CN102499179A - 一种IgAN肾小球硬化大鼠模型的建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种IgAN肾小球硬化大鼠模型的建立方法，该建立方法包含：步骤1，选取大鼠饲养1周后，隔日给予牛血清蛋白酸化水溶液灌胃，第2-4周每周从大鼠阴茎静脉注射金黄色葡萄球菌B型肠毒素溶液以及从腹腔注射完全弗氏佐剂；步骤2，将步骤1所得的大鼠在第5周和第6周分两次进行手术肾切除，两次手术共切除肾脏的5/6。本发明提供的IgAN肾小球硬化大鼠模型的建立方法，缩短了IgAN肾小球硬化大鼠模型的制作时间、并强化了肾组织纤维化的发生、发展，故该模型能够更好地服务于IgA肾病医学科研工作。
Description
技术领域
本发明涉及一种肾小球硬化模型的建立方法，具体地，涉及一种IgAN肾小球硬化大鼠模型的建立方法。
背景技术
IgA 肾病是以肾小球系膜区IgA 沉积为特征的肾小球肾炎，有学者将其归为系统性疾病的范畴，但大多数学者将IgA 肾病分为原发和继发，常见的继发性IgA 肾病为紫癜性肾炎、狼疮性肾炎和乙肝/肝硬化相关性肾炎。IgA 肾病是世界范围内最常见的原发性肾小球疾病，即使是IgA 肾病发病率比较低的美国，20 -39 岁的成人中，IgA肾病仍占原发性肾小球病的第一位。由于IgA肾病具有多样的临床表现、复杂的病理改变和不同的预后，越来越多的学者认为IgA 肾病不是单一的疾病,而是一个综合征。
过去认为IgA肾病是一种预后良好的疾病，现在认为IgA肾病是一种进展性疾病，只有5 %-30%的IgA肾病患者尿检异常能完全缓解，大多数患者呈慢性进行性发展。从首发症状起，每10 年约有20 %的患者发展到终末期肾病。关于IgA 肾病进展的危险因素，学术界意见比较一致的是肾小球硬化、肾间质纤维化、高血压、大量蛋白尿和肾功能损害。由于肾小球硬化和肾间质纤维化是不可逆的损害，因此是预后不良的强力危险因素。
对IgA肾病的确切发病机理目前尚未清楚，因此，针对本病的发生缺乏特异性的治疗。由于肾纤维化是本病进展至终末期肾脏病的中间环节，因此如何阻断或延缓肾纤维化的发生及发展是目前学术界关注的热点。应用比较生物学的方法，建立适当的动物模型，不仅能促进药物作用机制的研究和临床药物开发，而且为研究IgA肾病的病因、发病机制和病理生理改变提供重要线索。
目前，有关IgA肾病动物模型根据建立方法不同可基本分为诱发性，继发性，复合性，自发性和基因工程性等五类：
1.诱发性IgA肾病动物模型。
本类型模型出现最早，并且被广大肾脏病研究人员广泛采用，根据其诱导方法又可初步分为以下几类：免疫复合物诱导、微生物及其成分诱导、异种蛋白诱导。
国外较为经典的模型是利用差速离心法提取副流感嗜血杆菌外膜蛋白抗原，经口服免疫或腹腔注射以诱发小鼠IgA肾病。病理检查发现口服抗原40周、腹腔注射30周均可有肾小球内IgA沉积，实验动物同时出现蛋白尿，IgA沉积与系膜增生程度相关。
国内较为经典的模型是刘志红制作的金黄色葡萄球菌B型肠毒素（SEB）诱发的IgA肾病模型和韩庆烽制作的大肠杆菌诱发的IgA肾病模型，他们分别从肠道感染等角度对IgA肾病的发病机理作出探讨。
韩庆烽等实验表明，BALB/c小鼠经腹腔注射大肠杆菌全细胞或细胞壁成分后可以出现肾小球系膜区IgA为主的免疫沉积及电子致密物的沉积，即出现IgA肾病的病理学改变，但实验中未出现系膜区C3的沉积，同时实验小鼠也未出现蛋白尿或血尿。
异种蛋白诱导，一般使大（小）鼠口服牛血清白蛋白（BSA），常与其他方法联合应用，例如BSA加尾静脉注射葡萄球菌肠毒素（SEB）复合感染法、BSA合并行肝左叶部分切除，其基本原理可能为SEB静脉注射后通过损伤肠壁毛细血管内皮使肠粘膜的通透性增加，或人为破坏部分肝脏清除IgA能力，以增强食物抗原BSA刺激机体IgA分泌量增加,清除量减少，最终增强IgA在肾脏的沉积。
2.继发性IgA肾病动物模型。
继发病变型主要指某些全身性疾病发展时可导致肾内IgA免疫复合物沉积,出现IgA肾病的临床表现。此类模型多采用肝脏切除或诱导动物肝硬化的方法使肝脏IgA清除减少，另外狼疮性肾炎、过敏性紫癜肾炎也可见到继发性系膜区IgA沉积，但由于继发性肾脏改变常受原发病的影响，限制了其实际应用。
3.复合性IgA肾病动物模型。
本类模型系综合采用不同种类诱导方法制作，例如刘志红等制作的继发于肝硬变的IgA肾病混合模型，分别腹腔注射10%四氯化碳，尾静脉注射SEB，结果发现出现肾脏IgA沉积，并且出现较重蛋白尿。
4.自发性IgA肾病动物模型。
人类IgA肾病具有一定的家族遗传倾向，其发病可能与血管紧张素转换酶等多种基因多态性有关。与之类似，自发病变型IgA肾病动物模型中某些纯系动物具有IgA肾病易感性，有学者将HIGA小鼠施行部分肾切除，结果这些小鼠出现进行性肾小球硬化，局部TGF-β升高，该模型被认为可用于研究进行性硬化性IgAN。
5.基因工程IgA肾病动物模型。
利用转基因、基因敲除、基因替换等手段，使用某种或某些遗传性状通过基因工程技术而被人为改造过的动物制作IgA肾病动物模型是近年来这一领域的新兴前沿。较有代表性的有子宫蛋白缺陷模型、Fl-bcl-2转基因小鼠模型、FcaRI（CD89）转基因小鼠模型等，他们分别证实了IgA肾病发病的某方面因素，并在一定程度上发生了IgA肾病特征的病理改变。
由于实验动物与人类的差异性，且对于IgA肾病的病因至今尚无确切解答，因此目前存在的多种IgA肾病实验动物模型很难完全令人满意。例如，继发性和混合性模型搀杂了较多其他因素，不能很好的模拟IgA肾病原发过程；基因工程性模型和自发性模型价格过于昂贵价格，国内难以推广等等。目前，只有SEB（或以SEB为主）诱导的模型接近人类IgA肾病发病过程，反映其部分病理改变特点，但是该模型的不足之处在于肾小球纤维化形成的时间较长。进一步探索、寻找一种近似人类IgA肾病发病规律并且肾纤维化出现时间早的动物模型无疑是IgA肾病研究过程当中一个迫切需要解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于IgAN肾小球硬化模型的建立方法，将采用微生物和复合蛋白共同进行诱导的复合感染法和通过部分肾切除建立自发性肾小球硬化动物模型的方法相联合，并对该造模方法进行检验。
为了达到上述目的，本发明提供了一种IgAN肾小球硬化大鼠模型的建立方法，该方法包含以下步骤：步骤1，选取SD（Sprague Dawley）雄性大鼠饲养1周后，隔日给予牛血清蛋白（BSA）酸化水溶液灌胃，第2-4周每周从大鼠阴茎静脉注射金黄色葡萄球菌B型肠毒素（SEB）溶液以及从腹腔注射完全弗氏佐剂（一种免疫佐剂，成分为石腊油+羊毛脂+卡介苗）；步骤2，将步骤1所得的大鼠在第5周和第6周分两次进行手术肾切除，两次手术共切除肾脏的5/6。
