CN108721318B - miR-125b和化疗剂在制备治疗甲状腺癌的药物中的应用 - Google Patents

miR-125b和化疗剂在制备治疗甲状腺癌的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及miR‑125或其模拟物或其促进剂在制备化疗药物增效剂方面的应用。本发明研究发现miR‑125b在甲状腺癌组织样品中下调，Foxp3的表达上调。此外，miR‑125b可以通过与其3'UTR结合直接作用于Foxp3并抑制Foxp3的表达。因此揭示了miR‑125b和Foxp3之间的负相关性。过度表达miR‑125b通过诱导明显致敏甲状腺癌细胞对化疗剂的治疗的敏感性，并通过Atg7途径在体外和体内进行自噬。综合起来，我们的发现了miR‑125b负调控Foxp3促进的新机制自噬和增强化疗剂在甲状腺癌中的疗效，表明miR‑125b在甲状腺癌化疗中的显著治疗意义。

Description

miR-125b和化疗剂在制备治疗甲状腺癌的药物中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及miR-125b或miR-125b促进剂，与化疗剂在制备治疗抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
甲状腺癌占内分泌恶性肿瘤的90％，约占全部的1％人类恶性肿瘤。据估计，2016年在美国约有62,450例甲状腺新病例。尽管手术是甲状腺癌几十年来的主要治疗，但仍然存在一些发生复发的患者[1,2]。为甲状腺癌患者寻找潜在的标志物以及预后指标是至关重要的[3]。
微小RNA(miRNA)是一个内源性单链非编码RNA，在多种生物过程如细胞中起重要作用，包括增殖，粘附和分化。据估计，超过三分之一人类基因被miRNAs所靶向[4]。越来越多的证据表明，miRNA参与了癌症的发展进程[5]。一些miRNA的过度表达可能抑制肿瘤抑制基因表达，而下调其他miRNA可能导致肿瘤发生[6,7]。例如miR-146，miR-221和miR-222在甲状腺肿瘤组织中增加11至19倍，与甲状腺外的入侵或致癌相关[8]。miR-218-2及其宿主基因SLIT3的下调促进了甲状腺癌的侵袭和进展[9]。以前的研究报道表明miR-125b通过PIK3CD靶向抑制未分化的甲状腺癌细胞迁移和侵袭[10]。
发明内容
本发明的目的在于提供一种化疗剂抗甲状腺癌增效剂。
本发明的目的另一目的在于提供miR-125b或其类似物或其促进剂在制备化疗剂抗甲状腺癌增效剂方面的应用。
本发明的另一个目的在于提供一种抗甲状腺癌的药物组合物或药品套装，其可以使得化疗剂发挥更好的抗瘤效果。
本发明的进一步目的在于提供一种针对化疗剂不敏感的甲状腺癌，安全有效的化疗剂增效药物。
本发明的上述目的通过以下技术手段实现：
一方面，本发明提供了miR-125b或其类似物或miR-125b的促进剂在制备化疗剂抗甲状腺癌增效剂或耐药逆转剂的应用。
发明人经大量的研究发现，通过过表达miR-125b或者采用miR-125b类似物，它们可与Foxp3相互作用可以诱导甲状腺癌细胞的自噬，且增强了甲状腺癌细胞对化疗剂的敏感性。
耐药逆转剂是指，当采用一些化疗剂作为抗肿瘤药物用于治疗肿瘤时，存在着一些肿瘤对化疗剂并不太敏感，或者说这些肿瘤对化疗剂具有抗性，此时，可以采用与miR-125b或其模拟物或其促进剂(作为耐药逆转剂)联用化疗剂方式，以逆转肿瘤对所述化疗剂的抗性。
其中，miRNA mimics(miRNA模拟物)是模拟生物体内源的miRNAs，运用化学合成的方法合成，能增强内源性miRNA的功能。
所述的miR-125b模拟物针对miR-125b的成熟体设计并合成的小片段双链miRNA.作用与miR-125b的成熟体是一样，可以上调细胞内相应miR-125b的含量，增强内源性miR-125b的功能。
作为一种可选的实施方式，本发明采用的miR-125b模拟物序列如SEQ ID NO：1所示：
SEQ ID NO：1 ucccugagacccuaacuuguga其中，所述的miR-125b促进剂为增加miR-125b表达量或活性的物质或基因工具。在本发明一个示范性的实施例中，所述的miR-125b促进剂为构建的慢病毒miR-125b表达载体。
