoglobulinas. O adjetivo "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como tendo sido obtido de uma população substancialmente ho- mogênea de anticorpos, não devendo ser interpretado como exigência de produção do anticorpo por qualquer método em particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem utilizados de acordo com a presente inven- ção podem ser criados pelo método de hibridoma, descrito pela primeira vez por Kohler et ai, Nature, 256: 495, 1975, ou por métodos de DNA recombi- nante (consultar, por exemplo, a patente U.S. N0 4 816 567, Cabilly et ai). Os "anticorpos monoclonais" podem ser isolados também de bibliotecas de anticorpos em fagos, empregando as técnicas descritas em Clackson et al, 624-628, 1991; Marks et ai, J. Mol. Biol., 222: 581-597, 1991, por exemplo.

Os anticorpos monoclonais neste pedido incluem, especifica- mente, anticorpos "quiméricos" (imunoglobulinas), nos quais uma parte da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga a seqüências correspon- dentes em anticorpos derivados de uma espécie em particular ou pertencen- tes a uma classe ou subclasse de anticorpos em particular, enquanto que o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo a seqüências corresponden- tes em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencente a uma outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como fragmentos destes anticorpos, desde que estes exibam a atividade biológica desejada (Cabilly et al, supra; Morrison, et al., Proc. Natl Acad.. Sei. U.S.A., 81: 6851-6855, 1984).

Anticorpos monoclonais podem ser obtidos por várias técnicas que especialistas na técnica estão familiarizados. Resumidamente, células do baço de um animal imunizado com um antígeno desejado são imortaliza- das por fusão com uma célula de mieloma (consultar, Kohler et al., Eur. J. Immunol., 6: 511-519, 1976). Métodos alternativos de imortalização incluem transformação com Vírus Epstein Barr, oncogenes ou retrovírus, ou outros métodos bem-conhecidos na técnica. Colônias, derivadas de um único tipo de célula imortalizada são investigadas quanto à produção de anticorpos da especificidade e afinidade desejada para o antígeno, e o rendimento dos anticorpos monoclonais, produzidos por estas células pode ser intensificado por várias técnicas, incluindo injeção na poço peritoneal de um hospedeiro vertebrado. Alternativamente, é possível isolar seqüências de DNA que codi- ficam um anticorpo monoclonal ou um fragmento de ligação deste, por var- redura de biblioteca de DNA de células B humanas, de acordo com o proto- colo geral descrito por Huse etal., Science, 246: 1275-1281, 1989.

Anticorpos monoclonais e soros policlonais podem ser coletados e titulados em comparação à proteína imunogênica em um imunoensaio, por exemplo, um imunoensaio de fase sólida com o imunogene imobilizado em suporte sólido. São selecionados tipicamente antissoros policlonais com títu- lo de 104 ou mais altos, e estes são testados quanto a sua reatividade cru- zada, empregando um imunoensaio de ligação competitiva, antissoros poli- clonais e anticorpos monoclonais específicos se ligarão geralmente com Kd pelo menos próxima de 0,1 mM, mais usualmente, pelo menos próxima de 1 μΜ, de preferência, pelo menos, próxima de 0,1 μΜ ou melhor, e o mais pre- ferível, 0,01 μΜ ou melhor.

Formas "humanizadas" de anticorpos não-humanos (por exem- plo, murinos) são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulinas ou fragmentos destas (como Fv, Fab1 Fab11 F(ab')2 ou outras subsequências de ligação de antígenos de anticorpos) que contêm seqüência mínima deri- vada de imunoglobulina não-humana. Anticorpos humanizados são, em grande parte, imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) em que resí- duos de uma região determinante de complementaridade (CDR) do deposi- tário são substituídos por resíduos de uma CDR de espécie não-humana (anticorpo doador) como camundongo, rato ou coelho com a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, resíduos da região es- trutural (FR) Fv da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos correspondentes não-humanos. Além disso, anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados nem no anticorpo receptor nem nas seqüências CDR importadas ou estruturais. Essas modificações são efetuadas para refinar ainda mais e otimizar o desempenho do anticor- po. De modo geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente pelo menos um e tipicamente dois domínios variáveis completos, em que todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem àquelas de uma imunoglobulina não-humana, e em que todas ou substancialmente to- das as regiões FR são aquelas de uma seqüência de imunoglobulina huma- na. O anticorpo humanizado compreenderá, de modo mais adequado, pelo menos uma parte de uma região constante (Fc) de uma imunoglobulina, tipi- camente aquela de uma imunoglobulina humana. Para obter mais detalhes, consultar Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Reichmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992. O anti- corpo humanizado inclui um anticorpo Primatized ™, em que a região de li- gação do antígeno do anticorpo é derivada de um anticorpo produzido pela imunização de macacos macaque com o antígeno de interesse.

Alguns imunogenes, compreendendo partes dos fragmentos descritos neste pedido, podem ser utilizados para produzir anticorpos que reagem especificamente com os fragmentos. Por exemplo, um fragmento da presente invenção pode ser isolado, empregando técnicas conhecidas na área. Proteína recombinante pode ser expressa em células eucarióticas ou procarióticas, conforme descrito acima, e purificadas, conforme descrito aci- ma. A proteína recombinante é o imunogene preferido para a produção de anticorpos monoclonais ou policlonais. Alternativamente, um peptídeo sinté- tico, derivado das seqüências expostas neste pedido, e conjugado a uma proteína transportadora pode ser utilizado como imunogene. Proteínas que ocorrem naturalmente podem ser utilizadas também em forma pura ou impu- ra. O produto é injetado, em seguida, em um animal capaz de produzir anti- corpos. Anticorpos monoclonais ou policlonais podem ser gerados, para uso subsequente em imunoensaios para medição da proteína.

Métodos de produção de anticorpos monoclonais são conheci- dos daqueles versados na técnica. Uma linhagem natural de camundongos (por exemplo, camundongos BALB/C) ou de coelhos é imunizada com a pro- teína, utilizando um adjuvante convencional, como adjuvante de Freund e um protocolo convencional de imunização. A resposta imunológica do animal ao preparado do imunogene é monitorada por coleta de sangue para teste e determinação do título de reatividade em relação às subunidades beta. Quando títulos apropriadamente altos de anticorpo contra o imunogene fo- rem obtidos, o sangue é coletado do animal e o antissoro preparado. O fra- cionamento posterior dos antissoros para enriquecimento de anticorpos rea- tivos à proteína pode ser efetuado, se desejado (consultar, Harlow e Lane, supra).

Em uma outra modalidade, anticorpos ou fragmentos de anticor- pos podem ser isolados de bibliotecas de anticorpos em fagos, gerados pe- las técnicas descritas em McCafferty et al., Nature, 348: 552-554, 1990; Clackson et ai, Nature, 352: 624-628, 1991; Marks, et ai, J. Mol. Biol., 222: 581-597, 1991, descrevem o isolamento de anticorpos murinos e humanos, respectivamente, empregando bibliotecas em fagos. Publicações subse- quentes descrevem a produção de anticorpos humanos de alta afinidade (intervalo de nM) por empilhamento de cadeias (Mark et ai, Bio/Technology, 10: 779-783, 1992), bem como infecção combinatória e recombinação in vi- vo, como uma estratégia para construção de bibliotecas muito grandes em fagos (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21: 2265-2266, 1993). Dessa forma, estas técnicas são alternativas viáveis para técnicas convencionais de hibridoma de anticorpo monoclonal para isolamento de anticorpos mono- clonais.

Em certas modalidades, os anticorpos são selecionados para distinguirem entre um fragmento C-terminal do receptor de adiponectina e outro, ou seja, os anticorpos são selecionados para ligarem-se especifica- mente a uma forma, porém não à outra, sob as mesmas condições utilizadas no ensaio.

De acordo com o mesmo, a presente invenção provê um anti- corpo que se liga especificamente a um epítopo de um fragmento do recep- tor de adiponectina com SEQ ID NO:1. Em certas modalidades, o anticorpo se ligará especificamente a uma região da SEQ ID NO:1, fora do domínio de ligação da adiponectina, ou seja, o anticorpo se ligará especificamente a um epítopo no espaço entre os resíduos 1-22 da SEQ ID NO:1. Em certas mo- dalidades, o anticorpo se ligará especificamente a um epítopo no espaço entre os resíduos 1-14, 2-14, 2-14, 3-14, 4-14, 5-14, 6-14, 7-14, 8-14, 9-14, 10-14, 14-22 ou no espaço entre os resíduos 23-34 da SEQ ID NO:1. Em certas modalidades, o anticorpo se ligará especificamente a um epítopo pre- sente em uma das seqüências SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22. Em certas modalidades, o anti- corpo se ligará especificamente a uma região das SEQ ID NOS:1-12, fora do domínio de ligação da adiponectina.

A presente invenção provê também um anticorpo que se liga especificamente a um epítopo de um fragmento do receptor de adiponectina com SEQ ID NO:23. Em certas modalidades, o anticorpo se ligará especifi- camente a uma região da SEQ ID NO:23, fora do domínio de ligação da adi- ponectina, ou seja, o anticorpo se ligará especificamente a um epítopo no espaço entre os resíduos 1-22 da SEQ ID NO:23. Em certas modalidades, o anticorpo se ligará especificamente a um epítopo no espaço entre os resí- duos 1-14, 2-14, 2-14, 3-14, 4-14, 5-14, 6-14, 7-14, 8-14, 9-14, 10-14, 14-22 ou no espaço entre os resíduos 23-34 da SEQ ID NO:23. Em certas modali- dades, o anticorpo se ligará especificamente a um epítopo presente em uma das seqüências SEQ ID NOs: 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 ou 44. em certas modalidades, o anticorpo se ligará especificamente a uma região das SEQ ID NOS: 23-44, fora do domínio de ligação da adiponectina.

V. Correlação de fragmentos do receptor de adiponectina com estados de doença

Para certos métodos descritos neste pedido, o nível de pelo me- nos um fragmento solúvel do receptor de adiponectina é determinado em amostras diferentes de um paciente, para quem informação de diagnóstico ou prognóstico é desejada, a fim de serem fornecidos perfis. Um perfil de uma amostra em particular é essencialmente "uma impressão digital" do es- tado da amostra. Um estado normal pode ser distinguido de um estado de doença, e entre estados de doença, tipos diferentes de prognóstico (pros- pectos bons ou ruins de sobrevida em longo prazo, por exemplo) podem ser determinados. O diagnóstico pode ser efetuado ou confirmado por compara- ção de amostras do paciente com os perfis conhecidos. Pela avaliação da evolução de fragmentos solúveis do receptor de adiponectina, em tempos diferentes durante a progressão da doença, o estágio da doença pode ser determinado, bem como o possível prognóstico.

Um princípio de estudos diagnósticos é a correlação dos resul- tados de um procedimento com parâmetros clínicos especificados. A corre- lação envolve necessariamente uma comparação entre dois ou mais grupos distinguidos pelo parâmetro clínico. Parâmetro clínico poderia ser, por e- xemplo, presença ou ausência de doença, risco de doença, estágio de do- ença, gravidade de doença, classe de doença ou resposta a tratamento de doença. Dessa forma, a pessoa que faz o diagnóstico utiliza esta correlação para qualificar o estado de um indivíduo, com relação ao parâmetro clínico. Ou seja, a pessoa que faz o diagnóstico usa os resultados de um procedi- mento em um indivíduo para classificar ou diagnosticar o estado de um indi- víduo com relação a um parâmetro clínico, a confiança do diagnósti- co/classificação estando relacionada ao poder de classificação ou separação dos sinais ou sintomas, utilizado no teste.

Os métodos descritos neste pedido de qualificação ou quantifi- cação de fragmentos solúveis do receptor de adiponectina fornecem infor- mação que pode ser correlacionada com condições patológicas, predisposi- ção para doença, monitoramento terapêutico, estratificação de risco, entre outros.

Os presentes métodos são particularmente úteis para diagnosti- car condições, avaliar se certos fármacos exibirão um efeito desejado e de- terminar prognósticos. Os presentes métodos podem ser utilizados para de- tecção precoce de doenças, bem como para otimização de protocolos de tratamento. De preferência, a condição, ou seja, o estado de doença, será alguma associada a padrões anormais de fragmentação de um receptor de adiponectina.

Para uso neste pedido, "diagnosticar uma condição" refere-se à determinação se um indivíduo possui ou não possibilidade aumentada de apresentar uma condição especificada. Testes utilizados para diagnosticar uma condição, como os ensaios aqui descritos, em certos casos podem não ser capazes de diagnosticar uma condição por si só, porém são utilizados em combinação com outros testes para diagnosticar uma condição. De a- cordo com o mesmo, o significado de "diagnosticar uma condição" pretende incluir quaisquer métodos que auxiliam também no diagnóstico de uma con- dição.

Em certas modalidades, o invento provê métodos de monitora- mento da progressão de estados de doença em um paciente. O método compreende tipicamente as etapas de fornecimento de uma primeira amos- tra biológica do paciente, de preferência, amostra de urina, plasma sangüí- neo, soro sangüíneo e/ou de sangue total, a medição de pelo menos um fragmento solúvel do receptor de adiponectina em uma primeira amostra biológica em um primeiro instante, o fornecimento de uma segunda amostra do paciente, a medição do fragmento solúvel do receptor de adiponectina na segunda amostra biológica em um segundo instante e a determinação de progressão do estado de doença no paciente, com base na alteração em quantidade do fragmento do receptor de adiponectina ou com base em com- paração de medições de uma população de controle. Pela medição dos fragmentos solúveis do receptor em amostras de um paciente ao longo do tempo, um clínico será capaz de determinar se o estado de doença piorou ou melhorou. Um clínico pode, por conseguinte, utilizar estas medições para ajustar o tratamento apropriadamente. Métodos de monitoramento da pro- gressão de estados de doença, compreendendo a determinação de nível de pelo menos um fragmento C-terminal solúvel podem ser combinados a ou- tros testes para monitorar progressão do estado de doença.

Os presentes inventores constataram que indivíduos com dese- quilíbrio de adipócitos possuem padrões diferentes de fragmentos do recep- tor de adiponectina no sangue daqueles em indivíduos normais. A presente invenção, por conseguinte, provê métodos de determinação se um indivíduo possui desequilíbrio de adipócitos pela determinação dos níveis de, pelo menos, um fragmento do receptor de adiponectina em amostra de líquido corporal do indivíduo.

Por exemplo, a fim de determinar se um indivíduo possui dese- quilíbrio de adipócitos, os níveis do fragmento descrito neste pedido poderi- am ser determinados. Em certas modalidades, a ausência ou presença de somente níveis muitos baixos de certos fragmentos, ou seja, fragmentos que possuem de 25 a 34 aminoácidos em extensão (ou seja, SEQ ID NOS: 1, 2, 4-11, 23, 24 e 26-33), e, de modo geral, não ligados, será indicativo de pos- sibilidade aumentada de apresentar desequilíbrio de adipócitos. Por outro lado, a presença de níveis normais destes fragmentos será indicativa de e- quilíbrio normal de adipócitos. Em certas modalidades, a presença de quan- tidades aumentadas de certos fragmentos menores, ou seja, fragmentos não ligados com 13 a 24 aminoácidos em extensão (ou seja, SEQ ID NOS: 3, 12- 22, 25 e 34-44) será indicativa de possibilidade aumentada de apresentar desequilíbrio de adipócitos. Por outro lado, a presença de níveis normais destes fragmentos será indicativa de equilíbrio normal de adipócitos. A pre- sença de níveis totais aumentados de fragmentos do receptor de adiponecti- na, ou seja, concentração total de fragmentos do receptor de adiponectina será indicativa de uma possibilidade correspondente de apresentar desequi- líbrio de adipócitos. À medida que níveis sangüíneos de adiponectina aumentam, o percentual de pacientes com doença aumenta. Em pacientes com níveis sangüíneos de adiponectina inferiores a aproximadamente 4,0 pg/ml, o nú- mero de pacientes diagnosticados com síndrome metabólica aumenta visi- velmente, bem como há aumento também do risco de doença da artéria co- ronária. Por exemplo, um indivíduo com níveis sangüíneos de adiponectina inferior ou igual a aproximadamente 4,0 pg/ml possui chance aumentada de apresentar doença da artéria coronária, comparado a de um indivíduo com níveis sangüíneos de adiponectina acima de 4,0 pg/ml (razão de chances (odds ratio) é maior do que 3,0, para homens e mulheres ou maior do que 1,7 em homens e maior do que 10 em mulheres). O termo adiponectina refe- re-se à adiponectina total medida, incluindo monômeros de extensão com- pleta, porções globular e não globular, bem como oligômeros de adiponecti- na. Os patamares podem ser ajustados para ensaios específicos, capazes de medir formas individuais.

Pela medição dos níveis destes fragmentos em uma amostra de líquido biológico, obtida de um indivíduo em instantes diferentes, pode ser determinado se o desequilíbrio de adipócitos está melhorando ou piorando. Da mesma forma, pela medição dos níveis destes fragmentos antes e depois de intervenção terapêutica, pode ser determinado se a terapia é efetiva.

A adiponectina é um adipócito envolvido em alguns estados de doença, incluindo, por exemplo, obesidade, resistência à insulina, diabetes tipo II, síndrome metabólica, dislipidemia, doença cardiovascular e hiperten- são. Para uso neste pedido, um indivíduo que apresenta hipoadiponectine- mia possui concentrações plasmáticas reduzidas de adiponectina, em com- paração a indivíduos normais. Indivíduos com hipoadiponectinemia podem ser identificados, utilizando os presentes métodos. Estes métodos podem ser utilizados para determinar o aparecimento de hipoadiponectinemia, a progressão de hipoadiponectinemia e/ou a eficácia de tratamento de hipoa- diponectinemia em um indivíduo. Da mesma forma, estes métodos podem ser utilizados para determinar o aparecimento de uma condição caracteriza- da por hipoadiponectinemia, progressão de uma condição caracterizada por hipoadiponectinemia e ou a eficácia de tratamento de uma condição caracte- rizada por hipoadiponectinemia em um indivíduo.

Por exemplo, a fim de determinar se um indivíduo apresenta hi- poadiponectinemia, é possível determinar os níveis do fragmento descrito neste pedido. Em certas modalidades, a ausência ou presença de níveis aumentados de certos fragmentos, ou seja, fragmentos geralmente não liga- dos com aproximadamente de 13 a 24 aminoácidos em extensão (ou seja, SEQ ID NOS: 3, 12-22, 25 e/ou 34-44) será indicativa de possibilidade au- mentada de apresentar hipoadiponectinemia. Em certas modalidades, a pre- sença de quantidades diminuídas de certos fragmentos maiores, ou seja, fragmentos geralmente não ligados com 25 a 34 aminoácidos em extensão (ou seja, SEQ ID NOS: ID NOS: 1, 2, 4-11, 23, 24 e/ou 26-33) será indicativa de possibilidade aumentada de apresentar hipoadiponectinemia. A presença de níveis aumentados de fragmentos totais do receptor de adiponectina, li- gados ou não à proteína transportador, ou seja, adiponectina, será geral- mente indicativa de uma possibilidade correspondente de apresentar hipoa-

Pela medição dos níveis destes fragmentos em uma amostra de líquido biológico, coletada de um indivíduo em instantes diferentes, é possí- vel determinar se a hipoadiponectinemia está melhorando ou piorando. Da mesma forma, pela medição dos níveis destes fragmentos, antes e depois de intervenção terapêutica, pode ser determinado se a terapia é efetiva.