上述的IgAN肾小球硬化大鼠模型的建立方法，其中，步骤1所述的牛血清蛋白酸化水溶液的浓度为40mg/ml，隔日给药一次，给药周期为第1-15周，即在第1-15周给药。
上述的IgAN肾小球硬化大鼠模型的建立方法，其中，步骤1所述的金黄色葡萄球菌B型肠毒素溶液浓度为0.08mg/ml，每周给药一次，给药周期为第2-4周，即在第2-4周给药。
上述的IgAN肾小球硬化大鼠模型的建立方法，其中，步骤1所述的完全弗氏佐剂剂量为0.2ml/只.qw，给药周期为第2-4周，即在第2-4周、每周给药一次、每只给药0.2ml（qw：每周一次，每次时间固定）。
上述的IgAN肾小球硬化大鼠模型的建立方法，其中，步骤2所述的两次手术肾切除，第一次手术切除左肾的2/3，一周后行第二次手术，切除右肾。
上述的IgAN肾小球硬化大鼠模型的建立方法，其中，所述的建立方法还包含对IgAN肾小球硬化大鼠模型建立的检验方法，包含：进行大鼠血清尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）、血清胱抑素C（血清CysC）、尿沉渣红细胞测定（尿沉渣RBC测定）、24小时尿蛋白定量（24hUP）、尿胱抑素C（尿CysC）的动态变化数据的测定，以上数据均增加，即出现血尿、蛋白尿现象，则说明所述的IgAN肾小球硬化大鼠模型已建立。其中，血清尿素氮、血肌酐通过全自动生化分析仪测定，血清胱抑素C通过ELISA法测定，尿沉渣红细胞测定通过尿沉渣仪，24小时尿蛋白定量通过考马斯亮蓝法测定，尿胱抑素C通过ELISA法测定。
本发明具有以下优点：
通过本发明所采用方法建立的IgAN肾小球硬化模型，其肾小球IgA沉积的强度及硬化发生的时间早于目前国内外常用的复合感染的方法。由于缩短了模型制作时间、强化了纤维化的发生、发展，故该模型能够更好地服务于IgA肾病医学科研工作，缩短实验周期，并在此基础上探讨相关药物延缓或逆转IgAN肾小球硬化发生发展，推迟其进入终末期肾脏病的时间，进而减少透析所带来的巨额医疗开支。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式作进一步地说明。
实施例一
1. 复合感染。
将SD雄性大鼠适应性饲养1周后，开始隔日给予40mg/ml BSA酸化水溶液灌胃，第2-4周每周从大鼠阴茎静脉注射SEB 0.08mg/ml.qw和从腹腔注射完全弗氏佐剂0.2ml/只.qw。
2. 5/6肾切除。
第五周进行左肾2/3切除，麻醉后取俯卧位固定于手术台上，在背部手术区常规消毒，铺巾，取背左侧直切口切开皮肤，分开腰大肌，进入腹膜后，找到肾脏，并用止血钳分离肾周围脂肪囊和肾蒂，逐层切开皮下组织和包膜，特别小心的分离开肾上腺，避免损伤，充分暴露左侧肾脏，暴露肾蒂，用纤维止血钳夹住肾蒂，用眼科手术剪分别剪除左肾上下个1/3左右皮质，用吸收性明胶海绵压迫止血，开止血钳，观察有无出血，复位残肾，腹腔注入青霉素预防感染，关闭腹腔，缝合肌肉和皮肤，术后常规给予青霉素肌肉注射3d，喂水并观察。
一周后，即第6周行第二次手术，将右肾切除。同样充分暴露右侧肾脏后，用止血钳在肾门下夹闭肾蒂，摘除肾脏，然后清理腹腔，提取未剪除的肾蒂结扎线头，并将结扎的肾蒂放入腹腔。确定无出血后剪短结扎线头，腹腔注入青霉素，关腹，缝合。术后常规给予青霉素肌肉注射。
两次手术共切除5/6的肾脏，手术全过程均有一人执刀完成。
实施例二
1. IgAN肾小球硬化大鼠模型的建立。
将SD雄性大鼠96只适应性饲养1周后，根据体重按随机数字表分为4组，即：假手术组（A组）、5/6肾切除组（B组）、复合感染组（C组）、复合感染联合5/6肾切除组（D组）各组24只。
（1）. A组：假手术组，灌胃和静脉注射时给予等量的生理盐水，进行假手术，即大鼠腹腔注射麻醉药后，游离双侧肾脏、剥离肾周脂肪后，将肾脏复位，其余操作与实施例一中5/6肾切除方法相同。
（2）. B组: 5/6肾切除组，灌胃和静脉注射时均给予等量的生理盐水，5/6肾切除操作过程与实施例一中相同。
（3）. C组：复合感染组，对该组动物进行复合感染，具体操作与实施例一中复合感染部分相同。
（4）. D组：复合感染联合5/6肾切除，具体操作与实施例一相同。
2. IgAN肾小球硬化大鼠模型的检验。
（1）. 观察第0、4、8、12周大鼠血清尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）和血清胱抑素C（血清CysC）的动态变化情况。
血清尿素氮（BUN）和血肌酐（Scr），采用全自动生化分析仪（HITACHI 7600-010）进行检测，日本HITACHI公司生产。
血清胱抑素C（血清CysC）的检测方法为ELISA法。
所得结果如下所示。
表1：不同时间点血清BUN的结果（ 
±S）。
| 周期 | 鼠数 | A组 | B组 | C组 | D组 |
| 0周 | 8 | 5.45±0.31 | 5.59±0.38 | 5.36±0.17 | 5.44±0.24 |
| 4周 | 8 | 5.49±0.45 | 5.54±0.75 | 4.96±1.23 | 5.75±1.50 |
| 8周 | 8 | 5.53±0.70 | 14.58±1.99 | 5.96±1.12 | 17.59±2.90 |
| 12周 | 8 | 5.48±0.38 | 17.53±2.27 | 5.65±1.25 | 18.76±3.16 |
表2：不同时间点血清Scr的结果 （
±S）。
| 周期 | 鼠数 | A组 | B组 | C组 | D组 |
| 0周 | 8 | 26.57±3.88 | 26.90±4.58 | 26.14±2.65 | 26.38±5.75 |
| 4周 | 8 | 26.88±4.61 | 25.88±2.42 | 26.25±1.16 | 39.00±10.72 |
| 8周 | 8 | 26.13±1.73 | 63.00±7.05 | 26.75±1.80 | 66.75±10.40 |
| 12周 | 8 | 26.88±2.64 | 61.50±12.90 | 28.50±4.47 | 69.63±11.48 |
表3：不同时间点血清Cys C的结果（
±S）。
| 周期 | 鼠数 | A组 | B组 | C组 | D组 |
| 0周 | 8 | 511.12±23.78 | 515.37±36.58 | 514.94±36.16 | 520.11±55.70 |
| 4周 | 8 | 512.64±87.52 | 520.87±96.94 | 698.44±103.86 | 689.98±109.60 |
| 8周 | 8 | 567.37±117.08 | 766.89±98.61 | 740.71±105.03 | 819.09±187.66 |
