CN113663074A - Cleaved caspase-3在胶质瘤放疗后再增殖及胶质瘤预后预测中的应用 - Google Patents

Cleaved caspase-3在胶质瘤放疗后再增殖及胶质瘤预后预测中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于医药生物技术领域，公开了一种胶质瘤放疗后再增殖及胶质瘤预后预测的标志物——Cleaved caspase‑3蛋白。通过抑制胶质瘤细胞Cleaved caspase‑3蛋白的活性功能，其放疗后促进周围胶质瘤细胞再增殖的能力明显减弱，因此，抑制Cleaved caspase‑3蛋白表达和/或功能的物质能够用于制备抑制胶质瘤细胞放疗后再增殖的产品。胶质瘤患者肿瘤组织中Cleaved caspase‑3蛋白高表达，其生存期短；通过检测胶质瘤患者肿瘤组织中Cleaved caspase‑3蛋白的表达，可以有效区分胶质瘤患者的生存期，从而为胶质瘤预后预测的判断提供了新途径，为临床医生对于胶质瘤病情分析提供了参考依据。

Description

Cleaved caspase-3在胶质瘤放疗后再增殖及胶质瘤预后预 测中的应用
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，具体涉及cleaved caspase-3蛋白在胶质瘤放疗后再增殖及胶质瘤预后预测中的应用。
背景技术
胶质瘤是指起源于中枢神经系统胶质细胞的恶性肿瘤，占原发性颅内恶性肿瘤的80％左右。基于组织学类型，胶质瘤包含星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、室管膜细胞瘤、混合细胞类型以及其它类型。世界卫生组织(WHO)中枢神经系统肿瘤分类把胶质瘤分为I-IV级，I、II级为低级别胶质瘤，III、IV级为高级别胶质瘤。不同类型和级别的胶质瘤有着不同的生物学特征、临床特点以及预后情况。
胶质母细胞瘤是最常见的原发性脑部恶性肿瘤，约占50％。胶质母细胞瘤是恶性程度最高的胶质瘤，WHO分级为IV级。目前针对胶质母细胞瘤的基本治疗策略为最大安全范围的手术切除、术后同步放化疗以及序贯化疗。尽管针对胶质母细胞瘤已经形成了以手术、放疗、化疗为基础的综合治疗模式，其临床预后仍然极其不理想，一年生存率不到40％，五年生存率约为5％。胶质母细胞瘤经过初始一线治疗后几乎无法避免复发，这是其不良预后的重要原因。
胶质瘤放疗后再增殖是指在放疗中幸存的胶质瘤细胞于放疗间歇期或者放疗结束后以更快的速度加速增殖，最终导致肿瘤复燃的生物学过程。探索胶质瘤放疗后再增殖的机制有利于揭示胶质瘤放疗后复发的重要分子机制，也为研发可抑制胶质瘤放疗后再增殖的相关药物提供更多有效靶点。
Caspase-3在细胞凋亡过程中发挥重要促进作用，这是对于caspase-3功能最经典最广为接受的认识。通常情况下，caspase-3以酶原(zymogen)形式存在于细胞质中，不发挥生物学功能。当细胞接受到内源性或外源性的凋亡刺激信号后，凋亡信号通路被激活，最终导致caspase-3被切割形成具有生物学活性的cleaved caspase-3，cleaved caspase-3再通过与一系列底物相互作用进而发挥促进细胞凋亡的功能。Cleaved caspase-3被认为是细胞中重要的“凋亡执行者”之一，促进细胞凋亡。然而，事物往往具有两面性。近些年来越来越多研究揭示了cleaved caspase-3在许多生理病理过程中扮演了“促进再生”的角色，包括促进伤口愈合和组织再生、纤维化形成、诱导多能干细胞形成、放疗后血管新生等。那么，我们不禁提出假设，cleaved caspase-3是否能够介导胶质瘤放疗后再增殖的生物学过程。目前国内外尚无证据揭示cleaved caspase-3在胶质瘤放疗后再增殖的生物学过程中的作用。本发明目的之一旨在明确cleaved caspase-3在胶质瘤放疗后再增殖的生物学过程中能否发挥促进作用。本发明的研究将丰富拓展我们对cleaved caspase-3这一分子的认知，揭示其在肿瘤放疗后复发的过程中扮演的重要角色。
按照常规的逻辑，如果胶质瘤组织中cleaved caspase-3表达越高，表明肿瘤细胞凋亡程度越高，那么胶质瘤患者应该具有较好的预后特征。然而，本发明中发现cleavedcaspase-3促进了胶质瘤放疗后再增殖的生物学过程。那么按照本发明中揭示的cleavedcaspase-3的功能进行推论：如果胶质瘤组织中cleaved caspase-3表达越高，提示胶质瘤细胞快速再增殖的能力越强，进而肿瘤越容易复发进展，进而导致患者较差的生存预后。通过文献检索，目前国内外关于cleaved caspase-3在胶质瘤组织中预后价值的相关研究十分匮乏，结论尚不明确。本发明的另一目的在于揭示cleaved caspase-3表达水平在胶质瘤组织中的预后提示作用及价值。
发明内容
