CN108490180B - EphA8基因在制备胃癌药物及其诊断试剂盒中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了EphA8基因在制备抗乳腺癌药物及其诊断试剂盒中的应用。本发明通过临床胃癌临床样本组织芯片，免疫组化证实，EphA8在胃癌中表达增高，经生存分析提示EphA8表达较高的患者预后较差；通过体外细胞实验研究shRNA下调EphA8基因表达对胃癌细胞增殖侵袭等生物学行为的影响，发现特异性的shRNA序列可以有效抑制人胃癌细胞株MKN45中EphA8蛋白的表达，EphA8表达降低的MKN45细胞的增殖、侵袭能力降低，EphA8过表达的HGC27细胞增殖、侵袭能力增高。EphA8作为胃癌基因诊疗的靶点，在制备精准医疗的诊断试剂盒和用于治疗高表达EphA8的胃癌药物中，将具有广泛的应用。

Description

EphA8基因在制备胃癌药物及其诊断试剂盒中的应用
技术领域
本发明属于癌症精准医疗药物技术领域，具体涉及EphA8基因在制备胃癌药物及其诊断试剂盒中的应用。
背景技术
目前胃癌的治疗方法多种多样，其中最有效的治疗方法为根治性切除和化疗组合，但尽管如此，患者复发和转移的风险仍很高，5年生存率低于40％。随着肿瘤药理的发展和分子生物学研究的进展，分子靶向治疗已成为除手术、放疗、化疗之外的质粒恶性肿瘤方法中的第四种模式。与传统化疗不同，靶向治疗通过干扰癌症的发生和肿瘤生长所需的特定靶向分子来阻止癌细胞的生长，具有特异性强、疗效明显、不良反应小等优点，符合精准治疗的理念。例如抗人类表皮生长因子受体2(HER2)受体的曲妥珠单抗，已经被证实能增加HER2/neu阳性的不宜手术的患者和发生转移的患者的整体生存率。曲妥珠单抗的成功应用，使得不断探索新的生物分子标志物来预测、治疗胃癌，以改善患者生存质量，延长生存期具有重要的实际意义。
EphA8是生促红细胞生成素的人肝细胞(erythropoietin-producing humanhepatocelluar，Eph)蛋白家族的一员，Eph家族包括Eph受体及Ephrins(Eph受体相互作用蛋白)两大类，Eph受体是组成的跨膜蛋白酪氨酸激酶受体，参与许多生理、病理过程中的一个亚科，包括一个细胞外部分、Ephrins(Eph家族受体相互作用蛋白)、一个跨膜区域和细胞内有的激酶部分。Ephrins是这些受体的配体，Eph/Ephrin系统广泛的影响细胞骨架活性、细胞粘附、细胞间连接、细胞形态及细胞运动。在胚胎发育过程中，Eph-ephrin信号通路参与轴突导向、组织边界的形成、细胞迁移和分割。成年后，他们参与维持长时程增强、血管生成、干细胞分化和癌症有重要作用。Ephrin系统还参与沟通神经元以及神经元和胶质细胞。此外，它参与神经元连接的发育、突触的发育及其在胚胎期中传导基质中基质细胞的形成及方向；Ephrins在免疫系统中也发挥了作用，EphB调节淋巴细胞T应答，导致它们增殖，负责γ干扰素水平增加和刺激细胞毒性淋巴细胞活性；肠上皮的正常功能(活性成分吸收、粘液分泌、抗菌保护)也取决于Eph系统。在人体中，Eph家族至少有14种受(epha1-8，epha10，ephab1-4，ERK)和8种结合配体(ephrin-a1-5，ephrin-b1-3)。作为酪氨酸激酶受体，它们广泛存在于细胞膜，参与许多细胞及细胞间过程，因此它们是好的治疗靶点。其中EphA8是Ephrin A2，A3，A5的受体，在短距离的接触介导的轴突导向哺乳动物神经系统发育中起重要作用，但在肿瘤中的研究较少。在卵巢癌组织中EphA8mRNA水平明显高于癌旁正常组织；在神经胶质瘤中，由miR-10a对EphA8的下调诱导上皮间质转化促进肿瘤的迁移和侵袭。根据现有文献，EphA8在胃癌中的表达情况、生物学功能、以及临床病例参数之间的关系尚未有清晰的报道。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种EphA8用于制备抗胃癌的药物中的应用，满足抗乳腺癌药物的使用需求。本发明的另一目的是提供一种用于胃癌预后判断的试剂盒中的应用。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
EphA8基因(国家基因库，Entrez ID:2046)在制备用于胃癌诊断的试剂盒中的应用。
EphA8基因在制备用于胃癌判断预后的诊断试剂盒中的应用。
EphA8基因在制备用于治疗胃癌的药物中的应用。
所述药物以EphA8基因为靶点设计而成。
