CN111621567A - 用于诊断肝癌的标志物及其检测试剂和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域，用于诊断肝癌的标志物及其检测试剂和应用，具体涉及TRAF2在肝癌诊治中的应用。本发明提供一种用于诊断肝癌的标志物，所述的标志物为TRAF2，所述TRAF2在肝癌患者中表达上调。本发明为肝癌的诊断提供了新的生物标志物TRAF2，并且TRAF2可以作为治疗肝癌的新型靶点，为筛选诊治肝癌药物及治疗肝癌提供了新方向。

Description

用于诊断肝癌的标志物及其检测试剂和应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，用于诊断肝癌的标志物及其检测试剂和应用，具体涉及TRAF2在肝癌诊治中的应用。
背景技术
原发性肝癌(Primary liver cancer，PLC)是为数不多的发病率持续上升的肿瘤之一，在世界范围内，肝癌位居癌症相关死亡肿瘤的第四位。中国是肝癌大国，根据世界卫生组织统计，2018年我国新增肝癌392868例(9.2％)，死亡368960例(12.9％)，无论是发病率还是死亡率均居所有肿瘤的第三位。尽管肝癌的诊断和治疗有一定进展，但由于肝癌起病隐匿，早期征兆多不典型，就诊时常已处于疾病进展阶段，因此肝癌不仅发病率增高，肝癌患者的总体生存率低。因此研究人类肝癌早期发生及其发展的主要分子机制，鉴定新的肝癌高灵敏度和特异性标记物，对于不断寻求新的肝癌分子诊断与治疗疗法方式等也有着深远的现实意义。
近年来，对原发性肝癌发病机制的研究越来越多，目前的研究主要集中在基因水平的突变及相关的信号通路。端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)启动子区的突变是最常见的遗传变异，约占肝癌突变的60％，此外TP53、ARIDA1A、CTNNB1、Axin1的启动子区也是常见的突变区域。目前已知的参与原发性肝癌发生发展的信号通路主要有NF-κB通路，自噬通路，PI3K/AKT/mTOR信号通路等信号通路，这些与肝癌发生发展相关的基因突变及相关信号通路的改变通过影响细胞增殖与凋亡，细胞分化等生物学过程，导致其正常生理调控紊乱，最终导致肿瘤发生。因此通过靶向癌基因及相关信号通路中的关键分子，有助于早期预防肿瘤进展，为肝癌的治疗提供新的策略。
肿瘤坏死因子受体相关因子家族(Tumor necrosis factor receptor-associated factor，TRAF)是一类重要的接头蛋白，目前TRAF家族有7名成员(TRAF1-TRAF7)。TRAF家族一个典型的特点是在它们的C末端有一个共同的保守区域(TRAF7除外)，即TRAF结构域。TRAF结构域介导蛋白质-蛋白质的相互作用，不仅可以介导TRAF分子与上下游通路信号分子的相互作用，同时还可以介导TRAF的寡聚化。因此，TRAF家族的一个重要作用是在受体相关信号复合物的组装中充当衔接蛋白的角色，将上游受体与下游效应分子连接起来。此外，TRAF家族成员含RING结构，因此也被认为具有E3泛素连接酶的活性。泛素化修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰，依赖于泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasomesystem，UPS)。UPS是细胞内蛋白质降解的一种方式，对于维持蛋白质稳态至关重要。蛋白质泛素化是一种依赖ATP的三步酶促级联反应，首先泛素激活酶E1活化泛素分子(ubiquitin，Ub)，接着活化的Ub被转移到泛素结合酶E2；最后，泛素连接酶E3，识别并募集靶蛋白，催化泛素从E2到靶蛋白的转移，此过程通常需要泛素分子共价附于靶蛋白的赖氨酸残基(K)上来实现。目前TRAF2已被证明具有泛素E3连接酶活性。
现有的研究表明TRAF2在多种肿瘤组织中异常扩增重排，并且在多种肿瘤组织中突变，其最常见的突变形式为错义突变，TRAF2参与包括NF-κB等在内多种信号通路的调控，调控肿瘤细胞的增殖存活等重要生物学过程，因此深入探究TRAF2在肝癌中的表达水平及其作用机制，将为阐明肝癌发生进展的分子机制奠定基础，为肝癌的早期诊治提供潜在的靶点。