| 12周 | 8 | 596.42±109.06 | 899.02±136.87 | 844.31±83.73 | 1097.77±146.31 |
结果表明：复合感染联合5/6肾切除组的血清BUN呈时间依赖性，与复合感染组比较有显著的统计学意义（P<0.01），而与5/6肾切除组相比无统计学意义（P>0.05）；复合感染联合5/6肾切除组的血清Scr呈时间依赖性，与复合感染组比较有显著的统计学意义（P<0.01），而与5/6肾切除组相比无统计学意义（P>0.05）；复合感染联合5/6肾切除组的血清CysC呈时间依赖性，与5/6肾切除组和复合感染组比较均有显著的统计学意义（P<0.01）。即复合感染联合5/6肾切除组在同时间段内血清BUN、血清Scr和血清CysC与现有技术的复合感染组、5/6肾切除组相比，大都出现显著的增加，说明本发明提供的建模方法更加快速有效。
（2）. 观察第0、4、6、8、12周尿沉渣红细胞测定（尿沉渣RBC测定）、24小时尿蛋白定量（24hUP）、尿胱抑素C（尿CysC）的动态变化情况。
尿沉渣红细胞测定（尿沉渣RBC测定），测量仪器为尿沉渣仪（Sysmex UF-1000i），日本希森美康（Sysmex）公司生产。
24小时尿蛋白定量（24hUP）的测量方法为考马斯亮蓝法。
尿胱抑素C（尿CysC）的测量方法为ELISA法。
所得结果如下所示。
表4：不同时间点的尿沉渣RBC测定（104/ml）（
±S）。
| 周期 | 鼠数 | A组 | B组 | C组 | D组 |
| 0周 | 8 | 5.04±0.92 | 5.11±0.48 | 5.08±0.32 | 5.09±0.76 |
| 4周 | 8 | 5.01±0.85 | 5.35±0.58 | 7.56±1.49 | 7.40±1.54 |
| 6周 | 8 | 5.06±0.88 | 6.41±0.29 | 11.71±2.58 | 13.11±1.63 |
| 8周 | 8 | 5.05±0.31 | 6.64±0.35 | 12.28±1.90 | 14.84±2.50 |
| 12周 | 8 | 5.08±0.41 | 6.75±0.62 | 13.60±1.08 | 15.02±1.04 |
表5：不同时间点的24hUP（g/24h） （
±S）。
| 周期 | 鼠数 | A组 | B组 | C组 | D组 |
| 0周 | 8 | 6.32±1.30 | 6.35±0.81 | 6.24±1.22 | 6.37±0.81 |
| 4周 | 8 | 5.65±1.63 | 5.68±1.50 | 5.56±1.49 | 5.40±1.54 |
| 6周 | 8 | 5.59±1.9 | 11.71±2.58 | 6.94±2.32 | 27.31±8.26 |
| 8周 | 8 | 5.24±1.05 | 23.94±4.17 | 6.35±4.65 | 32.89±7.75 |
| 12周 | 8 | 5.19±1.42 | 22.69±4.01 | 6.26±4.17 | 38.19±11.50 |
表6：不同时间点的尿液CysC（ug/L）（
±S）。
| 周期 | 鼠数 | A组 | B组 | C组 | D组 |
| 0周 | 8 | 560.94±20.56 | 568.01±25.96 | 567.54±24.81 | 562.82±20.01 |
| 4周 | 8 | 517.80±49.50 | 514.10±63.55 | 527.85±50.77 | 518.33±58.96 |
| 6周 | 8 | 517.27±50.04 | 644.85±70.945 | 612.31±67.28 | 678.60±106.40 |
| 8周 | 8 | 523.09±31.97 | 704.52±53.69 | 676.51±45.60 | 710.33±97.29 |
| 12周 | 8 | 532.08±54.00 | 729.90±100.23 | 679.31±76.33 | 782.80±98.67 |
结果表明：复合感染联合5/6肾切除组的尿RBC测定逐渐增多，并呈时间依赖性，与5/6肾切除组和复合感染组比较均有显著的统计学意义（P<0.01）；复合感染联合5/6肾切除组的24hUP也逐渐增多，呈时间依赖性，与5/6肾切除组和复合感染组比较均有显著的统计学意义（P<0.01）；复合感染联合5/6肾切除组的尿液CysC呈时间依赖性，与复合感染组比较有显著的统计学意义（P<0.01），而与5/6肾切除组相比无统计学意义（P>0.05）。即复合感染联合5/6肾切除组在同时间段内尿RBC测定、24hUP和尿液CysC与现有技术的复合感染组、5/6肾切除组相比，大都出现显著的增加，说明本发明提供的建模方法更加快速有效。
3. IgAN肾小球硬化大鼠模型的应用。
（1）. 观察第8、12、15周大鼠肾组织中的TGF-β1、α-SMA、PDGF、IL-1、 FGF-1、 FN、 CoⅣ、CTGF蛋白表达情况。
通过免疫组化方法，实验过程如下。
石蜡切片常规脱蜡至水，PBS洗3×3min；用pH6.0 0.01M CB 热诱导修复（微波3档 20min）,室温自然冷却；PBS洗3×3min；0.3％H2O2抑制内源性过氧化物酶20min，室温；PBS洗3×3min；20%正常羊血清室温孵育30min, 不洗；滴加适当稀释特异性一抗37℃孵育 2h；PBS洗3×3min； EnVision试剂（HRP-R/M）37℃ 30min；PBS洗3×3min；DAB显色8～12min；苏木素衬染色，热水蓝化；吹干后，树脂封片；镜下观察，核紫蓝色，阳性呈棕黄色。
图像采集：通过显微镜、图像采集卡、数码相机或CCD摄像机采集数字图像，数字图像为标准的位图（BMP）文件格式。
物镜倍数：显微镜物镜有x4, x10, x20, x25, x40种五倍数选择（目镜x10）。
距离测量定标：距离可以用显微镜专用校正微尺来标定。标定可在x4, x10, x20, x25, x40 条件下进行。步骤是先点击图像中微尺上的两个点，再将它的实际微米数输入计算机，计算机自动计算得到比例因子后存储备用。
消除背景：本命令能把免疫组化中的紫蓝色背景从图像上去除。
选阴性区域：操作时用鼠标器选择阴性区域，处理后有效阴性区域用蓝色表示。此功能可以和选阳性区域功能交替使用。
选阳性区域：操作时用鼠标器选择棕黄色或棕褐色阳性区域，处理后有效阳性区域用红色表示。此功能可和选阴性区域功能交替使用。
测量：测量方式可选全视场测量。否则，需选择测量区域（用鼠标选择任意区域或选择矩形区域）。