所述增加miR-125b的表达量或活性的物质或基因工具，可以是在miR-125b正常表达的情况下，进一步增加miR-125b表达量或活性；也可以是在miR-125b受到抑制时，解除miR-125b抑制的物质或物质工具；还可以是使遗传物质突变，导致miR-125b不能正常表达时，修复miR-125b正常表达的物质或者基因工具。总之，那些能够增加miR-125b表达量或者提高miR-125b活性的物质或者基因工具，无论是通过直接作用的方法，还是间接作用的方式，都可以称为本发明中的MiR-125b促进剂。
作为一种优选的实施方式，所述的MiR-125b促进剂为含有miR-125b核酸片段的载体；
作为更一种优选的实施方式，所述的含有miR-125b片段的表达载体为含有miR-125b核酸片段的质粒。
上述的载体或质粒可以转染到需要治疗的细胞中，提高细胞中MiR-125b的表达量。
其中，所述的化疗剂包括但不限于含铂类化疗剂或小分子的酪氨酸激酶抑制剂中的一种或几种；
作为优选的实施方式，所述的化疗剂包括但不限于选自以下化疗剂或其的衍生物、或其药学上可接受的盐、溶剂化物、互变异构体、同分异构体：如顺铂、卡铂、奥沙利铂、索拉非尼、凡德他尼、瑞格非尼和吉非替尼中的至少一种，其中，顺铂和卡铂属于含铂类化疗剂，奥沙利铂、索拉非尼、凡德他尼、瑞格非尼和吉非替尼属于小分子的酪氨酸激酶抑制剂，或者所述的化疗剂包括其他将来开发的化疗剂。本发明研究发现，miR-125b与这些化疗剂之间均有增效关系，如顺铂、索拉菲尼、卡铂、奥沙利铂等。
另一方面，本发明提供了一种治疗甲状腺癌的药物组合物，其含有：
(a)化疗剂；
(b)miR-125b或其模拟物或其促进剂。
另一方面，本发明提供了一种治疗甲状腺癌的药物套装，其含有：
(a)化疗剂；
(b)miR-125b或其模拟物或其促进剂。
所述的化疗剂如上面的描述。
所述的miR-125b其模拟物或促进剂也如上面描述。
药品套装区别于药物组合物的地方在于，miR-125b或其模拟物或其促进剂不同于化疗剂的剂型，而是独立包装(例如：药丸、或胶囊、或药片或安剖瓶中，含有miR-125b或其模拟物或其促进剂；另外的药丸、或胶囊、或药片或安剖瓶中，含有化疗剂)。在一些实施例中，化疗剂、miR-125b或其模拟物或其促进剂，以及化疗剂和miR-125b或其模拟物或其促进剂的组合，也可含一种或多种佐剂。所述的佐剂是指在药物组成中，可辅助药物疗效的成分。药品套装也可以包含独立包装的miR-125b或其模拟物或其促进剂，以及独立包装的化疗剂。药物套装中miR-125b或其模拟物或其促进剂，以及化疗剂的施用，可以是同时施用或者是以任意的前后顺序施用，例如在化疗剂之前施用miR-125b或其模拟物或其促进剂，或者在化疗剂之后施用miR-125b或其模拟物或其促进剂，或者两者同时施用。在各种实施例中，患者可以是哺乳动物。在一些实施例中，哺乳动物可以是人。作为可选的实施方式，药物组合物或药品套装，其还包含药学上可接受的载体。作为可选的实施方式，所述的药物组合物或药品套装的制剂形式包括但不限于冻干粉针、注射剂、片剂、胶囊、或贴剂等等。
在本发明中，所述的甲状腺癌为miR-125b下调的甲状腺癌。
miR-125b在一些肿瘤中可发挥癌基因的作用，而在一些癌症中发挥抑癌基因的作用，如miR-125b在乳腺癌、肺癌、子宫内膜癌中位点缺失，表明MiR-125b基因具有肿瘤抑制基因的作用；在骨肉瘤中低表达，在细胞中修复miR-125b表达后，阻断了癌细胞的生长、迁移及肿瘤形成；提高miR-125b表达可以抑制卵巢癌细胞的生长(张颖,张平.Mir-125b在肿瘤中作用的研究[J].浙江临床医学,2015,17(11):2012-2014.)。
作为优选的实施方式，所述的肿瘤为对化疗剂不敏感的甲状腺癌，miR-125b或其模拟物或其促进剂可以增强化疗剂的敏感性。
或者，作为优选的实施方式，所述的肿瘤为对放射性碘无反应的甲状腺癌。
或者，作为优选的实施方式，所述的肿瘤为滤泡状甲状腺癌或未分化甲状腺癌。
本发明有益效果：
本发明首次发现，miR-125b可直接作用于Foxp3基因的3'-UTR序列，内源性抑制Foxp3表达，降低Foxp3的mRNA和蛋白质水平，与多种化疗剂联用，显示出增强甲状腺癌细胞对化疗剂的敏感性，大大增加化疗剂治疗的自噬作用。
让人惊喜的是，经试验发现，最高的抑制癌症效率从化疗剂单独使用24.4％提高到联合使用的93.4％，最低的抑制癌症效率从化疗剂单独使用57.1％提高到联合使用的82.1％。miR-125b与化疗剂联合使用与化疗剂单独使用相比，抑癌率可以显著提高25％-69％.
