CN108795938A - 肺腺癌外泌体特异miRNA及其靶基因与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了肺腺癌外泌体特异miRNA及其靶基因与应用。本发明利用高通量测序技术，结合系统的生物信息学分析方法，筛选得到与肺腺癌相关的特异性高含量外泌体miRNA，其RNA序列如SEQ ID NO.1‑3所示。本发明发现这些miRNA的共同靶基因是FOXN3，该基因能够抑制成纤维细胞的迁移能力，其表达量的降低促进成纤维细胞进入肿瘤组织，并促进肿瘤生长。本发明提供的肺腺癌外泌体特异性miRNA及其靶基因可以用作肺腺癌诊断标志物及制备诊断试剂盒，miRNA的抑制剂或其靶基因的表达促进剂可用于制备治疗肺腺癌的药物，或用于对肺腺癌的治疗进行用药指导，具备较好的临床应用价值和广阔的应用前景。

Description

肺腺癌外泌体特异miRNA及其靶基因与应用
技术领域
本发明涉及肺腺癌诊断技术领域，具体地说涉及肺腺癌外泌体特异miRNA及其靶基因在肺腺癌诊断中的应用。
背景技术
肺癌死亡率居我国居民肿瘤死亡率的第一位，肺腺癌属于肺癌的一种，发病年龄较低，女性及不吸烟者相对多见，由于早期无明显的临床症状，且容易发生血行转移，而导致诊断即晚期。又因为对于该疾病晚期阶段肿瘤细胞的遗传学特征尚不明确，致使治疗手段单一，限于手术和放、化疗，而靶向药物仅针对特定型肿瘤细胞如EGFR阳性细胞，且易发生耐药，致使预后不良。因此，提高肺腺癌的早期检出率和延长晚期肺腺癌的生存期对提高肺癌的治疗效果具有重要的意义。
肿瘤的发生、发展除由自身肿瘤相关基因变异导致的细胞增殖能力升高、转移能力增强，细胞恶变，破坏正常的组织生理功能外，与肿瘤微环境的支持作用密不可分。现已被科学家普遍认可的“种子与土壤”假说认为：肿瘤细胞作为种子，其增殖、侵袭、血管生成以及抗药性都与土壤——即肿瘤微环境有密切的关系。其中，肿瘤相关成纤维细胞(CAF)是肿瘤微环境的重要组成部分，是由正常成纤维细胞(NF)受肿瘤细胞影响转化而成，并进一步对肿瘤的增殖和转移具有直接或间接的促进作用。已有研究表明，仅针对肿瘤细胞杀伤的靶向药物对肿瘤的抑制效果是不够的，如能够结合杀伤CAF细胞可以起到更好的治疗肿瘤的作用，因此，肿瘤相关成纤维细胞已成为肿瘤治疗新手段的重要靶标对象。目前研究表明，肿瘤细胞可以通过分泌细胞因子，如TGF-β、PDGF等，对肿瘤周围的NF进行影响和教育，使其转化为CAF。但肿瘤细胞如何促使NF向CAF转化，导致功能改变，如何促进CAF向肿瘤内部迁移等机制尚未明确。因此，阐明该机制有助于更精确的切断肿瘤细胞与成纤维细胞之间的细胞通讯，更有效的抑制CAF对肿瘤的促进作用，从而发展新型的肿瘤治疗方法。
目前，临床常用于辅助诊断肺癌方法，如X射线，放射性核素检查，血清肿瘤标志物，低剂量螺旋CT(LDCT)检查等。早期肺癌常表现为无症状的肺结节，常规的检测手段很难发现，而目前筛查到微小肺结节的最有效检测方法为低剂量螺旋CT。但由于仪器费用昂贵导致检测费用高，影像诊断技术专业人才缺乏，对病人有一定的辐射副作用等因素，现仍然处于起步阶段，在基层医院尚未普及。
血清肿瘤标志物检测具有方便，快捷，价格适中等优点，是临床上肿瘤辅助诊断的常用方法。欧洲肿瘤标志物小组(EGTM)和美国临床生化学会(NACB)推荐的用于临床辅助诊断肺癌的血清肿瘤标志物蛋白分子已经有很多种。例如癌胚抗原(CEA)鉴别肺腺癌、神经元特异烯醇化酶(NSE)鉴别小细胞肺癌、鳞状上皮细胞癌抗原(SCC)鉴别诊断肺鳞癌、细胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)鉴别诊断非小细胞肺癌。这些分子虽然能够在临床诊断中尤其针对肺癌分类方面具有提示作用，但由于这些蛋白分子在其他多种肿瘤病人的外周血中的含量也呈高水平，例如CEA在肺腺癌病人外周血中可以检出，在胃肠肿瘤及其他腺癌病人中也具有辅助诊断意义，导致该标志物对肺癌特异性检测(如缺乏明显的影像学特征时)应用性降低。因此，肺癌及其亚型特异性的肿瘤分子标志物有助于更加精确的诊断肺癌病人。
外泌体(exosome)是新近发现的细胞通讯载体，由细胞质膜内陷形成直径为30-100nm的囊泡，包裹蛋白质、核酸等多种分子并释放到细胞外。外泌体可以随外周血等体液在各个组织器官间传递，进入受体细胞并发挥细胞通讯的作用。由于外泌体内含有多种具有基因调控功能的RNA，如microRNA(miRNA)、长链非编码RNA等，因此可以改变受体细胞的基因表达，影响其功能。研究表明，肿瘤细胞能分泌大量的外泌体，促进肿瘤的发展和转移，这种促肿瘤作用可能与其影响肿瘤微环境中的细胞有关。另外，由于外泌体是肿瘤主动释放的，内含肿瘤来源的特异性分子；囊泡外膜由脂质双分子层组成，理化性质稳定，能够保护其内容物免于被降解；而且能够在包括外周血、尿液、唾液等多种体液中检出，因此，外泌体是良好的肿瘤液体活检的标志物。综上，对于肿瘤分泌的外泌体成分的明确和作用的阐明能够为发展新型肿瘤治疗策略、发现新的特异性的肿瘤标志物提供帮助。
