CN111996252A

CN111996252A - Dyrk2基因在制备胃癌药物及其诊断试剂盒中的应用

Info

Publication number: CN111996252A
Application number: CN202010601594.7A
Authority: CN
Inventors: 黄剑飞; 张筱静
Original assignee: Affiliated Hospital of Nantong University
Current assignee: Affiliated Hospital of Nantong University
Priority date: 2020-06-28
Filing date: 2020-06-28
Publication date: 2020-11-27
Anticipated expiration: 2040-06-28
Also published as: CN111996252B

Abstract

本发明公开了DYRK2基因在制备胃癌药物及其诊断试剂盒中的应用，属于癌症精准医疗药物技术领域。本发明公开了DYRK2基因是胃癌精准医疗的一个诊疗靶点，所述的药物针对该靶点设计而成。本发明利用胃癌临床样本，免疫组化证实，DYRK2在胃癌中表达降低，经生存分析发现DYRK2表达较高的患者预后较好；通过体外细胞实验发现DYRK2在胃癌发生发展中的作用，表明它具有抑制胃癌细胞增殖、侵袭和迁移的功能；本发明还发现DYRK2基因与EMT相关。因此DYRK2可以作为胃癌基因诊疗的靶点，在制备精准医疗的诊断试剂盒和制备用于治疗胃癌药物中具有广泛的应用。

Description

DYRK2基因在制备胃癌药物及其诊断试剂盒中的应用

技术领域

本发明属于癌症精准医疗药物技术领域，更具体地说，涉及DYRK2基因在制备胃癌药物及其诊断试剂盒中的应用。

背景技术

胃癌(GC)是一种侵袭性癌症，是世界范围内的重要癌症，也是全球临床挑战的一大负担。2018年新增病例超过100万例，其中中国，蒙古，日本和韩国所占比例较大，且大约有783，000例死亡(相当于全球每12例死亡1例)，使其成为第五大常见癌症和癌症死亡的第三大原因。胃癌是男性癌症相关死亡率的第四大原因，也是全球女性死亡率居第五位的主要原因。据估计，80％-90％的GCs是腺癌，可以根据其组织学特征分类为分化(肠)或未分化(弥漫)类型(Lauren分类)。分化型相对发生率约为54％，在老年男性中更常见，并且发展缓慢，而弥漫型在年轻女性中更常见并且预后较差。手术仍然是局部胃癌的唯一治疗方法，而围手术期和辅助化疗以及放化疗可以改善预后。基于顺铂和氟嘧啶的化疗，在人表皮生长因子受体2阳性患者中加入曲妥珠单抗，是IV 期患者广泛使用的治疗方法。而对于具有良好表现状态的患者而言，二线化疗是一个很好的选择。目前，临床上胃癌仍普遍存在预后不良的情况，通常就诊时胃癌可能就已经发生转移，因此探索和发现敏感性及特异性强的生物标志物对胃癌的诊断和治疗具有重要意义。

DYRK2属于进化保守的双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶(dual specificitytyrosine-phosphorylation-regulated kinases，DYRKs)家族，是蛋白质激酶CMGC 组的一部分。DYRK2包含一个保守的激酶结构域和一个相邻的N端DYRK同源性框。DYRK2在激活环中自磷酸化一个关键的酪氨酸残基，并在丝氨酸和苏氨酸残基上将其底物磷酸化。一旦DYRK2完全翻译并从核糖体中释放出来，酪氨酸激酶的过渡活性就丧失了，DYRK2随后仅起丝氨酸/苏氨酸激酶的作用。 DYRK2在各种信号传导途径中起作用，包括脑和免疫系统中的NFAT信号传导， Hedgehog信号传导途径，低氧反应途径和对DNA损伤的p53激活。此外，DYRK2的下调与高水平的未磷酸化c-Jun和c-Myc有关，并且对人类乳腺癌的侵袭性很重要。DYRK2也参与snail的降解，并促进卵巢浆液性癌的上皮-间质转化。且有研究表明DYRK2的过表达可以抑制肝癌癌细胞的生长。根据现有文献，DYRK2在胃癌中的表达情况、生物学功能、以及临床病理参数之间的关系尚未有清晰的报道。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种 DYRK2基因在制备用于胃癌诊断的试剂盒中的用途。本发明所要解决的另一技术问题在于提供一种DYRK2基因在制备用于治疗胃癌的药物中的用途。

