CN104419715B - miR‑125b在抗肿瘤中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及miR‑125b在抗肿瘤中的应用。更具体地，本发明涉及构建体，抑制肿瘤细胞转移、降低肿瘤细胞耐药性或者诱导肿瘤细胞发生凋亡的方法，该构建体或者miR‑125b在制备药物中的用途，以及用于治疗癌症的药物。其中，该构建体包括编码miR‑125b的核酸分子，该miR‑125b具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。利用该构建体，能够将编码miR‑125b的核酸分子引入到肿瘤细胞中，进而可以通过在肿瘤细胞中过表达miR‑125b，有效地抑制肿瘤细胞转移、诱导肿瘤细胞发生凋亡，或者降低肿瘤细胞对药物的耐药性。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及miR-125b在抗肿瘤中的应用。具体地，涉及miR-125b在抑制肿瘤细胞转移、降低肿瘤细胞耐药性和诱导肿瘤细胞发生凋亡中的应用。更具体地，本发明涉及构建体，抑制肿瘤细胞转移、降低肿瘤细胞耐药性或者诱导肿瘤细胞发生凋亡的方法，该构建体或者miR-125b在制备药物中的用途，以及用于治疗癌症的药物。
背景技术
原发性肝癌，超过90％是肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)，是世界上最为常见的恶性肿瘤之一，在世界范围内最为常见的癌症致死病因中排名第3，在中国排名第2。目前肝癌的最有效治疗是切除肝癌组织，但手术后复发率很高，手术后5年肝癌复发率高达61.5％，究其原因，在于除非在肝癌早期进行手术，否则绝大多数病人的肝癌细胞已经发生转移，因此无论是肝切除还是肝移植并不能根本治愈肝癌。近十年来，通过建立高转移肝癌细胞系和动物模型，关于肝癌转移的研究取得了一系列进展，但是仍然有很多问题尚未解决，关于原发性肝癌转移和复发的机制仍然存在争议。上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程。通过EMT，上皮细胞失去了细胞极性，失去与基底膜的连接等上皮表型，获得了较高的迁移与侵袭、抗凋亡和降解细胞外基质的能力等间质表型。EMT是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程，已在乳腺癌模型中得到了很好的验证和研究。由于不同类型肿瘤的发病原因有异同，因此在其它类型肿瘤中，EMT是否也参与肿瘤的转移需要进一步验证。近年来，关于EMT在肝癌转移过程中的研究也逐渐表明，在肝癌中，EMT也是引起肿瘤细胞高转移的主要原因。
然而，目前抑制肿瘤转移、降低肿瘤细胞耐药性和诱导肿瘤细胞发生凋亡即抗肿瘤的手段仍有待改进。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够有效抑制肿瘤细胞转移、降低肿瘤细胞耐药性和诱导肿瘤细胞发生凋亡即抗肿瘤的手段。
本发明是基于发明人的下列发现而完成的：通过在肿瘤细胞中过表达miR-125b，可以有效地抑制肿瘤细胞转移、诱导肿瘤细胞发生凋亡，或者降低肿瘤细胞对药物的耐药性。
在本发明的第一方面，本发明提出了一种构建体。根据本发明的实施例，该构建体包括编码miR-125b的核酸分子，所述miR-125b具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。利用该构建体，能够将编码miR-125b的核酸分子，引入到肿瘤细胞中，进而可以通过在肿瘤细胞中过表达miR-125b，有效地抑制肿瘤细胞转移、诱导肿瘤细胞发生凋亡，或者降低肿瘤细胞对药物的耐药性。
根据本发明的实施例，所述编码miR-125b的核酸分子即miR-125b的核酸前体序列，具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。由此，可以进一步提高miR-125b的表达效率，进而进一步提高抑制肿瘤细胞转移、诱导肿瘤细胞发生凋亡，或者降低肿瘤细胞对药物的耐药性的效率。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种抑制肿瘤细胞转移、耐药性或者诱导肿瘤细胞发生凋亡的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：使所述肿瘤细胞过表达miR-125b，所述miR-125b具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。由此，可以有效地抑制肿瘤细胞转移，诱导肿瘤细胞发生凋亡，或者降低肿瘤细胞对药物的耐药性，从而有效地提高治疗癌症的效率。该方法也可以应用于非治疗目的的癌症细胞处理。
根据本发明的实施例，该方法还可以进一步包括下列附加技术特征：
在本发明的一个实施例中，使所述肿瘤细胞过表达miR-125b进一步包括：利用前面所述的构建体，将编码miR-125b的核酸分子引入到所述肿瘤细胞中。由此，可以进一步提高肿瘤细胞过表达miR-125b的效率，从而进一步提高抑制肿瘤细胞转移，诱导肿瘤细胞发生凋亡，或者降低肿瘤细胞对药物的耐药性的效率，进而更有效地提高治疗癌症的效率。
在本发明的一个实施例中，所述肿瘤细胞为肝癌细胞。