Há sensibilidade normal à insulina quando esta faz com que a célula adiposa produza adiponectina. A adiponectina em extensão completa agrega-se em multímeros, denominados tipicamente de formas de BPM, MPM, BPM. A adiponectina interage com o receptor 2 de adiponectina, no fígado, e com o receptor 1 de adiponectina no músculo para interromper a produção de glicose e promover glicólise e oxidação de ácido graxo. O re- ceptor 1 da adiponectina reage com uma forma clivada de adiponectina, de- nominada adiponectina globular, enquanto que o receptor 2 da adiponectina reage com a adiponectina de extensão completa. Foi demonstrado por ou- tros que a adiponectina globular forma-se por ação da elastase sangüínea. A resistência à insulina ocorre quando os adipócitos tornam-se hipertróficos e produzem menos adiponectina em resposta à insulina. Nesse estado, as células tornam-se mais apoptóticas e a divisão celular diminui. Em resultado, níveis plasmáticos de adiponectina diminuem. Os níveis de insulina aumentam em um esforço para fazer com que as células liberem mais adiponectina. No entanto, à medida que a resistência à insulina piora, mais insulina e menos adiponectina são produzidas. A menor produção de adiponectina resulta em diminuição de glicólise e oxidação de ácidos graxos, no músculo, e impede que a produção de glicose, no fígado, seja interrompida.

Para uso neste pedido, resistência à insulina refere-se a uma diminuição, em um indivíduo, na ação biológica da insulina in vivo, conforme avaliada pela taxa de disposição de glicose na circulação sangüínea (por exemplo, para tecido sensível à insulina, como músculo, tecido adiposo e fígado).

Diabetes mellitus é definido como hiperglicemia crônica, decor- rente de secreção e/ou ação deficiente de insulina. As duas principais classi- ficações da doença são tipo I, que envolve destruição de células beta pan- creáticas, geralmente por processo autoimune, e tipo II, comprometimento da eficiência fisiológica da insulina, ou seja, resistência à insulina. Diabetes mellitus é freqüentemente diagnosticado pela primeira vez pela demonstra- ção de hiperglicemia por meio do uso de determinações aleatórias ou em jejum de glicose plasmática ou por teste oral de tolerância à glicose. Os tes- tes de tolerância à glicose não medem resistência à insulina.

Uma vez diagnosticado diabetes, ensaios para insulina e peptí- deo C podem ser utilizados para diferenciar entre diabetes tipo I e tipo II, e entre diabetes tipo Il1 para distinguir aqueles que requerem tratamento com insulina, daqueles que podem ser controlados com alteração de padrões dietéticos e de exercício. É difícil distinguir aqueles que necessitam trata- mento com insulina de casos limítrofes que podem ser controlados somente com alterações em dieta e exercício.

A insulina é um hormônio polipeptídico, liberado pelas células beta pancreáticas para reduzir níveis de glicose sangüínea pela promoção de absorção celular de glicose e supressão de glicose endógena. O precur- sor imediato da insulina é a pró-insulina (PM, 9 kDa), um polipeptídeo de cadeia simples, consistindo em 86 aminoácidos com três pontes dissulfeto. A clivagem proteolítica produz insulina (PM, 6 kDa) que consiste em 51 amino- ácidos em duas cadeias, unidas pelas duas pontes dissulfeto; e o peptídeo de conexão (peptídeo C, PM 3 kDa), um polipeptídeo de cadeia simples con- tendo 31 aminoácidos. Quantidades equimolares de insulina e peptídeo C são secretadas, em seguida, na circulação. As concentrações de peptídeo C circulante são aproximadamente de 5 a 10 vezes mais altas do que aquelas de insulina, em resultado da meia-vida muito mais longa do peptídeo C. O peptídeo C é, portanto, uma medida da produção natural de insulina do cor- po e pode ser medido na presença de insulina sintética intravenosa.

O padrão ouro para medição de resistência à insulina é o méto- do de clamp (valor M) para medir a taxa de infusão de glicose (GIR), ajusta- da pela taxa de infusão de insulina (IIR) de forma a manter um nível de gli- cose sangüínea. Uma segunda medição comum é a de glicose e insulina em jejum (HOMA-IR). Foi relatado que o valor M (conforme determinado pelo método de clamp de glicose, um padrão ouro), correlacionado com níveis sangüíneos de adiponectina, demonstra que a adiponectina pode ser um indicador de resistência à insulina. Uma correlação adicional é a medição de níveis sangüíneos de glicose e insulina em jejum, corrigidos por adiponectina (FBS x FIRI/AND) (glicose sangüínea em jejum χ nível de insulina em je- jum/adiponectina).

Os presentes métodos podem ser utilizados para identificar indi- víduos com resistência à insulina. Ademais, os presentes métodos podem ser utilizados para determinar a gravidade da resistência à insulina em indi- víduos diabéticos e para recomendar o tratamento apropriado.

Por exemplo, a fim de se determinar se um indivíduo possui re- sistência à insulina, é possível determinar os níveis do fragmento descrito neste pedido. Em certas modalidades, a ausência ou presença de níveis di- minuídos de certos fragmentos, ou seja, fragmentos com 25 a 34 aminoáci- dos em extensão e que são geralmente não ligados (ou seja, SEQ ID NOS: 1,2,4-11, 23, 24 e/ou 26-33) será indicativa de possibilidade aumentada de apresentar resistência à insulina. Por outro lado, a presença de níveis nor- mais destes fragmentos será indicativa de estado normal. Em certas modali- dades, a presença de níveis aumentados de certos fragmentos menores, ou seja, fragmentos não ligados com 13 a 24 aminoácidos em extensão (ou se- ja, SEQ ID NOS: 3, 12-22, 25 e/ou 34-44) será indicativa de possibilidade aumentada de apresentar resistência à insulina. Por outro lado, a presença de níveis normais destes fragmentos será indicativa de estado normal. Um aumento em concentração total de fragmentos do receptor de adiponectina (ligados ou não) em relação à proteína transportadora, ou seja, adiponectina, é geralmente indicativo de possibilidade aumentada de apresentar resistên- cia à insulina.

Pela medição dos níveis destes fragmentos, em uma amostra de líquido biológico, coletada de um indivíduo em instantes diferentes, é possí- vel determinar se a resistência à insulina está melhorando ou piorando. Da mesma forma, pela medição dos níveis destes fragmentos, antes e depois de intervenção terapêutica, pode ser determinado se a terapia é efetiva.

A síndrome metabólica tem sido associada a níveis reduzidos de adiponectina plasmática e pode ser monitorada com os métodos da presente invenção. A síndrome metabólica, também conhecida como síndrome X, cor- responde a um grupo de fatores de risco responsabilizado por aumento de morbidade na doença cardiovascular entre pacientes acima do peso e obe- sos e pacientes portadores de diabetes mellitus tipo 2.

A Organização Mundial da Saúde e o Programa Nacional de E- ducação Sobre Colesterol - Painel de Tratamento de Adultos dos Estados Unidos (NCEP-ATP III) estabeleceram critérios de diagnóstico para síndro- me metabólica. Para uso na presente invenção, síndrome metabólica é defi- nida pelos critérios de diagnóstico da OMS, conforme fornecidos abaixo (Darwin Deen, American Family Physician, 69(12) (2004) 2875-2882). CCS

Tabela 1

<table>table see original document page 43</column></row><table>

OMS = Organização Mundial da Saúde; ATP = Painel de Tratamento de A- dultos; IMC = índice de massa corporal; HDL = lipoproteína de alta densida- de.

*--A resistência à insulina é identificada pelo diabetes tipo 2 ou comprometi- mento da glicose em jejum.

Os presentes inventores constataram que o nível de fragmentos solúveis do receptor de adiponectina em líquido corporal é indicador de sín- drome metabólica em um indivíduo. De acordo com o mesmo, o presente método pode ser utilizado para identificar indivíduos portadores de síndrome metabólica. Estes métodos podem ser utilizados em combinação com qual- quer outro critério diagnóstico para identificar síndrome metabólica.

Por exemplo, a fim de determinar se um indivíduo possui sín- drome metabólica, é possível determinar os níveis do fragmento descrito neste pedido. Em certas modalidades, a ausência ou presença de níveis di- minuídos de certos fragmentos, ou seja, fragmentos com 25 a 34 aminoáci- dos em extensão (ou seja, SEQ ID NOS: 1, 2, 4-11, 23, 24 e/ou 26-33) e que estão geralmente não ligados será indicativa de possibilidade aumentada de apresentar síndrome metabólica. Por outro lado, a presença de níveis nor- mais destes fragmentos será indicativa de estado normal. Em certas modali- dades, a presença de quantidades aumentadas de certos fragmentos meno- res, ou seja, fragmentos com 13 a 24 aminoácidos em extensão (i.e., SEQ ID NOS: 3, 12-22, 25 e/ou 34-44), será indicativa de possibilidade aumenta- da de apresentar síndrome metabólica. Um aumento em concentração total de fragmentos do receptor de adiponectina, ligados ou não à proteína trans- portadora, ou seja, adiponectina, é geralmente indicativo de possibilidade aumentada de apresentar síndrome metabólica.

Síndromes coronárias agudas (SCA) têm sido aplicadas a um grupo de doenças coronárias que resultam de lesão isquêmica no coração. A síndrome coronária aguda é definida como obstrução vascular acima de 60% em avaliação por angiografia, acompanhado ou não de condição cardí- aca.

Os presentes inventores constataram que o nível de fragmentos solúveis do receptor de adiponectina em líquido corporal é indicador de obs- trução vascular em um indivíduo. De acordo com o mesmo, o presente mé- todo pode ser utilizado para identificar indivíduos com obstrução vascular. Estes métodos podem ser utilizados em combinação com qualquer outro critério diagnóstico para identificar obstruções vasculares.

Por exemplo, a fim de determinar se um indivíduo possui obstru- ção vascular, é possível determinar os níveis do fragmento descrito neste pedido. Em certas modalidades, a ausência ou presença de certos fragmen- tos, ou seja, fragmentos com 25 a 34 aminoácidos em extensão (ou seja, SEQ ID NOS: 1, 2, 4-11, 23, 24 e/ou 26-33), e que estão geralmente não ligados, será indicativa de possibilidade aumentada de apresentar obstrução vascular. Por outro lado, a presença de níveis normais destes fragmentos será indicativa de estado normal. Em certas modalidades, a presença de quantidades aumentadas de certos fragmentos menores, ou seja, fragmen- tos com 13 a 24 aminoácidos em extensão (ou seja, SEQ ID NOS: 3, 12-22, 25 e/ou 34-44) será indicativa de possibilidade aumentada de apresentar obstrução vascular. Por outro lado, a presença de níveis normais destes fragmentos será indicativa de estado normal. Um aumento em concentração total de fragmentos do receptor de adiponectina, ligados ou não à proteína transportadora, ou seja, adiponectina, é geralmente indicativo de possibilida- de aumentada de apresentar obstrução vascular.

Uma condição cardíaca, também conhecida como condição de doença cardiovascular, significa geralmente uma doença que resulta de in- suficiência cardiovascular, incluindo, entre outras, doença cardíaca coronari- ana (a qual inclui ainda infarto do miocárdio e angina pectoris) ou doença da artéria coronária, acidente vascular cerebral, insuficiência cardíaca congênita e insuficiência cardíaca congestiva, além de pressão arterial alta. A doença cardíaca coronariana inclui também infarto do miocárdio e angina pectoris. Doenças cardiovasculares são caracterizadas geralmente por comprometi- mento do suprimento sangüíneo para o coração ou outros órgãos visados. "Insuficiência cardíaca" refere-se a uma anormalidade da função cardíaca, em que o coração não bombeia sangue na taxa necessária requerida para metabolização de tecidos. A insuficiência cardíaca pode ser causada por diversos fatores, incluindo formas isquêmicas, congênitas, reumáticas ou idiopáticas.

A doença cardíaca coronariana (DCC) é causada pelo espessa- mento das paredes internas das artérias coronárias. Este espessamento, denominado aterosclerose, estreita o espaço através do qual o sangue pode circular, diminuindo e às vezes interrompendo completamente o suprimento de sangue e nutrientes para o coração. A aterosclerose ocorre geralmente quando uma pessoa possui níveis altos de colesterol no sangue. O coleste- rol e gordura, circulando no corpo, depositam-se sobre as paredes das arté- rias. O depósito provoca o estreitamento das artérias e pode retardar ou blo- quear o fluxo de sangue. Quando o nível de colesterol no sangue é alto, há uma chance maior de que se deposite sobre as paredes das artérias. Esse processo inicia, na maioria das pessoas, durante a infância e os anos de adolescência, piorando à medida que elas envelhecem.

A insuficiência cardíaca congestiva (ICC) é um estado patológico progressivo em que o coração torna-se cada vez mais incapaz de suprir o rendimento (output) cardíaco adequado (o volume de sangue bombeado pe- lo sangue continuamente) de fornecimento do sangue oxigenado para teci- dos periféricos. À medida que a ICC progride, ocorrem danos estruturais e hemodinâmicos. Embora estes danos possam manifestar-se de modo varia- do, um sintoma característico é hipertrofia ventricular. A ICC é o resultado final comum de algumas das várias doenças cardíacas.

O infarto do miocárdio resulta geralmente de aterosclerose das artérias coronárias, freqüentemente acompanhadas de trombose coronária. Ele pode ser dividido em dois tipos principais: infartos transmurais, em que a necrose do miocárdio envolve toda a espessura da parede ventricular, e in- fartos subendocárdicos (não transmural), em que a necrose envolve o sub- endocárdio, o miocárdio transmural, ou ambos, sem estender-se, atraves- sando a parede ventricular, até o epicárdio. O infarto do miocárdio é causa conhecida de alteração nos efeitos hemodinâmicos e na estrutura de áreas danificadas e saudáveis do coração. Portanto, por exemplo, o infarto do mio- cárdio reduz o rendimento cardíaco máximo e o volume de ejeção do cora- ção. A estimulação da síntese de DNA, que ocorre no interstício, bem como aumento na formação de colágeno nas áreas do coração não afetadas, são também associados a infarto do miocárdio.

Angina pectoris ("angina") é uma dor ou desconforto recorrente no tórax que ocorre quando alguma parte do coração não recebe sangue suficiente. É um sintoma comum da doença cardíaca coronariana (DCC) que ocorre quando vasos transportando sangue para o coração tornam-se estrei- tados e bloqueados em decorrência de aterosclerose.

O diagnóstico e monitoramento de todas estas doenças pelos presentes métodos são incluídos pela presente invenção.

Por exemplo, os presentes inventores constataram que o nível de fragmentos solúveis do receptor de adiponectina em líquido corporal é indicativo se um paciente, especialmente se este já sofrer de aterosclerose, desenvolverá ou apresentará possivelmente insuficiência cardíaca congesti- va, infarto do miocárdio ou isquemia. De acordo com o mesmo, o presente método pode ser utilizado para identificar indivíduos com insuficiência cardí- aca congestiva, infarto do miocárdio ou isquemia. Estes métodos podem ser utilizados em combinação com qualquer outro critério diagnóstico para iden- tificação dessas condições.

Por exemplo, a fim de determinar se um indivíduo apresenta ou possivelmente desenvolverá insuficiência cardíaca congestiva, infarto do miocárdio ou isquemia, é possível determinar os níveis dos fragmentos des- critos neste pedido. Em certas modalidades, a ausência ou presença de ní- veis diminuídos de certos fragmentos, ou seja, fragmentos com 25 a 34 ami- noácidos em extensão (ou seja, SEQ ID NOS: 1, 2, 4-11, 23, 24 e/ou 26-33), e que estão geralmente não ligados, será indicativa de possibilidade aumen- tada de apresentar insuficiência cardíaca congestiva, infarto do miocárdio ou isquemia. Por outro lado, a presença de níveis normais destes fragmentos será indicativa de estado normal. Em certas modalidades, a presença de quantidades aumentadas de certos fragmentos menores, ou seja, fragmen- tos não ligados com 13 a 24 aminoácidos em extensão (ou seja, SEQ ID NOS: 3, 12-22, 25 e/ou 34-44) será indicativa de possibilidade aumentada de apresentar insuficiência cardíaca congestiva, infarto do miocárdio ou isque- mia. Por outro lado, a presença de níveis normais destes fragmentos será indicativa de estado normal. Um aumento em concentração total de fragmen- tos do receptor de adiponectina, ligados ou não à proteína transportadora, ou seja, adiponectina, é geralmente indicativo de possibilidade aumentada de apresentar insuficiência cardíaca congestiva, infarto do miocárdio ou is- quemia.

Semelhantemente, os presentes métodos podem ser utilizados para identificar indivíduos com hipertensão, obesidade, Iipidemia ou inflama- ção. Estes métodos podem ser utilizados em combinação com qualquer ou- tro critério diagnóstico para identificar essas condições. Em todas estas con- dições, em certas modalidades, a ausência ou presença de níveis diminuí- dos de certos fragmentos, ou seja, fragmentos com 25 a 34 aminoácidos em extensão (ou seja, SEQ ID NOS: SEQ ID NOS: 1, 2, 4-11, 23, 24 e/ou 26- 33), e que estão geralmente não ligados, será indicativa de possibilidade aumentada de apresentar a condição. Por outro lado, a presença de níveis normais destes fragmentos será indicativa de estado normal. Em certas mo- dalidades, a presença de quantidades aumentadas de certos fragmentos menores, ou seja, fragmentos não ligados com 13 a 24 aminoácidos em ex- tensão (ou seja, SEQ ID NOS: 3, 12-22, 24 e/ou 34-44), será indicativa de apresentar a condição. Por outro lado, a presença de níveis normais destes fragmentos será indicativa de estado normal. Um aumento em concentração total de fragmentos do receptor de adiponectina, ligados ou não à proteína transportadora, ou seja, adiponectina, é geralmente indicativo de possibilida- de aumentada de apresentar a condição.

A presente invenção prove métodos diagnósticos, prognósticos e terapêuticos, utilizando a medição específica de, pelo menos, um fragmento descrito neste pedido. Os métodos envolvem inicialmente o fornecimento de uma medição do fragmento do receptor de adiponectina e, em seguida, a correlação da medida com um estado de doença. Pela correlação da medi- ção, é possível qualificar o estado do indivíduo, com relação ao parâmetro clínico especialmente em questão. Em uma modalidade preferida, a medição é efetuada por espectrometria de massa por afinidade, conforme discutido acima.

O poder de um teste diagnóstico de predizer corretamente um estado é comumente medido em termos de sensibilidade do ensaio, especi- ficidade do ensaio ou a área sob a curva característica operada de um rece- bedor ("ROC"). A sensibilidade é o percentual de positivos verdadeiros, pre- ditos por um teste como positivo, enquanto que a especificidade é o percen- tual de negativos verdadeiros, preditos por um teste como negativo. Uma curva ROC fornece a sensibilidade de um teste em função de 1- especificidade. Quanto maior a área sob a curva ROC, mais poderoso é o valor preditivo do teste. Outras medidas úteis da utilidade de um teste são o valor preditivo positivo e valor preditivo negativo. Valor preditivo positivo é o percentual de positivos que efetivamente tiveram resultado positivo no teste. Valor preditivo negativo é o percentual de negativos que efetivamente tive- ram resultado negativo no teste.

Três fragmentos descritos neste pedido, individualmente ou em combinação, são úteis em ajudar na determinação de status de doença. Em certas modalidades, inicialmente, o biomarcador selecionado, ou seja, o fragmento em particular, é medido em uma amostra de um indivíduo, em- pregando os métodos aqui descritos, por exemplo, captura em biochip de SELDI, seguida por detecção por espectrometria de massa. Em seguida, a medição é comparada com uma quantidade diagnostica ou limite de corte que distingue um parâmetro diagnóstico de outro, por exemplo, um parâme- tro positivo de resistência à insulina de um parâmetro negativo de resistência à insulina. A quantidade diagnostica representa uma quantidade medida de um biomarcador acima ou abaixo da qual um paciente é classificado como portador de uma doença em particular. Por exemplo, se o fragmento for re- gulado positivamente em comparação a normal no estado de doença, então, uma quantidade medida acima do limite de corte diagnóstico fornece um di- agnóstico de doença. Alternativamente, se o biomarcador é regulado negati- vamente na doença, então, uma quantidade medida abaixo do limite de corte diagnóstico fornece um diagnóstico da doença. Conforme é bem-entendido na técnica, pelo ajuste do limite de corte diagnóstico, utilizado em um ensaio, é possível aumentar a sensibilidade ou especificidade do ensaio diagnóstico, dependendo da preferência da pessoa que faz o diagnóstico.

