CN116908457B - Tns2在制备上皮性卵巢癌早期诊断及治疗试剂盒和药物中的应用 - Google Patents
Tns2在制备上皮性卵巢癌早期诊断及治疗试剂盒和药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了TNS2在制备上皮性卵巢癌早期诊断及治疗试剂盒和药物中的应用，属于基因工程技术领域。本发明基于临床治疗上皮性卵巢癌早期诊断治疗难点及TNS2与上皮性卵巢癌之间的密切相关性，通过慢病毒转染构建TNS2稳定敲减的上皮性卵巢癌细胞系，通过细胞生物学方法验证了TNS2在上皮性卵巢癌迁移和侵袭中的作用，为开发卵巢癌早期诊断治疗新的靶标分子提供了新的思路。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及TNS2在制备上皮性卵巢癌早期诊断及治疗试剂盒和药物中的应用。
背景技术
卵巢癌是妇科临床最为致命的肿瘤之一，严重威胁女性的生命健康。卵巢癌仅占女性癌症的3%，它却是女性癌症死亡的第五大原因。上皮性卵巢癌是最常见的卵巢癌类型，其中约70%的病例是在Ⅲ期间或IV期被诊断出来的，导致预后不良。卵巢癌5年后的存活率较低，治愈率和存活率的趋势与目前相比没有明显改变。因此，探究在卵巢癌发生发展中关键调控基因，阐明调节机制，对有效控制卵巢癌的发生发展，提高患者生存率具有重要意义。
癌细胞的扩散是导致癌症患者病情恶化、治疗失败以及患者生存率不高的主要原因之一。癌细胞通过两个不同但相似的过程（称为迁移和侵袭）侵入局部组织并扩散到远处部位，细胞迁移(cell migration)也称为细胞爬行、细胞移动或细胞运动，是指细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的梯度后而产生的移动；细胞侵袭（cellinvasion）是指细胞通过细胞外基质从一个区域迁移到另一个区域的能力。因此，研究癌细胞转移机制并提出新的阻止方法对于癌症治疗具有重要意义。
TNS2（Tensin2）属于粘着斑蛋白家族成员之一，定位于整合素介导的局灶性和纤维性粘连，这些粘连在细胞外基质和细胞骨架之间提供了双向连接。TNS2有三种亚型：V1、V2和V3。它们的多个结构域有利于细胞外基质和细胞骨架网络之间的分子连接，以及介导或参与多种信号转导途径，进而影响肿瘤恶性进程的多种生理过程，包括细胞黏附、侵袭和迁移。
为了及时掌控肿瘤发生发展的情况，特别是对于癌细胞是否扩散进行随时掌握，需要选择合适的药物靶标。TNS2具有作为高价值生物标志物及药物靶标的潜力，在人类乳腺癌（clinical utility of tensin 2 levels as a diagnostic and prognosticbiomarker in breast cancer）、胃癌（immunohistochemical analysis of theexpression ofadhesion proteins: tns1, tns2 and tns3 in correlation withclinicopathological parameters in gastric cancer）中有较为优异的表现。但其是否能成为上皮性卵巢癌治疗的靶标，仍要在如下两个方面进行考量：1. 靶标的有效性，即靶标与疾病确实相关，并且通过调节靶标的生理活性能有效地改善疾病症状。2. 靶标的副作用，如果对靶标的生理活性的调节不可避免地产生严重的副作用，那么将其选作药物作用靶标是不合适的。因此，并不是所有在相关部位具有高表达的基因都可以选为靶标，一种疾病可能会和多个靶标有关，一个靶标也可能与多种疾病关联；即使是选为靶标，其作用可能只是监测，并不一定具有治疗的效果。因此，TNS2能否作为上皮性卵巢癌治疗的靶标分子仍需要进一步考察。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供TNS2在制备上皮性卵巢癌早期诊断及治疗试剂盒和药物中的应用。本发明是基于临床治疗上皮性卵巢癌早期诊断治疗难点及TNS2与上皮性卵巢癌之间的密切相关性，通过慢病毒转染构建TNS2稳定敲减的上皮性卵巢癌细胞系，通过细胞生物学方法验证了TNS2在上皮性卵巢癌迁移和侵袭中的作用，为开发卵巢癌早期诊断治疗新的靶标分子提供了新的思路。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供TNS2基因在制备用于诊断或监测上皮性卵巢癌进展的试剂盒中的应用，所述TNS2基因为如下i）或ii）所示的核酸分子：
