CN116516008A - 胃粘膜肠上皮化生标志物jun及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及胃粘膜肠上皮化生标志物JUN及其应用。目前肠化生‑胃癌进展机制不明，缺乏相关生物标志物研究，导致临床无法对其进行针对性的干预。为解决以上技术问题，本发明提供了检测JUN表达量的试剂在制备判断肠化生是否会进展为胃癌的产品中的应用。

Description

胃粘膜肠上皮化生标志物JUN及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及胃粘膜肠上皮化生标志物JUN及其应用。

背景技术

胃粘膜肠上皮化生(Intestinal metaplasia，IM，肠化生)是指胃粘膜上皮细胞被肠型上皮细胞所代替，胃粘膜中出现类似小肠或大肠粘膜的上皮细胞的现象。胃癌发病与肠化生细胞外基质合成降解平衡失调、胃粘膜组织的分解退变、胃粘膜持续病理性炎症状态密切相关。胃黏膜肠化本身不引起症状，通常是在患者进行上消化道内镜检查时取胃部活检无意发现的。肠化会伴有胃酸缺乏，可导致小肠细菌过度生长，部分患者可反复出现上腹部不适、嗳气、烧心、腹泻等症状。胃黏膜肠上皮化生可分为三度：胃黏膜1/3以下者为轻度，胃黏膜1/3～2/3者为中度，大于胃黏膜2/3者为重度。

现有技术中已经提出了正常胃黏膜-慢性非萎缩性胃炎-慢性萎缩性胃炎-肠化生-低级别上皮内瘤变-高级别上皮内瘤变-胃癌的发展路径，研究证实肠化生是最重要的胃癌前病变之一。

根据肠化生的结局将其划分为肠化生-肠化生(好肠化，患者始终维持在肠化生阶段)和肠化生-胃癌(坏肠化，是患者从肠化生阶段逐渐进展至胃癌)2种肠化生类型(结局)，此2种肠化生的病程、进展速度、结局均具有极大差异，因此也决定了临床诊疗上完全不同的干预方式、监测频率以及随访周期等。

胃粘膜肠上皮化生阶段的诊断、干预及治疗是胃癌二级预防的重要内容，对于胃癌的防治具有重要意义，也可有效缓解我国胃癌疾病带来的经济和社会负担。筛选肠化生-胃癌的生物标志物在阻滞肠化生进展，降低胃癌发病率等方面具有实际意义。

发明内容

目前肠化生-胃癌进展机制不明，缺乏相关生物标志物研究，导致临床无法对其进行针对性的干预。

为解决以上技术问题，本发明基于真实世界完成临床序贯病例的纳排，入组病例均为基于病理组织学确诊为肠化生的患者，且在同一医疗机构的不同时间点留取2次及以上的肠化生组织，根据其病变结局将其分为肠化生-肠化生(好肠化)和肠化生-胃癌(坏肠化)2种肠化生类型；通过收样、DSP平台处理病理切片、测序建库分析，提供了精准预测肠化生结局的重要生物标志物，有利于临床实现对肠化生患者的精准分流，显著提高肠化生的早筛、早诊、早治。

具体地，本发明提供以下技术方案：

第一方面，本发明提供了检测JUN表达量的试剂在制备判断肠化生是否会进展为胃癌的产品中的应用。

具体地，所述肠化生进展为胃癌也可以称为“坏肠化”，是指患者从肠化生阶段逐渐进展至胃癌的情况，所述“坏肠化”对应于“好肠化”，所述“好肠化”是指肠化生患者始终维持在肠化生阶段而不进展为胃癌患者。因此，以上产品也可以称为区分好肠化和坏肠化患者的产品、预测肠化生患者进展为胃癌的可能性的产品、预测肠化生患者的结局的产品，或者，胃癌早期诊断的产品。

本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。为了检测基因的表达，可使用多个互不相同的检测方法，例如，杂交测定、质量分析或实时荧光定量核酸扩增检测等的检测方法。