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

DYRK2基因在制备用于胃癌诊断的试剂盒中的用途。

DYRK2基因在制备用于治疗胃癌的药物中的用途。

进一步地，所述治疗胃癌的药物具有上调胃癌细胞中DYRK2基因表达的作用。

DYRK2基因在制备用于胃癌判断预后的诊断试剂盒中的用途。

进一步地，所述胃癌判断预后的诊断试剂盒以DYRK2基因为靶点设计而成。

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

与现有的技术相比，本发明委托生物样本库制备成组织芯片，利用免疫组化技术检测胃癌中DYRK2的表达情况，结果提示DYRK2的表达在癌旁正常组织中明显高于胃癌组织，且经过统计DYRK2高表达组患者的预后较好。另外经过Western blot、Transwell、CCK8、划痕等体外实验，利用shRNA抑制 DYRK2基因表达来研究对胃癌细胞生物学行为的影响；发现特异性的shRNA 序列可以有效抑制人胃癌细胞株MKN1中DYRK2蛋白的表达，并明显升高细胞的增殖、侵袭、迁移能力，相反DYRK2过表达的人胃癌细胞株HGC27细胞的增殖、侵袭、迁移能力明显降低；本发明还发现DYRK2基因与EMT相关。因此DYRK2可以作为胃癌基因诊疗的靶点，在制备精准医疗的诊断试剂盒和用于治疗高表达DYRK2的胃癌中具有广泛的应用。

附图说明

图1是IHC检测DYRK2在胃癌及癌旁组织中的表达图：a-b.弥散型胃癌组织及其软件判读后的结果；c-d.良性胃粘膜组织及其软件判读后的结果(棕褐色为3，橘黄色为2，浅黄色为1，蓝色为0)；a及b图中蓝色为主，仅极少量浅黄色、橘黄色，c及d图中黄色、橘黄色和棕褐色为主，蓝色极少量；