i）核苷酸序列是NCBI数据库 中Gene ID: 23371所示的核酸分子；
ii）除i）以外的编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核酸分子。
进一步的，其中所述诊断或监测是检测上皮性卵巢癌的发作、进展、稳定、改善和/或缓和。
进一步的，其中所述上皮性卵巢癌包括浆液性癌、子宫内膜样癌、透明细胞癌和黏液性癌。
本发明的第二方面，提供作为靶标的TNS2基因或TNS2基因编码的蛋白在制备用于治疗上皮性卵巢癌的药物中的应用，所述TNS2基因为如下i）或ii）所示的核酸分子：
i）核苷酸序列是NCBI数据库 中Gene ID: 23371所示的核酸分子；
ii）除i）以外的编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核酸分子；
所述TNS2基因编码的蛋白为如下（A1）或（A2）所示的蛋白质：
（A1）由序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
（A2）在（A1）中所限定的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白。
本发明的第三方面，提供下调TNS2基因表达或抑制TNS2蛋白活性在制备治疗上皮性卵巢癌药物中的应用。
进一步的，所述下调TNS2基因表达的物质包括：shRNA或siRNA。
进一步的，所述 shRNA的序列包括SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。
本发明的有益效果：
在本发明中，我们通过对大量卵巢组织正常样本及肿瘤恶性病理组织样本的研究，发现TNS2在卵巢恶性病理组织样本中的表达水平显著高于正常卵巢组织样本。随后成功构建TNS2-KD（Knock Down）慢性毒转染上皮性卵巢癌细胞系（SKOV3、A2780），通过puromycin筛选出能够显著抑制TNS2蛋白表达水平并稳定表达的TNS2-KD细胞系。发现TNS2被敲减之后，两种卵巢癌细胞系的细胞迁移和侵袭能力减弱。本发明以卵巢上皮细胞癌的治疗为切入点，成功寻找到TNS2这一靶标分子，为开展卵巢癌的临床治疗提供作用。
附图说明
图1是正常和恶性上皮性卵巢病理组织对比统计图，其中A是TNS2在正常和恶性上皮性卵巢病理组织中的表达情况；B是对A中TNS2表达的H-Score进行的统计学分析后的结果；C是TNS2在正常组织和不同分期的恶性病理组织中的表达情况；D是对C中TNS2表达的H-Score进行的统计学分析后的结果。
图2是细胞经慢病毒敲减之后的对比图，其中A是经慢病毒敲减后SKOV3细胞TNS2及β-actin的蛋白表达情况的WB条带代表图；B是经慢病毒敲减后A2780细胞TNS2及β-actin的蛋白表达情况的WB条带代表图；C和D分别是A2780细胞和SKOV3细胞经慢病毒敲减之后进行qRT-PCR检测后对数据进行统计学分析后的结果。
图3是细胞划痕实验实验结果，其中A是细胞划痕实验的结果代表图；B和C分别是SKOV3细胞和A2780细胞对细胞划痕实验的结果使用imageJ进行数据分析后得到的数据进行统计学分析后得到的柱状图。
图4是细胞细胞迁移实验和细胞侵袭实验结果，其中A是进行的transwell迁移实验结晶紫染色后的结果代表图；B和C分别是A2780细胞和SKOV3细胞对transwell迁移实验结果使用imageJ进行数据分析后得到的数据进行统计学分析后得到的柱状图；D是进行的transwell侵袭实验结晶紫染色后的结果代表图；E和F分别是SKOV3细胞和A2780细胞对transwell侵袭实验结果使用imageJ进行数据分析后得到的数据进行统计学分析后得到的柱状图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