在本发明的第三方面，本发明提出了前面所述的构建体、或者miR-125b在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，该药物用于治疗癌症，且其作用靶点为miR-125b。根据本发明的实施例，该药物可以用于抑制肿瘤细胞的转移、降低肿瘤细胞耐药性或诱导肿瘤细胞发生凋亡。根据本发明的具体的实施例，该癌症为肝癌。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种用于治疗癌症的药物。该药物包括：适于使肿瘤细胞过表达miR-125b的试剂。由此，可以通过使肿瘤细胞过表达miR-125b，从而抑制肿瘤细胞转移，诱导肿瘤细胞发生凋亡，或者降低肿瘤细胞对药物的耐药性。根据本发明的实施例，该药物中适于使肿瘤细胞表达miR-125b的试剂为前面所述的构建体。由此，可以进一步提高肿瘤细胞过表达miR-125b的效率，从而进一步提高抑制肿瘤细胞转移，诱导肿瘤细胞发生凋亡，或者降低肿瘤细胞对药物的耐药性的效率，更有效地提高治疗癌症的效率。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明一个实施例，人肝癌中miR-125b表达情况的检测结果，其中，
图1A为实时定量PCR检测miR-125b在人肝癌细胞系中的表达情况的结果，
图1B为实时定量PCR检测miR-125b在20对人肝癌(癌旁)组织中的表达情况的结果，
图1C为饼状统计图分析人肝癌(癌旁)组织中miR-125b的表达情况的结果，
图1D为对数统计图(Log2(肝癌/癌旁))分析人肝癌(癌旁)组织中miR-125b的表达情况的结果；
图2显示了根据本发明一个实施例，miR-125b对人肝癌细胞EMT相关蛋白表达的影响实验的结果，其中，
图2A显示了利用慢病毒转染的方式过表达miR-125b后的肝癌细胞系及对照的细胞形态，
图2B显示了利用慢病毒转染的方式过表达miR-125b后的人肝癌细胞系及对照的间质标志的表达情况的检测结果，
图2C显示了瞬转miR-125b抑制剂后人肝癌细胞系及对照中上皮标志E-cadherin的表达情况的检测结果；
图3显示了根据本发明一个实施例，mir-125b对人肝癌细胞的耐药性影响实验的结果。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，这些实施例旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，本发明是基于发明人在本领域的深入研究所完成的。发明人发现，与正常肝脏组织相比，无论在人肝癌细胞还是在人肝癌临床标本中，miR-125b的表达均下调。进而，发明人发现，通过在肿瘤细胞中过表达miR-125b，可以有效地抑制肿瘤细胞转移，诱导肿瘤细胞发生凋亡，降低肿瘤细胞对药物的耐药性。由此，本发明提出了一种能够有效抑制肿瘤细胞转移、降低肿瘤细胞耐药性和诱导肿瘤细胞发生凋亡即抗肿瘤的手段。
构建体
在本发明的第一方面，本发明提出了一种构建体。根据本发明的实施例，该构建体包括编码miR-125b的核酸分子，该miR-125b具有如下所示的核苷酸序列：5’-UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA-3’(SEQ ID NO：1)。利用该构建体，能够将编码miR-125b的核酸分子，引入到肿瘤细胞中，进而可以通过在肿瘤细胞中过表达miR-125b，有效地抑制肿瘤细胞转移，诱导肿瘤细胞发生凋亡，或者降低肿瘤细胞对药物的耐药性。根据本发明的实施例，所述编码miR-125b的核酸分子具有如下所示的核苷酸序列：5’-GGGTCCCATTAACTGGCATATAATCCTTCTTTAATGTAATAGAGGCTATGGTGTTGCTGTACAAATCTGCTAGAAGCAGATTTTAACCCATGTTTAGTCTCTTTCTTTGGATCTAATGGAATGACTCTTAACTGTTCATTGTCTGCATTGTTTCTCATATTCTTCATTATTTTAAGGTCTGGAATTAGTCTATAAATGGTCGTCGTGATTACTCAGCTCATCCTAACTTTTATATATCATATATATTTCTACTGAAGTATTTTAAATAGTATTTAGAGGTAAAAGTCTAAGTGAACCCAACTGTAATTTCTAAGCTATCCTTATTTCTGGAAGAAGAATTCTACCGCATCAAACCAGACTTTTCCTAGTCCCTGAGACCCTAACTTGTGAGGTATTTTAGTAACATCACAAGTCAGGCTCTTGGGACCTAGGCGGAGGGGAACCAGCAGCTTTGGACCTTATTGATTGTCTGCAGTTACCACCAGAACAAAAGAACATACATAGATTCTGCCTAGGAGAAAAGAACAATGCTTTTCTTTATCATCAGCAACGTTTTCACCATGACCCATCC-3’(SEQ ID NO：2)。由此，可以进一步提高miR-125b的表达效率，进而进一步提高抑制肿瘤细胞转移，诱导肿瘤细胞发生凋亡，或者降低肿瘤细胞对药物的耐药性的效率。