测量结果：免疫组化图像中阳性区域面积和阳性比率以及光密度值（Optical Density）。数据包括平均光密度（AOD简称OD）、阳性面积和总面积，得到免疫组化阳性指数=阳性面积×OD/总面积。
具体结果如下。
免疫组化实验大鼠肾组织中TGF-β1蛋白表达指数（见表7和表8）。
各组实验大鼠肾小球中的TGF-β1蛋白表达指数：
与假手术组表达指数相比：第8、12、15周时各组均有显著的统计学意义（P<0.01）；与5/6肾切除组表达指数相比：第12周复合感染组有统计学意义（P<0.01或 P<0.05），而其余各组无统计学意义（P>0.05）；与复合感染组表达指数相比：第12周时复合感染联合5/6肾切除组有显著的统计学意义（P<0.01），而第8、15周时复合感染联合5/6肾切除组无统计学意义（P>0.05）。
各组实验大鼠肾小管中的TGF-β1蛋白表达指数：
与假手术组表达指数相比：第8、12、15周时各组均有显著的统计学意义（P<0.01）；与5/6肾切除组表达指数相比：第12周时复合感染组有统计学意义（P<0.01），而其余组无统计学意义（P>0.05）；与复合感染组表达指数相比：第12周时复合感染联合5/6肾切除组有统计学意义（P<0.01），而第8、15周时复合感染联合5/6肾切除组无统计学意义（P>0.05）。
总之，复合感染联合5/6肾切除组在肾组织中的TGF-β1蛋白表达指数出现明显增加。
表7：各时间点各组大鼠肾小球中TGF-β1蛋白的表达指数（
±S）。
| 周期 | 鼠数 | A组 | B组 | C组 | D组 |
| 8周 | 6 | 2.52±0.60 | 3.51±0.87 | 3.38±0.65 | 3.74±0.81 |
| 12周 | 6 | 2.85±0.74 | 4.59±1.36 | 3.55±0.72 | 5.18±1.34 |
| 15周 | 6 | 2.85±1.06 | 4.93±0.92 | 5.17±1.14 | 4.79±1.01 |
表8：各时间点各组大鼠肾小管中TGF-β1蛋白的表达指数（
±S）。
| 周期 | 鼠数 | A组 | B组 | C组 | D组 |
| 8周 | 6 | 1.75±0.43 | 2.96±0.39 | 1.87±0.53 | 2.98±0.54 |
| 12周 | 6 | 1.95±0.43 | 3.01±0.78 | 2.39±0.58 | 3.88±1.35 |
| 15周 | 6 | 1.85±0.80 | 3.86±0.95 | 1.93±0.61 | 2.39±0.59 |
免疫组化实验大鼠肾组织中FGF-1蛋白表达指数（见表9和表10）。
各组实验大鼠肾小球中的FGF-1蛋白的表达指数：
与假手术组表达指数相比：第8、12、15周各组均有显著的统计学意义（P<0.01）；与5/6肾切除组表达指数相比：第12、15周复合感染组和第8、12、15周时复合感染联合5/6肾切除组均具有统计学意义（P<0.01或P<0.05），而其余组无统计学意义（P>0.05）；与复合感染组表达指数相比：第12周时复合感染联合5/6肾切除组有统计学意义（P<0.05），而其余组无统计学意义（P>0.05）。
各组实验大鼠肾小管中的FGF-1蛋白的表达指数：
与假手术组表达指数相比：除第8、15周复合感染组无统计学意义（P>0.05），其余组有显著的统计学意义（P<0.01）；与5/6肾切除组表达指数相比：第8、15周时复合感染组和第12周时复合感染联合5/6肾切除组均具有显著的统计学意义（P<0.01），而其余组无统计学意义（P>0.05）；与复合感染组表达指数相比：第8、12、15周时复合感染联合5/6肾切除组有统计学意义（P<0.01或P<0.05）。
总之，复合感染联合5/6肾切除组在肾组织中的FGF-1蛋白表达指数出现明显增加。
表9：各时间点各组大鼠肾小球中FGF-1蛋白的表达指数（
±S）。
| 周期 | 鼠数 | A组 | B组 | C组 | D组 |
| 8周 | 6 | 1.50±0.40 | 2.99±0.65 | 3.34±0.59 | 3.58±0.77 |
| 12周 | 6 | 1.68±0.54 | 3.08±1.05 | 4.24±0.96 | 5.27±1.50 |
| 15周 | 6 | 1.80±0.60 | 3.41±1.21 | 4.84±0.78 | 4.55±1.48 |
表10：各时间点各组大鼠肾小管中FGF-1蛋白的表达指数（±S）。
| 周期 | 鼠数 | A组 | B组 | C组 | D组 |
| 8周 | 6 | 1.50±0.62 | 2.61±0.57 | 1.63±0.27 | 2.36±0.52 |
| 12周 | 6 | 1.37±0.29 | 2.00±0.41 | 1.90±0.37 | 2.41±0.67 |
| 15周 | 6 | 1.35±0.26 | 2.46±0.44 | 2.10±0.54 | 3.42±0.68 |
免疫组化实验大鼠肾组织中FN蛋白表达指数（见表11和表12）。
各组实验大鼠肾小球中的FN 蛋白表达指数：
与假手术组表达指数相比：第8、12、15周时各组均有显著的统计学意义（P<0.01）；与5/6肾切除组表达指数相比：第8、12、15周复合感染组具有统计学意义（P<0.01或 P<0.05），而其余组无统计学意义（P>0.05）；与复合感染组表达指数相比：第8、12周时复合感染联合5/6肾切除组有显著的统计学意义（P<0.01），而第15周时复合感染联合5/6肾切除组无统计学意义（P>0.05）。
各组实验大鼠肾小管中的FN蛋白表达指数：
与假手术组表达指数相比：与第8、12周时的复合感染组与第8、15周时复合感染联合5/6肾切除组有显著统计学意义（P<0.01），而其余组无统计学意义（P>0.05）；与5/6肾切除组表达指数相比：第12、15周时复合感染组和第8、15周时复合感染联合5/6肾切除组有显著的统计学意义（P<0.01），而其余组无统计学意义（P>0.05）；与复合感染组的肾小管中表达指数相比：第8周时复合感染联合5/6肾切除组有统计学意义（P<0.01），而第12、15周时复合感染联合5/6肾切除组无统计学意义（P>0.05）。
总之，复合感染联合5/6肾切除组在肾组织中的FN蛋白表达指数出现明显增加。
表11：各时间点各组大鼠肾小球中FN蛋白的表达指数（
±S）。
| 周期 | 鼠数 | A组 | B组 | C组 | D组 |
| 8周 | 6 | 1.69±0.53 | 3.06±0.50 | 2.91±0.71 | 3.90±0.82 |
| 12周 | 6 | 1.98±0.76 | 4.10±0.92 | 3.74±1.02 | 5.03±1.40 |
| 15周 | 6 | 1.78±0.65 | 4.32±1.09 | 4.49±1.38 | 5.29±1.51 |