图2是DYRK2表达情况、胃癌分期、患者年龄与胃癌患者预后的关系图；

图3是五种胃癌细胞株中DYRK2的表达情况比较图；

图4是不同序列shRNA对DYRK2的抑制效率图；

图5是HA-DYRK2对DYRK2的过表达效率图；

图6是CCK-8实验研究抑制、增加DYRK2的表达对细胞增殖的影响图；

图7是Transwell侵袭实验研究抑制、增加DYRK2的表达对细胞侵袭的影响图；

图8是划痕实验研究抑制、增加DYRK2的表达对细胞转移的影响图；

图9是抑制、增加DYRK2对EMT相关分子的影响图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

以下实施例中使用的主要试剂为：DAB染色液(增强聚合物法)试剂盒(免疫组化试验用，福州迈新生物技术开发公司)；鼠抗人DYRK2单克隆抗体(免疫组化试验用，RD公司)；酶标抗小鼠/兔IgG聚合物(免疫组化试验用，福州迈新生物技术开发公司)；免疫染色一抗稀释液(上海碧云天生物技术有限公司)；柠檬酸组织抗原修复液(100X)(福州迈新生物技术开发公司)；内源性过氧化物酶阻断剂(福州迈新生物技术开发公司)；反应增强液(福州迈新生物技术开发公司)；二甲苯(常熟市鸿盛精细化工有限公司)、中性树胶(国药集团化学试剂有限公司)。DAB工作液(稀释液∶染色液∶DAB浓缩液为20∶1∶1)；人胃癌细胞株GES1，SNU719，MKN1，MKN45，HGC27(购自南京科佰生物科技有限公司)；1640培养基、胎牛血清(美国Gibco公司)；BCA蛋白测定试剂盒 (赛默飞世尔科技有限公司)；细胞冻存液(苏州新赛美公司)；PBS(福州迈新生物技术开发公司)；PVDF膜(Westernblot试验用，Bio-Rad公司)；兔抗人DYRK2 单克隆抗体(Westernblot试验用，CST公司)；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG (Westernblot试验用，proteintech公司)；ECL发光试剂盒(苏州新赛美公司)；LipFiter3.0(汉恒生物科技有限公司)。PMI-1640完全培养液：RPMI-1640与胎牛血清以9∶1比例混合，4℃保存。1×TBST 1L：Trisbase 1.211g，NaCl 8.76g 溶于800mL超纯水中，然后调节pH至7.5，定容至1 L，最后加入500μL吐温20。1×转膜液：14.4g甘氨酸、3.03gTris-base溶于700mL ddH₂O中，然后调pH至8.3，加200mL甲醇，最后定容至1L。封闭液100mL：取脱脂奶粉5g，加入100mL 1×TBST，混合溶解即可(需用时配制)。

以下实施例中使用的主要仪器如下：组织芯片系统(UT06，韩国，Unitma 公司)；倒置显微镜(DMIRB，德国，Leica公司)；化学发光凝胶成像系统(中国，上海天能科技有限公司)；全自动酶标仪(SN209941，美国，Bio-Tek公司)；电泳系统(美国，Bio-RadLaboratories公司)；二氧化碳水套式培养箱 (HEPACLASS 100，美国，ThermoFisher公司)；pH计(EL20，瑞士，Mettler Toledo 公司)。

实施例1：

2007-2017年间，从南通大学附属医院临床生物库获得了558份福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织样本，包括13例慢性胃炎(CG)，31例肠上皮化生(IM)， 46例上皮内肿瘤，407例胃癌和85例正常手术切缘。没有癌症患者接受任何治疗，包括放射疗法，化学疗法或免疫疗法，临床病例资料详细完整。该研究方案已得到中国南通大学附属医院人类研究伦理委员会的批准。

免疫组织化学法标本：407例胃癌组织中，性别女113例，男294例；年龄低于60岁的161例，超过60岁的246例；肿瘤分级：高分化和中分化的胃癌组织为130例，低分化的胃癌组织为222例，混合型的胃癌组织53例，其他类型 2例；TNM分期：0-I期93例，II期137例，III期147例，IV期30例。所有组织标本均用10％中性福尔马林固定，石蜡包埋，并筛选出无明显缺陷的蜡块，做成厚度为4mm的组织芯片，置于4℃储存备用。

1、组织芯片的制作：

(1)根据HE切片的镜下观察结果，对蜡块中有代表性的癌巢区域进行标记。

(2)石蜡与蜂蜡1∶1混合，制作成TMA空白受体蜡块。在蜡块上设计10×7 点组织陈列，然后用组织芯片仪打孔制成TMA空白蜡块。

(3)将供体蜡块在标记的点上选取最有代表性的癌巢区域，采集直径2mm 的组织块，每例各取1个芯。

(4)将取好的组织芯转移到受体蜡块的孔中，每个组织芯之间间隔一定的距离，并取相应癌旁组织做对照。

(5)组织阵列块放入55℃的温箱中加热融合10分钟，在蜡块快融化之前取出放至室温冷却，使受体蜡块与供体组织融为一体。

(6)切片前，将组织芯片置于4℃条件下预冷4小时左右，随后用全自动组织切片机对组织阵列块进行修正，速度为20mm/转，等修到全部组织完整为止。

(7)用切片机对组织阵列块进行切片，将连续切片分别漂在凉水中，使其自然展开，再将切片转移至45℃的温水中展片2分钟左右，待展开后将其贴在经过防脱片处理的载玻片上晾干。