附图说明
图1为miR-125b的表达量；a:miR-125b在人类滤泡状甲状腺癌(WRO)，甲状腺未分化癌(FRO，KAT19)和人正常甲状腺(Nthy-ori 3-1，Nthy1)细胞中的表达量；b.miR-125b在人滤泡状癌和滤泡腺瘤中的表达量。*数据结果为均值±SD(n＝3),
*p<0.05,**P<0.01,与对照细胞或者正常组织对比。
图2为过表达的miR-125b增加甲状腺癌细胞对顺铂和索拉非尼的敏感性；a:含有过表达/沉默的miR-125b的WRO和FRO，模拟物对照(pre-con)、抑制对照(anti-con)、未转染组(con)作为对照组；b:在miR-125b过表达的WRO和FRO中，采用顺铂处理48h的半致死量(IC50)；c:在miR-125b过表达的WRO和FRO中，采用索拉非尼处理48h的半致死量(IC50)。*数据结果为均值±SD(n＝3),*p<0.01,**P<0.001,与对照组或者miR-125b过表达的细胞对比。
图3为miR-125b靶向Foxp3的3'-UTR并抑制Foxp3的表达；(a):预测miR-125b与Foxp3的3'-UTR作用区域的示意图；(b)在WRO和FRO细胞中转染野生型或者是突变型的Foxp3和miR-125b模拟物或者抑制剂或对照的荧光素报告；(c)Foxp3的mRNA与其蛋白的表达水平。数据分析采用了t-检验法。数据结果为均值±SD(n＝3),*p<0.01,**P<0.001。
图4为miR-125b在裸小鼠中抑制FRO自爆的增长；含有Lv-ctrl and Lv-miR-125b的FRO细胞被注射到裸小鼠背部，每七天测量一次肿瘤组织大小。数据显示三次独立的实验。
图5为MiR-125b在裸小鼠中增强甲状腺癌细胞的自噬和抑制甲状腺癌细胞生长；a.采用或者不采用顺铂(3mg/kg体重)共同与lv-miR-125b或lv-ctrl处理后肿瘤在小鼠中的体积大小。肿瘤的大小和重量每七天测一次。b：肿瘤组织中的蛋白质免疫印迹(Westernblot)分析；c:肿瘤组织中的免疫组化染色分析，数据显示三次独立实验。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001,t-检验.
图6为采用顺铂和miR-125b处理后甲状腺癌细胞中Foxp3,Foxp3Δ3,p-p38和p38的表达量。a&b:通过Western blot和RT-PCR测定的Foxp3,Foxp3Δ3,Foxp3Δ8，p-p38和p38的表达量，结果显示，当细胞分别采用顺铂和miR-125b处理后，Foxp3Δ3的Foxp3Δ8下调而p-p38上调；c:通过sh-Foxp3下调Foxp3；d:Foxp3下调对细胞自噬的影响，细胞采用不含FBS的血清饥饿诱导36小时后，检测Atg7和LC3II的水平:
Foxp3与miR-125b的相互作用能增强顺铂对甲状腺癌的治疗效果。
图7为Foxp3在甲状腺组织中的表达水平。(a)对甲状腺组织样品进行Foxp3免疫组化染色，图像被放大了200倍并在Carl Zeiss显微镜上拍摄。(b)每个样本包含五个拍摄的图像，根据平均光密度计算阳性染色值。(c)使用斯皮尔曼相关系数进行协变量分析。t检验用于统计分析。***P<0.0001。
图8为miR-125b增强顺铂诱导的自噬。a-b：WRO和FRO细胞
通过RFP-GFP-LC3质粒转染后，用256μM顺铂处理48小时。c-e：自噬标记的蛋白质印迹分析LC3II，Atg5，Atg7，bcl-2，Beclin 1，肌动蛋白等表达水平。肌动蛋白被用作上样对照。显示的数据分别代表三次独立实验。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，t检验。
具体实施方式
以下实施方式是对本发明作进一步说明，但本发明的实施方式不局限于以下的实施例介绍，凡依照本发明的原理或理念所作的等同的变化或变通都应视为本发明保护的范畴。
在没有特别指明的情况下，本发明采用的材料及实验方法为常规材料及方法。
材料和方法
甲状腺组织标本：收集临床三十对甲状腺标本，肿瘤组织及其癌旁组织均来自同一甲状腺。三十对样本中包括12个滤泡癌和18个滤泡腺瘤。甲状腺样本是从一个单一的地方机构获得的。所有受试者在标本收集之前签署书面知情同意书。这项研究的人类伦理是由从香港中文大学-新界东医院联网临床研究伦理联席委员会批准的。香港中文大学动物实验伦理委员会也批准了这项研究。该研究按照1964年赫尔辛基宣言进行。
细胞系：人类滤泡状甲状腺癌(WRO)，甲状腺未分化癌(FRO，KAT19)和无限增殖的正常甲状腺(Nthy-ori 3-1，Nthy1)细胞均来自ATCC供应商。细胞培养于RPMI 1640(Invitrogen公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德)，并在含有5％的二氧化碳的大气中，10％FBS培养液，37℃下恒温培养。