Em algumas modalidades, a simples presença ou ausência de um fragmento em particular, sem a quantificação da quantidade do fragmen- to, é útil e pode ser correlacionada com um diagnóstico provável de doença, ou seja, resistência à insulina. Por conseguinte, uma presença ou ausência detectada, respectivamente, destes marcadores em um indivíduo pode indi- car que o indivíduo possui probabilidade mais alta de ser portador de resis- tência à insulina.

Em certas modalidades dos métodos de qualificação de status de doença, os métodos compreendem ainda o controle do tratamento de indivíduos com base no status. Este controle corresponde às ações subse- quentes do médico ou clínico para determinar status de doença. Por exem- plo, se um médico fizer diagnóstico de doença, então, um certo regime de tratamento será seguido. Por exemplo, para muitas pessoas, a doença car- díaca cardiovascular é controlada com mudanças de estilo de vida e medi- cações. Outras com doença cardíaca cardiovascular grave podem necessitar cirurgia. Em qualquer caso, uma vez desenvolvida a doença cardíaca cardi- ovascular, ela requer controle por toda a vida. Alternativamente, um diagnós- tico de ausência de estado de doença cardíaca coronariana ou de outra do- ença cardiovascular poderia ser seguido sem tratamento. Se o teste diag- nóstico fornecer um resultado inconcludente, sobre status de doença cardía- ca coronariana, poderá ser necessária a realização de outros testes.

Embora biomarcadores individuais sejam marcadores diagnósti- cos úteis, foi constatado que uma combinação de biomarcadores pode for- necer valor preditivo maior de um status em particular do que marcadores únicos isolados. Especificamente, a detecção de uma multiplicidade de mar- cadores em uma amostra pode aumentar o percentual de resultados positi- vos verdadeiros e negativos verdadeiros e diminuir o percentual de resulta- dos falso positivos ou falso negativos. De acordo com o mesmo, em certas modalidades, os presentes métodos envolvem a detecção de uma multiplici- dade dos fragmentos descritos neste pedido.

Dessa forma, em uma característica, esta invenção provê um método para descoberta de padrões de fragmentos do receptor de adiponec- tina que se correlacionam com um parâmetro clínico de interesse.

Em certas modalidades, a presente invenção provê métodos pa- ra medição da resposta à terapia, compreendendo as etapas de fornecimen- to de uma primeira amostra biológica, de preferência uma amostra de urina e/ou de plasma sangüíneo, medição da quantidade de, pelo menos, um fragmento solúvel do receptor de adiponectina na primeira amostra biológica em um primeiro instante, fornecimento de uma segunda amostra biológica do paciente, medição do fragmento na segunda amostra biológica em um segundo instante e de determinação da resposta no paciente, com base na alteração da quantidade do fragmento ou com base em comparação com uma população de controle. O indivíduo pode ser respondedor positivo, res- pondedor insuficiente ou não-respondedor. Para uso neste pedido, respon- dedor positivo é um indivíduo que responde positivamente a tratamento, ou seja, um indivíduo que obtém êxito em melhora da condição, incluindo qual- quer parâmetro objetivo ou subjetivo, como redução, remissão, diminuição de sintomas ou tornar a condição para mais tolerável para o paciente, dimi- nuição na taxa de degeneração ou declínio; tornar o ponto final de degene- ração menos debilitante ou melhora do bem-estar físico ou mental de um indivíduo. Um respondedor positivo é aquele no qual efeitos colaterais tóxi- cos ou nocivos do agente biologicamente ativo são superados, em termos clínicos, por efeitos terapeuticamente benéficos. Um não-respondedor é um indivíduo que não responde ao tratamento ou que não responde em nível satisfatório. Um respondedor insuficiente é um indivíduo que responde a tra- tamento, porém não no nível do respondedor positivo.

Em certas modalidades, em que o estado de doença é resistên- cia à insulina ou outra condição relacionada com resistência à insulina, como diabetes ou síndrome metabólica, o tratamento terapêutico compreende ge- ralmente a etapa de administração de uma quantidade efetiva de um ou mais produtos farmacêuticos de sensibilização à insulina. Produtos farma- cêuticos de sensibilização à insulina são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, agonistas de PPAR, como tiazolidinadiona (também referida como TZD), ou agonistas parciais de PPAR gama, conhecidos também co- mo moduladores seletivos de PPAR gama (SPPARM) , agonistas parciais duplos de PPAR alfa-gama (moduladores seletivos duplos de PPAR alfa- gama) e pan-agonistas de PPAR. Agonistas de PPAR gama com estrutura de TZD incluem pioglitazona, rosiglitazona, ciglitazona, darglitazona, englita- zona, balaglitazona, isaglitazona, troglitazona, netoglitazona, MCC-555 e BRL-49653. Outros agonistas de PPAR gama, alguns dos quais com estrutu- ra de TZD, incluem CLX-0921, 5-BTZD, GW-0207, LG-100641, LY-300512, NN-2344, LV 818, GW-677954, GW-7282 e T-131. Agonistas duplos de al- fa/gama PPAR exibem agonismo alfa e gama, podendo ser utilizados no tra- tamento de diabetes tipo 2 e para reduzir lipídeos. Agonistas de PPAR al- fa/gama incluem KRP-297 (MK-0767), muraglitazar (BMS-298585), farglita- zar, ragaglitazar, tesaglitazar (AZ-242), JT-501, GW-2570, GI-262579, CLX- 0940, GW-1536, GW1929, GW 2433, L-796449, LR-90, SB-219994, LY-578, LY-4655608, LSN-862, LY-510929 e LY-929.

Os métodos descritos neste pedido podem ser utilizados para determinar se é possível que um paciente responda a tratamento com qual- quer fármaco utilizado para tratar diabetes tipo 2 ou resistência à insulina, incluindo, por exemplo, biguanida (por exemplo, metformina); sulfonilureia; outra classe química de secretagogue de insulina, diferente de sulfonilureia, como meglitinida; insulina (que pode ser formulada para injeção subcutânea ou intramuscular, ou em uma fórmula que evite a necessidade de injeção, como oral, bucal ou nasal); inibidor de DP-IV ; inibidor de PTP-1B; análogo de GLP-1; inibidor de glicogênio fosforilase; antagonista do receptor de glu- cagon ; inibidor de hidroxiesterol desidrogenase (HSD-1); ativador de gluco- quinase ou agonista TZD ou não TZD de PPAR gama ou qualquer combina- ção de tratamento com estes.

Os métodos descritos neste pedido podem ser utilizados para determinar se um paciente possivelmente responderá a tratamento com qualquer fármaco utilizado para tratar obesidade, em paciente obeso que apresente também diabetes tipo 2 ou resistência à insulina, incluindo, por exemplo, ibutramina, orlistat, fentermina, agonista de Mc4r I, antagonis- ta/agonista invertido do receptor de canabinoide 1 (CB-1); agonista TZD ou não TZD de PPAR gama; ou qualquer combinação de tratamento com estes.

Os métodos descritos neste pedido podem ser utilizados para determinar se um paciente apresentará resposta a tratamento com qualquer fármaco utilizado para reduzir colesterol total ou colesterol HDL ou para ele- var o colesterol HDL1 incluindo, por exemplo, inibidor de HMG-CoA redutase (lovastatina, sinvastatina, rosuvastatina, pravastatina, fluvastatina, atorvasta- tina, rivastatina, pitavastatina, ZD-4522 e outras estatinas); niacina; inibidor de absorção de colesterol (ezetimibe); inibidor de CETP (torcetrapib); ago- nista de PPAR alfa (fenofibrato, genfibrizol, clofibrato ou bezafibrato); inibidor de ACAT (avasimibe); antioxidante (probucol); ou seqüestrador de ácido bili- ar (colestiramina) ou agonista TZD ou não TZD de PPAR gama; ou qualquer combinação de tratamento com estes.

Em certas modalidades, o nível de fragmentos do receptor de adiponectina é determinado antes de ser iniciado tratamento e, em seguida, depois que o tratamento prosseguiu por tempo suficiente para que ocorram as alterações no nível ou padrões dos fragmentos que reflitam se o paciente responderá a tratamento. Depois que o tratamento prosseguiu, um paciente que possivelmente responde à terapêutica terá aumentado os níveis de cer- tos fragmentos, ou seja, fragmentos com 25 a 34 aminoácidos em extensão (ou seja, SEQ ID NOS: 1, 2, 4-11, 23, 24 e/ou 26-33) e que geralmente não são ligados, e diminuído quantidades de certos fragmentos menores, ou se- ja, fragmentos com 13 a 24 aminoácidos (ou seja, SEQ ID NOS: 3, 12-22, 24 e/ou 34-44).

Em certas modalidades, as diferenças serão observadas em quatro semanas após o início do tratamento, de preferência em duas sema- nas após o início do tratamento e o mais preferível em uma semana após o início do tratamento. VI. Biomarcadores adicionais

Em certas modalidades, a avaliação de um ou mais marcadores adicionais é combinada para aumentar o valor preditivo da análise, em com- paração àquele obtido de medição isolada de fragmentos do receptor de a- diponectina. Por exemplo, um ou mais marcadores para o estado de doença, ou seja, desequilíbrio de adipócitos, resistência à insulina, diabetes, síndro- me metabólica, síndrome coronariana aguda (ou seja, obstrução vascular), doença cardíaca cardiovascular, acidente vascular cerebral, insuficiência cardíaca congênita, insuficiência cardíaca congestiva, hipertensão, angina, infarto do miocárdio, isquemia, aterosclerose, obesidade, lipidemia ou infla- mação, podem ser medidos juntamente com fragmentos do receptor de adi- ponectina para intensificar o valor preditivo dos métodos descritos. Biomar- cadores que podem ser utilizados em combinação com os presentes méto- dos incluem, por exemplo, fatores relacionados a adipócito, por exemplo, adiponectina, leptina, visfatina, klotho, peptídeo 1 semelhante a glucagon (GLP-1), DDPIV, resistina, grelina, proteína quinase ativada por AMP (AMPK), Sirtl1 agonistas de PPAR1 ARNT (translocador nuclear de receptor aril hidrocarboneto), HIF1B, peptídeo C, Foxa2, insulina ou glicose, incluindo fragmentos, peptídeos e variantes destes e/ou marcadores de inflamação, por exemplo, RBF-4, proteína C reativa (CRP)1 resistina, MCP-1, IL-6, TNF- a, IL-1 beta, PAI-1, bicunina, fatores autoimunes, auto-anticorpos contra áci- do glutâmico, auto-anticorpos contra células de ilhotas, auto-anticorpos con- tra insulina, auto-anticorpos contra IL-2, auto-anticorpos contra IA-2, increti- nas e outros fatores autoimunes e fragmentos, peptídeos ou variantes des- tes.

Os métodos descritos neste pedido podem ser utilizados em combinação com quaisquer outros testes que ajudarão no diagnóstico de uma doença, determinação de progressão de uma doença ou determinação de eficácia de tratamento de uma doença.

Em certas modalidades, os níveis de adiponectina serão medi- dos também no indivíduo. Métodos de medição de adiponectina e correlação de níveis de adiponectina com estados de doença são conhecidos na técni- ca, consultar, por exemplo, a patente U.S. No. 6 461 821, Publicações U.S. Nos. US 20050054005 e US 20050048565 e Publicação Internacional Nú- meros WO 2004086040, WO 2005046734, WO 2005038457 e WO 2004022596, cada um dos quais aqui incorporados, em sua totalidade, por referência neste pedido e para todas as finalidades. Para uso neste pedido, o termo adiponectina inclui variantes desta com atividade de adiponectina. Em certas modalidades, a quantidade de adiponectina total, as quantidades de adiponectina de baixo peso molecular e de alto peso molecular ou a rela- ção entre esses números será utilizada em combinação com os métodos da presente invenção. De acordo com o mesmo, estes métodos podem incluir a etapa de medição do nível de adiponectina (adiponectina total, adiponectina de alto peso molecular, adiponectina de baixo peso molecular ou outras for- mas de adiponectina, incluindo fragmentos e variantes desta), em uma a- mostra biológica de um indivíduo, e correlação da quantidade com a presen- ça de um estado de doença, progressão de doença ou eficácia de tratamen- to. Quantidades reduzidas de adiponectina são indicativas de doença, bem como relação menor entre adiponectina de alto ou baixo peso molecular e total.

Em certas modalidades, níveis de Ieptina serão medidos no indi- víduo. Métodos de medição de leptina, incluindo variantes desta, e correla- ção de níveis de leptina com estados de doença são conhecidos na técnica (consultar, por exemplo, Gorden e Gavrilova, Current Opinon in Pharmaco- logy, (2003) 3:655-659, aqui incorporado em sua totalidade por referência neste pedido e para todas as finalidades).

Em certas modalidades, níveis de peptídeo natriurético cerebral (BNP) podem ser medidos para ajudar no diagnóstico ou progressão de obs- trução vascular e doença cardiovascular. Métodos de medição de níveis de BNP e correlação destes com estados de doença são conhecidos na técni- ca. Consultar, por exemplo, Frank Peacock, Cleveland Clinic Journal of Me- dicine (2002), 69(3) 243-251, aqui incorporado em sua totalidade por refe- rência neste pedido e para todas as finalidades.

Os presentes métodos podem ser utilizados para identificar indi- víduos com inflamação e certas doenças, caracterizadas por inflamação ex- cessiva. Estes métodos podem ser associados a métodos conhecidos de determinação de níveis de inflamação em um indivíduo.

Em certas modalidades, níveis de bicunina e/ou uristatina serão medidos no indivíduo. Bicunina representa a cadeia leve inibidora da proteí- na inibidora inter-a-tripsina. Esta é inibidor de uma protease, conhecida co- mo estando elevada na urina de pacientes com doenças inflamatórias e é considerada uma proteína de fase aguda. Para uso neste pedido, bicunina inclui variantes desta com atividade de bicunina. Uristatina é um inibidor de tripsina, presente na urina, que está aumentado na maioria dos pacientes com infecções bacterianas ou virais, e em muitos com distúrbios inflamató- rios. Métodos de medição de bicunina ou uristatina, incluindo variantes des- tas, e correlação de níveis de bicunina ou uristatina com estados de doença são conhecidos na técnica. (Pugia e Lott, Clin. Chem Lab Med 2005 43(1 ):1- 16, Publicação Internacional No. WO 200504022, cada um dos quais aqui incorporados, em sua totalidade, por referência neste pedido e para todas as finalidades).

Em certas modalidades, níveis de proteína C reativa serão me- didos no indivíduo. Métodos de medição de proteína C, incluindo variantes desta, e correlação de níveis de proteína C com estados de doença são co- nhecidos na técnica. Por exemplo, proteína C reativa presente no soro san- güíneo durante episódios de inflamação ou infecção aguda. Níveis de CRP próximos de 1 mg/dl são geralmente considerados altos para CRP, e a maio- ria das infecções e inflamações levam a níveis de CRP acima de 10 mg/dl. Para uso neste pedido, proteína C reativa inclui variantes destas com ativi- dade de proteína C reativa (Pugia e Lott, Clin. Chem Lab Med 2005 43(1 ):1- 16, aqui incorporado em sua totalidade por referência neste pedido e para todas as finalidades).

Em certas modalidades, contagem de leucócitos pode ser asso- ciada aos métodos descritos neste pedido. Métodos de medição de leucóci- tos e correlação de níveis de leucócitos com estados de doença são conhe- cidos na técnica. Contagem de leucócito (WBC) ou a medição de leucócitos no sangue, é um marcador confiável e amplamente utilizado que reflete in- flamação em todo o corpo. A contagem de leucócitos é vinculada também a outras condições crônicas, incluindo doença cardiovascular, hipertensão e diabetes.

Em certas modalidades, medições de glicose em jejum, tolerân- cia à glicose e/ou níveis de peptídeo C estimulado por glucagon serão efetu- adas no indivíduo. Métodos de medição de insulina e peptídeo C, incluindo variantes destes, e correlação dos níveis de insulina e peptídeo C com esta- dos de doença são conhecidos na técnica. Por exemplo, níveis de peptídeo C estimulado por glucagon acima de aproximadamente 1,8 ng/ml foram rela- tados para identificar diabetes tipo 2, que poderia ser controlado sem trata- mento com insulina. Tipicamente, o limite superior de 3,0 ng/ml utilizado é indicativo de hiperinsulinemia ou resistência à insulina. O intervalo normal de referência, para adultos normais, é de 0,5 - 2 ng/ml. Em modalidades em que um ou mais marcadores são utilizados em combinação com fragmentos do receptor de adiponectina para aumentar o valor preditivo da análise, o nível dos marcadores adicionais pode ser me- dido na mesma amostra biológica do indivíduo ou em outra, a qual pode ser do mesmo tipo ou de tipo diferente. Por exemplo, o nível de fragmentos do receptor de adiponectina pode ser medido em uma amostra de plasma san- güíneo, enquanto o nível de um marcador adicional pode ser medido na mesma amostra de plasma, uma amostra diferente de plasma ou em uma amostra de soro ou urina do indivíduo. VII. Estados adicionais de doença

A adiponectina está envolvida em muitos processos e vias no corpo. De acordo com o mesmo, a detecção do padrão de fragmentação de fragmentos do receptor de adiponectina pode ser utilizada para determinar o aparecimento, monitorar a progressão e/ou determinar a eficácia do trata- mento com fármacos de muitos estados de doença. Especialmente, a detec- ção de fragmentos solúveis do receptor de adiponectina pode ser utilizada em combinação com outros métodos e ferramentas diagnosticas para de- terminar o aparecimento, monitorar a progressão e/ou determinar a eficácia de tratamento com fármacos de muitos estados de doença. Especialmente, a detecção de fragmentos solúveis do receptor de adiponectina pode ser associada à transformação angiogênica, aterogênica e de macrófagos de células. O receptor 1 da adiponectina é regulado positivamente por ligação com receptores nucleares LXR, os quais são ativados por ácidos graxos e os receptores LXR integram a transformação de macrófagos. Foi demonstrado que a expressão do receptor 1 da adiponectina aumenta também durante a transformação de monócitos.

De acordo com o mesmo, doenças inflamatórias, ou seja, doen- ça desencadeada por mediadores celulares ou extracelulares do sistema imunológico ou de tecidos que causam a inflamação de tecidos do corpo e, subseqüentemente, produz uma condição inflamatória aguda ou crônica, podem ser detectadas e monitoradas, empregando os presentes métodos. Exemplos desta doença incluem, por exemplo, hipersensibilidade do tipo I- IV, por exemplo, doença de hipersensibilidade do pulmão, incluindo asma, doenças atópicas, rinite ou conjuntivite alérgica, angioedema das pálpebras, angioedema hereditário, reações de hipersensibilidade a antirreceptor e do- enças autoimunes, tireoidite de Hashimoto, lúpus eritematoso sistêmico, sín- drome de Goodpasture, pênfigo, miastenia grave, doença de Grave e de Raynaud, artrite reumatoide, psoríase, doença de Crohn, esclerodermia, do- ença mista de tecido conjuntivo, polimiosite, sarcoidose, infecção do trato urinário, nefropatia por IgA, glomerulonefrite, reações agudas ou crônicas contra enxertos de hospedeiro.