针对现有技术中存在的问题和不足，本发明的目的之一旨在提供抑制cleavedcaspase-3蛋白表达和/或功能的物质在制备用于抑制胶质瘤细胞放疗后再增殖的产品中的应用，或在抑制胶质瘤细胞放疗后再增殖中的应用；发明的目的之二旨在提供一种抑制胶质瘤细胞放疗后再增殖的产品；本发明的目的之三旨在提供一种用于预测胶质瘤患者生存预后的分子标志物——cleaved caspase-3；本发明的目的之四旨在提供cleavedcaspase-3蛋白的检测试剂在制备预测胶质瘤预后的产品中的应用。
为实现发明目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明第一方面提供了抑制cleaved caspase-3蛋白表达和/或功能的物质在制备用于抑制胶质瘤细胞放疗后再增殖的产品中的应用，或在抑制胶质瘤细胞放疗后再增殖中的应用。实验证实，抑制胶质瘤细胞cleaved caspase-3蛋白的活性功能，其放疗后促进周围胶质瘤细胞再增殖的能力明显减弱。
根据上述的应用，优选地，所述抑制cleaved caspase-3蛋白表达和/或功能的物质包括：抑制caspase-3活化过程(即从酶原状态caspase-3转变成cleaved caspase-3)的物质；抑制cleaved caspase-3活性的小分子抑制剂；具有竞争性抑制作用的显性负性突变体。
本发明第二方面提供了一种抑制胶质瘤细胞放疗后再增殖的产品，所述产品中含有抑制cleaved caspase-3蛋白表达和/或功能的物质。
根据上述的产品，优选地，所述抑制cleaved caspase-3蛋白表达和/或功能的物质包括：抑制caspase-3活化过程(即从酶原状态caspase-3转变成cleaved caspase-3)的物质；抑制cleaved caspase-3活性的小分子抑制剂；具有竞争性抑制作用的显性负性突变体。
本发明第三方面提供了一种用于预测胶质瘤患者预后的标志物，所述标志物为cleaved caspase-3蛋白。
通过免疫组织化学检测cleaved caspase-3蛋白表达具有以下特征：
(1)通过与临床病理特征的关联分析发现cleaved caspase-3蛋白在胶质瘤肿瘤组织中的表达高低与胶质瘤WHO分级呈显著正向相关性，胶质瘤WHO分级越高，胶质瘤肿瘤组织中cleaved caspase-3蛋白表达越高；
(2)肿瘤组织中高表达cleaved caspase-3蛋白的胶质瘤患者，其生存期较短；
(3)胶质瘤肿瘤组织中cleaved caspase-3表达情况是反应胶质瘤患者生存预后的独立危险因素。
本发明第四方面提供了cleaved caspase-3蛋白的检测试剂在制备预测胶质瘤预后的产品中的应用。
根据上述的应用，优选地，所述产品通过免疫组织化学法、Western Blot或酶联免疫吸附法检测样本中cleaved caspase-3蛋白的表达水平。
根据上述的应用，优选地，所述检测试剂为特异性检测cleaved caspase-3蛋白的分子。
根据上述的应用，优选地，所述特异性检测cleaved caspase-3蛋白的分子为核酸或蛋白质。
根据上述的应用，优选地，所述蛋白质为与cleaved caspase-3蛋白特异性结合的抗体。更加优选地，所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。
根据上述的应用，优选地，所述样本为组织、血清或细胞。更加优选地，所述样本为胶质瘤手术切除组织样品。
根据上述的应用，优选地，所述产品为试剂盒、芯片或制剂。
根据上述的应用，优选地，所述组织样品的检测是采用免疫组织化学法对组织样品中的cleaved caspase-3蛋白进行检测，确定组织样品中cleaved caspase-3蛋白的表达水平。
本发明中胶质瘤预后预测的判断方法为：
肿瘤组织中高表达cleaved caspase-3蛋白的胶质瘤患者生存期短(胶质瘤患者生存期短是指与cleaved caspase-3蛋白低表达的胶质瘤患者相比，生存期更短)。所述生存期的计算方式为本领域所公知，是指从患者经病理诊断确诊开始至患者因任何原因引起死亡的时间或健在患者由病理诊断确诊时间至末次随访的时间。
与现有技术相比，本发明取得的积极有益效果为：
(1)本发明首次发现cleaved caspase-3蛋白具有促进胶质瘤细胞放疗后再增殖的作用，抑制胶质瘤细胞cleaved caspase-3蛋白功能后，这些细胞放疗后促进周围胶质瘤细胞再增殖的能力明显减弱，说明通过抑制cleaved caspase-3蛋白表达和/或功能能够抑制胶质瘤细胞放疗后再增殖。因此，抑制cleaved caspase-3蛋白表达和/或功能的物质能够用于制备抑制胶质瘤细胞放疗后再增殖的产品。
(2)本发明提供了一种可以有效评估胶质瘤患者生存期的分子标志物——cleaved caspase-3蛋白。Cleaved caspase-3蛋白高表达的胶质瘤患者组生存期较cleaved caspase-3蛋白低表达的胶质瘤患者组短，说明cleaved caspase-3蛋白的高表达与胶质瘤的不良预后相关。此外，本发明揭示cleaved caspase-3高表达是胶质瘤患者不良预后的独立危险因素。通过检测胶质瘤组织样本中cleaved caspase-3蛋白的表达水平，可以有效评估胶质瘤患者的预期生存情况，从而为胶质瘤预后预测提供新方法，为临床医生判断疾病严重程度提供参考依据。
