CN111227981A - 一种神经母细胞瘤肾上腺原位移植瘤动物模型的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种神经母细胞瘤肾上腺原位移植瘤动物模型的建立方法,包括以下步骤:(1)动物筛选;(2)神经母细胞经胰酶消化、稀释,制得细胞悬液(3)动物背部切口,将细胞悬液注射入肾上腺周围脂肪处。与传统异位皮下移植的肿瘤相比,本发明的方法的成瘤率更高,达100%、肿瘤生长速度明显加快,移植瘤在相同时间点明显大于异位移植瘤,肿瘤组织HE染色提示本发明移植瘤肿瘤组织较传统皮下异位移植瘤肿瘤细胞密度更大;且本发明的方法避免从腹部开口进行手术,避免在腹部开口下对腹腔脏器的影响,并且解决了脾脏遮挡肾上腺造成的手术难度问题,有效的减少了操作难度。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种神经母细胞瘤肾上腺原位移植瘤动物模型的建立方法。
背景技术
神经母细胞瘤(Neuroblastoma,NB)是儿童常见的一种交感神经系统的恶性胚源性肿瘤,其起源于神经嵴,恶性度极高,预后极差,但具有自行消退和体外诱导分化成熟的特点。对于如何更好的治愈NB是目前肿瘤界研究的焦点问题,而动物模型是肿瘤疾病临床前研究的重要组成部分,其中小鼠移植瘤模型可模拟人肿瘤自然生长过程,是目前最主流的研究NB的动物模型。移植瘤模型可分为异位移植和原位移植模型,约60%的神经母细胞瘤原发于腹膜后,来源于肾上腺髓质或交感神经节,因此异位移植瘤模型并不能完全模拟神经母细胞瘤的生物学行为,而原位移植瘤模型在生物学特性上更贴近临床实际,因此,建立肾上腺原位移植NB动物模型的造模方法,对未来进一步研究NB发生、发展及治疗具有重要影响。
有鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种神经母细胞瘤肾上腺原位移植瘤动物模型的建立方法,通过该方法建立的神经母细胞瘤肾上腺原位移植瘤动物模型,具有成瘤率更高,肿瘤生长速度明显加快,移植瘤在相同时间点更大的优势。
一种神经母细胞瘤肾上腺原位移植瘤动物模型的建立方法,包括以下步骤:
(1)动物筛选;
(2)神经母细胞经胰酶消化、稀释,制得细胞悬液;
(3)动物背部切口,将细胞悬液注射入肾上腺周围脂肪处。
所述动物为小鼠。
所述动物筛选过程中,需选用SCID-Beige免疫缺陷小鼠,雌性,5周龄,体重14-16g。
所述细胞悬液的制备方法,包括以下步骤:肿瘤细胞接种实验当天将BE2细胞用胰酶消化后,按照PBS:Matrigel=1:1的比例稀释BE2细胞,制成2×106/50μl/只的细胞悬液。
所述(3)中,具体包括以下步骤:小鼠左侧背部备皮消毒,左侧背部肋缘下开1cm左右切口,将细胞悬液50微升注射到肾上腺周围脂肪层内,缝合消毒。
与现有技术相比,本发明的有益效果在于:
(1)本发明的神经母细胞瘤肾上腺原位移植瘤动物模型的建立方法,不同于传统皮下异位肿瘤移植模型,而是体外培养人神经母细胞瘤细胞,然后接种于小鼠背部,并分别在肿瘤细胞接种后第14天、21天、28天取瘤组织;与传统异位皮下移植的肿瘤相比,本发明的方法的成瘤率更高,达100%、肿瘤生长速度明显加快,移植瘤在相同时间点明显大于异位移植瘤,肿瘤组织HE染色提示本发明移植瘤肿瘤组织较传统皮下异位移植瘤肿瘤细胞密度更大。
(2)本发明同时提供了另一种神经母细胞瘤肾上腺原位开腹接种动物模型的建立方法(开腹接种),体外培养人神经母细胞瘤细胞,然后开腹接种于小鼠左侧肾上腺周围脂肪内,并分别在肿瘤细胞接种后第14天、21天、28天取瘤组织;实验结果表明,开腹开口接种相对于背部开口接种,小鼠脾脏会遮挡实验操作视线,而且脾脏质地较脆且易出血,不宜过多触碰;而背部接种时开口位置更便于细胞注射,可直接找到肾上腺周围脂肪层,注射细胞时不会影响腹腔其他脏器。