TNS2基因序列如NCBI数据库中Gene ID: 23371所示，TNS2基因编码的蛋白序列如SEQ ID NO.1所示，具体参见NCBI数据库以及序列表。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
在实施例的实验中，卵巢正常及病理组织芯片购买自陕西爱维拉生物科技有限公司（芯片编号：Ova-11035）；含有15%胎牛血清、1%青霉素链霉素的MCCOY’S5A培养基（Solarbio）构成SKOV3完全培养基；含有10%胎牛血清、1%青霉素链霉素的1640培养基（gibico）构成A2780完全培养基；A2780无血清培养基购自HyClone,SKOV3无血清培养基购自Solarbio。
实施例1：不同临床组织样本中TNS2表达情况
收集临床正常卵巢组织样本和不同分期的卵巢癌组织样本，进行免疫组化实验检测不同样本中TNS2的表达水平。
通过图1中A和图1中B，可以看出TNS2在病理组织中呈现出高表达的特性。
实施例2：通过细胞实验对TNS2在上皮性卵巢癌中的功能进行进一步鉴定
1.细胞培养
将SKOV3和A2780细胞株复苏后，SKOV3采用SKOV3完全培养基， A2780采用A2780完全培养基，培养条件均为：在培养箱中37℃、5% CO2条件下培养。
2.TNS2-KD稳定表达细胞株构建
构建TNS2-KD和空载的shRNA慢病毒颗粒进行慢病毒转染（SEQ ID NO.2~ SEQ IDNO.4），设置敲减(KD)组和对照组以及空白对照组，将SKOV3和A2870两种细胞分别接种于两个不同的12孔板中，每组设置三个重复，接种密度为4×104个细胞每孔。于37℃、5% CO2培养箱条件下培养过夜后，将三种shRNA慢病毒颗粒T1,T2,T3（SEQ ID NO.5~ SEQ ID NO.7）在病毒MOI=10，polybrene浓度为4μg/ml条件下分别感染24h后更换新鲜培养基（SKOV3完全培养基和A2780完全培养基），培养72h后用puromycin在一周内从1.5μg/ml浓度降低至0.75μg/ml，筛选出可以稳定表达的敲减细胞（T1转染A2780命名为A2780-KD，T3转染SKOV3命名为SKOV3-KD）和空载细胞（A2780-B和SKOV3-B）。
空载的shRNA序列（SEQ ID NO.2）:
ATCTTGTGGAAAGGACGAGGATCCGGACAAGCTTCGAATTCATCGATACTAGTAAGGATCTGCGATCGCTCCGGTGCCCGTCAGTG；
A2780-KD序列（SEQ ID NO.3）:
GGATCCGCATGACCTGACCCGCTTAAATTCAAGAGATTTAAGCGGGTCAGGTCATGCTTTTTTGAATTC；
SKOV3-KD序列（SEQ ID NO.4）:
GGATCCGCACCTCTGCTCTCAGATAATTTCAAGAGAATTATCTGAGAGCAGAGGTGCTTTTTTGAATTC；
shRNA-T1序列（SEQ ID NO.5）：
GGATCCGCATGACCTGACCCGCTTAAATTCAAGAGATTTAAGCGGGTCAGGTCATGCTTTTTTGAATTC
shRNA-T2序列（SEQ ID NO.6）:
GGATCCCACTCTTACCATGCGGAAATTTTCAAGAGAAATTTCCGCATGGTAAGAGTGTTTTTTGAATTC
shRNA-T3序列（SEQ ID NO.7）:
GGATCCGCACCTCTGCTCTCAGATAATTTCAAGAGAATTATCTGAGAGCAGAGGTGCTTTTTTGAATTC；
3.Western Blot检测TNS2蛋白水平表达情况