其中，在本文中所使用的术语“构建体”意指能够运输它已与之连接的另一种核酸(目的核酸分子)的核酸分子。一种类型的构建体是“质粒”，它指外源过表达的DNA片段可以连接到其内的环状双链DNA环上。另一种类型的构建体是病毒构建体，其中外源过表达的DNA片段可以连接到病毒基因组内。某些构建体能够在它们已引入其内的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌构建体和游离型哺乳动物构建体)。其他构建体(例如非游离型哺乳动物构建体)在引入宿主细胞内后可以整合到宿主细胞基因组内，且因此连同宿主基因组一起进行复制。此外，某些构建体能够指导它们与之可操作地连接的基因表达。一般而言，在重组DNA技术中使用的表达构建体通常为质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“构建体”可以互换使用，因为质粒是最常用的构建体形式。然而，本发明预期包括此类其他形式的表达构建体，例如提供等价功能的病毒构建体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。在本发明中所使用的术语“核酸”可以是任何包含脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的DNA、RNA，其长度不受任何特别限制。对于用于构建体的核酸类型，优选所述核酸为DNA，因为DNA相对于RNA而言，其更稳定，并且易于操作。
另外，根据本发明的实施例的构建体还可以进一步包含其他的元件，从而为构建体赋予额外的有益效果。本领域技术人员可以根据需要，选择这些元件在构建体上与编码miR-125b的核酸分子的相对位置。既可以设置在编码miR-125b的核酸分子的上游，也可以设置在编码miR-125b的核酸分子的下游，只要这些元件能够发挥其相应的功能即可。在本发明中所使用的术语“5’侧”可以与“上游”互换使用，“3’侧”可以与“下游”互换使用。
具体地，根据本发明的一个实施例，本发明的构建体可以进一步包含启动子序列，所述启动子序列与所述编码miR-125b的核酸分子可操作地相连。在本发明中所使用的术语“启动子”指的是这样一种核酸序列，其能够指导与其可操纵地连接的核酸分子的转录。在本发明中所使用的术语“可操纵地”指的是核酸表达控制序列例如启动子、信号序列、增强子等与目标核酸序列之间的功能连接，其中当合适的分子例如转录活化分子与表达控制序列结合时，表达控制序列影响着对应于目标核酸序列的核酸的转录和/或翻译。由此，可以直接通过表达构建体在动物细胞中引入特定的启动子，并且该启动子可以用于启动编码miR-125b的核酸分子的转录和表达，由此，可以提高所获得的重组细胞中编码miR-125b的核酸分子的表达效率。根据本发明的具体实例，所述启动子为CMV启动子。发明人发现，当采用该启动子时，可以有效地在肿瘤细胞中过表达miR-125b。
根据本发明的一个实施例，本发明的构建体(在本文中有时也称为“表达构建体”)可以进一步包括编码报告蛋白的序列。在本发明中所使用的术语“报告蛋白”是指这样的一种蛋白质，其在表达后，能够产生可以直接或者间接检测的信号，进而能够反映表达构建体所携带的外源核酸序列是否已经在细胞中被成功表达。根据本发明的实施例，报告蛋白的种类并不受特别限制，只要其具有可检测的活性即可。根据本发明的实施例，报告蛋白可以是一种能够产生光学信号的蛋白质例如发光蛋白或者荧光蛋白例如绿色荧光蛋白等。或者报告蛋白可以是一种能够与底物相互作用以产生可检测信号的酶，例如lacZ基因编码的β-半乳糖苷酶。β-半乳糖苷酶能催化一系列底物转化成极易检测的不同颜色的产物。但是lacZ在细胞内本底表达较高，并且检测需要破碎细胞壁，从而限制了其应用。因而，根据本发明的一些实施例，报告蛋白可以为选自发光蛋白、荧光蛋白、酶的至少一种。由此，可以根据常规的方法，对所述报告蛋白进行监测。例如可以采用：比色法、荧光法、生物发光法、化学发光法、酶联免疫法(ELISA)及原位染色法对报告蛋白进行检测。这其中，优选发光蛋白，因为发光蛋白能够发出特定波长的光，因而能够容易对发光蛋白进行检测，并且容易对其进行定量检测。根据本发明的一个实施例，报告蛋白为绿色荧光蛋白。由此，可以便捷地通过荧光显微镜，就能够确定表达构建体所携带的外源核酸序列是否已经在细胞中被成功表达。
根据本发明的一个实施例，表达构建体可以进一步包括筛选标记基因。在本发明中所使用的术语“筛选标记基因”指的是这样的一种基因，其编码的产物能够赋予连同构建体接受该基因的细胞一种特殊的性质，该特殊的性质使得接受该基因的细胞与未接受该基因的细胞很容易被区分开。由此，便于筛选接受表达构建体的细胞。根据本发明的实施例，筛选标记基因的类型不受特别限制，根据本发明的一些示例，所述筛选标记基因为药物抗性基因。由此，容易地通过接受外源表达构建体的重组细胞的抗药性来进行筛选，例如在培养基中添加抗生素，则相应连同构建体接受并表达抗生素抗性基因的细胞将在培养基上能够存活下来。根据本发明的具体示例，所述筛选标记基因为新霉素抗性基因。由此，能够进一步提高筛选接受外源表达构建体的重组细胞的效率。
miR-125b的用途
在本发明的第二方面，本发明提出了一种抑制肿瘤细胞转移、降低肿瘤细胞耐药性或者诱导肿瘤细胞发生凋亡的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：使所述肿瘤细胞过表达miR-125b，所述miR-125b具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。由此，可以有效地抑制肿瘤细胞转移，诱导肿瘤细胞发生凋亡，或者降低肿瘤细胞对药物的耐药性，从而有效地提高治疗癌症的效率。