表12：各时间点各组大鼠肾小管中FN蛋白的表达指数（
±S）。
| 周期 | 鼠数 | A组 | B组 | C组 | D组 |
| 8周 | 6 | 1.08±0.36 | 1.14±0.28 | 1.30±0.35 | 1.91±0.52 |
| 12周 | 6 | 1.43±0.49 | 1.37±0.35 | 2.22±0.64 | 2.80±0.73 |
| 15周 | 6 | 1.47±0.65 | 1.16±0.39 | 2.11±0.73 | 2.23±0.87 |
免疫组化实验大鼠肾组织中PDGF蛋白表达指数（见表13和表14）。
各组实验大鼠肾小球中的PDGF 蛋白表达指数：
与假手术组表达指数相比：除第8周5/6肾切除组无统计学意义（P>0.05）外，与其余组均有显著的统计学意义（P<0.01）；与5/6肾切除组表达指数相比：第15周复合感染组具有统计学意义（P<0.01），第8、12、15周时复合感染联合5/6肾切除组均具有统计学意义（P<0.01），而第8、12周时复合感染组无统计学意义（P>0.05）；与复合感染组表达指数相比：第12周时复合感染联合5/6肾切除组有显著的统计学意义（P<0.01），而第8、15周时复合感染联合5/6肾切除组无统计学意义（P>0.05）。
各组实验大鼠肾小管中的PDGF蛋白表达指数：
与假手术组表达指数相比：第8、12、15周时5/6肾切除组和复合感染联合5/6肾切除组均有显著统计学意义（P<0.01），与第12周复合感染组有显著的统计学意义（P<0.01），而第8、15周无统计学意义（P>0.05）；与5/6肾切除组表达指数相比：第8、15周时复合感染组与第12、15周时复合感染联合5/6肾切除组均具有显著的统计学意义（P<0.01），而第12周时复合感染组与第8周时复合感染联合5/6肾切除组均无统计学意义（P>0.05）；与复合感染组表达指数相比：第8、12、15周时复合感染联合5/6肾切除组有统计学意义（P<0.01）。
总之，复合感染联合5/6肾切除组在肾组织中的PDGF蛋白表达指数出现明显增加。
表13：各时间点各组大鼠肾小球中PDGF蛋白的表达指数（±S）。
| 周期 | 鼠数 | A组 | B组 | C组 | D组 |
| 8周 | 6 | 2.38±0.68 | 2.71±0.85 | 3.00±0.63 | 3.29±0.76 |
| 12周 | 6 | 2.29±0.69 | 2.90±0.72 | 3.10±0.80 | 3.49±0.72 |
| 15周 | 6 | 2.87±0.90 | 3.80±1.18 | 4.70±1.26 | 4.46±0.85 |
表14：各时间点各组大鼠肾小管中PDGF蛋白的表达指数（±S）。
| 周期 | 鼠数 | A组 | B组 | C组 | D组 |
| 8周 | 6 | 2.16±0.31 | 2.99±0.33 | 2.08±0.27 | 3.21±0.42 |
| 12周 | 6 | 1.88±0.56 | 2.46±0.59 | 2.81±0.64 | 4.01±1.01 |
| 15周 | 6 | 4.57±0.60 | 2.61±0.65 | 3.96±1.29 | 5.24±0.75 |
免疫组化实验大鼠肾组织中α-SMA蛋白表达指数（见表15和表16）。
各组实验大鼠肾小球中的α-SMA 蛋白表达：
与假手术组表达指数相比：第8、12、15周各组均有显著的统计学意义（P<0.01）；与5/6肾切除组表达指数相比：第8、15周时复合感染组与复合感染联合5/6肾切除组都具有显著的统计学意义（P<0.01），第12周时复合感染联合5/6肾切除组具有显著的统计学意义（P<0.01），而第12周时复合感染组无统计学意义（P>0.05）；与复合感染组表达指数相比：第8、12周时复合感染联合5/6肾切除组有统计学意义（P<0.01），而第15周时复合感染联合5/6肾切除组无统计学意义（P>0.05）。
各组实验大鼠肾小管中的α-SMA蛋白表达：
与假手术组表达指数相比：第8、12、15周各组均有统计学意义（P<0.01或P<0.05）；与5/6肾切除组表达指数相比：第8、15周时复合感染组和复合感染联合5/6肾切除组都具有显著的统计学意义（P<0.01），第12周时复合感染联合5/6肾切除组具有显著的统计学意义（P<0.01），而第12周时复合感染组无统计学意义（P>0.05）；与复合感染组表达指数相比：第8、12、15周时复合感染联合5/6肾切除组有统计学意义（P<0.01）。
总之，复合感染联合5/6肾切除组在肾组织中的α-SMA蛋白表达指数出现明显增加。
表15：各时间点各组大鼠肾小球中α-SMA蛋白的表达指数（
±S）。
| 周期 | 鼠数 | A组 | B组 | C组 | D组 |
| 8周 | 6 | 1.11±0.39 | 1.97±0.66 | 2.66±0.92 | 3.78±0.56 |
| 12周 | 6 | 1.31±0.50 | 2.82±0.95 | 3.04±1.09 | 4.67±0.86 |
| 15周 | 6 | 1.09±0.55 | 3.09±0.94 | 4.63±1.53 | 5.67±1.66 |
表16：各时间点各组大鼠肾小管中α-SMA蛋白的表达指数（
±S）。
| 周期 | 鼠数 | A组 | B组 | C组 | D组 |
| 8周 | 6 | 1.29±0.29 | 2.39±0.38 | 1.51±0.30 | 3.13±0.48 |
| 12周 | 6 | 1.66±0.47 | 2.70±0.50 | 2.54±0.61 | 3.67±0.77 |
| 15周 | 6 | 1.49±0.59 | 2.85±0.90 | 2.02±0.82 | 4.07±1.59 |
免疫组化实验大鼠肾组织中CTGF蛋白表达指数（见表17和表18）。
各组实验大鼠肾小球中的CTGF 蛋白表达指数：
与假手术组表达指数相比：第8、12、15周各组均有显著的统计学意义（P<0.01）；与5/6肾切除组表达指数相比：第12周复合感染组和第8、12、15周时复合感染联合5/6肾切除组均具有统计学意义（P<0.01或P<0.05），而其余组无统计学意义（P>0.05）；与复合感染组表达指数相比：第8、12、15周时复合感染联合5/6肾切除组均有显著的统计学意义（P<0.01）。
各组实验大鼠肾小管中的CTGF蛋白表达指数：
与假手术组表达指数相比：第8、12、15周各组均有显著的统计学意义（P<0.01）；与5/6肾切除组表达指数相比：第8周时复合感染组和第8、12周时复合感染联合5/6肾切除组均具有显著的统计学意义（P<0.01），而其余组无统计学意义（P>0.05）；与复合感染组表达指数相比：第8、12周时复合感染联合5/6肾切除组有统计学意义（P<0.01），而第15周时复合感染联合5/6肾切除组无统计学意义（P>0.05）。