抗体：Foxp3和Foxp3Δ3购自Novus Biologicals(Littleton，CO)。LC3，Atg家族成员和Beclin 1从Cell Signaling(Danvers，MA)购买。肌动蛋白，p-p38和p38的抗体购自Santa Cruz(Dallas，TX)。
实时定量聚合酶链式反应：从甲状腺细胞系中提取分离总RNA使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)。
Foxp3(正向(SEQ ID NO：3)5'-GAGAAGCTGAGTGCCATGCA-3'；反向(SEQ ID NO：4)：5'-AGGAGCCCTTGTCGGATGAT-3')；肌动蛋白(正向(SEQ ID NO：5)：5'-AAGATGACCCAGATCATGTTTGAGACC-3'；反向(SEQ ID NO：6)5'-AGCCAGGTCCAGACGCAGGAT-3')和miR-125b(SEQ ID NO：7TCCCTGAGACCCTAACTTGTGA)的表达水平采用聚合酶链式反应进行检测，如在先的研究[11]所述。对于miR-125b表达测定，总RNA通过使用NCodeTM miRNAFirst-Stand cDNA合成试剂盒(Invitrogen)进行反转录。所有反应至少进行三次，产物通过ABI Prism 7700sequence detector(Applied Biosystems，Foster City，CA)进行qPCR测定，U6和肌动蛋白作为内参。
荧光素酶测定：根据LV-miR-125b-5p的序列构建LV-miR-125b-5p慢病毒载体。将包含茎环的pre-miR-125b-5p的110bp序列扩增并克隆到慢病毒载体pLV3(命名为Lv-miR-125b-5p)中。该慢病毒的生产和纯化设计和购买来自GenePharma(中国上海)。如在先研究[12]所述测量荧光素酶活性。
MiR-125b模拟物转染：将WRO和FRO细胞接种在6孔板中，使用lipofectamine 2000(Invitrogen)转染剂转染miR-125b模拟物或非特异性对照(GenePharma，中国上海)并按照试剂盒的说明书进行。MiR-125b模拟物：正义(SEQ ID NO：1)5'-UCC CUG AGA CCC UAA CUUGUG A-3'；反义(SEQ ID NO：2)5'-ACA AGU UAGGGU CUC AGG GAU U-3'。细胞如下进行进一步分析。
MiR-125b抑制剂转染：将WRO和FRO细胞接种在6孔板中，使用lipofectamine 2000(Invitrogen)转染剂转染miR-125b抑制剂或非特异性对照(Invitrogen)并按照试剂盒的说明书进行。MiR-125b抑制剂：(SEQ ID NO：8)5'-UCA CAA GUUAGG GUC UCA GGG A-3'。通过荧光素酶报告分析法对细胞进行分析。
Foxp3的稳定敲除：预先设计的短发夹RNA(shRNA)载体购自Biosettia(SanDiego，CA)。四个克隆的shRNA寡核苷酸序列和对照用于稳定敲除WRO和FRO细胞中的Foxp3。一般而言，细胞在12孔组织培养板中生长至约80％。DNA按照说明书在37℃下用PacI消化3小时(h)。然后使用Lipofectamine 2000试剂作为转染剂，在无血清培养基中，分别将含有每个shRNA克隆和作为对照的1μg纯化质粒，转染至细胞中，48小时后，细胞传代培养到6孔板中，并用3μg/ml嘌呤霉素进行筛选。经过4周的抗生素筛选，收获细胞并裂解蛋白质用于进一步的蛋白质印迹(Western blot)分析。
免疫组化分析(IHC)：从手术标本取得的甲状腺组织样本在10％福尔马林溶液中固定，然后在石蜡中包埋过夜。切片在4微米厚度。如参考文献[13]所述，进行不同抗体的IHC染色。简言之，采用二甲苯将组织切片脱蜡，梯度乙醇至水。然后将组织切片在抗原修复缓冲液中煮沸1分钟(min)，并用3％H2O2溶液淬灭5分钟。在此之后，在室温下用VectorImmPRESS二级过氧化物酶试剂温育30分钟min，然后进行DAB底物显色2分钟，然后进行苏木素QS复染。这些图像是由蔡司斑点成像系统(卡尔蔡司，耶拿，德国)捕获的。以200倍的放大率拍摄5个随机视野。通过Image-Pro Plus 6.0图像分析软件测量不同抗体的表达。采用Image-Pro Plus在荧光图像中测量总积分光密度(IOD SUM)。整个视场的平均光密度(D)使用公式D＝IODSUM/面积总和计算，其中IOD SUM和面积总和是整个视场中整体光学密度和整个视场中的面积。