附图说明
图1为pLEX-GFP-luc2质粒的图谱示意图；
图2为U87-Fluc中荧光素酶活性与细胞数量之间的正向相关关系图；
图3为模拟胶质瘤放疗后再增殖的体外细胞模型中放疗后U87细胞对U87-Fluc促增殖效果图；
图4为放疗后U87细胞中cleaved caspase-3蛋白表达的免疫荧光试验结果图；
图5为U87-CASP3DN细胞株中HA-tag的表达结果图；
图6为放疗后U87-CASP3DN细胞株对U87-Fluc促增殖效果图；
图7为免疫组织化学染色评分示结果图；
图8为高级别胶质瘤、低级别胶质瘤中cleaved caspase-3蛋白表达水平结果图；
图9为cleaved caspase-3蛋白表达水平与胶质瘤患者生存期的K-M曲线图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。
下列实施例所述的实验方法，如无特殊说明，均为本技术领域常规技术，或按照生产厂商所建议的条件；所用试剂、材料和仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
本说明书中，术语“U87”代表“人胶质瘤细胞系U87-MG”，是一种可用于体外培养的人胶质瘤母细胞瘤细胞系。
本说明书中，术语“Fluc”代表“萤火虫荧光素酶(firefly luciferase，Fluc)”。
本说明书中，术语“GFP”代表“绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)”。
本说明书中，术语“U87-Fluc”代表“稳定表达Fluc和GFP融合蛋白的U87细胞”。
本说明书中，术语“U87-CASP3DN”代表“过度表达caspase-3显性负性突变体(caspase-3 dominant negative version)的U87细胞”。
(一)模拟胶质瘤放疗后再增殖的体外细胞模型的构建
实施例1：构建稳定表达Fluc和GFP融合蛋白的U87细胞(U87-Fluc)
1、慢病毒包装
慢病毒包装的具体操作如下：
1)待培养于10cm细胞培养皿中的293T细胞汇合度达到60-70％时，开始进行操作。
2)在2ml Opti-MEM培养基中加入3.3μg pLEX-GFP-luc2(其质粒图谱示意图如图1所示)、3μg psPAX2、1.2μg pMD2.G，充分混合；在另外2ml Opti-MEM培养基中加入50μlLipofectamine 2000，充分混合。使两种混合液室温静置5分钟。
3)约5分钟后，将两种混合液充分混合，室温静置20分钟。
4)约20分钟后，吸除293T细胞培养基，将上一步骤中混合液缓慢加入293T细胞培养皿中。轻轻晃动培养皿，使液体充分覆盖细胞表面。
5)继续培养293T细胞6小时后，吸除覆盖细胞表面液体，并加入10％胎牛血清培养基(不含双抗)，继续培养。
6)48小时之后，在荧光显微镜下观察293T细胞中GFP表达情况。如果GFP表达情况良好，基本说明293T细胞中慢病毒包装成功。收集富含慢病毒颗粒的293T细胞培养上清液，4℃、3000rpm离心20分钟，并通过0.22μm滤器过滤。将处理后的富含慢病毒颗粒的上清液分装至1.5ml EP管中，每管1ml，置于-80℃冰箱中保存待用。
2、慢病毒感染U87细胞及U87-Fluc细胞的筛选与构建
具体操作步骤如下：
1)将目的细胞(U87细胞)铺于6孔板中，铺入细胞数量以过夜后汇合度达到50％为宜。
2)从-80℃冰箱中取出1ml病毒液置于冰上，使其自然融化。
3)将1ml病毒液、1ml 10％胎牛血清培养基(不含双抗)、2μl polybrene充分混合，得到混合液。
4)吸除6孔板中细胞培养基，加入上一步骤中混合液，继续培养细胞。
5)24小时后，在荧光显微镜下观察目的细胞中GFP表达情况。如果GFP阳性细胞比例较高，则更换6孔板中培养基为10％胎牛血清培养基。如果GFP阳性细胞比例较低(不足10％)，则继续培养24小时后再更换培养基。
6)6孔板中目的细胞汇合度达到100％后，将其中细胞传代至10cm细胞培养皿中进行培养。待10cm皿中目的细胞汇合度达到50％后，开始使用嘌呤霉素浓度为1μg/ml的培养基进行细胞培养。稳定转染pLEX-GFP-luc2的U87细胞会存活下来，其余细胞则会被杀死。
7)经过一段时间(10-20天)嘌呤霉素筛选培养后(最终嘌呤霉素浓度可提高至3-4μg/ml)，即可获得稳定转染pLEX-GFP-luc2的U87细胞。
按照上述操作步骤，成功构建稳定表达萤火虫荧光素酶(Fluc)和绿色荧光蛋白(GFP)的U87细胞，将其命名为U87-Fluc细胞。U87-Fluc细胞中荧光素酶的作用为：在U87-Fluc细胞中加入发光底物后，萤火虫荧光素酶可催化发光底物发生变化，产生生物化学发光，可以通过细胞活体成像仪检测生物化学发光来高效评估荧光素酶活性。