Cânceres podem ser detectados e monitorados também pelos presentes métodos. Câncer refere-se a qualquer uma de algumas doenças, caracterizadas por proliferação não controlada e anormal de células, a capa- cidade de células afetadas disseminarem-se em nível local ou através do sistema sangüíneo e linfático para outras partes do corpo (ou seja, de formar metástases), bem como por qualquer uma de algumas características estru- turais e/ou moleculares. O termo câncer inclui, entre outros, cânceres dos órgãos reprodutores femininos, incluindo, entre outros, câncer de ovário, câncer cervical e câncer de útero; câncer de pulmão; câncer de mama; car- cinoma de célula renal; Iinfoma de Hodgkin; Iinfoma não de Hodgkin; cânce- res do sistema genitourinário, incluindo, entre outros, câncer de rim, câncer de próstata, câncer de bexiga e câncer de uretra; cânceres da cabeça e pescoço; câncer de fígado; cânceres do sistema gastrointestinal, incluindo, entre outros, câncer de estômago, câncer de esôfago, câncer de intestino delgado ou câncer de colo; cânceres das vias biliares; câncer de pâncreas; cânceres do sistema reprodutor masculino, incluindo, entre outros, câncer de testículo; doença trofoblástica gestacional; cânceres do sistema endócrino, incluindo, entre outros, câncer de tiroide, câncer de paratireoide, câncer de glândula adrenal, tumores carcinoides, insulinomas e tumores PNET; sarco- mas, incluindo, entre outros, sarcoma de Ewing, osteossarcoma, Iipossar- coma, Ieiomiossarcoma e rabdomiossarcoma; mesoteliomas; cânceres da pele; melanomas; cânceres do sistema nervoso central; cânceres pediátricos e cânceres do sistema hematopoiético, incluindo, entre outros, todas as for- mas de leucemia, síndromes mielodisplásicas, doenças neuroproliferativas e mieloma múltiplo. VIII. Kits

Para uso nas aplicações descritas ou sugeridas acima, kits são providos também pela invenção. Estes kits podem, por exemplo, compreen- der um meio de transporte, dividido em compartimentos fechados para alojar um ou mais recipientes, contendo tiras, cassetes, chips de microfluido, fras- cos, tubos e similares, cada um destes recipientes compreendendo cada um dos elementos a serem utilizados no método. Por exemplo, um dos recipien- tes pode compreender uma sonda que está marcada ou que pode ser mar- cada para detecção. Esta sonda pode ser um anticorpo ou polinucleotídeo específico para um fragmento C-terminal solúvel do receptor.

Ademais, os kits podem incluir material de instruções contendo orientações (ou seja, protocolos) para a prática dos métodos desta invenção. Embora o material de instrução compreenda tipicamente material escrito ou impresso, ele não se limita a tanto. Qualquer meio capaz de armazenar es- tas instruções e para comunicá-las a um usuário final é contemplado por es- ta invenção. Estes meios incluem, entre outros, meio de armazenamento eletrônico (por exemplo, discos magnéticos, fitas, cartuchos, chips e simila- res), meios ópticos (por exemplo, CD ROM) e similares. Estes meios podem incluir endereços de sites da Internet que forneçam este material de instru- ções.

O kit pode compreender também, por exemplo, um meio para se obter uma amostra biológica de um indivíduo. Meios para obter amostras biológicas de indivíduos são bem-conhecidos na técnica, por exemplo, cate- teres, seringas e similares, e não são aqui discutidos em detalhes.

Os Exemplos seguintes de Modalidades de características espe- cíficas para condução da presente invenção são fornecidos somente a título de ilustração e não pretendem limitar a abrangência da presente invenção de forma alguma. Exemplos

Exemplo 1 - Detecção de fragmentos C-terminais em indivíduos diabéticos Cento e dezesseis pacientes foram avaliados pela história médi- ca. Cinqüenta não possuíam história de diabetes ou fatores de risco metabó- Iico (lipídeos, hipertensão, obesidade) e não foram diagnosticados como por- tadores de síndrome metabólica, de acordo com a definição da OMS. Ses- senta e nove possuíam história de diabetes do Tipo 1 ou Tipo 2. A resistên- cia à insulina foi ainda avaliada em todos os pacientes por medição de glico- se, peptídeo C e hemoglobina A1c.

Adiponectina1 peptídeo C1 insulina e Adiponectina de APM foram medidos com um kit comercial de ELISA. A HbAIc foi medida com o apare- Iho DCA 2000+ (Bayer) e a glicose, pelo YSI. O ensaio seguinte ELISA de AdipoRI foi utilizado para medir todos os fragmentos C-terminais, quer liga- dos ou não.

Os materiais para o ensaio ELISA de fragmento C-terminal do AdipoRI incluíram placas de microtitulação (Costar PN 3690, alta ligação;), Tampão Tris Salino (TBS) (Pierce, Número do Produto 28376). Peptídeo (peptídeos 16-34) do receptor 1 da Adiponectina (AdipoRI) (Phoenix Phar- maceuticals, Inc., Número do Produto 001-44), Super Block em TBS (Pierce, Número do Produto 37535), TBS/TW - Tampão Tris Salino contendo Tween 20 a 0,05% (Tween 20 - Pierce, Número do Produto - P8341), anticorpo anti- AdipoRI de coelho ( Phoenix Pharmaceuticals, Inc., Número do Produto G- 001-44), IgG de cabra anti-ALP de coelho (Sigma, Número do Produto A 3687), 1-Step PNPP (Pierce, Número do Produto 37621) e NaOH a 2N.

Os reagentes foram preparados conforme segue. Uma solução de estoque de peptídeo de AdipoRI (Phoenix Pharmaceuticals, Inc., Número do Produto 001-44) foi preparada, dissolvendo-se 100 pg de peptídeos em 100 ul de Acetonitrila a 60%, contendo TFA a 0,1%, conforme orientado. Es- ta solução foi ainda diluída de 1,0 mg/ml para 10 ml com água nanopura, visando uma solução de estoque de 10 pg/ml de aa. Esta solução foi reparti- da em alíquotas de 500 μΙ por frasco, sendo armazenadas congeladas a - 70 °C. Foi utilizado 0,10 pg/ml de peptídeo de AdipoRI em TBS para revestir as placas, e foi preparado pelo acréscimo de 100 μΙ de peptídeo de AdipoRI a 10 μg/ml em TBS (A acima) para 9900 μΙ de TBS e misturando bem. Uma solução de estoque de anti-AdipoR1 de Coelho (Phoenix Pharmaceuticals1 Inc., Número do Produto G-001-44) foi preparada pela dissolução de 200 pg de anticorpo em 200 μΙ de água nanopura, conforme orientado. Esta solução é repartida em alíquotas de 50 μΙ e armazenada congelada a -70°C. Uma solução de 6,0 μg/ml de anti-AdipoR1 de Coelho em Super Blocker é feita pelo acréscimo de 18,0 μΙ de anti-AdipoR1 de estoque em 2982 μΙ de Super Blocker, misturando-se bem. Uma solução de 3,7 pg/ml de anti-AdipoR1 de Coelho em Super Blocker (utilizada para diluir, 5 vezes, amostras de plas- mas; alterar concentração para outras diluições) foi preparada pelo acrésci- mo de 56,2 μΙ de anti-AdipoR1 de estoque (C) a 15.000 μΙ de Super Blocker, misturando-se bem. Foi efetuada uma diluição de 1/2000 da IgG de cabra anti-ALP de coelho pelo acréscimo de 7,5 μΙ de IgG de Cabra anti-ALP de coelho IgG (Sigma, Número do Produto A 3687) em 15,0 ml de Superbloc- ker, misturando-se bem.

O preparo de calibradores foi efetuado com peptídeo de Adi- poR1 em superblocker, contendo 3,0 pg/ml de anti-AdipoR1 de Coelho para atingir concentrações de peptídeo de AdipoRI de 5,0; 2,5; 1.25; 6,25; 0,312; 0,156; 0,078 eO pg/ml.

O método do Ensaio ELISA de AdipoRI foi efetuado pelo reves- timento da placa de microtitulação com 50 μΙ/poço de peptídeo de AdipoRI a 0,10 pg/ml em TBS, e armazenamento a 4 0C por no mínimo 72 horas, re- moção da placa revestida de microtitulação do refrigerador e esvaziamento da placa e lavagem 3 vezes com 200 μΙ/poço de TBS. Essa etapa foi segui- da pelo acréscimo de 50 μΙ de tampão Super Block (Pierce NP 37535) a ca- da poço e agitação da placa por 30 minutos a 25 0C. A placa foi esvaziada e lavada 5 vezes com TBS/TW. Essa etapa foi seguida pelo acréscimo dos calibradores preparados contendo 5000, 2500, 1250, 625, 312, 156, 78 e 0 ng/ml de peptídeo de AdipoRI ou de amostras diluídas 5 vezes com tampão blocker. Todas as amostras e calibradores continham 3,0 pg/ml de anti- AdipoRI de Coelho. As amostras ou calibradores foram acrescentados, em 50 μΙ/poço, e incubados durante a noite a 5 0C em um refrigerador. Essa e- tapa foi seguida pelo esvaziamento da placa e lavagem 5 vezes com TBS/TW.

A diluição de 1/2000 de IgG de Cabra anti-ALP de coelho em Super Blocker foi acrescentada, em 50 μΙ/poço, a todas as poços no Modelo de ELISA. Este foi incubado por 2 horas a 25°C no Agitador Jitterbugl na velocidade de agitação n° 2. A placa foi esvaziada e lavada 5 vezes com TBS/TW. 50 μΙ de 1-Step PNPP (Pierce NP 37621) foram acrescentados a cada poço. A placa foi incubada por 30 min a 25 0C no Agitador Jitterbug. 25 μΙ de NaOH a 2N foram acrescentados a cada poço para interromper a rea- ção enzimática. A placa foi deixada em repouso por, pelo menos, 5 min an- tes de leitura a 405 nm. Foi efetuado ajuste de dados de calibrador para uma curva padrão e cálculo de desconhecidos (Declínio de fase única exponenci- al fornece o melhor ajuste) para calcular os valores na amostra.

A adiponectina diminui com diabetes tipo 2. Ela permanece inal- terada com diabetes tipo 1. A adiponectina foi mais alta em controles nor- mais e pacientes Tipo 1, comparado a Tipo 2 (consultar Tabela 2). A adipo- nectina diminuiu e, em seguida, aumentou com HbA1c. Todas as diferenças foram pequenas e não muito significativas com valores T abaixo de 1,4 (Pro- babilidade <80% de significância). As diferenças de adiponectina não foram preditivas de IMC (índice de massa corporal).

O uso de uma relação entre Adiponectina de APM/Totla melhora diferenças em populações e mantém as mesmas tendências observadas com adiponectina. A relação aumenta com doença. Adiponectina de APM/total diminui com HbAIc alta (Consultar a Tabela 3). Mais uma vez, o diagnóstico de Tipo 1 é menos correlacionado com adiponectina de APM/total mais alta do que em diagnóstico de Tipo 2. No entanto, o diagnós- tico de Tipo 1 forneceu uma relação mais alta do que controles normais.

Os níveis totais de C-terminal solúvel de AdipoRI aumentam com patologia diabética (por exemplo, diabetes tipo 2 ou resistência à insuli- na). Essas diferenças são muito mais significativas do que aquelas para adi- ponectina ou a relação de APM (valor T > 3,8, Probabilidade >99,9% de sig- nificância) (Consultar a Tabela 4). Surpreendentemente, AdipoRI aumenta com diabetes Tipo 1, indicando que o receptor também está relacionado com o Tipo 1. Seria esperado também que estes pacientes sofressem de dese- quilíbrio de adipócitos, porém apresentam também perda de células betas. AdipoRI aumenta mais com HbAIc mais alto do que a adiponectina. No ge- ral, AdipoRI é mais sensível do que adiponectina e a relação de APM. A combinação de AdipoRI e adiponectina em uma relação matemática foi me- lhor do que a adiponectina isolada para predizer patologia diabética. A com- binação de AdipoRI e peptídeo c, em uma relação matemática, foi melhor do que peptídeo c isolado para predizer patologia diabética.

Tabela 2. Adiponectina

<table>table see original document page 63</column></row><table>

Tabela 3. APM/adiponectina

<table>table see original document page 63</column></row><table> Tabela 4. AdipoRI solúvel

<table>table see original document page 64</column></row><table>

Exemplo 2 - Detecção de fragmentos C-terminais em indivíduos com sín- dromes metabólicas e outras doenças cardiovasculares e coronárias

Outro grupo de 188 pacientes foram completamente caracteriza- dos quanto condições cardiovasculares e risco por vários testes diagnósticos e angiografia. Normais (n = 113) foram considerados aqueles que não apre- sentavam síndrome metabólica, diabetes, síndrome coronariana aguda (SCA), IAM ou ICC. Pacientes do grupo de 188 foram colocados em grupos afetados quanto à síndrome metabólica, marcadores, SCA, IAM e ICC, hi- pertensão, obesidade, lipidemia, resposta inflamatória e resposta anti- inflamatória. Síndrome coronariana aguda foi definida como obstrução >60% em avaliação por angiografia, acompanhado ou não por condição cardíaca aguda. Síndrome metabólica foi definida por resistência à insulina ou mais de dois fatores de risco metabólico, de acordo com a definição da OMS. A resistência à insulina foi avaliada por diagnóstico e medicação diabética. Fa- tores de risco metabólico incluem hipertensão, lipidemia e obesidade. Obe- sidade foi avaliada por índice de massa corporal (IMC). Hipertensão foi ava- liada por pressão arterial ou medicação. Lipidemia foi avaliada por relação de lipídeos ou medicação para redução de lipídeos. Inflamação foi avaliada por contagem de leucócitos ou CRP. Status anti-inflamatório foi avaliado por imunoensaio de inibidores de tripsina urinária, no sangue e urina (Medições em imunoensaio de bicunina e uristatina). Todos os pacientes foram adicio- nalmente avaliados pela história médica e medicação e caracterizados em grupos afetados de acordo com o mesmo.

Adiponectina e Adiponectina de APM foram medidas com o kit comercial de ELISA. Marcadores cardíacos foram medidos empregando o aparelho Centaur (Bayer). O ensaio ELISA do AdipoRI1 descrito no Exemplo 1, foi utilizado para medir todos os fragmentos C-terminais, quer ligados ou não.

A adiponectina diminui com SCA e síndrome metabólica, porém a significância dos valores foi inferior à esperada de 99,9% de certeza (Con- sultar a Tabela 5). A adiponectina aumentou com ICC e IM, o que interferiria com a avaliação. Ela também não se correlacionou bem com status inflama- tório.

Os níveis totais de AdipoRI solúvel no soro aumentam com SCA e síndrome metabólica, e a significância dos valores foi altamente significati- va (99,9% de certeza) e muito mais significativa do que a observada para adiponectina (Consultar a Tabela 6). Surpreendentemente, AdipoRI aumen- ta à medida que as condições tornam-se mais agudas e à medida que as respostas inflamatória e anti-inflamatória aumentam. AdipoRI predisse ainda síndrome metabólica. Foi constatado também que AdipoRI solúvel, na urina e plasma, correlaciona-se com síndrome metabólica.

Tabela 5. Adiponectina

<table>table see original document page 65</column></row><table> <table>table see original document page 66</column></row><table>

(1) Inclui pacientes com IAM e ICC

(2) Significância de 99,9% prob ou duas caudas de 0,01 quando o valor T é superior a >3,8

Tabela 6. AdipoRI solúvel

<table>table see original document page 66</column></row><table> <table>table see original document page 67</column></row><table>

inclui IAM e ICO2,4 é aproximadamente 99% prob ou duas caudas de 0,01, >3,8 é aproximadamente 99,9% prob ou duas caudas de 0,001.

Exemplo 3 - Elucidação de via bioquímica

A sensibilidade normal à insulina ocorre quando a insulina faz com que a célula adiposa produza adiponectina. A adiponectina de extensão completa agrega-se em formas de BPM1 MPM e APM. A adiponectina inte- rage com o receptor 2 da adiponectina no fígado e receptor 1 da adiponecti- na no músculo, para interromper a produção de glicose e provocar glicólise e oxidação de ácidos graxos. O receptor 1 de adiponectina reage com a forma clivada de adiponectina, denominada adiponectina globular, enquanto que o receptor 2 de adiponectina reage com adiponectina de extensão completa. Foi recentemente demonstrado por terceiros que a adiponectina globular forma-se por ação da elastase sangüínea.

A resistência à insulina ocorre quando adipócitos tornam-se hi- pertróficos e produzem menos adiponectina em resposta à insulina. Nesse estado, as células tornam-se mais apoptóticas e a divisão celular diminui. Em resultado, níveis plasmáticos de adiponectina diminuem. Os níveis de insulina aumentam em um esforço para fazer com que as células liberem mais adiponectina. No entanto, a resistência à insulina piora e mais insulina e menos adiponectina são produzidas. O menor nível de adiponectina resul- ta em menos glicólise e oxidação de ácidos graxos no músculo e impede que a produção de glicose no fígado seja interrompida.

Foi confirmado que elastase inflamatória e leucócitos estão sig- nificativamente elevados em pacientes diabéticos. Uma revisão da literatura concorda que tanto a insulina feita pelo homem como a natural aumenta o número de leucócitos em diabéticos. À medida que a elastase aumenta na inflamação, um percentual maior de adiponectina é produzido. A falta de multímeros provoca menos ação no fígado. Foi confirmado que inibidores de protease anti-inflamatórios (Uri e Bik) estavam significativamente elevados em diabetes. Estes inibidores são formados por elastase, tendo sido recen- temente demonstrado que, em modelos de células, eles induzem apoptose hipertrófica em linhagens de células normais.

Os fragmentos do receptor, após exposição à elastase, foram propostos como mecanismo para a formação do fragmento solúvel em a- mostras de pacientes. Isso foi testado, utilizando espectroscopia de massa por afinidade com um anticorpo policlonal para o C-terminal de AdipoRI e amostras de pacientes.

O AdipoR1 foi confirmado por espectros de massa como presen- tes no sangue com massa de 34; 28-29; 19-18; 15-13; 9,5-9,0; 7,9; 6,6; 6,5; 5,2; 4,0 a 3,8 e 1 a 2 kDa. Esses dados confirmaram que 1) fragmentos de AdipoRI foram encontrados em pacientes e controles 2) fragmentos de Adi- poR1 formam dímeros e 3) fragmentos de AdipoR1 estavam ligados à adi- ponectina. O último foi comprovado, repetindo-se a espectroscopia de mas- sa por afinidade com um anticorpo policlonal para a adiponectina.

A falta de multímero de adiponectina, durante resistência à insu- lina, foi ainda proposta como a possível causa de diferenças em padrões de fragmentação entre pacientes e normais. De fato, um desaparecimento das formas com massas de 3,9 e 7,8 ocorreu em diabetes, porém estava presen- te em normais. Nos dados abaixo, todos os 5 pacientes não possuíam estas massas e todos os 5 normais apresentaram as massas de 3901 e 7814 Da (consultar os dados do gráfico). Por conseguinte, massas diferentes supos- tamente resultam de exposição de sítios de clivagem proteolítica quando há disponibilidade de multímeros para ligação.