发明内容
本发明的是提供TRAF2在肝癌诊治中的应用。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种用于诊断肝癌的标志物，所述的标志物为TRAF2，所述TRAF2在肝癌患者中表达上调。
本发明提供TRAF2在制备预防或治疗肝癌的药物组合物中的应用。进一步，所述药物组合物包括TRAF2功能性表达抑制剂。
本发明提供TRAF2筛选肝癌诊治药物中的用途。
本发明提供用于检测标志物TRAF2表达水平的试剂，所述试剂包括如下引物：
TRAF2-F：5'-GCCCTTCAACCAGAAGGTGAC-3’
TRAF2-R：5’-CCAACCCCCAGACACCAGTA-3’。
本发明提供检测TRAF2表达水平的试剂在制备诊断肝癌试剂盒中的用途。所述TRAF2在肝癌患者中表达上调。
另外，本发明提供一种制剂或试剂盒，所述制剂或试剂盒含有检测TRAF2表达水平的反应试剂。
本发明第三方面，提供所述制剂或试剂盒在制备诊断肝癌产品中的应用。
本发明取得的有益效果：
本发明详细的检测了临床肝癌组织样本中TRAF2的表达水平，发现与癌旁组织相比，肝癌组织中TRAF2的mRNA和蛋白的表达水平均显著增高。构建TRAF2敲低和过表达的肝癌细胞模型，发现TRAF2能够显著促进肝癌细胞的增殖、克隆形成能力。对TRAF2发挥作用的下游靶点进行筛选，免疫共沉淀实验首次发现TRAF2与p62结合，进一步泛素化分析显示，TRAF2能够给p62分子添加非降解的K63多聚泛素链。裸鼠成瘤实验进一步证实：敲除TRAF2显著抑制小鼠皮下成瘤模型中肝癌的生长并降低瘤体的体积与质量。这些结果均显示：TRAF2能够通过对p62进行翻译后泛素化调控进而对肝癌的生长发挥显著的促进效应，而其在肝癌组织中显著性高表达有可能是参与肝癌发生与进展的关键因素。本发明为肝癌的诊断提供了新的生物标志物TRAF2，并且TRAF2可以作为治疗肝癌的新型靶点，为筛选诊治肝癌药物及治疗肝癌提供了新方向。
附图说明
图1所示为肝癌患者临床标本中癌组织与癌旁组织中TRAF2蛋白和mRNA表达水平的检测。
图2所示为敲除TRAF2对肝癌细胞增殖及克隆形成能力的影响。
图3所示为敲除TRAF2对肝癌细胞皮下成瘤能力的影响。
图4所示为过表达TRAF2对肝癌细胞增殖及克隆形成能力的影响。
图5所示为TRAF2通过与p62直接结合发挥抑癌效应
图6所示为TRAF2通过靶向泛素化调控p62发挥促癌效应。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1细胞株及培养条件
人胚肾上皮细胞293，人肝癌细胞系HepG2，Huh7，Hep3B，PLC/PRF/5，SK-HEP-1，人正常肝细胞HL-7702细胞，为本实验室长期培养的细胞系，培养条件：均采用DMEM培养基(含1％的青霉素和链霉素)，置于5％CO2，37℃培养箱进行培养。
实施例2 Real-time PCR检测TRAF2在肝癌细胞及正常肝细胞中mRNA的表达水平
1.RNA提取
(1)取六孔板中培养的细胞，加1ml Trizol裂解细胞，转移液体至无RNA酶的Eppendorf管。
(2)加入0.2ml已预冷的氯仿，用手剧烈振荡摇晃15秒后，室温静置3分钟，直至可看到清晰的分层现象。
(3)4℃，12000g离心15分钟，将上层含RNA的水相转移到新的Eppendorf管中。
(4)加入0.5ml已预冷的异丙醇，上下颠倒混匀后，室温静置10分钟。
(5)4℃，10000g离心10分钟；弃上清，加入1ml 75％乙醇来洗涤RNA沉淀。4℃，7500g离心5分钟，弃上清。
(6)室温下干燥约5～10分钟。加入20μl～50μl无RNase的水，枪头吹打几次，55～60℃放置10分钟使RNA完全溶解。
(7)用NanoDrop仪器测定RNA的浓度。
2.逆转录合成cDNA
在无RNA酶的PCR管中先后加入以下试剂：
Figure BDA0002533571940000041
逆转录程序：37℃，15min；85℃，5s，结束反应。
3.荧光定量RT-PCR实验
实验中所用的引物来源于已经发表文献经过验证的引物序列，以cDNA为模板，按照试剂盒说明书逐一添加其他组分，荧光定量PCR反应体系及程序见下表：