所述药物包括以下四条siRNA序列：
EphA8-shRNA#1：5’-TTCTGGATCGAGGCCGTCAAT-3’；
EphA8-shRNA#2：5’-TCTATGCTGAGATCAAGTTTA-3’；
EphA8-shRNA#3：5’-GGAGAAGATGCACTATCAGAA-3’；
EphA8-shRNA#4：5’-ACCAGGTTTGCAACGTCATGA-3’。
有益效果：与现有的技术相比，本发明委托生物样本库制备成组织芯片，利用免疫组化技术检测胃癌中EphA8的表达情况，结果提示EphA8的表达在胃癌组织中明显高于癌旁正常组织，且经过统计EphA8高表达组患者的预后较差。另外经过Western blot、Transwell、CCK8、划痕等体外实验，利用小干扰RNA抑制EphA8基因表达来研究对胃癌细胞生物学行为的影响；发现特异性的shRNA序列可以有效抑制人胃癌细胞株MKN45中EphA8蛋白的表达，并明显降低细胞的增殖、侵袭、迁移能力，相反EphA8过表达的人胃癌细胞株HGC27细胞的增殖、侵袭、迁移能力明显升高。因此EphA8可以作为胃癌细胞基因诊疗的一个靶点，在制备胃癌诊断试剂盒和治疗胃癌的药物中将具有广泛的应用。
附图说明
图1是IHC检测EphA8在胃癌及癌旁组织中的表达结果图；A为分化差的胃癌，B为分化好的胃癌，C为重度不典型增生，D为肠上皮化生，E为正常胃粘膜；
图2是EphA8表达情况、胃癌分期与胃癌患者预后的关系图；
图3是五种胃癌细胞株中EphA8的表达情况比较图；
图4是不同序列shRNA对EphA8的抑制效率图；
图5是Flag-EphA8对EphA8的增长效率图；
图6是CCK-8实验在相应的时间点检测转染和未转染胃癌细胞的增殖指数图；
图7是Transwell实验研究抑制、增加EphA8的表达对细胞侵袭的影响结果图；
图8是Transwell实验研究抑制、增加EphA8的表达对细胞迁移的影响结果图；
图9是划痕实验研究抑制、增加EphA8的表达对细胞迁移的影响结果图；
图10是抑制、增加EphA8对相关通路分子的影响图；
图11是抑制、增加EphA8对生物钟和自噬相关分子的影响图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
以下实施例中使用的主要试剂为：二步法免疫组化检测试剂盒：基因科技上海有限公司；兔抗人EphA8多克隆抗体(免疫组化试验用，omnimabs公司)；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗(免疫组化试验用，北京中杉金桥公司)；抗体稀释液(北京中山生物技术有限公司)；0.01mol/L柠檬酸缓冲液(pH6.0)(北京中山生物技术有限公司)；DAB：Dako公司；二甲苯、中性树胶等由病理科提供。DAB工作液：试剂C:试剂B＝1:50；人胃癌细胞株AGS,SNU719,MKN1,MKN45,MKN27(购自南京科佰生物科技有限公司)；1640培养基、胎牛血清：美国gibco公司；BCA蛋白测定试剂盒：Biosharp；PVDP膜(Westernblot试验用)：Bio-Rad公司；兔抗人EphA8多克隆抗体(Westernblot试验用，omnimabs公司)；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔/鼠IgG(Westernblot试验用)：abcam公司；ECL发光试剂盒(苏州新赛美公司)；LipofectamineTM2000(美国Invitrogen公司)。PMI-1640完全培养液：分别加入RPMI-1640与胎牛血清混匀，使其终浓度分别为90％，10％，1×，4℃保存。细胞冻存液：将RPMI-1640完全培养液、胎牛血清和DMSO按5∶4∶1比例配制，4℃保存。1×PBS1L：取Na2HP04·’12H203.23g、Na2H2P04·’2H20 0.45g、Nacl 8g混合溶解，定容至1L。1×TBST1L：取Tris2.42g、NaCl8.0g、Tween-200.5mL，混合溶解，定容至1L，常温保存。1×转膜Buffer1L：甘氨酸14.4g、Tris3.03g，加适量双蒸水搅拌溶解，再加200mL无水甲醇，定容至1L，混合均匀(用时配制)。封闭液100mL：取脱脂奶粉5g，加入100mL1×TBST，混合溶解即可(需用时配制)。
