CN112400806A

CN112400806A - 一种肿瘤早早期动物模型的构建方法及其应用

Info

Publication number: CN112400806A
Application number: CN202011118562.8A
Authority: CN
Inventors: 尹悦; 蒋瑞兰; 沈明望
Original assignee: Individual
Current assignee: Guilin Medical University
Priority date: 2020-10-19
Filing date: 2020-10-19
Publication date: 2021-02-26

Abstract

本发明提供一种肿瘤早早期动物模型的构建方法及其应用，解决现有造模存在的耗时长、成本高、以及无法应用在无症状者肿瘤筛查的问题。肿瘤早早期动物模型的构建方法包括以下步骤：1)对非人哺乳动物的肿瘤细胞进行体外培养和传代扩增；2)将扩增后的肿瘤细胞胰酶消化，清洗重悬后计数；3)将清洗重悬后的肿瘤细胞稀释为预先确定的早早期动物模型注射浓度；4)选择与所述肿瘤细胞来源物种遗传背景相匹配的非人哺乳动物，对其接种肿瘤细胞悬液；5)接种后14～30天，获得早早期动物模型。本发明肿瘤早早期动物模型构建耗时短、成本低、操作简易，并可用于肿瘤免疫研究和肿瘤早早期生物标志物的筛选。

Description

一种肿瘤早早期动物模型的构建方法及其应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种肿瘤早早期动物模型的构建方法及其应用。

背景技术

恶性肿瘤的发病率和死亡率逐年增高，是全球重大的公共健康问题。目前，肿瘤的二级预防仍然主要依赖患者自觉临床症状就诊，确诊金标准依靠病理组织活检，而影像学、血清学检查只能作为辅助手段。因此，出现临床症状前或者影像学检查无法筛查到的微小甚至显微水平的肿瘤(称之为早早期肿瘤)，是二级预防研究的重点。

目前的研究普遍认可免疫编辑理论，认为肿瘤发生过程中与免疫系统的相互作用分为三个阶段：1)正常体内产生的肿瘤细胞会被免疫系统及时清除，即免疫监视；2)如果肿瘤细胞没有被完全清除，机体进入免疫平衡阶段，此阶段免疫系统不能完全清除肿瘤细胞，肿瘤在免疫系统压力下被重塑；3)随着肿瘤进展最终突破免疫系统，进入免疫逃逸并出现临床症状和体征；由此可见，免疫平衡阶段是预防研究的重点。

以往研究免疫平衡阶段的动物模型旨在描述免疫微环境的细胞表型，或探究免疫平衡的机制。研究造模多采用致癌剂诱导，也有研究皮肤黑色素瘤的动物模型采用皮肤接种法诱导免疫平衡；但是这些方法耗时较长，一般 5～12个月，研究需要基因改造鼠，成本较高，并且这类研究重点在于免疫平衡机制和免疫微环境，对应的是侵入性的临床肿瘤病理检查，对于已确诊的肿瘤患者预后和治疗有意义，却在无症状者肿瘤筛查中很难应用。

因此，研究一个耗时短，成本较低，并且处于免疫平衡进入免疫逃逸期的早早期，且暂时未出现肿瘤或者肿瘤处于微小或显微水平的早早期动物模型非常必要；并且，新的动物模型应用中需要明确生物标志物筛选研究的生物标本取材来源和方法，也是急需解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于解决现有造模存在的耗时长、成本高、以及无法应用在无症状者肿瘤筛查的问题，而提供了一种肿瘤早早期动物模型的构建方法及其应用。

为实现上述目的，本发明所提供的技术解决方案是：

一种肿瘤早早期动物模型的构建方法，其特殊之处在于，包括以下步骤：

1)对非人哺乳动物的肿瘤细胞进行体外培养和传代扩增，以满足后续建立模型的需求，培养使用的培养基种类与肿瘤细胞种类有关，如MEM、 DMEM或RMPI1640为基础培养基再加入10％胎牛血清等；

