CN108498546B - 一种预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的中药组合物及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的中药组合物,由如下重量份的原料药制成:壁虎10‑210份、地龙10‑210份、鼠妇虫10‑210份、蜂蛹5‑150份。所述蜂蛹可替换为蜂房。本发明还公开了一种预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的药物制剂及其制备方法,所述药物制剂的剂型包括丸剂、胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂、口服液、灌肠液、煎煮剂。本发明解决了溃疡性结肠炎癌变的临床问题,降低溃疡性结肠炎癌变的发生率,而且药物副作用小,患者经济负担小。本发明可以干预溃疡性结肠炎癌变的发生,在结肠组织炎‑癌转化中起到重要作用,其治疗效果优于美沙拉嗪组,明显优于康复新液组。
Description
技术领域
本发明涉及中药技术领域,具体涉及一种预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的中药组合物及应用。
背景技术
溃疡性结肠炎(Ulcerativecolitis,UC)是一种病因尚未十分明确的非特异性炎性肠炎,病理特点为结肠黏膜慢性炎性反应和溃疡形成,主要临床表现为腹痛、血性腹泻,体重减轻,呕吐等消化道症状,病程缠绵,反复发作。现在认为UC是结直肠癌的一种癌前病变,UC患者并发结直肠癌的危险性较正常人群高20倍,构成结肠癌的高发人群,应受到重视,故弄清溃疡性结肠炎相关癌变(Ulcerative colitis associated Carcinogenesis,UCAC)发病机制对UCAC的防治具有重要的意义。据统计,UCAC的发病率占所有大肠癌的1%-2%,但占UC患者死亡原因的15%,由此可见积极预防和治疗UC已成为预防UCAC的关键,本病现代医学治疗疗效不甚理想,目前已知有效药物美沙拉嗪因价格昂贵、毒副作用大,应用受到限制,中医药治疗本病具有独特优势。
根据UC的临床症状来看属于“泄泻”、“痢疾”、“腹痛”、“肠风下血”的中医范畴,中医证型主要分为湿热内蕴证、气滞血瘀证、脾肾虚弱证、脾肾阳虚证、肝郁脾虚证。UC的主要病因为先天不足与后天脾胃功能虚弱,除此之外也可由虚实夹杂,寒热并存,正气受损,邪气未除所致。脾主运化,将水谷精微和津液吸收、转输到全身各脏腑,若脾阳不振,脾胃运化失职,大肠传导失司,气机升降失调,气血不和,津液停聚成湿,水湿下注,清浊不分,湿浊蕴结,瘀滞而化热,灼伤经络,血败肉腐而病。常用内服方剂有葛根芩连汤、白头翁汤、参苓白术散、香砂六君子汤等。保留灌肠法是治疗溃疡性结肠炎的一种有效的肠道局部治疗方法,已经纳入该疾病的中西医结合诊治专家共识,灌肠常用的中药有锡类散、康复新液等,也可辩证选用敛疮生肌、活血化瘀、清热解毒燥湿类药物。
近年来虫类药抗肿瘤的作用的研究正在逐渐兴起,国内外对于虫类药用于治疗溃疡性结肠炎及相关癌变的研究尚属空白。还涎方是根据多年临床经验和相关前期研究,精选壁虎、地龙、蜂房(或蜂蛹)、鼠妇虫四味中药组成,申请人以其为切入点,研制安全有效、有针对性地预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的中药制剂,以解决防治溃疡性结肠炎癌变无理想治疗药物的现状。
发明内容
本发明第一个目的是提供一种快速起效、疗效确切、价格便宜、对于溃疡性结肠炎癌变具有显著预防或治疗作用的中药组合物(本发明中又称还涎方)。本发明的第二个目的是提供一种预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的药物制剂及其制备方法,所述药物制剂的剂型包括丸剂、胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂、口服液、灌肠液、煎煮剂。本发明的第三个目的是提供一种预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的中药组合物的应用。
本发明通过下面的技术方案加以实现:
一种预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的中药组合物,由壁虎、地龙、鼠妇虫、蜂蛹四种药材制成。所述蜂蛹可替换为蜂房。
一种预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的中药组合物,由如下重量份的原料药制成:壁虎10-210份、地龙10-210份、鼠妇虫10-210份、蜂房5-150份。
一种预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的中药组合物,由如下重量份的原料药制成:壁虎120份、地龙120份、鼠妇虫120份、蜂房90份。
一种预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的中药组合物,由如下重量份的原料药制成:壁虎10-210份、地龙10-210份、鼠妇虫10-210份、蜂蛹5-150份。
一种预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的中药组合物,由如下重量份的原料药制成:壁虎120份、地龙120份、鼠妇虫120份、蜂蛹90份。
一种预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的药物制剂,所述药物制剂由权利要求1-6任一项所述的中药组合物制成。
一种预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的药物制剂,所述药物制剂的剂型包括丸剂、胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂、口服液、灌肠液、煎煮剂。
所述散剂由如下方法制备:
所述中药组合物使用药物粉碎机反复打碎、过80-120筛,制成细粉细粉,即得散剂;
所述煎煮剂制备方法:
所述的中药组合物,按照1:20-1:30的料液比,加水浸泡,浸泡1.5-2.5小时,武火煮沸,文火煎煮20-40钟,过滤取滤汁;滤渣再次按照1:20-1:30的料液比,加水煮沸,文火煎煮20-40分钟,过滤取滤汁;合并滤汁即得煎煮剂;
所述灌肠液由如下方法制备:可由下列任一方法制备;
第一种制备方法,将散剂按照1:1-1:2的料液比,加入温水浸泡混匀后,加入助悬剂,即得灌肠液;所述助悬剂可选用羧甲基纤维素钠;
第二种制备方法,所述的中药组合物按照1:10-1:15的料液比,加水浸泡1.5-2.5小时,取出中药组合物放入榨汁机中,加入1-2倍量的蒸馏水,搅碎搅匀8-10min,用8-10层纱布过滤,得滤液放入榨汁机中,再加入1-2倍量的蒸馏水,搅碎搅匀4-6min,依上法过滤,得到的滤液配比成13.5mg/mL的溶液,即得灌肠液;
第三种制备方法,所述的中药组合物,按照1:20-1:30的料液比,加水浸泡,浸泡1.5-2.5小时,武火煮沸,文火煎煮约20-40钟,过滤取滤汁;滤渣再次按照1:20-1:30的料液比,加水煮沸,文火煎煮20-40分钟,过滤取滤汁;合并滤汁武火浓缩至滤汁体积的1/60-1/30。
给药方法为保留灌肠的优点:因溃疡性结肠炎病变范围局限,局部治疗优势巨大,中医保留灌肠是临床常用治疗手段,通过直肠直接给药,使药物直接作用于病灶,同时药物可以通过直肠中下段血管直接进入血循环,减少药物在肝脏中的代谢,提高药物的生物利用率,临床疗效良好。
在实际应用过程中,可以根据实际情况来选择给药的方法。
一种预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的中药组合物的应用,用于制备治疗胃十二指肠溃疡药物、或治疗急慢性胃炎药物、或治疗炎性肠病药物、或预防溃疡性结肠炎癌变药物、或治疗溃疡性结肠炎癌变药物中的应用。