Figure BDA0002533571940000042
PCR程序：95℃预变性30s→95℃5s→60℃30s，重复40个循环；
每个样品做三个复孔，实时定量PCR仪会根据标准曲线自动地读出各个样品的Ct值，以此计算出每一个样品的拷贝数，随后分别取两个样品定量结果的平均值，最后以GAPDH基因作为内参基因，分别校对每个样品的基因拷贝数。
如图1所示，通过定量RT-PCR检测，5株肝癌细胞株中TRAF2mRNA表达水平显著高于正常HL7702细胞。
实施例3肝癌患者临床标本中癌组织与癌旁组织中TRAF2蛋白表达水平的检测。
本发明共有临床组织标本120对，其中组织芯片90对样本用于免疫组织化学染色检测TRAF2的表达水平，30对通过Western blot检测TRAF2的蛋白表达水平，组织来自浙江大学附属第一医院。
1.组织蛋白的提取
(1)采用液氮研磨的方式，将获得的肝癌临床样本组织置于研钵中，并加入液氮进行研磨，研磨过程中要保证研钵中始终有液氮。当组织样本研钵至粉末时即可，转入EP管中，并加入蛋白裂解液。
(2)裂解：裂解液中需提前加入蛋白酶抑制剂与磷酸酶抑制，比例为：50:1:5，裂解30min，每隔10min混匀一次，整个裂解过程在冰上操作。13600rpm，4℃，30min，将上清导入新的1.5ml EP管中备用。
(3)蛋白浓度测定：采用BCA蛋白定量试剂盒进行测定，具体方法按照试剂盒说明书进行，采用M5酶标仪读数。
2.Western blot
(1)蛋白凝胶的制备：
分离胶：
Figure BDA0002533571940000051
浓缩胶：
Figure BDA0002533571940000052
(2)变性样品制备：之前已经测好浓度的蛋白样品，根据上样体积加入适量4×SDSsample buffer，并加水补齐，以保证每个样品的总体积相同。100℃，10min金属浴，使蛋白完全变性。13600rpm，RT，1min离心备用；
(3)凝胶电泳：小心拔出制胶梳，清水轻柔的冲洗一次后，将其固定于电泳槽中，并加入1×SDS电泳液；将准备好的蛋白样品按实验需求逐一上样，需要注意，上样过程中尽量避免蛋白样品的丢失。蛋白电泳程序为：60V→marker清晰分开→120V→溴酚蓝至凝胶底部，结束跑胶(保持恒压)。
(4)转膜：提前准备好转膜所需的滤纸，海绵垫，NC膜用铅笔做好标记并提前浸润于转膜液中备用；电泳结束，撬开制胶版，取出凝胶置于转膜液中，按照海绵垫，滤纸，NC膜，蛋白凝胶的顺序制备“三明治夹心”转膜结构，此过程中每一步都要赶气泡，之后平移转到转膜内胆槽中，正极在下，负极在上；转膜槽中灌满转膜液，外周加入冰水混合物降温，转膜程序：恒流250mA，75min。
(5)封闭：转膜结束，1×TBST清洗NC膜一次，之后丽春红染色液染色，根据条带的位置大小裁剪NC膜；1×TBST清洗丽春红至红色脱掉，5％的脱脂牛奶封闭NC膜，摇床上缓慢进行，45-60min。
(6)一抗孵育：封闭结束，1×TBST清洗残存牛奶，不同的目的分子根据说明书分别配置一抗稀释液，一般选用1％脱脂牛奶或5％BSA，置于4℃冰箱，摇床孵育12-15小时。
(7)一抗回收，洗膜：孵育一抗结束后回收至15ml离心管中，置于-20℃冰箱冻存。1×TBST洗涤NC膜3次，每次10min。
(8)二抗孵育：根据一抗属性用3％的脱脂牛奶配置相应二抗，比例为1:10000，1小时，室温，缓慢孵育。
(9)洗膜：二抗孵育结束后，按照与洗涤一抗相同的步骤洗涤三次，静置等待WB曝光。
(10)曝光与图像采集：ECL1:1混匀显色5min，暗示中曝光X光胶片，曝光时间根据目的条带信号强弱调整，之后扫描仪扫描胶片，保存图像，并分析结果。
如图1所示，经western blot检测，临床肝癌组织中TRAF2的蛋白表达水平显著高于癌旁组织。
实施例4免疫组化检测TRAF2在肝癌和癌旁组织中的表达情况
(1)烤片：将组织芯片放置烘箱中，温度调至63℃，烤蜡1h，使表面蜡融化
(2)组织脱蜡：将切片依次至于二甲苯15min、二甲苯Ⅱ15min、100％酒精5min、100％酒精Ⅱ5min、90％酒精5min、80％酒精5min、75％酒精5min，进行脱蜡和水化处理。