实施例2：U87-Fluc细胞荧光素酶活性与细胞数量的相关性探讨
在后续的体外共培养模型中，希望通过检测U87-Fluc萤火虫荧光素酶活性强弱来反应U87-Fluc增殖情况。所以，有必要证实U87-Fluc中萤火虫荧光素酶活性与细胞数量之间是否呈现正性相关关系。在96孔板中铺入指定数目的U87-Fluc，待细胞贴壁后，借助细胞活体生物化学发光成像仪检测96孔板中U87-Fluc的荧光素酶活性。
具体实验操作如下：
将生长状态良好的U87-Fluc细胞消化，制备单细胞悬液。分别按每孔100、250、500、750、1000、2500、5000、7500、10000个细胞，将U87-Fluc铺于96孔板之中。待细胞充分贴壁后即可使用细胞活体成像仪对96孔板进行细胞成像，检测96孔板中U87-Fluc细胞的荧光素酶活性。
采用细胞活体成像仪进行细胞成像的具体操作为：弃掉待成像的细胞培养板中的培养液，加入适量体积(96孔板：80μl/孔、24孔板：150μl/孔)终浓度为0.15mg/ml D-luciferin potassium。然后使用细胞活体成像仪进行U87-Fluc细胞生物化学发光活体成像，完成图像采集，并使用配套软件进行数据分析。
数据分析具体操作为：数据均以均数±标准误(Mean±SEM)的形式呈现。我们使用统计学软件SPSS 20.0(IBM，USA)进行统计学分析。在参数检验中，对于多组独立数据两两比较，我们采用单因素方差分析(One-way ANOVA，One-way analysis of variance)和最小显著性差异法(least significant difference，LSD)。P值小于0.05被认为有统计学意义上的差异。
根据荧光素酶活性与细胞数量制作曲线，其结果如图2所示。
由图2可知，U87-Fluc细胞中荧光素酶活性与细胞数量表现出紧密的正向相关关系，R2为0.9864。因此，在后续的体外共培养模型中，可以通过检测U87-Fluc细胞荧光素酶活性强弱来反应其体外增殖情况。
实施例3：模拟胶质瘤放疗后肿瘤细胞再增殖过程的体外细胞模型构建
1、利用医用直线加速器放疗胶质瘤细胞U87
具体操作步骤如下：
1)细胞准备：可对生长于各种规格细胞培养皿中的U87细胞进行X射线照射。
2)将待照射的细胞放置在一块15cm厚的透明有机玻璃上，细胞培养皿上方覆盖一块薄的透明塑料板，用来限定照射视野；照射使用的是产生X射线的医用直线加速器，其放射剂量率为3.6Gy/分钟。
2、模拟胶质瘤放疗后肿瘤细胞再增殖的体外细胞模型的构建
本发明将U87-Fluc细胞与经医用直线加速器放疗后U87细胞进行共培养，得到模拟胶质瘤放疗后再增殖的细胞模型。
共培养细胞模型构建方法的具体操作步骤如下：
1)利用医用直线加速器对U87细胞进行梯度剂量的放疗：0Gy(即不放疗)、2Gy、6Gy、10Gy，将放疗处理后的U87细胞于当天消化，然后按一定数目(1.5×104/孔)接种至24孔板之中，采用2％胎牛血清培养基进行培养，培养温度为37℃，培养时间为24h。
2)培养24h后，向已接种放疗照射后U87细胞的培养孔中接种U87-Fluc细胞(接种量为100个/孔)，采用2％胎牛血清培养基37℃进行培养。同时设置一组为只铺入U87-Fluc细胞(U87-Fluc细胞单独培养体系)，作为对照组。
3)每2天更换一次2％胎牛血清培养基，经过12天的培养后，利用细胞活体成像仪对24孔板进行细胞成像，检测U87-Fluc细胞的荧光素酶活性，反应U87-Fluc细胞的再增殖情况。采用细胞活体成像仪进行细胞成像以及数据分析处理的具体操作与实施与上文相同，具体不再赘述。具体实验结果如图3所示。
由图3可知，与U87-Fluc细胞单独培养组相比较，经10Gy放疗后的U87细胞(即10GyU87细胞)可显著刺激U87-Fluc细胞增殖；与未放疗后U87细胞(即0Gy U87细胞)相比，经10Gy放疗后的U87细胞也可显著刺激U87-Fluc细胞增殖。具体来说，10Gy U87细胞+U87-Fluc细胞共培养组的生物化学发光信号值约为U87-Fluc细胞单独培养组、0Gy U87细胞+U87-Fluc细胞共培养组的3.5倍和5.8倍以上。
因为经10Gy放疗后U87细胞显示出明显的促进周围U87-Fluc再增殖的效应，为了方便开展后续研究，将选取10Gy放疗剂量作为后续研究的处理剂量。
(二)Cleaved caspase-3蛋白对胶质瘤细胞放疗后再增殖的影响研究
实施例4：通过细胞免疫荧光检测10Gy放疗后U87细胞中cleaved caspase-3蛋白的表达
具体操作步骤如下：
1)用PBS洗一遍生长于内嵌10mm微孔的35mm玻璃底培养皿中的U87细胞，U87细胞已经过10Gy放疗照射。
2)4％多聚甲醛固定细胞15分钟。
3)PBS洗三次，每次5分钟。
4)0.5％Triton X-100进行通透化处理5分钟。