总之，复合感染联合5/6肾切除组在肾组织中的CTGF蛋白表达指数出现明显增加。
表17：各时间点各组大鼠肾小球中CTGF蛋白的表达指数（
±S）。
| 周期 | 鼠数 | A组 | B组 | C组 | D组 |
| 8周 | 6 | 1.44±0.42 | 3.01±0.68 | 2.57±0.69 | 3.61±0.80 |
| 12周 | 6 | 1.54±0.40 | 3.94±0.56 | 3.14±0.80 | 4.97±1.13 |
| 15周 | 6 | 1.54±0.39 | 3.82±0.59 | 4.24±0.88 | 5.14±0.66 |
表18：各时间点各组大鼠肾小球中CTGF蛋白的表达指数（
±S）。
| 周期 | 鼠数 | A组 | B组 | C组 | D组 |
| 8周 | 6 | 1.62±0.44 | 3.49±0.56 | 2.72±0.78 | 4.32±0.76 |
| 12周 | 6 | 1.41±0.34 | 3.81±0.83 | 3.42±0.52 | 5.15±1.05 |
| 15周 | 6 | 1.56±0.36 | 3.82±0.60 | 4.25±0.81 | 3.81±0.98 |
免疫组化实验大鼠肾组织中CoⅣ蛋白表达指数（见表19和表20）。
各组实验大鼠肾小球中的CoⅣ蛋白表达指数：
与假手术组表达指数相比：第8、12、15周时各组均有显著的统计学意义（P<0.01）；与5/6肾切除组表达指数相比：第12周复合感染组和第12、15周复合感染联合5/6肾切除组均有统计学意义（P<0.01），而其余组无统计学意义（P>0.05）；与复合感染组表达指数相比：第12、15周时复合感染联合5/6肾切除组有显著的统计学意义（P<0.01），而第8周时复合感染联合5/6肾切除组无统计学意义（P>0.05）。
各组实验大鼠肾小管中的CoⅣ蛋白表达指数：
与假手术组表达指数相比：除第8、15周复合感染组无统计学意义（P>0.05），其余组均有显著的统计学意义（P<0.01）；与5/6肾切除组表达指数相比：第8、15周时复合感染组和第12、15周时复合感染联合5/6肾切除组均具有统计学意义（P<0.01或P<0.05），而其余组无统计学意义（P>0.05）；与复合感染组表达指数相比：第8、12、15周时复合感染联合5/6肾切除组有统计学意义（P<0.01）。
总之，复合感染联合5/6肾切除组在肾组织中的CoⅣ蛋白表达指数出现明显增加。
表19：各时间点各组大鼠肾小球中CoⅣ蛋白的表达指数（
±S）。
| 周期 | 鼠数 | A组 | B组 | C组 | D组 |
| 8周 | 6 | 2.79±0.48 | 3.59±0.54 | 3.59±0.98 | 3.98±1.05 |
| 12周 | 6 | 1.65±0.52 | 4.32±0.85 | 3.44±0.88 | 5.65±1.27 |
| 15周 | 6 | 3.47±0.84 | 4.76±0.89 | 4.99±1.50 | 6.44±1.22 |
表20：各时间点各组大鼠肾小管中CoⅣ蛋白的表达指数（
±S）。
| 周期 | 鼠数 | A组 | B组 | C组 | D组 |
| 8周 | 6 | 2.50±0.54 | 3.47±0.57 | 2.38±0.95 | 3.81±0.61 |
| 12周 | 6 | 2.36±0.52 | 3.56±0.59 | 3.331±0.86 | 4.11±0.94 |
| 15周 | 6 | 2.52±0.62 | 4.23±1.13 | 2.68±0.99 | 5.04±1.33 |
免疫组化实验大鼠肾组织中IL-1蛋白表达指数（见表21和表22）。
各组实验大鼠肾小球中的IL-1蛋白表达指数：
与假手术组表达指数相比：第8、12、15周各组均有显著的统计学意义（P<0.01）；与5/6肾切除组表达指数相比：第15周复合感染组与第8、12、15周时复合感染联合5/6肾切除组均具有统计学意义（P<0.01 或P<0.05），而其余各组无统计学意义（P>0.05）；与复合感染组表达指数相比：第8、12、15周时复合感染联合5/6肾切除组有显著的统计学意义（P<0.01）。
各组实验大鼠肾小管中的IL-1蛋白表达指数：
与假手术组表达指数相比：第8、12、15周各组均有显著的统计学意义（P<0.01）；与5/6肾切除组表达指数相比：第8周时复合感染组与第8、12、15周时复合感染联合5/6肾切除组均具有显著的统计学意义（P<0.01），而第12、15周时复合感染组均无统计学意义（P>0.05）；与复合感染组表达指数相比：第8、12、15周时复合感染联合5/6肾切除组均有统计学意义（P<0.01或P<0.05）。
总之，复合感染联合5/6肾切除组在肾组织中的IL-1蛋白表达指数出现明显增加。
表21：各时间点各组大鼠肾小球中IL-1蛋白的表达指数（
±S）。
| 周期 | 鼠数 | A组 | B组 | C组 | D组 |
| 8周 | 6 | 1.47±0.32 | 2.74±0.75 | 3.03±0.76 | 3.88±0.92 |
| 12周 | 6 | 1.51±0.52 | 3.17±0.78 | 3.21±0.65 | 4.20±1.22 |
| 15周 | 6 | 1.68±0.69 | 3.83±0.65 | 4.25±0.94 | 5.17±0.79 |
表22：各时间点各组大鼠肾小管中IL-1蛋白的表达指数（
±S）。
| 周期 | 鼠数 | A组 | B组 | C组 | D组 |
| 8周 | 6 | 1.11±0.18 | 1.98±0.28 | 1.62±0.30 | 2.59±0.36 |
| 12周 | 6 | 1.30±0.35 | 2.36±0.67 | 2.52±0.61 | 3.08±0.74 |
| 15周 | 6 | 1.20±0.33 | 2.56±0.79 | 2.61±0.83 | 3.97±0.88 |
综上所述，通过免疫组织化学法观察第8、12、15周大鼠肾组织中的TGF-β1、α-SMA、PDGF、IL-1、 FGF-1、 FN、 CoⅣ、CTGF水平表达研究结果显示，复合感染联合5/6肾切除组的TGF-β1、α-SMA、PDGF、IL-1、 FGF-1、 FN、 CoⅣ、CTGF蛋白在肾小球和肾小管中的表达呈明显上调，表明它们可能在IgAN肾小球硬化过程中起着重要作用。通过采用本发明提供的方法建立的IgAN肾小球硬化大鼠模型进行实验，可以从蛋白水平上探究IgAN肾小球硬化过程的发生发展。