(8)将切片置于60℃的中烤片3分钟，58℃继续烤片18h。

(9)将做好的组织芯片保存于切片盒，置于-20℃保存备用。

2、免疫组化染色

(1)首先将组织芯片放于60℃恒温烘箱中烘烤约40min至石蜡熔化；

(2)立即将芯片放入二甲苯I，二甲苯II，100％乙醇I和100％乙醇II中，各浸泡5分钟，接着再依次放入95％乙醇，90％乙醇，80％乙醇和70％乙醇中，各浸泡2分钟，再用清水冲洗；

(3)提前在免疫组化盒中放入抗原修复液，并通过水浴法，预热到95℃，然后将芯片放入容器中，接着95℃处理20分钟进行抗原修复，然后自然冷却至室温，再用PBS冲洗3次，每次5分钟；

(4)然后用免疫组化笔在芯片上的组织周围画上边界线，接着在圈内部滴满3％H₂O₂，孵育10min，然后用PBS洗3次，每次5分钟；

(5)滴加一抗(鼠抗人DYRK2单克隆抗体)，4℃孵育过夜；

(6)在室温下复温1小时，去除一抗，PBS冲洗3次，每次5分钟，滴加聚合物增强剂，室温孵育20min；然后用PBS洗3次，每次5分钟；

(7)滴加二抗(酶标抗小鼠/兔IgG聚合物)，室温孵育30min，然后用PBS 洗3次，每次5分钟；

(8)滴加新鲜配置的DAB试剂，显色后将芯片放于自来水下冲洗5分钟终止显色；

(9)将芯片放于苏木素染色2分钟，并立即用流水缓慢冲洗，然后放入 0.5％HCl-乙醇溶液中，浸泡2分钟，最后流水冲洗15分钟；

(10)把芯片依次在80％乙醇，90％乙醇，95％乙醇，100％乙醇I，100％乙醇II，二甲苯中浸泡1分钟，并在通风橱中自然风干；

(11)最后用中性树胶封片。

3、结果判断：

首先由定量软件(Vectra 3.0)进行染色的定量，然后由病理学家验证和校正所有评分数据和图谱。将染色强度划分为0(-，蓝色)，1(+，浅黄色)，2(+ +，棕黄色)和3(+++，棕褐色)，染色强度和该强度的细胞所占百分比(0％～ 100％)的乘积为最终得分(0～300)。随后，用X-tile软件通过特定的截止阈值将蛋白表达相关数据转换成二分数据(低和高)，0～126为低表达或无表达，127 ～300为高表达。接着用STATA软件进行卡方检验统计临床参数与目的基因之间的关系，同时使用SPSS22.0进行单因素分析和多因素分析方法评估胃癌患者的预后价值，所有检验结果P＜0.05为差异有统计学意义。

407例胃组织切片标本行免疫组化染色，DYRK2蛋白阳性主表达于癌旁组织的细胞质中，呈棕黄色，而大部分胃癌组织低表达或无表达，见免疫组化照片 (图1中a-b为阴性，c-d为阳性)。免疫组化染色结果显示胃癌组织DYRK2蛋白表达阳性率为34.89％(142/407)，癌旁组织表达阳性率62.35％(53/85)，慢性胃炎表达阳性率84.62％(11/13)，肠化表达阳性率为77.42％(24/31)，低级别上皮内瘤变阳性率为52.63％(10/19)，高级别上皮内瘤变为55.56％(15/27)，，六者比较差异显著，有统计学意义(P＜0.001)(表1)。Kaplan-Meier生存曲线显示DYRK2高表达组比DYRK2低表达组总体生存率高(图2)*P＜0.05。