本发明的积极效果是:
1、从疾病防治角度考虑,本发明解决了溃疡性结肠炎癌变的临床问题,降低溃疡性结肠炎癌变的发生率,而且药物副作用小,患者经济负担小。
2、从经济建设的角度考虑,使用还涎方保留灌肠能够快速缓解溃疡性结肠炎患者临床症状,缩短治疗疗程,节省治疗费用;另外,该药物能降低结肠癌发病率,间接节约政府医疗资源及医保资金;动物药能够通过养殖获得,资源丰富,成本低廉,增加动物药的使用,能够减少植物药过度使用造成的环境资源破坏,具有可持续发展的优势。
3、从应用趋势来看,还涎方已在临床开展应用,疗效稳定,经过剂型优化,可制成中成药制剂,潜在经济效益巨大。
4、本发明可以干预溃疡性结肠炎癌变的发生,在结肠组织炎-癌转化中起到重要作用其治疗效果优于美沙拉嗪组,明显优于康复新液组。同时实验证明:当蜂蛹药材缺乏时,可以用蜂房来代替。本发明能显著降低AOM/DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠肠黏膜炎症程度,且对溃疡性结肠炎小鼠的早期癌变具有预防作用。还涎方抑制AOM/DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠癌变的机制与还涎方抑制p53基因突变、显著下调bcl-2、cox-2的表达水平有关。
附图说明
图1为结肠石蜡切片免疫组化染色过程。
图2为高倍显微镜(HE×100)下观察病理切片图。
图3为各组p53免疫组化染色图。
图4为各组bcl-2免疫组化染色图。
图5为各组cox-2免疫组化染色图。
具体实施方式
下面结合实施例,对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此,不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
下述实施实例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法;所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1
一种预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的中药组合物,其特征在于:由壁虎、地龙、鼠妇虫、蜂蛹四种药材制成。
所述预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的中药组合物,由如下重量份的原料药制成:壁虎10份、地龙10份、鼠妇虫10份、蜂蛹5份。
一种预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的药物制剂,由壁虎10份、地龙10份、鼠妇虫10份、蜂蛹5份制成。
所述药物制剂的剂型包括丸剂、胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂、口服液、灌肠液、煎煮剂。
所述散剂由如下方法制备:
将上述的中药组合物使用药物粉碎机反复打碎、过80筛,制成细粉细粉,即得散剂;
所述煎煮剂制备方法:
将上述的中药组合物,按照1:20的料液比,加水浸泡,浸泡1.5小时,武火煮沸,文火煎煮20钟,过滤取滤汁;滤渣再次按照1:20的料液比,加水煮沸,文火煎煮20分钟,过滤取滤汁;合并滤汁即得煎煮剂;
所述灌肠液由如下方法制备:可由下列任一方法制备;
第一种制备方法,将散剂按照1:1的料液比,加入温水浸泡混匀后,加入助悬剂(如羧甲基纤维素钠)使药物处于悬浮状态,即得灌肠液;
第二种制备方法,将上述的中药组合物按照1:10的料液比,加水浸泡1.5小时,取出中药组合物放入榨汁机中,加入1倍量的蒸馏水,搅碎搅匀8min,用8层纱布过滤,得滤液放入榨汁机中,再加入1倍量的蒸馏水,搅碎搅匀4min,依上法过滤,得到的滤液配比成13.5mg/mL的溶液,即得灌肠液。
第三种制备方法,将上述的中药组合物,按照1:20的料液比,加水浸泡,浸泡1.5小时,武火煮沸,文火煎煮20分钟,过滤取滤汁;滤渣再次按照1:20的料液比,加水煮沸,文火煎煮20分钟,过滤取滤汁;合并滤汁武火浓缩至滤汁体积的1/30。
一种预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的中药组合物的应用,其特征在于:用于制备治疗胃十二指肠溃疡药物、或治疗急慢性胃炎药物、或治疗炎性肠病药物、或预防溃疡性结肠炎癌变药物、或治疗溃疡性结肠炎癌变药物中的应用。
实施例2
一种预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的中药组合物,其特征在于:由壁虎、地龙、鼠妇虫、蜂蛹四种药材制成。
所述预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的中药组合物,由如下重量份的原料药制成:壁虎120份、地龙120份、鼠妇虫120份、蜂蛹60份。
一种预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的药物制剂,由壁虎120份、地龙120份、鼠妇虫120份、蜂蛹60份制成。
所述药物制剂的剂型包括丸剂、胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂、口服液、灌肠液、煎煮剂。
所述散剂由如下方法制备:
将上述的中药组合物使用药物粉碎机反复打碎、过100筛,制成细粉细粉,即得散剂;
所述煎煮剂制备方法:
将上述的中药组合物,按照1:25的料液比,加水浸泡,浸泡2小时,武火煮沸,文火煎煮30分钟,过滤取滤汁;滤渣再次按照1:25的料液比,加水煮沸,文火煎煮30分钟,过滤取滤汁;合并滤汁即得煎煮剂;
所述灌肠液由如下方法制备:可由下列任一方法制备;
第一种制备方法,将散剂按照1:1.5的料液比,加入温水浸泡混匀后,加入助悬剂(如羧甲基纤维素钠)使药物处于悬浮状态,即得灌肠液;
第二种制备方法,将上述的中药组合物按照1:12.5的料液比,加水浸泡2小时,取出中药组合物放入榨汁机中,加入1倍量的蒸馏水,搅碎搅匀10min,用8层纱布过滤,得滤液放入榨汁机中,再加入1倍量的蒸馏水,搅碎搅匀5min,依上法过滤,得到的滤液配比成13.5mg/mL的溶液,即得灌肠液;
第三种制备方法,将上述的中药组合物,按照1:25的料液比,加水浸泡,浸泡2小时,武火煮沸,文火煎煮30分钟,过滤取滤汁;滤渣再次按照1:25的料液比,加水煮沸,文火煎煮30分钟,过滤取滤汁;合并滤汁武火浓缩至滤汁体积的1/45。
一种预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的中药组合物的应用,其特征在于:用于制备治疗胃十二指肠溃疡药物、或治疗急慢性胃炎药物、或治疗炎性肠病药物、或预防溃疡性结肠炎癌变药物、或治疗溃疡性结肠炎癌变药物中的应用。
实施例3
一种预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的中药组合物,其特征在于:由壁虎、地龙、鼠妇虫、蜂蛹四种药材制成。
所述预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的中药组合物,由如下重量份的原料药制成:壁虎210份、地龙210份、鼠妇虫210份、蜂蛹150份。
一种预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的药物制剂,由壁虎210份、地龙210份、鼠妇虫210份、蜂蛹150份制成。
所述药物制剂的剂型包括丸剂、胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂、口服液、灌肠液、煎煮剂。
所述散剂由如下方法制备:
将上述的中药组合物使用药物粉碎机反复打碎、过120筛,制成细粉细粉,即得散剂;