优选地，所述产品中还包括检测RPL8和/或ETS2表达量的试剂。

也即，最优选地，本发明提供了检测试剂组合物在制备判断肠化生是否会进展为胃癌的产品中的应用，所述检测试剂组合物中包括检测JUN、RPL8和ETS2表达量的试剂。

优选地，所述产品可以是试剂盒、芯片、系统、装置、软件等任何实物的产品或基于计算机程序的虚拟产品。

更具体地，所述试剂盒包括免疫组化检测试剂盒、免疫印迹检测试剂盒、免疫层析检测试剂盒、流式细胞分析试剂盒、qPCR试剂盒、ELISA试剂盒等。

进一步，所述的试剂盒还可以包括选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。

更具体地，所述的芯片包括基因芯片、蛋白芯片，所述的基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的探针，所述的探针包括用于检测生物标志物转录水平的针对所述生物标志物的探针；所述的蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的与所述生物标志物编码的蛋白特异性结合的抗体。

优选地，所述检测试剂包括检测mRNA表达量的试剂和/或检测蛋白表达量的试剂。

优选地，所述检测表达量的试剂是检测蛋白表达量的试剂，示例性地，所述试剂包括特异性靶向所述生物标志物的抗体。

优选地，所述检测mRNA表达量的试剂包括特异性扩增所述生物标志物的引物，特异性识别所述生物标志物的探针。

本发明所述生物标志物包括JUN，另一种具体实施例中，本发明所述生物标志物是JUN、ETS2和RPL8的组合。

优选地，所述试剂盒还可以包括蛋白表达量辅助检测试剂，所述蛋白表达量辅助检测试剂包括但不限于：封闭液、抗体稀释液、洗涤缓冲液、显色终止液。

优选地，所述试剂盒还可以包括mRNA表达量辅助检测试剂，所述mRNA表达量辅助检测试剂包括但不限于：使所述引物对应的扩增子可视化的反应试剂，例如通过琼脂糖凝胶电泳法、酶联凝胶法、化学发光法、原位杂交法、荧光检测法等使扩增子可视化的试剂；RNA提取试剂；逆转录试剂；cDNA扩增试剂；制备标准曲线所用的标准品；阳性对照品。

优选地，所述JUN的表达量是针对来自于受试者样本进行检测而得到的。

优选地，所述RPL8和/或ETS2的表达量是针对来自于受试者样本进行检测而得到的。

更具体地，JUN、ETS2在细胞核中表达，RPL8在细胞质中表达。JUN、ETS2、RPL8均在肠化生组呈低表达，在胃癌组呈高表达。

术语“样本”可以是从受试者分离的任何生物样本。例如，样本可以包括但不限于组织、血液、组织、尿液、唾液、精液、乳汁、脑脊髓液、泪液、痰、粘液、淋巴、胞液、腹水、胸膜积液、羊水、膀胱冲洗液和支气管肺泡灌洗液等。

优选地，所述样本是组织。

更具体地，本发明涉及的组织包括行内镜或手术用于诊断或干预治疗肠化生患者所留取的肠化生组织。

优选地，本发明涉及的组织是通过石蜡包埋方法进行保存的组织样本，或者是其他任意保存方法处理所得到的组织样本。

优选地，所述受试者为人，更具体地，是肠化生患者。

本发明的另一方面提供了用于执行一种判断方法的系统(或称为装置、设备、设备组合)或其应用，所述系统至少执行以下的步骤：

1)接受所输入的受试者数据，包含来自所述受试者的样本中生物标志物的表达水平值；

2)分析生物标志物的水平并与阈值相比，若所述受试者的生物标志物的水平高于未患病的对照受试者的参考值范围(阈值)提示所述受试者会进展为胃癌；

3)输出步骤2)的判断结果；

所述方法是判断肠化生是否会进展为胃癌的方法，所述生物标志物包括JUN。

优选地，本发明所述生物标志物还包括ETS2和/或RPL8。

在一种具体地实施例中，所述肠化生患者与受试者具有相同含义，可互相替换。

优选地，所述系统包含以下设备：

1)用于存储数据的存储组件，其中所述存储组件中存储进行判断肠化生是否会进展为胃癌的判断指令；

2)用于处理数据的计算机处理器，其中所述计算机处理器接受存储组件的指令，并进行判断；以及

3)用于显示(输出)关于所述患者的诊断信息的显示器组件。

优选地，所述受试者为人，更具体地，是肠化生患者。

具体地，所述JUN、ETS2、RPL8都在进展为胃癌的肠化生患者中高表达，也即，当所述受试者的生物样本中JUN、ETS2、RPL8中任意一个升高时，就代表了所述受试具有进展为胃癌的风险。