表1.DYRK2在胃癌组织及良性组织中的表达

a，手术切缘为胃癌患者的正常手术切缘组织，无肠上皮化生或上皮内瘤变。

*p＜0.05

可见，DYRK2蛋白的表达癌旁组织中明显高于胃癌组织。DYRK2高表达患者较低表达患者预后好。

实施例2：

1、shRNA设计

选用人DYRK2(GENE ID：8445)的四段不同的shRNA序列及阴性对照 shRNA(negative control，NC)，由广州复能基因有限公司设计并完成，序列如下：

shRNA#1：5′-CCTTCGAACACCATGAGATTT-3′；在基因上的位置1081-1101；

shRNA#2：5′-GGACAAGGATAACACAATGAA-3′；在基因上的位置466-486；

shRNA#3：5′-GGTAGAAGCGGTATTAAAGTA-3′；在基因上的位置759-779；

shRNA#4：5′-GCACACAATGAATGATCACCT-3′；在基因上的位置1331-1351；

NC：5′-ACGTGACACGTTCGGAGACATT-3′。

2、细胞(GES1、MKN1、MKN45、SNU719、HGC27)复苏：

(1)细胞培养室常规消毒，将复苏所需用品放入超净台紫外照射30min；

(2)水浴锅升温至37℃待用；

(3)将冻存的细胞从液氮罐中迅速取出，立即放入37℃的水浴锅中迅速晃动，在1min之内快速融化；

(4)将细胞小心吸入15mL的离心管中，加入PBS，吹打混匀，800r/min， 3min离心；

(5)弃去上清，加入5mL的1640完全培养基，充分吹打细胞，移入培养瓶中，放入培养箱培养，次日换液；

3、细胞传代培养：

(1)从培养箱中取出细胞，在显微镜下分别用低倍镜、高倍镜观察细胞形态，细胞密度；

(2)细胞培养室常规消毒，将细胞传代所需用品放入超净台紫外照射30min；

(3)弃去培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞，加入适量的胰酶消化细胞，镜下观察细胞形态，待贴壁细胞变圆并慢慢开始脱落，用完全培养基终止胰酶的消化作用，并吹打下贴壁细胞，并转入15mL的离心管中，800r/min，3min离心；

(4)离心后，弃去上清，加入1640完全培养基，充分吹打混匀细胞，按分配好的体积移入新培养瓶中，显微镜下观察细胞密度，放入培养箱培养。

4、细胞计数法：

(1)待细胞长成待实验用时，消化细胞，制备成细胞悬液；

(2)取10μL细胞悬液与10μL台盼蓝混合，取10μL混合液滴于计数板上；

(3)把计数板插入计数仪计数，得出细胞密度(个/mL)；

5、细胞冻存：

(1)保证细胞在冻存前状态良好，需在冻存前12h换液；

(2)细胞培养室常规消毒，将细胞冻存所需用品放入超净台紫外照射30min；

(4)离心后，弃去上清，加入1mL的冻存液，吹打混匀移入冻存管中，用封口膜裹好，放入液氮罐中长期保存；

6、Western Blot分别筛选DYRK2高、低表达细胞系

(一)蛋白质提取：

(1)从培养箱中取出细胞后置于冰上，去除培养基，并用预冷的PBS清洗细胞，并弃PBS；

(2)加入裂解液(含蛋白酶抑制剂)，裂解细胞，用刮刀刮下细胞后，转移至1.5mLEP管中；

(3)冰上静置5分钟，涡旋30秒，重复3次；

(4)4℃，离心10min，转速12000g；

(5)吸取上清，移至新的EP管中，BCA法测浓度，配置上样体系，于-20 ℃储存。

(二)SDS-PAGE电泳：

(1)配胶：将玻璃板清洗干净，倾斜晾干。组装玻璃板，用去离子水进行验漏，验漏结束后在组装的玻璃板中加入10％分离胶，大约加至距玻璃板上端2 cm处，立即加异丙醇液封，放置30min，等分离胶凝固后轻轻倒掉上层异丙醇，再加入浓缩胶至玻璃板顶部，立即插入梳子，静置1h，至浓缩胶凝固；