2)将步骤1)扩增后的肿瘤细胞胰酶消化，清洗重悬后计数；

3)将步骤2)清洗重悬后的肿瘤细胞稀释为预先确定的早早期动物模型注射浓度；

4)选择与所述肿瘤细胞来源物种遗传背景相匹配的非人哺乳动物，对其接种步骤3)得到的肿瘤细胞悬液；

5)接种后14～30天，获得早早期动物模型；

以上步骤3)中所述确定早早期动物模型注射浓度的实验过程如下：

a)根据确定的肿瘤细胞成瘤注射的最佳浓度，将步骤2)清洗重悬后的肿瘤细胞稀释为低于所述最佳浓度的多个浓度梯度肿瘤细胞悬液；所述肿瘤细胞成瘤注射的最佳浓度在试剂供应商使用说明书或者科技文献都有记载，因此是确定的；稀释时既可以在节约实验成本的前提下10倍或5倍稀释，筛选出一个大范围，再在这个大范围内进行更细致的梯度划分，也可以在节约时间成本的前提下，直接进行较为细致的梯度划分，比如2倍稀释或2.5倍稀释；

b)选择与所述肿瘤细胞来源物种遗传背景相匹配的非人哺乳动物，并对其分组接种所述多个浓度梯度肿瘤细胞悬液；

c)观察记录接种肿瘤细胞后非人哺乳动物的成瘤情况；

d)接种后14～30天，将暂未出现肿瘤或出现微小肿瘤但未进入快速增长期的非人哺乳动物筛选出；其中，对暂未出现肿瘤的非人哺乳动物继续观察其成瘤生长曲线来确认其被筛选时是否处于肿瘤早早期，对出现微小肿瘤但未进入快速增长期的非人哺乳动物实验解剖来确认其被筛选时是否处于肿瘤早早期，然后，根据筛查时处于肿瘤早早期的动物对应的接种浓度，来确定早早期动物模型注射浓度。

进一步地，所述步骤1)中，所述肿瘤细胞来源于细胞系或者原代肿瘤细胞；

所述步骤2)中，所述清洗重悬是指采用等渗盐溶液清洗重悬，例如磷酸盐缓冲液、Hank’s液等；所述计数是指采用细胞计数仪器计数，例如细胞计数板、流式细胞仪等。

进一步地，所述步骤3)中，所述肿瘤细胞成瘤注射的最佳浓度约为 1×10⁵～5×10⁶个/100μL/只动物，具体浓度值与肿瘤细胞种类或者肿瘤组织来源器官有关，本发明不建议为了保障细胞活性使用含有外源蛋白抗原的辅助试剂，如MaTRIgel，会干扰后续模型在肿瘤免疫和生物标志物研究的应用；

所述步骤4)中，所述接种为皮下注射或者原位注射，具体注射部位与肿瘤细胞的种类有关。

进一步地，步骤3)中c)，所述观察记录是指使用游标卡尺或动物肿瘤成像手段观察记录肿瘤的大小；

步骤3)中d)，在接种后14～30天内，将暂未出现肿瘤或出现微小肿瘤但未进入快速增长期的非人哺乳动物筛选出并抽血留存血样，待后期观察完成后，将属于处于早早期动物的血液样本继续用于筛选生物标志物或其他研究，节省时间和成本；所述早早期动物模型注射浓度较所述成瘤注射的最佳浓度低1～2个数量级；免疫应答过程的天数为14天，为避免后续应用模型筛选生物标志物时免疫应答相关基因的干扰，应在14天后取血；而肿瘤接种动物大部分在30天内出现成瘤，应在30天前取血，因此早早期筛选及取血时间点限定在此范围；由于动物个体存在免疫差异性，在这个范围内，筛选及取血时间越早，早早期动物模型建立成功率越高。

进一步地，为了便于开展研究并构建模型，所述非人哺乳动物为野生型非基因改造非免疫缺陷鼠或野生型大鼠；其中，野生型非基因改造非免疫缺陷鼠为C57BL/6小鼠(对应遗传背景相同的B16F10细胞系、B16细胞系、 Lewis肺癌细胞系等)、BALB/c小鼠(对应4T1乳腺癌细胞系等)或者其它野生型非基因改造非免疫缺陷鼠；野生型大鼠为SD大鼠、Wistar大鼠等野生型大鼠(可采用相同遗传背景的动物腹水、肿瘤组织等来源的原代肿瘤细胞移植接种)。当然在相同的目标下，也可采用其它非人哺乳动物。