根据本发明的实施例，使所述肿瘤细胞过表达miR-125b的方法并不受特别限制。可以通过向细胞中引入可以表达miR-125b的核酸分子，也可以直接将miR-125b引入到细胞中来实现。根据本发明的实施例，可以利用前面所述的构建体，将编码miR-125b的核酸分子引入到所要处理的肿瘤细胞中。由此，根据本发明的具体实施例，使所述肿瘤细胞过表达miR-125b的方法进一步包括：利用前面所述的构建体，将编码miR-125b的核酸分子引入到所述肿瘤细胞中。由此，可以进一步提高肿瘤细胞过表达miR-125b的效率，从而进一步提高抑制肿瘤细胞转移，诱导肿瘤细胞发生凋亡，或者降低肿瘤细胞对药物的耐药性的效率，进而能够更有效地提高治疗癌症的效率。
根据本发明的实施例，可以利用本发明的手段处理的肿瘤细胞的类型并不受特别限制。在本发明的一个实施例中，所述肿瘤细胞可以为选自肺癌、肝癌、胃癌、食管癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、宫颈癌、甲状腺癌、鼻咽癌和脑胶质瘤的至少一种的细胞。根据本发明的具体实施例，优选肝癌细胞。
在本发明的第三方面，本发明提出了前面所述的构建体、或者miR-125b在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，该药物用于治疗癌症。根据本发明的实施例，该药物可以用于抑制肿瘤细胞的转移、耐药性或者使所述肿瘤细胞发生凋亡。根据具体的实施例，该癌症可以为肝癌。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种用于治疗癌症的药物。该药物包括：适于使肿瘤细胞过表达miR-125b的试剂。由此，可以人为通过使肿瘤细胞过表达miR-125b，从而抑制肿瘤细胞转移，诱导肿瘤细胞发生凋亡，或者降低肿瘤细胞对药物的耐药性。根据本发明的实施例，该药物中适于使肿瘤细胞过表达miR-125b的试剂为前面所述的构建体。由此，可以进一步提高肿瘤细胞过表达miR-125b的效率，从而进一步提高抑制肿瘤细胞转移，诱导肿瘤细胞发生凋亡，或者降低肿瘤细胞对药物的耐药性的效率，更有效地提高治疗癌症的效率。
下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。
若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》第三版或者相关产品(例如《Molecular Cloning:ALaboratory Manual》，Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning:ALaboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor，通过参照将其全文并入本文)进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
其中，所述百分比浓度如无特别说明均为质量/体积(W/V)百分比浓度或体积/体积(V/V)百分比浓度。所用引物、DNA序列合成及DNA序列测定均由上海英骏公司完成。
实施例1人肝癌中miR-125b的表达情况
按照以下步骤进行试验，以检测人肝癌中miR-125b的表达情况：
一、肝癌细胞/组织cDNA模板的制备
1、细胞总RNA的提取
提取RNA之前用1‰DEPC水处理枪头和Eppendorf管，高压灭菌，烤干备用。
(1)细胞铺满瓶底80％时终止培养，吸弃细胞培养液，加入PBS洗涤一次；
(2)每瓶细胞加入1ml TRIzol，反复吹打使细胞破碎溶解；
(3)将液体转移到1.5ml的EP管中，室温静置5～10min；
(4)加入0.2ml氯仿/ml TRIzol，剧烈振荡混匀15s，室温静置10min；
(5)12000rpm，4℃，离心15min；
(6)离心后液体分为三层，从下至上依次为酚/氯仿层、中间蛋白层、上层无色水相。RNA存于上层水相中；
(7)吸取上层水相至新的EP管中，注意避免将中间蛋白吸出；
(8)加入预冷的异丙醇0.5ml/ml TRIzol，颠倒混匀，室温静置10min；
(9)12000rpm，4℃，离心10min；
(10)弃上清，RNA沉淀用75％乙醇(750μl无水乙醇，250μl DEPC水现配)洗涤，12,000rpm，4℃，离心5min；
(11)弃上清，超净台中鼓风干燥3分钟左右，RNA呈半透明状；
(12)加入15-20μl 1‰DEPC水溶解RNA沉淀，紫外分光光度计测定浓度及OD值，-70℃保存或直接用于逆转录反应。
注意：操作过程中戴口罩、手套并注意更换，以防止RNA被RNA酶降解。
2.组织总RNA的提取
(1)切取100mg新鲜组织放入匀浆管中，管中加入1ml Trizol；
(2)每块组织匀浆前先用75％乙醇和1‰的DEPC水清洗匀浆机转头，将匀浆管置于冰盒上匀浆，组织经反复匀浆直至无明显沉淀后，将匀浆液转入1.5ml EP管中，室温静置5分钟；以下步骤同细胞总RNA的提取。
3.RNA反转录成cDNA
细胞及组织中提取的总RNA，使用miScript反转录试剂盒进行反转录，反应体系(20μl)构成及反应条件如下：
| miScript反转录缓冲液(5×) | 4μl |
| miScript反转录酶混合物 | 1μl |
| 模板RNA | 1μg |
| 无RNA酶去离子水 | 相应调整 |
| 总体积 | 20μl |
混匀后置于PCR仪中，反应条件：37℃1h，95℃5min，4℃保持。合成的cDNA可立即用于下游实验或-20℃冰箱保存。