(3)本发明的方法避免从腹部开口进行手术,这样避免在腹部开口下对腹腔脏器的影响,并且解决了脾脏遮挡肾上腺造成的手术难度问题,有效的减少了操作难度。
说明书附图
图1为肾上腺原位移植瘤肿瘤细胞接种过程图,其中A为左侧卧位固定在手术台上及备皮区域,B为手术开口位置,C为开腹后暴露左侧肾上腺及周围脂肪层,D为细胞注射时针头刺入位置,E为肿瘤细胞注射入脂肪层内,F为肿瘤细胞注射完毕后脂肪层形态。
图2为两组肿瘤生长情况比较图。
图3为皮下异位移植组及肾上腺原位移植组肿瘤生长情况图,其中A皮下异位移植瘤取材图,B皮下异位移植瘤生长情况图,C为皮下异位移植瘤局部放大图,D为肾上腺原位移植瘤取材图,E为肾上腺原位移植瘤生长情况图,F为肾上腺原位移植瘤局部放大图。
图4为两组不同成瘤方式肿瘤组织形态及组织学形态图,其中A为皮下异位移植瘤肿瘤大体形态,B为皮下异位移植瘤HE染色图×40倍,C为皮下异位移植瘤HE染色图×200倍,D为肾上腺原位移植瘤肿瘤大体形态,E为肾上腺原位移植瘤HE染色图×40倍,F为肾上腺原位移植瘤HE染色图×200倍。
具体实施方式
一种神经母细胞瘤肾上腺原位移植瘤动物模型的建立方法,包括以下步骤:
(1)选用SCID-Beige免疫缺陷小鼠,雌性,5周龄,体重14-16g;
(2)肿瘤细胞接种实验当天将BE2细胞用胰酶消化后,按照PBS:Matrigel=1:1的比例稀释BE2细胞,制成2×106/50μl/只的细胞悬液用于肿瘤细胞接种;
(3)气体诱导麻醉后,小鼠消毒,左侧背部肋缘下开口,将准备好的细胞悬液抽取50微升注射到肾上腺周围脂肪层内,缝合并消毒。
以下通过具体实施例对本发明进行说明。
1材料和方法
1.1细胞及培养液
采用神经母细胞瘤细胞系SK-N-BE2(BE2)细胞,由美国国立卫生研究院-国家癌症研究所-分子细胞生物实验室Dr.Carol.J.Thiele博士惠赠。采用含有10%胎牛血清(以色列BI公司)、2mM/L谷氨酰胺(以色列BI公司)、100U/ml青霉素(以色列BI公司)、100μg/ml链霉素的RPMI 1640培养液(以色列BI公司),培养于37℃、5%CO2的孵箱内,2-3天传代一次,取对数生长期的细胞用于进一步实验。
1.2动物
实验动物选用SCID-Beige免疫缺陷小鼠,雌性,5周龄,体重14-16g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,动物许可证号:SCXK(京)2016-0006。
1.3仪器
体式显微镜(宁波永新光学股份有限公司型号:NSZ-608T)、小动物呼吸麻醉机(美国MATRX型号:MODLE3000)。
1.4实验方法
1.4.1注射细胞准备
肿瘤细胞接种实验当天将BE2细胞用胰酶消化后,按照PBS:Matrigel=1:1的比例稀释BE2细胞,制成2×106/50μl/只的细胞悬液用于肿瘤细胞接种。
1.4.2神经母细胞瘤细胞接种
30只SCID-Beige小鼠随机分为两组,皮下异位移植瘤组9只,原位移植瘤组21只,标记编号并称量体重,A组为皮下异位移植组,B组为肾上腺原位移植组。A组动物在无菌条件下,将准备好的细胞悬液抽取50微升经皮下注射到小鼠右侧腋下位置,注射完毕后放回饲养笼内正常饲养。B组动物气体诱导麻醉后,小鼠左侧卧固定在手术台,将左侧背部部备皮消毒,左侧背部肋缘下开1cm左右切口,将准备好的细胞悬液抽取50微升,体式显微镜下注射到肾上腺周围脂肪层内,免拆缝合线缝合并消毒创口,待小鼠苏醒后放回饲养笼内正常饲养。
1.4.3术后观察