以下实施例中使用的主要仪器如下：组织芯片制作仪：美国Beecher Instruments公司；自动免疫组化染色仪(2D)：美国LABVISION公司。倒置相差显微镜：日本Olympus公司；凝胶成像系统：美国BIO-RAD公司；多功能酶标仪：美国Thermo公司；BD AccuriTM C6流式细胞仪：美国Becton Dickinson公司。
实施例1
206例胃癌组织切片标本、相应32例癌旁组织及60例胃良性疾病切片标本，所有切片组织均取自南通大学附属医院病理科2007-2017年间住院手术治疗患者。所有的病例均是由两名病理学专家进行病理组织学确定，患者术前没有接受过免疫治疗、化疗或放疗，临床病例资料详细完整。
免疫组织化学法标本：206例胃癌组织中，性别女69例，男137例；年龄低于60岁的75例，超过60岁的131例；肿瘤分级：高分化的胃癌组织为23例，中分化的胃癌组织为45例，低分化的胃癌组织为128例；TNM分期：0-Ⅰ期56例，Ⅱ期48例，Ⅲ期87例，Ⅳ期15例。60例胃良性组织中，包括12例慢性胃炎、9例肠化、10例低级上皮内瘤变、29例高级上皮内瘤变，所有组织标本均常规10％中性福尔马林固定，石蜡包埋，蜡块经筛选无明显缺陷，委托病理科制作成厚度为4mm厚的组织芯片，置于冰箱4℃冷藏室储存备用。
1.1组织芯片的制作：
(1)根据HE染色切片的镜检结果，在蜡块上有代表性的癌巢区域作标记。(2)1:1混合石蜡与蜂蜡，制作空白受体蜡块。在蜡块上设计10×7孔，共350点组织阵列，然后用组织芯片仪制成TMA空白蜡块。(3)将供体蜡块在标记的点上选取最有代表性的癌巢区域，取直径2mm的组织块，每例各取1个芯。(4)将取好的组织芯转移到受体蜡块的孔中，并取相应癌旁组织做对照。(5)组织阵列块在55℃的恒温烤箱中加热融合10分钟，在快融化之前放至室温冷却，使受体蜡块与供体组织融为一体。(6)将组织芯片置于4℃条件下冷冻4小时左右，随后用全自动组织切片机对组织阵列块进行修正，速度为20mm/转，等修到所有组织芯完全曝露。(7)用切片机对组织阵列块进行切片，将连续切片分别漂在凉水中，使其自然展开，再将切片转移至45℃温水中展片2分钟左右，待展开后将其贴在经过防脱片处理的载玻片上晾干。(8)将切片置于60℃的环境下烤片3分钟，58℃继续烤片16h。(9)将做好的组织芯片保存于切片盒，置于冰箱4℃冷藏室备用。
1.2免疫组化染色(EnVision两步法)
(1)脱蜡水化：组织芯片先放在60℃的恒温箱中，烘烤约6-8小时，便于二甲苯脱蜡。将已干燥的组织芯片浸于二甲苯中30分钟2次。取出后进行梯度酒精脱水，100％乙醇5分钟，95％乙醇5分钟，80％乙醇5分钟，70％乙醇5分钟，ddH2O水冲洗组织芯片。(2)抗原修复：将组织芯片置于耐高温切片架上，置于pH为6.0的柠檬酸盐缓冲液，99℃高温修复30分钟，自然冷却至室温后用PBS冲洗3次，每次5分钟，最后用免疫组化笔画出组织范围。(3)滴加30％H2O2避光孵育20分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。蒸馏水冲洗，再将芯片置入PBS缓冲液中浸泡5分钟，总共3次，然后取出甩干。(4)滴加10％封闭液，置于室温下20分钟后PBS冲洗。(5)用一抗稀释液稀释兔抗人EphA8多克隆抗体(稀释比例为1:50)，后滴200μL加于组织芯片上，在4℃条件下过夜。(6)第二天，取出组织芯片，复温30分钟，后置入PBS缓冲液中浸泡5分钟，一共3次，之后取出甩干。(7)在组织芯片上滴加200μL的二抗增强剂，于室温孵育30分钟，将组织芯片置于PBS缓冲液中浸泡5分钟，一共3次，取出甩干。(8)滴加200μL二抗，与室温下放置30分钟，将组织芯片置于PBS缓冲液中浸泡5分钟，一共3次，取出甩干。(9)滴加准备好的显色剂DAB工作液，光镜下控制显色程度，显色完全后，立即用蒸馏水冲洗，终止显色。(10)衬染：于胃癌组织切片上滴加适量的苏木素复染10-20s，后在自来水中缓缓冲洗，然后再放于盐酸－乙醇分色液中约2-3s，最后用流水缓慢冲洗5分钟。(11)脱水：准备不同浓度梯度的乙醇溶液(70％乙醇、80％乙醇、95％乙醇、无水乙醇)，按顺序依次浸泡3min×1次、3min×1次、5min×1次、5min×1次，后稍微吹干切片上的乙醇，再浸于二甲苯溶液中8min×2次。(12)封片：在胃癌组织切片中央处滴一滴中性树脂，盖上盖玻片并轻轻按压，此过程不要产生气泡，置于通风橱中风干。