(3)漂洗切片：用蒸馏水漂洗切片三次，每次5min；继续用PBS洗涤三次，每次5min。
(4)抗原修复：使用DAKO全自动免疫组化预处理系统仪器修复。
(5)滴加3％H2O2，37℃孵育30min，取出芯片，用PBS洗涤三次，每次5min。
(6)封闭：滴加山羊血清封闭液，37℃孵育30min。
(7)一抗孵育：弃去山羊血清封闭液，擦干组织周围液体，直接滴加稀释后的一抗，4℃过夜。
(8)复温：将湿盒取出置于37℃孵育30min。
(9)PBS洗涤三次，每次洗5min。滴加二抗，37℃孵育30min。
(10)PBS洗涤三次，每次洗5min；滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37℃孵育30min。
(11)用PBS洗涤，每次洗5min，共洗三次。
(12)DAB显色：DAB显色液按说明书配置，滴加DAB显色液，镜下观察控制显色时间，蒸馏水终止显色。
(13)苏木素复染10min。
如图1所示，免疫组化染色图片显示TRAF2在肝癌组织中染色强度显著高于临近癌旁组织，对染色强度定量后，利用SPSS软件经T检验分析发现，肝癌组织中TRAF2的表达水平显著高于癌旁组织。
实施例5 ATPlite细胞增殖实验
(1)Huh7和Hep3B细胞，提前按实验需求进行预处理，并计数，96孔板每孔中接种1500个细胞，并做三个复孔；
(2)第二天，每孔中加入35μl的ATPlite，避光混匀5min后，导出至白色96孔板，酶标仪读数；
(3)重复第二天步骤，共监测5天；
(4)之后每天的读数与第一天做比值，绘制生长曲线。共重复三次，做统计学分析。
如图3所示，经ATPlite试剂盒检测后发现，Huh7与Hep3B细胞分别敲除TRAF2基因后，Huh7与Hep3B细胞增殖能力显著下降。图4，在敲除TRAF2的Huh7细胞中重新转入TRAF2的过表达质粒后，Huh7细胞增殖能力显著强于对照组。
实施例6克隆形成实验
准备：加入2.5ml 0.1％gelatin，静置20分钟左右使明胶凝固。
(1)60mm培养皿中加入2.5ml 0.1％gelatin，静置20分钟左右使明胶凝固。Huh7与Hep3B细胞株消化离心并计数，每个60mm培养皿中接种Huh7与Hep3B细胞各300个，并做三个复孔；
(2)细胞生长7-10天左右时显微镜下观察克隆大小，当克隆细胞数＞50个时，收取细胞进行考马斯亮蓝染色；
(3)弃去培养基，常温1×PBS清洗培养皿，并吸走残存液体，每皿中加入2.5ml考马斯染料，常温染色20-30分钟；
(4)染色结束，回收染料，并清水冲洗，室温晾干；
(5)用凝胶成像系统，选择coomassie模式拍照并保存，计数克隆数量并分析。
如图3所示，经ATPlite试剂盒检测后发现，敲除TRAF2后，Huh7与Hep3B细胞增殖能力显著下降。
如图3所示，经考马斯亮蓝染色后发现，Huh7与Hep3B细胞分别敲除TRAF2基因后，Huh7与Hep3B细胞克隆形成显著下降。图4，在敲除TRAF2的Huh7细胞中重新转入TRAF2的过表达质粒后，Huh7细胞克隆形成能力显著强于对照组。
实施例7裸鼠皮下成瘤实验
(1)细胞准备：敲除TRAF2的Huh7细胞及对照细胞正常培养，选取生长状态良好的细胞进行传代计数；
(2)裸鼠准备：4-5周龄，免疫缺陷雄性裸鼠购于江苏集萃药康生物公司，裸鼠饲养在免疫缺陷鼠专用房间，每只裸鼠用耳钉进行标记，并称量体重。根据实验设计每组5只裸鼠；
(3)细胞计数：接种数量为：1×106个细胞，细胞消化离心后进行计数，用1×PBS重悬细胞，使得细胞悬液的浓度为1×107个细胞/ml。充分混匀细胞悬液后，每组各分装6支EP管，每管100μl；
(4)细胞接种：接种方式：皮下接种；接种部位：裸鼠侧腹部靠近臀部的位置；接种前用其中一管细胞悬液先润洗胰岛素针，100μl细胞悬液全部接种；
(5)肿瘤体积测量与裸鼠称重：每隔三天称量裸鼠体重与肿瘤长、短径并记录；
(6)待肿瘤最大直径长至1-1.5cm左右时采用颈椎脱臼的方式处死裸鼠，取出皮下瘤拍照，称重，并分割肿瘤组织一部分用于WB，一部分用于RT-PCR，一部分用于免疫组化(固定在组织标本固定液中)，剩余标本冻存于液氮中备用。