Exemplo 4 - Preparo de anticorpos monoclonais

Camundongos BALB/c foram imunizados com 100 Mg/camundongo de uma composição imunogênica de peptídeo AdipoRI sin- tético. Depois de um mês, foram efetuadas sangrias oculares de cada ca- mundongo e tituladas por ELISA, em comparação ao imunogene para avaliar a resposta imunológica. Os camundongos exibiram a melhor resposta quan- do inoculados por injeção de 100 pg/camundongo com o imunogene. Depois de quatro dias, os camundongos foram sacrificados e os seus baços utiliza- dos para fusão, de acordo com o método de Kohler e Milstein, Nature 256:495 (1975). Os esplenócitos foram fundidos com células de mieloma SP2-0 Ag14, utilizando uma solução de PEG (polietilenoglicol) com relação entre esplenocitos e células de Mieloma de 5:1, e acomodados em placas com 96 poços, empregando meio de crescimento contendo 50% de PEG/HAT. Depois de 7-10 dias de incubação a 37 graus Celsius, culturas de fusão foram monitoradas quanto a crescimento, por alimentação a cada 3-4 dias, utilizando o método de seleção de HAT (hipoxantina, aminopterina, ti- midina), seguido por cultura secundária com meio de crescimento HAT.

Depois de 2-3 semanas, os poços de crescimento de colônia de hibridoma foram testados por ELISA para determinar quais crescimentos tinham produzido resposta imunológica de anticorpo contra o peptídeo. As culturas da placa de 96 poços foram testadas com o peptídeo uristatina em placas revestidas com 1 Mg/ml. Depois de revestimento das placas, durante a noite, a 2-8 °C, todas as placas foram lavadas e bloqueadas. Os sobrena- dantes das culturas de células foram, em seguida, aplicados em 100 μΙ/poço por uma hora em temperatura ambiente. Depois de lavagem das placas, Pe- roxidase de rábano de Cabra anti-lgG de camundongo, em diluição de 1:2000 foi aplicada em 100 μΙ/poço por uma hora. As placas foram lavadas mais uma vez, seguido por substrato de OPD (dicloridrato de o-fenileno dia- mina) e lidas em 490nm em um leitor de placa Spectra Max.

As colônias com resposta positiva foram transferidas para placas com 24 poços, para expandirem-se ainda mais e serem novamente testadas para verificar os resultados positivos. As colônias que exibiram resultados positivos foram expandidas ainda mais em placas com seis poços em Meio de Dulbecco Modificado por Iscove (IMDM) com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS). Após expansão, as colônias foram congeladas a - 70 0C e transferi- das, em seguida, para nitrogênio líquido para armazenamento prolongado. Com base nos resultados de ELISA, utilizando o peptídeo purificado, vários clones foram expandidos ainda mais em IMDM, 10% de FBS e congelados.

Exemplo 5 - Caracterização de anticorpos monoclonais com SELDI

Um método de medição dos fragmentos específicos do adipoRI em amostras de pacientes foi realizado utilizando anticorpos monoclonais e anticorpos policlonais, testados com padrões de AdipoR solúvel e plasmas de pacientes em superfícies de chips. A ligação foi estimada por análise de Dessorção/lonização Realçada por Laser de Superfície (SELDI) em um es- pectrômetro de massa de tempo de vôo SELDI PBS Il (Ciphergen, Fremont, Califórnia), para determinar as relações entre massa e carga (m/z) das pro- teínas ligadas aos anticorpos. Dez espécimes de plasma de pacientes foram testadas ainda: cinco pacientes foram positivos para diabetes; cinco foram negativos para diabetes. A ligação foi medida em dois tipos de superfície (PS20 e RS100), empregando um procedimento convencional de incubação. O sinal de cada medição de massa foi comparado ao ruído de fundo para serem obtidas as relações entre sinal e ruído (S/N). Somente massas com relações de S/N acima de 10 foram aceitas.

O procedimento da análise por SELDI foi o seguinte: Três micro- litros de NaHCC>3 a 50 mmol/l (pH 8,0) foram acrescentados sobre o chip de proteína e cobertos com uma placa (ou seja, um bioprocessador) para for- mar poços de amostras, seguido pelo acréscimo de 1 μΙ de anticorpo (1 mg/ml), em cada local, e incubados em temperatura ambiente por 2 horas, sob agitação em uma câmara com controle de umidade. A solução de cada local, neste momento, foi lavada duas vezes com 5 μΙ de tampão de lavagem (solução salina tamponada com fosfato (PBS) + 0,5% de detergente Triton). Os sítios não ligados foram bloqueados com 5μΙ de BSA a 2 mg/ml (albumi- na sérica bovina) ou etanolamina a 1 mol/l. Após incubação em temperatura ambiente, a BSA ou etanolamina foi descartada e os locais, lavados duas vezes com 5μΙ de tampão de lavagem (PBS + 0,5% de Triton). Cinco μΙ de PBS foram acrescentados a cada local e os chips foram colocados no bio- processador. 10 10μl adicionais de PBS1 bem como 10 μl da amostra a ser testada (ou PBS como controle) foram acrescentados a cada poço, seguido por agitação dos poços lacrados a 4°C por 18 horas. Os poços foram lava- dos em seguida com tampão de lavagem e PBS, sendo novamente agitadas em temperatura ambiente por 2 min. Os poços foram lavados com duas ve- zes com 300μl de água deionizada saturada com ácido sinapínico; isso ser- ve como molécula absorvente de energia durante protonização de proteínas ligadas aos anticorpos. Os últimos são fixados à superfície dos chips. Os chips contendo os espécimes de anticorpo ligado foram analisados quanto à massa ligada, utilizando o espectrômetro de massa de SELDI, de acordo com as instruções do fabricante.

Exemplo 6 - Fragmentos C-terminais solúveis em diabéticos

A Tabela 6 exibe os resultados de determinações múltiplas de cinco pacientes normais para a detecção de um fragmento de receptor de adiponectina com massa de 7812 e cinco diabéticos que não apresentaram a mesma massa. Uma separação semelhante foi constatada pra massa de 3901. Estas duas massas estão presentes em indivíduos normais, porém ausentes ou presentes em níveis muito baixos, ou seja, níveis diminuídos em pacientes com as condições da doença, fornecidas neste pedido.

Tabela 6. Resultados de SELDI em 7812 e 3901 Dalton

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A Tabela 7 exibe os resultados de determinações múltiplas de cinco pessoas normais e pacientes diabéticos para a detecção de fragmen- tos de receptor de adiponectina com massas de 4,5-6,9; 7-8,2; 9-11; 13-15; 17-19; 27-29 ou 30-34 e cinco diabéticos que não apresentaram as mesmas massas. Tabela 7. Resultados de SELDI em 4,5-6,9; 7-8,2; 9-11; 13-15; 17-19; 27-29 ou 30-34 KDa Dalton

<table>table see original document page 72</column></row><table>

Exemplo 7 - Serina proteases

As serina proteases da família de tripsina são aumentadas du- rante inflamação e incluem tripsina, quimotripsina, calicreína, plasmina, complemento D, trombina e fatores IX a, Xa, XIa e XIIa. Todas possuem afi- nidade primária de triptases clivando Arg-Xaa ou Lis-Xaa. Serinas proteases adicionais da família de tripsina, liberadas por células imunológicas, incluem elastase, granzima (A, Β, Η, M), triptase 2 e mastócito proteases 1. Os prin- cipais homólogos da elastase, incluindo catepsina G, proteinase 3, azuroci- dina e micolobastina possuem afinidade de clivagem de Val-Xaa > Ala-Xaa. As granzimas AeK possuem afinidade de clivagem de triptases. A granzima B possui afinidade de clivagem para Asp-Xaa. A granzima M possui afinida- de de clivagem para Met-Xaa ou Leu-Xaa. A granzima H e mastócito protea- se 1 possuem afinidade de clivagem de quimase para clivar Fe-Xaa, Tir-Xaa ou Trp-Xaa.

Análises de padrões de fragmentação de adiponectina e de fragmentos do receptor de adiponectina foram determinadas usando tripsina e elastase como exemplos de proteases inflamatórias. Os fragmentos com 29 a 34 aminoácidos em extensão (ou seja, SEQ ID NOS: 1, 2, 4-11, 16, 17 e/ou 19-26) foram preditos por clivagem por elastase. Os fragmentos com 20 a 25 aminoácidos em extensão (ou seja, SEQ ID NOS: 3, 12-15, 18 e/ou 27- 30) foram preditos por serinas proteases ou granzimas gerais da família da tripsina. Exemplo 8 - Definição de sensibilidade e especificidade

As amostras foram divididas entre normal e anormal. Foram co- letados resultados para todas, e os valores observados de adipoRI foram adjudicados em comparação a um patamar atribuído de adipoRI. O patamar é o valor abaixo do qual todos os resultados são considerados normais e acima dos quais são considerados positivos. O patamar varia de um número baixo a um número alto, e o valor preditivo do resultado é calculado, utilizan- do o número de verdadeiros positivos (TP), falsos positivos (FP), verdadeiros negativos (TN) e falsos negativos (FN) encontrados. A sensibilidade (TP/TP+FP) e especificidade (TN/TN+FN) são calculadas para cada patamar testado. O patamar com a sensibilidade e especificidade mais altas fornece o melhor valor preditivo (100% seria o ideal). Exemplo 9 - Patamares de fragmento de receptor de adiponectina

A seguir é apresentado um exemplo de definição de patamar, empregando os pacientes e métodos apresentados no exemplo 1. Na tabela abaixo, o patamar acima do qual o resultado de AdipoRI foi considerado positivo varia de 15 a 21 pg/ml. Neste exemplo, um valor mais alto é consi- derado positivo. O número de verdadeiros negativos, ou pacientes correta- mente identificados sem diabetes diagnosticada, é calculado junto com o número de falsos positivos, falsos negativos e verdadeiros positivos. O ideal seria um ensaio sem falsos positivos ou 100% de especificidade e nenhum falso negativo ou 100% de sensibilidade. Conforme pode ser observado a partir dos dados, o patamar de 15 foi melhor para sensibilidade, enquanto que o patamar de 21 foi melhor para especificidade. O patamar e intervalo dependem do fragmento detectado e o método analítico utilizado. Neste e- xemplo, o intervalo total do ensaio foi de 5 a 30 pg/ml, ou aproximadamente de 6X. De acordo com o mesmo, as unidades de concentração e intervalo variaram com o fragmento detectado e o método analítico utilizado (SELDI versus ELISA). Por exemplo, para o fragmento testado no Exemplo 6 e Ta- bela 7, a diferença entre normais e diabético foi, freqüentemente, de 100X. Conforme previsto, a concentração de um fragmento específico foi inferior à concentração de todos os fragmentos. O tipo de amostra utilizado, se urina, plasma ou soro também afetou as concentrações do fragmento. A concen- tração do fragmento em urina e soro foi aproximadamente 10 vezes menor do que a do plasma. Uma vez selecionado um ensaio e fragmento, os pata- mares são ajustados para ser atingido melhor o acordo clínico desejado, empregando os métodos apresentados.

Tabela 8

<table>table see original document page 74</column></row><table>

Exemplo 10 - Uso de painéis para ensaios de desequilíbrio de adipócitos

A seguir é apresentado um exemplo de uso de biomarcadores adicionais e correlatos com o resultado de AdipoR1 para melhorar a predi- ção de distúrbio diabético. Os pacientes diabéticos e normais e métodos a- presentados no exemplo são utilizados. Na tabela abaixo, três analitos são comparados quanto à sua capacidade para detectar diabetes. Os patamares utilizados oferecem TN comparável. Conforme previsto, ADIPOR1 detectou mais verdadeiros positivos do que os outros analitos.

Tabela 9

<table>table see original document page 74</column></row><table>

Vinte e cinco dos sessenta e nove pacientes eram do Tipo 1. Os analitos foram comparados também quanto à sua capacidade para ser posi- tivo para diabetes tipo 1. Somente 4 dos 25 diabéticos tipo 1 apresentaram adiponectina anormalmente baixa. O peptídeo C usa dois patamares, um para níveis anormalmente baixos e um para níveis anormalmente altos. Pep- tídeo C anormalmente baixo indica falta de insulina e, conforme previsto, 23 dos 25 diabéticos do tipo 1 apresentaram peptídeo c anormalmente baixo.

Diabéticos do tipo 1 freqüentemente apresentaram também fragmentos do AdipoRl Poucos diabéticos do tipo 1 apresentaram peptídeo c anormalmen- te alto.

Estes analitos detectam pacientes diferentes. Esse achado é possivelmente explicado por diferenças na patologia, uma vez que cada ana- lito mede uma parte diferente do desequilíbrio. Por exemplo, acredita-se que a falta de insulina que afeta o peptídeo C seja decorrente das células de ilho- tas, enquanto que a falta de adiponectina seja decorrente da deficiência dos adipócitos em produzir o hormônio. Acredita-se que a presença de fragmen- tos de adipoR 1, neste exemplo, seja decorrente da célula muscular res- guardar o receptor de uso excessivo.

Esses dados demonstram que a combinação de analitos em conjunto seria melhor do que qualquer um isolado. Na tabela abaixo, a rela- ção mais simples é testada, considerando que qualquer um do painel positi- vo represente que o resultado é anormal. De acordo com o mesmo, todos os analitos deverão ser negativos para ser considerado resultado normal. Con- forme é descrito acima, os patamares são ajustados para atingirem os me- lhores resultados.

Tabela 10

<table>table see original document page 75</column></row><table> O número mais alto de verdadeiros positivos foi obtido para o uso combinado de peptídeo c, adiponectina e adipoRl O número mais alto de verdadeiros negativos foi obtido para o uso combinado de peptídeo c e adipoRl ou pelo uso de peptídeo c, adiponectina e adipoRl. Em ambos os casos, os números de verdadeiros negativos foram comparáveis ao do adi- poRl

Exemplo 11 - Níveis de receptor solúvel de adiponectina em painéis de plasma e DAC

A seguir é apresentado um exemplo de uso de biomarcadores adicionais e correlatos com o resultado do AdipoRl para melhorar a predi- ção de doença cardiovascular. Os pacientes com doença cardiovascular e normais e métodos apresentados no exemplo 2 são utilizados. Pacientes afetados são aqueles com SCA por angiografia ou risco alto por correspon- derem à definição de síndrome metabólica. Pacientes com condições cardi- ovasculares preexistentes, como IAM ou ICC, foram excluídos, uma vez que o diagnóstico já havia sido feito pelos ensaios de Tnl ou BNP, ou por outras avaliações diagnosticas.

Foram medidos fragmentos solúveis C-terminal do receptor 1 da adiponectina por ELISA, conforme apresentados no Exemplo 1. Os resulta- dos correlacionaram-se bem com graus de obstrução vascular (Tabela 11). Risco de distúrbios cardiovasculares foi avaliado também por marcador adi- cional quanto à resposta pró e anti-inflamatória e adiponectina. Analitos para resposta pró e anti-inflamatória foram comparados ao adiporl. Resultados anormais ocorreram mais possivelmente em pacientes com obstrução vas- cular do que com adiponectina, uristatina, bicunina, leucócito ou CRP. A sensibilidade mais alta sustenta uma correlação diagnostica do receptor 1 da adiponectina com obstrução vascular, decorrente de aterosclerose. Tabela 11. Sensibilidade de fragmentos solúveis do Receptor 1 da adiponec- tina para aterosclerose

<table>table see original document page 77</column></row><table>

O uso de painéis de resposta pró e anti-inflamatória e marcado- res de adipócito foi comparado quanto à sua capacidade de detectar distúr- bios cardiovasculares. O número mais alto de verdadeiro positivo foi obtido para o uso combinado de bicunina, uristatina, CRP1 leucócito, adiponectina e adipoR1. O número mais alto de verdadeiro negativo foi obtido para o uso combinado de adiponectina e adipoRI.

Cada intervalo recitado inclui todas as combinações e subcom- binações de intervalos, bem como números específicos contidos nos mes- mos.

Todas as publicações e pedidos de patentes citados nesta expo- sição são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência neste pedido, para todas as finalidades, conforme se cada publicação ou pedido de paten- te individualizado tivesse sido específica e individualmente indicado como incorporado por referência para todas as finalidades.

Embora a invenção precedente tenha sido descrita em alguns detalhes por meio de ilustração e exemplo para fins de clareza de entendi- mento, será evidente de imediato para qualquer técnico no assunto, à luz dos ensinamentos desta invenção, que certas alterações e modificações po- dem ser efetuadas à mesma, sem distanciar-se do espírito ou abrangência das reivindicações anexadas. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Siemens Medicai Solutions Diagnostics

Pugia, Michael J.

<120> DETECÇÃO DE PEPTÍDEOS SOLÚVEIS DO RECEPTOR DE ADIPONECTINA E USO

EM DIAGNÓSTICO E TERAPÊUTICO MST-3558

PCT/US2006/061555 2006-12-04 US 60/748,305 2005-12-07 50

PatentIn versão 3.3 1

34 PRT

Seqüência artificial

<130> <140> <141> <150> <151> <160> <170> <210> <211> <212> <213> <220>

<223> Construto sintético

<400> 1

Val Leu Val Val Ala Ala Ala Phe Val His Phe Tyr Gly Val Ser Asn 1 5 10 15

Leu Gln Glu Phe Arg Tyr Gly Leu Glu Gly Gly Cys Thr Asp Asp Thr 20 25 30

30

Leu Leu <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>

2

33 PRT

Seqüência artificial

Construto sintético 2

Leu Val Val Ala Ala Ala Phe Val His Phe Tyr Gly Val Ser Asn Leu 15 10 15

Gln Glu Phe Arg Tyr Gly Leu Glu Gly Gly Cys Thr Asp Asp Thr Leu 20 25 30

Leu

<210> 3

<211> 20 <212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construto sintético

<400> 3

Ser Asn Leu Gln Glu Phe Arg Tyr Gly Leu Glu Gly Gly Cys Thr Asp 15 10 15

Asp Thr Leu Leu 20

<210> 4

<211> 32

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construto sintético

<400> 4

Val Val Ala Ala Ala Phe Val His Phe Tyr Gly Val Ser Asn Leu Gln 15 10 15

Glu Phe Arg Tyr Gly Leu Glu Gly Gly Cys Thr Asp Asp Thr Leu Leu

20 25 30

<210> 5

<211> 31

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construto sintético <400> 5

Val Ala Ala Ala Phe Val His Phe Tyr Gly Val Ser Asn Leu Gln Glu 1 5 10 15

Phe Arg Tyr Gly Leu Glu Gly Gly Cys Thr Asp Asp Thr Leu Leu 20 25 30

6

30 PRT

Seqüência artificial

<210> <211> <212> <213> <220>

<223> Construto sintético

<4 00> 6

Ala Ala Ala Phe Val His Phe Tyr Gly Val Ser Asn Leu Gln Glu Phe 1 5 10 15

Arg Tyr Gly Leu Glu Gly Gly Cys Thr Asp Asp Thr Leu Leu 20 25 30

7

29 PRT

Seqüência artificial

<210> <211> <212> <213> <220>

<223> Construto sintético

<4 00> 7

Ala Ala Phe Val His Phe Tyr Gly Val Ser Asn Leu Gln Glu Phe Arg 1 5 10 15

Tyr Gly Leu Glu Gly Gly Cys Thr Asp Asp Thr Leu Leu

20 25

<210> 8 <211> 28 <212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220> <223> Construto sintético