二、miR-125b荧光定量实时PCR检测
将反转录的cDNA样品以适当比例稀释后，使用miScript SYBR Green PCR Kit配置如下PCR反应体系：
上表中的上游引物序列如下(在同一管反应体系中待检测的miR-125b引物和作为内参的U6引物同时加入)：
miR-125b引物序列：5’-TCCCTGAGACCCTAACTTGTGA-3’(SEQ ID NO：3)；
内参U6引物序列：5’-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3’(SEQ ID NO：4)。
将8联管内容物离心混匀后放置于BioRad IQ5 PCR仪中运行。其中，miR-125b进行PCR反应条件：95℃15min，(95℃15s，54.1℃30s，72℃30s)×40个循环，72℃7min，4℃保持。U6基因为内参，其PCR条件为：95℃15min，(95℃15s，56.6℃30s，72℃30s)×40个循环，72℃7min，4℃保持。每个标本设3个平行管，重复3次。
数据分析：以U6作为内参标定miR-125b的表达量，计算方法为2－△△Ct相对定量方法。
三、结果
结果见图1。图1显示了人肝癌中miR-125b表达情况的检测结果，其中，图1A为实时定量PCR检测miR-125b在人肝癌细胞系中的表达情况的结果，图1B为实时定量PCR检测miR-125b在20对人肝癌(癌旁)组织中的表达情况的结果，图1C为饼状统计图分析人肝癌(癌旁)组织中miR-125b的表达情况的结果，图1D为对数统计图(Log2(肝癌/癌旁))分析人肝癌(癌旁)组织中miR-125b的表达情况的结果。由图1可知，miR-125b在人肝癌细胞系及临床肝癌组织中均为低表达。
实施例2 miR-125b对人肝癌细胞EMT相关蛋白表达的影响
按照以下步骤进行试验，以研究miR-125b对人肝癌细胞EMT相关蛋白表达的影响：
一、pHRS-1cla-miR-125b-CMV-EGFP载体的构建
1.1以pcDNA3.1(-)-myc-his为模板PCR扩增CMV序列，PCR扩增体系(20μl)构成及反应条件如下：
| 10×PCR缓冲液 | 2μl |
| dNTP混合物(2.5mM) | 2μl |
| 引物(上下游) | 1μl |
| rTaq酶 | 0.2μl |
| 模板 | 1μl |
| ddH2O | 13.8μl |
反应条件：95℃5min，(95℃30s，60℃30s，72℃30s)×35个循环，72℃7min，4℃保持。
PCR产物分析：PCR产物于1％琼脂糖凝胶上电泳分离，紫外光下照相分析。
1.2 CMV目的条带的回收
按照AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒的说明书，回收CMV目的条带，并将回收的DNA片段可立即使用或保存于-20℃备用。
1.3将CMV启动子与Promega公司的pGEM-T Easy载体连接。操作步骤如下：
(1)短暂离心pGEM-T-Easy载体及DNA插入对照管，使内容物汇集到管底；
(2)按以下方法建立连接反应，注意：使用低DNA结合力的0.5ml离心管；每次使用2×快速连接缓冲液时要充分混匀。
(3)用移液器吹打连接反应混合物使之混匀，4℃孵育过夜。
1.4连接产物的转化及克隆扩大培养
将上述连接产物进行转化及克隆扩大培养。
1.5质粒提取
采用爱思进生物技术公司的AxyPrep质粒DNA小量提取试剂盒，从上述获得的克隆载体中提取质粒。获得质粒后，紫外分光光度仪检测质粒浓度，OD260/OD280在1.8以上，证明纯度较高，可以用于转染等下游分子生物学实验或-20℃保存。
1.6质粒酶切鉴定及测序鉴定
连入克隆载体的CMV启动子长度约为600bp，因此首先采用酶切的方法根据片段大小对重组质粒进行鉴定。酶切体系为：
| 10×H缓冲液 | 2μl |
| T-CMV启动子 | 1μg |
| SpeI | 1μl |
| MluI | 1μl |
| ddH2O | 补至20μl |
37℃酶切2h后1％琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行初步鉴定。酶切正确的质粒进行菌种保存，并送上海英骏公司进行测序鉴定，以保证连入的片段序列准确无误。
1.7将测序正确的重组质粒和pHRS-1cla-EGFP分别用SpeI和MluI进行双酶切，1％琼脂糖凝胶电泳分离并回收600bp和9kb的条带后连接(16℃，过夜)，此后进行连接产物的转化、克隆扩大培养及质粒提取，重组质粒酶切鉴定，阳性重组质粒送上海英骏公司进行测序鉴定。
具体操作步骤同前所述。连接体系如下：
| 10×快速连接缓冲液 | 2μl |
| T4DNA连接酶 | 1μl |
| 600bp CMV启动子片段 | 14μl |
| 9kb pHRS-1cla-EGFP片段 | 3μl |
| ddH2O | 补至20μl |
DNA片段回收后电泳检查比较两者浓度，按载体：插入片段摩尔比为1:6-1:4的比例，将二者加入到连接反应体系中。
1.8人全血基因组DNA的提取
利用Qiagen公司全血基因组DNA提取试剂盒提取人全血基因组DNA，并采用紫外分光光度计测浓度，-70℃保存备用。
1.9以提取的人全血基因组DNA为模板，PCR扩增pri-miR-125b
PCR扩增体系(20μl)构成及反应条件如下：
| 10×PCR缓冲液 | 2μl |