结果判断：免疫组化结果判断采用双盲法，由两位经验丰富的病理科医师对组织芯片上的染色结果独立评价。根据染色阳性的肿瘤细胞数目所占百分比计为0～100％，染色强度按肿瘤细胞着色的深浅计分：无着色为0分，黄色计1分，浅棕色计2分，棕褐色计3分。EphA8的最终染色得分为染色强度与阳性细胞染色面积的乘积。EphA8表达分数的分界点由X-tile软件得出。评分如下：0～139为低表达或无表达，140～300为高表达。
所有数据均用统计软件SPSSV.20.0和STATAV.9.0处理，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，EphA8表达与胃癌患者的预后关系分析用Kaplan-Meier生存分析，所有检验结果P<0.05为差异有统计学意义。
298例胃组织切片标本行免疫组化染色，EphA8蛋白阳性主表达于胃癌组织的细胞质中，呈棕黄色，而大部分癌旁组织低表达或无表达，见免疫组化照片(图1中A-D为强阳性，E为阴性)。免疫组化染色结果显示胃癌组织EphA8蛋白表达阳性率为61.17％(126/206)，癌旁组织表达阳性率15.63％(5/32)，慢性胃炎表达阳性率25.00％(3/12)，肠化表达阳性率为44.44％(4/9)，低级别上皮内瘤变阳性率为50.00％(5/10)，高级别上皮内瘤变为58.62％(17/29)，,六者比较差异显著，有统计学意义(P＝0.0148)(表1)。Kaplan-Meier生存曲线显示EphA8高表达组比EphA8低表达组总体生存率低(图2)*P<0.05。
表1胃癌组织和癌旁组织/胃良性疾病组织中EphA8蛋白的表达
Figure GDA0001633919640000061
Figure GDA0001633919640000071
可见，EphA8蛋白的表达在胃癌组织中明显升高。EphA8高表达患者较低表达患者预后差。
实施例2
2.1shRNA设计
选用人EphA8的四段不同的shRNA序列及阴性对照shRNA(negative control，NC)，由bioinshine公司设计并完成，序列如下：
EphA8-shRNA#1：5’-TTCTGGATCGAGGCCGTCAAT-3’；在基因上的位置1353-1373；
EphA8-shRNA#2：5’-TCTATGCTGAGATCAAGTTTA-3’；在基因上的位置415-435；
EphA8-shRNA#3：5’-GGAGAAGATGCACTATCAGAA-3’；在基因上的位置1862-1882；
EphA8-shRNA#4：5’-ACCAGGTTTGCAACGTCATGA-3’；在基因上的位置334-354；
NC：5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’。
2.2细胞复苏：
(1)从-80℃冰箱中取出AGS,SNU719,MKN1,MKN45,MKN27细胞的冻存管，放到37℃水浴箱中快速摇动，使细胞在1min内完全解冻。取出冻存管酒精消毒后放入超净台。(2)吸取细胞悬液至15mL的离心管中，添加10mLRPMI-1640于AGS,SNU719,MKN1,MKN45,MKN27细胞中，混合均匀，1200rpm离心3min。(3)倒去上清，取2mL含10％胎牛血清的培养液重悬细胞，转移到细胞培养瓶中，置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养，次日更换一次培养液，继续培养。
2.3细胞传代培养：
(1)紫外灯消毒超净台30分钟，将所需液体提前从冰箱中拿出复温待温，打开酒精灯。(2)将培养瓶中旧培养液弃去，PBS冲洗一遍，加入1mL含0.02％EDTA+0.25％胰酶消化液，消化3～5分钟，显微镜下观察细胞状态，当细胞变圆，间隙变大时，加入5mL含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液终止消化，用吸管反复吹打瓶底。(3)细胞悬液离心，1200rpm，3分钟后弃去上清液，加入含10％胎牛血清的RPMI-164培养基重悬细胞，分装至新的培养瓶，再加入适量培养液，置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中继续培养。
2.4细胞计数法：
(1)细胞消化制备成细胞悬液，用酒精棉球将盖玻片擦干净，放到细胞计数板上。(2)吹打细胞悬液使其混匀，取10μL轻轻注入盖玻片和计数板的交界处。(3)在显微镜下读取计数板四角大方格的细胞数，细胞压到线时，只计左侧和上方者，不计右侧和下方。(4)计算：细胞密度(个/mL)＝(4大格细胞数之和/4)×104。