miRNA是一类内源性、高度保守、非编码的小分子RNA，长度通常为18-25nt。miRNA主要通过抑制蛋白编码基因的翻译或降解mRNA来发挥调控作用。研究表明：miRNA可广泛参与发育周期、细胞增殖和分化、细胞凋亡、新陈代谢、神经调控、肿瘤发生以及病毒和宿主的相互作用等各种生理和病理的调控过程。miRNA所在基因座的缺失、扩增、突变、表观遗传修饰沉默等均可引起miRNA的异常表达或调控，从而导致肿瘤的发生。人类大约有50％的已注释miRNA位于和癌症相关的脆性位点及基因组区域中,并且miRNA的表达与多种肿瘤相关,可能在肿瘤中起着原癌或抑癌基因的作用。
miRNA作为分子标志物用于癌症临床分子诊断是一个必然的趋势。现阶段尚未见成熟的miRNA分子标志物应用于临床诊断肺腺癌的技术与产品。
发明内容
本发明的目的在于提供一种肺腺癌外泌体特异miRNA及其应用。
本发明的另一目的在于提供肺腺癌外泌体相关的特异miRNA的靶基因及其应用。
本发明利用新一代高通量测序技术，结合系统的生物信息学分析方法，筛选得到3个肺腺癌外泌体特异miRNA，其名称为hsa-miR-22-3p，hsa-miR-21-5p，hsa-miR-21-3p。其RNA序列分别如SEQ ID NO.1-3所示。
miRNA名称 序列
hsa-miR-22-3p AAGCUGCCAGUUGAAGAACUGU(SEQ ID NO.1)
hsa-miR-21-5p UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA(SEQ ID NO.2)
hsa-miR-21-3p CAACACCAGUCGAUGGGCUGU(SEQ ID NO.3)
上述3个肺腺癌外泌体特异miRNA中的任一个或多个可作为分子标志物用于诊断肺腺癌。
因此，本发明提供了上述3个肺腺癌外泌体特异miRNA中的任一个或多个在制备肺腺癌诊断试剂盒中的应用。
本发明提供了FOXN3基因表达量的检测试剂或能够调控FOXN3基因的miRNA的检测试剂在制备肺腺癌诊断试剂盒或肺腺癌用药效果评价体系中的应用。
本发明提供了上述3个肺腺癌外泌体特异miRNA中的任一个或多个在制备肺腺癌用药效果评价体系中的应用。
本发明提供了上述3个肺腺癌外泌体特异miRNA中的任一个或多个的抑制剂在制备治疗肺腺癌药物中的应用，所述miRNA的抑制剂为miRNA转录抑制剂、miRNA转录后加工抑制剂或miRNA转录加工成熟后的功能抑制剂。
本发明提供了上述3个肺腺癌外泌体特异miRNA中的任一个或多个的检测试剂在制备肺腺癌用药效果评价体系中的应用。
本发明提供了含有上述任一或多个特异miRNA的检测试剂的肺腺癌诊断试剂盒。所述试剂盒通过检测外周血中所述特异miRNA的表达量实现肺腺癌的诊断。
所述检测miRNA的检测试剂包括检测所述miRNA的探针或者扩增所述miRNA的引物。本领域技术人员应当理解，所述的检测试剂为能检测到上述特异miRNA表达量的任何公知试剂，例如含有检测目标特异miRNA的引物的检测试剂，通过对体液、组织样本进行实时荧光定量PCR(qPCR)的方法实现对特异miRNA表达量的定量检测，根据表达量多少判断是否患肺腺癌。
含有上述任一或多个特异miRNA的抑制剂的肺腺癌治疗药物属于本发明的保护范围。
进一步地，本发明提供了上述特异miRNA的靶基因。
优选地，所述靶基因编码蛋白的氨基酸序列为以下任一：
(1)具有如SEQ ID NO.4和/或5所示的氨基酸序列；
(2)具有如SEQ ID NO.4和/或5所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的氨基酸序列。
本发明提供了一种肺腺癌治疗药物，含有能够调控FOXN3基因的miRNA的抑制剂。本发明所述的FOXN3基因编码蛋白的氨基酸序列含有SEQ ID NO.4和/或5所示的氨基酸序列。
本发明提供了上述靶基因在抑制成纤维细胞迁移能力中的应用。
本发明提供了上述靶基因在抑制成纤维细胞转化为非正常成纤维细胞中的应用。
本发明提供了上述靶基因的表达促进剂在制备治疗癌症的药物中的应用。所述表达促进剂包括直接促进靶基因表达的生物材料或化学材料；以及间接促进靶基因表达的生物材料或化学材料，例如对上述靶基因表达有抑制作用的非编码RNA的抑制剂。
优选地，所述癌症为肺腺癌。