本发明还提供了采用上述肿瘤早早期动物模型的构建方法构建的动物模型在筛选生物标志物方面以及肿瘤免疫研究方面的应用。

同时，也披露了上述构建的早早期动物模型进行筛选生物标志物的方法，其特殊之处在于，包括以下步骤：

S1)选取同物种的阴性组动物及肿瘤组动物，并分别对阴性组、肿瘤组以及所述早早期动物模型组的动物进行取血，分离得到血小板样品；

S2)分别提取步骤S1)所有血小板样品的总RNA，进行血小板基因检测；

S3)分析步骤S2)的基因检测结果，筛选早早期动物模型组与肿瘤组和阴性对照组相比特异的具有表达差异的基因，并经实验验证后，作为生物标志物。

进一步地，所述步骤S1)中，取血来源于外周血；取血分离血小板一般采用两步离心法，也可以选择商品化血小板分离试剂盒分离；

两步离心法：首先将抗凝血180×g(此为离心力，其中，g为重力加速度)室温离心10分钟，收集上清(即含有丰富血小板的血浆层)至无菌离心管中，将其1250×g室温离心10分钟，弃上清，获得血小板沉淀；

取血分离血小板后立即加入TRIzol试剂裂解低温保存(-80℃冰箱或者更低温度)或加入RNA保护剂(比如：商品化试剂RNAlater等)适温保存避免RNA降解。

进一步地，所述步骤S2)中，采用转录组测序或者基因芯片等转录组检测手段进行血小板基因检测。

进一步地，所述步骤S3)中，筛选生物标志物是指利用测序或芯片结果进行生物信息学分析，或者采用人工智能手段(例如机器学习)对大数据直接进行分析(该方式可在样本量较大时优先使用)，并经实验验证(可进行实时荧光定量PCR)的过程。

本发明的原理是：

本发明通过将与动物遗传背景相匹配的可成瘤的肿瘤细胞进行体外有限稀释，将不同数量级(浓度)的肿瘤细胞悬液接种至动物，观察不同数量级组动物的成瘤情况，将组内接种后14～30天内暂未成瘤或者出现微小肿瘤但未进入快速增长期的动物视为早早期肿瘤组。同时，利用上述方法构建的动物模型通过血小板转录组基因检测方法筛选肿瘤早早期生物标志物。

本发明的优点是：

1.本发明肿瘤早早期动物模型构建方法简单易操作，只需常规的细胞培养、细胞悬液注射接种等动物常规操作技术。

2.本发明肿瘤早早期动物模型构建过程不需要价格昂贵的基因改造动物或者转基因细胞系，从而最大化模拟肿瘤免疫体内的真实情况，避免外来插入或者改造基因对免疫系统的未知影响。

3.本发明构建动物模型时间短，无需化学致癌物诱导肿瘤免疫需要半年到一年以上实验周期，也不需要复杂的手术操作，降低时间和实验成本。

4.本发明肿瘤早早期动物模型应用中取材的生物标本来源于外周血血小板，需血量少，创伤小，易操作，另外血小板易分离处理，无需其它液体活检所需的复杂和昂贵的技术(例如：循环肿瘤细胞或循环肿瘤DNA等)。

5.本发明肿瘤早早期动物模型构建方法以及筛选生物标志物、肿瘤免疫研究的用途适用于所有能够成瘤的肿瘤细胞，具有普遍适用性，尤其对无症状肿瘤筛查具有重要的意义。

附图说明

图1是采用不同数量的肿瘤细胞接种后的肿瘤生长情况，图注为注射细胞数，单位：个/100μL/只动物；图1中a表示不同浓度细胞注射小鼠的肿瘤生长情况的生长曲线图；图1中b表示无瘤动物比例与时间的Kaplan-Meier 曲线图；

图2是本发明肿瘤早早期模型在疾病生物标志物研究中应用的实验技术流程；

图3是肿瘤组(Melanoma)和肿瘤早早期组(2×10³group)造模后解剖图；

图4是本实施例应用于肿瘤生物标志物筛选的结果；

图5是本实施例经基因测序筛选的肿瘤早早期特异的生物标志物结果；

图6是本实施例荧光定量PCR实验验证图5中的生物标志物结果。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明的内容作进一步的详细描述，下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均是可从商业途径得到的常规试剂和材料。另外，下文提供大量技术细节以便提供对本发明更为彻底的理解，然而对于本领域技术人员来说，显然本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施，在本发明构思的前提下，可以做出若干变化和改进，这些都属于本发明的保护范围。本发明的实施方式包括但不仅限于以下实施例。