所述煎煮剂制备方法:
将上述的中药组合物,按照1:30的料液比,加水浸泡,浸泡2.5小时,武火煮沸,文火煎煮约40钟,过滤取滤汁;滤渣再次按照1:30的料液比,加水煮沸,文火煎煮40分钟,过滤取滤汁;合并滤汁即得煎煮剂;
所述灌肠液由如下方法制备:可由下列任一方法制备;
第一种制备方法,将散剂按照1:2的料液比,加入温水浸泡混匀后,加入助悬剂(如羧甲基纤维素钠)使药物处于悬浮状态,即得灌肠液;
第二种制备方法,将上述的中药组合物按照1:15的料液比,加水浸泡2.5小时,取出中药组合物放入榨汁机中,加入2倍量的蒸馏水,搅碎搅匀10min,用10层纱布过滤,得滤液放入榨汁机中,再加入2倍量的蒸馏水,搅碎搅匀6min,依上法过滤,得到的滤液配比成13.5mg/mL的溶液,即得灌肠液。
第三种制备方法,将上述的中药组合物,按照1:30的料液比,加水浸泡,浸泡2.5小时,武火煮沸,文火煎煮约40钟,过滤取滤汁;滤渣再次按照1:30的料液比,加水煮沸,文火煎煮40分钟,过滤取滤汁;合并滤汁武火浓缩至滤汁体积的1/60。
一种预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的中药组合物的应用,其特征在于:用于制备治疗胃十二指肠溃疡药物、或治疗急慢性胃炎药物、或治疗炎性肠病药物、或预防溃疡性结肠炎癌变药物、或治疗溃疡性结肠炎癌变药物中的应用。
实施例4
一种预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的中药组合物,其特征在于:由壁虎、地龙、鼠妇虫、蜂蛹四种药材制成。
所述预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的中药组合物,由如下重量份的原料药制成:壁虎60份、地龙60份、鼠妇虫60份、蜂蛹30份。
一种预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的药物制剂,由壁虎60份、地龙60份、鼠妇虫60份、蜂蛹30份制成。
所述药物制剂的剂型包括丸剂、胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂、口服液、灌肠液、煎煮剂。
所述散剂由如下方法制备:
将上述的中药组合物使用药物粉碎机反复打碎、过80筛,制成细粉细粉,即得散剂;
所述煎煮剂制备方法:
将上述的中药组合物,按照1:20的料液比,加水浸泡,浸泡1.5小时,武火煮沸,文火煎煮20钟,过滤取滤汁;滤渣再次按照1:20的料液比,加水煮沸,文火煎煮20分钟,过滤取滤汁;合并滤汁即得煎煮剂;
所述灌肠液由如下方法制备:可由下列任一方法制备;
第一种制备方法,将散剂按照1:1的料液比,加入温水浸泡混匀后,加入助悬剂(如羧甲基纤维素钠)使药物处于悬浮状态,即得灌肠液;
第二种制备方法,将上述的中药组合物按照1:10的料液比,加水浸泡1.5小时,取出中药组合物放入榨汁机中,加入1倍量的蒸馏水,搅碎搅匀8min,用8层纱布过滤,得滤液放入榨汁机中,再加入1倍量的蒸馏水,搅碎搅匀4min,依上法过滤,得到的滤液配比成13.5mg/mL的溶液,即得灌肠液。
第三种制备方法,将上述的中药组合物,按照1:20的料液比,加水浸泡,浸泡1.5小时,武火煮沸,文火煎煮20分钟,过滤取滤汁;滤渣再次按照1:20的料液比,加水煮沸,文火煎煮20分钟,过滤取滤汁;合并滤汁武火浓缩至滤汁体积的1/30。
一种预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的中药组合物的应用,其特征在于:用于制备治疗胃十二指肠溃疡药物、或治疗急慢性胃炎药物、或治疗炎性肠病药物、或预防溃疡性结肠炎癌变药物、或治疗溃疡性结肠炎癌变药物中的应用。
实施例5
一种预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的中药组合物,其特征在于:由壁虎、地龙、鼠妇虫、蜂蛹四种药材制成。
所述预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的中药组合物,由如下重量份的原料药制成:壁虎180份、地龙180份、鼠妇虫180份、蜂蛹90份。
一种预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的药物制剂,由壁虎180份、地龙180份、鼠妇虫180份、蜂蛹90份制成。
所述药物制剂的剂型包括丸剂、胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂、口服液、灌肠液、煎煮剂。
所述散剂由如下方法制备:
将上述的中药组合物使用药物粉碎机反复打碎、过120筛,制成细粉细粉,即得散剂;
所述煎煮剂制备方法:
将上述的中药组合物,按照1:30的料液比,加水浸泡,浸泡2.5小时,武火煮沸,文火煎煮约40钟,过滤取滤汁;滤渣再次按照1:30的料液比,加水煮沸,文火煎煮40分钟,过滤取滤汁;合并滤汁即得煎煮剂;
所述灌肠液由如下方法制备:可由下列任一方法制备;
第一种制备方法,将散剂按照1:2的料液比,加入温水浸泡混匀后,加入助悬剂(如羧甲基纤维素钠)使药物处于悬浮状态,即得灌肠液;
第二种制备方法,将上述的中药组合物按照1:15的料液比,加水浸泡2.5小时,取出中药组合物放入榨汁机中,加入2倍量的蒸馏水,搅碎搅匀10min,用10层纱布过滤,得滤液放入榨汁机中,再加入2倍量的蒸馏水,搅碎搅匀6min,依上法过滤,得到的滤液配比成13.5mg/mL的溶液,即得灌肠液。
第三种制备方法,将上述的中药组合物,按照1:30的料液比,加水浸泡,浸泡2.5小时,武火煮沸,文火煎煮约40钟,过滤取滤汁;滤渣再次按照1:30的料液比,加水煮沸,文火煎煮40分钟,过滤取滤汁;合并滤汁武火浓缩至滤汁体积的1/60。
一种预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的中药组合物的应用,其特征在于:用于制备治疗胃十二指肠溃疡药物、或治疗急慢性胃炎药物、或治疗炎性肠病药物、或预防溃疡性结肠炎癌变药物、或治疗溃疡性结肠炎癌变药物中的应用。
实施例6
一种预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的中药组合物,其特征在于:由壁虎、地龙、鼠妇虫、蜂蛹四种药材制成。
所述预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的中药组合物,由如下重量份的原料药制成:壁虎10份、地龙10份、鼠妇虫10份、蜂房5份。
一种预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的药物制剂,由壁虎10份、地龙10份、鼠妇虫10份、蜂房5份制成。
所述药物制剂的剂型包括丸剂、胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂、口服液、灌肠液、煎煮剂。
所述散剂由如下方法制备:
将上述的中药组合物使用药物粉碎机反复打碎、过80筛,制成细粉细粉,即得散剂;
所述煎煮剂制备方法:
将上述的中药组合物,按照1:20的料液比,加水浸泡,浸泡1.5小时,武火煮沸,文火煎煮20分钟,过滤取滤汁;滤渣再次按照1:20的料液比,加水煮沸,文火煎煮20分钟,过滤取滤汁;合并滤汁即得煎煮剂;
所述灌肠液由如下方法制备:可由下列任一方法制备;
第一种制备方法,将散剂按照1:1的料液比,加入温水浸泡混匀后,加入助悬剂(如羧甲基纤维素钠)使药物处于悬浮状态,即得灌肠液;
第二种制备方法,将上述的中药组合物按照1:10的料液比,加水浸泡1.5小时,取出中药组合物放入榨汁机中,加入1倍量的蒸馏水,搅碎搅匀8min,用8层纱布过滤,得滤液放入榨汁机中,再加入1倍量的蒸馏水,搅碎搅匀4min,依上法过滤,得到的滤液配比成13.5mg/mL的溶液,即得灌肠液。