(2)电泳：从-20℃取出蛋白样品，待自然融化后，于95℃煮5min，冰上冷却后上样。电泳槽中放入安装好的凝胶，槽中加入新鲜的电泳液，拔去梳子，冲洗泳道，并依次在孔中加入蛋白样品及蛋白marker。电泳程序设置为，80V 条件下进行45min，而后在110V条件下进行，待溴酚蓝染料跑至板子底部时，关闭程序停止电泳。

(3)转膜：根据胶的大小，剪取一样大小的PVDF膜，先将其置于甲醇中 30s，再置于预冷的转膜液中备用，海绵垫和滤纸也一同放入转膜液中备用。在转膜夹中，从正极到负极(黑→白)依次放置：海绵垫→滤纸→凝胶→PVDF膜 →滤纸→海绵垫，注意去除胶与膜之间的气泡，夹紧转膜夹，并放置于转膜槽中，加入预冷的转膜液与冰盒，并使整个转膜槽置于冰块中，连接电源，按0.35A 恒流90min的条件进行转膜。

(4)封闭：转膜结束后立即取出PVDF膜，浸泡于由TBST配置的含5％脱脂牛奶的封闭液中，室温封闭60min。用PBST洗膜3次，每次5分钟。

(5)孵一抗(兔抗人DYRK2单克隆抗体)：在抗体孵育盒中倒入一抗，然后把PVDF膜放入对应的盒子中，置于摇床上，4℃过夜。

(6)孵二抗(辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG)：将抗体孵育盒从4℃取出，室温复温30min，用PBST洗膜3次，每次5分钟。室温孵育二抗1小时，用PBST洗膜3次，每次5分钟。配置ECL显影液，并均匀滴加在PVDF膜上，通过成像系统显影并保存图像。

(三)胃癌细胞的筛选：

(1)提取胃癌细胞的蛋白；

(2)用Western Blot检测DYRK2蛋白的表达情况，筛选出高、低表达细胞；

(3)Westernblot检测结果表明DYRK2蛋白在MKN1细胞中表达最高，在 HGC27细胞中表达量最低(图3)。

7、细胞转染

(一)转染效率的判定：

(1)提前一天将对数生长的细胞消化、收集、离心重新按实验所需要的密度接种在六孔板中；

(2)16h左右，取出六孔板观察细胞形态，当细胞状态良好，密度为60％-70％时继续下一步试验；

(3)以250μL RPMI-1640稀释0μL、3μL、5μL、7μL LipFiter3.0，轻轻混匀；

(4)以250μL RPMI-1640分别稀释0μg、3μg、5μg、7μg的shRNA，轻轻混匀；

(5)室温孵育5min后，混合稀释的shRNA和稀释的LipFiter3.0(shRNA/μg：LipFiter3.0/μL＝1∶1)，在室温下孵育20min，使形成shRNA-LipFiter3.0复合物；

(6)弃去6孔板内旧培养液，用PBS清洗一遍，每孔加1.95mL不含双抗的RPMI-1640完全培养基，随后将shRNA-LipFiter3.0复合物加入到六孔板中，呈“十”字型轻轻摇动培养板，使液体充分混匀，而后把六孔板放入培养箱；

(7)4-6h之后，更换新鲜的完全培养基，继续放入培养箱中培养；

(8)24和48h后，在荧光显微镜下，观察转染效率，选择转染效率最佳时的shRNA浓度。结果显示，5μg的shRNA的转染效率最高，大约为80％，故后续的实验检测选择的shRNA浓度为5μg。