<400> 8

Ala Phe Val His Phe Tyr Gly Val Ser Asn Leu Gln Glu Phe Arg Tyr 1 5 10 15

Gly Leu Glu Gly Gly Cys Thr Asp Asp Thr Leu Leu 20 25

9

27 PRT

Seqüência artificial

<210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>

Construto sintético 9

Phe Val His Phe Tyr Gly Val Ser Asn Leu Gln Glu Phe Arg Tyr Gly

1 5 10

Leu Glu Gly Gly Cys Thr Asp Asp Thr Leu Leu 20 25

10 26 PRT

Seqüência artificial

15

<210> <211> <212> <213> <220>

<223> Construto sintético

<400> 10

Val His Phe Tyr Gly Val Ser Asn Leu Gln Glu Phe Arg Tyr Gly Leu 1 5 10 15

Glu Gly Gly Cys Thr Asp Asp Thr Leu Leu

20 25

<210> 11 <211> 25

<212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Construto sintético

<400> 11

His Phe Tyr Gly Val Ser Asn Leu Gln Glu Phe Arg Tyr Gly Leu Glu

1 5 10 15

Gly Gly Cys Thr Asp Asp Thr Leu Leu

20 25

<210> 12 <211> 24

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construto sintético

<400> 12

15 Phe Tyr Gly Val Ser Asn Leu Gln Glu Phe Arg Tyr Gly Leu Glu Gly 10 15

Gly Cys Thr Asp Asp Thr Leu Leu 20

<210> 13

<211> 23

<212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Construto sintético

<400> 13

Tyr Gly Val Ser Asn Leu Gln Glu Phe Arg Tyr Gly Leu Glu Gly Gly 15 10 15

Cys Thr Asp Asp Thr Leu Leu 20

<210> 14

<211> 22 <212> PRT <213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construto sintético

<400> 14

Gly Val Ser Asn Leu Gln Glu Phe Arg Tyr Gly Leu Glu Gly Gly Cys 15 10 15

Thr Asp Asp Thr Leu Leu 20

<210> 15

<211> 21 <212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construto sintético

<400> 15

Val Ser Asn Leu Gln Glu Phe Arg Tyr Gly Leu Glu Gly Gly Cys Thr 15 10 15

Asp Asp Thr Leu Leu 20

<210> 16 <211> 19

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construto sintético

<400> 16

Asn Leu Gln Glu Phe Arg Tyr Gly Leu Glu Gly Gly Cys Thr Asp Asp 15 10 15

Thr Leu Leu

<210> 17

<211> 18 <212> PRT <213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construto sintético

<400> 17

Leu Gln Glu Phe Arg Tyr Gly Leu Glu Gly Gly Cys Thr Asp Asp Thr 1 5 10 15

Leu Leu

18 17 PRT

Seqüência artificial

<210> <211> <212> <213> <220>

<223> Construto sintético

<400> 18

Gln Glu Phe Arg Tyr Gly Leu Glu Gly Gly Cys Thr Asp Asp Thr Leu 1 5 10 15

Leu

19 16 PRT

Seqüência artificial

<210> <211> <212> <213> <220>

<223> Construto sintético

<400> -19

Glu Phe Arg Tyr Gly Leu Glu Gly Gly Cys Thr Asp Asp Thr Leu Leu 15 10 15

<210> 20 <211> 15

<212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Construto sintético

<400> 20

Phe Arg Tyr Gly Leu Glu Gly Gly Cys Thr Asp Asp Thr Leu Leu

1 5 10 15

<210> 21 <211> 14

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construto sintético

<400> 21

Arg Tyr Gly Leu Glu Gly Gly Cys Thr Asp Asp Thr Leu Leu 15 10

<210> 22

<211> 13

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construto sintético

<400> 22

Tyr Gly Leu Glu Gly Gly Cys Thr Asp Asp Thr Leu Leu 15 10

<210> 23

<211> 34

<212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Construto sintético

<400> 23

Ile Phe Val Val Ala Gly Ala Phe Val His Phe His Gly Val Ser Asn 15 10 15 Leu Gln Glu Phe Arg Phe Met Ile Gly Gly Gly Cys Ser Glu Glu Asp 20 25 30

Ala Leu

<210> 24

<211> 31

<212> PRT

<213> Sequencia artificial

<220>

<223> Construto sintético

<400> 24

Val Ala Gly Ala Phe Val His Phe His Gly Val Ser Asn Leu Gln Glu 1 5 10 15

Phe Arg Phe Met Ile Gly Gly Gly Cys Ser Glu Glu Asp Ala Leu 20 25 30

<210> 25

<211> 20

<212> PRT

<213> Sequencia artificial

<220>

<223> Construto sintético

<400> 25

Ser Asn Leu Gln Glu Phe Arg Phe Met Ile Gly Gly Gly Cys Ser Glu 1 5 10 15

Glu Asp Ala Leu 20

<210> 26

<211> 33

<212> PRT

<213> Sequencia artificial

<220>

<223> Contruto sintetico <400> 26

Phe Val Val Ala Gly Ala Phe Val His Phe His Gly Val Ser Asn Leu 1 5 10 15

Gln Glu Phe Arg Phe Met Ile Gly Gly Gly Cys Ser Glu Glu Asp Ala 20 25 30

Leu

<210> 27

<211> 32

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construto sintético

<400> 27

Val Val Ala Gly Ala Phe Val His Phe His Gly Val Ser Asn Leu Gln 1 5 10 15

Glu Phe Arg Phe Met Ile Gly Gly Gly Cys Ser Glu Glu Asp Ala Leu

20 25 30

<210> 28 <211> 30

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construto sintético

<400> 28

Ala Gly Ala Phe Val His Phe His Gly Val Ser Asn Leu Gln Glu Phe 1 5 10 15

Arg Phe Met Ile Gly Gly Gly Cys Ser Glu Glu Asp Ala Leu

20 25 30

<210> 29

<211> 29

<212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Construto sintético

<400> 29

Gly Ala Phe Val His Phe His Gly Val Ser Asn Leu Gln Glu Phe Arg 1 5 10 15

Phe Met Ile Gly Gly Gly Cys Ser Glu Glu Asp Ala Leu

20 25

<210> 30

<211> 28 <212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construto sintético

<400> 30

Ala Phe Val His Phe His Gly Val Ser Asn Leu Gln Glu Phe Arg Phe 1 5 10 15

Met Ile Gly Gly Gly Cys Ser Glu Glu Asp Ala Leu

20 25

<210> 31

<211> 27

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construto sintético

<400> 31

Phe Val His Phe His Gly Val Ser Asn Leu Gln Glu Phe Arg Phe Met 1 5 10 15

Ile Gly Gly Gly Cys Ser Glu Glu Asp Ala Leu

20 25

<210> 32

<211> 26 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220>

<223> Construto sintético

<400> 32

Val His Phe His Gly Val Ser Asn Leu Gln Glu Phe Arg Phe Met Ile

1 5 10

Gly Gly Gly Cys Ser Glu Glu Asp Ala Leu 20 25

33 25 PRT

Seqüência artificial

<210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>

Construto sintético 33

His Phe His Gly Val Ser Asn Leu Gln Glu Phe Arg Phe Met Ile Gly

1 5 10

Gly Gly Cys Ser Glu Glu Asp Ala Leu 20 25

34 24 PRT

Seqüência artificial

15

<210> <211> <212> <213> <220>

<223> Construto sintético

<400> 34

Phe His Gly Val Ser Asn Leu Gln Glu Phe Arg Phe Met Ile Gly Gly 1 5 10 15

Gly Cys Ser Glu Glu Asp Ala Leu 20

<210> 35

<211> 23 <212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construto sintético

<400> 35

His Gly Val Ser Asn Leu Gln Glu Phe Arg Phe Met Ile Gly Gly Gly 15 10 15

Cys Ser Glu Glu Asp Ala Leu 20

<210> 36

<211> 22 <212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construto sintético

<400> 36

Gly Val Ser Asn Leu Gln Glu Phe Arg Phe Met Ile Gly Gly Gly Cys 15 10 15

Ser Glu Glu Asp Ala Leu 20

<210> 37

<211> 21 <212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construto sintético

<4 00> 37

Val Ser Asn Leu Gln Glu Phe Arg Phe Met Ile Gly Gly Gly Cys Ser 15 10 15

Glu Glu Asp Ala Leu 20

<210> 38 <211> <212> <213> <220> <223> <400>

19 PRT

Seqüência artificial

Construto sintético 38

Asn Leu Gln Glu Phe Arg Phe Met Ile Gly Gly Gly Cys Ser Glu Glu

1 5

Asp Ala Leu <210> 39

10

15

<211> <212> <213> <220> <223> <400>

18 PRT

Seqüência artificial

Construto sintético 39

Leu Gln Glu Phe Arg Phe Met Ile Gly Gly Gly Cys Ser Glu Glu Asp

40 17 PRT

Seqüência artificial

Ala Leu <210> <211> <212> <213> <220>

<223> Construto sintético

<400> 40

Gln Glu Phe Arg Phe Met Ile Gly Gly Gly Cys Ser Glu Glu Asp Ala 1 5 10 15

Leu

<210> 41

<211> 16 <212> PRT <213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construto sintético

<400> 41

Glu Phe Arg Phe Met Ile Gly Gly Gly Cys Ser Glu Glu Asp Ala Leu

<210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>

10

15

42 15 PRT

Seqüência artificial

Construto sintético 42

Phe Arg Phe Met Ile Gly Gly Gly Cys Ser Glu Glu Asp Ala Leu

1

<210> <211> <212> <213> <220> <223> <4 00>

10

15

43 14 PRT

Seqüência artificial

Construto sintético 43

Arg Phe Met Ile Gly Gly Gly Cys Ser Glu Glu Asp Ala Leu

1

<210> <211> <212> <213> <220> <223> <4 00>

10

44 13 PRT

Seqüência artificial

Construto sintético 44

Phe Met Ile Gly Gly Gly Cys Ser Glu Glu Asp Ala Leu 1 5 10

<210> 45

<211> 2108

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador de oligonucleotídeo

<400> 45

ggcgctgaag atcggggccg ctcggccgca ggccgcctcc agcgccgcgg gatgtagcgc 60

gggggaccgc ggcccccagc agagcccgcc tgcccggctt gtctaccatc agagggagat 120

ctctgccccc tggggctgag agaccccaac ctttccccaa gctgaagctg cagggtattg 180

aggtaccagc cagatgtctt cccacaaagg atctgtggtg gcacagggga atggggctcc 240

tgccagtaac agggaagctg acacggtgga actggctgaa ctgggacccc tgctagaaga 300

gaagggcaaa cgggtaatcg ccaacccacc caaagctgaa gaagagcaaa catgcccagt 360

gccccaggaa gaagaggagg aggtgcgggt actgacactt cccctgcaag cccaccacgc 420

catggagaag atggaagagt ttgtgtacaa ggtctgggag ggacgttgga gggtcatccc 4 80

atatgatgtg ctccctgact ggctaaagga caacgactat ctgctacatg gtcatagacc 540

tcccatgccc tcctttcggg cttgcttcaa gagcatcttc cgcattcata cagaaactgg 600

caacatctgg acccatctgc ttggtttcgt gctgtttctc tttttgggaa tcttgaccat 660

gctcagacca aatatgtact tcatggcccc tctacaggag aaggtggttt ttgggatgtt 720

ctttttgggt gcagtgctct gcctcagctt ctcctggctc tttcacaccg tctattgtca 780

ttcagagaaa gtctctcgga ctttttccaa actggactat tcagggattg ctcttctaat 840

tatggggagc tttgtcccct ggctctatta ttccttctac tgctccccac agccacggct 900

catctacctc tccatcgtct gtgtcctggg catttctgcc atcattgtgg cgcagtggga 960

ccggtttgcc actcctaagc accggcagac aagagcaggc gtgttcctgg gacttggctt 1020

gagtggcgtc gtgcccacca tgcactttac tatcgctgag ggctttgtca aggccaccac 1080

agtgggccag atgggctggt tcttcctcat ggctgtgatg tacatcactg gagctggcct 1140

ttatgctgct cgaattcctg agcgcttctt tcctggaaaa tttgacatat ggttccagtc 1200

tcatcagatt ttccatgtcc tggtggtggc agcagccttt gtccacttct atggagtctc 1260

caaccttcag gaattccgtt acggcctaga aggcggctgt actgatgaca cccttctctg 1320

agccttccca cctgcggggt ggaggaggaa cttcccaagt gcttttaaaa ataacttctt 1380

tgctgaagtg agaggaagag tctgagttgt ctgtttctag aagaaacctc ttagagaatt 1440 cagtaccaac caagcttcag cccactttca cacccactgg gcaataaact ttccatttcc 1500 attctcctag ctggggatgg ggcatggtca aacttagcca tcccctcctc agcaaggcat 1560 ctaccggccc ctcacagaga cagtactttg aaactcatgt tgagatttta ccctctcctc 1620 caaccatttt gggaaaatta tggactggga ctcttcagaa attctgtctt ttcttctgga 1680 agaaaatgtc cctcccttac ccccatcctt aactttgtat cctggcttat aacaggccat 1740 ccatttttgt agcacacttt tcaaaaacaa ttatataccc tggtcccatc tttctagggc 1800 ctggatctgc ttatagagca ggaagaataa agccaccaac ttttacctag cccggctaat 1860 catggaagtg tgtccaggct tcaagtaact tgagttttaa tttttttttt ttcttggcag 1920 agtaatgtaa aatttaaatg gggaaagata tttaatattt aatactaagc tttaaaaaga 1980 aacctgctat cattgctatg tatcttgatg caaagactat gatgttaata aaagaaagta 2040 cagaagagac ttggcattca aagatttcaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2100 aaaaaaaa 2108

<210> 46

<211> 375

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Construto sintético

<400> 46

Met Ser Ser His Lys Gly Ser Val Val Ala Gln Gly Asn Gly Ala Pro 1 5 10 15

Ala Ser Asn Arg Glu Ala Asp Thr Val Glu Leu Ala Glu Leu Gly Pro

20 25 30

Leu Leu Glu Glu Lys Gly Lys Arg Val Ile Ala Asn Pro Pro Lys Ala

25 35 40 45

Glu Glu Glu Gln Thr Cys Pro Val Pro Gln Glu Glu Glu Glu Glu Val

50 55 60

Arg Val Leu Thr Leu Pro Leu Gln Ala His His Ala Met Glu Lys Met 65 70 75 80

Glu Glu Phe Val Tyr Lys Val Trp Glu Gly Arg Trp Arg Val Ile Pro

85 90 95

Tyr Asp Val Leu Pro Asp Trp Leu Lys Asp Asn Asp Tyr Leu Leu His 100 105 110

Gly His Arg Pro Pro Met Pro Ser Phe Arg Ala Cys Phe Lys Ser Ile

115 120 125

Phe Arg Ile His Thr Glu Thr Gly Asn Ile Trp Thr His Leu Leu Gly

130 135 140

Phe Val Leu Phe Leu Phe Leu Gly Ile Leu Thr Met Leu Arg Pro Asn 145 150 155 160

Met Tyr Phe Met Ala Pro Leu Gln Glu Lys Val Val Phe Gly Met Phe

165 170 175

Phe Leu Gly Ala Val Leu Cys Leu Ser Phe Ser Trp Leu Phe His Thr

180 185 190

Val Tyr Cys His Ser Glu Lys Val Ser Arg Thr Phe Ser Lys Leu Asp

195 200 205

Tyr Ser Gly Ile Ala Leu Leu Ile Met Gly Ser Phe Val Pro Trp Leu

210 215 220

Tyr Tyr Ser Phe Tyr Cys Ser Pro Gln Pro Arg Leu Ile Tyr Leu Ser 225 230 235 240

Ile Val Cys Val Leu Gly Ile Ser Ala Ile Ile Val Ala Gln Trp Asp

245 250 255

Arg Phe Ala Thr Pro Lys His Arg Gln Thr Arg Ala Gly Val Phe Leu

260 265 270

Gly Leu Gly Leu Ser Gly Val Val Pro Thr Met His Phe Thr Ile Ala

275 280 285

Glu Gly Phe Val Lys Ala Thr Thr Val Gly Gln Met Gly Trp Phe Phe

290 295 300

Leu Met Ala Val Met Tyr Ile Thr Gly Ala Gly Leu Tyr Ala Ala Arg 305 310 315 320

Ile Pro Glu Arg Phe Phe Pro Gly Lys Phe Asp Ile Trp Phe Gln Ser

325 330 335

His Gln Ile Phe His Val Leu Val Val Ala Ala Ala Phe Val His Phe

340 345 350

Tyr Gly Val Ser Asn Leu Gln Glu Phe Arg Tyr Gly Leu Glu Gly Gly Cys Thr Asp Asp Thr Leu Leu

<210> 47

<211> 2072

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Iniciador de oligonucleotideo

<400> 47

ggggccgctc ggccgcaggc cgcctccagc gccgcgggat gtagcgcggg ggaccgcggc 60

ccccagcaga gcccgcctgc ccggcttgtc taccatcaga gggagatctc tgccccctgg 120

ggctgagaga ccccaacctt tccccaagct gaagctgcag ggtattgagg taccagccag 180

atgtcttccc acaaaggatc tgtggtggca caggggaatg gggctcctgc cagtaacagg 240

gaagctgaca cggtggaact ggctgaactg ggacccctgc tagaagagaa gggcaaacgg 300

gtaatcgcca acccacccaa agctgaagaa gagcaaacat gcccagtgcc ccaggaagaa 3 60

gaggaggagg tgcgggtact gacacttccc ctgcaagccc accacgccat ggagaagatg 420

gaagagtttg tgtacaaggt ctgggaggga cgttggaggg tcatcccata tgatgtgctc 4 80

cctgactggc taaaggacaa cgactatctg ctacatggtc atagacctcc catgccctcc 540

tttcgggctt gcttcaagag catcttccgc attcatacag aaactggcaa catctggacc 600

catctgcttg gtttcgtgct gtttctcttt ttgggaatct tgaccatgct cagaccaaat 660

atgtacttca tggcccctct acaggagaag gtggtttttg ggatgttctt tttgggtgca 720

gtgctctgcc tcagcttctc ctggctcttt cacaccgtct attgtcattc agagaaagtc 780

tctcggactt tttccaaact ggactattca gggattgctc ttctaattat ggggagcttt 840

gtcccctggc tctattattc cttctactgc tccccacagc cacggctcat ctacctctcc 900

atcgtctgtg tcctgggcat ttctgccatc attgtggcgc agtgggaccg gtttgccact 960

cctaagcacc ggcagacaag agcaggcgtg ttcctgggac ttggcttgag tggcgtcgtg 1020

cccaccatgc actttactat cgctgagggc tttgtcaagg ccaccacagt gggccagatg 1080

ggctggttct tcctcatggc tgtgatgtac atcactggag ctggccttta tgctgctcga 1140

attcctgagc gcttctttcc tggaaaattt gacatatggt tccagtctca tcagatttac 1200

catgtcctgg tggtggcagc agcctttgtc cacttctatg gagtctccaa ccttcaggaa 1260

ttccgttacg gcctagaagg cggctgtact gatgacaccc ttctctgagc cttcccacct 1320 gcggggtgga ggaggaactt cccaagtgct tttaaaaata acttctttgc tgaagtgaga 1380

ggaagagtct gagttgtctg tttctagaag aaacctctta gagaattcag taccaaccaa 1440

gcttcagccc actttcacac ccactgggca ataaactttc catttccatt ctcctagctg 1500

gggatggggc atggtcaaac ttagccatcc cctcctcagc aaggcatcta ccggcccctc 1560

acagagacag tactttgaaa ctcatgttga gattttaccc tctcctccaa ccattttggg 1620

aaaattatgg actgggactc ttcagaaatt ctgtcttttc ttctggaaga aaatgtccct 1680

cccttacccc catccttaac tttgtatcct ggcttataac aggccatcca tttttgtagc 1740

acacttttca aaaacaatta tataccctgg tcccatcttt ctagggcctg gatctgctta 1800

tagagcagga agaataaagc caccaacttt tacctagccc ggctaatcat ggaagtgtgt 1860

ccaggcttca agtaacttga gttttaattt tttttttttt cttggcagag taatgtaaaa 1920

tttaaatggg gaaagatatt taatatttaa tactaagctt taaaaagaaa cctgctatca 1980

ttgctatgta tcttgatgca aagactatga tgttaataaa agaaagtaca gaagagactt 2040

ggcattcaaa gaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 2072 <210> 48

<211> 375

<212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Construto sintético

<440> 48

Met Ser Ser His Lys Gly Ser Val Val Ala Gln Gly Asn Gly Ala Pro 1 5 10 15

Ala Ser Asn Arg Glu Ala Asp Thr Val Glu Leu Ala Glu Leu Gly Pro 20 25 30

Leu Leu Glu Glu Lys Gly Lys Arg Val Ile Ala Asn Pro Pro Lys Ala 35 40 45

Glu Glu Glu Gln Thr Cys Pro Val Pro Gln Glu Glu Glu Glu Glu Val

50 55 60

Arg Val Leu Thr Leu Pro Leu Gln Ala His His Ala Met Glu Lys Met

65 70 75 80

Glu Glu Phe Val Tyr Lys Val Trp Glu Gly Arg Trp Arg Val Ile Pro 85 90 95 Tyr Asp Val Leu Pro Asp Trp Leu Lys Asp Asn Asp Tyr Leu Leu His