第三种制备方法,将上述的中药组合物,按照1:20的料液比,加水浸泡,浸泡1.5小时,武火煮沸,文火煎煮20分钟,过滤取滤汁;滤渣再次按照1:20的料液比,加水煮沸,文火煎煮20分钟,过滤取滤汁;合并滤汁武火浓缩至滤汁体积的1/30。
一种预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的中药组合物的应用,其特征在于:用于制备治疗胃十二指肠溃疡药物、或治疗急慢性胃炎药物、或治疗炎性肠病药物、或预防溃疡性结肠炎癌变药物、或治疗溃疡性结肠炎癌变药物中的应用。
实施例7
一种预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的中药组合物,其特征在于:由壁虎、地龙、鼠妇虫、蜂蛹四种药材制成。
所述预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的中药组合物,由如下重量份的原料药制成:壁虎120份、地龙120份、鼠妇虫120份、蜂房60份。
一种预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的药物制剂,由壁虎120份、地龙120份、鼠妇虫120份、蜂房60份制成。
所述药物制剂的剂型包括丸剂、胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂、口服液、灌肠液、煎煮剂。
所述散剂由如下方法制备:
将上述的中药组合物使用药物粉碎机反复打碎、过100筛,制成细粉细粉,即得散剂;
所述煎煮剂制备方法:
将上述的中药组合物,按照1:25的料液比,加水浸泡,浸泡2小时,武火煮沸,文火煎煮30分钟,过滤取滤汁;滤渣再次按照1:25的料液比,加水煮沸,文火煎煮30分钟,过滤取滤汁;合并滤汁即得煎煮剂;
所述灌肠液由如下方法制备:可由下列任一方法制备;
第一种制备方法,将散剂按照1:1.5的料液比,加入温水浸泡混匀后,加入助悬剂(如羧甲基纤维素钠)使药物处于悬浮状态,即得灌肠液;
第二种制备方法,将上述的中药组合物按照1:12.5的料液比,加水浸泡2小时,取出中药组合物放入榨汁机中,加入1倍量的蒸馏水,搅碎搅匀10min,用8层纱布过滤,得滤液放入榨汁机中,再加入1倍量的蒸馏水,搅碎搅匀5min,依上法过滤,得到的滤液配比成13.5mg/mL的溶液,即得灌肠液;
第三种制备方法,将上述的中药组合物,按照1:25的料液比,加水浸泡,浸泡2小时,武火煮沸,文火煎煮30分钟,过滤取滤汁;滤渣再次按照1:25的料液比,加水煮沸,文火煎煮30分钟,过滤取滤汁;合并滤汁武火浓缩至滤汁体积的1/45。
一种预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的中药组合物的应用,其特征在于:用于制备治疗胃十二指肠溃疡药物、或治疗急慢性胃炎药物、或治疗炎性肠病药物、或预防溃疡性结肠炎癌变药物、或治疗溃疡性结肠炎癌变药物中的应用。
实施例8
一种预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的中药组合物,其特征在于:由壁虎、地龙、鼠妇虫、蜂蛹四种药材制成。
所述预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的中药组合物,由如下重量份的原料药制成:壁虎210份、地龙210份、鼠妇虫210份、蜂房150份。
一种预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的药物制剂,由壁虎210份、地龙210份、鼠妇虫210份、蜂房150份制成。
所述药物制剂的剂型包括丸剂、胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂、口服液、灌肠液、煎煮剂。
所述散剂由如下方法制备:
将上述的中药组合物使用药物粉碎机反复打碎、过120筛,制成细粉细粉,即得散剂;
所述煎煮剂制备方法:
将上述的中药组合物,按照1:30的料液比,加水浸泡,浸泡2.5小时,武火煮沸,文火煎煮约40钟,过滤取滤汁;滤渣再次按照1:30的料液比,加水煮沸,文火煎煮40分钟,过滤取滤汁;合并滤汁即得煎煮剂;
所述灌肠液由如下方法制备:可由下列任一方法制备;
第一种制备方法,将散剂按照1:2的料液比,加入温水浸泡混匀后,加入助悬剂(如羧甲基纤维素钠)使药物处于悬浮状态,即得灌肠液;
第二种制备方法,将上述的中药组合物按照1:15的料液比,加水浸泡2.5小时,取出中药组合物放入榨汁机中,加入2倍量的蒸馏水,搅碎搅匀10min,用10层纱布过滤,得滤液放入榨汁机中,再加入2倍量的蒸馏水,搅碎搅匀6min,依上法过滤,得到的滤液配比成13.5mg/mL的溶液,即得灌肠液。
第三种制备方法,将上述的中药组合物,按照1:30的料液比,加水浸泡,浸泡2.5小时,武火煮沸,文火煎煮约40钟,过滤取滤汁;滤渣再次按照1:30的料液比,加水煮沸,文火煎煮40分钟,过滤取滤汁;合并滤汁武火浓缩至滤汁体积的1/60。
一种预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的中药组合物的应用,其特征在于:用于制备治疗胃十二指肠溃疡药物、或治疗急慢性胃炎药物、或治疗炎性肠病药物、或预防溃疡性结肠炎癌变药物、或治疗溃疡性结肠炎癌变药物中的应用。
实施例9
一种预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的中药组合物,其特征在于:由壁虎、地龙、鼠妇虫、蜂蛹四种药材制成。
所述预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的中药组合物,由如下重量份的原料药制成:壁虎60份、地龙60份、鼠妇虫60份、蜂房30份。
一种预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的药物制剂,由壁虎60份、地龙60份、鼠妇虫60份、蜂房30份制成。
所述药物制剂的剂型包括丸剂、胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂、口服液、灌肠液、煎煮剂。
所述散剂由如下方法制备:
将上述的中药组合物使用药物粉碎机反复打碎、过80筛,制成细粉细粉,即得散剂;
所述煎煮剂制备方法:
将上述的中药组合物,按照1:20的料液比,加水浸泡,浸泡1.5小时,武火煮沸,文火煎煮20分钟,过滤取滤汁;滤渣再次按照1:20的料液比,加水煮沸,文火煎煮20分钟,过滤取滤汁;合并滤汁即得煎煮剂;
所述灌肠液由如下方法制备:可由下列任一方法制备;
第一种制备方法,将散剂按照1:1的料液比,加入温水浸泡混匀后,加入助悬剂(如羧甲基纤维素钠)使药物处于悬浮状态,即得灌肠液;
第二种制备方法,将上述的中药组合物按照1:10的料液比,加水浸泡1.5小时,取出中药组合物放入榨汁机中,加入1倍量的蒸馏水,搅碎搅匀8min,用8层纱布过滤,得滤液放入榨汁机中,再加入1倍量的蒸馏水,搅碎搅匀4min,依上法过滤,得到的滤液配比成13.5mg/mL的溶液,即得灌肠液。
第三种制备方法,将上述的中药组合物,按照1:20的料液比,加水浸泡,浸泡1.5小时,武火煮沸,文火煎煮20分钟,过滤取滤汁;滤渣再次按照1:20的料液比,加水煮沸,文火煎煮20分钟,过滤取滤汁;合并滤汁武火浓缩至滤汁体积的1/30。
一种预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的中药组合物的应用,其特征在于:用于制备治疗胃十二指肠溃疡药物、或治疗急慢性胃炎药物、或治疗炎性肠病药物、或预防溃疡性结肠炎癌变药物、或治疗溃疡性结肠炎癌变药物中的应用。
实施例6
一种预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的中药组合物,其特征在于:由壁虎、地龙、鼠妇虫、蜂蛹四种药材制成。