本发明提供了上述靶基因的表达促进剂在制备抑制成纤维细胞癌变的药物中的应用。
本发明提供了上述靶基因的检测试剂在制备肺腺癌用药效果评价体系中的应用。
本发明还提供一种含有检测上述靶基因表达量的肺癌检测试剂盒。所述试剂盒可通过组织穿刺活检方法，检测该靶基因的表达量，实现检测目的。
本发明提供了一种含有上述靶基因表达促进剂的治疗肺癌的药物。
优选地，所述肺癌为肺腺癌。
本发明利用高通量测序技术，结合系统的生物信息学分析方法，筛选得到与肺腺癌相关的特异性高含量外泌体miRNA。这些外泌体miRNA能够促进成纤维细胞恶性转化，促进肿瘤增殖，可作为肺腺癌临床体外诊断的分子标志物。由于本发明提供的肺腺癌特异性的外泌体miRNA对成纤维细胞恶性转化具有重要的促进作用，因此它们可以作为肺腺癌治疗的靶标，用于开发特异性的肿瘤治疗药物，例如阻断肺癌外泌体的分泌、阻断成纤维细胞对于外泌体的吸收、降低外泌体中特异性miRNA的含量。
本发明还发现这些miRNA的靶基因是FOXN3，该基因能够抑制成纤维细胞的迁移能力，其表达量的降低促进成纤维细胞进入肿瘤组织，促进肿瘤生长。肿瘤组织中成纤维细胞(CAF)FOXN3的表达可以作为肿瘤活检的一个指标，用来辅助诊断肿瘤和监测预后。本发明提供的肺腺癌外泌体特异性miRNA及其靶基因可以用作肺腺癌诊断标志物及制备诊断试剂盒，FOXN3可以作为肺腺癌基因治疗的药物开发对象，即促进CAF中FOXN3的表达可以抑制CAF，进而抑制肿瘤。miRNA的抑制剂或其靶基因的表达促进剂可用于制备治疗肺腺癌的药物，或用于对肺腺癌的治疗进行用药指导，具备较好的临床应用价值和广阔的应用前景。
附图说明
图1的A图为透射电镜鉴定A549分泌的外泌体，图1的B图为A549分泌的外泌体的径粒分布，图1的C图为A549分泌的外泌体的表面蛋白标志物的鉴定图。
图2为肺腺癌与多种肿瘤分泌的外泌体miRNA的表达水平的比较分析图。MCF7，MDAMB231是乳腺癌细胞系；DKO1，DKS8，DLD1是结直肠癌细胞系；A2780，HeyA8，OVCA433，SKOV3是卵巢癌细胞系；A549是肺腺癌细胞系。
图3为肺腺癌病人组与健康组血清外泌体hsa-miR-22-3p，hsa-miR-21-5p，hsa-miR-21-3p的荧光定量检测结果。
图4为肺腺癌细胞分泌的外泌体促进正常成纤维细胞向肿瘤相关成纤维细胞转化的表现图。图4的A图为被标记的A549外泌体被正常MRC5细胞吸收。图4的B图为正常MRC5细胞受A549外泌体处理后，MRC5的形态发生变化。图4的C图为qPCR定量分析α-SMA在MRC5CAF中的表达水平显著高于MRC5 Normal。图4的D图为MRC5 CAF的迁移能力要显著高于正常MRC5细胞。图中MRC5 Normal是培养在去除胎牛血清(FBS)的外泌体的完全培养基中，且未加A549外泌体孵育的人成纤维细胞；MRC5 CAF是培养在去除FBS的外泌体的完全培养基中，且加A549外泌体孵育的人成纤维细胞。
图5为软琼脂实验检测外泌体孵育后的成纤维细胞对肿瘤细胞克隆形成的影响，相较于NF分泌的外泌体，CAF分泌的外泌体显著促进A549细胞的增殖。NF是未受A549外泌体处理的MRC5细胞；CAF是A549外泌体处理后的MRC5细胞。
图6A为qPCR检测靶基因FOXN3在未受A549外泌体处理的MRC5细胞和A549外泌体处理的MRC5细胞的表达水平。被A549外泌体处理后的MRC5细胞中的FOXN3的表达水平显著低于未受A549外泌体处理的MRC5细胞的表达水平。图6B为荧光素酶报告基因分析。结果表明在A549外泌体中高度表达的hsa-miR-22-3p，hsa-miR-21-5p，hsa-miR-21-3p可以直接调控FOXN3的表达水平。
图7为抑制外泌体miRNA能促进FOXN3表达水平的效果图。图中，anti-scramble是对照组，即受A549外泌体处理的MRC5细胞；anti-hsa-miR-22-3p是抑制了A549外泌体中的hsa-miR-22-3p后，再用该外泌体处理的MRC5细胞；anti-hsa-miR-21-3p是抑制了A549外泌体中的hsa-miR-21-3p后，再用该外泌体处理的MRC5细胞；anti-hsa-miR-21-5p是抑制了A549外泌体中的hsa-miR-21-5p后，再用该外泌体处理的MRC5细胞。所用抑制剂为商业合成的针对每一个miRNA的反义核酸。图中三个P值指代anti-scramble与anti-hsa-miR-22-3p，anti-hsa-miR-21-3p或anti-hsa-miR-21-5p分别比较后的统计值。