同时，本发明提供了以上判断肠化生是否会进展为胃癌的方法(判断方法)，或者，所述方法也可以称为，早期诊断胃癌的方法。

本发明所述“阈值”或“cutoff”取决于特定的测量技术，不同的测量技术会得到不同的测量结果，例如本发明表2中对于cut-off值的记载是基于免疫组化半定量分析方法的测量值，如果使用不同的方法，则可能需要类推转换。但这种转换是在本领域技术人员技能范畴之内的。同时，容易理解的是，不同生物标志物的阈值不相同，需根据实际检测情况确定，其确定方法是本领域技术人员所熟悉的。

所述术语“高于阈值”或“高表达”的指所述标志物的表达量量等于或大于对照群体中生物标志物表达水平，生物标志物相对于对照表达水平过表达至少1.5倍，例如至少1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3.0倍、3.1倍、3.2倍、3.3倍、3.4倍或3.5倍或更多倍。

如本发明所使用的所述“对照群体”可以是始终维持在肠化生阶段而未进展为胃癌的患者。

术语“表达量”或“表达水平”通常可互换使用，且一般指生物学样品中多核苷酸、mRNA或氨基酸产物或蛋白质的量。“表达”一般指基因所编码的信息转换成细胞中存在的和运行的结构的过程。

本发明的优点和有益效果：

本发明所提供的JUN与肠化生结局具有极高的关联度，敏感性和特异性高达0.8以上，AUC值高达0.9以上。本发明所提供新应用对于临床具有重要意义，可用于胃癌的早期发现，为患者争取时间，尽早开始治疗，提高患者的生存率，降低死亡率，对减轻我国的医疗负担具有重大的意义。

附图说明

图1是基于DSP技术获取肠化生－胃癌的细胞形态学标记图像与对应的IHC图像；A：肠化生；B：胃腺癌。

图2是CD45和PanCK为细胞形态学标记的背景下得到的肠化生-癌差异基因火山图；A是CD45为细胞形态学标记，B是PanCK为细胞形态学标记。

图3是免疫组化实验鉴定JUN在肠化生组织和胃癌组织中表达情况的结果图。

图4是JUN在肠化生-胃癌组间差异统计分析结果图。

图5是在人肠化生-胃癌组织中JUN免疫组化半定量分析结果绘制的ROC曲线。

图6是在人肠化生-胃癌组织中JUN、ETS2和RPL8免疫组化半定量分析结果绘制的ROC曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

实施例1、通过数字空间分析技术平台筛选差异基因

1、实验材料

临床序贯人胃粘膜肠化生组织8例

数字空间分析(GeoMx Digital Spatial Profiler，DSP)技术平台

2、实验方法

2.1临床样本收集

病例样本收集：以望京医院为中心单位，联合各个分中心单位，基于临床医生、病理学专家、临床患者、就诊系统等多途径收集肠化生患者。根据肠化生结局分组如下：

肠化生-肠化生(好肠化组)：肠化生后的时间点依然保持肠化生(5年以内未进展)；

肠化生-胃癌(坏肠化组)：肠化生后的时间点进展为胃黏膜上皮内瘤变或胃癌；

共纳入2组，每组4例，共8例。所选组织均为10％的中性缓冲福尔马林固定的石蜡包埋组织。

2.2DSP技术平台分析

胃粘膜肠化生序贯组织样本切片制备。切片厚度为5μm，推荐使用新鲜切片，如需要保存，保存时间不能超过14天；如果样品表面暴露于空气中，最初的2-3片弃掉不用；3year-old FFPE blocks；组织切片须放置于玻片上的有效位置内(长35.3mm×宽14.1mm)，若每张载玻片上有多个切片，请确保组织间隔至少2–3mm，具体放置情况可根据组织大小确定；推荐使用阳离子防脱片(SuperFrostTM Plus载玻片)来制备切片，以防出现组织脱落。质控合格后使用。