5)免疫染色封闭液室温封闭1小时。
6)加入抗cleaved caspase-3一抗抗体(#9664；Cell Signaling Technology,Inc.)4℃过夜。
7)PBS洗三次，每次5分钟。
8)加入荧光二抗，避光孵育1小时，后续所有操作均应避光。
9)PBS洗三次，每次5分钟。
10)加入DAPI，孵育3分钟。
11)PBS洗三次，每次5分钟。
12)使用激光共聚焦显微镜观察细胞并拍照。
具体实验结果如图4所示。
由图4可知，U87细胞经过10Gy X射线辐照后第4天，U87细胞中cleaved caspase-3表达明显升高。
实施例5：构建稳定过度表达caspase-3显性负性突变体(CASP3DN)的U87细胞(U87-CASP3DN)
为了验证U87细胞中cleaved caspase-3蛋白促进了胶质瘤细胞放疗后再增殖，首先通过抑制U87细胞中cleaved caspase-3蛋白活性，然后观察这些被抑制cleavedcaspase-3活性的U87细胞放疗后促进周围U87-Fluc再增殖能力是否减弱。第163位半胱氨酸是caspase-3蛋白的活性位点。因此，为了抑制cleaved caspase-3活性，我们构建了稳定表达caspase-3显性负性突变体(即将第163位半胱氨酸突变成丙氨酸，C163A)的U87细胞株(U87-CASP3DN)。
稳定过度表达caspase-3显性负性突变体(CASP3DN)的U87细胞的具体实验操作如下：
1、慢病毒包装
1)培养于10cm细胞培养皿中的293T细胞汇合度达到60-70％时，开始进行操作。
2)将3.3μg pLEX-CASP3-C163A质粒、3μg psPAX2质粒、1.2μg pMD2.G质粒加入至2ml Opti-MEM培养基中，充分混合；将50μl Lipofectamine 2000加入至另外2ml Opti-MEM培养基中，混合均匀。两种混合液在室温静置5分钟。
3)5分钟后，将两种混合液充分混合，室温静置20分钟。
4)20分钟后，吸除培养293T的10cm皿中细胞培养基，将上一步骤中混合液缓慢加入此细胞培养皿中。轻轻晃动培养皿，使液体充分覆盖细胞表面。
5)继续培养293T细胞6小时后，吸除覆盖细胞表面液体，并加入10％胎牛血清培养基(不含双抗)，继续培养。
6)48小时之后，收集富含慢病毒颗粒的293T细胞培养上清液，4℃、3000rpm离心20分钟，并通过0.22μm滤器过滤。将处理后的富含慢病毒颗粒的上清液分装至1.5ml EP管中，每管1ml，置于-80℃冰箱中保存待用。
2、慢病毒感染细胞及U87-CASP3DN细胞株构建
1)将目的细胞(U87细胞)铺于6孔板中，铺入细胞数量以过夜后汇合度达到50％为宜。
2)从-80℃冰箱中取出1ml病毒液置于冰上，使其自然融化。
3)将1ml病毒液、1ml 10％胎牛血清培养基(不含双抗)、2μl polybrene充分混合。
4)吸除6孔板中细胞培养基，加入上一步骤中混合液，继续培养细胞。
5)24小时后，更换6孔板中培养基为10％胎牛血清培养基。
6)6孔板中目的细胞汇合度达到100％后，将其中细胞传代至10cm细胞培养皿中进行培养。待10cm皿中目的细胞汇合度达到50％后，开始使用嘌呤霉素浓度为1μg/ml的培养基进行细胞培养。稳定转染pLEX-CASP3-C163A的细胞会存活下来，其余细胞则会被杀死。
7)经过一段时间(10-20天)嘌呤霉素筛选培养后(最终嘌呤霉素浓度可提高至3-4μg/ml)，即可获得稳定转染pLEX-CASP3-C163A的U87细胞，将其命名为U87-CASP3DN。
实施例6：U87-CASP3DN细胞中caspase-3显性负性突变体(CASP3DN)表达的检测
因为caspase-3显性负性突变体基因和血凝素标签蛋白(hemagglutinin-tag，HA-tag)基因串联构建在同一载体上，二者能够同时表达。因此，可以通过检测HA-tag的表达情况来反应U87-CASP3DN细胞中caspase-3显性负性突变体表达情况。本发明采用Westernblot检测HA-tag表达的具体实验操作如下：
1、实验方法：
Western blot检测的具体操作步骤如下：
(1)蛋白样品制备
1)将培养有目的细胞的6cm或10cm细胞培养皿取出置于冰上。吸除细胞培养基后，用PBS缓慢洗两遍细胞。
2)在细胞培养皿中加入适量已加入蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液(6cm皿加入80-100μl，10cm皿加入200-250μl)，缓慢摇晃培养皿，使裂解液充分接触细胞，置于冰上10分钟左右。
3)用细胞刮子将已裂解的细胞刮至培养皿一侧，然后用微量移液器将细胞裂解液转移至1.5ml EP管中。利用涡旋振荡器使1.5ml EP管细胞裂解液充分裂解。
4)4℃、12000rpm离心20分钟后，将1.5ml EP管中上清液转移至新的1.5ml EP管中。
(2)蛋白样品浓度测定