蛋白质印迹(Western blot)：每道约3μg的蛋白质在10％SDS-PAGE凝胶上分离并转移到硝酸纤维素膜(Millipore，Billerica，MA)上。该膜采用含有0.1％吐温20(TBST)和3％的脱脂牛奶在4℃过夜封闭。用TBST洗涤三次后，膜与上述的抗体(1：500TBST，TBST包含3％的脱脂牛奶)一起在室温下孵育1小时。结合的抗体被用辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗(1：2000稀释)和ECL plus试剂(Amersham Biosciences，Pittsburgh，PA)检测。将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。
自噬测定：编码mRFP-EGFP-LC3的质粒来源于Tamotsu Yoshimori(大阪大学)慷慨捐赠。在转染前24h，在12孔板每孔接种约5×10 4个细胞。采用Lipofectamine 2000(Invitrogen，11668)转染剂，按照说明书的步骤，将质粒(800ng/孔)转染细胞中按照制造商的方案进行。添加不含FBS的培养基作为自噬诱导剂，并在48小时饥饿后，采用蔡司斑点成像系统(Carl Zeiss，Jena，Germany)捕获图像。
统计分析：所有结果均以平均值±SD表示。统计分析是通过使用GraphPad Prism软件的Student's t检验执行。为了比较比较两组或两组以上，使用单因素方差分析(ANOVA)进行分析。当方差分析显示显着时，应用Tuke’s的程序进行多重比较组间或组内的差异，统计学上认为p值小于0.05具有显著意义。
实施例1 MiR-125b在甲状腺肿瘤组织和甲状腺癌细胞中下调。
来自30对甲状腺组织的RNA，包括12个滤泡状癌和18个滤泡腺瘤，通过qRT-PCR检测miR-125b表达水平。具体方法参见“材料和方法”部分。
在4对滤泡腺瘤中，miR-125b表达在肿瘤组织和非肿瘤组织无明显差异。2个滤泡癌中，miR-125b的表达水平在肿瘤组织与非肿瘤组织相比上调，而miR-125b在10例滤泡癌和14例滤泡腺瘤中，与肿瘤组织配对的癌旁组织相比，在肿瘤组织中显著下调(图1b)。我们也通过RT-PCR评估了miR-125b在人类滤泡状甲状腺癌(WRO)和甲状腺未分化癌中(FRO，KAT19))和正常甲状腺细胞(Nthy-ori 3-1，Nthy1)细胞中的表达。结果显示miR-125b在滤泡状甲状腺癌和甲状腺未分化癌细胞系中，相比于正常甲状腺细胞系中下调(图1a)。
实施例2 miR-125b的过度表达使甲状腺癌细胞对顺铂和索拉非尼敏感。
为了进一步阐明miR-125b在甲状腺癌中的作用，我们稳定地过度表达miR-125b，通过在甲状腺癌细胞中的转染miR-125b模拟物和miR-125b抑制剂，然后用嘌呤霉素筛选细胞。另外，我们建立了一个模拟物对照(pre-con)和一个抑制剂对照(anti-con)，并使用未转染组(con)作为对照。具体方法参见“材料和方法”部分。
通过RT-PCR证实甲状腺癌细胞中miR-125b的过表达/沉默(图2a)。将这些稳定的细胞接种在96孔板中，通过MTT测定法测量细胞在不同浓度顺铂或索拉非尼给药48h后细胞的生长曲线。与阴性对照相比，过度表达的miR-125b显着使甲状腺癌细胞对顺铂和索拉非尼敏感(图2b和c)。这些结果表明，miR-125b可以提高顺铂和索拉非尼的疗效杀死或抑制甲状腺癌细胞。
实施例3 MiR-125b靶向Foxp3的3'UTR以抑制其表达。
生物信息学分析预测Foxp3是miR-125b的靶标。具体方法参见“材料和方法”部分。
3'-UTR的序列508-526与miR-125b完美匹配(图3a)。目标被荧光素酶报告系统进行实验验证。如图3b所示，共转染的miR-125b抑制含有野生型Foxp3 3'UTR序列的报道分子萤光素酶活性，但通过双荧光素酶报告测定法显示，不能抑制突变的Foxp3。进一步的分析显示，miR-125b抑制内源性Foxp3mRNA(图3c)和蛋白质水平(图3d)。总之，这些数据表明miR-125b可以直接靶向Foxp3的3'-UTR序列。
实施例4 Foxp3在甲状腺腺瘤和癌中表达上调。
先前的研究已经报道了在甲状腺癌细胞中Foxp3表达增加。在本研究还分析了30对甲状腺标本，包括12个滤泡状癌和18个滤泡腺瘤以确定Foxp3的表达水平。IHC染色的Foxp3的特点和图像以200倍的放大率随机选取五个视野。计算阳性染色的平均光密度的方法见上面的描述。Foxp3表达在甲状腺腺瘤，甲状腺癌和多结节性甲状腺肿组织中上调(p<0.0001)(图7)。