本实施例以黑色素瘤为例阐述本发明肿瘤早早期动物模型的构建方法和应用。

构建方法具体步骤如下：

1、小鼠黑色素瘤细胞系培养

将B16F10细胞系在DMEM完全培养基(90％DMEM基础培养基+10％ FBS)中培养、增殖和传代，血球计数板或其它细胞计数仪器计数。

2、构建肿瘤早早期动物模型

2.1、将培养的肿瘤细胞用0.25％胰酶(含EDTA)消化至细胞不再贴壁，用培养液终止消化后吹打均匀；

2.2、将细胞消化液置于15mL离心管中，以300×g离心5分钟，弃上清；

2.3、加入pH值为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)重悬细胞，离心弃上清，再加入PBS重悬细胞，离心弃上清后加入1mL Hank’s平衡盐溶液(HBSS) 重悬细胞，血球计数板或其它细胞计数仪器计数；在前期清洗重悬细胞时加入PBS是为了降低成本，最后重悬加入HBSS则是为了在较长时间的注射注射操作过程中保持肿瘤细胞的活性；

2.4、将细胞稀释为B16F10文献报道常规注射浓度，即1×10⁶个/ml(每只小鼠注射1×10⁵个/100μL，如果是其它细胞系应根据其常规注射细胞浓度进行相应调整)；

2.5、将步骤2.4的细胞悬液继续稀释多个梯度，具体为1×10⁶个/ml， 1×10⁵个/ml，5×10⁴个/ml和2×10⁴个/ml浓度梯度的细胞悬液；

2.6、取多个1mL注射器，分别吸取100μL步骤3中不同浓度的细胞悬液，分组接种于6-8周龄的C57BL/6小鼠皮下并每3-5天观察成瘤情况并使用游标卡尺测量肿瘤大小；参照图1中不同浓度细胞(附图1中图例为每只小鼠注射细胞数)注射小鼠的肿瘤生长情况，生长曲线显示细胞注射浓度越低，小鼠成瘤时间越晚(图1中a)，以无瘤动物比例为纵坐标的Kaplan- Meier曲线显示，细胞注射浓度越低，观察期限内动物成瘤比例越低(图1 中b)。

3、肿瘤早早期动物模型应用

3.1、参考图2实验技术流程，选择成瘤时间较晚的2×10³/100μL/只的接种浓度为早早期组(2×10³/100μL/只)，另外设置阳性成瘤组(1×10⁵/100μL/ 只)和阴性对照组(HBSS)。在接种后14天取小鼠外周血(本实施例采用眼球后静脉窦取血)。图3为阳性成瘤组(Melanoma)和早早期暂时无瘤组 (2×10³，单位：/100μL/只)的解剖图，如果出现早早期组个别小鼠解剖出现肿瘤，则这只小鼠的外周血不作为早早期组，弃去；

如果小鼠为非存活取血，早早期组观察期限内成瘤比例约20％，并非 100％，因此需要将早早期组解剖无瘤的10只小鼠外周血RNA合并为一个样品以增加检测效能。如果小鼠为存活取血，早早期组需要继续观察至一个月以上，在取血后肿瘤才开始形成或者才进入快速生长期才能将之前取的血样计入有效早早期组样品，存活取血量较少，也需要将多只小鼠血样RNA合并，或者采用测序前扩增再建库的技术(如SMART-Seq技术)，以解决样品量少的问题；

3.2、将小鼠EDTA抗凝处理的外周血180×g室温离心10分钟，收集上清(即含丰富血小板的血浆层)并转移至无菌离心管中；将含丰富血小板的血浆1250×g室温离心10分钟，弃上清，获得血小板沉淀；将血小板沉淀立即加入总RNA提取试剂TRIzol，混匀裂解充分后马上放入-80℃冰箱冻存；