2.5细胞冻存：
(1)选择对数生长期的细胞，消化细胞，制备成细胞悬液，离心1200r/min，3min。(2)弃去上清，加入冻存液重悬细胞，按每管1mL分装到无菌的冻存管中。(3)将冻存管封好，标明细胞名称、冻存时间等信息。(4)梯度冻存：4℃放置30min，-20℃放置30min，置于-80℃冰箱中，如需长期保存则放入液氮罐。
2.6细胞培养：
(1)复苏的细胞移入25cm2培养瓶中，37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养。(2)次日更换细胞培养液，继续培养待细胞生长达90％融合后，细胞传代培养。(3)经过几次传代后部分细胞可冻存，部分细胞继续培养，准备试验用。
2.7Westernblot分别筛选EphA8高、低表达细胞系
2.7.1蛋白质提取：
(1)各种胃癌细胞均培养于37℃培养箱，CO2饱和湿度保持在5％，用RPMI1640完全培养基培养，1-2天换液，根据相应的密度传代。(2)按实验的需求将shRNA转染至相应的胃癌细胞中，收集正常或转染后的胃癌细胞，弃培养基，用预冷的PBS洗涤细胞2次，弃PBS，用移液器将残留的PBS溶液吸取干净，以免稀释细胞蛋白。(3)根据细胞培养瓶的大小和细胞的生长密度，加入不同的1×SDS细胞裂解液，后用细胞刮子刮净细胞，转移至干净的EP管中。(4)将刮下的细胞蛋白在沸水中煮沸10-15min，结束后取出立刻放于冰上冷却。(5)4℃离心(12000r×10min)。(6)留上清，用紫外分光亮度仪测细胞蛋白的浓度，后保存在-80℃冰箱以备用。
2.7.2SDS-PAGE电泳：
配胶：(1)将两片干净的玻璃板对齐后放入夹中卡紧，垂直卡在架子上，准备灌胶。(2)先将12％的分离胶用1mL枪沿两玻璃间隙灌胶，先快后慢，避免产生气泡，注胶至距上缘约1.5cm处，在胶上缓慢加一层异丙醇。放置30分钟左右至水和胶之间可见明显折线，用ddH2O冲洗掉上层异丙醇，用5％浓缩胶灌满剩余间隙，并插上梳子。约半小时后拔掉梳子，准备上样。(3)每孔上样约为15～20μL，其中一孔加入预染蛋白质Marker。
电泳：起始电压80V，约40min，待溴酚蓝进入分离胶，电压改为100V，约90min，当溴酚蓝接近分离胶底部时停止电泳。
转膜：(1)电转移垫和滤纸用转膜缓冲液浸湿，PVDF膜在甲醇中浸10s至完全极化。(2)从玻璃板上小心取下凝胶，去除所有浓缩胶，将凝胶放在转移缓冲液中浸泡。(3)组装电转移装置，由负极到正极，按电移垫、2层滤纸、凝胶、PVDF膜、2层滤纸、电转移垫顺序安装，PVDF膜接正极、凝胶接负极，注意不要起气泡，放入电转仪，加盖电极和绝缘盖板，300mA，2h。
膜的封闭、标记抗体及显影：(1)5g脱脂奶粉用TBST定容至100mL，充分混匀配成封闭液，将PVDF膜放入封闭液中，在摇床上室温孵育2h。(2)取出PVDF膜，在摇床上用TBST液洗3遍，每次10min。(3)按1∶200的比例将一抗(EphA8抗体)和一抗稀释液混匀，将膜置入此液体中，4℃过夜。(4)取出PVDF膜，在摇床上用PBST液洗3遍，每次10min。(5)加二抗，按1∶2000的比例将二抗和PBST混匀，将膜置入此液体中，室温孵育2h。(6)取出PVDF膜，在摇床上用PBST液洗3遍，每次10min。(7)按ECL试剂盒说明书，将A、B液混合，滤纸吸干PVDF膜，将膜正面朝上滴加配好混合液，凝胶成像系统拍照、保存。
2.7.3胃癌细胞的筛选：
(1)按上述方法分别提取五种胃癌细胞的蛋白。(2)用Westernblot检测EphA8蛋白的表达情况，筛选出高、低表达细胞。
Westernblot检测结果表明EphA8蛋白在MKN45细胞中表达较高，在MKN27细胞中表达量最低(图3)。
2.8细胞转染
2.8.1转染效率的判定：
(1)转染前一天，取对数生长期的MKN45细胞，按4～5×104/孔的密度接种在六孔培养板上(细胞量控制在过夜能达到70％)，加入2mL含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基，置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养。(2)以100μL RPMI-1640稀释5μLLipofectamineTM2000，轻轻混匀。(3)以100μL RPMI-1640分别稀释0μL、1000ng、1500ng、2000ng、2500ng的shRNA，轻轻混匀。