（1）蛋白提取：①低速离心收集贴壁细胞后用预冷PBS重悬清洗细胞再离心收集细胞，②离心完毕后，吸去多余的上清，留下与细胞相同体积的PBS，漩涡震荡重悬细胞。将蛋白酶抑制剂混合物：变形裂解液=1：100的比例配制成100μL变性裂解液加入离心管中，漩涡震荡。将离心管放在冰上裂解细胞，裂解5分钟。③将裂解后的细胞转移至预冷的纯化柱套管中，14000rpm离心30s取出。立即将收集管放置于冰上，弃去纯化柱，变性总蛋白提取完成。④将蛋白样品：5×上样缓冲液=4：1的比例混合均匀，放入提前加热的金属浴中，100℃，加热变性10分钟后，将蛋白样品标记好名称，时间等放入-20℃保存备用。
（2）蛋白浓度测定：①配制工作液：按照BCA试剂：Cu试剂=50：1配制成BCA工作液，稀释标准品终浓度为5mg/ml。②将标准品按0，1，2，4，8，12，16，20μL加到96孔板的蛋白标准品孔中，加PBS补足至20μL。向96孔板的样品孔中加入2μL的待测蛋白样品，加18μL的PBS补至20μL。③向每个孔中加入200μL配制好的BCA工作液，轻轻混匀，放入37℃，孵育30分钟。用酶标仪测定96孔板在562nm处的吸光度，重复三次，取平均值。④根据测得标准品的吸光度做出标准曲线，以X轴为蛋白浓度，以Y轴为吸光度。根据标准曲线和蛋白样品的吸光度计算蛋白样品的浓度。
（3）SDS-PAGE凝胶电泳
①制胶，按照表1中比例配制6%的分离胶，配好胶后，用移液器快速混匀，向胶板中加入8ml分离胶混合液。并观察是否漏液。用移液器吸取2ml超纯水，贴着胶板壁来回缓慢均匀的注入，进行水封。
表1
②分离胶凝固后，倒掉分离胶上层的水，将制胶架轻轻倾斜，用滤纸沿着一侧吸附剩余水分。按照表2中比例配制5%浓缩胶，充分混匀后，立即加入3~4ml浓缩胶混合液，加满即可。加满后，插入1.5mm的梳子。
表2
③室温下待浓缩胶凝固后，将胶架转移至电泳槽分别向电泳槽内外槽加入1×电泳缓冲液，拔下梳子，准备加样。根据测得的蛋白浓度计算出相应的上样量。使用加样枪头将Mark和蛋白样品向加样孔中加样。
④电泳: 设置电泳电压80V，电泳时间1h30min后将电压转至120V继续电泳，当Mark电泳至合适位置时，停止电泳。
⑤转膜：电泳结束后根据蛋白Mark的位置的指示，切出目的蛋白样品的胶，在凝胶右上角做好标记。根据凝胶大小，切割出同样大小的PVDF膜，将其泡在甲醇中30S进行激活，随后将其放入纯水中5min，使PVDF膜进行平衡，随后将PVDF膜放入转膜缓冲液中进行平衡。组装好“三明治”转膜夹层放入转膜槽中，倒入转膜液，将转膜槽放入装有冰的泡沫盒中。设置转膜电流250mA，转膜时间2h。
⑥封闭：用TBST配制含有5%脱脂奶粉的封闭液封闭PVDF膜，在摇床上65rpm，封闭1h。
⑦一抗孵育：4℃过夜孵育。（一抗用封闭液配制，TNS2一抗：封闭液=1：1000，β-actin一抗：封闭液=1：2000），一抗孵育结束后，将PVDF膜放入TBST中进行洗膜，在摇床上85rpm,10min/5次。
⑧二抗孵育：摇床上65rpm,孵育1h。（TNS2二抗：TBST=1：2000，β-actin二抗：TBST=1：2000），二抗孵育结束后，于摇床上洗膜，85rpm,10min/4次。
⑨显影：使用ECL化学发光试剂盒，按照A液：B液=1：1的比例配好显影液，将PVDF膜放在化学发光凝胶系统的曝光托盘上，向膜上滴加适当的显影液，使用系统的自动曝光，保存图片结果。
4.实时荧光定量PCR检测RNA水平TNS2表达情况
（1）RNA提取：使用RNA提取试剂盒提取总RNA。①收集贴壁细胞沉淀至1.5mlEP管中，加入100μL裂解液R1，振荡混合30s，室温静置1min。②弃去杂质，将上清液吸入套有接液管的纯化柱中，12000rpm离心30s。③离心结束后，弃去接液管中的液体，加入600μL洗涤液，12000rpm，离心30s。重复洗涤一次。④离心结束后，弃去接液管中的液体，空柱于离心机中10000rpm离心1min后将纯化柱转移到新的1.5ml离心管中。⑤在纯化柱膜中央加入洗脱液40μL，室温静置1min， 12000rpm离心30s，在1.5ml离心管中获得总RNA。⑥使用紫外分光光度计检测RNA样品的浓度（ng/μL）。