所述预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的中药组合物,由如下重量份的原料药制成:壁虎180份、地龙180份、鼠妇虫180份、蜂房90份。
一种预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的药物制剂,由壁虎180份、地龙180份、鼠妇虫180份、蜂房90份制成。
所述药物制剂的剂型包括丸剂、胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂、口服液、灌肠液、煎煮剂。
所述散剂由如下方法制备:
将上述的中药组合物使用药物粉碎机反复打碎、过120筛,制成细粉细粉,即得散剂;
所述煎煮剂制备方法:
将上述的中药组合物,按照1:30的料液比,加水浸泡,浸泡2.5小时,武火煮沸,文火煎煮约40钟,过滤取滤汁;滤渣再次按照1:30的料液比,加水煮沸,文火煎煮40分钟,过滤取滤汁;合并滤汁即得煎煮剂;
所述灌肠液由如下方法制备:可由下列任一方法制备;
第一种制备方法,将散剂按照1:2的料液比,加入温水浸泡混匀后,加入助悬剂(如羧甲基纤维素钠)使药物处于悬浮状态,即得灌肠液;
第二种制备方法,将上述的中药组合物按照1:15的料液比,加水浸泡2.5小时,取出中药组合物放入榨汁机中,加入2倍量的蒸馏水,搅碎搅匀10min,用10层纱布过滤,得滤液放入榨汁机中,再加入2倍量的蒸馏水,搅碎搅匀6min,依上法过滤,得到的滤液配比成13.5mg/mL的溶液,即得灌肠液。
第三种制备方法,将上述的中药组合物,按照1:30的料液比,加水浸泡,浸泡2.5小时,武火煮沸,文火煎煮约40钟,过滤取滤汁;滤渣再次按照1:30的料液比,加水煮沸,文火煎煮40分钟,过滤取滤汁;合并滤汁武火浓缩至滤汁体积的1/60。
一种预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的中药组合物的应用,其特征在于:用于制备治疗胃十二指肠溃疡药物、或治疗急慢性胃炎药物、或治疗炎性肠病药物、或预防溃疡性结肠炎癌变药物、或治疗溃疡性结肠炎癌变药物中的应用。
为了证明未本发明的药效,开展以下动物实验:
动物研究内容
1.1主要实验仪器
仪器名称 生产厂家
分析天平 沙多利斯
倒置式生物显微镜 重庆光学仪器厂
超净工作台 上海阳光实验仪器有限公司
超低温冰箱 青岛海尔特种电器有限公司
高速冷冻离心机 赛默飞世尔科技有限公司
微量移液器 Gilson公司,德国
灌肠器、小鼠固定器 自制
冻存管 美国康宁公司
1.2主要实验试剂
实验药品与试剂:
(1)造模诱导剂:氧化偶氮甲烷AOM(分子量:74.08),低温保存,购自Sigma-Aldrich公司,货号:A5486,CAS号:25843-45-2,纯度≧98%。葡聚糖硫酸钠DSS(分子量:36000-50000)。白色粉末,购自于翊圣生物公司,货号:9011-18-1,批号:60316ES25。
(2)供试药品:中药干品壁虎、地龙、蜂蛹、蜂房、鼠妇虫均(购自长春-北京同仁堂,经鉴定为正品)。
(3)阳性对照药:美沙拉嗪(5-氨基水杨酸,分子量:153.13500),购自黑龙江中医药大学附属第一医院,白色至灰白色粉末,CAS号:89-57-6。康复新液(美洲大蠊干燥重提提取物),淡棕色液体,气微腥臭,味甜,100mL/瓶,符合国家药品标准WS3-B-3674-2000(Z)。
1.3实验动物
BALB/C小鼠60只(雄性,鼠龄5周左右,体重20±2g,SPF级),购自黑龙江中医药大学实验动物中心。
1.4药物制备
(1)AOM溶液制备:用无菌水溶解AOM配制10mg/mL的储存液,分装后放到-20℃保存,避免反复冻融。AOM在水或生理盐水中的稳定性好于塑料管。使用之前,融化分装母液并用无菌生理盐水1:10倍稀释。
(2)DSS溶液制备(2.5%DSS溶液):称取2.5gDSS溶于100mL无菌水,本溶液置于4℃可稳定保存1周,现配现用。
(3)还涎方1制备:按照实施例2中灌肠液的第二种方法制备。
(4)还涎方2制备:按照实施例7中灌肠液的第二种方法制备。
(5)美沙拉嗪与康复新液溶液制备:美沙拉嗪与蒸馏水配伍,用药浓度10mg/mL,康复新液与蒸馏水配伍,用药浓度7.5mg/mL。
2.实验方法
2.1.AOM/DSS诱导BALB/c小鼠溃疡性结肠炎癌变动物模型
实验前,将60只小鼠随机分成空白组、模型组、治疗组(还涎方1组、还涎方2组、美沙拉嗪组、康复新液组),每组10只,并用笼子编号法及尾部记号法标记小鼠,以适宜温度、湿度、光照周期条件下分笼适应性喂养1w,期间给予SPF级标准动物饲料及自由饮水(SPF级高压灭菌处理后饮用水)喂养。参考Neufert等建立AOM/DSS模型制备的标准方案:空白组继续给予SPF级标准动物饲料及自由饮水(高温消毒后)喂养。模型组、治疗组以AOM腹腔单次小鼠注射10mg/KgWt,1w后以2.5%DSS(分子量36000-50000)溶液连续饮用1w,继之以高温消毒后的饮用水连续喂养2w为第1周期;第二周期给予2.5%DSS溶液连续饮用1w,继之以高温消毒后的饮用水连续喂养2w。第3周期DSS给药重复以上步骤,完成小鼠溃疡性结肠炎癌变动物模型建立如下表1。
表1小鼠溃疡性结肠炎癌变动物模型建立
2.1.1.小鼠腹腔注射致癌剂AOM
计算所需AOM总量(按10mg/kg标准),解冻足够的AOM储存液。用生理盐水按AOM储存液:生理盐水=1:10比例制备AOM注射液。建模前每只小鼠称重,之后每日称重1次,空白组小鼠不做任何处理,模型组与治疗组按10mg/kg剂量(即0.1mL注射液/10g小鼠)给AOM注射液腹腔注射一次(注射方法:小鼠腹腔注射用1mL的注射器,配合4号针头,注射时右手持注射器,左手的小指和无名指抓住小鼠的尾巴,中指、食指、拇指指抓住小鼠的颈部,使小鼠的头部向下,身体后倾,充分暴露腹部,便于注射。同时,腹腔中的器官倒向胸部自然位移,防止注射器刺入时损伤大肠、小肠等器官。确定注射点,轻柔进针,防止刺伤腹部器官,导致腹腔出血及动物死亡。小鼠体重通常较轻,因此腹腔注射时针头可在腹部皮下穿行一小段距离,从腹部一侧进针,穿过腹中线后在腹部的另一侧进入腹腔,注射完药物后,缓缓拔出针头,并轻微旋转针头,防止漏液。
2.1.2.小鼠自由饮水致炎剂DSS
制备2.5%的DSS:将2.5g DSS溶于100mL灭菌水。空白组自由饮食饮水,每日更换饮水。喂药:除空白组外,其余各组每一笼的水瓶内加入够小鼠1d饮用的上述DSS溶液,每只小鼠每天5~10mL。每日更换新鲜2.5%DSS溶液,连续饮用7d后,加入灭菌水正常喂养小鼠14d,完成1周期,2-3每周期重复第一周期DSS给药及饮水。
2.2.还涎方保留灌肠干预溃疡性结肠炎癌变动物模型
从实验第二周期开始,治疗组开始灌肠给药,每组每只小鼠给予0.25mL/d灌肠治疗,其中,还涎方1组(灌肠;浓度13.5mg/mL)、还涎方2组(灌肠;浓度13.5mg/mL)、美沙拉嗪组(灌肠:浓度10mg/mL)、康复新液(灌肠;浓度7.5mg/mL)对照组,空白组(等量生理盐水灌肠),模型组(等量生理盐水灌肠)直至2周期后实验结束。如表2。
灌肠方法:将小鼠固放入固定装置中,取1mL一次性无菌注射器1支,拔下注射器针头,排空注射器内的空气,插管套头一端与注射器连接,抽取灌肠液。插管插头一端沾取石蜡油,润滑表面,把插管顺着小鼠肛门缓慢插入3-4cm,灌肠后用纱布包裹插管轻轻拔出。然后将小鼠固定装置固定于铁架台上,调节适当的高度,倒置小鼠保留灌肠30min。
表2小鼠溃疡性结肠炎癌变动物模型建立
3.实验标本的采集
3.1小鼠粪便标本的采集
(1)标本采集时间:5w末、8w末、11w末。
(2)粪便采集:分别对除空白组小鼠的每只小鼠进行取材。固定小鼠,将其尾部提起,用手轻轻按压小鼠下腹部,手机新鲜粪便于对应编号的带盖塑料管中,立即密封,将小管置于冰盒中保存,将所有样品置于-80℃低温冰箱中保存备用。
3.2小鼠结直肠标本的采集
(1)标本采集时间:采用随机数字表法分别在1、2周期结束时,每组各取3只小鼠处死,第3周期结束后处死所有动物。