| dNTP Mix(2.5mM) | 2μl |
| 上下游引物* | 1μl |
| rTaq酶 | 0.2μl |
| 基因组DNA模板 | 1μl |
| ddH2O | 13.8μl |
上表中的上下游引物序列如下：
*扩增pri-miR-125b上游引物：5’-GGATCCGGGTCCCATTAACTGGCATA-3’(SEQ ID NO：5)；
*扩增pri-miR-125b下游引物：5’-ACTAGTGGATGGGTCATGGTGAAAAC-3’(SEQ ID NO：6)。
反应条件：95℃5min，(95℃30s，54℃30s，72℃30s)×35个循环，72℃7min，4℃保持。
1.10用1％琼脂糖凝胶电泳分离pri-miR-125b片段并回收，而后将该片段与pGEM-T Easy载体4℃连接过夜，连接产物进行感受态菌转化、挑取克隆扩大培养、质粒提取(具体操作步骤同前)。
1.11提取的pGEM-T Easy-miR-125b重组质粒用BamHI和SpeI双酶切(37℃，1.5-3h)，1％琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，阳性的重组质粒送上海英骏公司测序。
酶切体系如下：
| 10×K缓冲液 | 2μl |
| 重组质粒 | 1μg |
| SpeI | 1μl |
| BamH I | 1μl |
| ddH2O | 补至20μl |
1.12将测序正确的pGEM-T Easy-miR-125b质粒和pHRS-1cla-CMV-EGFP质粒分别用BamHI和SpeI双酶切，1％琼脂糖凝胶电泳分离并回收580bp和9.7kb左右的条带，TaKaRa公司快速连接试剂盒进行连接，连接产物进行感受态菌转化、挑取克隆扩大培养、质粒提取(具体操作步骤同前)，酶切阳性的克隆经测序证实为pHRS-1cla-miR-125b-CMV-EGFP重组质粒，未插入miR-125b的pHRS-1cla-CMV-EGFP作为对照质粒。所得质粒经紫外分光光度仪测定浓度后于-20℃保存，用于后续的细胞转染。
二、瞬时转染合成的miR-125b片段
合成的mir-125b片段序列为：
正义链：5’-UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA-3’(SEQ ID NO：1)；
反义链：5’-ACAAGUUAGGGUCUCAGGGAUU-3’(SEQ ID NO：7)。
阴性对照序列为：
正义链：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’(SEQ ID NO：8)；
反义链：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’(SEQ ID NO：9)。
具体方法如下：
1、转染前一天，以合适的细胞密度接种到6孔培养板上(接种密度是3-4×105个/ml)，转染时，细胞要达到90-95％的融合。
2、溶液1：240μl无血清培养基+10μl lipofectamine 2000/孔(总体积250μl)(温育5min)。
3、溶液2：240μl无血清培养基+10μl合成的mir-125b片段溶液/孔。
4、将溶液1与溶液2混合，室温下置20min。
5、与此同时，将6孔板中的细胞用无血清培养基冲洗细胞两遍后，加入1.5ml无血清培养基。
6、将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀。在37℃，5％的CO2中保温5-6小时。
7、6小时后，更换含有血清的全培养基，在37℃，5％的CO2中48-72h检测转染水平。
三、重组慢病毒载体pHRS-1cla-miR-125b-CMV-EGFP在肝癌细胞中的过表达及其鉴定
1、肝癌细胞的接种
转染前一天取生长状态良好、密度达80％的肝癌细胞一瓶，吸弃瓶中的旧培养基，PBS洗涤1次，0.25％胰蛋白酶(含0.02％EDTA)消化，显微镜下见细胞变圆并部分从瓶底脱落时立即加入新鲜的完全培养基中和，将细胞悬液吸入玻璃离心管中，1000rpm，常温离心4分钟，弃上清，细胞沉淀用新鲜培养基重悬后计数，6孔板每孔接种细胞数为2×105个，加培养基2.5ml。将细胞轻轻晃匀后置37℃，5％CO2孵箱中培养。
2、细胞转染
参照Invitrogen公司Lipofectamine 2000转染说明书进行。
(1)将10μl脂质体加入250μl Opti-MEM培养基中，轻轻混匀，室温孵育5分钟；
(2)将4μg质粒(分别为pHRS-1cla-miR-125b-CMV-EGFP及pHRS-1cla-CMV-EGFP重组质粒)加入250μl Opti-MEM培养基中，轻轻混匀；
(3)将上述溶液轻轻混合，室温孵育20分钟；
(4)显微镜下观察昨日接种的细胞密度约60-70％，适宜转染，将原培养基吸弃，换成1.5ml Opti-MEM培养基；
(5)将500μlDNA-脂质体复合物逐滴加入6孔板中，轻轻晃匀，37℃，5％CO2条件下继续培养；
(6)4-6小时后更换为含血清的完全培养基；
(7)48-72h后收细胞用于下一步实验。
3、实时荧光定量PCR检测miR-125b在转染的肝癌细胞中的表达水平
(1)Trizol法提取转染pHRS-1cla-miR-125b-CMV-EGFP重组质粒及对照质粒72h后的肝癌细胞的总RNA，步骤同前。
(2)cDNA合成，使用Qiagen公司的miScript反转录试剂盒。