实施例5通过Atg7(自噬相关蛋白)过表达miR-125b增强了甲状腺癌细胞的自噬。
顺铂诱导许多癌症的自噬，包括甲状腺癌14。表达已知miRNA，通过其对几种致癌基因和原癌基因基因的影响来调节自噬。在本发明中，miR-125b增强了顺铂和索拉非尼两者在甲状腺癌细胞中的功效，并且miR-125b联合作用的效果顺铂比索拉非尼更强。所以接下来选择了miR-125b诱导顺铂对甲状腺癌细胞自噬的影响。具体方法参见“材料和方法”部分。
与LV-ctrl相比，GFP-LC3斑点数量和LC3II的量在转染LV-miR-125b后增加转染，(图8)。自噬相关蛋白LC3，Atg5，Atg7和Beclin 1也通过westernblot检测(图8c-e)。我们发现，顺铂治疗后，LC3II，Beclin 1和Atg 7上调，而Bcl-2下调。这些结果表明，Bcl-2的抑制导致细胞凋亡Beclin 1在甲状腺癌细胞中的释放。总之，miR-125b的过表达通过刺激Atg7增强甲状腺癌细胞的自噬。
实施例6过表达MiR-125b增强了顺铂在异种移植小鼠模型中的抗肿瘤效力。
在上述体外观察之后，我们在体外验证了异种移植模型。具体方法参见“材料和方法”部分。
将稳定转染miR-125b模拟物的FRO细胞注射入体内裸鼠的背侧。与对照组相比，miR-125b模拟物在28天，35天和42天后显着降低肿瘤大小和体积(图4)。这一发现表明miR-125b对甲状腺癌具有抗肿瘤作用。
另外，要确定miR-125b是否增强了化疗剂对甲状腺癌细胞的敏感性，我们也评估了顺铂在动物体内的抗肿瘤疗效。在裸鼠皮下植入有或没有过表达miR-125b FRO细胞。每隔一天腹膜内注射顺铂3mg/kg，2次/周。结果显示，miR-125b或顺铂可以减少肿瘤在小鼠体内大小(图5a)。然而，小鼠中实验中观察到最大的效果来自miR-125b和顺铂的组合使用。除了肿瘤大小的减少以外，Foxp3的表达也被抑制，LC3II作为自噬的生物标志物的水平显著增加(图5b和c)。图5显示了与对照组相比，顺铂在携带miR-125b过表达的小鼠中显着更大抑制肿瘤生长的能力。MiR-125b模拟物抑制Foxp3Δ8的表达并上调p-p38表达增加顺铂治疗的自噬作用。
我们以前的研究报道抑制Foxp3的表达能够促进细胞凋亡和抑制迁移，这表明靶向甲状腺癌细胞的Foxp3可能会提供一个新的治疗甲状腺癌的方向[15]。Foxp3Δ3和Foxp3Δ8是天然产生的两个Foxp3异构体，外显子3位于阻遏物域和外显子8位于亮氨酸拉链域。Foxp3Δ3作为可能指导癌症的新的化疗标志物，因为在膀胱癌中其表达水平与顺铂耐药性相关[16]。
根据图6结果，miR-125b模拟物抑制Foxp3Δ3和Foxp3Δ8在甲状腺癌细胞中的表达。此外，p38(MAPK途径中的主要调节者之一)据报道诱导LC3II[17,18]。因此，我们调查了甲状腺癌细胞中Foxp3Δ3，p-p38和p38的水平(图6a、b)。结果显示，用顺铂和miR-125b处理的细胞中，Foxp3Δ3表达下调，而p-p38表达上调。为了确认Foxp3和自噬之间的联系，我们用shRNA敲低Foxp3建立WRO和FRO细胞的两个亚克隆。通过蛋白质印迹(western blot)验证Foxp3的抑制(图6c)。将细胞用不含FBS的培养基处理36小时以诱导自噬，我们发现shFoxp3细胞中Atg7和LC3II的水平上调与诱导饥饿期间的正常对照相比(图6d)。
实施例7 miR-125b的过度表达使甲状腺癌细胞对卡铂、奥沙利铂更加敏感。
为了进一步阐明miR-125b在甲状腺癌中的作用，我们稳定地在甲状腺癌细胞中转染miR-125b使其过度表达，通过转染miR-125b模拟物和miR-125b抑制剂和然后用嘌呤霉素筛选细胞。另外，我们建立了一个模拟物对照(pre-con)和一个抑制剂对照(anti-con)，并使用未转染组(con)作为对照。具体方法参见“材料和方法”部分。
该通过RT-PCR证实甲状腺癌细胞中miR-125b的过表达/沉默图8a)。将这些稳定的细胞接种在96孔板中，通过MTT测定法测量不同浓度卡铂或奥沙利铂给药48h后，细胞的生长曲线。与阴性对照相比，过度表达的miR-125b明显使甲状腺癌细胞对卡铂,奥沙利铂更加敏感。这些结果表明，miR-125b可以提高卡铂,奥沙利铂的疗效，抑制甲状腺癌细胞生长。
参考文献：
1 Lang BH,Lo CY,Chan WF,et al.Prognostic factors in papillary andfollicular thyroid carcinoma:their implications for cancer staging.Ann SurgOncol 2007；14:730-738.