(二)shRNA-DYRK2转染MKN1：

(1)实验分组DYRK-shRNA#1组，DYRK2-shRNA#2组，DYRK2-shRNA#3 组，DYRK2-shRNA#4组，阴性对照(NC)组；

(2)转染前一天，取对数生长期的MKN1细胞按2～3×10⁴/孔的密度接种在六孔培养板上，加入2mL RPMI-1640完全培养基(含10％胎牛血清)，置于培养箱中培养；

(3)待细胞密度达60％-70％时进行下一步；

(4)以250μL RPMI-1640稀释5μL LipFiter3.0，轻轻混匀；

(5)以250μLRPMI-1640稀释5μg的shRNA，轻轻混匀；

(6)室温孵育5min后，混合稀释的shRNA和稀释的LipFiter3.0，在室温下孵育20min，使形成shRNA-LipFiter3.0复合物；

(7)弃去6孔板内旧培养液，用PBS清洗一遍，每孔加1.95mL不含双抗的RPMI-1640完全培养基，随后将shRNA-LipFiter3.0复合物加入到六孔板中，呈“十”字型轻轻摇动培养板，使液体充分混匀，而后把六孔板放入培养箱；

(8)4-6h之后，更换新鲜的完全培养基，继续放入培养箱中培养；

(9)转染72h后提取细胞总蛋白进行Western Blot。

(三)Western Blot筛选转染效率最高的一组shRNA：

(1)按上述方法分别提取DYRK2-shRNA-1组、DYRK2-shRNA-2组、 DYRK2-shRNA-3、DYRK2-shRNA-4组和，阴性对照组细胞的蛋白；

(2)用Western Blot检测DYRK2的表达情况；

(3)筛选出转染效率最高的一组shRNA用于后续的细胞实验。

Western Blot法检测四个不同的shRNA序列对MKN1细胞DYRK2蛋白表达的干扰效率显示：DYRK2-shRNA-4在转染后48小时对MKN1细胞的干扰效率最佳，以此作为后续研究的shRNA(DYRK2-shRNA-4后续简称DYRK2-shRNA) (图4)。

(四)HA-DYRK2转染HGC27细胞

(1)实验分组：Mock、Ctrl和HA-DYRK2。

(2)转染前一天，取对数生长期的HCG27细胞按2～3×10⁴/孔的密度接种在六孔培养板上，加入2mL RPMI-1640完全培养基(含10％胎牛血清)，置于培养箱中培养；

(3)待细胞密度达60％-70％时进行下一步；

(4)以250μL RPMI-1640稀释5μL LipFiter3.0，轻轻混匀；

(4)以250μL RPMI-1640稀释5μg的HA-DYRK2质粒，轻轻混匀；

(5)室温孵育5min后，混合稀释的HA-DYRK2质粒和稀释的LipFiter3.0，在室温下孵育20min，使形成HA-DYRK2-LipFiter3.0复合物；

(6)弃去6孔板内旧培养液，用PBS清洗一遍，每孔加1.95mL不含双抗的RPMI-1640完全培养基，随后将HA-DYRK2-LipFiter3.0复合物加入到六孔板中，呈“十”字型轻轻摇动培养板，使液体充分混匀，而后把六孔板放入培养箱；

(8)转染72h后提取细胞总蛋白进行Western Blot。

Western blot实验验证HA-DYRK2对HGC27细胞中DYRK2表达的升高效率。结果显示转染HA-DYRK2(后续简称DYRK2-OE)的细胞，DYRK2的表达较Mock和Ctrl组明显上升(图5)。

8、CCK8法观察细胞增殖能力

(1)通过消化收集转染后6-24h的各组细胞，待用；

(2)将细胞密度调整至每组一致，每孔种入5000个细胞，每组设置3个复孔，轻轻拍打培养板，使细胞均匀分布；

(3)细胞贴壁完全后的0h，24h，48h，72h，每孔分别加入10μL CCK-8 试剂，轻轻拍打培养板，放入培养箱2h后取出，用酶标仪检测450nm下的吸光度值，注意酶标仪的线性范围；