1)将1.2ml PBS加入至蛋白标准品(30mg BSA)中，充分溶解后就形成了25mg/ml的蛋白标准溶液。
2)取10μl 25mg/ml蛋白标准溶液，加入至490μl PBS中，充分混合后配制成0.5mg/ml蛋白工作液。
3)根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，混合均匀，室温24小时内BCA工作液稳定。
4)将0.5mg/ml蛋白工作液按0、1、2、4、8、12、16、20μl加到96孔板的标准品孔中，用PBS将每孔补足至20μl。
5)将适当体积待测样品加到96孔板的样品孔中，也用PBS将每孔补足至20μl。
6)每孔加入200μl BCA工作液，置于37℃恒温培养箱中30分钟。
7)用酶标仪测定562nm波长处吸光度值，并根据标准曲线计算待测样品蛋白浓度。
(3)蛋白变性
将待变性蛋白样品与5×上样缓冲液按4:1体积充分混合后，置于干式恒温加热器上。100℃，10分钟，使蛋白充分变性。变性后置于室温自然冷却，置-20℃冰箱保存待用。
(4)配制PAGE凝胶
配制PAGE凝胶采用的是Promoton PAGE凝胶快速制备试剂盒，具体操作步骤如下。
1)各取2.7ml分离胶缓冲液和分离胶溶液混合均匀。
2)在步骤1)中的混合溶液中加入60μl改良型过硫酸铵溶液，混合均匀。
3)将步骤2)中的混合溶液加入制胶玻璃板中，加入适量的水覆盖在分离胶之上。
4)大约10-15分钟之后，分离胶凝固，倒去上层水。
5)各取0.75ml浓缩胶缓冲液和浓缩胶溶液混合均匀。
6)在步骤5)中的混合溶液中加入15μl改良型过硫酸铵溶液，混合均匀。
7)将步骤6)中的混合液加入制胶玻璃板中，插入梳齿。
(5)电泳
1)将玻璃胶板置于电泳槽中，安装好电泳装置。在电泳槽中倒入电泳缓冲液，不同样品统一成相同的上样质量后进行上样，也要加入预染蛋白marker。
2)80V恒压进行电泳，一般约2-3个小时目的蛋白即可分离开来。
3)撬开制胶玻璃板，即可取出PAGE凝胶。
(6)转膜
1)根据PAGE胶的大小裁剪出同样尺寸的PVDF膜。将PVDF膜在甲醇中活化30秒之后，置于转膜缓冲液中待用。
2)按负极(夹板黑色面)到正极(夹板透明面)的顺序依次放置好海绵、凝胶、PVDF膜、海绵，小心去除各层之间的气泡后，合上夹板。
3)将夹板置于转膜装置中，并在转膜装置中放入一块儿冰盒，倒入已经4℃预冷的转膜缓冲液。由于转膜时会产生大量热量，将整个转膜槽置于冰水混合物中，200mA恒流进行转膜，转膜时间根据目的蛋白分子量酌情决定。
(7)封闭
将转膜后的PVDF膜置于5％脱脂牛奶中，置于摇床上，室温孵育2个小时。
(8)孵育一抗
将PVDF膜置于抗体孵育盒中，加入3-4ml稀释后的抗HA-tag一抗抗体(#3724；CellSignaling Technology,Inc.)，置于4℃摇床孵育过夜。
(9)洗膜
将PVDF膜置于另外抗体孵育盒中，加入适量TBST，置于摇床上洗膜。每次5分钟，共3次。
(10)孵育二抗
将PVDF膜置于另外抗体孵育盒中，加入稀释后的辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(111-035-003，Jackson ImmunoReseach)，置于摇床上，室温孵育2个小时。
(11)洗膜
将PVDF膜置于另外抗体孵育盒中，加入适量TBST，置于摇床上洗膜。每次5分钟，共3次。
(12)显影
将显影底物按1:1体积比混合后，滴加到PVDF膜上，将膜送入凝胶成像仪中进行显影。
2、实验结果
Western blot结果显示，U87-CASP3DN细胞株显著表达HA-tag(如图5)，进而说明U87-CASP3DN细胞株已稳定表达caspase 3显性负性突变体。
实施例7：抑制胶质瘤细胞中cleaved caspase-3活性对胶质瘤放疗后再增殖的影响
为了探索抑制胶质瘤细胞U87的cleaved caspase-3活性后，能否抑制放疗后胶质瘤细胞再增殖，本发明将经放疗照射后的U87-CASP3DN细胞与U87-Fluc细胞共培养，探讨放疗照射后的U87-CASP3DN细胞对U87-Fluc细胞再增殖的影响。具体实验操作如下：
1、实验方法：
(1)将利用医用直线加速器放疗(放疗照射剂量为10Gy)后的U87细胞、U87-CASP3DN细胞于当天消化，然后1.5×104/孔接种于24孔板之中，采用2％胎牛血清培养基进行培养，培养温度为37℃，培养时间为24h。
(2)培养24h后，向接种U87细胞或U87-CASP3DN细胞的培养孔中接种U87-Fluc细胞(接种量为100个/孔)，继续培养12天，每2天更换一次2％胎牛血清培养基。为了进行对比，设置了一组只铺入U87-Fluc细胞(U87-Fluc细胞单独培养组)，作为阴性对照。
培养12天后，利用细胞活体成像仪对24孔板进行细胞成像，检测U87-Fluc细胞的荧光素酶活性，反应U87-Fluc细胞的再增殖情况。采用细胞活体成像仪进行细胞成像以及数据分析处理的具体操作与实施与上文相同，具体不再赘述。具体实验结果如图6所示。