(2)组织灌注固定:小鼠解剖前用水合氯醛进行腹腔注射麻醉,用药剂量计算:0.3-0.4mL/100g与10%体重的乘积。小鼠成功麻醉后将固定其四肢,沿肋弓下缘两侧剪开腹腔,从腹腔到横隔往上剪开胸腔,分暴露心脏,视野清晰,用1mL注射器针头,从心尖的左侧进针,插入针头三分之一,用止血钳固定针头,用另一止血钳扎住腹主动脉,剪破右心耳,打开静脉注射器开关。观察输液器管液体流动,从右心耳流出生理盐水(15-20mL)的颜色变白即可换4%多聚甲醛(25-30mL)灌流至小鼠四肢抽动、全身僵硬为止。
小鼠结直肠组织取材:待灌注成功后,充分暴露腹腔,迅速沿肠系膜或肛门寻找出结直肠,分离肛门至回盲部连接处,盲肠后端取1-2cm肠道为结肠,沿肛门剪下结直肠组织,测量结直肠长度,并观察组织整体形态及有无病变,判断病变程度及周围组织有无粘连。在培养皿中倒入生理盐水,将剪下的组织用培养皿中的生理盐水进行冲洗,去除肠管壁外的脂肪和血液,操作中保护结肠的完整性。
(4)结直肠组织固定:将结直肠组织置于改良Davidson’s固定液(将37%-40%的甲醛溶液、无水乙醇、冰醋酸和蒸馏水分别按照6:3:1:10的体积比例配制)中固定18h后转入10%中性福尔马林固定液中继续固定24小时。固定完毕后,用1xPBS缓冲液反复浸洗以冲掉残留的固定剂,以免固定剂形成沉淀,影响以后组织块的染色。之后将组织块置于1xPBS(pH7.2~7.4)/0.02%叠氮化钠中保存。
(5)结直肠组织石蜡切片的制作
洗涤与脱水:固定后的结直肠组织需除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀,用酒精多次浸洗,进行脱水。
透明:脱水后,将结直肠组织浸渍于纯酒精和异丁醇各半的混合液1小时后,再转入纯异丁醇中浸渍4℃冰箱过夜,次日室温下,将组织完全浸入正丁醇中3h。
浸蜡与包埋:将结直肠组织从正丁醇中移出后,滤纸吸干表面液体,放在60℃的石蜡和二甲苯的等量混合液中浸渍,再先后移入2个60℃的石蜡液中浸渍3h,浸蜡后的结直肠组织材料块放在装有蜡液的容器中。
切片:包埋好的蜡块用刀片修成规整的四棱台,以少许热蜡液将其底部迅速贴附于小木块上,夹在轮转式切片机的蜡块钳内,使蜡块切面与切片刀刃平行,旋紧。切片厚度为4-7微米,切出一片接一片的蜡带,用毛笔轻托轻放在纸上。
贴片与烤片:首先在洁净的载玻片上涂抹薄层蛋白甘油,再将一定长度蜡带(连续切片)或用刀片断开成单个蜡片于温水(45℃左右)中展平后,捞至玻片上铺正,最后用滤纸吸除多余水分,将载玻片放入45℃温箱中干燥。
注意:为了减少组织材料的急剧收缩,洗涤应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行,通常从30%或50%酒精开始,经70%、85%、95%直至纯酒精(无水乙醇),每次时间为1h,如不能及时进行各级脱水,组织则放在70%酒精中保存,因高浓度酒精易使组织收缩硬化,不宜处理过久。
3.3HE染色
(1)试剂配制:0.5~1%的伊红酒精溶液:称取伊红Y0.5~1g,加少量蒸馏水溶解后,再滴加冰醋酸直至浆糊状。以滤纸过滤,将滤渣在烘箱中烤干后,以95%酒精100毫升溶解。苏木素染液3000mL(苏木精6g、无水乙醇100mL、硫酸铝钾150g、蒸馏水2000mL、碘酸钠1.2g、冰醋酸120mL、甘油900mL)将苏木素溶于无水乙醇,再将硫酸铝钾溶于蒸馏水,溶解后将甘油倾入一起混合,最后加入冰醋酸和碘酸钠。1%盐酸酒精分化液:将1mL浓盐酸加入99mL70%酒精中。
(2)染色流程:二甲苯(Ⅰ)15min→二甲苯:无水乙醇=1:12min→100%乙醇(Ⅰ)→5min100%乙醇(Ⅱ)5min→80%乙醇5min→蒸馏水5min→苏木精液染色5min→流水稍洗去苏木精液1-3s→1%盐酸乙醇1-3s→稍水洗10-30s→蒸馏水过洗1-2s→0.5%伊红液染色1-3min→蒸馏水稍洗1-2s→80%乙醇稍洗1-2s→95%乙醇(Ⅰ)2-3s→95%乙醇(Ⅱ)3-5s→无水乙醇5-10min→石炭酸二甲苯5-10min→二甲苯(Ⅰ)2min→二甲苯(Ⅱ)2min→二甲苯(Ⅲ)2min→中性树胶封固。
3.4结直肠石蜡切片免疫组化染色(选用SP试剂盒)方法如图1所示。
3.5统计学分析
4.实验观察指标
4.1便隐血试验
硫酸甲氨基酚法进行大便隐血试验
试剂:①10g/l硫酸甲氨基酚乙酸溶液:称取硫酸甲氨基酚1g,溶于40mL蒸馏水中,加冰乙酸30mL溶解,蒸馏水加至100mL混匀。放入棕色瓶中避光保存,如有变色则应重新配制。②3%过氧化氢溶液。
方法:取少许粪便涂于玻片中央,滴加10g/l硫酸甲氨基酚乙酸溶液3滴,及3%过氧化氢溶液3滴混匀,立即观察结果,如下表3。
表3便隐血表达评价
4.2结肠炎症反应情况
结肠长度及结肠质量变化:每周期给药(或生理盐水)结束,各组分别处死3只小鼠。第3周期治疗结束后,继续治疗7天,处死剩余全部小鼠。处死小鼠前称取体质量,并取全段结肠沿肠系膜剖开,生理盐水洗净,测量全结肠长度,滤纸吸干后,用BP221S微量称重仪(德国造)测结肠湿质量,按下式计算肠重指数:
4.3组织学损伤的的评估
浓度1%戊巴比妥1mL/(kg·BW)腹腔注射麻醉,眼球取血,离心,取血清。剖腹,观察结肠外观取肛门至回盲部的结肠,并测量结肠的长度。沿肠系膜边缘纵行剖开,在解剖镜下观察结肠大体形态。每只小鼠于有严重炎症或溃疡处取标本2cm的结肠组织置于10%中福尔马林浸泡固定,24h后常规石腊包埋、切片(4um),HE染色,观察组织学改变并按表4评分。组织学损伤程度用炎症、病变深度、陷窝破坏评分与病变范围评分的乘积表示。
表4结肠损伤评分表
4.4结肠组织大体形态损伤指数
将小鼠结肠组织切成6μm厚的冰冻切片,常规HE染色,镜下观察黏膜炎症情况,包括黏膜的完整性,黏膜内炎症细胞的浸润,隐窝结构的改变程度和炎症范围。结肠病灶病理组织肉眼评分标准如下:结肠病变肉眼评分标准:如下表5。
表5结肠组织大体形态损伤指数(colon macroscopic damage index,CMDI)评价
4.5病理学组织检测
结肠病灶病理组织显微镜检查并评分,评分标准如下表6;
表6结肠病灶病理组织显微镜检查评分标准
4.6免疫组化检测
在倒置生物显微镜下观察结果,并用高分辨率数码相机拍照。采用Vet.3.00程序软件进行图像数字采集及进行平均光密度半定量结果分析。调节系统去除本底色,测量特异染色的平均光密度。在显微镜下高倍(×100)视野观察细胞着色情况。p53主要染色部位在细胞核或细胞浆,主要染色成棕黄或棕褐色,cox-2主要染色部位在细胞浆,主要染色成棕黄或棕褐色,bcl-2主要染色部位在细胞浆,少数细胞膜着色,主要染色成棕褐色。
将免疫组化封片后组织切片放在光镜下,调节好视野及光线,随机选取5个高倍镜视野(每个视野细胞数不小于300个细胞)观察结肠组织p53、cox-2、bcl-2。
检测结果并评分:见表7-8。
表7细胞染色阳性率计分
表8染色强度计分
最后用染色强度与细胞阳性率评分的乘积进行总分评分。
5结果
5.1小鼠一般情况
实验进行第1周期,空白组小鼠精神状况良好,反应灵敏,毛色有光泽,饮食可、粪便呈棕黑色麦粒状软便,无稀便、血便、黏液便等,体重随喂养时间正常增加。模型组与治疗组喂养2.5%DSS溶液3-5d后出现出现松散样粪便、体重减轻,精神不振,毛色暗淡、脱毛、食欲减退等症状,5-7d时体重明显下降,大便呈细条状稀便,肉眼可见血便。小鼠自由饮水2w后,精神状态、饮食情况略有恢复,仍可见稀便、血便。
实验进行第2周期,空白组小鼠状态良好,喂养2.5%DSS溶液4-5d后模型组小鼠精神萎靡,活动减少、饮食欠佳,体重明显下降,血便、黏液便症状加重。治疗组多数小鼠症状减轻,精神改善,进食量增加。同比康复新液组,还涎方1组、还涎方2组、美沙拉嗪组体重较前明显增加,血便次数减少,程度减轻,无明显黏液血便等症状。