BE2肿瘤细胞接种后第二天开始每天记录小鼠体重变化。接种肿瘤细胞后第14天、21天、28天比较A、B两组成瘤情况及肿瘤大小。肿瘤大小测量:记录肿瘤最长径a和最短径b,采用公式V=a×b2/2计算肿瘤体积,皮下异位移植瘤肿瘤大小每周测量三次,肾上腺原位移植瘤肿瘤大小测量取材后肿瘤组织大小。组织形态学检查:A组取完整肿瘤标本、B组将肿瘤、左肾及肾周脂肪一并取出,于4%多聚甲醛内固定,行HE染色,观察镜下病理改变。
1.5统计学分析
2结果
2.1神经母细胞瘤肾上腺原位移植模型建立
无菌条件下使用异氟烷,通过小动物呼吸麻醉机诱导麻醉并将流量控制在氧气流量200ml/min,异氟烷浓度3%持续麻醉,小鼠左侧卧位固定在体式显微镜下,并将小鼠左侧背部肋缘下备皮,安尔碘表面消毒,在左侧背部肋缘下开1cm左右切口,镜下用无损显微镊轻柔的暴露手术所需视野,此时可见脂肪组织包覆的左侧肾上腺及左侧肾脏上级部分,用无菌棉签将肾脏轻柔向小鼠尾侧拨动,此时将暴露肾上腺及周围脂肪层,将准备好的神经母细胞瘤细胞悬液50微升抽入针尖型号为28G的注射器内,镜下左手用棉签固定肾上腺脂肪位置,右手持注射器,在肾上腺周围脂肪处尽量平行进针,注意针尖不可触碰到肾上腺,针尖不可穿透脂肪层,确定针尖斜面全部进入脂肪层后缓慢注射细胞悬液,注射后可见脂肪层快速形成丘状隆起,确认细胞悬液全部注射入脂肪层后快速拔出注射器的同时左手棉签抵住入针位置1-2分钟避免漏液。而后恢复脏器位置,逐层缝合肌肉层及皮层,缝合处消毒并停止异氟烷麻醉,待小鼠苏醒后放回饲养笼内正常饲养(图1)。
2.2肾上腺原位移植瘤与皮下异位移植瘤组间成瘤情况比较
在接种相同数量肿瘤细胞的情况下,分别在14天、21天、28天比较两组小鼠的成瘤率(表1)、平均肿瘤体积(表2)及肿瘤生长情况(图2)。
如表1所示,接种相同数量肿瘤细胞后,皮下异位移植瘤的成瘤率在14天、21天、28天分别为33%、67%、78%,而肾上腺原位移植瘤的成瘤率均为100%。14天时原位移植瘤与异位移植瘤成瘤率相比具有统计学差异(P=0.0114)。结果提示,原位移植瘤的成瘤率高,且成瘤明显早于皮下异位移植瘤。28天内动态观察并记录肿瘤大小。皮下异位移植瘤组共9只小鼠,分别在14天、21天、28天时测量肿瘤大小;肾上腺原位移植瘤组共21只小鼠,分别在14天、21天、28天各处死7只,取出肿瘤组织测量肿瘤大小。如表2及图2所示,与皮下移植瘤相比,原位移植瘤生长速度更快,肿瘤体积更大,差异具有统计学意义(14天时P<0.05,21天及28天时P<0.001)。
表1两组移植瘤方法的成瘤率比较(%)
注:肿瘤移植后14天两组成瘤率比较,*P=0.0114
表2两组移植瘤方法的肿瘤生长情况
注:肿瘤移植后14天的肿瘤体积比较,*P<0.05;21天、28天的肿瘤体积比较,**P<0.001
2.3两种不同成瘤方式肿瘤组织病理特点
与皮下异位移植瘤相比,接种细胞后相同时间点的肾上腺原位移植瘤的肿瘤体积更大(图4A、4D)。HE染色可见,皮下异位移植瘤与原位移植瘤的肿瘤细胞形态相同,呈蓝色,细胞形态小、核大胞浆含量少(图4B、4E)。但与皮下异位移植瘤相比,原位移植瘤的肿瘤细胞密度更大、红细胞分布更多,提示血流更为丰富(图4C、4F)。
从上文中可以看出,神经母细胞瘤皮下异位移植瘤因其操作简单易行广泛用于神经母细胞瘤的研究,但有其局限性。与皮下异位移植瘤模型相比,肾上腺原位移植模型成瘤速度快、细胞需求量小、肿瘤体积大、局限于特定位置而且在短期内未发现有转移形成,造模方式可行,是一种研究神经母细胞瘤的理想动物模型。临床中约有60%的神经母细胞瘤原发于腹膜后,来源于肾上腺髓质或交感神经节,所以原位移植瘤动物模型的生物学特性更贴近临床实际。在查阅大量相关文献资料后发现,肾上腺原位移植瘤模型越来越多地成为目前主流的神经母细胞瘤移植瘤形式,但未见详细的操作流程作为方法学方面的指导,本文详细介绍了神经母细胞瘤肾上腺原位移植瘤动物模型的造模方法并创新性的从小鼠背侧开口进行肿瘤细胞的注射,减少手术难度、减轻手术过程对小鼠的生理影响。为今后更加准确、高效的复制此动物模型的提供细致和标准化实验方案。对未来进一步研究NB发生、发展及治疗奠定了良好的科研基础。