石蜡组织切片及HE染色：石蜡切片脱蜡，梯度酒精水化；蒸馏水洗；苏木素染8min，自来水洗，1％的盐酸酒精分化3-5秒，自来水冲洗，0.6％氨水返蓝，流水冲洗；伊红染色1-3min；梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片；免疫组织化学染色：常规组织固定、脱水、包埋、石蜡切片，65℃烤片1h，脱蜡、水化，酶修复法进行抗原修复，细胞样本95％乙醇充分固定，3％过氧化氢孵育10min，PBS洗2次，一抗孵育30min，PBS洗2次，二抗孵育20min，PBS洗2次，DAB染色，自来水冲洗，复染，脱水，透明，封片；

病理HE载玻片备用，启用DSP分析平台，RNA探针原位杂交孵育，形态学markers染色，加载仪器并设置；将载玻片装入仪器，识别载玻片，定义扫描区域，可选择ROIs，点击“Approve ROIs”进入UV切割，通过毛细管针将切割后的oligos收集到孔板中；NGS文库制备和质控；测序文库构建质控，对Oligo进行Illumina测序定量。获取好肠化和坏肠化的差异基因，进行生信分析。

2.2关键差异基因筛选

通过DSP分析平台得到好肠化和坏肠化组的差异表达基因，标记基因的筛选条件为：adjusted p-value<0.05；Log2(fold change)>1.2。

3、实验结果

图1是基于DSP技术获取肠化生－胃癌的细胞形态学标记图像与对应的IHC图像。A.肠化生：该列的图片依次为肠化生的HE图像、基于DSP技术获取的同部位形态学标记图像、CD45形态学标记图像、PanCK形态学标记图像；B.胃腺癌：该列的图片依次为胃腺癌的HE图像、基于DSP技术获取的同部位形态学标记图像、CD45形态学标记图像、PanCK形态学标记图像。

分别以CD45(炎症细胞)和PanCK(上皮细胞)为细胞形态学标记的背景基础，筛选获得了CD45/PanCK共同表达的一组肠化生-胃癌的差异基因，其中包括：JUN、ETS2、RPL8。差异基因火山图如图2所示。

表1、CD45、PanCK基础上肠化生-癌的差异基因表

实施例2、分子标志物鉴定实验

1、实验材料

人胃粘膜肠化生组织30例

Anti-JUN Antibody(JUN，博士德生物，BM4168，)

RabbitAnti-ETS2 antibody(ETS2，博奥森生物，bs-5964R)

Anti-RPL8 Antibody(RPL8，博士德生物，A06793-1)

2、实验方法

2.1标本收集

按照实施例1中2.1临床样本收集的标准另收集人胃粘膜肠化生组织30例。样本为根据临床实际诊疗情况，必须行内镜或手术用于诊断或干预治疗肠化生/胃癌患者所留取的肠化生/胃癌病变组织。

2.2免疫组化染色及判读

常规组织固定、脱水、包埋、石蜡切片，65℃烤片1h，脱蜡、水化，酶修复法进行抗原修复，细胞样本95％乙醇充分固定，3％过氧化氢孵育10min，PBS洗2次，一抗孵育30min，Anti-Aggrecan Antibody稀释浓度为1:50，PBS洗2次，二抗孵育20min，PBS洗2次，DAB染色，自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。封片后使用显微镜观察染色结果。

切片的病理学结果由两名经验丰富的病理学家双盲阅片，并使用共识解释作为最终的结果。不同的结果由第三位病理学家裁决。

2.3ROC曲线

随机对每张免疫组化切片进行3个视野的随机采图，每个视野在10X镜下被拍摄。通过image pro plus软件分析每张切片3个随机视野的JUN、ETS2+阳性细胞数，将细胞总数进行统计分析；RPL8+阳性表达的积分光密度采用3个随机视野的平均值。病理学结果由两名病理学家独立分析，并使用共识解释作为最终的结果，不同的结果由第三位病理学家裁决。