实验进行第3周期,空白组小鼠状态良好,喂养2.5%DSS溶液7d后,模型组小鼠精神萎靡、反应迟钝、饮食差,体重骤降,便稀、便血次数增多,程度加重,有粘液样便,死亡2只。治疗组多数小鼠症状好转,体重均高于模型组,且较入组前有所升高,实验过程中每组小鼠每周期体重均数的变化比较,空白组>还涎方1组>还涎方2组>美沙拉嗪灌肠液>康复新液>模型组。其中还涎方1组与还涎方2组小鼠精神活动、饮食均良好,血便次数明显减少,无明显黏液血便等症状。实验过程中每组小鼠每周期体重均数的变化如表9所示。
5.2小鼠便隐血情况
小鼠便隐血情况实验结果如表10所示,Fisher确切概率法显示:各组之间的阳性率存在差异。治疗后,还涎方组小鼠便隐血情况明显改善,具有统计学意义(P<0.01)。
表10小鼠便隐血情况
5.3小鼠结肠炎症反应情况
小鼠结肠长度比较,空白组>还涎方1组>还涎方2组>美沙拉嗪组>康复新液组>模型组;结肠湿质量比较,空白组<还涎方1组<还涎方2组<美沙拉嗪组<康复新液组<模型组,差异具有统计学意义,见表11、13,治疗组间通过LSD-t法进行两两比较,差异具有统计学意义,见表12、14;
表11小鼠结肠长度
方差分析结果显示:各组之间的结肠长度差异具有统计学意义(F=58.634,P<0.01)。
表12LSD-t法进行两两比较
表13小鼠结肠湿质量
方差分析的结果显示:各组之间的结肠湿质量差异均具有统计学意义(F=43.457,P<0.01)。
表14LSD-t法进行两两比较
小鼠肠重指数=结肠长度(cm)/结肠湿质量(g)*100%,如下表15-16。
表15小鼠肠重指数
方差结果显示:各组之间的肠重指数差异具有统计学意义(F=89.172,P<0.001)。
表16LSD-t法进行两两比较
5.4组织学损伤评估
实验第3周期结束后,处死全部剩余小鼠(第3周期造模期间,模型组死亡2只,发现后立即进行解剖)后观察,可见空白组结肠黏膜光滑,血管纹理清晰,未见充血、水肿、溃疡等变化,肠腔内大便性状正常,脾脏鲜红,大小正常。模型组肠壁增厚,血管纹理不清,结肠黏膜苍白,肠壁有明显充血、水肿改变,具有凹凸不平感,部分小鼠结肠周围出现粘连现象,不易与其他组织分开,同时肠壁内部可见少量散在微小隆起,肠腔内大便不成形,粗细不等,偶伴有黄白色黏液。各治疗组以上症状较模型组均有改善,还涎方1组及还涎方2组小鼠无明显肠壁粘连、血管不清现象,仅小部分小鼠肠壁存在轻度充血、水肿及肠壁粘连等现象;美沙拉嗪组小鼠结肠稍欠光滑,血管纹理增粗,肠腔内大便软;康复新液组结肠表面欠光滑,有中-重度充血、水肿,大便松散,无黄白色黏液。
各组小鼠组织学损伤评分如表17所示。
表17组织学损伤评分
a.模型组与空白组比较P<0.01;b.治疗组与模型组比较P<0.05
5.5镜下病理组织学观察
各组小鼠处死后取肉眼见病变严重处组织行HE染色,高倍显微镜(HE×100)下观察病理切片,可见空白组黏膜上皮完整,腺体排列整齐,结构完整,无炎性细胞浸润、充血、水肿、溃疡等改变,为正常结肠黏膜。模型组黏膜上皮脱落,腺体大小不等,排列紊乱,开口较大,或呈倒三角形,组织间隙可见少量的中性粒细胞等炎症细胞浸润,部分腺体出现异常增生细胞,极性消失,大小不等,形态多样,核大深染,核质比例增加,核分裂相增多,伴有多处浅表及深溃疡形成,呈现慢性炎症改变伴轻-中度异型增生表现,局灶呈重度异型增生。还涎方1组与还涎方2组,黏膜较完整,腺体排列较整齐,少量炎性细胞浸润,无明显溃疡形成,其中还涎方1组优于还涎方2组,差异无统计学意义(P>0.05)。美沙拉嗪组结肠黏膜明显水肿,伴有淋巴细胞浸润,多数小鼠无明显溃疡形成。康复新液组有炎性细胞浸润,多数伴有浅表溃疡形成,少部分有深溃疡形成,局灶呈轻-中度异型增生表现。还涎方1组、还涎方2组与美沙拉嗪组对比,无统计学差异(P>0.05)。还涎方1组、还涎方2组较康复新液组有明显改善(P<0.01)。各治疗组中,还涎方1组、还涎方2组、美沙拉嗪组、较模型组均有明显改善(P<0.01),康复新液组较模型组有改善(P<0.05)。高倍显微镜下观察病理切片图见图2(HEx100)。评分数据比较见表18-21。
表18肉眼观察评分(评分标准见4.4)
结果显示:各组之间的肉眼差异具有统计学意义(F=124.933,P<0.001)
表19LSD-t法进行两两比较
表20镜下观察评分(评分标准见4.5)
结果显示:各组之间的镜下差异具有统计学意义(F=129.427,P<0.01)。
还涎方1组、还涎方2组与美沙拉嗪组对比,无统计学差异(P>0.05)。还涎方1组、还涎方2组与康复新液组有统计学差异(P<0.05)。各治疗组中,还涎方1组、还涎方2组、美沙拉嗪组、较模型组均有明显改善(P<0.01),康复新液组较模型组有改善(P<0.05)。
表21LSD-t法进行两两比较
5.6免疫组化检测结果
5.6.1结肠组织p53表达情况
p53基因属于抑癌基因,该基因编码一种分子量为53kDa的蛋白质,命名为p53。p53基因在正常情况下对细胞分裂起着减慢或监视的作用。p53基因突变后,由于其空间构象发生改变,失去了对细胞生长、凋亡和DNA修复的调控作用,p53基因由抑癌基因转变为癌基因。因此,p53基因的失活对肿瘤形成具有重要作用。在免疫组化染色中,p53主要染色部位在细胞核或细胞浆,主要染色成棕黄色或棕褐色。实验组动物标本中p53阳性率分别为:空白组3.5%、还涎方1组8.3%、还涎方2组9.6%、美沙拉嗪灌肠液组19.7%、康复新液组49.3%、模型组75%。p53在正常结肠黏膜组织中呈低表达,在还涎方组与美沙拉嗪灌肠液组小鼠中的表达与空白组较为接近。模型组随着病变加重,蛋白表达的阳性细胞也随之增加,且阳性细胞在病变组织中呈散在分布,着色增强。各组之间p53表达的差别具有显著的统计学意义(P<0.01);还涎方1组、还涎方2组、美沙拉嗪组、康复新液组均低于模型组;同时各组治疗组相比较,还涎方1组、还涎方2组的阳性表达低于美沙拉嗪组及康复新液组,差别均具有显著统计学意义(P<0.01),说明还涎方具有预防慢性溃疡性结肠炎癌变的作用。见表22-23,图3。
表22各组小鼠结肠组织p53免疫组化评分
结果显示:各组之间的p53表达差异具有统计学意义(F=155.859,P<0.01)。
表23LSD-t法进行两两比较
5.6.2结肠组织bcl-2表达情况
bcl-2蛋白与组织炎症和癌变均密切相关。在正常组织中bcl-2表达率通常很低,在炎症相关癌变发展过程表达升高,参与从炎症、异型增生到癌症发生的过程。在免疫组化染色中,bcl-2主要染色部位在细胞浆,少数细胞膜着色,主要染色成棕褐色。取各组小鼠结肠组织后经bcl-2免疫组化检测,结果显示空白组bcl-2表达多为阴性或低表达;与空白组相比,模型组染色后组织细胞中bcl-2显色较深,表达较多,两者有显著差异(P<0.01);与空白组相比,还涎方1组、还涎方2组、美沙拉嗪组、康复新液组表达均有升高(P<0.05),升高程度康复新液>美沙拉嗪灌肠液>还涎方2组>还涎方1组,单均低于模型组。实验结果见表24-25,图4。
表24各组小鼠结肠组织bcl-2免疫组化评分
结果显示:各组之间的bcl-2表达差异具有统计学意义(F=124.377,P<0.01)。
表25LSD-t法进行两两比较
5.6.3结肠组织cox-2表达情况
cox-2水平与炎癌转化密切相关。其在正常组织中散在分布,在从炎症、异型增生到炎症相关癌变发展过程中表达率逐渐上升。cox-2的主要染色部位在细胞浆,主要染色成棕黄或棕褐色。取各组小鼠结肠组织后,经cox-2免疫组化染色,结果显示空白组cox-2较少,细胞着色较浅;与空白组相比,模型组cox-2显色明显加深,表达量明显增多(P<0.01);与空白组相比,各治疗组cox-2表达均有不同程度升高,其中还涎方1组、还涎方2组与美沙拉嗪组相近,明显低于康复新液组,有显著统计学差异(P<0.01),各治疗组表达均低于模型组。实验结果见表26-27,图5。
表26各组小鼠结肠组织cox-2免疫组化评分
结果显示:各组之间的cox-2表达差异具有统计学意义(F=105.827,P<0.01)。
表27LSD-t法进行两两比较
6、总结