图8为Transwell实验检测FOXN3对成纤维细胞迁移能力的影响。相对于对照MRC5细胞，通过敲低其FOXN3的表达水平，细胞的迁移能力明显增强。MRC5 shscr是对照组；MRC5shFOXN3是敲低FOXN3表达水平的MRC5细胞。
图9的A图为对成瘤两周后的BALB/c裸鼠，分别在瘤周注射PBS，正常MRC5细胞或FOXN3低表达的MRC5细胞。两周后，取出肿瘤并进行HE染色分析。相较于注射PBS和注射正常MRC5细胞，在瘤周注射FOXN3低表达的MRC5细胞组，其肿瘤切片显示出更多的成纤维细胞。图中箭头指示成纤维细胞。图9的B图为对成瘤两周后的BALB/c裸鼠，分别在瘤周注射PBS，正常MRC5细胞或FOXN3低表达的MRC5细胞。两周后，进行小鼠活体成像分析。结果表明，相较于注射PBS和注射正常MRC5细胞，在瘤周注射FOXN3低表达的MRC5细胞更能促进肿瘤细胞的生长。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1肺腺癌外泌体特异miRNA的筛选
1、外泌体的提取和鉴定
收集肺腺癌细胞系A549培养上清液。4℃，3000g离心15分钟，收集上清液置于新的EP管中。4℃，16000g离心1小时，收取上清液置于新的EP管中。4℃，120000g离心2小时，弃上清液。PBS重悬外泌体沉淀。
取10μl外泌体重悬液，滴在含碳铜网上，晾干后加1％醋酸双氧铀，静置5min，用PBS漂洗2min，用滤纸吸掉多余液体，反复清洗三次后晾干。80kV电压透射电镜下观察外泌体形态，结果如图1的A图显示。
对外泌体进行径粒分布研究，采用英国Malven公司Nanosight3000仪器，将外泌体悬液用PBS稀释至适当光学信号检测水平，混匀后检测，结果如图1的B图显示。
用BCA法测定外泌体悬液蛋白浓度，取1μg外泌体液体，western blot检测。采用外泌体标记抗体CD63和TSG101为鼠单克隆抗体(1:1000稀释)和细胞对照抗体tublin为鼠单克隆抗体(1:4000稀释)，内参蛋白GAPDH为兔多克隆抗体(1:10000稀释)。结果如图1的C图显示。
2、通过高通量测序技术，明确肺腺癌细胞中的miRNA组成，发现一组肺腺癌特异性的miRNA
通过高通量测序技术对外泌体中的miRNA进行检测，并与公共数据库中乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、结直肠癌细胞外泌体中的miRNA组成相比较，发现肺腺癌分泌的外泌体中miRNA组成具有特异性，且筛选到一组肺腺癌特异性高含量的miRNA，分别为hsa-miR-22-3p，hsa-miR-21-5p，hsa-miR-21-3p；其RNA序列分别如SEQ ID NO.1-3所示。图2热度图中显示了A549细胞分泌的外泌体miRNA的相对表达水平。其中由于hsa-miR-24-3p和hsa-miR-320a不能直接调控其靶基因FOXN3，故而舍去。
3、肺腺癌病人的外周血分离的外泌体中，发现上述特异性的miRNA高表达
实验结果如图3显示肺腺癌病人和健康对照组外周血中外泌体miRNA的相对表达水平。收集5例肺腺癌病人血清样本，5例健康人样本作为对照，通过外泌体的提取与qPCR检测(正向引物序列分别为hsa-miR-21-5p F:ACACTCCAGCTGGGTAGCTTATCAGACTGA；hsa-miR-21-3p F:ACACTCCAGCTGGGCAACACCAGTCGATG；hsa-miR-22-3p F:ACACTCCAGCTGGGAAGCTGCCAGTTGAAG；反向引物为商用通用引物，由QIAGEN公司提供)，发现上述特异性表达的miRNA在病人外泌体中的含量显著高于健康对照)。
本发明采用在5例患者样本中表达量较5例健康对照样本中表达量的差异倍数大于1.5倍，且存在显著差异(p-value<0.05)的miRNA作为肺腺癌的分子标志物。最终筛选出在肺腺癌病例样本中特异性表达的一组miRNA为：hsa-miR-22-3p，hsa-miR-21-5p，hsa-miR-21-3p。
实施例2含有特异性miRNA的外泌体促进正常成纤维细胞向肿瘤相关成纤维细胞(CAF)转化
本发明发现含有实施例筛选的3个特异性miRNA的外泌体可以被正常成纤维细胞吸收并促进正常成纤维细胞向肿瘤相关成纤维细胞(CAF)转化，表现为CAF的形态学变化，标志性分子高表达和迁移能力提高。