(4)室温孵育5min后，混合稀释的shRNA和稀释的LipofectamineTM2000，在室温下孵育20min，使形成siRNA-LipofectamineTM2000复合物。(5)弃去6孔板内旧培养液，用PBS清洗两遍，将复合物加入到每个包含细胞的孔中，轻轻前后十字摇动培养板，使其充分混匀，每孔加1.8mLRPMI-1640，放入培养箱。(6)6小时后换液，加入2mL含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基。(7)24小时后每孔加0.1mLDAPI，染色2分钟，用PBS清洗三次，去除残余荧光，然后置于倒置荧光显微镜下观察、拍照，得出shRNA转染最佳效率所需要的浓度。整个过程用锡箔纸包裹，注意避光。
不同浓度的shRNA对转染率有一定影响，根据RNA干扰实验的设计原则，要求尽可能使转染率相对较高，shRNA浓度相对较低。实验结果提示，2500ng shRNA的转染率最高，大约为80％，可以用于进行后续的实验检测。
2.8.2shRNA-EphA8转染MKN45：
(1)实验分组EphA8-shRNA#1组，EphA8-shRNA#2组，EphA8-shRNA#3组，EphA8-shRNA#4组，NC和空白对照组。(2)转染前一天，取对数生长期的MKN45细胞按4～5×104/孔的密度接种在六孔培养板上(细胞量控制在过夜能达到70％)，加入2mL含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基，置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养。(3)分别用100μL RPMI-1640稀释5μL LipofectamineTM2000和2500ng shRNA，轻轻混匀。(4)室温孵育5min后，混合稀释的shRNA和稀释的LipofectamineTM2000，轻轻混合，在室温下孵育20min，使形成shRNA-LipofectamineTM2000复合物。(5)弃去6孔板内旧培养液，用PBS清洗两遍，将复合物加入到每个包含细胞的孔中，轻轻前后十字摇动培养板，使其充分混匀，每孔加1.8mLRPMI-1640，放入培养箱。(6)6小时后换液，加入2mL含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基，37℃、5％CO2培养48小时，至细胞生长到孔板面积约80～90％时提取细胞蛋白，进行下一步Westernblot检测。
2.8.3Westernblot筛选转染效率最高的一组shRNA：
(1)按上述方法分别提取EphA8-siRNA-1组，EphA8-siRNA-2组，EphA8-siRNA-3组EphA8-siRNA-4组，阴性对照组和空白对照组细胞的蛋白。(2)用Westernblot检测EphA8的表达情况。(3)筛选出转染效率最高的一组siRNA序列用于后续的细胞生物学检测。
Westernblot法检测四段不同的shRNA序列对MKN45细胞EphA8蛋白表达的干扰效率显示：EphA8-siRNA#4在转染后48小时对MKN45细胞的干扰效率最佳，以此作为后续研究的干扰序列(图4)。
2.8.4Flag-EphA8转染HGC27细胞
(1)实验分组：Flag-EphA8、Mock和Ctrl。(2)转染前一天，取对数生长期的HGC27细胞按4～5×104/孔的密度接种在六孔培养板上(细胞量控制在过夜能达到70％)，加入2mL含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基，置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养。(3)分别用100μL RPMI-1640稀释5μL LipofectamineTM2000和2500ng Flag-EphA8，轻轻混匀。(4)室温孵育5min后，混合稀释的Flag-EphA8和稀释的LipofectamineTM2000，轻轻混合，在室温下孵育20min，使形成复合物。(5)弃去6孔板内旧培养液，用PBS清洗两遍，将复合物加入到每个包含细胞的孔中，轻轻前后十字摇动培养板，使其充分混匀，每孔加1.8mLRPMI-1640，放入培养箱。(6)6小时后换液，加入2mL含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基，37℃、5％CO2培养48小时，至细胞生长到孔板面积约80～90％时提取细胞蛋白，进行下一步Westernblot检测。