我们在实践中发现,模型建立过程中有一些注意事项:1,麻醉方式最好选择气体麻醉,本实验在拥有一定操作熟练度的情况下,每只鼠需要麻醉时间短,常规麻醉小鼠苏醒慢、对机体影响较大,气体麻醉是目前对于短时间麻醉和反复多次麻醉时首选的麻醉方式。2,切口位置的选择,本发明的原位移植瘤细胞注射时创新性的选择从小鼠背部开口进行细胞注射,避免从腹部开口进行手术,这样避免在腹部开口下对腹腔脏器的影响,并且解决了脾脏遮挡肾上腺造成的手术难度问题,有效的减少了操作难度。3,原位移植时需要注意对脾脏和肾脏的保护,由于脾脏与肾脏均为质地较脆的实质性器官,不当的操作会对其造成损伤,影响小鼠术后状态甚至成活率。尽量使用棉签一类的柔性器具来触碰。4,对肾上腺的保护,注射细胞时针尖位置要确保不会碰到肾上腺实质,以免造成小鼠术中死亡。5,防止肿瘤细胞漏液,在脂肪层注射细胞时要做到进针既稳又准,注射器针尖不能刺穿脂肪层,尽量使针尖前端多进入脂肪层一段距离,注射时注射位置要能看到皮丘状隆起,拔针的同时要迅速用棉签抵住针眼防止漏液。6,术后要勤观察小鼠状态,原位移植后肿瘤发展迅速,对小鼠生理状态影响极大,每天称量体重,观察毛色等外观变化。
在发明的研究过程中发现,肾上腺原位移植瘤模型在神经母细胞瘤的研究中更符合临床患儿体内神经母细胞瘤生长的特点。相较于异位移植瘤模型,原位移植瘤模型成瘤率更高,各时间点成瘤率均为100%,肿瘤生长速度快、实验周期短,在实验研究中优于异位移植瘤模型。故本发明提供了一种神经母细胞瘤肾上腺原位移植瘤动物模型的建立方法,为准确高效地复制该动物模型提供一种标准化实验方案,对NB的研究奠定了良好的科研基础。
Claims (7)
1.一种神经母细胞瘤肾上腺原位移植瘤动物模型的建立方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)动物筛选;
(2)神经母细胞经胰酶消化、稀释,制得细胞悬液;
(3)动物背部切口,将细胞悬液注射入肾上腺周围脂肪处。
2.根据权利要求1所述的神经母细胞瘤肾上腺原位移植瘤动物模型的建立方法,其特征在于,所述动物为小鼠。
3.根据权利要求1所述的神经母细胞瘤肾上腺原位移植瘤动物模型的建立方法,其特征在于,所述动物筛选过程中,需选用SCID-Beige免疫缺陷小鼠,雌性,5周龄,体重14-16g。
4.根据权利要求1所述的神经母细胞瘤肾上腺原位移植瘤动物模型的建立方法,其特征在于,所述的神经母细胞瘤为神经母细胞瘤细胞系SK-N-BE2(BE2)细胞。
5.根据权利要求4所述的神经母细胞瘤肾上腺原位移植瘤动物模型的建立方法,其特征在于,所述神经母细胞瘤细胞系SK-N-BE2(BE2)细胞需进行以下培养:采用含有10%胎牛血清(以色列BI公司)、2 mM/L谷氨酰胺(以色列BI公司)、100 U/ml青霉素(以色列BI公司)、100 µg/ml链霉素的RPMI 1640培养液(以色列BI公司),培养于37 ℃、5% CO2的孵箱内,2-3天传代一次,取对数生长期的细胞用于进一步实验。
6.根据权利要求1所述的神经母细胞瘤肾上腺原位移植瘤动物模型的建立方法,其特征在于,所述细胞悬液的制备方法,包括以下步骤:肿瘤细胞接种实验当天将BE2细胞用胰酶消化后,按照PBS:Matrigel=1:1的比例稀释BE2细胞,制成2×106/50μl/只的细胞悬液。
7.根据权利要求1所述的神经母细胞瘤肾上腺原位移植瘤动物模型的建立方法,其特征在于,所述(3)中,具体包括以下步骤:小鼠左侧背部备皮消毒,左侧背部肋缘下开1cm左右切口,将细胞悬液50微升注射到肾上腺周围脂肪层内,缝合消毒。
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