100 105 110

Gly His Arg Pro Pro Met Pro Ser Phe Arg Ala Cys Phe Lys Ser Ile

115 120 125

Phe Arg Ile His Thr Glu Thr Gly Asn Ile Trp Thr His Leu Leu Gly

130 135 140

Phe Val Leu Phe Leu Phe Leu Gly Ile Leu Thr Met Leu Arg Pro Asn 145 150 155 160

Met Tyr Phe Met Ala Pro Leu Gln Glu Lys Val Val Phe Gly Met Phe

165 170 175

Phe Leu Gly Ala Val Leu Cys Leu Ser Phe Ser Trp Leu Phe His Thr

180 185 190

Val Tyr Cys His Ser Glu Lys Val Ser Arg Thr Phe Ser Lys Leu Asp

195 200 205

Tyr Ser Gly Ile Ala Leu Leu Ile Met Gly Ser Phe Val Pro Trp Leu

210 215 220

Tyr Tyr Ser Phe Tyr Cys Ser Pro Gln Pro Arg Leu Ile Tyr Leu Ser 225 230 235 240

Ile Val Cys Val Leu Gly Ile Ser Ala Ile Ile Val Ala Gln Trp Asp

245 250 255

Arg Phe Ala Thr Pro Lys His Arg Gln Thr Arg Ala Gly Val Phe Leu

260 265 270

Gly Leu Gly Leu Ser Gly Val Val Pro Thr Met His Phe Thr Ile Ala

275 280 285

Glu Gly Phe Val Lys Ala Thr Thr Val Gly Gln Met Gly Trp Phe Phe

290 295 300

Leu Met Ala Val Met Tyr Ile Thr Gly Ala Gly Leu Tyr Ala Ala Arg 305 310 315 320

Ile Pro Glu Arg Phe Phe Pro Gly Lys Phe Asp Ile Trp Phe Gln Ser

325 330 335

His Gln Ile Tyr His Val Leu Val Val Ala Ala Ala Phe Val His Phe 340 345 350 Tyr Gly Val Ser Asn Leu Gln Glu Phe Arg Tyr Gly Leu Glu Gly Gly

355 360 365

Cys Thr Asp Asp Thr Leu Leu 370 375

<210> 49 <211> 3500 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Iniciador de oligonucleotídeo <400> 49

agaatttgtt tgtaaggtat gggaaggtcg gtggcgagtg atccctcatg atgtactacc 60

agactggctc aaggataatg acttcctctt gcatggacac cggcctccta tgccttcttt 120

ccgggcctgt tttaagagca ttttcagaat acacacagaa acaggcaaca tttggacaca 180

tctcttaggt tgtgtatcct tcctgtgcct ggggatcttt tatatgtttc gcccaaatat 240

ctcctttgtg gcccctctgc aagagaaggt ggtctttgga ttatttttct taggagccat 300

tctctgcctt tctttttcat ggctcttcca cacagtctac tgccactcag agggggtctc 360

tcggctcttc tctaaactgg attactctgg tattgctctt ctgattatgg gaagttttgt 420

tccttggctt tattattctt tctactgtaa tccacaacct tgcttcatct acttgattgt 480

catctgtgtg ctgggcattg cagccattat agtctcccag tgggacatgt ttgccacccc 540

tcagtatcgg ggagtaagag caggagtgtt tttgggccta ggcctgagtg gaatcattcc 600

taccttgcac tatgtcatct cggaggggtt ccttaaggcc gccaccatag ggcagatagg 660

ctggttgatg ctgatggcca gcctctacat cacaggagct gccctgtatg ctgcccggat 720

ccccgaacgc tttttccctg gcaaatgtga catctggttt cactctcatc agctgtttca 780

tatctttgtg gttgctggag cttttgttca cttccatggt gtctcaaacc tccaggagtt 840

tcgtttcatg atcggcgggg gctgcagtga agaggatgca ctgtgatacc taccagtctc 900

cagggactat gaccctaaac cagggcctgc ggcacttgcg ggcctccctg ctggctactg 960

atgccagtac cagaggagcc ccaaaacttt gacagcctcg tgggctttgt gacggcccag 1020

gggctctgcg tggtacatga ctgagaagag aaaaacaaaa ataaatcata cctcaaagga 1080

tggagtgcat caattgggag aaaaggagac atagcccaaa ccctggctta ttcttgggat 1140

ctactgattg cgggctctgc aagacccttg gcaaactggc ttctgatcca tatcatattt 1200

atttgtagaa gatggcgaaa cagtttagct ggtggttctt tcttctccct ttctctctct 1260 ctatgacaat aatacaaacc aatttaagtg aacatttata tccgataagg ggtgggagtg 1320 tgattttaaa tgctcttttg ggagaacaaa gaaattaatg taaataagat ttctaactgt 1380 ttaaataaga ctttatataa atgtttaaaa cataggggta agggagggag ggagaatttt 1440 tgtatagaat gaaacatgca agtaccacac actgtttgaa ttttgcacaa aaagtgactg 1500 taggatcagg tgatagcccc ggaatgtaca gtgtcttggt gcaccaagat gccttctaaa 1560 ggctgacata ccttggaccc taatggggca gagagtatag ccctagccca gtggtgacat 1620 gaccactccc tttgggaggc ctgaggtaga ggggagtggt atgtgttttc tcagtggaag 1680 cagcacatga gtgggtgaca ggatgttaga taaaggctct agttagggtg tcattgtcat 1740 ttgagagact gacacactcc tagcagctgg taaaggggtg ctggaggcca tggaggagct 1800 ctagaaacat tagcatgggc tgatctgatt acttcctggc atcccgctca cctttatggg 1860 aagtcttatt agagggatgg gacagttttc catatccttg ctgtggagct ctggaacact 1920 ctctaaattt ccctctatta aaaatcactg ccctaactat acttcctcct tgagggaata 1980 gaaatggacc tttctctgac atagttcttg gcatgggagc cagccacaaa tgagattctg 2040 acgtgtccag gtttctcctg agctcatcta catagattgg tagacccttc ctttggatta 2100 ggaaagatga gttttacctc tggtacactg tcttggtaag cctggatgtg acagacacct 2160 cggctctcct tgaataagaa agccagcaga actcttaaag ccagttgtag tacggagttg 2220 tcagcactca ctgaacctca ctttacaggg ataagagtgg tgtggcattt taaatacaat 2280 ggtatgttat tgccagggag tgaggtacaa gacgatggct catgtcacag gcctacctga 2340 tacggtgtca gagaaagtgg tggggaaagg atctggttca tggaattctg atcttggccc 2400 ataggtgaac caccaaaata gtgctcgagt cttaggttac tgtcatcaaa gacttgggat 2460 gactccatta tatcctgggg ttgtgggtat tagaactaaa tatggaggtc ctgagcatgg 2520 ggactggtgt cctcagtagg tgtttgggaa tatgggaagg gtctcctatt tattcaatag 2580 agttttctca gttattttcc tccctcgccc ttgcaatctc cagcaaaagg tgggatctag 2640 gaagaaagaa tccagtgtag aagttgagaa gaacttgaac gttttggttc tggataaggt 2700 cactgtccta ggtgctaggt ggaccgagca aaagactcag tggatgaact ggtgcagtgc 2760 ctgacagaat aaagaacagt attaatccct ttgagaaagc atagtccagc aggacagtgg 2820 ccatttggac agaagcccac ttagtttctt gggagcaaca gcacgtatca gaagccagac 2880 ttgctcttcg gtcatgcact ttgggataca gcgtataggt gcagccctgt cacaacacca 2940 acagaagtag cagcctctgg gtgcagtcac ccacacccca aagctggaag gatctggttc 3000 aacatagcac aaacccttag gaaaaatgaa attaacatca ctgatgtgta atccagtaaa 3060 atctcccttt ttcgggtgtg tatgtgggca tgtgcccatt tctatgtgtg tgtctacgtg 3120 cagctcacta ccaacagcct catgtgcact tgacctgaca gtgctcgctg agaactctca 3180 ccaggttggc gcctgaatgc cttactctca gcagtcagag gcttgcttgc tctgtgcaga 3240 tttttaattt tcttttttgg ccctaggctg gttgggacct ctacagcttc attctttcac 3300 attaaatagt gacctttttc agtattttcc ctcttcccct ttataaatta tgctaaagcc 3360 acaaagcaca tttttgggga tcatagaagg ttggggttcc agaaaggcat ctgtgtgatg 3420 gttccattga tgtgggattt ccctacttgc tgtattctca gtttctaata aaaagaacca 3480 aatgaaaaaa aaaaaaaaaa 3500

<210> 50

<211> 386

<212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Construto sintético

<400> 50

Met Asn Glu Pro Thr Glu Asn Arg Leu Gly Cys Ser Arg Thr Pro Glu

1 5 10 15

Pro Asp Ile Arg Leu Arg Lys Gly His Gln Leu Asp Gly Thr Arg Arg

20 25 30

Gly Asp Asn Asp Ser His Gln Gly Asp Leu Glu Pro Ile Leu Glu Ala 35 40 45

Ser Val Leu Ser Ser His His Lys Lys Ser Ser Glu Glu His Glu Tyr 50 55 60

Ser Asp Glu Ala Pro Gln Glu Asp Glu Gly Phe Met Gly Met Ser Pro 65 70 75 80

Leu Leu Gln Ala His His Ala Met Glu Lys Met Glu Glu Phe Val Cys 85 90 95

Lys Val Trp Glu Gly Arg Trp Arg Val Ile Pro His Asp Val Leu Pro

100 105 110

Asp Trp Leu Lys Asp Asn Asp Phe Leu Leu His Gly His Arg Pro Pro 115 120 125

Met Pro Ser Phe Arg Ala Cys Phe Lys Ser Ile Phe Arg Ile His Thr 130 135 140

Glu Thr Gly Asn Ile Trp Thr His Leu Leu Gly Cys Val Phe Phe Leu 145 150 155 160

Cys Leu Gly Ile Phe Tyr Met Phe Arg Pro Asn Ile Ser Phe Val Ala

165 170 175

Pro Leu Gln Glu Lys Val Val Phe Gly Leu Phe Phe Leu Gly Ala Ile

180 185 190

Leu Cys Leu Ser Phe Ser Trp Leu Phe His Thr Val Tyr Cys His Ser

195 200 205

Glu Gly Val Ser Arg Leu Phe Ser Lys Leu Asp Tyr Ser Gly Ile Ala

210 215 220

Leu Leu Ile Met Gly Ser Phe Val Pro Trp Leu Tyr Tyr Ser Phe Tyr 225 230 235 240

Cys Asn Pro Gln Pro Cys Phe Ile Tyr Leu Ile Val Ile Cys Val Leu

245 250 255

Gly Ile Ala Ala Ile Ile Val Ser Gln Trp Asp Met Phe Ala Thr Pro

260 265 270

Gln Tyr Arg Gly Val Arg Ala Gly Val Phe Leu Gly Leu Gly Leu Ser

275 280 285

Gly Ile Ile Pro Thr Leu His Tyr Val Ile Ser Glu Gly Phe Leu Lys

290 295 300

Ala Ala Thr Ile Gly Gln Ile Gly Trp Leu Met Leu Met Ala Ser Leu 305 310 315 320

Tyr Ile Thr Gly Ala Ala Leu Tyr Ala Ala Arg Ile Pro Glu Arg Phe

325 330 335

Phe Pro Gly Lys Cys Asp Ile Trp Phe His Ser His Gln Leu Phe His

340 345 350

Ile Phe Val Val Ala Gly Ala Phe Val His Phe His Gly Val Ser Asn

355 360 365

Leu Gln Glu Phe Arg Phe Met Ile Gly Gly Gly Cys Ser Glu Glu Asp

370 375 380 .

Ala Leu 385 LISTAGEM DE SEQÜENCIA

SEQ ID N0:1: Fragmento 1 do Receptor 1 de Adiponectina vlvvaaafvh fygvsnlqef rygleggctd dtll

SEQ ID NO:2: Fragmento 2 do Receptor 1 de Adiponectina lvvaaafvh fygvsnlqef rygleggctd dtll

SEQ ID NO:3: Fragmento 3 do Receptor 1 de Adiponectina snlqef rygleggctd dtll

SEQ ID NO:4: Fragmento 4 do Receptor 1 de Adiponectina vvaaafvh fygvsnlqef rygleggctd dtll

SEQ ID NO:5: Fragmento 5 do Receptor 1 de Adiponectina vaaafvh fygvsnlqef rygleggctd dtll

SEQ ID NO:6: Fragmento 6 do Receptor 1 de Adiponectina aaafvh fygvsnlqef rygleggctd dtll

SEQ ID NO:7: Fragmento 7 do Receptor 1 de Adiponectina

aafvh fygvsnlqef rygleggctd dtll SEQ ID NO:8: Fragmento 8 do Receptor 1 de Adiponectina afvh fygvsnlqef rygleggctd dtll

SEQ ID NO:9: Fragmento 9 do Receptor 1 de Adiponectina fvh fygvsnlqef rygleggctd dtll

SEQ ID NO:10: Fragmento 10 do Receptor 1 de Adiponectina vh fygvsnlqef rygleggctd dtll

SEQ ID NO:11: Fragmento 11 do Receptor 1 de Adiponectina h fygvsnlqef rygleggctd dtll

SEQ ID NO:12: Fragmento 12 do Receptor 1 de Adiponectina fygvsnlqef rygleggctd dtll

SEQ ID NO:13: Fragmento 13 do Receptor 1 de Adiponectina ygvsnlqef rygleggctd dtll

SEQ ID NO:14: Fragmento 14 do Receptor 1 de Adiponectina gvsnlqef rygleggctd dtll

SEQ ID NO:15: Fragmento 15 do Receptor 1 de Adiponectina vsnlqef rygleggctd dtll SEQ ID NO:16: Fragmento 16 do Receptor 1 de Adiponectina nlqef rygleggctd dtll

SEQ ID NO:17: Fragmento 17 do Receptor 1 de Adiponectina lqef rygleggctd dtll

SEQ ID NO:18: Fragmento 18 do Receptor 1 de Adiponectina qef rygleggctd dtll

SEQ ID NO:19: Fragmento 19 do Receptor 1 de Adiponectina ef rygleggctd dtll

SEQ ID NO:20: Fragmento 20 do Receptor 1 de Adiponectina f rygleggctd dtll

SEQ ID NO:21: Fragmento 21 do Receptor 1 de Adiponectina rygleggctd dtll

SEQ ID NO:22: Fragmento 22 do Receptor 1 de Adiponectina ygleggctd dtll

SEQ ID NO:23: Fragmento 1 do Receptor 2 de Adiponectina ifvvagafvh fhgvsnlqef rfmigggcse edal

SEQ ID NO:24: Fragmento 2 do Receptor 2 de Adiponectina vagafvh fhgvsnlqef rfmigggcse edal

SEQ ID NO:25: Fragmento 3 do Receptor 2 de Adiponectina snlqef rfmigggcse edal

SEQ ID NO:26: Fragmento 4 do Receptor 2 de Adiponectina fvvagafvh fhgvsnlqef rfmigggcse edal

SEQ ID NO:27: Fragmento 5 do Receptor 2 de Adiponectina vvagafvh fhgvsnlqef rfmigggcse edal

SEQ ID NO:28: Fragmento 6 do Receptor 2 de Adiponectina agafvh fhgvsnlqef rfmigggcse edal

SEQ ID NO:29: Fragmento 7 do Receptor 2 de Adiponectina gafvh fhgvsnlqef rfmigggcse edal

SEQ ID NO:30: Fragmento 8 do Receptor 2 de Adiponectina 30 afvh fhgvsnlqef rfmigggcse edal

SEQ ID NO:31: Fragmento 9 do Receptor 2 de Adiponectina fvh fhgvsnlqef rfmigggcse edal SEQ ID NO: 32: Fragmento 10 do Receptor 2 de Adiponectina vh fhgvsnlqef rfmigggcse edal

SEQ ID NO: 33: Fragmento 11 do Receptor 2 de Adiponectina h fhgvsnlqef rfmigggcse edal

SEQ ID NO: 34: Fragmento 12 do Receptor 2 de Adiponectina fhgvsnlqef rfmigggcse edal

SEQ ID NO: 35: Fragmento 13 do Receptor 2 de Adiponectina hgvsnlqef rfmigggcse edal

SEQ ID NO:36: Fragmento 14 do Receptor 2 de Adiponectina gvsnlqef rfmigggcse edal