采用spss软件通过平均值对人肠化生-胃癌组织变绘制ROC曲线，计算AUC曲线下面积和阈值，评价新发现的肠化生-胃癌特征性基因JUN和标志物组合对肠化生病变程度的诊断价值。

3、实验结果

3.1免疫组化实验结果

通过免疫组化(IHC)实验鉴定JUN在人胃粘膜肠化生-胃癌组织中的表达趋势。

可见胃癌组较肠化生组JUN阳性细胞的数量明显增多，肠化生组阳性细胞约占总细胞的10-30％，胃癌组阳性细胞约占总细胞的50-70％。也即，JUN在肠化生组呈低表达，在胃癌组呈高表达。结果如图3所示。

3.2 ROC曲线分析

组间统计学差异见图4，JUN在肠化生组与胃癌组的表达相比(L/H)存在显著差异P＝0.0002，P<0.001，H代表胃癌高表达组L代表肠化生低表达组。免疫组化半定量分析结果及其ROC曲线如图5。联合其他标志物(ETS2和RPL8)进行检测，ROC曲线如图6所示。ROC曲线参数如表2所示。

表2、JUN和标志物组合的ROC曲线参数

结果表明JUN和标志物组合是能够区分肠化生-胃癌病变的生物标志物，尤其在区别诊断肠化生类型和极早期胃癌中存在价值。

Claims (10)

1.检测JUN表达量的试剂在制备判断肠化生是否会进展为胃癌的产品中的应用。

2.如权利要求1所述应用，所述产品包括试剂盒、芯片、系统或装置。

3.如权利要求2所述应用，所述试剂盒包括免疫组化检测试剂盒、免疫印迹检测试剂盒、免疫层析检测试剂盒、流式细胞分析试剂盒、PCR试剂盒、ELISA试剂盒。

4.如权利要求2所述应用，所述的芯片包括基因芯片、蛋白芯片；

优选地，所述芯片包括固相载体以及固定在固相载体的探针。

5.如权利要求1所述应用，所述检测试剂包括检测mRNA表达量的试剂和/或检测蛋白表达量的试剂；

优选地，所述检测蛋白表达量的试剂包括特异性靶向目标蛋白的抗体；

优选地，所述检测mRNA表达量的试剂包括特异性扩增所述生物标志物的引物，特异性识别所述生物标志物的探针。

6.如权利要求1所述应用，所述JUN的表达量是针对来自于受试者样本进行检测而得到的；

优选地，所述样本是组织；

更具体地，所述组织包括内镜或手术所留取的肠化生组织；

优选地，所述组织包括通过石蜡包埋方法进行保存的组织。

7.如权利要求6所述应用，所述受试者为人，更具体地，是肠化生患者；

优选地，所述产品中还包括检测RPL8和/或ETS2表达量的试剂。

8.用于执行一种判断方法的系统，所述系统至少执行以下的步骤：

1)接受所输入的受试者数据，包含来自所述受试者的样本中生物标志物的表达水平值；

2)分析生物标志物的水平并与阈值相比，若所述受试者的生物标志物的水平高于未患病的对照受试者的参考值范围提示所述受试者会进展为胃癌；

3)输出步骤2)的判断结果；

所述方法是判断肠化生是否会进展为胃癌的方法，所述生物标志物包括JUN；

优选地，所述生物标志物还包括ETS2和/或RPL8。

9.如权利要求8所述系统，所述系统包含以下设备：

1)用于存储数据的存储组件，其中所述存储组件中存储进行判断肠化生是否会进展为胃癌的判断指令；

2)用于处理数据的计算机处理器，其中所述计算机处理器接受存储组件的指令，并进行判断；以及

3)显示器组件。

10.如权利要求8所述设备，所述受试者为人，更具体地，是肠化生患者。