2 Lang BH,Lo CY,Wong KP,et al.Should an Involved but FunctioningRecurrent Laryngeal Nerve be Shaved or Resected in a Locally AdvancedPapillary Thyroid Carcinoma？Ann Surg Oncol 2013；20:2951-2957.
3 Haugen BR,Alexander EK,Bible KC,et al.2015American ThyroidAssociation Management Guidelines for Adult Patients with Thyroid Nodules andDifferentiated Thyroid Cancer:The American Thyroid Association GuidelinesTask Force on Thyroid Nodules and Differentiated Thyroid Cancer.Thyroid 2016；26:1-133.
4 Lewis BP,Burge CB,Bartel DP.Conserved seed pairing,often flanked byadenosines,indicates that thousands of human genes are microRNA targets.Cell2005；120:15-20.
5 Guo JM,Miao Y,Xiao BX,et al.Differential expression of microRNAspecies in human gastric cancer versus non-tumorous tissues.J GastroenHepatol 2009；24:652-657.
6 Lodewijk L,Prins AM,Kist JW,et al.The value of miRNA in diagnosingthyroid cancer:a systematic review.Cancer Biomark 2012；11:229-238.
7 Wang T,Xu H,Qi M,et al.miRNA dysregulation and the risk ofmetastasis and invasion in papillary thyroid cancer:a systematic review andmeta-analysis.Oncotarget 2017(in press).
8 Marini F,Luzi E,Brandi ML.MicroRNA Role in Thyroid CancerDevelopment.J Thyroid Res 2011；2011:407123.
9 Guan H,Wei G,Wu J,et al.Down-regulation of miR-218-2 and its hostgene SLIT3 cooperate to promote invasion and progression of thyroid cancer.JClin Endocrinol Metab 2013；98:E1334-1344.
10 Bu QG,You FP,Pan GZ,et al.MiR-125b inhibits anaplastic thyroidcancer cell migration and invasion by targeting PIK3CD.Biomed Pharmacother2017；88:443-448.
11 Liu ZM,Hasselt CA,Song FZ,et al.Expression of functionalmetallothionein isoforms in papillary thyroid cancer.Mol Cell Endocrinol2009；302:92-98.
12 Fu WM,Zhu X,Wang WM,et al.Hotair mediates hepatocarcinogenesisthrough suppressing miRNA-218 expression and activating P14 and P16signaling.J Hepatol 2015；63:886-895.
13 Chen GG,Lai PB,Chak EC,et al.Immunohistochemical analysis of pro-apoptotic Bid level in chronic hepatitis,hepatocellular carcinoma and livermetastases.Cancer Letters 2001；172:75-82.
14 Zhang Y,Yang WQ,Zhu H,et al.Regulation of autophagy by miR-30dimpacts sensitivity of anaplastic thyroid carcinoma to cisplatin.BiochemPharmacol 2014；87:562-570.
15 Chu R,Liu SY,Vlantis AC,et al.Inhibition of Foxp3 in cancer cellsinduces apoptosis of thyroid cancer cells.Mol Cell Endocrinol 2015；399:228-234.
16 Zhang HW,Prado K,Zhang KX,et al.Biased Expression of the FOXP3Delta 3 Isoform in Aggressive Bladder Cancer Mediates Differentiation andCisplatin Chemotherapy Resistance.Clin Cancer Res 2016；22:5349-5361.
17 Utaipan T,Athipornchai A,Suksamrarn A,et al.Isomahanine inducesendoplasmic reticulum stress and simultaneously triggers p38 MAPK-mediatedapoptosis and autophagy in multidrug-resistant human oral squamous cellcarcinoma cells.Oncol Rep 2017；37:1243-1252.
18 Cimas FJ,Callejas-Valera JL,Pascual-Serra R,et al.MKP1 mediateschemosensitizer effects of E1a in response to cisplatin in non-small celllung carcinoma cells.Oncotarget 2015；6:44095-44107.
19 Klusmann JH,Li Z,Bohmer K,et al.miR-125b-2 is a potential oncomiRon human chromosome 21 in megakaryoblastic leukemia.Gene Dev 2010；24:478-490.
20 Jia HY,Wang YX,Yan WT,et al.MicroRNA-125b Functions as a TumorSuppressor in Hepatocellular Carcinoma Cells.Int J Mol Sci 2012；13:8762-8774.
21 Visone R,Pallante P,Vecchione A,et al.Specific microRNAs aredownregulated in human thyroid anaplastic carcinomas.Oncogene 2007；26:7590-7595.