SEQ ID NO:37: Fragmento 15 do Receptor 2 de Adiponectina vsnlqef rfmigggcse edal

SEQ ID NO:38: Fragmento 16 do Receptor 2 de Adiponectina nlqef rfmigggcse edal

SEQ ID NO:39: Fragmento 17 do Receptor 2 de Adiponectina Iqef rfmigggcse edal

SEQ ID NO:40: Fragmento 18 do Receptor 2 de Adiponectina qef rfmigggcse edal

SEQ ID NO:41: Fragmento 19 do Receptor 2 de Adiponeetina ef rfmigggcse edal

SEQ ID NO:42: Fragmento 20 do Receptor 2 de Adiponectina f rfmigggcse edal

SEQ ID NO:43: Fragmento 21 do Receptor 2 de Adiponeetina rfmigggcse edal

SEQ ID NO:44: Fragmento 22 do Receptor 2 de Adiponectina fmigggcse edal

SEQ ID NO:45 - Seqüência do ácido nucleico do Receptor 1 de Adiponectina ggcgctgaag atcggggccg ctcggccgca ggccgcctcc agcgccgcgg gatgtagcgc gggggaccgc ggcccccagc agagcccgcc tgcccggctt gtctaccatc agagggagat ctctgccccc tggggctgag agaccccaac ctttccccaa gctgaagctg cagggtattg aggtaccagc cagatgtctt cccacaaagg atctgtggtg gcacagggga atggggctcc tgccagtaac agggaagctg acacggtgga gaagggcaaa cgggtaatcg ccaacccacc gccccaggaa gaagaggagg aggtgcgggt catggagaag atggaagagt ttgtgtacaa atatgatgtg ctccctgact ggctaaagga tcccatgccc tcctttcggg cttgcttcaa caacatctgg acccatctgc ttggtttcgt gctcagacca aatatgtact tcatggcccc ctttttgggt gcagtgctct gcctcagctt ttcagagaaa gtctctcgga ctttttccaa tatggggagc tttgtcccct ggctctatta catctacctc tccatcgtct gtgtcctggg ccggtttgcc actcctaagc accggcagac gagtggcgtc gtgcccacca tgcactttac agtgggccag atgggctggt tcttcctcat ttatgctgct cgaattcctg agcgcttctt tcatcagatt ttccatgtcc tggtggtggc caaccttcag gaattccgtt acggcctaga agccttccca cctgcggggt ggaggaggaa tgctgaagtg agaggaagag tctgagttgt cagtaccaac caagcttcag cccactttca attctcctag ctggggatgg ggcatggtca ctaccggccc ctcacagaga cagtactttg caaccatttt gggaaaatta tggactggga agaaaatgtc cctcccttac ccccatcctt ccatttttgt agcacacttt tcaaaaacaa ctggatctgc ttatagagca ggaagaataa catggaagtg tgtccaggct tcaagtaact agtaatgtaa aatttaaatg gggaaagata aacctgctat cattgctatg tatcttgatg cagaagagac ttggcattca aagatttcaa aaaaaaaa

actggctgaa ctgggacccc tgctagaaga caaagctgaa gaagagcaaa catgcccagt actgacactt cccctgcaag cccaccacgc ggtctgggag ggacgttgga gggtcatccc caacgactat ctgctacatg gtcatagacc gagcatcttc cgcattcata cagaaactgg gctgtttctc tttttgggaa tcttgaccat tctacaggag aaggtggttt ttgggatgtt ctcctggctc tttcacaccg tctattgtca actggactat tcagggattg ctcttctaat ttccttctac tgctccccac agccacggct catttctgcc atcattgtgg cgcagtggga aagagcaggc gtgttcctgg gacttggctt tatcgctgag ggctttgtca aggccaccac ggctgtgatg tacatcactg gagctggcct tcctggaaaa tttgacatat ggttccagtc agcagccttt gtccacttct atggagtctc aggcggctgt actgatgaca cccttctctg cttcccaagt gcttttaaaa ataacttctt ctgtttctag aagaaacctc ttagagaatt cacccactgg gcaataaact ttccatttcc aacttagcca tcccctcctc agcaaggcat aaactcatgt tgagatttta ccctctcctc ctcttcagaa attctgtctt ttcttctgga aactttgtat cctggcttat aacaggccat ttatataccc tggtcccatc tttctagggc agccaccaac ttttacctag cccggctaat tgagttttaa tttttttttt ttcttggcag tttaatattt aatactaagc tttaaaaaga caaagactat gatgttaata aaagaaagta aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa SEQ ID NO: 46 - Seqüência de aminoácidos do Receptor 1 de Adiponectina

msshkgsvva qgngapasnr eadtvelael gplleekgkr vianppkaee eqtcpvpqee eeevrvltlp lqahhamekm eefvykvweg rwrvipydvl pdwlkdndyl lhghrppmps fracfksifr ihtetgniwt hllgfvlflf lgiltmlrpn myfmaplqek wfgmfflga vlclsfswlf htvychsekv srtfskldys giallimgsf vpwlyysfyc spqprliyls ivcvlgisai ivaqwdrfat pkhrqtragv flglglsgvv ptmhftiaeg fvkattvgqm gwfflmavmy itgaglyaar iperffpgkf diwfqshqif hvlvvaaafv hfygvsnlqe frygleggct ddtll

SEQ ID NO: 4 7 - Seqüência do ácido nucleico de variante do Receptor 1 de Adi- ponectina

ggggccgctc ggccgcaggc cgcctccagc gccgcgggat gtagcgcggg ggaccgcggc ccccagcaga gcccgcctgc ccggcttgtc taccatcaga gggagatctc tgccccctgg ggctgagaga ccccaacctt tccccaagct gaagctgcag ggtattgagg taccagccag atgtcttccc acaaaggatc tgtggtggca caggggaatg gggctcctgc cagtaacagg gaagctgaca cggtggaact ggctgaactg ggacccctgc tagaagagaa gggcaaacgg gtaatcgcca acccacccaa agctgaagaa gagcaaacat gcccagtgcc ccaggaagaa gaggaggagg tgcgggtact gacacttccc ctgcaagccc accacgccat ggagaagatg gaagagtttg tgtacaaggt ctgggaggga cgttggaggg tcatcccata tgatgtgctc cctgactggc taaaggacaa cgactatctg ctacatggtc atagacctcc catgccctcc tttcgggctt gcttcaagag catcttccgc attcatacag aaactggcaa catctggacc catctgcttg gtttcgtgct gtttctcttt ttgggaatct tgaccatgct cagaccaaat atgtacttca tggcccctct acaggagaag gtggtttttg ggatgttctt tttgggtgca gtgctctgcc tcagcttctc ctggctcttt cacaccgtct attgtcattc agagaaagtc tctcggactt tttccaaact ggactattca gggattgctc ttctaattat ggggagcttt gtcccctggc tctattattc cttctactgc tccccacagc cacggctcat ctacctctcc atcgtctgtg tcctgggcat ttctgccatc attgtggcgc agtgggaccg gtttgccact cctaagcacc ggcagacaag agcaggcgtg ttcctgggac ttggcttgag tggcgtcgtg cccaccatgc actttactat cgctgagggc tttgtcaagg ccaccacagt gggccagatg ggctggttct tcctcatggc tgtgatgtac atcactggag ctggccttta tgctgctcga attcctgagc gcttctttcc tggaaaattt gacatatggt tccagtctca tcagatttac catgtcctgg tggtggcagc ttccgttacg gcctagaagg gcggggtgga ggaggaactt ggaagagtct gagttgtctg gcttcagccc actttcacac gggatggggc atggtcaaac acagagacag tactttgaaa aaaattatgg actgggactc cccttacccc catccttaac acacttttca aaaacaatta tagagcagga agaataaagc ccaggcttca agtaacttga tttaaatggg gaaagatatt ttgctatgta tcttgatgca ggcattcaaa gaaaaaaaaa

agcctttgtc cacttctatg cggctgtact gatgacaccc cccaagtgct tttaaaaata tttctagaag aaacctctta ccactgggca ataaactttc ttagccatcc cctcctcagc ctcatgttga gattttaccc ttcagaaatt ctgtcttttc tttgtatcct ggcttataac tataccctgg tcccatcttt caccaacttt tacctagccc gttttaattt tttttttttt taatatttaa tactaagctt aagactatga tgttaataaa aaaaaaaaaa aa

gagtctccaa ccttcaggaa

ttctctgagc cttcccacct

acttctttgc tgaagtgaga

gagaattcag taccaaccaa

catttccatt ctcctagctg

aaggcatcta ccggcccctc

tctcctccaa ccattttggg

ttctggaaga aaatgtccct

aggccatcca tttttgtagc

ctagggcctg gatctgctta

ggctaatcat ggaagtgtgt

cttggcagag taatgtaaaa

taaaaagaaa cctgctatca

agaaagtaca gaagagactt

SEQ ID NO:48 - Seqüência de aminoácidos de variante de Receptor 1 de Adipo- nectina

msshkgsvva qgngapasnr eadtvelael gplleekgkr vianppkaee eqtcpvpqee

eeevrvltlp lqahhamekm eefvykvweg rwrvipydvl pdwlkdndyl lhghrppmps

fracfksifr ihtetgniwt hllgfvlflf lgiltmlrpn myfmaplqek vvfgmfflga

vlclsfswlf htvychsekv srtfskldys giallimgsf vpwlyysfyc spqprliyls

ivcvlgisai ivaqwdrfat pkhrqtragv flglglsgvv ptmhftiaeg fvkattvgqm

gwfflmavmy itgaglyaar iperffpgkf diwfqshqiy hvlvvaaafv hfygvsnlqe frygleggct ddtll

SEQ ID NO:49 - Seqüência do ácido nucleico do Receptor 2 de Adiponectina

agaatttgtt tgtaaggtat gggaaggtcg gtggcgagtg atccctcatg atgtactacc

agactggctc aaggataatg acttcctctt gcatggacac cggcctccta tgccttcttt

ccgggcctgt tttaagagca ttttcagaat acacacagaa acaggcaaca tttggacaca

tctcttaggt tgtgtatcct tcctgtgcct ggggatcttt tatatgtttc gcccaaatat

ctcctttgtg gcccctctgc aagagaaggt ggtctttgga ttatttttct taggagccat tctctgcctt tctttttcat ggctcttcca cacagtctac tgccactcag agggggtctc tcggctcttc tctaaactgg attactctgg tattgctctt ctgattatgg gaagttttgt tccttggctt tattattctt tctactgtaa tccacaacct tgcttcatct acttgattgt catctgtgtg ctgggcattg cagccattat agtctcccag tgggacatgt ttgccacccc tcagtatcgg ggagtaagag caggagtgtt tttgggccta ggcctgagtg gaatcattcc taccttgcac tatgtcatct cggaggggtt ccttaaggcc gccaccatag ggcagatagg ctggttgatg ctgatggcca gcctctacat cacaggagct gccctgtatg ctgcccggat ccccgaacgc tttttccctg gcaaatgtga catctggttt cactctcatc agctgtttca tatctttgtg gttgctggag cttttgttca cttccatggt gtctcaaacc tccaggagtt tcgtttcatg atcggcgggg gctgcagtga agaggatgca ctgtgatacc taccagtctc cagggactat gaccctaaac cagggcctgc ggcacttgcg ggcctccctg ctggctactg atgccagtac cagaggagcc ccaaaacttt gacagcctcg tgggctttgt gacggcccag gggctctgcg tggtacatga ctgagaagag aaaaacaaaa ataaatcata cctcaaagga tggagtgcat caattgggag aaaaggagac atagcccaaa ccctggctta ttcttgggat ctactgattg cgggctctgc aagacccttg gcaaactggc ttctgatcca tatcatattt atttgtagaa gatggcgaaa cagtttagct ggtggttctt tcttctccct ttctctctct ctatgacaat aatacaaacc aatttaagtg aacatttata tccgataagg ggtgggagtg tgattttaaa tgctcttttg ggagaacaaa gaaattaatg taaataagat ttctaactgt ttaaataaga ctttatataa atgtttaaaa cataggggta agggagggag ggagaatttt tgtatagaat gaaacatgca agtaccacac actgtttgaa ttttgcacaa aaagtgactg taggatcagg tgatagcccc ggaatgtaca gtgtcttggt gcaccaagat gccttctaaa ggctgacata ccttggaccc taatggggca gagagtatag ccctagccca gtggtgacat gaccactccc tttgggaggc ctgaggtaga ggggagtggt atgtgttttc tcagtggaag cagcacatga gtgggtgaca ggatgttaga taaaggctct agttagggtg tcattgtcat ttgagagact gacacactcc tagcagctgg taaaggggtg ctggaggcca tggaggagct ctagaaacat tagcatgggc tgatctgatt acttcctggc atcccgctca cctttatggg aagtcttatt agagggatgg gacagttttc catatccttg ctgtggagct ctggaacact ctctaaattt ccctctatta aaaatcactg ccctaactat acttcctcct tgagggaata gaaatggacc tttctctgac atagttcttg gcatgggagc cagccacaaa tgagattctg acgtgtccag gtttctcctg agctcatcta catagattgg tagacccttc ctttggatta ggaaagatga gttttacctc tggtacactg tcttggtaag cctggatgtg acagacacct cggctctcct tgaataagaa agccagcaga actcttaaag ccagttgtag tacggagttg tcagcactca ctgaacctca ctttacaggg ataagagtgg tgtggcattt taaatacaat ggtatgttat tgccagggag tgaggtacaa gacgatggct catgtcacag gcctacctga tacggtgtca gagaaagtgg tggggaaagg atctggttca tggaattctg atcttggccc ataggtgaac caccaaaata gtgctcgagt cttaggttac tgtcatcaaa gacttgggat gactccatta tatcctgggg ttgtgggtat tagaactaaa tatggaggtc ctgagcatgg ggactggtgt cctcagtagg tgtttgggaa tatgggaagg gtctcctatt tattcaatag agttttctca gttattttcc tccctcgccc ttgcaatctc cagcaaaagg tgggatctag gaagaaagaa tccagtgtag aagttgagaa gaacttgaac gttttggttc tggataaggt cactgtccta ggtgctaggt ggaccgagca aaagactcag tggatgaact ggtgcagtgc ctgacagaat aaagaacagt attaatccct ttgagaaagc atagtccagc aggacagtgg ccatttggac agaagcccac ttagtttctt gggagcaaca gcacgtatca gaagccagac ttgctcttcg gtcatgcact ttgggataca gcgtataggt gcagccctgt cacaacacca acagaagtag cagcctctgg gtgcagtcac ccacacccca aagctggaag gatctggttc aacatagcac aaacccttag gaaaaatgaa attaacatca ctgatgtgta atccagtaaa atctcccttt ttcgggtgtg tatgtgggca tgtgcccatt tctatgtgtg tgtctacgtg cagctcacta ccaacagcct catgtgcact tgacctgaca gtgctcgctg agaactctca ccaggttggc gcctgaatgc cttactctca gcagtcagag gcttgcttgc tctgtgcaga tttttaattt tcttttttgg ccctaggctg gttgggacct ctacagcttc attctttcac attaaatagt gacctttttc agtattttcc CtCttCCCCt ttataaatta tgctaaagcc acaaagcaca tttttgggga tcatagaagg ttggggttcc agaaaggcat ctgtgtgatg gttccattga tgtgggattt ccctacttgc tgtattctca gtttctaata aaaagaacca aatgaaaaaa aaaaaaaaaa

SEQ ID NO: 50 - Seqüência de aminoácidos do Receptor 2 de Adiponectina

mneptenrlg csrtpepdir lrkghqldgt rrgdndshqg dlepileasv lsshhkksse

eheysdeapq edegfmgmsp llqahhamek meefvckvwe grwrviphdv lpdwlkdndf

llhghrppmp sfracfksif rihtetgniw thllgcvffl clgifymfrp nisfvaplqe

kwfglfflg ailclsfswl fhtvychseg vsrlfskldy sgiallimgs fvpwlyysfy

cnpqpcfiyl ivicvlgiaa iivsqwdmfa tpqyrgvrag vflglglsgi iptlhyvise

gflkaatigq igwlmlmasl yitgaalyaa riperffpgk cdiwfhshql fhifwagaf

vhfhgvsnlq efrfmigggc seedal

Claims (37)

1. Método de detecção de fragmentação de um receptor de adi- ponectina em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de análise quanto à presença ou ausência de, pelo menos, um frag- mento C-terminal solúvel do receptor de adiponectina em uma amostra de líquido biológico, obtida do indivíduo.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos, um fragmento C-terminal está ligado à proteína transportadora.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a proteína transportadora é adiponectina.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos, um fragmento C-terminal do receptor de adiponecti- na é detectado por um anticorpo.

5. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que pelo menos, um fragmento C-terminal ligado à proteína transpor- tadora é detectado por um anticorpo.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de análise quanto à presença de, pelo menos, um frag- mento C-terminal do receptor de adiponectina no líquido biológico compre- ende o contato da amostra com um agente de ligação específico para o, pelo menos, um fragmento C-terminal do receptor de adiponectina.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o agente de ligação compreende um anticorpo.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é marcado com uma molécula repórter.

9. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a etapa de análise quanto à presença de, pelo menos, um frag- mento C-terminal do receptor de adiponectina no líquido biológico compre- ende ainda o contato da amostra com um segundo agente de ligação espe- cífico para o primeiro agente de ligação.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o segundo agente de ligação é um anticorpo.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pe- lo fato de que o segundo agente de ligação é marcado com uma molécula repórter.

12. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a etapa de análise quanto à presença de, pelo menos, um frag- mento C-terminal do receptor de adiponectina no líquido biológico compre- ende o contato da amostra com um agente de ligação específico para a pro- teína transportadora ligada ao, pelo menos, um fragmento do receptor de adiponectina, e o método compreende ainda a etapa de determinação se a proteína transportadora está ligada ao, pelo menos, um fragmento do recep- tor de adiponectina.

13. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o líquido corporal é plasma sangüíneo ou sangue total.

14. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o líquido corporal é urina.

15. Método de detecção do nível de expressão de um receptor de adiponectina em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreen- de a etapa de determinação do nível de, pelo menos, um fragmento C- terminal do receptor de adiponectina em uma amostra de líquido biológico e correlação do nível do, pelo menos, um fragmento C-terminal com o nível de expressão do receptor de adiponectina.

16. Método de detecção do nível de expressão de adiponectina em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de de- terminação do nível de, pelo menos, um fragmento C-terminal do receptor de adiponectina em uma amostra de líquido biológico e correlação do nível do, pelo menos, um fragmento C-terminal com o nível de expressão de adipo- nectina.

17. Método de determinação de progressão de uma condição, aparecimento de uma condição ou eficácia de tratamento de uma condição, que possui como característica o desequilíbrio de adipócitos em um indiví- duo, caracterizado pelo fato de que compreende a determinação do nível de, pelo menos, um fragmento C-terminal solúvel do receptor de adiponectina, presente em uma amostra de líquido corporal obtida do indivíduo, e correla- ção do nível com progressão da condição, aparecimento da condição ou efi- cácia de tratamento da condição.

18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pe- lo fato de que pelo menos, um fragmento C-terminal solúvel está ligado à proteína transportadora.

19. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pe- lo fato de que pelo menos, um fragmento C-terminal solúvel não está ligado.

20. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pe- lo fato de que compreende ainda a determinação do nível de adiponectina em uma amostra biológica obtida do indivíduo, e correlação do nível de adi- ponectina com progressão da condição, aparecimento da condição ou eficá- cia de tratamento da condição.

21. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pe- lo fato de que compreende ainda a determinação do nível de bicunina em uma amostra biológica obtida do indivíduo, e correlação do nível de bicunina com progressão da condição, aparecimento da condição ou eficácia de tra- tamento da condição.

22. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pe- lo fato de que compreende ainda a determinação do nível de proteína C rea- tiva em uma amostra biológica obtida do indivíduo, e correlação do nível de proteína C reativa com progressão da condição, aparecimento da condição ou eficácia de tratamento da condição.

23. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pe- lo fato de que compreende ainda a determinação do nível de leucócitos em uma amostra biológica obtida do indivíduo, e correlação do nível de leucóci- tos com progressão da condição, aparecimento da condição ou eficácia de tratamento da condição.

24. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pe- lo fato de que compreende ainda a determinação do nível de peptídeo C em uma amostra biológica obtida do indivíduo, e correlação do nível de peptídeo C com progressão da condição, aparecimento da condição ou eficácia de tratamento da condição.

25. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pe- lo fato de que o método visa à determinação de aparecimento da condição, caracterizada por desequilíbrio de adipócitos.

26. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pe- lo fato de que o método visa à determinação de progressão da condição, caracterizada por desequilíbrio de adipócitos.

27. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pe- lo fato de que o método visa à determinação de eficácia de tratamento da condição, caracterizada por desequilíbrio de adipócitos.

28. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pe- lo fato de que o tratamento é administração de um agonista de PPAR gama.

29. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pe- lo fato de que a condição é síndrome metabólica.

30. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pe- lo fato de que a condição é obstrução vascular.

31. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pe- lo fato de que a condição é diabetes tipo I ou diabetes tipo II.

32. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pe- lo fato de que a condição é aterosclerose.

33. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pe- lo fato de que a condição é doença cardiovascular.

34. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pe- lo fato de que a doença cardiovascular é insuficiência cardíaca congestiva, infarto agudo do miocárdio, doença da artéria coronária, aterosclerose ou isquemia.

35. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pe- lo fato de que a condição é resistência à insulina.

36. Método de determinação se um indivíduo portador de arteri- osclerose é propenso a desenvolver doença cardiovascular, caracterizado pelo fato de que compreende a determinação do nível de, pelo menos, um fragmento C-terminal solúvel do receptor de adiponectina, presente em uma amostra de líquido biológico obtida do indivíduo, e correlação do nível com a possibilidade de desenvolvimento de doença cardiovascular.

37. Método de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pe- lo fato de que a doença cardiovascular é insuficiência cardíaca congestiva, infarto agudo do miocárdio ou isquemia.