如图4所示，Huh7-sgTRAF2细胞与Huh7-sgCtrl细胞制备成细胞悬液后，接种至裸鼠皮下，经14天观察记录后发现，敲除TRAF2后形成的皮下瘤的体积，重量均小于对照组。
实施例8免疫共沉淀实验(Co-IP)
1.外源Co-IP
(1)前一天细胞铺板，第二天细胞转染质粒(具体质粒量根据实验设计来)，转染48小时后细胞刮收取细胞，可直接进行第二步或放-80细胞℃备用；
(2)裂解细胞，收取细胞上清至EP管中备用，预留出45μl全细胞裂解液并加入15μl4×SDS sample buffer作为对照(WCE)。若定量检测相互作用，则需要蛋白浓度；若只定性则直接进行第三步实验；
(3)取适量偶联抗体的beads，加入1ml不加蛋白酶抑制剂的裂解液洗去beads保护液，4℃，5000rpm，离心1min，尽量弃去上清。
(4)将剩余的上清转移到已准备好的beads中，4℃冰箱，垂直摇床旋转孵育3小时；
(5)beads洗脱，4℃，5000rpm离心1min，弃上清，再5000rpm离心30s，吸走残余液。beads中加入1ml wash buffer，4℃，5000rpm离心1min洗涤beads，重复4次。最后一次离心结束后，再离心30s，用枪头吸尽残余液体；
(6)beads中加入适量2×SDS sample buffer，1100rpm，震荡15s，重复两次；
(7)与WCE一起金属浴，100℃，WCE 10min，IP样品5min；
(8)蛋白变性后，RT，13600rpm离心1min，之后进行WB检测。
2.内源Co-IP
内源免疫共沉淀步骤与外源类似，增加孵育抗体一步：细胞裂解上清液中，分别加入特定抗体与Normal IgG做为对照，4℃冰箱，孵育2-4小时；准备好20μl Protein Gbeads，方法同外源，将孵育过抗体的样品全部转入已加好的Protein G beads的EP管中，继续4℃冰箱，孵育3小时；如图5所示，经过外源与内源Co-IP检测发现，TRAF2与p62结合。
实施例9泛素化水平检测
本实验中p62蛋白泛素化水平检测采用外源Co-IP的方法，由于实验中带Ub的质粒为HA标签，因此实验采用HA beads进行。收取样品，裂解蛋白后测定浓度，每组样品中加入15μl HA beads，后与beads共孵育进行后续步骤。如图6所示，泛素E3连接酶TRAF2能够给p62添加泛素链。
实施例10数据分析
本发明中，生存分析采用Kaplan-Meier法分析，实验数据采用SPSS 20.0软件进行统计分析。细胞增殖与存活实验组间差异采用方差分析(ANOVA)与Student’s t-test检验，p<0.05表示差异有统计学意义，结果用GraphPad Prism 8.0软件进行制图。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 用于诊断肝癌的标志物及其检测试剂和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcccttcaac cagaaggtga c 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccaaccccca gacaccagta 20

Claims (9)

1.用于诊断肝癌的标志物，所述的标志物为TRAF2。
2.权利要求1所述标志物在制备筛选肝癌诊治试剂或试剂盒中的用途。
3.权利要求1所述标志物在制备预防或治疗肝癌的药物或药物组合物中的应用，所述药物组合物包括TRAF2功能性表达抑制剂。
4.权利要求1所述标志物在筛选肝癌诊治药物中的用途。
5.用于检测权利要求1所述标志物表达水平的试剂，所述试剂包括如下引物：
TRAF2-F：5'-GCCCTTCAACCAGAAGGTGAC-3’
TRAF2-R：5’-CCAACCCCCAGACACCAGTA-3’。
6.根据权利要求3所述的试剂，其中扩增引物的扩增方法为TaqMan探针法。
7.权利要求2所述试剂在诊断肝癌和预测肝癌转移中的应用。
8.用于诊断肝癌的试剂盒，包含用于检测权利要求1所述标志物的试剂。
9.权利要求6所述试剂盒在诊断肝癌和预测肝癌转移中的应用。
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