(4)分析数据，绘制折线图。

转染48小时后，转染DYRK2-shRNA#4的细胞与转染NC组相比，生长增殖能力明显增强，提示抑制DYRK2表达提高MKN1细胞的增殖能力；转染 HA-DYRK2的HGC27细胞与转染NC组相比生长增殖能力增强，提示过表达 DYRK2可以减弱HGC27细胞的增殖能力(图6)。

9、Transwell观察细胞侵袭能力

(1)将小室放置于24孔板内，将50μL稀释后的基质胶(基质胶与基培混合比为1∶6)沿小室侧壁加入上室，小心加入避免产生气泡，放入培养箱培养5 h；

(2)消化并收集转染后6h的各组细胞，待用；

(3)用基培重悬细胞，计数；

(4)在小室的上室中种入等量细胞：200μL HGC27(密度：4×10⁵个/mL) 或MKN1(密度：2.5×10⁵个/mL)，下室放入含10％胎牛血清的1640基培；

(5)在37℃培养48h后取出，PBS轻轻洗一下；

(6)在24孔板中加入4％的多聚甲醛，小室放入24孔板中，固定15min， PBS轻轻洗一下；

(7)结晶紫染色15min，用PBS洗2次，用棉签轻轻擦拭上室，以去除没有穿过去的细胞；

(8)用倒置显微镜拍照，统计。

(9)计数每张膜的中央部分和周围部分随机3个视野，实验重复三次，计算平均值。

(10)分析数据

计数结果显示，DYRK2抑制组的MKN1细胞与NC组相比，穿过Transwell 小孔细胞数较多，细胞的侵袭能力增强；DYRK2过表达组的HGC27与NC组相比，穿过Transwell小孔细胞数变少，细胞的侵袭能力减弱(图7)。

10、划痕实验验证DYRK2表达改变对MKN1和HGC27细胞迁移能力的影响

(1)用记号笔在6孔板背面画直线做标记；

(2)种细胞于6孔板中并进行转染，待转染约24h且细胞均匀铺满6孔板后，在培养板上方放置直尺，且直尺垂直于6孔板背面的记号，沿直尺用10μL 枪头在皿底划痕，力度保持均匀一致；

(3)去掉皿中培养基，并PBS轻轻冲洗掉细胞碎片，加入含5％胎牛血清的1640培养基，拍照记录，继续培养细胞；

(4)24小时后继续拍照记录；

(5)分析数据。

24h后观察发现，DYRK2抑制组的MKN1细胞与NC组相比，愈合更快； DYRK2过表达组的HGC27与NC组相比，愈合得更慢(图8)。以上实验结果均重复三次，结果有统计学意义。

实例3：DYRK2蛋白表达与EMT的关系

Western Blot研究DYRK2表达与EMT的关系

(1)细胞转染分四组：NC、DYRK2-shRNA和NC、DYRK2-OE(转染过程同实施例2中“7、细胞转染”所述)。

(2)转染的细胞常规取蛋白存放于-20℃，以备Western Blot实验用。

Western Blot结果显示，过表达DYRK2蛋白水平时，S100A4和N-cadherin 的表达水平降低，而E-cadherin的表达增加，相反，当DYRK2表达降低时，S100A4 和EMA的表达增加(如图9)，说明DYRK2在EMT的转化过程中发挥重要作用，DYRK2抑制胃癌的EMT过程，从而抑制胃癌细胞的侵袭、转移能力。

Claims

1.DYRK2基因在制备用于胃癌诊断的试剂盒中的用途。

2.DYRK2基因在制备用于治疗胃癌的药物中的用途。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述治疗胃癌的药物具有上调胃癌细胞中DYRK2基因表达的作用。

4.DYRK2基因在制备用于胃癌判断预后的诊断试剂盒中的用途。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述胃癌判断预后的诊断试剂盒以DYRK2基因为靶点设计而成。