（2）. 观察第8、12、15周大鼠肾组织中的TGF-β1、α-SMA、PDGF、FGF-1、FN的mRNA表达情况。
通过Q-RT-PCR法观察，操作步骤如下。
步骤1：Q-RT-PCR实验前的准备。
实验耗材（1.5ml Eppendorf管，1ml、00μL、10μL、5μL、2.5μL吸头）预先用0.1%DEPC水（取2ml DEPC加2000ml水，摇匀，过夜，灭菌）浸泡过夜，然后用灭菌水淋洗，并于100℃烤干，高压蒸气灭菌15分钟。
专用一次性8孔联体PCR反应管（ABI PRISM光学反应管）及配套的反应管盖（ABI PRISM光学反应盖板）。
配置75%的乙醇：1倍的DEPC处理水加3倍的无水乙醇，预冷。
Trizol（预冷）：内含异硫氰酸胍等物质,能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。
蒸馏水（ddH2O）：DEPC处理水。
氯仿（预冷）：能将胞膜及胞壁部分结构溶解，使胞内各种物资释放出，并抑制细胞释放出的核酸酶，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。
异丙醇（预冷）：异丙醇选择性沉淀DNA而与在溶液中的RNA分离。
PCR试验所需试剂盒：5×Buffer，Oligo dT primer，Random 6 mers， PrimeScriptTM RT Enzyme Mix，再加入Rnase Free dH2O，上游引物F，下游引物R以及TaqMan probe。
步骤2：细胞总RNA的提取。
称取50mg的组织，放入研钵中，切碎后边加液氮边研磨，待组织彻底研碎后，移入DEPC（diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯），1000ml双蒸水中加1mlDEPC配制成的DEPC水静置4小时就可用来泡实验器具，是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。水处理过的EP管，加入1mlRNAisol，用移液器轻轻吹打混匀。
室温放置5min，取上清，每管加入氯仿（三氯甲烷，又称氯仿，贮于密封的棕色瓶中，萃取剂）200μl，剧烈震荡混匀，室温静置5min，4℃，12000g离心15min。
小心吸取上清到另一EP管中，加入等量异丙醇，上下颠倒混匀，-20℃冰箱过夜。
取出EP管，4℃，12000g离心10min。
弃上清，加入1ml用DEPC配置好的75%的乙醇，洗涤沉淀。
4℃，12000g离心10min，弃上清，静置干燥片刻，加入50μlDEPC水溶解沉淀。
取1μl RNA产物加入99μL DEPC水用生物分光光度仪测定RNA浓度，OD260/OD280为1.8~2.1，RNA产物置-80℃冰箱保存待用。
步骤3：RNA的逆转录。
即cDNA的合成，cDNA是与RNA链互补的单链DNA，以其RNA为模板，在适当引物的存在下，由RNA与DNA进行一定条件下合成的就是cDNA。
根据试剂盒说明，按下列组份配置RT反应液（反应液配置在冰上进行）。
逆转录反应条件如下。
| 37℃ | 15 分钟×3（反转录反应） |
| 85℃ | 5秒（反转录酶的失活反应） |
步骤4：RT-PCR扩增反应。
根据试剂盒说明，按下列组份配置PCR反应液（反应液配置在冰上进行）。
| 试剂 | 使用量 | 终浓度 |
| 5×Premix EX Taq TM（2×） | 10.0 μL | 1× |
| PCR 正向引物（10μmol） | 0.4 μL | 0.2μm×1 |
| PCR 反向引物（10μmol） | 0.4 μL | 0.2μm×1 |
| 荧光探针溶液 | 0.8 μL | ×2 |
| ROX Reference Dye （50×） | 0.4 μL | 1× |
| DNA模板 | 2.0 μL | ×3 |
| RNase Free DH2O，即灭菌蒸馏水 | 6.0 μL | ----- |
| Total | 20.0 μL | ×5 |
Real Time PCR反应条件（两步法PCR扩增标准程序）。
| Stage 1： | 预变期 |
| Reps： | 1 |
| 95℃ | 30秒 |
| Stage 2： | PCR 反应 |
| Reps： | 40 |
| 95℃ | 5秒 |
| 60℃ | 31秒 |
反应结果用7300 system SDS Software分析。
绝对mRNA表达水平的计算：每个样本靶基因（检测基因）的相对mRNA表达水平，能直接用样品各自的内源控制物GAPDH表达来标准化加入的初始RNA量。简单地说，每个样品的靶基因的相对mRNA表达水平可以用以下公式计算：相对mRNA表达=2一△Ct，△Ct值=靶基因Ct值－GAPDHCt值。
Q-RT-PCR检测细胞外基质和细胞因子结果如下。
各组实验大鼠肾组织中TGF-β1mRNA的表达（见表23）：
与假手术组相比：除第8、12周复合感染组无统计学意义（P>0.05），其余组均有统计学意义（P<0.01或P<0.05）；与5/6肾切除组相比：第8、12、15周复合感染组和第15周复合感染联合5/6肾切除组有统计学意义（P<0.01），而其余组无统计学意义（P>0.05）；与复合感染组相比：第8、12、15周时复合感染联合5/6肾切除组有统计学意义（P<0.01）。
表23：各时间点各组大鼠肾组织中TGF-β1 mRNA的表达情况（
±S）。
| 周期 | 鼠数 | A组 | B组 | C组 | D组 |
| 8周 | 6 | 0.0708±0.0216 | 0.4647±0.1046 | 0.1344±0.0428 | 0.5810±0.1131 |
| 12周 | 6 | 0.0594±0.0193 | 0.5303±0.1406 | 0.1033±0.0487 | 0.6000±0.0624 |
| 15周 | 6 | 0.0285±0.0122 | 0.3078.±0.0723 | 0.1076±0.0424 | 0.5237±0.0729 |
各组实验大鼠肾组织中FGF-1 mRNA的表达（见表24）：
与假手术组相比：除第8周复合感染组无统计学意义（P>0.05），其余组均有显著的统计学意义（P<0.01）；与5/6肾切除组相比：第8、12周复合感染组与第12周复合感染联合5/6肾切除组均具有统计学意义（P<0.01或P<0.05），其余各组无统计学意义（P>0.05）；与复合感染组相比：第8、15周时复合感染联合5/6肾切除组有统计学意义（P<0.01或P<0.05）。
表24：各时间点各组大鼠肾组织中FGF-1 mRNA的表达情况（
±S）。
| 周期 | 鼠数 | A组 | B组 | C组 | D组 |