Western blot实验验证Flag-EphA8对HGC27细胞中EphA8表达的升高效率。结果显示转染Flag-EphA8的细胞，EphA8的表达较Mock和Ctrl组明显上升(图5)。
2.9CCK8法观察细胞增殖
(1)转染前一天，取对数生长期的MKN45及HGC27细胞，按4～5×104/孔的密度接种在六孔培养板上(细胞量控制在过夜能达到70％)，加入2mL含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基，置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养。(2)细胞铁壁后，分4组进行转染：HGC27Ctrl、HGC27Flag-EphA8、MKN45NC和MKN45EphA8-shRNA#4，使用脂质体LipofectamineTM2000介导转染(转染步骤同上)。(3)6h后将转染的细胞常规消化，重悬细胞，调整细胞浓度为3×104个/mL，按100μL/孔接种于96孔板中，每块板每组细胞设3个复孔，37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养。(4)6h后待细胞贴壁，取转染12h为CCK8实验0h，分别检测0h、24h、48h、72h、96h四个时间段细胞增殖情况。(5)先吸尽孔内液体，每孔加入90μL含10％血清的RPMI-1640和10μL CCK8液，37℃、5％CO2培养2小时，多功能酶标仪测定各孔A450值。(6)以3组细胞在不同检测时间点(0h、24h、48h、72h、96h)的A450值绘制细胞生长曲线。
转染48小时后，转染EphA8-shRNA#4的细胞与转染NC组相比出现明显生长抑制(P<0.05)，提示抑制EphA8表达可降低MKN45细胞的增殖能力；转染Flag-EphA8的HGC27细胞与转染Ctrl组相比生长增殖能力增强，提示过表达EphA8可以加强HGC27细胞的增值能力(图6)。
2.10Transwell观察细胞侵袭、迁移能力
(1)实验设置4组：HGC27Ctrl、HGC27Flag-EphA8、MKN45NC和MKN45EphA8-shRNA#4，每组设3个复孔。(2)取培养至对数生长期细胞，常规消化，重悬细胞，以2.5×105/孔接种于六孔板上，待细胞融合达70％～90％时使用脂质体LipofectamineTM2000介导转染(转染步骤同上)。(3)取Transwell小室，上室面覆以Matrigel胶(Matrigel胶：RPMI-1640培养基＝1：4)50μL/孔，将小室放入24孔板，使用前37℃孵育1h。(4)转染48h后，常规消化，重悬各组细胞，以200μL/孔接种于覆盖Matrigel胶的小室内，下室为含20％胎牛血清的RPMI-1640培养液600μL，37℃、5％CO2培养箱中孵育24h。(5)孵育结束后，取出小室，PBS洗两遍，用棉签轻轻拭去上室滤膜内侧面贴壁细胞，PBS洗两遍。(6)将滤膜用4％多聚甲醛固定10分钟，吸去固定液，将膜风干，每孔加入500μL考马斯亮蓝染液，室温置放30min，除去染色液，PBS洗两遍，将上室取出，自然干燥。(7)正置荧光显微镜下计数膜背面迁移的细胞数，计数每张膜的中央部分和周围部分随机3个视野，实验重复三次，计算平均值。
转染48h后的各组细胞，通过计数穿过Transwell小孔细胞数目迁移、侵袭能力，转染EphA8-shRNA#4组的细胞与NC组相比迁移、侵袭能力受到抑制(P<0.05)，shRNA敲降EphA8后MKN45细胞的迁移、侵袭能力下降；转染Flag-EphA8的HGC27细胞与Ctrl组相比迁移、侵袭能力明显增加，Flag-EphA8过表达EphA8后HGC27细胞的迁移、侵袭能力上升(图7表示侵袭能力、图8表示迁移能力)。以上所有数据均用统计软件SPSSV.20.0和STATAV.9.0处理，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2.11划痕实验验证EphA8表达改变对HGC27和MKN45细胞迁移能力的影响