22 Szylberg L,Bodnar M,Harasymczuk J,et al.Expression of FoxP3protein plays a key role in thyroid tumors in children.Fetal Pediatr Pathol2014；33:84-91.
23 Ugolini C,Elisei R,Proietti A,et al.FoxP3 expression in papillarythyroid carcinoma:a possible resistance biomarker to iodine 131treatment.Thyroid 2014；24:339-346.
24 Levy JMM,Towers CG,Thorburn A.Targeting autophagy in cancer.Naturereviews Cancer 2017；17:528-542.
25 Yi H,Long B,Ye X,et al.Autophagy:A potential target for thyroidcancer therapy(Review).Mol Clin Oncol 2014；2:661-665.
26 D'Angelo E,Fassan M,Maretto I,et al.Serum miR-125b is a non-invasive predictive biomarker of the pre-operative chemoradiotherapyresponsiveness in patients with rectal adenocarcinoma.Oncotarget 2016；7:28647-28657.
27 Sui X,Chen R,Wang Z,et al.Autophagy and chemotherapy resistance:apromising therapeutic target for cancer treatment.Cell Death Dis 2013；4:e838.
28 Selvi SK,Vinoth A,Varadharajan T,et al.Neferine augmentstherapeutic efficacy of cisplatin through ROS-mediated non-canonicalautophagy in human lung adenocarcinoma(A549 cells).Food Chem Toxicol 2017；103:28-40.
29 Hsin IL,Ou CC,Wu MF,et al.GMI,an Immunomodulatory Protein fromGanoderma microsporum,Potentiates Cisplatin-Induced Apoptosis via Autophagyin Lung Cancer Cells.Mol Pharmaceut 2015；12:1534-1543.
30 Zhu XF,Ji MD,Han Y,et al.PGRMC1-dependent autophagy by hyperosideinduces apoptosis and sensitizes ovarian cancer cells to cisplatintreatment.Int J Oncol 2017；50:835-846.
31 Washington MN,Suh G,Orozco AF,et al.ARHI(DIRAS3)-mediatedautophagyassociated cell death enhances chemosensitivity to cisplatin inovarian cancer cell lines and xenografts.Cell Death Dis 2015；6:e1836.
序列表
<110> 王珊珊
<120> miR-125b和化疗剂在制备治疗甲状腺癌的药物中的应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ucccugagac ccuaacuugu ga 22
<210> 2
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acaaguuagg gucucaggga uu 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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aggagccctt gtcggatgat 20
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<400> 5
aagatgaccc agatcatgtt tgagacc 27
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<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ucacaaguua gggucucagg ga 22

Claims (6)

1.miR-125b在制备化疗剂抗甲状腺癌增效剂或耐药逆转剂的应用；所述的化疗剂为顺铂或索拉非尼。
2.miR-125b及化疗剂的组合在制备治疗甲状腺癌药物中的应用；所述的化疗剂为顺铂或索拉非尼。
3. 根据权利要求1-2任一所述的应用，其特征在于，所述的甲状腺癌为miR -125b下调的甲状腺癌。
4.根据权利要求1-2任一所述的应用，其特征在于，所述的甲状腺癌为对化疗剂不敏感的甲状腺癌。
5.根据权利要求1-2任一所述的应用，其特征在于，所述的甲状腺癌为对放射性碘无反应的甲状腺癌。
6.根据权利要求1-2任一所述的应用，其特征在于，所述的甲状腺癌选自滤泡状甲状腺癌或未分化甲状腺癌。
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Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2681336A4 (en) * 2011-03-02 2014-11-19 Groove Biopharma Corp ENHANCED BIODISTRIBUTION OF OLIGOMERS
CN104419715B (zh) * 2013-09-10 2017-11-07 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 miR‑125b在抗肿瘤中的应用
JP2015198643A (ja) * 2014-03-31 2015-11-12 国立研究開発法人国立がん研究センター 骨肉腫患者における抗がん剤の奏功性の予測方法
CN106460053A (zh) * 2014-05-13 2017-02-22 罗塞塔金诺米克斯有限公司 在甲状腺肿瘤分类中的mirna表达特征
CN105497916B (zh) * 2015-10-15 2019-05-07 中山大学 小分子非编码RNAmiR-125b在制备用于治疗肿瘤包绕型血管类型肝癌的药物中的应用
CN105950730A (zh) * 2016-05-21 2016-09-21 崔学俊 用于甲状腺癌诊断的miRNA生物标志物及检测试剂盒
KR101844845B1 (ko) * 2016-09-21 2018-04-18 연세대학교 산학협력단 담도암 치료용 약물 감수성 예측용 조성물
CN106520929A (zh) * 2016-10-17 2017-03-22 上海赛安生物医药科技有限公司 非小细胞肺癌检测引物探针及其试剂盒

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
The functional mechanism of miR-125b in gastric cancer and its effect on the chemosensitivity of cisplatin;Xinyue Zhang等;《Oncotarget》;20171214;第9卷(第2期);2105-2119 *

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