（2）逆转录合成cDNA：利用逆转录试剂盒来逆转录RNA合成cDNA（体系见表3，反应条件：37℃，15min；98℃，5min；4℃循环）。将提取的总RNA于金属浴中65℃，加热5min，结束后立即放在冰上急冻。根据测得的RNA浓度，计算逆转录时各组所需的的体积，使反应体系中的RNA质量为1μg。
表3：TNS2逆转录反应体系：
（3）稀释cDNA模板，将模板稀释10倍备用。所用引物序列如下：
Forward Prime（SEQ ID NO.8）：5’-GGCCTGGACTGATGAGAGGT-3’；
Reverse Prime（SEQ ID NO.9）：5’-CGTGGAGTGCTGCCTTTGAT-3’。
按照表4反应体系加样：
表4：
按照反应体系加完样后，将混合液轻轻混匀，进行PCR反应（表5）。
表5：PCR反应体系为：
5.细胞划痕检测细胞迁移能力
（1）取生长状态良好的对数生长期细胞，按照合适密度接种于六孔板中，每组设置3个复孔，放入37℃，5%CO2的培养箱中培养。
（2）细胞密度达到90%左右时，用200μL枪头沿直尺垂直于平面横竖交叉划痕。
（3）划痕结束后，吸弃旧培养基，用PBS清洗2次，更换新鲜培养基。放入37℃，5%CO2的培养箱中培养。
（4）分别于0h，24h，36h，48h在显微镜下观察迁移情况并拍照。
6.transwell检测细胞迁移能力
（1）取生长状态良好的对数生长期细胞，用无血清培养基重悬细胞，按照8000个/孔的密度接种于24孔transwell小室上室，每组设置3个复孔。
（2）在transwell小室下室中加入含有血清的完全培养基（SKOV3采用SKOV3完全培养基， A2780采用A2780完全培养基），注意小室之间不要产生气泡。放入培养箱中培养。
（3）培养24h后，吸弃旧培养基，上室用PBS洗1次，用4%多聚甲醛固定30min，PBS洗1次。
（4）结晶紫染色30min，PBS洗1次。显微镜下观察拍照。
7.transwell检测细胞侵袭能力
（1）将基质胶稀释后向上室中加入100μL，放入培养箱中1h。
（2）吸弃上室中的液体。取生长状态良好的对数生长期细胞，用无血清培养基重悬细胞，按照8000个/孔的密度接种于24孔transwell小室上室，每组设置3个复孔。
（3）在transwell小室下室中加入含有血清的完全培养基（SKOV3采用SKOV3完全培养基， A2780采用A2780完全培养基），注意小室之间不要产生气泡。放入培养箱中培养。
（4）培养24h后，吸弃旧培养基，上室用PBS洗1次，用4%多聚甲醛固定30min，PBS洗1次。
（5）结晶紫染色30min，PBS洗1次，显微镜下观察拍照。
实验结果
通过图2可以看到，在使用A2780和SKOV3细胞时，相关mRNA的表达情况较为一致，敲减细胞组（A2780-T1和SKOV3-T3）均低于空载细胞（A2780-B和SKOV3-B）组。说明敲减后，呈现出低表达状态。
通过图3、图4可以看到，对于细胞划痕实验和transwell实验，使用A2780和SKOV3细胞敲减细胞组（A2780-KD和SKOV3-KD）划痕愈合率以及细胞数目均低于空载细胞（A2780-B和SKOV3-B）组，说明敲减后，细胞迁移能力以及侵袭能力降低。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (1)
1.shRNA在制备降低上皮性卵巢癌细胞迁移能力和侵袭能力的药物中的应用，其特征在于，
shRNA的序列为SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4。
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116908457A (zh) | 2023-10-20 |
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