2、实验结果
由图6可知，与经10Gy放疗照射后的U87细胞相比较，经10Gy放疗照射后的U87-CASP3DN细胞促进U87-Fluc细胞再增殖的能力明显削弱。由此说明，抑制胶质瘤细胞cleaved caspase-3活性后，这些细胞放疗后促进周围胶质瘤细胞再增殖的能力明显减弱。因此，可以通过抑制cleaved caspase-3蛋白表达和/或功能来抑制胶质瘤细胞放疗后再增殖。
(三)Cleaved caspase-3蛋白表达与胶质瘤患者预后的关系研究
实施例8：探究Cleaved caspase-3蛋白表达与胶质瘤患者预后评估中的价值
1、实验方法
(1)免疫组织化学法检测实验方法
免疫组织化学法检测实验方法的具体步骤如下：
1)烤片：将载有组织切片的载片架置于60℃烘箱中2小时。
2)脱蜡和水化。将载有组织切片的载片架依次浸入下述溶液：二甲苯10分钟→二甲苯10分钟→无水乙醇5分钟→95％乙醇5分钟→75％乙醇5分钟。
3)PBS洗两次，每次5分钟。
4)抗原修复。将Tris-EDTA缓冲液倒入高压锅中，加热至初步沸腾。将组织切片浸入至抗原修复液中，盖上高压锅盖继续加热。待高压锅盖压力阀被蒸汽顶起时，开始计时3分钟。3分钟后关闭高压锅，打开锅盖，使修复液及切片自然冷却至室温。
5)PBS洗两次，每次5分钟。
6)滴加免疫组化封闭液，室温封闭半个小时。
7)甩去封闭液，滴加抗cleaved caspase-3一抗(#9664；Cell SignalingTechnology,Inc.)，4℃过夜。
8)PBS洗三次，每次5分钟。
9)滴加免疫组化试剂盒中的二抗，37℃孵育半个小时。
10)PBS洗三次，每次5分钟。
11)DAB显色。按1:50体积比将免疫组化试剂盒中DAB原液和稀释液混合后，滴加到载玻片上的标本上。在显微镜下观察显色程度，待棕色呈现至适当程度后，将载玻片置于水中，终止显色。
12)将显色完毕的组织切片置于载片架上，流水冲洗30分钟。
13)将载有组织切片的载片架浸入苏木素染液中5分钟。
14)流水冲洗掉多余苏木素染液，再次浸入0.5％盐酸酒精中3秒钟，完成分化。
15)流水冲洗半小时，使苏木素充分蓝化。
16)脱水。将载有组织切片的载片架依次浸入下述溶液：75％乙醇5分钟→95％乙醇5分钟→无水乙醇5分钟→无水乙醇5分钟→二甲苯10分钟。
17)将载有组织切片的载片架置于60℃烘箱中，烘干切片后，用中性树胶封片。
(2)组织芯片免疫组织化学染色评分
根据现有标准，对组织芯片染色程度进行评估。
免疫组织化学染色评分有染色分布和染色强度两个指标相乘得到。
染色分布评分按染色阳性细胞百分比分类，具体如下：0％的肿瘤细胞出现阳性着色为0分，(0％，1％]的肿瘤细胞出现阳性着色为1分，(1％，10％]的肿瘤细胞出现阳性着色为2分，(10％，30％]的肿瘤细胞出现阳性着色为3分；＞30％的肿瘤细胞出现阳性着色为4分。染色分布评分示意图如图7所示。
染色强度评分如下：阴性染色为0分，弱染色为1分，中度染色为2分，强染色为3分。染色强度评分示意图如图7所示。
染色分布评分×染色强度评分记为最终评分结果，最高分12分。0～6分为低表达，7～12分为高表达。评分由两名独立观察员进行评估，有差异的部分交由第三名有经验的观察员仲裁处理。
(3)组织芯片统计学分析
为明确Cleaved caspase-3蛋白表达在胶质瘤患者预后判断中的意义，购买含有180例胶质瘤标本的胶质瘤组织芯片(ZL-BraGsur1801，上海威奥生物科技有限公司)，采用实施例8所述的免疫组化方法对含有180例胶质瘤标本的组织芯片进行cleaved caspase-3免疫组化染色，并按实施例8所述组织芯片免疫组织化学染色评分方法进行评分。结合180例患者的临床基本特征资料，首先通过卡方检验(Chi-square test)、Spearman相关性分析等统计学方法分析180例胶质瘤患者肿瘤组织样本中cleaved caspase-3表达情况与临床病理特征的相关性。此外，通过Kaplan-Meier法生存分析、采用log-rank检验分析180例胶质瘤患者肿瘤组织样本中cleaved caspase-3蛋白的表达水平与胶质瘤临床生存期的关系。再者，通过单因素和多因素COX比例风险回归模型分析180例胶质瘤患者肿瘤组织样本中Cleaved caspase-3表达水平作为胶质瘤独立预后预测指标的可能性。
2、实验结果
(1)卡方检验、Spearman相关性分析180例胶质瘤患者肿瘤组织样本中cleavedcaspase-3表达情况与临床病理特征的相关性
卡方检验分析组织芯片中180例胶质瘤患者的肿瘤组织中cleaved caspase-3蛋白表达和临床病理特征之间的相关性的结果如表1所示。
表1不同临床病理特征的胶质瘤患者中cleaved caspase-3表达情况
Figure BDA0003238192140000171
*有显著统计学差异。