(1)实验分4组：HGC27Ctrl、HGC27Flag-EphA8、MKN45NC和MKN45EphA8-shRNA#4。(2)提前将实验要用的marker笔、直尺紫外消毒30分钟。(3)marker笔在6孔板后用直尺比着约每间隔0.5-1.0cm划一条横线，横穿过孔，每孔至少5条线。(4)取转染的细胞，常规消化，重悬细胞，以5×105/孔接种于六孔板上(细胞数以过夜能长满六孔板为准)。(5)第二天用枪头比着直尺，垂直于背后横线划痕(枪头垂直)。(6)用PBS缓慢清洗细胞3次后，加入含1％血清的RPMI-1640培养基，置于37℃，5％CO2，的培养箱，按0、12、24、48h拍照记录。
24h后HGC27Ctrl和HGC27Flag-EphA8组细胞划痕几乎愈合，明显EphA8过表达的HGC27细胞与Ctrl组相比，划痕愈合更快；48h时，观察可得EphA8抑制的MKN45细胞与NC组相比，划痕愈合较慢(图9)。以上实验结果均重复三次，结果有统计学意义。
实例3EphA8蛋白表达与通路分子、生物钟及自噬的关系
3.1Western blot研究EphA8表达与通路分子的关系
(1)细胞转染分四组：HGC27Ctrl、HGC27Flag-EphA8、MKN45NC和MKN45EphA8-shRNA#4(转染过程如2.8.2和2.8.4所述)。(2)转染的细胞常规取蛋白存放于-20℃，以备western blot实验用。
Western blot结果显示，EphA8过表达组中，CyclinA、CyclinD1、CDK4、MMP2、MMP9表达明显均高于Ctrl组(*p<0.05)；抑制EphA8表达组中，CyclinA、CyclinD1、CDK4、MMP2、MMP9表达均明显低于NC组(*p<0.05)(图10)。表明EphA8与这些通路分子直接或间接相关。
3.2Western blot研究EphA8表达与生物钟及自噬的关系
(1)细胞转染分四组：HGC27Ctrl、HGC27Flag-EphA8(转染过程如2.8.4所述)。(2)转染的细胞常规取蛋白存放于-20℃，以备western blot实验用。
Western blot结果显示，EphA8过表达组中，PER1、PER2、TIMELESS、TAU、LC3B、SQSTM1表达明显均高于Ctrl组(*p<0.05)(图11)。表明EphA8与生物钟及自噬有直接或间接联系。
序列表
<110> 南通大学附属医院
<120> EphA8基因在制备胃癌药物及其诊断试剂盒中的应用
<130> 100
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> EphA8-shRNA#1(Artificial)
<400> 1
ttctggatcg aggccgtcaa t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> EphA8-shRNA#2(Artificial)
<400> 2
tctatgctga gatcaagttt a 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> EphA8-shRNA#3(Artificial)
<400> 3
ggagaagatg cactatcaga a 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> EphA8-shRNA#4(Artificial)
<400> 4
accaggtttg caacgtcatg a 21
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> NC(Artificial)
<400> 5
ttctccgaac gtgtcacgt 19

Claims (2)

1.EphA8基因在制备用于胃癌诊断的试剂盒中的应用；所述的试剂盒以组织中高表达的EphA8蛋白作为诊断胃癌的标志物。
2.EphA8基因在制备用于治疗胃癌的药物中的应用；所述的药物以胃癌细胞中高表达的EphA8蛋白作为靶标；所述药物以EphA8基因为靶点设计而成；所述药物包括以下四条siRNA序列：
EphA8-siRNA#1：5’- TTCTGGATCGAGGCCGTCAAT -3’；
EphA8-siRNA#2：5’- TCTATGCTGAGATCAAGTTTA -3’；
EphA8-siRNA#3：5’- GGAGAAGATGCACTATCAGAA -3’；
EphA8-siRNA#4：5’- ACCAGGTTTGCAACGTCATGA -3’。
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