本实施例用绿色荧光蛋白标记A549细胞分泌的外泌体(包含hsa-miR-22-3p，hsa-miR-21-5p，hsa-miR-21-3p)，将这些外泌体与人肺成纤维细胞MRC5孵育后，发现外泌体进入成纤维细胞内部(图4的A图)，表明这些外泌体可以被成纤维细胞吸收；吸收了外泌体的成纤维细胞的细胞形态发生了变化，从原来的散乱性分布变成极性排列(图4的B图)；通过qPCR检测，发现CAF的标志性分子α-SMA表达水平显著提高(图4的C图)；采用Transwell实验发现吸收了外泌体的MRC5细胞穿过膜的细胞数量明显增加(图4的D图)，说明其迁移能力显著提高。
经含有上述特异性miRNA的外泌体孵育，转化后的MRC5细胞促进肿瘤细胞在软琼脂培养基中形成细胞克隆，转化后的成纤维细胞促进肿瘤的增殖能力(图5)。
实施例3本发明外泌体特异性miRNA促进正常成纤维细胞恶性转化的关键基因FOXN3
1、本发明发现正常成纤维细胞吸收了肿瘤细胞分泌的含有本发明所述特异性的miRNA的外泌体后，基因FOXN3的表达下降，FOXN3是这组特异性miRNA的靶分子。
用实施例1得到的肺腺癌分泌的外泌体孵育成纤维细胞MRC5，并通过qPCR方法检测了FOXN3的表达，发现吸收了外泌体后，MRC5中的FOXN3表达显著降低(图6A)；双荧光报告系统是确定miRNA的靶基因有效的检测体系，根据实施例1筛选得到的3个特异性miRNA可能在FOXN3的mRNA的3’UTR结合区域设计、合成序列，连接入含有荧光素酶报告基因luciferase载体中，转染细胞。发现这些特异性的miRNA可以抑制报告基因的表达，但是却对结合序列突变的报告基因表达没有影响(图6B)，证实FOXN3是这组miRNA的靶基因。FOXN3基因的两个isoform编码的蛋白序列分别如SEQ ID NO.4和5所示。
采用miRNA抑制剂(商品化合成的针对每一个miRNA的反义核酸，由广州锐博生物公司合成)，分别抑制A549外泌体中的
hsa-miR-22-3p，hsa-miR-21-5p或hsa-miR-21-3p。再用被抑制miRNA的三种外泌体的每一种去处理受体细胞MRC5，最后用qPCR定量检测受体细胞MRC5中FOXN3的表达水平。结果发现相较于没有被抑制miRNA的外泌体而言，分别抑制外泌体中每一种miRNA都会使FOXN3的表达水平有显著的提高，见图7。说明这三种外泌体miRNA各自对FOXN3都有直接的调控作用。
2、靶向抑制正常成纤维细胞中FOXN3的表达，致使细胞迁移能力提高。
在MRC5细胞中，通过转染特异性抑制FOXN3的shRNA载体(通过设计合成FOXN3的shRNA序列，接入商品化的pLKO.1载体得到)，经由Transwell实验检测，MRC5细胞的过膜细胞数随着FOXN3的降低而显著升高(图8)，说明FOXN3抑制了成纤维细胞的迁移能力。
3、FOXN3的降低促进成纤维细胞进入肿瘤组织，并且促进肿瘤生长。
对A549细胞建立裸鼠移植瘤模型，取BALB/c四周龄裸鼠，分别注射1百万个肺腺癌细胞A549。待成瘤后，分别注射PBS、1百万个正常成纤维细胞MRC5、1百万个FOXN3低表达的成纤维细胞MRC5(FOXN3的shRNA载体转染入MRC5细胞中，通过载体上的抗生素标记筛选后得到)。两周后，取小鼠肿瘤，进行HE染色。图9的A图显示FOXN3的表达被抑制后，致使进入肿瘤组织中的成纤维细胞增多；图9的B图显示，与对照组(正常成纤维细胞+肿瘤细胞组(图中标为A549+MRC5(shscramble))和肿瘤细胞组(图中标为A549))相比，注射FOXN3低表达的成纤维细胞+肿瘤细胞组(图中标为A549+MRC5(shFOXN3))的移植瘤大小显著增加，说明FOXN3是具有抑制成纤维细胞恶性转化的重要分子。
基于上述各实施例的结果，本发明发现了肺腺癌特异性的外泌体miRNA：hsa-miR-22-3p，hsa-miR-21-5p，hsa-miR-21-3p；其RNA序列分别如SEQ ID NO.1-3所示，不同于其他肿瘤分泌的外泌体中miRNA，且该组肺腺癌特异性的外泌体miRNA具有促进成纤维细胞恶性转化，进而促进肿瘤增殖的功能。基于外泌体在体液中易于检测，这组外泌体miRNA可以作为检测标志物用于肺腺癌的辅助诊断和监测预后，对于制备肺腺癌检测试剂盒具有明确的导向作用。本发明还发现成纤维细胞吸收了肿瘤的外泌体后，FOXN3基因表达显著降低，且FOXN3对于成纤维细胞进入肿瘤组织，促进肿瘤增殖具有重要的作用。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国科学院北京基因组研究所
<120> 肺腺癌外泌体特异miRNA及其靶基因与应用
<130> KHP181112761.8
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aagcugccag uugaagaacu gu 22
<210> 2