| 8周 | 6 | 0.0658±0.0130 | 0.2148±0.0543 | 0.0742±0.0217 | 0.3764±0.1302 |
| 12周 | 6 | 0.0312±0.0117 | 0.1450±0.0320 | 0.1033±0.0314 | 0.3398±0.0512 |
| 15周 | 6 | 0.0439±0.0059 | 0.2509±0.0700 | 0.1639±0.0461 | 0.3188±0.0867 |
各组实验大鼠肾组织中FN mRNA的表达（见表25）：
与假手术组相比：除第12周5/6肾切除组无统计学意义（P>0.05），其余组均有统计学意义（P<0.01或P<0.05）；与5/6肾切除组相比：第12、15周复合感染组和第15周复合感染联合5/6肾切除组均具有统计学意义（P<0.01或P<0.05），其余各组无统计学意义（P>0.05）；与复合感染组相比：第8、12、15周时复合感染联合5/6肾切除组有统计学意义（P<0.01）。
表25：各时间点各组大鼠肾组织中FN mRNA的表达情况（
±S）。
| 周期 | 鼠数 | A组 | B组 | C组 | D组 |
| 8周 | 6 | 0.0134±0.0024 | 0.0444±0.0148 | 0.0315±0.0055 | 0.0598±0.0103 |
| 12周 | 6 | 0.0213±0.0060 | 0.1919±0.0330 | 0.0563±0.0217 | 0.2405±0.0300 |
| 15周 | 6 | 0.0219±0.0098 | 0.1747±0.0399 | 0.1052±0.0289 | 0.4173±0.0651 |
各组实验大鼠肾组织中PDGF mRNA的表达（见表26）：
与假手术组相比：除第8周复合感染组无统计学意义（P>0.05），其余组均有统计学意义（P<0.01或P<0.05）；与5/6肾切除组相比：第9、15周复合感染组和第8周复合感染联合5/6肾切除组均有统计学意义（P<0.01或P<0.05），其余组无统计学意义（P>0.05）；与复合感染组相比：第8、12、15周时复合感染联合5/6肾切除组有统计学意义（P<0.01）。
表26：各时间点各组大鼠肾组织中PDGF mRNA的表达情况（
±S）。
| 周期 | 鼠数 | A组 | B组 | C组 | D组 |
| 8周 | 6 | 0.0611±0.0226 | 0.1477±0.0518 | 0.0812±0.0299 | 0.2432±0.0556 |
| 12周 | 6 | 0.0512±0.0154 | 0.2408±0.1068 | 0.0850±0.0129 | 0.3060±0.0881 |
| 15周 | 6 | 0.0479±0.0042 | 0.3595±0.0871 | 0.0911±0.0140 | 0.3866±0.0882 |
各组实验大鼠肾组织中α-SMA mRNA的表达（见表27）：
与假手术组相比：第8、12、15周各组均有统计学意义（P<0.01或P<0.05）；与5/6肾切除组相比：第8、15周复合感染组均有统计学意义（P<0.05），其余组无统计学意义（P>0.05）；与复合感染组相比：第8、12、15周时复合感染联合5/6肾切除组有统计学意义（P<0.01）。即复合感染联合5/6肾切除组的PDGF mRNA表达明显增加。
表27：各时间点各组大鼠肾组织中α-SMA mRNA的表达指数（
±S）。
| 周期 | 鼠数 | A组 | B组 | C组 | D组 |
| 8周 | 6 | 0.0033±0.0012 | 0.1743±0.0940 | 0.0118±0.0065 | 0.2014±0.0363 |
| 12周 | 6 | 0.0055±0.0016 | 0.0437±0.0183 | 0.0204±0.0071 | 0.0733±0.0167 |
| 15周 | 6 | 0.0148±0.0071 | 0.0669±0.0193 | 0.0408±0.0149 | 0.0746±0.0249 |
综上所述，通过Q-RT-PCR法观察第8、12、15周大鼠肾组织中的TGF-β1、α-SMA、PDGF、FGF-1、FN的mRNA水平表达情况研究结果显示，复合感染联合5/6肾切除组的肾组织中TGF-β1、α-SMA、PDGF、FGF-1、FN均呈现明显上调的趋势。通过采用本发明提供的方法建立的IgAN肾小球硬化大鼠模型进行实验，可以从基因水平上探究IgAN肾小球硬化的发生发展。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
Claims (6)
1.一种IgAN肾小球硬化大鼠模型的建立方法，其特征在于，该方法包含以下步骤：
步骤1，选取大鼠饲养1周后，隔日给予牛血清蛋白酸化水溶液灌胃，第2-4周每周从大鼠阴茎静脉注射金黄色葡萄球菌B型肠毒素溶液以及从腹腔注射完全弗氏佐剂；
步骤2，将步骤1所得的大鼠在第5周和第6周分两次进行手术肾切除，两次手术共切除肾脏的5/6。
2. 如权利要求1所述的IgAN肾小球硬化大鼠模型的建立方法，其特征在于，步骤1所述的牛血清蛋白酸化水溶液的浓度为40mg/ml，隔日给药一次，给药周期为第1-15周。
3.如权利要求1或2所述的IgAN肾小球硬化大鼠模型的建立方法，其特征在于，步骤1所述的金黄色葡萄球菌B型肠毒素溶液浓度为0.08mg/ml，每周给药一次，给药周期为第2-4周。
4.如权利要求3所述的IgAN肾小球硬化大鼠模型的建立方法，其特征在于，步骤1所述的完全弗氏佐剂剂量为0.2ml/只.qw，即每周给药一次、每只大鼠给药0.2ml，给药周期为第2-4周。
5.如权利要求1所述的IgAN肾小球硬化大鼠模型的建立方法，其特征在于，步骤2所述的两次手术肾切除，第一次手术切除左肾的2/3，一周后行第二次手术，切除右肾。
6.如权利要求1所述的IgAN肾小球硬化大鼠模型的建立方法，其特征在于，所述的建立方法还包含对IgAN肾小球硬化大鼠模型建立的检验方法，包含：
进行大鼠血清尿素氮、血肌酐、血清胱抑素C、尿沉渣红细胞测定、24小时尿蛋白定量以及尿胱抑素C的动态变化数据的测定，以上数据均增加，说明所述的IgAN肾小球硬化大鼠模型已建立。
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| CN115443947A (zh) * | 2022-10-12 | 2022-12-09 | 江苏省人民医院（南京医科大学第一附属医院） | 高血压动物模型的制备方法 |
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