由表1可知，在180例人胶质瘤组织标本中，cleaved caspase-3蛋白表达高低与性别、年龄无显著相关性；但是Spearman相关性分析显示cleaved caspase-3蛋白表达高低与胶质瘤WHO分级有显著相关性：WHO恶性程度分级越高，cleaved caspase-3蛋白高表达患者人数愈多(Spearman rho＝0.188，p＝0.011)。这些数据表明胶质瘤恶性程度越高，肿瘤组织中cleaved caspase-3蛋白表达程度越高。
(2)高级别胶质瘤、低级别胶质瘤中cleaved caspase-3表达水平分析
根据免疫组织化学评分结果，将180例胶质瘤患者分为cleaved caspase-3蛋白高表达组和cleaved caspase-3蛋白低表达组。我们进一步比较高级别胶质瘤中(III、IV级)与低级别胶质瘤中(I、II)中cleaved caspase-3蛋白表达水平的差异。结果如图8所示。
由图8可知，在高级别胶质瘤(WHO III级和IV级)中，cleaved caspase-3表达显著高于其在低级别胶质瘤(WHO I级和II级)中表达。
(3)胶质瘤患者肿瘤组织样本中cleaved caspase-3蛋白的表达水平与胶质瘤临床生存期的关系
采用Kaplan-Meier法和Log-rank检验对组织芯片中的180例胶质瘤患者的cleaved caspase-3蛋白表达水平与生存时间的关系进行分析，评估cleaved caspase-3蛋白表达水平用于预测胶质瘤患者预后的价值，其结果如图9所示。
由图8中B可知，cleaved caspase-3蛋白高表达组胶质瘤患者的生存时间较cleaved caspase-3蛋白低表达组短(P＜0.001)，生存预后差。
(4)COX回归分析cleaved caspase-3表达水平评估作为胶质瘤独立预后预测指标的可能性
采用Cox比例风险模型对cleaved caspase-3蛋白表达水平作为胶质瘤独立预后预测指标的可能性进行评估。Cox回归分析结果如表2所示。
表2 Cleaved caspase-3预后价值的单因素和多因素COX回归分析
Figure BDA0003238192140000181
*有显著统计学差异。
由表2可知，经过单因素和多因素COX风险回归模型分析，Cleaved caspase-3蛋白表达情况被认为是判断胶质瘤预后的独立危险因素(相对风险比：0.573，95％置信区间：0.415-0.792)，即cleaved caspase-3高表达是表明胶质瘤患者较差生存预后的独立预测指标。因此，cleaved caspase-3表达情况是胶质瘤的一种新的预后生物标志物。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，但不仅限于上述实例，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1. 抑制cleaved caspase-3蛋白表达和/或功能的物质在制备用于抑制胶质瘤细胞放疗后再增殖的产品中的应用，或在抑制胶质瘤细胞放疗后再增殖中的应用。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制cleaved caspase-3蛋白表达和/或功能的物质包括：抑制caspase-3转变成cleaved caspase-3的物质、抑制cleavedcaspase-3活性的小分子抑制剂、具有竞争性抑制作用的显性负性突变体。
3. 一种抑制胶质瘤细胞放疗后再增殖的产品，其特征在于，所述产品中含有抑制cleaved caspase-3蛋白表达和/或功能的物质。
4. Cleaved caspase-3蛋白的检测试剂在制备预测胶质瘤预后的产品中的应用。
5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述产品通过免疫组织化学法、WesternBlot或酶联免疫吸附法检测样本中cleaved caspase-3蛋白的表达水平。
6. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述检测试剂为特异性检测cleavedcaspase-3蛋白的分子。
7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述特异性检测cleaved caspase-3蛋白的分子为核酸或蛋白质。
8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述蛋白质为与cleaved caspase-3蛋白特异性结合的抗体。
9.根据权利要求5-8任一所述的应用，其特征在于，所述样本为组织、血清或细胞。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述产品为试剂盒、芯片或制剂。
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