反应体系(20μl)构成及反应条件如下：
| miScript反转录缓冲液(5×) | 4μl |
| miScript反转录酶混合物 | 1μl |
| 模板RNA | 1μg |
| 无RNA酶去离子水 | 相应调整 |
| 总体积 | 20μl |
混匀后置于PCR仪中，反应条件：37℃1h，95℃5min，4℃保持。合成的cDNA可立即用于下游实验或-20℃冰箱保存。
(3)实时荧光定量PCR
将反转录的cDNA样品以适当比例稀释后，使用miScript SYBR Green PCR Kit配置如下PCR反应体系：
| 2×Quanti Tect SYBR Green PCR master Mix | 12.5μl |
| 上游引物 | 0.5μl |
| miScript通用引物 | 0.5μl |
| 模板cDNA | 2μl |
| 无RNA酶去离子水 | 9.5μl |
| 总体积 | 25μl |
上表中所述的上游引物序列如下：
miR-125b：5’-TCCCTGAGACCCTAACTTGTGA-3’(SEQ ID NO：3)。
U6：5’-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3’(SEQ ID NO：4)；
将8联管内容物离心混匀后放置于BioRad IQ5PCR仪中运行。miR-125b反应条件：95℃15min，(95℃15s，54.1℃30s，72℃30s)×40个循环，72℃7min，4℃保持。U6基因为内参，其PCR反应条件为：95℃15min，(95℃15s，56.6℃30s，72℃30s)×40个循环，72℃7min，4℃保持。每个标本设3个平行管，重复3次。
数据分析：以U6作为内参标定miR-125b的表达量，计算方法为2－△△Ct相对定量方法。
四、瞬时转染的miR-125b片段在肝癌细胞中的表达鉴定
实时荧光定量PCR检测miR-125b在转染的肝癌细胞中的表达水平同上述步骤。
五、Western Blot蛋白检测
Western Blot蛋白检测miR-125b在转染的肝癌细胞中的表达水平。
六、结果
结果见图2。图2显示了miR-125b对人肝癌细胞EMT相关蛋白表达的影响实验的结果，其中，图2A显示了利用慢病毒转染的方式过表达miR-125b后的肝癌细胞系及对照的细胞形态，及细胞形态由成纤维样转变为上皮样；图2B显示了瞬转miR-125b抑制剂后人肝细胞系L02及对照中上皮标志E-cadherin的表达情况的检测结果，即在人胎肝细胞系L02中瞬转miR-125b抑制剂后，上皮标志E-cadherin下调；图2C显示了利用慢病毒转染的方式过表达miR-125b后的人肝癌细胞系及对照的间质标志的表达情况的检测结果，即在人肝癌细胞系中用慢病毒转染的方式过表达miR-125b后，间质标志的表达受到抑制，表明EMT过程被抑制。上述结果表明：miR-125b在肝癌细胞中能够抑制上皮-间质转换过程。
实施例3 mir-125b对人肝癌细胞的耐药性影响
以阿霉素为例，按照以下步骤进行试验，以研究mir-125b对人肝癌细胞的耐药性影响：
一、瞬时转染合成的miR-125b抑制剂降低肝癌细胞中miR-125b的表达及其鉴定
合成的miR-125b抑制剂序列如下：5’-UCACAAGUUAGGGUCUCAGGGA-3’(SEQ ID NO：10)。
对照序列为：5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’(SEQ ID NO：11)。
瞬时转染及其鉴定方法同实施例1所示。
二、耐药性测试
首先在96孔板中接种野生型肝癌细胞，按照5×103个细胞/孔接种，24h后加入从0-2μg/ml不同浓度的阿霉素进行处理细胞，48h后根据细胞死亡情况选择合适的处理浓度。
实验时，根据不同的细胞类型选择合适的药物处理浓度。对于稳定转染PHRS-125b载体的细胞，按照5×103个细胞/孔接种，24h后即加入阿霉素进行耐药实验，48h后进行CCK-8检测。对于瞬时转染合成的miR-125b抑制剂的细胞，在转染后24h加入阿霉素进行耐药实验，48h后进行CCK-8检测。
CCK-8检测步骤：CCK-8试剂盒采用日本同仁化学研发的试剂盒，步骤如下：
1.在96孔板中配制100ml的细胞悬液。将培养板在培养箱预培养24小时(在37℃，5％CO2的条件下)。
2.向培养板加入10ml不同浓度的待测物质。
3.将培养板在培养箱孵育一段适当的时间(例如:6、12、24或48小时)。
4.向每孔加入10ml CCK-8溶液(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数)。
5.将培养板在培养箱内孵育1-4小时。
6.用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
三、结果