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
uagcuuauca gacugauguu ga 22
<210> 3
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caacaccagu cgaugggcug u 21
<210> 4
<211> 490
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Gly Pro Val Met Pro Pro Ser Lys Lys Pro Glu Ser Ser Gly Ile
1 5 10 15
Ser Val Ser Ser Gly Leu Ser Gln Cys Tyr Gly Gly Ser Gly Phe Ser
20 25 30
Lys Ala Leu Gln Glu Asp Asp Asp Leu Asp Phe Ser Leu Pro Asp Ile
35 40 45
Arg Leu Glu Glu Gly Ala Met Glu Asp Glu Glu Leu Thr Asn Leu Asn
50 55 60
Trp Leu His Glu Ser Lys Asn Leu Leu Lys Ser Phe Gly Glu Ser Val
65 70 75 80
Leu Arg Ser Val Ser Pro Val Gln Asp Leu Asp Asp Asp Thr Pro Pro
85 90 95
Ser Pro Ala His Ser Asp Met Pro Tyr Asp Ala Arg Gln Asn Pro Asn
100 105 110
Cys Lys Pro Pro Tyr Ser Phe Ser Cys Leu Ile Phe Met Ala Ile Glu
115 120 125
Asp Ser Pro Thr Lys Arg Leu Pro Val Lys Asp Ile Tyr Asn Trp Ile
130 135 140
Leu Glu His Phe Pro Tyr Phe Ala Asn Ala Pro Thr Gly Trp Lys Asn
145 150 155 160
Ser Val Arg His Asn Leu Ser Leu Asn Lys Cys Phe Lys Lys Val Asp
165 170 175
Lys Glu Arg Ser Gln Ser Ile Gly Lys Gly Ser Leu Trp Cys Ile Asp
180 185 190
Pro Glu Tyr Arg Gln Asn Leu Ile Gln Ala Leu Lys Lys Thr Pro Tyr
195 200 205
His Pro His Pro His Val Phe Asn Thr Pro Pro Thr Cys Pro Gln Ala
210 215 220
Tyr Gln Ser Thr Ser Gly Pro Pro Ile Trp Pro Gly Ser Thr Phe Phe
225 230 235 240
Lys Arg Asn Gly Ala Leu Leu Gln Asp Pro Asp Ile Asp Ala Ala Ser
245 250 255
Ala Met Met Leu Leu Asn Thr Pro Pro Glu Ile Gln Ala Gly Phe Pro
260 265 270
Pro Gly Val Ile Gln Asn Gly Ala Arg Val Leu Ser Arg Gly Leu Phe
275 280 285
Pro Gly Val Arg Pro Leu Pro Ile Thr Pro Ile Gly Val Thr Ala Ala
290 295 300
Met Arg Asn Gly Ile Thr Ser Cys Arg Met Arg Thr Glu Ser Glu Pro
305 310 315 320
Ser Cys Gly Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Pro Lys Glu Asp His Asn
325 330 335
Tyr Ser Ser Ala Lys Ser Ser Asn Ala Arg Ser Thr Ser Pro Thr Ser
340 345 350
Asp Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala Asp Asp His Tyr Glu Phe
355 360 365