3.3、将前述的各个实验组的血小板TRIzol样品提取总RNA进行转录组测序，参考图4测序结果中差异表达基因的热图，测序结果可以进行生物信息学分析后进一步筛选早早期组(E)，与阴性对照组(C)以及阳性肿瘤组 (M)的差异表达基因。筛选的基因还可以进一步实验验证，参考图5筛选结果中部分基因的测序结果，图6为实时定量PCR实验验证图5中同样基因的结果，从而应用于肿瘤早早期生物标记物的研究。

上述构建方法以及应用可适用于所有能够成瘤的肿瘤细胞，具有普遍性，因此，可根据研究需要，改变肿瘤种类和动物种类，采用上述方法构建肿瘤早早期动物模型。

以上对本发明的较佳实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，其中未尽详细描述的设备和结构应该理解为使用本领域中的普通方式予以实施；任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例，这并不影响本发明的实质内容。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。

Claims

1.一种肿瘤早早期动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)对非人哺乳动物的肿瘤细胞进行体外培养和传代扩增；

2)将步骤1)扩增后的肿瘤细胞胰酶消化，清洗重悬后计数；

5)接种后14～30天，获得早早期动物模型；

a)根据确定的肿瘤细胞成瘤注射的最佳浓度，将步骤2)清洗重悬后的肿瘤细胞稀释为低于所述最佳浓度的多个浓度梯度肿瘤细胞悬液；

c)观察记录接种肿瘤细胞后非人哺乳动物的成瘤情况；

d)接种后14～30天，将暂未出现肿瘤或出现微小肿瘤但未进入快速增长期的非人哺乳动物筛选出；其中，对暂未出现肿瘤的非人哺乳动物继续观察其成瘤生长曲线来确认其被筛选时是否处于肿瘤早早期，对出现微小肿瘤但未进入快速增长期的非人哺乳动物实验解剖来确认其被筛选时是否处于肿瘤早早期，由此来确定早早期动物模型注射浓度。

2.根据权利要求1所述肿瘤早早期动物模型的构建方法，其特征在于：

所述步骤1)中，所述肿瘤细胞来源于细胞系或者原代肿瘤细胞；

所述步骤2)中，所述清洗重悬是指采用等渗盐溶液清洗重悬；所述计数是指采用细胞计数仪器计数。

3.根据权利要求1或2所述肿瘤早早期动物模型的构建方法，其特征在于：

所述步骤3)中，所述肿瘤细胞成瘤注射的最佳浓度为1×10⁵～5×10⁶个/100μL/只动物；

所述步骤4)中，所述接种为皮下注射或者原位注射。

4.根据权利要求3所述肿瘤早早期动物模型的构建方法，其特征在于：

步骤3)中c)，所述观察记录是指使用游标卡尺或动物肿瘤成像手段观察记录肿瘤的大小；

步骤3)中d)，在接种后14～30天，将暂未出现肿瘤或出现微小肿瘤但未进入快速增长期的非人哺乳动物筛选出并抽血留存血样；所述早早期动物模型注射浓度较所述成瘤注射的最佳浓度低1～2个数量级。

5.根据权利要求1所述肿瘤早早期动物模型的构建方法，其特征在于：

所述非人哺乳动物为野生型非基因改造非免疫缺陷鼠或野生型大鼠。

6.采用权利要求1肿瘤早早期动物模型的构建方法构建的动物模型在筛选生物标志物方面以及肿瘤免疫研究方面的应用。

7.取权利要求1构建的早早期动物模型进行筛选生物标志物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1)选取同物种的阴性对照组动物及肿瘤组动物，并分别对阴性对照组、肿瘤组以及所述早早期动物模型组的动物进行取血，分离得到血小板样品；

8.根据权利要求7所述筛选生物标志物的方法，其特征在于：

所述步骤S1)中，取血来源于外周血，且取血分离血小板后立即加入TRIzol试剂裂解低温保存或加入RNA保护剂适温保存。

9.根据权利要求8所述筛选生物标志物的方法，其特征在于：

所述步骤S2)中，采用转录组测序或者基因芯片进行血小板基因检测。

10.根据权利要求9所述筛选生物标志物的方法，其特征在于：

所述步骤S3)中，筛选生物标志物是指利用测序或芯片结果进行生物信息学分析或者采用人工智能手段对大数据直接进行分析后，进行实验验证的过程。