(1)体重变化实验结果:第三周期每组小鼠每周期体重均数的变化比较,空白组>还涎方1组>还涎方2组>美沙拉嗪灌肠液>康复新液>模型组。其中还涎方1组与还涎方2组小鼠精神活动、饮食均良好,血便次数明显减少,无明显黏液血便等症状。
(2)小鼠便隐血情况实验结果:各组之间的便隐血阳性率存在差异。治疗后,还涎方组小鼠便隐血情况明显改善,具有显著统计学意义(P<0.01)。
(3)小鼠结肠长度比较,空白组>还涎方1组>还涎方2组>美沙拉嗪组>康复新液组>模型组;结肠湿质量比较,空白组<还涎方1组<还涎方2组<美沙拉嗪组<康复新液组<模型组,差异有统计学意义。
(4)组织学损伤评估结果:各治疗组较模型组均有改善。其中还涎方1组及还涎方2组小鼠小鼠无明显肠壁粘连、血管不清现象,仅小部分小鼠肠壁存在充血、水肿,肠壁粘连等现象;美沙拉嗪组小鼠结肠稍欠光滑,血管纹理增粗,肠腔内大便软;康复新液组结肠表面欠光滑,有中-重度充血、水肿,大便松散,无黄白色黏液。
(5)镜下病理组织学观察结果:还涎方1组与还涎方2组,黏膜较完整,腺体排列较整齐,少量炎性细胞浸润,无明显溃疡形成,其中还涎方1组优于还涎方2组,差异无统计学意义(P>0.05);美沙拉嗪组结肠黏膜明显水肿,伴有淋巴细胞浸润,多数小鼠无明显溃疡形成;康复新液组有炎性细胞浸润,多数伴有浅表溃疡形成,少部分有深溃疡形成局灶呈轻-中度异型增生表现;还涎方1组、还涎方2组与美沙拉嗪组对比,差异无统计学差异(P>0.05)。还涎方1组、还涎方2组较康复新液组有明显改善(P<0.01)。各治疗组中,还涎方1组、还涎方2组、美沙拉嗪组较模型组均有明显改善(P<0.01),康复新液组较模型组有改善(P<0.05)。
(6)免疫组化结果:取各组小鼠结肠组织,经p53免疫组化检测,结果显示空白组p53呈低表达,细胞着色较浅;与空白组相比,模型组p53显色明显加深,表达量明显增多(P<0.01);与空白组相比,各治疗组p53显色及表达均有不同程度升高,但均低于模型组。其中还涎方1组、还涎方2组与美沙拉嗪灌组相近,明显低于康复新液组,有显著统计学差异(P<0.01)。在正常组织中bcl-2表达率通常很低,在炎症相关癌发展过程中与而在炎症、异型增生正相关。取各组小鼠结肠组织后,经bcl-2免疫组化检测,结果显示空白组bcl-2表达多为阴性或低表达;与空白组相比,模型组染色后组织细胞中bcl-2显色较深,表达较多,两者有显著差异(P<0.01);与空白组相比,还涎方1组、还涎方2组、美沙拉嗪组、康复新液组表达均有升高(P<0.05),升高程度康复新液>美沙拉嗪灌肠液>还涎方2组>还涎方1组,单均低于模型组。经cox-2免疫组化检测,结果显示空白组cox-2较少,细胞着色较浅;与空白组相比,模型组cox-2显色明显加深,表达量明显增多(P<0.01);与空白组相比,各治疗组cox-2表达均有不同程度升高,其中还涎方1组、还涎方2组与美沙拉嗪组相近,明显低于康复新液组,有显著统计学差异(P<0.01),各治疗组表达均低于模型组。
综上所述,本发明可以干预溃疡性结肠炎癌变的发生,在结肠组织炎-癌转化中起到重要作用,还涎方1组和还涎方2组的对于干预溃疡性结肠炎癌变的发生,在结肠组织炎-癌转化中的预防或治疗效果优于美沙拉嗪组,明显优于康复新液组。同时实验证明:还涎方1组的治疗效果要略好于还涎方2组,但差异不显著,当蜂蛹药材缺乏时,可以用蜂房来代替。还涎方1组和还涎方2组能显著降低AOM/DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠肠黏膜炎症程度,且对溃疡性结肠炎小鼠的早期癌变具有预防作用。还涎方抑制AOM/DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠癌变的机制与还涎方抑制p53基因突变、显著下调bcl-2、cox-2的表达水平有关。
Claims (10)
1.一种预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的中药组合物,其特征在于:由如下重量份的原料药制成:壁虎120份、地龙120份、鼠妇虫120份、蜂蛹90份。
2.一种预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的中药组合物,其特征在于:由如下重量份的原料药制成:壁虎120份、地龙120份、鼠妇虫120份、蜂房90份。
3.一种预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的中药组合物,其特征在于:由如下重量份的原料药制成:壁虎120份、地龙120份、鼠妇虫120份、蜂蛹60份。
4.一种预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的中药组合物,其特征在于:由如下重量份的原料药制成:壁虎210份、地龙210份、鼠妇虫210份、蜂蛹150份。
5.一种预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的中药组合物,其特征在于:由如下重量份的原料药制成:壁虎120份、地龙120份、鼠妇虫120份、蜂房60份。
6.一种预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的中药组合物,其特征在于:由如下重量份的原料药制成:壁虎210份、地龙210份、鼠妇虫210份、蜂房150份。
7.一种预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的药物制剂,其特征在于:所述药物制剂由权利要求1-6任一项所述的中药组合物制成。
8.根据权利要求7所述的一种预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的药物制剂,其特征在于:
所述药物制剂的剂型包括丸剂、胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂、口服液、灌肠液、煎煮剂。
9.根据权利要求8所述的一种预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的药物制剂,其特征在于:
所述散剂由如下方法制备:
将权利要求1-6任一项所述的中药组合物使用药物粉碎机反复打碎、过80-120筛,制成细粉,即得散剂;
所述煎煮剂制备方法:
将权利要求1-6任一项所述的中药组合物,按照1:20-1:30的料液比,加水浸泡,浸泡1.5-2.5小时,武火煮沸,文火煎煮20-40份钟,过滤取滤汁;滤渣再次按照1:20-1:30的料液比,加水煮沸,文火煎煮20-40分钟,过滤取滤汁;合并滤汁即得煎煮剂;
所述灌肠液由如下方法制备:可由下列任一方法制备;
第一种制备方法,将散剂按照1:1-1:2的料液比,加入温水浸泡混匀后,加入助悬剂使药物处于悬浮状态,即得灌肠液;
第二种制备方法,将权利要求1-6任一项所述的中药组合物按照1:10-1:15的料液比,加水浸泡1.5-2.5小时,取出中药组合物放入榨汁机中,加入1-2倍量的蒸馏水,搅碎搅匀8-10min,用8-10层纱布过滤,得滤液放入榨汁机中,再加入1-2倍量的蒸馏水,搅碎搅匀4-6min,依上法过滤,得到的滤液配比成13.5mg/mL的溶液,即得灌肠液;
第三种制备方法,将权利要求1-6任一项所述的中药组合物,按照1:20-1:30的料液比,加水浸泡,浸泡1.5-2.5小时,武火煮沸,文火煎煮20-40分钟,过滤取滤汁;滤渣再次按照1:20-1:30的料液比,加水煮沸,文火煎煮20-40分钟,过滤取滤汁;合并滤汁武火浓缩至滤汁体积的1/60-1/30。
10.根据权利要求1-6任一项所述的一种预防或治疗溃疡性结肠炎癌变的中药组合物的应用,其特征在于:用于制备预防溃疡性结肠炎癌变药物、或治疗溃疡性结肠炎癌变药物中的应用。
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