Ala Thr Lys Gly Ser Gln Glu Gly Ser Glu Gly Ser Glu Gly Ser Phe
370 375 380
Arg Ser His Glu Ser Pro Ser Asp Thr Glu Glu Asp Asp Arg Lys His
385 390 395 400
Ser Gln Lys Glu Pro Lys Asp Ser Leu Gly Asp Ser Gly Tyr Ala Ser
405 410 415
Gln His Lys Lys Arg Gln His Phe Ala Lys Ala Arg Lys Val Pro Ser
420 425 430
Asp Thr Leu Pro Leu Lys Lys Arg Arg Thr Glu Lys Pro Pro Glu Ser
435 440 445
Asp Asp Glu Glu Met Lys Glu Ala Ala Gly Ser Leu Leu His Leu Ala
450 455 460
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485 490
<210> 5
<211> 468
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Met Gly Pro Val Met Pro Pro Ser Lys Lys Pro Glu Ser Ser Gly Ile
1 5 10 15
Ser Val Ser Ser Gly Leu Ser Gln Cys Tyr Gly Gly Ser Gly Phe Ser
20 25 30
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35 40 45
Arg Leu Glu Glu Gly Ala Met Glu Asp Glu Glu Leu Thr Asn Leu Asn
50 55 60
Trp Leu His Glu Ser Lys Asn Leu Leu Lys Ser Phe Gly Glu Ser Val
65 70 75 80
Leu Arg Ser Val Ser Pro Val Gln Asp Leu Asp Asp Asp Thr Pro Pro
85 90 95
Ser Pro Ala His Ser Asp Met Pro Tyr Asp Ala Arg Gln Asn Pro Asn
100 105 110
Cys Lys Pro Pro Tyr Ser Phe Ser Cys Leu Ile Phe Met Ala Ile Glu
115 120 125
Asp Ser Pro Thr Lys Arg Leu Pro Val Lys Asp Ile Tyr Asn Trp Ile
130 135 140
Leu Glu His Phe Pro Tyr Phe Ala Asn Ala Pro Thr Gly Trp Lys Asn
145 150 155 160
Ser Val Arg His Asn Leu Ser Leu Asn Lys Cys Phe Lys Lys Val Asp
165 170 175
Lys Glu Arg Ser Gln Ser Ile Gly Lys Gly Ser Leu Trp Cys Ile Asp
180 185 190
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210 215 220
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225 230 235 240
Lys Arg Asn Gly Ala Leu Leu Gln Val Pro Pro Gly Val Ile Gln Asn
245 250 255
Gly Ala Arg Val Leu Ser Arg Gly Leu Phe Pro Gly Val Arg Pro Leu
260 265 270
Pro Ile Thr Pro Ile Gly Val Thr Ala Ala Met Arg Asn Gly Ile Thr
275 280 285
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Val Ser Gly Asp Pro Lys Glu Asp His Asn Tyr Ser Ser Ala Lys Ser