结果见图3。图3显示了mir-125b对人肝癌细胞的耐药性影响实验的结果。图3即为采用三种肝癌细胞系进行阿霉素的耐药性实验的结果，其中Li-7为相对低表达miR-125b的肝癌细胞系，Li-7-PHRS-125b及Li-7-PHRS-con为稳定过表达miR-125b的稳转株细胞及其转染空载体的对照组细胞；sk-hep1和7721为相对过表达miR-125b的肝癌细胞系，sk-hep1125b抑制剂和sk-hep1 125b抑制剂对照组是指在sk-hep1细胞中通过瞬时转染过表达合成序列(SEQ ID NO：10)及其对照片段(SEQ ID NO：11)使得miR-125b下调；7721 125b抑制剂和7721 125b抑制剂对照组是指在7721细胞中通过瞬时转染过表达合成序列(SEQ ID NO：10)及其对照片段(SEQ ID NO：11)使得miR-125b下调。从图3中可以看到，过表达miR-125b后，细胞存活率下降，耐药性降低；下调miR-125b后，细胞存活率上升，耐药性下降。有显著统计学差异的浓度用*号或**号表示，其中*表示P<0.01，**表示P<0.05。从而表明mir-125b分子与肿瘤细胞耐药性成负相关，即抑制耐药性。
实施例4、mir-125b对人肝癌细胞凋亡的影响
在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的PS由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为35-36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此，Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V进行荧光素PE标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。
实验前一天，发明人将达80％融合、稳定过表达miR-125b的97H细胞及其对照细胞用常规方法传代，分别接种到6孔板中，每种细胞接种3孔，传代后24h，添加含10ng/ml的TGF-β1和5％胎牛血清的高糖DMEM培养基、37℃5％CO2常规条件下培养3-4天，检测凋亡率(培养期间不换液)。其中，通过流式细胞术，使用Annexin V-PE凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡。
具体地：(1)80％融合的细胞用不含EDTA的胰酶消化、离心收集(2000rpm，离心5min)，胰酶消化时间不宜过长，否则容易引起假阳性；
(2)用PBS洗涤细胞2次(2000rpm离心5min)，收集1-5×105细胞；
(3)加入500μl的结合缓冲液悬浮细胞；
(4)加入1μl Annexin V-PE混匀，室温、避光，反应5-15min；
(5)在1小时内用流式细胞仪检测。
结果见下表：
| 凋亡百分比 | 无TGF-β1 | 添加TGF-β1 |
| 对照97H细胞 | 13.1％ | 22.0％ |
| 过表达miR-125b的97H细胞 | 11.3％ | 40％ |
由上表可知，mir-125b和TGF-β1协同促进人肝癌细胞的凋亡。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (9)
1.一种体外降低肿瘤细胞耐药性的方法，所述方法用于非治疗目的，其特征在于，包括：
使所述肿瘤细胞过表达miR-125b，所述miR-125b的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，
其中，所述肿瘤细胞为肝癌细胞。
2.一种体外诱导肿瘤细胞发生凋亡的方法，所述方法用于非治疗目的，其特征在于，包括：
使所述肿瘤细胞过表达miR-125b并添加TGF-β1，所述miR-125b的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示；
其中，所述肿瘤细胞为肝癌细胞。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，使所述肿瘤细胞过表达miR-125b进一步包括：
利用构建体，将编码miR-125b的核苷酸序列引入到所述肿瘤细胞中。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述编码miR-125b的核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示。
5.包括编码miR-125b的核苷酸序列的构建体或者miR-125b与TGF-β1在联合制备药物中的用途，所述药物用于使肿瘤细胞发生凋亡，所述miR-125b的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述肿瘤细胞为肝癌细胞。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述编码miR-125b的核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示。
7.一种用于使肿瘤细胞发生凋亡的药物，其特征在于，包括：适于使肿瘤细胞过表达miR-125b的试剂和TGF-β1；其中，所述miR-125b的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述肿瘤细胞为肝癌细胞。
8.根据权利要求7所述的药物，其特征在于，所述适于使肿瘤细胞过表达miR-125b的试剂为构建体，所述构建体包括编码miR-125b的核苷酸序列。
9.根据权利要求8所述的药物，其特征在于，所述编码miR-125b的核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示。
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