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Ser Asn Ala Arg Ser Thr Ser Pro Thr Ser Asp Ser Ile Ser Ser Ser
325 330 335
Ser Ser Ser Ala Asp Asp His Tyr Glu Phe Ala Thr Lys Gly Ser Gln
340 345 350
Glu Gly Ser Glu Gly Ser Glu Gly Ser Phe Arg Ser His Glu Ser Pro
355 360 365
Ser Asp Thr Glu Glu Asp Asp Arg Lys His Ser Gln Lys Glu Pro Lys
370 375 380
Asp Ser Leu Gly Asp Ser Gly Tyr Ala Ser Gln His Lys Lys Arg Gln
385 390 395 400
His Phe Ala Lys Ala Arg Lys Val Pro Ser Asp Thr Leu Pro Leu Lys
405 410 415
Lys Arg Arg Thr Glu Lys Pro Pro Glu Ser Asp Asp Glu Glu Met Lys
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465
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acactccagc tgggtagctt atcagactga 30
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acactccagc tgggcaacac cagtcgatg 29
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
acactccagc tgggaagctg ccagttgaag 30

Claims (10)

1.一种肺腺癌外泌体特异miRNA，其特征在于，其为如下任意一个或多个miRNA：hsa-miR-22-3p，hsa-miR-21-5p，hsa-miR-21-3p；其RNA序列分别如SEQ ID NO.1-3所示。
2.权利要求1所述的特异miRNA或其检测试剂在制备检测肺腺癌诊断试剂盒或在制备肺腺癌用药效果评价体系中的应用。
3.权利要求1所述的特异miRNA的抑制剂或肺癌外泌体分泌抑制剂或成纤维细胞吸收外泌体阻断剂在制备治疗肺腺癌药物中的应用，所述miRNA的抑制剂为miRNA转录抑制剂、miRNA转录后加工抑制剂或miRNA转录加工成熟后的功能抑制剂。
4.权利要求1所述的特异miRNA的靶基因在抑制成纤维细胞迁移能力、或抑制成纤维细胞转化为非正常成纤维细胞中的应用。
5.权利要求1所述的特异miRNA的靶基因的表达促进剂在制备抑制成纤维细胞癌变的药物或制备治疗癌症的药物中的应用，所述癌症为肺腺癌。
6.权利要求1所述的特异miRNA的靶基因的检测试剂在制备肺腺癌用药效果评价体系中的应用。
7.一种肺腺癌的诊断试剂盒，其特征在于，含有检测权利要求1所述的特异miRNA的试剂，和/或含有检测权利要求1所述的特异miRNA的靶基因表达量的试剂，和/或含有检测能够调控FOXN3基因的miRNA的试剂。
8.如权利要求7所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述的特异miRNA的靶基因编码蛋白的氨基酸序列为以下任一：
(1)具有如SEQ ID NO.4和/或5所示的氨基酸序列；
(2)具有如SEQ ID NO.4和/或5所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的氨基酸序列。
9.一种肺腺癌的治疗药物，其特征在于，含有权利要求1所述的特异miRNA的抑制剂、肺癌外泌体分泌抑制剂、成纤维细胞吸收外泌体阻断剂、和/或权利要求1所述的特异miRNA的靶基因的表达促进剂；所述miRNA的抑制剂为miRNA转录抑制剂、miRNA转录后加工抑制剂或miRNA转录加工成熟后的功能抑制剂。
10.如权利要求9所述的治疗药物，其特征在于，所述的特异miRNA的靶基因编码蛋白的氨基酸序列为以下任一：
(1)具有如SEQ ID NO.4和/或5所示的氨基酸序列；
(2)具有如SEQ ID NO.4和/或5所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的氨基酸序列。
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